CN108142730A - 具有免疫调节功能的虾用饲料添加剂以及含此的虾用饲料组合物 - Google Patents

Abstract

本发明有关于一种具有免疫调节功能的虾用饲料添加剂，其包含免疫调节性多醣成分以及核酸佐剂，确实可更有效提升虾体的免疫基因表现，达到有效增进抗病力等功效，可添加于虾用饲料组合物中。

Description

具有免疫调节功能的虾用饲料添加剂以及含此的虾用饲料组 合物

技术领域

本发明是有关于一种水产养殖用饲料添加剂，特别是有关于一种具有免疫调节功能的虾用饲料添加剂以及含此的虾用饲料组合物。

背景技术

生物性免疫调节剂为促进虾先天性免疫力(innate immunity)的关键技术，由于虾仅具有先天性免疫力，而不具备适应性免疫力(adaptive immunity)，无法产生针对特定病原感染后发展出来的记忆性免疫细胞，因此也无法发展出虾的疫苗。

免疫多醣属当今最热门的健康食品之一，不少产品标榜其具有强化免疫功能的活性，但并非所有多醣均具有生理功效，必须在免疫细胞具有特定受体，才可以经由多醣-受体结合作用，进而活化免疫细胞功能。以哺乳动物而言，树状突细胞及巨噬细胞为体内主要高度表现Dectin-1的细胞，可以辨识特定免疫多醣，如beta-glucan的分子结构，藉由此结合作用可活化其免疫活性。

目前已知含有未甲基化CpG模组(motif)的DNA(或称CpG DNA)片段，可使用于小鼠、人、猪及牛等哺乳动物用的疫苗，不仅大为增强适应性免疫细胞活性，CpG DNA片段更具备活化先天性免疫力活性，但以化学方法合成的CpG DNA片段，不仅合成费时，无法大量合成且价格昂贵，合成的CpG DNA片段必须以化学修饰核酸之间的磷酸二酯键，以硫取代磷，降低DNA分解酶(DNAase)分解CpG DNA片段的速率。再者，CpG DNA片段具有种别特异性，适用于哺乳动物与适用于水产养殖动物的CpG DNA，二者序列不同且无法彼此替换使用。

近年来，由于大量人工繁殖虾苗和人工养虾的兴起，虾类疾病日益严重，其存活率一般约仅50％，造成养虾业严重的损失。虾类仅具有先天性免疫力(innate immunity)，并不具备脊椎动物对病原发展出的适应性免疫力(adaptive immunity)，难以藉由疫苗产生针对特定病原感染后诱发的特异性记忆性免疫细胞，更无虾用饲料可促进虾先天性免疫力。

有鉴于此，亟需开发一种虾用饲料添加剂以及含此的虾用饲料组合物，以促进虾类免疫力。

发明内容

因此，本发明的一个方面在于提供一种具有免疫调节功能的虾用饲料添加剂，藉由添加复合免疫调节剂，可有效提升虾体的免疫基因表现，达到有效增进抗病力的功效，又可使虾体增色。

本发明的另一方面在于提供一种具有免疫调节功能的虾用饲料组合物，藉由添加上述虾用饲料添加剂，可有效提升虾体的免疫基因表现，达到有效增进抗病力的功效，又可使虾体增色。

根据本发明的上述方面，提出一种具有免疫调节功能的虾用饲料添加剂，包含核酸佐剂以及免疫调节性多醣成分。

在上述实施例中，虾用饲料添加剂包含核酸佐剂及免疫调节性多醣成分。在一例示中，前述序列可包含至少一CpG模组，而前述免疫调节性多醣成分则包含菇类水性萃取物。前述菇类可源自于一菇类，且此菇类可包含小火焰菌属(Flammulina spp.)、香菇属(Lentinula spp.)及/或侧耳属(Pleurotus spp.)。

在上述实施例中，上述核酸佐剂的序列可例如SEG ID NO:1所示的序列。

在上述实施例中，上述菇类可包含但不限于金针菇(Flammulina velutipes(Fr.)Sing.)、香菇(Lentinula edodes(Berk.)Pegler)及/或白精灵菇(white king oystermushroom；Pleurotus nerbrodensis)。

在上述实施例中，前述菇类水性萃取物为热水萃取物。

在上述实施例中，前述核酸佐剂与免疫调节性多醣成分的重量比可例如为1：4000至4：1000。

在上述实施例中，前述核酸佐剂与免疫调节性多醣成分的重量比可例如为1：2000。

根据本发明的另一方面，提出一种具有免疫调节功能的虾用饲料组合物，包含基本配方以及复合免疫调节剂(即，本发明的虾用饲料添加剂)。

依据本发明一实施例，上述具有免疫调节功能的虾用饲料组合物的口服剂量可例如为受试对象的平均体重的3％，以调节受试对象的免疫相关基因的表现量。

依据本发明一实施例，上述核酸佐剂占口服剂量的含量可例如为1ppm至4ppm。

依据本发明一实施例，上述核酸佐剂占口服剂量的含量可例如为1ppm至2ppm。

依据本发明一实施例，上述免疫调节性多醣成分占口服剂量的含量可例如为0.10重量百分比至0.40重量百分比。

依据本发明一实施例，上述免疫调节性多醣成分占口服剂量的含量可例如为0.20重量百分比至0.40重量百分比。

依据本发明一实施例，上述免疫相关基因可包含但不限于虾抗菌蛋白(Crustin)基因、虾粘附蛋白(Peroxinectin)基因及/或转谷氨酰胺酶(transglutaminase，TGase)基因。

依据本发明一实施例，上述受试对象可例如为白虾(Litopenaeus vannamei)。

应用本发明的具有免疫调节功能的虾用饲料添加剂，其包含免疫调节性多醣成分以及核酸佐剂，确实可更有效提升虾体的免疫基因表现，达到有效增进抗病力等功效，可添加于虾用饲料组合物中。

附图说明

为让本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附附图的详细说明如下：

图1是绘示根据本发明一实施例的菇类免疫多醣的制造方法的部分流程图；

图2是绘示根据本发明一实施例的免疫调节性多醣成分浓度与葡萄糖浓度标准曲线的曲线图；

图3是绘示根据本发明一实施例以虾淋巴细胞平台评估不同划分物的相对细胞存活率；

图4是绘示根据本发明一实施例以虾淋巴细胞平台检测核酸佐剂的相对细胞存活率；

图5是显示本发明数个实施例的不同配方的虾用饲料组合物的虾体照片；

图6A至图6B是绘示根据本发明一实施例的虾淋巴血细胞吞噬FITC标定的金黄色葡萄球菌的流式细胞分析图(图6A)与阳性反应细胞的百分比(图6B)；

图7A至图7C是分别绘示根据本发明数个实施例的虾抗菌蛋白(Crustin)基因(图7A)、虾粘附蛋白(Peroxinectin)基因(图7B)及/或转谷氨酰胺酶(transglutaminase，TGase)基因(图7C)的相对表现量；

图8是绘示根据本发明数个实施例的实验虾经攻毒试验后的累积死亡率；其中，符号说明：

100：方法

101/110/111/113/115/117/119/120/121/123/125/127/129/130/131/133/135/137/139：步骤。

具体实施方式

承前所述，本发明提供一种具有免疫调节功能的虾用饲料添加剂，其包含免疫调节性多醣成分及核酸佐剂，可添加于虾用饲料中，虾只经摄食后，可有效提升虾体的免疫基因表现，达到有效增进抗病力的功效。

申言之，本发明此处所称的虾用饲料添加剂，可进一步添加于基本配方中。在一实施例中，前述基本配方的成分及其比例并无特别限制，可以是任何市售虾用饲料，但未添加复合免疫调节剂者。

本发明此处所称的「虾」并不限于特定品种。在一些实施例中，虽以白虾(Litopenaeus vannamei)为例进行各项免疫调节功效的评估，惟本发明适用的虾种类不限于此处所举。

本发明此处所称的虾用饲料添加剂是指具有促进虾体的免疫活化功能的多种成分，其包含免疫调节性多醣成分以及核酸佐剂。在一些实施例中，前述核酸佐剂与免疫调节性多醣成分的来源并无特别限制。

在一例示中，前述核酸佐剂是指具有促进虾体的免疫活化功能的核酸序列。在一实施例中，前述核酸佐剂的序列包含至少一CpG模组。在一例示中，前述核酸佐剂的序列可包含如SEG ID NO:1所示的序列。

在一例示中，前述免疫调节性多醣成分可源自于菇类，其中此菇类可包含但不限于小火焰菌属(Flammulina spp.)、香菇属(Lentinula spp.)及/或侧耳属(Pleurotusspp.)。在另一例示中，前述菇类可包含但不限于金针菇(Flammulina velutipes(Fr.)Sing.)、香菇(Lentinula edodes(Berk.)Pegler)及/或白精灵菇(white king oystermushroom；Pleurotus nerbrodensis)。在其他实施例中，亦可使用上述例举以外的其他菇类作为免疫调节性多醣成分的来源。

在上述例子中，上述免疫调节性多醣成分可包含菇类水性萃取物。在一些实施例中，前述菇类水性萃取物可例如为热水萃取物。在一例示中，前述菇类可例如在沸水及常压中，或利用大于100℃的水蒸气及高压中，进行至少一次的高温萃取。上述菇类热水萃取液与其他固形物分离后，可选择性进行习知的沉淀步骤及干燥步骤，例如乙醇沉淀步骤及冷冻干燥步骤等，藉此获得菇类水性萃取物。

在上述实施例中，上述核酸佐剂与免疫调节性多醣成分的重量比可例如为1：4000至4：1000，然以1：2000为较佳。

本发明此处所称的虾用饲料添加剂，可进一步添加于基本配方中，以制得具有免疫调节功能的虾用饲料组合物。在一实施例中，前述基本配方的成分及其比例并无特别限制，可以是任何市售虾用饲料，但未添加复合免疫调节剂者。

本发明此处所称的免疫调节功能，是指受试对象经口服上述具有免疫调节功能的虾用饲料组合物后，可以调节受试对象的免疫相关基因的表现量。在上述实施例中，前述受试对象的口服剂量可例如为受试对象的一般摄食量，例如受试对象的平均体重的3％，以调节受试对象的免疫相关基因的表现量，惟本发明并不限于此，前述口服剂量可视实际情况而高于或低于受试对象的平均体重的3％。

在上述实施例中，上述受试对象可例如为白虾(Litopenaeus vannamei)。

在上述实施例中，上述核酸佐剂占口服剂量的含量可例如为1ppm至4ppm，然以1ppm至2ppm为较佳，其中1ppm相当于1mg/kg。在一些实施例中，多醣成分占口服剂量的含量为0.10重量百分比至0.40重量百分比，然以0.20重量百分比至0.40重量百分比为较佳，其中1重量百分比相当于10g/kg。

在上述实施例中，上述免疫相关基因可包含但不限于虾抗菌蛋白(Crustin)基因、虾粘附蛋白(Peroxinectin)基因及/或转谷氨酰胺酶(transglutaminase，TGase)基因。

本发明的具有免疫调节功能的虾用饲料组合物，藉由添加复合免疫调节剂，不仅可有效提升虾体的免疫基因表现，达到有效增进抗病力的功效，另可使虾体增色。

以下利用数个实施例以说明本发明的应用，然其并非用以限定本发明，本发明技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。

实施例1.开发具有促进免疫细胞功能的免疫调节性多醣成分(PS)

1.制备免疫调节性多醣成分

此实施例是由多种菇类萃取出具有促进免疫细胞功能的免疫调节性多醣成分(PS)。

首先，取常见的几种食用菇类，金针菇、香菇与白精灵菇，经由不同萃取步骤分离出三种产物。请参阅图1，其是绘示根据本发明一实施例的菇类免疫多醣的制造方法的部分流程图。

请参阅图1，其是绘示根据本发明一实施例的菇类免疫多醣的制造方法的部分流程图。首先，如图1的步骤101所示，提供新鲜的菇类子实体，切除其培养料后，称其重量约为1000g，将其剥散开并摆放至网状呈盘中，于65℃烘干4天后可得约60g干菇。

接着，如图1的步骤110所示，进行第一萃取步骤。将30g干菇(研磨或未研磨)及500mL的去离子水(ddH₂O)置于1L血清瓶中，在沸水及常压中，或利用市售高压灭菌釜在大于100℃(例如121℃高温)的水蒸气及0.10kpa至0.15kpa的压力下，高温萃取2小时后，利用习知固液分离的方法，例如于6000rpm以4℃离心20分钟，以分离出第一萃取液111(即上清液)与第一固形物113(即残渣)。

然后，如图1的步骤115所示，取200mL第一萃取液111与4倍体积800mL的95％乙醇，在4℃下进行第一沉淀步骤达24小时。之后，利用习知固液分离的方法，例如于6000rpm以4℃离心20分钟后，去除上清液并对沉淀物进行第一干燥步骤117。第一干燥步骤117可利用习知干燥方法进行，例如以氮气初步去除沉淀物所含的95％乙醇后，置于-20℃冷冻24小时，进行冷冻干燥处理，直至干燥完全，以获得第一划分物(Fraction 1)119。

上述第一固形物113(即残渣)可进一步进行第二萃取步骤120，以获得第二固形物123。第二萃取步骤120可使用与第一萃取步骤110相同的制程条件，在沸水及常压中，或利用121℃水蒸气及0.10kpa至0.15kpa压力下，高温萃取2小时后，利用习知固液分离的方法，例如于6000rpm以4℃离心20分钟，以分离出第二萃取液121(即上清液)与第二固形物123(即残渣)。

然后，如图1的步骤125所示，取200mL第二萃取液121与4倍体积800mL的95％乙醇，在4℃下进行第二沉淀步骤125达24小时。之后，利用习知固液分离的方法，例如于6000rpm以4℃离心20分钟后，去除上清液并对沉淀物进行第二干燥步骤127。第二干燥步骤127可利用与第一干燥步骤117相同的方法进行，不另赘述，以获得第二划分物(Fraction 2)129。

上述第二固形物123(即残渣)可进一步进行第三萃取步骤，其是利用500mL的10％NaOH碱液，在4℃浸泡一天后，再用醋酸中和至pH 7.0，将其移到4℃环境下，利用蒸馏水透析2天。然后，上述透析后的产物再利用习知固液分离的方法，例如于6000rpm以4℃离心20分钟后，取得第三萃取液131(即上清液)与第三固形物133(即残渣)。

之后，如图1的步骤135所示，取200mL的第三萃取液131与800mL的95％乙醇，在4℃下进行第二沉淀步骤135及第三干燥步骤137，以获得第三划分物(Fraction 3)139。前述第二沉淀步骤135及第三干燥步骤137可利用与第一沉淀步骤115及第一干燥步骤117相同的方法进行，故不再赘述。

关于上述免疫调节性多醣成分的划分物编号、所使用的菇类子实体的种类、子实体研磨与否以及相关划分物种类，列于表1。上述所得的第一划分物(Fraction 1)119、第二划分物(Fraction 2)129及第三划分物(Fraction 3)139亦进行后续评估，以作为免疫调节性多醣成分。

表1

2.免疫调节性多醣成分(PS)的总醣浓度的测定

此实施例是利用酚硫酸法测定上述所得的第一划分物(Fraction 1)119、第二划分物(Fraction 2)129及第三划分物(Fraction 3)139的总醣浓度。

首先，称取10mg葡萄糖，以ddH₂O定量至100mL，分别稀释不同浓度的葡萄糖水溶液20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL。取各浓度的葡萄糖水100μL、0.5mL 60％酚及2.5mL浓硫酸置于20mL玻璃试管中，混合静置30分钟，并以分光光度计波长490nm测定吸光值后，再利用吸光值与相对浓度建立标准曲线图，如图2所示。

称取10mg的第一划分物(Fraction 1)119、第二划分物(Fraction 2)129及第三划分物(Fraction 3)139并且溶于5mL 65℃蒸馏水中，使其浓度为2mg/mL，以ddH₂O将其稀释10倍成为0.2mg/mL后，取100μL的划分物溶液(含免疫调节性多醣成分)、0.5mL 60％酚及2.5mL浓硫酸置于20mL玻璃试管中，混合静置30分钟，并以分光光度计波长490nm测定吸光值，再利用标准曲线推算其总醣量，其结果如图2所示，上述各划分物的免疫调节性多醣成分浓度201与葡萄糖浓度203的相关系数R²高达0.9978。

3.以虾淋巴细胞平台筛选免疫多醣

实施方法为先准备至少两个打气泵及新鲜海水，以确保虾子的存活。将白虾从养殖场移至操作台后，至少静置1小时让虾子稳定，随时注意打气情形与虾子状态，并适时添加新鲜海水。取体积1mL的针筒，装上26G×1/2”(0.45×13mm)的针头，先吸取0.4mL已配置好的虾淋巴细胞专用抗凝剂，并将针筒至于冰上待备用。抗凝剂配方为100mL的抗凝液中含有0.82g NaCl、0.55g Citric acid、1.98g Glucose以及0.88g Sodium citrate、2.1563gGlucosamine以及0.25g EDTA，调整pH至7.0并存放于4℃。再取50mL的离心管，内含20mL虾细胞培养液并置于冰上待备用，虾细胞培养液配制方法为先取10g的glucose加入800mL的灭菌水，溶解完后，再依序加入5g NaCl，2包2×Leibovitz’s L-15粉末，溶解完毕后，以无菌水调整至840mL，以1N HCl调整pH值至7.0，再加入10mL(1％,v/v)的抗生素，最后再加入150mL(15％,v/v)胎牛血清(fetal bovine serum；FBS)，溶液的总体积为1000mL，使用孔径大小为0.22μm的滤膜过滤去除细菌，过滤完后将配置好的培养基存放于4℃待使用。抗生素溶液配方100×(CORNING)内含有10,000g/mL的链霉素(Streptomycin)、10,000I.U./mL的青霉素(Penicillin)、25mg/mL的两性霉素(Amphotericin)、8.5mg/mL的NaCl。

用单手固定虾子后，露出虾腹部，将其胸节跟第一对腹节撑开，会看到虾头胸甲与虾身连接处，把虾子头部朝下，针头对准连接处后小于45度角下针，针头前端插入0.3cm至0.5cm的深度后，缓慢抽出透明/蓝虾体液。接着，快速将虾体液跟针筒里的抗凝剂以1:1比例混合均匀后，取掉针头并将虾血及抗凝血剂同时注入已经准备好的50mL离心管中，上下翻转离心管使其细胞散布均匀以避免细胞团聚。每管50mL离心管共收集20只虾血细胞，得到总体积为40mL(20mL虾血细胞培养液+10mL抗凝血剂+10mL虾血细胞)，取出10μL混合液，加上90μL的台酚蓝溶液(Trypan blue solution，0.5％，Biological Industries)，进行细胞计数。

将细胞调整至1×10⁶cells/ml的细胞浓度，取100μL种于96孔盘中，贴附3hr后，每孔细胞加入表1所列的S1-S15的不同划分物10μl(含250ng多醣)作用6小时后，各孔加入11μL的cell counting kit-8reagent，作用1小时后用酶免疫分析仪测定OD₄₅₀的数值。每组实验组各做4重复，分别以样品的OD₄₅₀值(ODs)与控制组(Control)的OD₄₅₀值(ODc)的比例作为样品对虾淋巴细胞活性促进的相对细胞存活率(Relative Cell Viability，％)，如图3所示。

请参阅图3，其是绘示根据本发明一实施例以虾淋巴细胞平台评估不同划分物的相对细胞存活率。图3的图号*代表相较于控制组在统计上具有p<0.05的显著差异性，图号**代表相较于控制组在统计上具有p<0.01的显著差异性，图号***代表相较于控制组在统计上具有p<0.001的显著差异性。

由图3结果显示，上述划分物S4(即，未经研磨金针菇萃取的第一划分物)具有较佳的免疫细胞促进活性，以此作为后续动物实验的免疫调节性多醣成分。

实施例2.开发具有促进免疫细胞功能的核酸佐剂(CpG)

1.制备核酸佐剂

此实施例使用的核酸佐剂(CpG)的序列如SEG ID NO:1所示，是由基龙米克斯(Taipei,Taiwan)合成，并嵌入商用载体pUC57，形成重组质体。之后，再将此重组质体转形至大肠杆菌DH5α，形成转形株，以利于量产核酸佐剂。

首先，将上述转形株接种在含有浓度25μg/mL的Ampicillin抗生素的LB(Lysogenybroth)液态培养基中，于37℃、200rpm转速培养菌液14小时后，利用接种环沾菌液以画四区的方式涂盘至含有100μg/mL Ampicillin抗生素的LB固态培养基中，置于37℃培养箱进行14小时培养。挑选单一菌落接种至1.5mL离心管，内含100μg/mL的安比西林(Ampicillin)的LB液态培养基1mL，在37℃、200rpm转速培养菌液14小时后，取50μL菌液加入12.5μL的甘油，置于-80℃保存菌种。

将上述3μL菌液培养种入3mL含100μg/mL Ampicillin的LB液态培养基中，37℃及转速200rpm的条件下培养8小时后，取2mL菌液转至100mL含100μg/mL Ampicillin的LB液态培养基培养16小时，培养条件为37℃、转速200rpm。培养完的菌液以QIAGEN Plasmid Maxi(Germany)套组进行质体萃取，以分光光度计OD₂₆₀测量DNA浓度，以沸水加热30分钟核酸佐剂，即可使用。

2.以虾淋巴细胞平台检测核酸佐剂

根据上述实施例1的3的实施方法，以虾淋巴细胞平台评估核酸佐剂的免疫促进成效，每孔细胞添加10μl的核酸佐剂(含50ng核酸佐剂ˇ)结果如图4所示。

请参阅图4，其是绘示根据本发明一实施例以虾淋巴细胞平台检测核酸佐剂的相对细胞存活率。图4的图号***代表相较于控制组在统计上具有p<0.001的显著差异性。

由图4结果显示，相较于控制组，核酸佐剂确实具有促进虾淋巴细胞的细胞活性，以此作为后续动物实验的核酸佐剂。

实施例3.以动物实验检测免疫调节与生理功能性的虾饲料与其制备

1.实验动物

实验虾的平均体长及体重分别为10.43±0.4cm及9.11±0.9g。实验用白虾(Litopenaeus vannamei)取自屏东县私人养殖场，运回后蓄养于屏东科技大学水产养殖是户外养殖场，环境条件为26±1℃、海水盐度20‰，蓄养期间每日投喂虾只平均体重3％的控制组饲料，经蓄养一周后，进行试验饲料的投喂，经投喂白虾持续20天。

以同批孵育的虾，进行动物实验，以不添加任何添加物的虾饲料为基底饲料，作为控制组(CTRL组)。实验组则分别添加免疫调节性多醣成分(PS组)、核酸佐剂(CpG组)、或PS+CpG。每组喂食的白虾以4只为一批，共进行五批试验，每批试验持续投喂20天，合计80只。

2.制备实验饲料

白虾饲料配方(蛋白质37％和脂质7％)作为饲料的基本配方，分别添加免疫调节性多醣成分(PS)、核酸佐剂(CpG)、或PS+CpG作为三种实验饲料，其中饲料的基本配方如下表2所示。进行实验时，以不含任何添加物的基本配方作为CTRL组，以基本配方分别添加PS(每公斤添加2.5g的免疫调节性多醣成分)、CpG(每公斤添加1.25mg的核酸佐剂)及PS+CpG(每公斤添加2.5g的免疫调节性多醣成分及1.25mg的核酸佐剂，相当于0.25重量百分比的免疫调节性多醣成分及1.25ppm的核酸佐剂)作为三种实验饲料。

表2

3.投喂试验饲料

实验虾在设置有圆形箱网(0.8×0.6×0.6m)的10吨水泥池(6×2×1.2m)中进行投喂，实验期间不控温，连续打气维持溶氧大于5mg/L。每组各进行三重复，每个重复20尾虾。试验期间，每日喂饲二次，每日投喂量为虾体重2％，并在喂饲后1小时将残饵移除，以避免水质恶化。实验虾在喂食实验饲料20天后，每组动物分为两批，一批牺牲进行活体免疫活性分析，另一批虾子进行攻毒试验，以病原菌溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)感染后，检测动物存活率。

4.活体免疫活性分析

4.1虾活体增色的生理功能

请参阅图5，其是显示本发明数个实施例的虾用饲料组合物饲养的虾体照片。图5的结果显示以不同配方饲养的虾体的色泽，差异显著，其中以PS组的实验虾体色为最淡且最透明，依次为控制组(CTRL组)及PS+CpG组，而实验虾体色最暗者为CpG组。

4.2评估虾用饲料组合物对虾淋巴细胞的吞菌作用的影响

本次实验每组各取6只虾子，先将3×10⁸particles/10mg含有FITC荧光标定的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(ThermoFisher，S-2854)加入3mL PBS[内含2mM叠氮化钠(Sodium azide)]回溶，剧烈震荡3次(15秒/次)，使其细菌颗粒悬浮均匀。配置完成的细菌溶液最终浓度为1×10⁹particles/mL，分装于褐色微量离心管中，置于-20℃。另外，配制PBS-EDTA，取0.0038g的EDTA(分子量为292.25)溶入10mL PBS，配置为最终浓度含有EDTA 1.3mM的PBS-EDTA stock。将PBS-EDTA stock稀释1000倍(EDTA 1.3μL)作为PBS-EDTA工作溶液(working solution)供后续实验用。

取出虾淋巴血后，直接与针筒里的抗凝血剂以1:1比例混合均匀，取掉针头将虾血及抗凝剂直接注入到1.5mL微量离心管中，取出10μL混合液，加上90μL的台酚蓝溶液(Trypan blue solution，0.5％，Biological Industries)，进行细胞计数，其余细胞则静置于冰上。将计数完的细胞，每管又各取两次5×10⁵细胞放入两管各装有1mL虾血培养液中，再加入5×10⁶particles/5μL的S.aureus-FITC，取其中一管置于4℃冰上避光，作为细胞吞噬作用的控制组；另一管则置于25℃避光反应1小时。反应1小时后皆加入预冷的200μL的台酚蓝溶液(Trypan blue solution，0.4％，Biological Industries)反应15分钟，再离心4℃、300xg、10分钟。之后，移除上清液后，加入1mL的PBS-EDTA工作溶液(workingsolution)重新悬浮细胞，将细胞转移至干净的流式细胞仪上样管；再次离心4℃、300xg、10分钟后，移除上清液加入1mL冰的含有3.8％三聚甲醛(paraformaldehyde)的PBS固定细胞，以流式细胞仪(Coulter Epics Altra Flow Cytometry，Beckman Coulter，USA)分析其吞噬能力。

用流式细胞仪分析免疫调节与生理功能性的虾饲料对于虾淋巴细胞的吞菌作用影响，结果显示以含免疫调节性多醣成分或核酸佐剂饲料于喂饲20天后，分析其虾淋巴细胞的细胞吞菌作用，其结果如图6A及图6B所示。

请参阅图6A及图6B，其是绘示根据本发明一实施例的虾淋巴血细胞吞噬FITC标定的金黄色葡萄球菌的流式细胞分析图(图6A)与阳性反应细胞的百分比(图6B)。图6B数值上方标示的字母若为不同，例如a与b，则代表二者间具有显著差异性。图6B数值上方标示的字母若为相同，例如a与ab、b与ab、ab与ab，则代表二者数据间无显著差异。

由图6A及图6B的各组虾淋巴血细胞吞噬FITC标定的金黄色葡萄球菌(S.aureus-FITC)的阳性反应细胞百分比的结果显示，PS组与PS+CpG组可显著促进虾淋巴血细胞的吞噬作用，其中又以PS+CpG组的吞噬作用更显著(p<0.05)。4.3免疫调节与生理功能性的虾饲料对于虾淋巴细胞的免疫基因表现影响

抽取其虾血淋巴细胞，将其经离心后取其细胞沈淀物，以RNA(Macherey-Nagel,Germany)套组抽取总量RNA。首先加入350μL buffer RA1及3.5μLβ-mercaptoethanol震荡混匀后移到NucleoSpin Filter，以11,000xg离心1分钟，将收集的液体加入350μL 75％乙醇，吸排(pipetting)5次后移至NucleoSpin RNA Column以11,000xg离心30秒，并去除Column液体，再加入350μL滤膜去盐缓冲液(Membrane DesaltingBuffer，MDB)以11,000xg离心1分钟，而后加入95μL重组去氧核醣核酸酶反应混合物(rDNase Reaction mixture)于室温下静置15分钟，并加入200μL清洗缓冲液RAW2以11,000xg离心30秒。更换新的收集管(collection tube)，并加入600μL RA3，以11,000xg离心30秒，去除下层液体，加入250μL清洗缓冲液RA3，以11000xg离心2分钟，将Filter移到新的1.5mL微量离心管(eppendrof)中，加入30μL无核糖核酸酶水(RNase-free H₂O)，以11,000xg离心1分钟即得RNA。取抽取的5μL RNA样品加入495μL焦碳酸二乙酯处理的水(DEPC-H₂O)，测定OD_260/280值，总RNA的Ratio值需介于1.8～2.0间，其余置于-80℃备用。

利用superscript^TMⅡ(Invitrogen,USA)反转录酶套组合成cDNA。首先，各别取虾血淋巴总量RNA样品2μg置于RNase-free的200μL微量离心管中，分别加入0.5μg的Oligo(dT)_12-18引物和1μL 10mM dNTP，再以DEPC-H₂O定量至最终体积为13.5μL，置于聚合酶链锁反应器中以65℃反应5分钟后，置于冰上；再依序加入4μL 5×第一股溶液(first-strandbuffer)、1μL 0.1M DTT、0.5μL核糖核酸酶抑制剂(RNase inhibitor)及1μL反转录酶后混合均匀，总反应体积为20μL，以聚合酶链锁反应器于42℃50分钟、70℃15分钟反应后，所合成的cDNA置于-20℃备用。

接下来，以96(Roche,Germany)，根据制造商提供的操作方法，评估实验虾的免疫相关基因表现量的差异性。首先，将反转录完成的cDNA各别以PCR H₂O稀释400倍，每管(LightCycler8-TubeStr,Roche,Germany)的反应物成分：2.5μL cDNA、1μL 5μM正向引物(primer F)、1μL 5μM反向引物(primer R)、5μL Smart Quant Green Master Mix(Protech,Taiwan)及0.5μL PCR H₂O，总反应体积为10μL。相关的引物对如序列SEQ IDNOs：2至9所示，其中虾抗菌蛋白(Crustin)基因的引物对如序列SEQ ID NOs：2至3所示，虾粘附蛋白(Peroxinectin)基因的引物对如序列SEQ ID NOs：4至5所示，转谷氨酰胺酶(TGase)基因的引物对如序列SEQ ID NOs：6至7所示，β-actin基因的引物对如序列SEQ IDNOs：8至9所示。

反应条件为：95℃反应600秒重复1循环，95℃反应15秒、59℃反应20秒、72℃反应30秒重复40循环，95℃5秒、65℃60秒、97℃反应1秒1循环。实验结果可得定量循环(quantification cycle，Cq)值，并参考Pfaffi等人(2001)提出如式(I)至式(III)的RealTime PCR相对定量计算方式：

△Cq＝Cq(target gene)-Cq(β-actin) (I)

△△Cq＝Cq(target gene)-Cq(β-actin)_treated〕-〔Cq(target gene)-Cq(β-actin)_untreated〕 (II)

Ratio＝2^-(△△Cq) (III)

在式(I)中，△Cq表示二基因荧光于Cq值的循环数(cycle)的差异。在式(II)中，△△Cq表示处理组与控制组荧光于Cq值的循环数差异。在式(III)中，Ratio表示此基因的相对表现量，以Ratio值比较各实验结果，如图7的所示。

请参阅图7A至图7C，其是分别绘示根据本发明数个实施例的虾抗菌蛋白(Crustin)基因(图7A)、虾粘附蛋白(Peroxinectin)基因(图7B)及/或转谷氨酰胺酶(transglutaminase，TGase)基因(图7C)的相对表现量。图7A至图7C的各基因表现量是以β-actin基因的表现量进行换算。图7A至图7C数值上方标示的字母若为不同，例如a与b，则代表二者间具有显著差异性。图7A至图7C数值上方标示的字母若为相同，例如a与ab、b与ab、ab与ab，则代表二者数据间无显著差异。

由图7A至图7C结果显示，各别添加PS或CpG的实验组，对于虾抗菌蛋白(Crustin)、转谷氨酰胺酶(TGase)以及虾粘附蛋白(Peroxinectin)的基因表现，虽可提高约20％，但由于动物实验各体差异，而未达统计上的显著水准。然而，同时添加PS以及CpG的实验组，则显著增加虾抗菌蛋白(Crustin)、转谷氨酰胺酶(TGase)以及虾粘附蛋白(Peroxinectin)的基因表现量(p<0.05)。

4.4攻毒试验

本实验使用分离自白虾病虾的溶藻弧菌(V.alginolyticus)作为病原菌，接种于含1.5％NaCl的TSA(tryptic soy agar)培养基上，置于27℃，培养24小时后，再取单一菌落到50ml的含1.5％NaCl的TSB培养基中，置于27℃，转速100rpm培养24小时。随后，以7,000×g离心20分钟，去除上清液后，以生理食盐水回溶沉淀的菌块，再以分光光度计波长601nm调整菌液浓度，配制成1×10⁷cfu/ml的悬浊液。感染实验用虾子的平均体长及平均体重分别为11.86±0.9cm及12.83±1.6g，每只虾于血窦注射40μl菌液，使其每只虾子含有约4×10⁵cfu/虾的病原菌。病原菌注射后，虾子被饲养于含30L半淡海水(20‰)的60L玻璃水族缸中，温度控制在28℃，连续观察7天。实验期间，每日换水并记录死亡率，其结果如图8所示。

请参阅图8，其是绘示根据本发明数个实施例的实验虾经攻毒试验后的累积死亡率。图8数值上方标示的字母若为不同，例如a与b，则代表二者间具有显著差异性。图图8数值上方标示的字母若为相同，例如a与ab、b与ab、ab与ab，则代表二者数据间无显著差异。

由图8结果显示，实验虾(即白虾)摄食不同实验饲料20天后，进行攻毒试验。各组白虾于溶藻弧菌感染后第1天，即开始出现死亡情形，其中以控制组(CTRL组)虾子的累积死亡率相对于较高。第7天时，CTRL组、PS组、CpG组及PS+CpG组的白虾的累积死亡率分别为48.6±6.1％、30±3.3％、30±3.3％及23.3±1.9％。同样地，累积死亡率以CTRL组较高，且与其他实验组有显著性的差异，而摄食PS+CpG实验组饲料的白虾的累积死亡率为较低。

此攻毒实验结果与攻毒前虾体的免疫基因表现量一致，显示本发明的具有免疫调节功能的虾用饲料组合物同时添加PS以及CpG作为复合免疫调节剂，不仅对于虾体有增色作用，更有效提升虾体的免疫基因表现，进而达到有效增进抗病力的功效。

上述实施例中，每组数据的样本数至少为3个(n≧3)。

综言之，由上述数个实施例证实，本发明的具有免疫调节功能的虾用饲料组合物，藉由添加复合免疫调节剂，确实可更有效提升虾体的免疫基因表现，达到有效增进抗病力的功效，又可使虾体增色。

需补充的是，本发明虽以特定品种的虾、特定的基本配方、特定来源的免疫多醣(PS)、特定序列的核酸佐剂或特定的评估方式作为例示，说明本发明的具有免疫调节功能的虾用饲料组合物及其应用，惟本发明所属技术领域中任何具有通常知识者可知，本发明并不限于此，在不脱离本发明的精神和范围内，本发明的具有免疫调节功能的虾用饲料组合物及其应用，亦可使用其他品种的虾、其他的基本配方、其他来源的免疫多醣(PS)、其他序列的核酸佐剂或其他的评估方式进行。

虽然本发明已以数个实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，在本发明所属技术领域中任何具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

序列表

<110> 国立屏东科技大学

<120> 具有免疫调节功能的虾用饲料添加剂以及含此的虾用饲料组合物

<130> TWLB7055-16P1

<160> 9

<210> 1

<211> 227

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核酸佐剂的序列

<400> 1

actagttcgt cgaagtcgtt atcgttgggg ggttcgtcga agtcgttatc gttggggggt 60

tcgtcgaagt cgttatcgtt ggggggttcg tcgaagtcgt tatcgttggg gggttcgtcg 120

aagtcgttat cgttgggggg ttcgtcgaag tcgttatcgt tggggggttc gtcgaagtcg 180

ttatcgttgg ggggttcgtc gaagtcgtta tcgttggggg gtctaga 227

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 虾抗菌蛋白(Crustin)基因的上游引物

<400> 2

acgaggcaac catgaagg 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 虾抗菌蛋白(Crustin)基因的下游引物

<400> 3

aaccaccacc aacacctac 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 虾粘附蛋白(Peroxinectin)基因的上游引物

<400> 4

gaagaaagga gaccgatac 19

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 虾粘附蛋白(Peroxinectin)基因的下游引物

<400> 5

gctggacggc ttggatg 17

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 转谷氨酰胺酶(transglutaminase，TGase)基因的上游引物

<400> 6

ttcacaagcc tgacatcacc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 转谷氨酰胺酶(transglutaminase，TGase)基因的下游引物

<400> 7

gcagcagtgg gatagggtta 20

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> β-actin基因的上游引物

<400> 8

ccacgagacc acctacaac 19

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> β-actin基因的下游引物

<400> 9

agcgagggca gtgatttc 18

Claims (14)

1.一种具有免疫调节功能的虾用饲料添加剂，其特征在于包含：

核酸佐剂，其中核酸佐剂的序列包含至少一CpG模组；以及

免疫调节性多醣成分，其中该免疫调节性多醣成分包含菇类水性萃取物，该菇类水性萃取物是源自于菇类，且该菇类包含小火焰菌属(Flammulina spp.)、香菇属(Lentinulaspp.)及/或侧耳属(Pleurotus spp.)。

2.根据权利要求1所述的具有免疫调节功能的虾用饲料添加剂，其特征在于其中该序列包含如SEG ID NO:1所示的序列。

3.根据权利要求1所述的具有免疫调节功能的虾用饲料添加剂，其特征在于其中该菇类包含金针菇(Flammulina velutipes(Fr.)Sing.)、香菇(Lentinula edodes(Berk.)Pegler)及/或白精灵菇(white king oyster mushroom；Pleurotus nerbrodensis)。

4.根据权利要求1所述的具有免疫调节功能的虾用饲料添加剂，其特征在于其中该菇类水性萃取物为热水萃取物。

5.根据权利要求1所述的具有免疫调节功能的虾用饲料添加剂，其特征在于其中该核酸佐剂与该免疫调节性多醣成分的重量比为1：4000至4：1000。

6.根据权利要求1所述的具有免疫调节功能的虾用饲料添加剂，其特征在于其中该核酸佐剂与该免疫调节性多醣成分的重量比为1：2000。

7.一种具有免疫调节功能的虾用饲料组合物，其特征在于包含：

基本配方；以及

虾用饲料添加剂，其中该虾用饲料添加剂包含如权利要求1至6任一项所述的核酸佐剂以及免疫调节性多醣成分。

8.根据权利要求7所述的具有免疫调节功能的虾用饲料组合物，其特征在于其中该具有免疫调节功能的虾用饲料组合物的口服剂量为受试对象的平均体重的3％，以调节该受试对象的免疫相关基因的表现量。

9.根据权利要求8所述的具有免疫调节功能的虾用饲料组合物，其特征在于其中该核酸佐剂占该口服剂量的含量为1ppm至4ppm。

10.根据权利要求8所述的具有免疫调节功能的虾用饲料组合物，其特征在于其中该核酸佐剂占该口服剂量的含量为1ppm至2ppm。

11.根据权利要求8所述的具有免疫调节功能的虾用饲料组合物，其特征在于其中该免疫调节性多醣成分占该口服剂量的含量为0.10重量百分比至0.40重量百分比。

12.根据权利要求8所述的具有免疫调节功能的虾用饲料组合物，其特征在于其中该免疫调节性多醣成分占该口服剂量的含量为0.20重量百分比至0.40重量百分比。

13.根据权利要求8所述的具有免疫调节功能的虾用饲料组合物，其特征在于其中该免疫相关基因包含虾抗菌蛋白(Crustin)基因、虾粘附蛋白(Peroxinectin)基因及/或转谷氨酰胺酶(transglutaminase，TGase)基因。

14.根据权利要求7所述的具有免疫调节功能的虾用饲料组合物，其特征在于其中该受试对象为白虾(Litopenaeus vannamei)。