KR20070084398A

KR20070084398A - 천연 생체면역 추출물 제조공정 및 상기 추출물의 용도

Info

Publication number: KR20070084398A
Application number: KR1020077011441A
Authority: KR
Inventors: 필립 앤쏘니 주니어 쿠리; 쉐인 파트라키스; 에이미 조 마일스
Original assignee: 프로그레시브 바이오액티브스 인크.
Priority date: 2004-10-18
Filing date: 2005-10-18
Publication date: 2007-08-24
Also published as: EP1809674A1; RU2007118549A; AU2005297361A1; CN101111523A; CA2583138A1; ZA200703874B; US20090227535A1; WO2006042403A1; US20050020490A1

Abstract

세포 소스로부터 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 제조하는 공정으로서, 상기 공정은 세포 소스의 알칼리 추출 단계와; 물 추출 단계와; 산 추출 단계와; 물 추출 단계를 포함하되, 상기 물 추출의 최소 일 단계는 약 15 내지 약 30분의 시간범위 동안 약 100℃의 온도까지 증기분사에 의한 저온살균 단계를 포함한다. 제조되는 고체성분은 건조중량으로 최소 약 70% β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 포함한다. 본 발명은 또한 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 제조하는 공정의 하나 이상의 일 알칼리 추출단계에서 얻어진 액상을 수집하는 단계와; 약 5.0 내지 약 8.0의 pH 범위까지 상기 액상 pH를 산으로 조절하는 단계와; 약 15분 내지 약 30분 동안 약 100 ℃의 온도까지 증기분사에 의한 상기 액상을 저온살균하는 단계와; 상기 저온살균된 액상으로부터 만난 및 만난-단백질 복합체를 분리하는 단계를 포함하는 만난 및 만난-단백질 복합체를 제조하는 공정을 제공한다. 본 발명은 부가적으로 본 공정에 의해 제조되는 β-(1,3/1,6)-D-글루칸 및/또는 만난 및 만난-단백질을 포함하는 동물사료를 제공한다.

세포 소스, β-글루칸, 만난, 저온살균, 추출단계

Description

천연 생체면역 추출물 제조공정 및 상기 추출물의 용도{PROCESS FOR PRODUCING NATURAL IMMUNOBIOTIC EXTRACT AND USES THEREOF}

본 발명은 천연 생체면역 추출물 제조공정 및 상기 추출물의 용도에 관한 것이다. 더욱 특별하게는, 본 발명은 건강유지장치 및 가축류, 가금류, 반려동물(伴侶動物) 및 수산양식에서 성장촉진 항생제에 대한 대체로서의 용도를 위해 경제적으로 및 생태학적으로 안전한 천연 생체면역 추출물 제조공정을 목적으로 한다.

항생물질 내성균은 상기의 박멸의 어려움 및 박멸 비용때문에 지난 10년간 심각한 위협으로서 표면화되었다. 항생물질 내성균의 출현은 사육동물의 사료에 "성장촉진제"로서 항생제의 광범위한 사용 및 인간에게 항상제의 자주 부당하며 증가된 사용과 연관된다.

항생물질 내성균의 광범위한 출현에 대한 관심은 유럽연합이 동물사료에 "성장촉진제"로서 항생물질의 사용을 금지하게 만들었다. 미국에서 지난 몇년에 걸쳐서, 농업에서 항생물질의 사용을 금지하거나 크게 감소시키고자 하는 다수의 법안이 제안되었다. 소비자들의 증가하는 인식 및 과학자 및 다수의 정부기관에 의한 관심때문에, 농업에서 항생물의 사용금지가 미국 및 여러 다른 나라에서 실현될 수 있다. 성장촉진 항생물질의 사용에 대한 금지는 동물사육의 비용, 식육의 비용을 증가시킬 것이고 성장촉진 항생제에 대한 안전한 대용물을 찾을 수 없다면 식육공급을 감소시킬 것이다.

상기 이유로, 천연 생체면역제의 사용에 대한 연구가 관심을 얻게 되었다. 생체면역제는 장, 점막의 광범위 활성화 또는 전신성 면역 자극/조절을 통하여 건강을 증진시키는 작용제 또는 유기체이다. 동물의 면역계의 향상은 결과적으로 사료에 항생제의 첨가를 불필요하게 하면서 동물의 감염 및 질병에 저항하는 능력이 높아지게 된다.

사람 및 동물에 사용하기 위해 검사된 면역증진제 중에서 효모세포로부터 획득한 β-글루칸 성분이 있다. 글루칸, 만난(mannan) 및 만난단백질(manno-protein)이 다양한 효모류, 버섯, 식물 및 소수의 박테리아류, 지의류 및 해조류의 세포벽으로부터 추출될 수 있다 [참조문헌 Chemistry and Biology of (1,3)-β-Glucan, B.A.Stone and A.E. Clarke, 1992, La Trobe University Press, Australia]. 상기 정보로부터, 척추성분, 가지(branching), 단량체 또는 치환기의 유형에서 변화하는 다양하고 상이한 형태의 β-글루칸이 추출될 수 있으며, 이는 결과적으로 다당류가 상이한 물리적 및 생물학적 성질을 갖게 한다. 예를들면, 효모 및 균류는 폴리(1,3)-β-D-글루코피라노실-(1,6)-β-D-글루코피라노스, 또는 β-(1,6) 글루칸으로 지칭되는 다당류계를 생성하는 데, 이는 β-(1,3) 글루코시드 결합에 동시에 연결된 글루코스 기본구성단위의 주사슬 및 β-(1,6) 글루코시드 결합에 의한 주사슬에 연결된 가지로 구성된다. β-(1,3/1,6) 글루칸의 생물학적 활성은 β-(1,6)-가지의 주파수에 관련될 수 있다.

β-(1,6)-가지된 β-(1,3) 글루칸은 척추동물 및 무척추 생물의 면역계를 활성화시키는 것으로 알려져 왔다

[참조문헌문헌 Abel and Czop, "Stimulation of human monocyte beta-glucan receptors by glucan particles induces production of TNT-alpha and IL-1 Beta"(1992) Int. Journal Immunopharmacolol, 14:1363-1373; Vetvicka et al, "Pilot Study: Orally-Administered Yeast β-(1,3)-glucan Prophylactically Protects Against Antrax Infection and Cancer in Mice"(2002) The Journal of the American Nutraceutical Association, Vol5, No.2; Ueno, H.,"Beta-1,3-D- Glucan,"(2002) Japanese Journal Society Terminal Systemic Disease, 6:151-154; U.S. Patent NO. 4,138,479].

효모로부터의 β- 글루칸은 매크로파지의 새포막상에 특정수용체를 결합함에 의해서 면역계를 활성화시킨다. [참조문헌 Czop and Kay, "Isolation and Characterization of β-glucan Receptors on Human Mononuclear Phagocytes"(1991) J. Exp. Med. 173:1511-1520 ]. 활성화된 매크로파지는 다수의 사이토카인의 생성뿐만아니라 탐식능력 및 살균능력을 증가시키며, 이는 순차적으로 면역계의 다른 성분을 활성화시킨다 [참조문헌 Di Luzio et al. in "The Macrophage in Neoplasia", M. Fink, ed., 1976 Academic Press, New York, NY, pp 181-182].

자연상태에서 분리된 글루칸은 항전염성 및 항박테리아성 [Onderdonk et al., "Anti-infective effect of poly-β-1,6 glucotriosyl-β-1,3-glucopyranose glucan in vivo" (1992) Infection and Immunity, 60:1642-1647]; 항신생물성 [Mansell et al, "Macrophage mediated destruction of human malignant cells in vivo"(1975) Journal National Cancer Institute, 54:571-80]; 항종양성 [DeLuzio et al(1979) Advances in Experimental Medicine and Biology, 21A:269-290]; 및 항콜레스테롤혈증성(anti-cholesterolamemic) (예를들면, 미국특허 제3,081,226호 참조) 같은 변화된 생물학적 활성을 나타낸다

만난 및 만난단백질 복합체는 자연적으로 발생하는 다당류 복합체이며 효모류, 버섯, 식물 및 소수의 박테리아류, 지의류 및 해조류로부터 추출될 수 있다. 만난은 만노오스 중합체이며 총 세포벽 다당류 성분의 주요부분을 나타내며, 만난은 단백질과 공유결합으로 발견되며, 인산염 성분을 포함할 수 있다.

만난 및 만난단백질 분자는 장벽에 대장β균 (Escherichia coli) 같은 박테리아의 부착을 방지하는데 유익하므로, 동물에서 총체적인 감염가능성을 줄인다. 만난 및 만난단백질 복합체는 부가적 보호를 부가하며 병원체가 장에 부착하는 것을 방지함으로써 총체적인 감염가능성을 감소하므로, 동물은 감염을 확장시킬 가능성이 적어진다. 만난은 또한 면역계 세포에 의해서 β-글루칸을 포함하는 물질의 식균작용을 조정하는 것으로 밝혀졌다 [Giaimis et al (1993) Journal of Leukocyte Biology, 54, 564-571]. 그러므로, 만난 및 만난단백질 복합체는 또한 생체면역제로서 중요하고 면역증진제와 조합될 때 특히 유용할 수 있다.

효모에서의 베타 글루칸의 정제 및 용도에 관한 다수의 문헌이 있으며, 공정은 일반적으로 순수 제빵업자의 또는 양조자의 효모 또는 정제된 세포벽 및 다양한 온도에서 염기 및 산 추출물에 관련된 다양한 추출과정을 이용한다 [예를들면, Hassid et al(1941) Journal of the American Chemical Society, 63:295-298; Manners et al (1973), Biochem. J. 135:19-30 참조]. 효모세포로부터 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 추출하는 다수의 방법이 Jamas et al(미국특허 제4,810,646호; 제5,028,703호 ; 및 제5,250,436호), Donzis(미국특허 제5,223,491호), 및 Kelly(미국특허 제6,242,594호)에 의해 개시된 것을 포함하여 공지되어 있다.

상기 방법은 효모세포의 알칼리성 추출과 뒤이은 산추출 및 β-(1,3/1,6)-D-글루칸의 분리를 게시한다. 그러나, 상기 방법은 결과적으로 β-(1,3/1,6)-D-글루칸의 질 및 순도가 불일정하게 하며 생물학적 활성의 수치가 변화되게 된다. 또한, 상기 방법은 비활성화된 형태의 β-글루칸의 분해 및/또는 분리에 기인하여 보다 경제적인 대규모 회분식 공정에 적용하기 어렵다. 또한, 종래기술 방법은 동물건강에 이로울 수 있는 세포벽으로부터 추출된 만난 또는 만난단백질을 분리하기 보다 상기을 폐기한다.

미국특허 제6,444,448호(Wheatcroft)는 자기분해에 의한 비용해성 효모 β-글루칸-만난 복합체의 제조를 개시한다. 상기 공정은 β-글루칸, 만난 및 만난단백질을 포함하는 조성물을 산출한다. 그러나, 상기 조성물에서 만난 및 β-글루칸의 조합은 β-글루칸 생화학적 활성 감소 및 매크로파지의 활성화 감소를 유발한다.

또한, β-(1,3/1,6)-D-글루칸은 면역적격성 증진제(예를들면 미국특허 제4,138,479호; 제5,817,643호; 제6,444,448호; 및 제6,214,337호 참조) 및 성장촉진 항생제에 대한 대용물로서 잠재성을 보였으며, 일반적으로 종래기술방법의 불일정 한 수율 및 생화학적 활성때문에 보충용 지침을 확립하는 데 발전이 거의 없었다. 또한, β-글루칸을 분리하는 현 방법의 경우에서, 경제적 가능성이 문제점으로 남아있다.

본 발명의 목적은 천연 생체면역 추출물 제조공정 및 상기 추출물의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명은 세포 소스로부터 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 제조하는 공정을 제공하며, 상기 공정은 a) 세포 소스의 알칼리 추출, b) 물 추출, c) 산 추출, 및 d) 건조중량으로 최소 약 70% β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 포함하는 고형체 조성물을 제조하기 위한 물 추출을 포함한다.

물 추출의 최소 일 단계는 약 15 내지 약 30분의 시간범위당 약 100도의 온도까지 증기분사에 의한 저온살균을 포함한다. 상기 설명된 공정에서, 물 추출의 양단계는 저온살균을 포함한다.

상기 공정의 알칼리 추출단계(단계 a)는 세포 소스를 알칼리 용액으로 처리하는 단계 및 약 30분간 약 45 ℃ 내지 약 80 ℃의 범위에서 온도를 가열하는 단계를 포함할 수 있으며, 약 1psi 내지 약 25psi의 압력범위에서 약 15분 내지 약 120분의 시간범위동안 약 95 ℃ 내지 약 150 ℃의 온도범위까지 온도상승이 뒤따른다. 택일적으로, 알칼리 추출단계는 약 45분간 약 80 ℃의 온도까지 가열하는 단계를 포함할 수 있으며, 약 1psi 내지 약 25psi의 압력범위에서 약 30분간 약 121 ℃ 까지 온도상승이 뒤따른다.

전술한 공정의 알칼리 추출단계에서, 알칼리 용액은 세포 소소 대 알칼리 용액의 비가 약 1:5 내지 약 1: 15인 범위로 첨가되는 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토금속 수산화물 용액일 수 있다.

전술한 대로 공정의 물 추출단계(단계 b) 및 d))는 약 20 ℃ 내지 약 100 ℃의 온도범위에서 약 15분 내지 약 2.5시간의 시간범위 동안 약 1:4 내지 약 1:20인 고형체 대 물 범위에서 물을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 공정의 산 추출단계(단계 c)는 고형체 대 산성 용액의 비가 약 1:4 내지 약 1:20인 산성 용액으로 처리하는 단계를 포함할 수 있으며 약 15분 내지 약 2시간의 시간범위 동안 약 45 ℃ 내지 약 120 ℃ 의 온도범위까지 가열하는 단계를 포함할 수 있다.

전술한 대로의 공정에서, a) 내지 d)의 각 단계는 상기 처리된 물질을 액상 및 고상으로 분리하는 단계가 뒤따르며, 각각의 후속단계는 고상에서 수행된다.

택일적으로 처리된 물질의 분리가 뒤따르는 단계 a)의 순서는 1,2 또는 3번 수행될 수 있다. 다른 선택으로서 단계 c)내지 단계 d)의 순서가 1,2 또는 3번 수행될 수 있다. 전술한 공정은 단계 a) 이전에 약 15 내지 약 30분의 시간범위 동안 약 100 ℃ 의 온도범위까지 증기분사에 의한 세포 소소를 저온살균하는 선택적 단계를 포함할 수 있다.

전술한 공정은 빵 효모, 맥주 효모, 누룩 효모, 및 효모 세포벽 물질로 구성된 군으로부터 선택된 세포 소스 같은 임의의 적절한 세포 소스를 활용할 수 있다.

전술한 공정에서, 단계 a)로부터 얻어진 액상은 수집되고 화합될 수 있다.

본 발명은 또한 ℃세포 소스로부터 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 제조하는 공정을 제공하며, 상기 공정은

a) 약 15 내지 약 30분의 시간 범위동안 약 100 ℃의 온도까지 증기분사에 의한 효모의 저온살균단계와

b) 저온살균된 효모를 제1 액상 및 제1 고상으로 분리하는 단계와

c) 고형체 대 알칼리 용액의 비가 약 1:5 내지 약 1:15 인 범위에서 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 수산화물로 상기 제1 고상의 알칼리 추출하는 단계 및 약 30분간 약 45 ℃ 에서 약 80 ℃의 온도범위까지 가열하는 단계와

d) 알칼리 추출된 혼합물을 형성하기 위해서, 약 1psi 내지 약 25psi의 압력범위에서 약 15분 내지 약 120분의 시간범위 동안 약 95 ℃ 내지 약 150 ℃의 온도범위까지 온도를 증가시키는 단계와

e) 알칼리 추출된 혼합물을 제2 액상 및 제2 고상으로 분리하는 단계와

f) 물 추출된 혼합물을 형성하기 위해서, 약 20 ℃ 내지 약 100 ℃의 온도범위에서 약 15분 내지 약 2.5 시간의 시간범위 동안 고형체 대 물의 비가 약 1:4 내지 약 1:20인 범위에서 물로 제2 액상의 물 추출하는 단계와

g) 약 15분 내지 약 30분의 시간범위동안 약 100 ℃의 온도까지 증기분사에 의해 물 추출된 혼합물의 저온살균단계와

h) 물 추출된 혼합물을 제3 액상 및 제3 고상으로 분리하는 단계와

i) 산 추출된 혼합물을 형성하기 위해서, 고형체 대 산성 용액의 비가 약 1:4 내지 약 1:20인 범위에서 산성 용액으로 제3 고상의 산 추출하는 단계 및 약 15분 내지 약 2 시간의 시간범위 동안 약 45 ℃ 내지 약 120 ℃의 온도범위까지 가열하는 단계와

j) 상기 산 추출 혼합물을 제4 액상 및 제4 고상으로 분리하는 단계와

k) 물 추출된 혼합물을 형성하기 위해서, 약 20 ℃ 내지 약 100 ℃의 온도범위에서 약 15분 내지 약 2.5 시간의 시간범위 동안 고형체 대 물의 비가 약 1:4 내지 약 1:20인 범위에서 물로 제4 고상의 물 추출하는 단계와

l) 약 15 내지 약 30분의 시간 범위 동안 약 100 ℃의 온도까지 증기분사에 의한 물 추출 혼합물의 저온살균단계와

m) 물 추출된 혼합물을 최소 약 70% β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 포함하는 제5 고상 및 제5 액상으로 분리하는 단계를 포함한다.

전술한 공정에서, 단계 a) 내지 e)의 순서는 1,2 또는 3번 수행될 수 있다. 추가 선택단계로, 단계 i) 내지 m)은 1,2 또는 3번 수행될 수 있다.

전술한 공정은

ⅰ) 하나 이상의 일 알칼리 추출단계에서 얻어진 액상을 수집하는 단계와

ⅱ) 약 5.0 내지 약 8.0의 pH 범위에 단계ⅰ)의 액상의 pH를 산으로 조절하는 단계와

ⅲ) 약 15분 내지 약 30분 동안 약 100 ℃의 온도까지 증기분사에 의한 단계 ⅱ) 의 액상을 저온살균하는 단계와

ⅳ) 단계 ⅲ) 의 저온살균된 액상으로부터 만난 및 만난단백질을 분리하는 단계에 의한 만난 및 만난-단백질 복합체의 제조를 포함할 수 있다.

전술한 공정에서 분리단계(단계 ⅳ)는 침전 및 원심분리 또는 건조에 의해서 달성될 수 있다.

전술한 만난 및 만난-단백질의 제조공정은 최소 약 30% 만난 탄화수소류를 포함할 수 있는 단계 ⅳ)의 고상을 생산할 수 있다. 또한, ⅳ)에서 얻은 고상은 최소 약 5% 단백질을 포함할 수 있다.

본 발명은 전술한 공정에 의해 동물의 면역능력을 향상시키는데 효율적인 양으로 제조되는 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 포함하는 동물사료를 부가적으로 제공할 수 있다. 동물사료는 가금류, 돼지, (말, 소 및 갑각류 같은) 말종(equine species)로 구성된 군으로부터 선택된 동물용일 수 있다. 전술한 동물사료에서 β-글루칸의 유효량은 완전배합사료(complete feed)의 약 5 g / 1000 kg 내지 약 500 g / 1000 kg 의 범위일 수 있다. β-(1,3/1,6)-D-글루칸의 유효량은 동물의 형태에 기반하여 변화할 수 있다. 동물이 가금류인 경우, 유효량은 사료의 약 20 g / 1000 kg 내지 약 50 g / 1000 kg 의 범위일 수 있다. 동물이 돼지인 경우, 돼지의 성장주기 및 사용의 기간에 근거하여 사료의 약 20 g / 1000 kg 내지 약 500 g / 1000 kg 의 범위일 수 있다. 동물이 말인 경우, 유효량은 사료의 약 25 g / 1000 kg 내지 약 300 g / 1000 kg 의 범위일 수 있다. 동물이 새우인 경우, 유효량은 사료의 약 35 g / 1000 kg 내지 약 300 g / 1000 kg 의 범위일 수 있다.

본 발명은 전술한 공정에 의해 제조되는 β-(1,3/1,6)-D-글루칸의 유효량을 첨가하고 돼지에 동물사료를 공급함으로써 돼지에서의 항생체 형성을 강화시키는 방법을 부가적으로 제공한다.

본 발명은 또한 동물에서의 항생체 형성을 강화하고 일반적으로 백신을 투여함과 관련된 부정적 성장반응을 감소하는 방법을 제공하며, 이는 전술한 공정에 의해 제조되는 β-(1,3/1,6)-D-글루칸의 유효량을 동물사료에 첨가하는 단계 및 상기 동물사료를 동물에 공급하는 단계를 포함한다.

부가적으로, 본 발명은

a) 동물의 면역능력을 강화하는데 유효한 양으로 청구항 제1항 내지 제18항 중의 어느 한 공정에 의해 제조되는 β-(1,3/1,6)-D-글루칸

b) 동물의 장벽에 박테리아 유착을 억제하는데 충분한 양으로 청구항 제19항 내지 제22항 중의 어느 항에 의한 공정에 의해 제조되는 만난 및 만난-단백질을 포함하는 동물사료를 제공한다.

전술한 대로 동물사료에서 β-(1,3/1,6)-D-글루칸의양은 완전배합사료(complete feed)의 약 5 g / 1000 kg 내지 약 500 g / 1000 kg 의 범위일 수 있으며, 동물사료에서의 만난 및 만난-단백질의 양은 완전배합사료(complete feed)의 약 100 g / 1000 kg 내지 약 4000 g / 1000 kg 의 범위일 수 있다.

종래기술의 공정 및 방법과 대조하여, 본 발명은 β-(1,3/1,6)-D-글루칸, 만난 및 만난-단백질 복합체를 미생물학적 분해에서 보호하며 안정화 시키므로, 증가된 추출효율 및 고 수율을 낳는다. 이는 추출된 다당류 및 복합체의 일정한 품질 및 생물학적 활성을 보장한다. 글루칸 추출에서 알칼리 추출단계로부터 회수된 액상으로부터의 만난 및 만난-단백질 복합체는 또한 제조비용을 낮춘다. 사료첨가제로서 분리된 β-(1,3/1,6)-D-글루칸의 사용은 사육동물의 면역능력을 강화하고 항체 보충의 현 실상에 경제적인 선택을 제공한다. 본 방법에 의해 분리된 만난 및 만난-단백질 복합체는 대장균 같은 병원유기체가 창자에 부착됨을 방지함으로써 추가적인 보호를 부가하고 전반적인 감염위험성를 줄이기 위해서 상기 β-글루칸과 결합하여 사용될 수 있다.

본 발명에 의해 분리된 β-(1,3/1,6)-D-글루칸은 동물의 선천성 면역계를 활성화할 수 있슴을 보이며, 이는 개선된 질병관리를 가능케한다. 또한, 암돼지당 태어난 새끼돼지의 수 증가 및 새끼돼지의 후속 생존가능성의 증가 같은 부차적 건강 및 생산성 이점이 발견된다. 백신의 투여전에 본 발명에 따라서 제조된 β-글루칸으로 동물을 치료함은 동물에서 최종 항체 적정농도를 강화하고 반면에 일반적으로 백신의 사용에 기인한 부정적 성장조건을 감소하거나 방지함으로써 백신의 효율성을 증진할 수 있다. 또한 초유의 질이 강화될 수 있으므로 수동면역의 강화를 가져온다. 따라서, β-(1,3/1,6)-D-글루칸은 동물 (특히 사육된 동물)을 건강하고 적정속도로 성장하게 유지하기 위한 동물사료에서의 "성장촉진" 항생제를 감소 및/또는 대체할 수 있게 된다.

또한, 본 발명은 생물학적 활성의 양이 다양한 순도치에 직접 관계함을 성립시킨다. 또한, 다양한 동물실험에서 벨곡선 효과(bell curve effect)가 관찰되며 이는 가축 및 다른 동물에서의 면역조절을 위한 β-(1,3/1,6)-D-글루칸의 최적 사용이 큰 정량의 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 상요하는 종래기술 실행에 의해서 얻어질 수 없슴을 나타낸다.

본 발명의 요약은 본 발명의 모든 특징을 반드시 설명하지는 않는다.

도1은 본 발명에 의한 천연 생체면역 추출물 제조공정을 나타낸 일반적 흐름도이다.

도2a는 본 발명에 의한 천연 생체면역 추출물의 파수변화에 의한 투과율을 나타낸 도표이다.

도2b는 본 발명에 의한 천연 생체면역 추출물의 또다른 성질을 나타낸 도표이다.

도3은 시험물질과 상대적 형광을 비교한 도표이다.

다음의 설명은 바람직한 실시예이다.

본 발명은 세포 소스로부터 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 제조하는 공정을 제공하며, 상기 공정은 a) 세포 소스의 알칼리 추출, b) 물 추출, c) 산 추출, 및d) 건조중량으로 최소 약 70% β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 포함하는 고형체조성물을 제조하기 위한 물 추출을 포함한다.

물 추출의 최소 일 단계는 약 15 내지 약 30분의 시간범위당 약 100도의 온도까지 증기분사에 의한 저온살균을 포함한다.

용어 β-(1,3/1,6)-D-글루칸은 본 명세서에서 또한 β-글루탄으로 지칭되며, 이는 식물에만 제한되지 않고 균류 및 박테리아를 포함하는 다양한 유형의 세포의 세포벽에서 발견되는 폴리-(1,3)-β-D-글루코피라노실-(1,6)-β-D- 글루코피라노스를 의미한다. β-글루칸은 β-(1,6) 결합을 통해서 분자간 및 분자내부 분기를 갖는 β-(1,3)-연결된 글루코스 단위로 구성된다. β-글루칸은 세포벽에서 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 포함하는 세포 소스로부터 분리될 수 있다.

"세포 소스"는 당업계에 알려진 β-(1,3/1,6)-D-글루칸의 임의의 적절한 소스를 의미한다. β-글루칸은 균류, 식물 및/또는 박테리아 세포에 한정되지 않는 세포 소스로부터 분리될 수 있다. 본 발명의 공정에서 개시물질로서 사용되는 세포 소스는 당업계에 알려진 임의의 적절한 형태(예를들면 액체, 슬러리 또는 건조 파우더)일 수 있거나, 균류, 식물 및/또는 박테리아로부터 얻은 세포벽 물질일 수 있다. 비한정적 예로서, 세포 소스는 살아서 생존가능한 또는 비생존성으로 소비될 수 있는 효모이다. 사용되는 효모 또는 다른 균성 균주는 자연적 발생하는 균주(strain)일 수 있거나, 유전적으로 공학설계된 균주일 수 있다. 당업계에 알려진 임의의 적합한 효모 또는 균성 균주는 예를들면 제한하려는 의도는 아니지만, (Saccharomyces spp, Shizophyllum spp, Pichia spp, Hansenula spp, Candida spp, Torulopsis spp, 및 Kluyveromyces spp)이다. 상기의 특정예는 (Saccharomyces cerevisiae , Saccharomyces delbrueckii , Saccharomyces rosei , Saccharomyces microellipsodes, Saccharomyces carlsbergensis , Saccharomyces bisporus , Saccharomyces fermentati , Saccharomyces rouxii , Saccharomyces uvarum , Shizophyllum pombs , Kluyveromyces polysporus , Candida albicans , Candida cloacae, Candida tropicalis , Candida utilis , Hansenula wingei , Hansenula arni, Hansenula henricii , Hansenula americana, Hansenula canadiensis , Hansenula capsulata , Hansenula polymorpha , Kluyveromyces fragilis , Pichia kluyveri, Pichia pastoris , Pichia polymorpha , Pichia rhodanensis , Pichia ohmeri, Torulopsis bovina , 및 Torulopsis glabrata )에 제한되지 않고 상기를 포함한다. 세포질소스로서 제빵업자 또는 양조자의 효모에 존재하는 Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces delbrueckii , Saccharomyces carlsbergensis , 및/또는 Saccharomyces rouxii 가 중요한데, 이는 생존가능한 살아있는 또는 소비된 비생존가능 형태일 수 있으며, 양조장 또는 다른 적절한 벤더로부터 직접 얻을 수 있다.

특정한, 비한정적 예에서, 소비된 Saccharomyces cerevisiae 효모가 본 발명의 공정에서 활용될 수 있다.

세포 소스로부터 β-(1,3/1,6)-D-글루칸의 제조는 당업계에 알려진 알칼리 추출, 물 추출, 및 산 추출의 임의의 적절한 방법에 의해서 진행될 수 있으며, 이의 특정조건은 당업자에 의해서 정해질 수 있다. 상기 추출방법은 예를들면 제한하려는 의도는 아니지만, Hassid et al.(1941, Journal of the American Chemical Society, 63:295-298), Manners et al.(1973, Biochem. J. 135, 19-30), Jamas et al. (미국특허 제 4,810,646호; 제5,028,703호; 및 제5,250,436호), Donzis (미국특허 제 5,223,491호), 및 Kelly (미국특허 제6,242,594호)에 의해서 설명되고, 상기 모두는 본 명세서에서 전체로 참조로서 포함된다. 본 발명의 공정에 적합한 조건의 일 비한정적 예가 하기에서 설명된다.

용어 "알칼리 추출"(단계 a)은 만난 및 만난-단백질을 포함하는 비β-글루칸 성분을 용해 및/또는 추출하기 위해서 알칼리 및 열로 세포 소스를 처리함을 지칭하며, 세포가 세포 소스로 사용되는 경우, 알칼리 추출은 세포분해에 영향을 미칠 수 있다. β-(1,3/1,6)-D-글루칸의 세포 소스는 알칼리 용액과 결합되며, 결과적인 세포 소스-알칼리 용액 혼합물은 교반될 수 있다. 용어 "교반"은 당업계에 알려진 임의의 적절한 물리적 휘저음을 지칭한다. 예를들면, 제한하려는 의도는 아니지만, 혼합물은 교반장치 또는 유화용 펌프에 의해 교반될 수 있다.

알칼리 용액은 당업계에 알려진 임의의 적절한 유형인 강 알칼리 용액(예를들면, 제한하려는 의도는 아니지만, 알칼리금속 수산화 용액 또는 알칼리토금속 수산화 용액)일 수 있다. 알칼리 용액의 특히 비한정적적 예는 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 수산화 칼슘 및 수산화 리튬이다. 예를들면, 알칼리 용액은 수산화 나트륨일 수 있다. 알칼리 용액은 예를들면 0.5 N 내지 5 N 의 범위안 임의의 적절한 농도 (예를들면 약 0.5N, 0.7N, 1.0N, 1.2N, 1.5N, 1.7N, 2.0N, 2.2N, 2.5N, 2.7N, 3.0N, 3.2N, 3.5N, 3.7N, 4.0N, 4.2N, 4.5N, 4.7N, 5.0N 사이의 임의의 농도이거나, 명세서에서 개시된 임의의 두 농도사이에 정의된 범위에서의 농도)일 수 있다. 알칼리 용액은 일반적으로 세포 소소 대 알칼리 용액의 비가 약 1:3 내지 약 1:15인 범위에서 또는 예를들면 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14 또는 1:15인 범위에서 또는 본 명세서에 개시된 임의의 두개의 비율에 의해 정해진 범위 사이 임의의 범위에서 세포 소스에 첨가된다. 세포 소스 알칼리 용액 혼합물의 최종 pH 범위는 일반적으로 약 8 내지 약 14 이거나 상기 사이 임의의 pH 이다(예를들면, 세포 소스- 알칼리 용액 혼합물의 최종 pH는 약 8,9,10,11,12,13 또는 14이거나 본 명세서에서 개시된 임의의 두 개의 pH에 의해 정의된 pH 범위이다. 비한정적 예에서, 세포 소스- 알칼리 용액 혼합물의 pH 범위는 약 12 내지 약 14이다.

세포 소스- 알칼리 용액 혼합물은 이후 약 30 분 내지 약 240 분의 시간범위 동안 또는 상기 사이 임의시간 동안 약 45 ℃ 내지 약 120 ℃의 온도범위까지 가열된다. 예를들면, 세포 소스-알칼리 용액 혼합물은 약 45℃, 50 ℃, 55 ℃, 60 ℃, 65 ℃, 70 ℃, 75 ℃, 80 ℃, 85 ℃, 90 ℃, 95 ℃, 100 ℃, 105 ℃, 110 ℃, 115 ℃, 120 ℃의 온도 또는 본 명세서에서 개시된 임의의 두 개의 온도조합에 의해 정의된 임의의 온도범위까지 약 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 230, 235, 240 분 또는 본 명세서에 개시된 임의의 두 개의 시간에 의해 정의된 시간범위 길이동안 가열된다. 예를들면, 임의의 방식으로 제한하려는 의도는 아니지만, 세포 소스-알칼리 용액 혼합물은 약 30 분 내지 약 60 분의 시간범위 동안 약 45 ℃ 내지 약 80 ℃의 온도범위까지 가열될 수 있다. 추가 비한정적 예에서, 세포 소스-알칼리 용액 혼합물은 약 45 분의 시간범위 동안 약 45 ℃ 의 온도범위까지 가열될 수 있다. 상기 가열단계 동안, 세포 소스-알칼리 용액 혼합물은 전술한 대로 교반될 수 있다.

혼합물이 가열되는 온도와 함께 알칼리 용액의 농도가 반응시간에 역으로 영향을 미침을 당업자는 이해할 것이다. 예를들면, 알칼리 용액의 농도 및/또는 온도가 높을수록 반응시간은 짧아질 수 있다. 세포 소스-알칼리 용액 혼합물의 가열은 압력증가를 유발할 수 있슴은 당업자가 이해할 것이다. 일반적으로 및 제한하려는 의도는 아니면서, 압력은 약 0 내지 25 psi, 또는 상기 사이 임의의 범위로 증가할 수 있다; 예를들면, 압력은 약 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 psi 또는 본 명세서에서 개시된 임의의 두 개의 압력의 조합에 의해 정의된 범위에서의 압력까지 증가할 수 있다.

알칼리 추출은 또한 세포 소스-알칼리 용액 혼합물의 온도를 증가시키는 단계 및 압력을 증가시키는 단계를 포함하는 제2 단계를 포함할 수 있다. 세포 소스-알칼리 용액 혼합물의 온도는 약 15 분 내지 약 240 분의 시간범위 동안 또는 상기 사이 임의의 시간 범위동안 약 1psi 내지 약 25 psi 의 압력에서 약 95 ℃ 내지 약 150 ℃ 의 온도범위까지 또는 상기 사이의 임의의 온도범위까지 가열될 수 있다. 예를들면, 온도는 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 또 는 240 분 또는 본 명세서에서 개시된 임의의 두 개의 시간의 조합으로 정의된 시간동안 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 psi 또는 본 명세서에서 개시된 임의의 두 개의 압력의 조합에 의해 정의된 범위에서의 압력에서 약 95℃, 100℃, 105℃, 110℃, 115℃, 120℃, 125 ℃, 130℃, 135℃, 140℃, 145℃, 150℃ 온도 또 는 본 명세서에서 개시된 임의의 두 개의 온도의 조합으로 정의된 온도까지 증가할 수 있다. 예를들면, 임의의 방식으로 제한하려는 의도는 아니면서, 온도는 약 15 분 내지 약 120 분의 시간범위 동안 약 1psi 내지 약 25 psi 의 압력범위에서 약 95 ℃ 내지 약 150 ℃ 의 온도범위까지 가열될 수 있다. 다른 비한정 예에서, 온도는 약 30 분 동안 약 1 psi 내지 약 15 psi 의 압력범위에서 약 121 ℃ 의 온도범위까지 가열될 수 있다. 상기 가열단계동안, 세포 소스-알칼리 용액 혼합물은 전술한 대로 교반될 수 있다.

또한, 당업자는 혼합물이 가열되는 온도와 함께 알칼리 용액의 농도가 반응시간에 역으로 영향을 미칠 것임을 이해할 것이다. 예를들면, 알칼리 용액의 농도 및/또는 온도가 높을수록 반응시간은 짧아질 수 있다.

전술한 대로 알칼리 추출의 방법은 알칼리 추출 혼합물을 발생시킨다. 알칼리 추출된 혼합물 또는 풀(pool)된 알칼리 추출 혼합물은 이후에 분리된다.

용어 "분리된" 또는 "분리" 는 문제의 혼합물이 액체 및 고형체성분으로 나누어짐을 의미한다. 액체 및 고형체성분은 또한 "액상" 및 "고상"으로 본 명세서에서 지칭될 수 있다. 당업계에 알려진 임의의 적절한 분리방법이 사용될 수 있다. 예를들면, 임의의 방식으로 제한하려는 목적은 아니지만, 고형체및 액체 성분은 원 심분리, 여과, 막 여과 또는 역삼투압에 의해서 분리될 수 있다. 특히, 비한정예로서, 상기 혼합물은 원심분리에 의해 분리될 수 있다.

알칼리 추출 혼합물의 분리후에 얻어진 액상인 "알칼리 추출 액상"은 거의 세포 소스의 알칼리 용해성 비목적된 β-글루칸 성분 및 비β-글루칸성분을 포함한다. 알칼리 추출 액상은 수집되고 풀(pool)되고, 하기에서 설명한 대로 만난 및 만난-단백질을 얻기 위해서 추가 처리될 수 있다. 알칼리 추출 후에 얻어진 고상인 "알칼리 추출 고상"은 β-글루칸을 포함한다.

당업자는, 선택적으로, 알칼리 추출의 반복된 순환이 "신" 세포 소스 물질에서 수행될 수 있다. "신" 물질은 이전에 알칼리 추출에 따르지 않았던 세포 소스를 의미한다. 예를들면, 임의의 방식으로 제한하려는 의도는 아니면서, 알칼리 추출은 1 내지 20번 수행될 수 있거나, 상기 사이 임의의 반복량으로 수행될 수 있다. 예를들면, 알칼리 추출은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 번 또는 본 명세서에 개시된 임의의 두 개의 숫자범위에 의해 정의된 임의의 반복량으로 반복될 수 있다. 제한하려는 의도는 아니면서, 알칼리 추출단계는 예를들면 1, 2, 3번 수행될 수 있다. 알칼리 추출단계가 신 세포 소스 물질에서 수행될 경우에, 알칼리 추출의 각 순환으로부터의 알칼리 추출 고상은 풀(pool)된다.

알칼리 추출의 연속적 순환이 요구한 대로 알칼리 비목적된 β-글루칸 성분 및 비β-글루칸 성분을 제거를 증가시키기 위해서 선택적으로 수행될 수 있슴을 당업자는 또한 인식할 것이다. 상기 경우에, 알칼리 추출은 알칼리 추출 고상 또는 풀(pool)된 알칼리 추출 고상에서 수행될 수 있다. 예를들면, 임의의 방식으로 제한하려는 의도는 아니면서, 알칼리 추출은 1 내지 20번 또는 이 사이 임의의 적절한 반복량으로 성공적으로 수행될 수 있다. 예를들면, 알칼리 추출은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 번 또는 본 명세서에 개시된 임의의 두 개의 숫자범위에 의해 정의된 임의의 반복량으로 반복될 수 있다. 제한하려는 의도는 아니면서, 알칼리 추출단계는 예를들면 1, 2, 3번 수행될 수 있다. 알칼리 추출의 연속 순환이 알칼리 추출 고상에서 β-글루칸의 순도를 증가시킴은 당업자가 이해할 것이다. 그러나, 공정의 총비용은 알칼리 추출의 각 연속 순환에 대하여 증가한다. 그러므로, 당업자는 알칼리 추출의 수 및 공정의 경제적 실행가능성 간의 균형을 고려해야 한다.

알칼리 추출 고상 또는 풀(pool)된 알칼리 추출 고상은 이후 물 추출(단계 b)하게 된다. 당업계에서 "물 세척(water wash)"으로서 또한 알려진 용어 "물 추출(water extraction)"은 임의의 잔여 비β-글루칸 성분을 제거하기 위해서 물로 고체성분을 세척함을 가리킨다. 물 세척단계는 또한 알칼리 추출 고상의 pH 를 낮추는데 조력한다. 물 추출단계는 당업계에 알려진 임의의 적절한 방법에 의해서 수행될 수 있다. 예를들면, 임의의 방식으로 제한하려는 의도는 아니면서, 고형체성분은 고체성분 대 물의 비율이 약 1:4 내지 약 1:20인 범위에서 또는 상기 사이 임의의 비율에서 물에 재현탁(resuspend)될 수 있다. 예를들면, 물은 약 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20 인 고체성분 대 물의 비율에서 또는 본 명세서에서 개시된 임의의 두 개의 비율에 의해 정의된 범위에서 첨가될 수 있다. 재현탁된 고상은 약 15 분 내지 약 240 분의 시간 동안 약 20 ℃ 내지 약 100 ℃ 의 온도범위 또는 상기 사이 임의의 온도범위까지 가열된다. 예를들면, 재현탁된 고상은 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 또는 240 분 또는 본 명세서에서 개시된 임의의 두 개의 시간의 조합으로 정의된 시간동안, 약 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃, 85℃, 90℃, 95℃, 100℃ 또는 본 명세서에서 개시된 임의의 두 개의 온도의 조합에 의해 정의된 온도까지 가열될 수 있다. 예를들면, 제한하려는 의도는 아니지만, 재현탁된 고상은 약 15 분 내지 약 150 분의 시간범위 동안 약 20 ℃ 내지 약 100 ℃ 의 온도범위까지 가열될 수 있다. 추가 비한정예에서, 재현탁된 고상은 약 30 분간 약 20 ℃ 내지 약 60 ℃ 의 온도범위까지 가열될 수 있다.

혼합물이 가열되는 온도는 반응시간에 역으로 영향을 미친다는 것은 당업자에게 이해될 것이다. 예를들면, 알칼리 용액의 농도 및/ 또는 온도가 높을수록, 반응시간은 짧아질 수 있다. 물 추출동안, 재현탁된 고체는 전술한 대로 당업계에 잘 알려진 임의의 적절한 방법에 의해서 교반될 수 있다. 물 추출은 물 추출 혼합물을 생성한다.

이후에 물 추출 혼합물은 전술한 방식으로 액상 및 고상으로 분리도니다. 물 추출 혼합물의 액상은 일반적으로 폐기되며, 고상은 산 추출을 위해 존속된다.

당업자에게 명백하듯이, 물 추출의 연속 순환은 모든 효모 고체가 분리될 때까지 요구되는 대로 택일적으로 수행될 수 있다. 상기 경우에, 물 추출은 물 추출 고상에서 수행될 수 있다. 예를들면, 임의의 방식으로 제한하려는 의도는 아니면서, 물 추출은 1 내지 10 번 연속적으로 또는 상기 사이 임의의 반복량으로 요구된 대로 수행될 수 있다. 예를들면, 물 추출은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 번 또는 본 명세서에서 개시된 임의의 두 개의 수의 범위에 의해 정의된 반복량으로 수행될 수 있다. 제한하려는 의도는 아니면서, 알칼리 추출단계는 예를들면 1, 2, 3번 수행될 수 있다. 그러나, 물세척의 수 및 공정의 경제적 실행가능성간 균형이 있다. 연속적 물세척 단계로부터 발생하는 고상은 이후에 산 추출(단계 c)를 따른다.

용어 "산 추출", "산성 추출", 또는 "산 추출함"은 산으로 물 추출된 혼합물의 고상을 처리하는 것 및 다른 다당질/설탕 및 몇몇 지질에 제한되지 않고 이를 포함하는 임의의 잔여 비대상된 β-글루칸 성분 및 비 β-글루칸 성분을 용해 및/또는 추출하기 위해서 가열하는 것을 지칭한다. 물 추출된 혼합물의 고상은 고상-산성 용액 혼합물을 형성하기 위해서 산성 용액과 결합되어서 교반될 수 있다. 교반은 전술한 대로 당업계에서 알려진 임의의 적절한 방법일 수 있다.

산성 용액은 당업계에서 알려진 임의의 적절한 유형의 산성 용액일 수 있다(예를들면, 제한하려는 의도는 아니지만, 임의의 약산성 용액). 산 추출에서의 용도용 주요한 물질중 하나는 아세트산이다. 산성 용액은 임의의 적절한 농도일 수 있다. 예를들면, 2 % 내지 10% (v/v)의 범위 또는 상기 사이 임의의 농도범위일 수 있다. 예를들면, 산성 용액은 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, 또는 10% (v/v) 산성 용액, 또는 본 명세서에 개시된 임의의 두 개의 농도사이에 정의된 범위의 농도일 수 있다. 비한정적 예에서, 산성 용액은 3% 용액이다. 산성용액은 일반적으로 고체성분 대 용액의 비율이 약 1:4 내지 약 1:20인 범위에서 또는 상기 사이 임의의 비율에서 물 추출된 혼합물의 고상에 첨가될 수 있다. 예를들면, 산성 용액은 약 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20 인 고체성분 대 산성 용액의 비율에서 또는 본 명세서에서 개시된 임의의 두 개의 비율에 의해 정의된 범위의 비율에서 고상에 첨가될 수 있다. 비한정적 예에서, 산성 용액은 1:10 인 고체성분 대 산성 용액의 비율에서 첨가된다.

고상-산성 용액 혼합물의 최종 pH의 범위는 일반적으로 약 2 내지 약 5 이거나 상기 사이 임의의 pH 이다 (예를들면, 세포 소스- 알칼리 용액 혼합물의 최종 pH는 약 2,3,4 또는 5이거나 본 명세서에서 개시된 임의의 두 개의 pH에 의해 정의된 pH 범위이다. 비한정적 예에서, 고상-산성 용액 혼합물의 pH 범위는 약 3 내지 약 4이거나, 추가예에서 약 4이다.

고상-산성 용액 혼합물은 이후 약 15 분 내지 약 120 분의 시간범위 동안 또는 상기 사이 임의시간 동안 약 45 ℃ 내지 약 120 ℃의 온도범위까지 가열된다. 예를들면, 고상-산성 용액 혼합물은 약 45℃, 50 ℃, 55 ℃, 60 ℃, 65 ℃, 70 ℃, 75 ℃, 80 ℃, 85 ℃, 90 ℃, 95 ℃, 100 ℃, 105 ℃, 110 ℃, 115 ℃, 120 ℃의 온도 또는 본 명세서에서 개시된 임의의 두 개의 온도조합에 의해 정의된 임의의 온도범위까지, 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120 분 또는 본 명세서에 개시된 임의의 두 개의 시간에 의해 정의된 시간범위 동안 가열된다. 예를들면, 임의의 방식으로 제한하려는 의도는 아니지만, 고상-산성 용액 혼합물은 약 15 분 내지 약 60 분의 시간범위 동안 약 45 ℃ 내지 약 80 ℃의 온도범위까지 가열될 수 있다. 추가 비한정적 예에서, 고상-산성 용액 혼합물은 약 60 분의 시간범위 동안 약 80 ℃ 의 온도범위까지 가열될 수 있다.

혼합물이 가열되는 온도와 함께 산성 용액의 농도가 반응시간에 역으로 영향을 끼침을 당업자는 이해할 것이다. 예를들면, 산성 용액의 농도 및/또는 온도가 높을수록 반응시간은 짧아질 수 있다. 고상-산성 용액 혼합물의 가열은 압력증가를 유발할 수 있슴은 당업자가 이해할 것이다. 일반적으로 및 제한하려는 의도는 아니면서, 압력은 약 0 내지 25 psi, 또는 상기 사이 임의의 범위로 증가할 수 있다; 예를들면, 압력은 약 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 psi 또β는 본 명세서에서 개시된 임의의 두 개의 압력의 조합에 의해 정의된 범위에서의 압력까지 증가할 수 있다.

상기에서 설명한 산 추출 방법은 산 추출 혼합물을 생산할 것이다. 산 추출 혼합물은 이후에 설명한 대로 분리된다. 산 추출 혼합물의 분리후에 얻어진 액상은 폐기된다. 산 추출후에 얻어진 고상, "산 추출 고상"은 β-글루칸을 포함한다.

당업자는, 선택적으로, 산성 추출의 반복된 순환이 이전에 산 추출에 제공되지 않은 물 추출 고상에서 수행될 수 있다. 예를들면, 임의의 방식으로 제한하려는 의도는 아니면서, 산 추출은 1 내지 20번 수행될 수 있거나, 상기 사이 임의의 반복량으로 수행될 수 있다. 예를들면, 산 추출은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 번 또는 본 명세서에 개시된 임의의 두 개의 숫자범위에 의해 정의된 임의의 반복량으로 반복될 수 있다. 제한하려는 의도는 아니면서, 산 추출단계는 예를들면 1, 2, 3번 수행될 수 있다. 산 추출단계가 이전에 산 추출에 제공되지 않은 물 추출된 고상에서 수행될 경우에, 산 추출의 각 순환으로부터의 산 추출된 고상은 풀(pool)된다.

산 추출의 연속적 순환이 요구한 대로 비(非)β-글루칸 성분을 제거하기 위해서 선택적으로 수행될 수 있슴을 당업자는 또한 인식할 것이다. 상기 경우에, 산 추출은 산 추출된 고상 또는 풀(pool)된 산 추출된 고상에서 수행될 수 있다. 예를들면, 임의의 방식으로 제한하려는 의도는 아니면서, 산 추출은 1 내지 20번 또는 이 사이 임의의 적절한 반복량으로 성공적으로 수행될 수 있다. 예를들면, 산 추출은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 번 또는 본 명세서에 개시된 임의의 두 개의 숫자범위에 의해 정의된 임의의 반복량으로 반복될 수 있다. 제한하려는 의도는 아니면서,산 추출단계는 예를들면 1, 2, 3번 수행될 수 있다. 산 추출의 연속 순환이 산 추출된 고상에서 β-글루칸의 순도를 증가시킴은 당업자가 이해할 것이다. 그러나, 공정의 총비용은 알칼리 추출의 각 연속 순환에 대하여 증가한다. 그러므로, 당업자는 알칼리 추출의 수 및 공정의 경제적 실행가능성 간의 균형을 고려해야 한다.

산 추출된 고상 또는 풀(pool)된 산 추출 고상은 이후에 물 추출(단계 d)에 제공된다. 산 추출된 고상 또는 풀(pool)된 산 추출 고상의 물 추출은 상기에 설명한 조건하에서 진행할 수 있으며 물 추출된 혼합물을 생산한다. 물 추출된 혼합물은 이후에 상기에 설명한 방법에 의해 액상 및 고상으로 분리된다. 물 추출된 혼합물의 액상은 일반적으로 폐기되며, 고상은 유지된다. 이전에 설명한 대로 및 당업자에게 자명하듯이, 물 추출은 요구된 대로 모든 효모 고형체가 분리될 때까지 선택적으로 반복될 수 있다. 반복수행되는 물 추출의 경우에, 물 추출에서 결과발생된 고상은 풀(pool)된다.

본 발명의 방법에서, 상기 설명한 알칼리 추출, 산 추출 및 물 추출에 대한 조건 또는 종래기술 조건에 의해서 최소 하나의 물 추출 단계는 분리전에 하나의 저온살균단계를 포함한다. 예를들면, 알칼리 추출단계(단계 a)에 뒤이은 물 추출단계(단계 b)는 저온살균을 포함할 수 있으며, 산 추출단계(단계 c)에 뒤이은 물 추출단계(단계 d)는 저온살균을 포함할 수 있거나, 또는 알칼리 추출단계에 뒤이은 물 추출단계(단계 b) 및 산 추출단계에 뒤이은 물 추출단계(단계 d) 모두는 저온살균을 포함할 수 있다.

용어 "저온살균" 또는 "저온살균하다"는 혼합물을 안정화하기 위해서 물에 재현탁되는 고형체의 처리를 의미하며, β-(1,3/1,6)-D-글루칸의 미생물 분해를 최소화한다. 저온살균은 당업계에서 알려진 임의의 방법에 의해서 행해질 수 있다 (예를들면, 제한하려는 의도는 아니지만, 스팀재킷을 사용하여 직접 증기분사 또는 간접 증기분사). 예를들면, 제한하려는 의도는 아니면서, 물 추출된 혼합물의 저온살균은 약 15 분 내지 약 240 분의 시간범위 동안 또는 상기 사이 임의시간 동안 약 75 ℃ 내지 약 100 ℃의 온도까지 발생할 수 있다. 예를들면, 물 추출된 혼합물의 저온살균은 약 75 ℃, 80 ℃, 85 ℃, 90 ℃, 95 ℃, 100 ℃ 또는 본 명세서에서 개시된 임의의 두 개의 온도조합에 의해 정의된 임의의 온도범위까지, 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 230, 235, 240 분 또는 본 명세서에 개시된 임의의 두 개의 시간에 의해 정의된 시간동안 발생할 수 있다. 제한하려는 의도는 아니지만, 저온살균은 약 15 분 내지 약 30 분의 시간범위 동안 약 85 ℃ 내지 약 100 ℃의 온도까지 발생할 수 있다. 추가 비한정적 예에서, 저온살균은 약 20 분간 약 100 ℃ 의 온도까지 발생할 수 있다.

혼합물이 가열되는 온도가 반응시간에 역으로 영향을 미침을 당업자는 이해할 것이다 (예를들면, 온도가 높을수록, 반응시간이 짧아질 수 있다).

물 추출된 혼합물이 저온살균된 후에 액상 및 고상으로의 혼합물의 분리가 전술한 대로 진행할 수 있다.

선택적으로, 알칼리 추출단계, 산 추출단계, 또는 알칼리 및 산 추출단계에 뒤이은 저온살균된 물 추출된 혼합물은 분리 전에 약 2기간 내지 약 7일간 또는 상기 사이 임의의 시간량 동안 전술한 대로 당업계에 알려진 적절한 방법에 의해 교반될 수 있다. 예를들면, 저온살균된 물 추출된 혼합물은 약 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 22시간, 1일, 1.5일, 2일, 2.5일, 3일, 3.5일, 4일, 4.5일, 5일, 5.5일, 6일, 6.5일, 7일 또는 본 명세서 에서 개시된 임의의 두 개의 범위량에 의해 정의된 시간량 동안 교반될 수 있다.

비한정적 예에서, 물 추출된 혼합물은 주위온도에서 약 2 시간 내지 2일간 교반될 수 있다. 분리전에 저온살균된 물 추출된 혼합물의 교반은 분리공정으로부터 저온살균된 물 추출 혼합물이 축적되게 하므로, 최종 분리공정이 대규모로 진행할 수 있다. 물 추출된 혼합물이 저온살균되기 때문에, β-글루칸 성분의 분해가 방지되거나 최소화된다.

또다른 선택단계에서, 전술한 발명의 공정은 사전처리단계를 또한 포함할 수 있다. 예를들면, 세포 소스는 알칼리 추출단계(단계 a) 이전에 저온살균에 의해 사전처리될 수 있다. 상기 경우에, 세포 소스는 효모 슬러리, 크림, 팩처리된 효모케이크로서 제공될 수 있다. 슬러리, 크림, 또는 효모 케이크는 약 15 % 내지 80 % 고형체함량 또는 상기 사이 임의량의 고형체함량을 포함할 수 있다 (예를들면, 슬러리는 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 고형체또는 개시된 임의의 두 개의 퍼센트의 조합에 의해 정의된 범위에서의 임의 %의 고체를 포함할 수 있다). 비한정적 예에서, 슬러리는 약 60% 내지 약 70% 고체범위의 고형체함량을 포함할 수 있다. 사전처리단계에서의 저온살균은 전술한 대로 일반적으로 수행되며, 물 추출단계가 선택적으로 뒤따를 수 있다.

전술한 공정인 단계 d)에서 얻어진 물 추출된 혼합물의 분리는 건조중량으로 최소 약 70 % 내지 약 98% 범위 또는 상기 사이 임의 % 범위인 β-(1,3/1,6)-D-글루칸 퍼센트를 포함하는 고체성분을 산출한다 (예를들면, 고체성분은 건조중량으로 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%,76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% β-(1,3/1,6)-D-글루칸, 또는 본 명세서에서 개시된 임의의 두 개의 퍼센트의 조합에 의해 정의된 범위의 임의 퍼센트 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 포함할 수 있다). 비한정적 예에서, 고체성분은 건조중량으로 약 70 % 내지 약 90% β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 포함하며, 추가예로서, 건조중량으로 80% β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 포함할 수 있다.

본 공정에 의해 제조된 최종 β-(1,3/1,6)-D-글루칸 조성물은 택일적 보체 활성화 실험 (National Jewish Medical & Research Center, Denver, CO)에 의해 결정되는 것으로서 β-(1,3/1,6)-D-글루칸의 mg 당 배출된 최소 약 30 ㎍ Bb 의 생물학적 활성 또는 상기 사이 임의의 활성을 갖는다. 예를들면, β-(1,3/1,6)-D-글루칸 조성물은 β-(1,3/1,6)-D-글루칸의 mg 당 배출된 최소 약 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45,46, 47, 48, 49, 또는 50㎍ Bb 또는 본 명세세에서 개시된 임의의 두개의 활성에 의해 정의된 범위의 활성을 갖을 수 있다. 특히,비한정적 예로서, 최종 β-(1,3/1,6)-D-글루칸 조성물은 β-(1,3/1,6)-D-글루칸의 mg 당 배출된 최소 약 40 ㎍ Bb 의 생물학적 활성을 갖는다.

최종 분리단계 이후에, 고체성분은 당업계에 알려진 적절한 방법에 의해 건조될 수 있다. 용어 "건조"는 물(수분) 또는 용매의 제거를 지칭한다. 고체성분의 건조는 최종 β-글루칸 제품을 산출하며 당업계에 알려진 적절한 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를들면, 임의방식으로 제한하려는 의도는 아니면서, 고체성분은 동결건조(lyophilization), 가열, 공기건조, 드럼건조, 분무건조, 적외선 건조, 마이 크로파 또는 전파에 의한 건조, 복사열에 의한 건조 또는 임의의 적절한 방법에 의해 건조될 수 있다. 비한정적 예로서, 고체성분은 분무건조에 의해 건조될 수 있다.

최종 고체성분은 약 10% 미만 또는 상기 사이 임의의 퍼센트의 습도 함량까지 건조될 수 있다 (예를들면, 최종 생산물의 습도함량은 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10% 이하, 또는 본 명세서에서 개시된 두 개의 퍼센트의 조합에 의해 정의된 범위에서의 임의 습도함량일 수 있다. 특히, 비한정적 예로서, 최종 생산물의 습도함량은 약 10 % 이하의 습도함량을 갖을 수 있다.

건조된 최종 생산물인 β-(1,3/1,6)-D-글루칸 조성물은 약 7 ㎛ 이하인 평균 직경을 갖는 입자를 포함하는 파우더(powder)이다 (예를들면, 평균입자크기는 약 7㎛, 6.5㎛, 6㎛, 5.5㎛, 5㎛, 4.5㎛, 4㎛, 3.5㎛, 3㎛, 2.5㎛, 2㎛, 1.5㎛, 1㎛ 일 수 있거나, 본 명세서에서 개시된 두 개의 임의크기의 조합에 의해 정의된 범위에서의 임의 크기일 수 있다. 상기 파우더는 원하는 크기의 입자를 얻기위해서 추가로 처리될 수 있다. 예를들면, 제한하려는 의도는 아니지만, 상기 파우더는 해머밀링(hammer milling) 또는 볼밀링(ball milling)에 의해서 분쇄될 수 있다.

건조된 최종 β-(1,3/1,6)-D-글루칸 조성물은 안정할 수 있으며, 밀봉된 용기에서 약 15 ℃ 내지 약 25 ℃의 범위 온도에서 저장될 때 최소 약 12달의 저장수명을 갖을 수 있다. 예를들면, 본 발명의 β-글루칸의 저장수명은 약 15 ℃, 16 ℃, 17 ℃, 18 ℃, 19 ℃, 20 ℃, 21 ℃, 22 ℃, 23 ℃, 24 ℃, 또는 25 ℃의 온도에서 또는 본 명세서에서 개시된 두 개의 온도의 조합에 의해 정의된 범위에서의 임의 온도에서 저장될 때, 최소 약 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 달 또는 본 명세서에서 개시된 두 개의 시간의 조합에 의해 정의된 범위에서의 임의 저장수명일 수 있다. 비한정적 예로서, 최종 β-글루칸 조성물은 밀봉된 용기에서 약 20 ℃ 내지 약 25 ℃의 범위 온도에서 저장될 때 최소 약 24달의 저장수명을 갖는다. 밀봉된 용기는 당업계에 알려진 임의의 적절한 용기일 수 있다 (예를들면, 제한하려는 의도는 아니지만, 예를들면 습도와 접촉을 방지하는 플라스틱등 임의의 적절한 재료로 제조된 용기 또는 백(bag)일 수 있다.

본 발명은 또한 세포 소스로부터 만난 및 만난-단백질 복합체를 생산하는 공정을 제공할 수 있는데, 이는

ⅰ) 전술한 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 제조하는 공정의 하나 이상의 일 알칼리 추출단계(단계 a)로부터 얻은 액상을 수집하는 단계와

ⅱ) 산으로 약 5.0 내지 약 8.0의 pH 범위까지 단계ⅰ)의 액상의 pH를 조절하는 단계와

ⅲ) 약 15분 내지 약 30분 동안 약 100 ℃의 온도까지 증기분사에 의해 단계 ⅱ) 의 액상을 저온살균하는 단계와

ⅳ)저온살균된 액상으로부터 만난 및 만난-단백질을 분리하는 단계를 포함한다.

용어 "만난(mannans)"은 만노오스 중합체로 대표되는 다당류계를 의미하는데, 만난은 본 명세서에서 "만난-단백질"이라고도 또한 지칭되는 "만난-단백질 복 합체"라 불리는 단백질과 공유회합(covalent association)하여 복합체로서 주로 발견된다. 상기 유형의 다당류 복합체는 식물, 효모, 균류 및 박테리아에 제한되지 않고 이를 포함하는 여러 유형의 세포의 세포벽에서 발견되며, 당업계에 알려진 임의의 적절한 세포 소스포부터 분리될 수 있다. 비한정적 예로서, 세포 소스 균류(예를들면, 효모)는 천연 발생하는 균주(strain)일 수 있거나, 유전적으로 공학설계된 균주일 수 있다. 당업계에 알려진 임의의 적합한 효모 또는 균류 균주 (예를들면 제한하려는 의도는 아니지만, Saccharomyces spp, Shizophyllum spp, Pichia spp, Hansenula spp, Candida spp, Torulopsis spp, 및 Kluyveromyces spp이다. 상기의 특정예는 Saccharomyces cerevisiae , Saccharomyces delbrueckii , Saccharomyces rosei , Saccharomyces microellipsodes , Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces bisporus , Saccharomyces fermentati , Saccharomyces rouxii , Saccharomyces uvarum , Shizophyllum pombs , Kluyveromyces polysporus , Candida albicans , Candida cloacae, Candida tropicalis , Candida utilis , Hansenula wingei , Hansenula arni, Hansenula henricii , Hansenula americana, Hansenula canadiensis , Hansenula capsulata , Hansenula polymorpha , Kluyveromyces fragilis , Pichia kluyveri, Pichia pastoris , Pichia polymorpha , Pichia rhodanensis , Pichia ohmeri , Torulopsis bovina , 및 Torulopsis glabrata 에 제한되지 않고 상기를 포함한다)가 사용될 수 있다. 세포질소스로서 제빵업자 또는 양조자의 효모에 존재하는 Saccharomyces cerevisiae , Saccharomyces delbrueckii , Saccharomyces carlsbergensis , 및/또는 Saccharomyces rouxii 가 중 요한데, 이는 생존가능한 살아있는 또는 소비된 비생존가능 형태일 수 있으며, 양조장 또는 다른 적절한 벤더로부터 직접 얻을 수 있다. 특정한, 비한정적 예에서, 소비된 Saccharomyces cerevisiae 효모가 본 발명의 공정에서 활용될 수 있다.

본 발명의 공정에서 만난 및 만난-단백질 복합체는 전술한 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 제조하는 공정의 하나 이상의 일 알칼리 추출단계(단계 a)로부터 얻은 액상으로부터 분리된다.

전술한 대로, 알칼리 추출된 액상은 만난 및 만난-단백질을 포함하여 대부분 세포 소스의 알칼리 용해성 비β-글루칸 성분을 포함한다. 하나, 또는 하나 이상의 알칼리 추출단계로부터 얻은 알칼리 추출된 액상은 필요한 대로 수집되고 풀(ppol)된다.

하나, 또는 하나 이상의 알칼리 추출된 액상의 pH는 이후에 약 5.0 내지 약 8.0의 pH 범위 또는 상기 사이 임의의 pH로 산을 이용하여 조절된다. 예를들면, 알칼리 추출된 액상의 pH는 약 5.0, 5.2, 5.5, 5.7, 6.0, 6.2, 6.5, 6. 7, 7.0, 7.2, 7.5, 7.7, 8.0 또는 본 명세서에 개시된 임의의 두 개의 pH에 의해 정의된 pH 범위까지 조절될 수 있다. 예를들면, 제한하려는 의도는 아니면서, 알칼리 추출된 액상의 pH는 약 7.0 까지 조절될 수 있다. 당업계에 알려진 임의의 적절한 산이 pH를 조절하는 데 사용될 수 있다. 예를들면, 임의방식으로 제한하려는 의도는 아니면서, 당업계에 알려진 임의의 강산이 사용될 수 있다 (예를들면, 염산, 질산 또는 황산이 액체의 pH를 조절하는 데 사용될 수 있다). 추가적인, 비한정예로서, 염산(HCl)은 pH를 조절하는 데 사용될 수 있다.

알칼리 추출된 액상은 pH의 조절 중, 조절 후, 또는 조절 중 및 조절 후에 교반될 수 있다. 용어 "교반"은 당업계에 알려진 물리적 휘저음의 임의의 적절한 방법을 지칭한다. 예를들면, 제한하려는 의도는 아니지만, 혼합물은 교반장치, 교반기 또는 유화용 펌프에 의해서 교반될 수 있다.

pH 조절된, 알칼리 추출된 액상은 이후에 저온살균된다. 저온살균단계는 전술한 방식으로 수행된다. 예를들면, 임의방식으로 제한하려는 의도는 아니면서, 저온살균은 당업계에 알려진 기술(예를들면 증기재킷을 사용하여 직접 증기분사 또는 간접 증기분사)에 의해 달성될 수 있다. 예를들며 제한하려는 의도는 아니면서, 물 추출된 혼합물의 저온살균은 약 15 분 내지 약 240 분의 시간범위 동안 또는 상기 사이 임의시간 동안 약 75 ℃ 내지 약 100 ℃의 온도 또는 상기 사이 임의온도에서 발생할 수 있다. 예를들면, 물 추출된 혼합물의 저온살균은 약 75 ℃, 78 ℃, 80 ℃, 82 ℃, 85 ℃, 88 ℃, 90 ℃, 92 ℃, 95 ℃, 98 ℃, 100 ℃ 의 온도 또는 본 명세서에서 개시된 임의의 두 개의 온도조합에 의해 정의된 임의의 온도에서, 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 230, 235, 240 분 또는 본 명세서에 개시된 임의의 두 개의 시간에 의해 정의된 시간범위 동안 발생할 수 있다. 제한하려는 의도는 아니면서, 저온살균은 약 15 분 내지 약 30 분의 시간범위 동안 약 85 ℃ 내지 약 100 ℃의 온도에서 발생할 수 있다. 추가 비한정적 예에서, 저온살균은 약 20 분의 시간범위 동안 약 100 ℃ 의 온도에서 발생할 수 있다.

저온살균 다음으로, 만난 및 만난-단백질 복합체는 저온살균되고, pH 조절되고, 알칼리 추출된 액상으로부터 분리된다. 분자의 분리는 당업계에 알려진 기술(예를들면 침전 또는 건조에 의해)에 의해 달성될 수 있다.

pH 조절되고, 알칼리 추출된 액상의 건조는 당업계에 알려진 임의의 적절한 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를들면, 임의방식으로 제한하려는 의도는 아니면서, 고체성분은 동결건조(lyophilization), 가열, 공기건조, 드럼건조, 분무건조, 적외선 건조, 마이크로파 또는 전파에 의한 건조, 복사열에 의한 건조 또는 임의의 적절한 방법에 의해 건조될 수 있다. 비한정적 예로서, 고체성분은 분무건조에 의해 건조될 수 있다. 액상의 건조는 만난 및 만난-단백질 생산물을 산출한다.

택일적으로, 만난 및 만난-단백질은 액상의 침전에 의해 분리될 수 있다. 액상의 침전은 당업계에 알려진 임의의 적절한 방법에 의해 (예를들면 알코올을 사용하여) 달성될 수 있다. 임의의 적절한 식용등급 알코올이 사용될 수 있다 (예를들면 에탄올 또는 프로판올에 제한되지 않음). 당업계에 알려진 방법에 따라서, 사용되는 알코올량은 액체 대 알코올이 약 1:0.25 내지 약 1:3의 범위일 수 있다. 침전된 만난 및 만난-단백질은 원심분리도고 액상은 폐기되며, 만난 및 만난-단백질 침전물은 만난 및 만난-단백질 생산물을 산출하기 위해서 당업계에 알려진 임의의 적절한 방법에 의해 차후 건조될 수 있다.

상기 공정의 단계 ⅳ)에서 만난 및 만난-단백질의 분리는 건조중량으로 최소 약 25% 의 만난 탄수화물류를 포함하는 최종 생산물을 산출한다. 예를들면, 최종 생산물은 건조중량으로 최소 약 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 또는 40% 또는 본 명세세에서 개시된 임의의 두 개의 퍼센트의 조합에 의해 정의된 범위의 임의 퍼센트인 만난 탄수화물류을 포함한다. 비한정적 예에서, 최종 만난 및 만난-단백질 생산물은 건조중량으로 약 30% 탄수화물류을 포함한다. 또한, 최종 생산물은 건조중량으로 약 5% 인 단백질을 포함한다. 예를들면, 고체성분은 건조중량으로 최소 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28% 29%, 30% 단백질을 포함할 수 있다. 비한정적 예에서, 최종 만난 및 만난-단백질 생산물은 건조중량으로 약 5% 단백질을 포함한다. 그러므로, 최종 생산물은 건조중량으로 최소 약 35% 만난-단백질을 포함할 수 있다 (예를들면, 최종 생산물은 건조중량으로 최소 약 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49% 또는 50% 만난-단백질을 포함할 수 있다.

만난 및 만난-단백질 생산물은 약 15% 이하의 습도 함량 또는 상기 사이 임의 퍼센트까지 건조될 수 있다 (예를들면, 최종 생산물의 습도 함량은 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 또는 15% 이하 또는 본 명세세에서 개시된 임의의 두 개의 퍼센트의 조합에 의해 정의된 범위의 임의 습도 함량일 수 있다). 비한정적 예에서, 최종 생산물의 습도 함량은 약 15% 인 습도함량을 갖는다.

건조된 만난 및 만난-단백질 생산물은 파우더이며 원하는 입자크기를 얻기위해서 추가 공정처리될 수 있다. 예를들면, 제한하려는 의도는 아니지만, 파우더는 해머밀링 또는 볼밀링에 의해서 분쇄될 수 있다.

본 발명은 또한 전술한 대로 제조된 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 포함하는 동물사료에 관련된다. β-(1,3/1,6)-D-글루칸은 동물의 면역능력을 증진하는데 효과적인 양으로 동물사료에 첨가될 수 있다. 용어 "면역능력을 향상시킨다"는 것은 비특이 방식으로 동물의 선천적 면역계를 증진하는 것을 지칭한다. β-(1,3/1,6)-D-글루칸은 매크로파지의 세포막 및 다른 면역세포에 특정 수용체를 결합함으로써 면역계를 활성화시키며, 매크로파지의 식균 및 살균활동 및/또는 다수의 사이토카인의 생산을 증가시키고 순차적으로 면역계의 다른 성분을 활성화시킨다.

β-글루칸의 유효량은 동물의 형태에 기반하여 변함을 당업자는 이해할 것이다. 본 발명의 동물사료는 임의 형태의 가축, 가금류, 어류, 갑각류, 새우 또는 반려동물용일 수 있다. 예를들면, 임의방식으로 제한하려는 의도는 아니지만, 상기 동물사료는 가금류 같은 조류, 돼지류, (말, 소, 염소, 양 또는 다른 가축 같은) 말류, (어류, 개, 고양이를 포함하는) 반려동물 및 (갑각류, 새우 및 양식 어류 같은) 수산양식류를 양육하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, β-(1,3/1,6)-D-글루칸의 유효량은 약 5 g/ 1000 kg의 완전배합사료 내지 약 500 g/ 1000 kg의 완전배합사료 범위에, 또는 상기 사이 임의의 양이다. 예를들면, β-(1,3/1,6)-D-글루칸의 유효량은 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500 g/ 1000kg 의 완전배합사료 또는 본 명세서에서 개시된 임의의 두 개의 양에 의해 정의된 범위에서의 임의의 양일 수 있다. 보다 구체적인 예에서, 임의방식으로 제한하려는 의도는 아니면서, 하기의 β-글루칸의 유효량이 사용될 수 있다:

- 동물이 가금류인 경우, 유효량은 약 20 내지 약 50 g/ 1000 kg의 완전배합사료(예를들면 40 g/ 1000 kg의 완전배합사료)일 수 있다.

- 동물이 돼지인 경우, 유효량은 돼지의 성장주기에 근거하여 약 20 내지 약 500 g/ 1000 kg의 완전배합사료 사이일 수 있다. 예를들면, 수유 돼지 및 새끼돼지용으로 약 75 내지 약 95 g/ 1000 kg의 완전배합사료, 또는 약 80 g/ 1000 kg의 완전배합사료일 수 있다. 또는 추가예로서, 유효량은 존속기간 및 잉태주기에 따라서 돼지 잉태용으로 약 150 내지 약 450 g/ 1000 kg의 완전배합사료, 또는 약 200 내지 약 400 g/ 1000 kg의 완전배합사료일 수 있다. 비한정적 예에서, 잉태 돼지는 전체 잉태기동안 약 200 g/ 1000 kg의 완전배합사료가 공급되거나, 잉태의 최종 약 30 내지 약 40일 동안 약 400 g/ 1000 kg의 완전배합사료가 공급될 수 있다.

- 동물이 말 같은 말류인 경우, 유효량은 약 25 내지 약 300 g/ 1000 kg의 완전배합사료일 수 있다. 예를들면 25 내지 약 100g/ 1000 kg의 완전배합사료이거 나 추가예에서, 유효량은 약 60 g/ 1000 kg의 완전배합사료일 수 있다.

- 동물이 새우인 경우, 유효량은 약 35 내지 약 300 g/ 1000 kg의 완전배합사료(예를들면 100 g/ 1000 kg의 완전배합사료)일 수 있다.

본 발명은 a)동물의 면역능력을 증진하는 데 효과적인 양으로 전술한 공정에 의해 생산되는 β-(1,3/1,6)-D-글루칸, 및 b) 동물의 장벽에 대한 박테리아 부착을 감소하거나 저지하는 데 충분한 양으로 전술한 공정에 의해 제조되는 만난 및 만난-단백질을 포함하는 동물사료를 부가적으로 제공한다. 예를들면, 동물사료는 약 5 내지 약 500 g/ 1000 kg의 완전배합사료 또는 상기 사이 임의의 양인 β-(1,3/1,6)-D-글루칸, 및 약 100 내지 약 4000 g/ 1000 kg의 완전배합사료 범위 또는 상기 사이 임의의 양인 만난 및/또는 만난-단백질을 포함할 수 있다. 예를들면, 동물사료는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500 g/ 1000kg 의 완전배합사료 또는 본 명세서에서 개시된 임의의 두 개의 양에 의해 정의된 범위에서의 임의의 양인 β-(1,3/1,6)-D-글루칸및, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2150, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2600, 2650, 2700, 2750, 2800, 2850, 2900, 2950,3000, 3050, 3100, 3150, 3200, 3250, 3300, 3350, 3400, 3450, 3500, 3550, 3600, 3650, 3700, 3750, 3800, 3850, 3900, 3950, 4000 g/ 1000kg 의 완전배합사료 또는 본 명세서에서 개시된 임의의 두 개의 양에 의해 정의된 범위에서의 임의의 양인 만난 및/또는 만난-단백질을 포함할 수 있다.

본 발명의 공정에 의해 생산된 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 사용하는 상용시험에서, 정량 의존성 응답 또는 벨곡선 효과가 다양한 사료시험(특히 돼지에 대한)에서 관찰된다. 특히, 상용의 PRRS 백신을 사용하여 예방접종되고 다음으로 0, 40, 80, 또는 120 g/ 1000kg 의 완전배합사료 정량으로 β-글루칸이 공급된 새끼돼지는 정량의존성 응답을 보이며, 80 g/ 1000kg 의 완전배합사료가 항체 응답 및 평균 일당 증체량을 최소화하는 반면에, 120 g/ 1000kg 의 완전배합사료는 대조구와 유사한 응답을 나타낸다 (예4 참조).

또다른 시험에서, 암퇘지는 분만 이전에 4주간 0, 0.5, 또는 1g β-글루칸/암퇘지/일 이 공급되며 분만 전 14일째 상용의 보강제 백신 마이코플라즈마 하이오뉴모니아(Mycoplasma hyopneumoniae 로 예방접종된다. 1g/ 1day 에서 β-글루칸이 공급된 암퇘지는 새끼돼지에 대한 항-마이코플라스마 항체의 수동수송에 있어서 현저한 증가를 보인다. 0.5 g β-글루칸/암퇘지/일 의 정량은 대조구에서와 현저히 상이하지 않은 항체응답을 나타낸다(예6 참조).

이론에 의해 제약되지 않으면서, 벨곡선 효과가 얻어지는 메카니즘은 고(高) 정량에서 면역기능을 하방 조절하는 생물학적 피드백 메카니즘에 관련될 수 있다.상기는 가축/동물에서 면역조절용으로 정제된 β-글루칸의 적절하면서 최적의 사용에 대한 중요한 발견이며 직접적인 상용적 의미가 있다. 상기는 비효과적 및/또는 불일정한 결과를 생산할 수 있는 1 내지 2 kg/ 1000kg 의 완전배합사료 범위에서 대(大) 복용량을 오류하여 제시하는 종래기술 관행과 모순된다. 그러므로, 사용되는 추출공정, 순도 및 β-글루칸의 복용량은 적정 응용에서 인자가 될 수 있다.

본 발명은 하기의 비한정적 예에 있어서만 참조로서 상세히 설명된다.

예 1: 효모로부터 β-(1,3/1,6)-D- 글루칸의 정제

β-(1,3/1,6)-D-글루칸은 도1의 흐름도에서 일반적으로 도시된 듯이, 하기의 공정에 의한 효모세포로부터 추출된다. (약 15% 고체) 소비 효모 슬러리의 150L 표본이 약 20분간 100 ℃의 온도까지 100 증가분사에 의해 저온살균된다. 혼합물은 이후에 액상 및 고상이 분리될 때까지 1000 - 3000 x g 에서 원심분리에 의해 분리된다. 액상은 폐기되고 효모 고형체는 20℃에서 15분간 교반하면서 1:5 부피 물(v/v)로 재현탁된다. 혼합물은 이후 원심분리에 의해 분리되며, 액체는 폐기되고 효모 고형체는 1.5 N NaOH 의 10 부피 (w/v)로 현탁된다. 혼합물은 이후 교반과 함께 45분간 80 ℃까지 가열되며, 그후 121℃ , 15 psi 에서 30분간 고압반응솥 처리된다. 혼합물은 50℃까지 냉각되며 주위온도에서 교반되는 상태가 된다. 고상 및 액상은 원심분리에 의해 분리되며 수집된다. 알칼리 추출은 분리된 효모 고형체를 사용하여 추가로 2번 수행되며 고상이 결합된다. 알칼리 추출 액상은 예2 에서 설 명한 대로 풀(epool)되고 추가 공정을 위해 존속된다. 풀(pool)된 알칼리 추출 고상은 전술한 대로 물 추출되고 이후에는 원심분리에 의해 분리된다. 액상은 폐기되며 고상은 존속되고 상기처럼 물 추출된다. 제2 물 추출후 분리전에 용액은 20분간 100 ℃의 온도까지 증기분사에 의해 저온살균된다. 혼합물은 이후에 원심분리에 의해 분리되고 액상은 폐기되고 고체는 존속된다. 고체는 교반과 동시에 1 시간동안 80℃ 온도까지 고형체 대 산(v/v)의 비가 1:10으로 3% 아세트산으로 산 추출하게 된다. 혼합물은 원심분리에 의해 분리되며 액상은 폐기되며 고체는 존속된다. 고체는 이후에 전술한 대로 물로 세척되고, 저온살균되고 분리된다. 고체는 이후에 수집되며 하기의 조건하에서 건조 분무된다.

사료 고형체= 10.0% (범위 5 - 25 %)

건조 파우더 잔여습도 = 8.0 % (범위 5 -15 %)

입구 공기온도 = 400 °F (204 ℃) (범위 400 -750°F)

출구 공기온도 = 200 °F (93 ℃) (범위 200 -240°F)

회전미립화기 (rotary atomizer)를 사용하여 사료 미립화

공기 냉각/수송 시스템을 사용하여 100 °F 미만까지 건조 파우더 냉각

분무건조된 물질의 조성은 표1에서 도시된다.

[표 1] 정제된 β-(1,3/1,6)-D-글루칸의 조성

도시된 ¹ 결과는 3개의 상이한 제조(로트 번호 040816, 040511, 040601)의 평균이다.

β-(1,3/1,6)-D-글루칸 조성물의 생화학적 활성은 (National Jewish Medical & Research Center, Denver, CO 에서 수행된) 생체내 택일적 보체 활성화 실험에 의해 결정된다. 간략히, β-(1,3/1,6)-D-글루칸 D-글루칸 조성물 (1 mg/ml, 0.4 mg/ml, 및 0.1 mg/ml)의 서스펜션(suspension)의 1 부분(part)은 신규한 사람 혈청의 9 부분과 혼합된다. 37 ℃ 에서 30분간 배양한 후에, 혼합물은 불용성 입자를 제거하기 위해서 원심도출된다. 상청액(上淸液)은 Bb를 양적으로 측정함에 의해서 보체 활성화용으로 시험되며, 보체 단백질 인자 B. 자이모산(Zymosan) 5 mg/ml 의 활성화에 방출된 단백질 단편이 대조구로서 사용된다.

전술한 방법에 의해 얻어진 동물등급 β-글루칸의 구조적 특성은 제약 등급 효모 β-글루칸 (90% 이상 순도)에 비교된다. 도2a 및 도2b는 각각 제약등급 효모 β-글루칸 및 본 발명의 공정에 의해 얻어진 β-글루칸의 푸리에 변환 적외선 (FTIR) 스펙트럼을 도시한다. X 및 Y 축의 눈금이 동일하지 않는 경우, 유사 결합 및/또는 화학적 결합이 제약등급 효모 β-글루칸 및 현 설명되는 공정에 의해 얻어 진 β-글루칸 모두에 현존한다.

제약등급 효모 β-글루칸 및 본 발명의 공정에 의해 얻어진 β-글루칸의 핵자기 공명(NMR) 스펙트럼은 60 - 140 범위 (데이터 미도시)에서 유사한 신호를 나타내며, 상기 신호에 확실한 특징은 β-글루칸의 면역 생화학 활성을 줄 수 있다. MacroGuard^TM 제품에 대한 핵자기 공명 스펙트럼은 상기 신호(데이터 미도시)의 현저한 부재를 나타내며, 이는 제품의 제한된 생화학 활성을 설명할 수 있다.

예2: 액상으로부터 만난 및 만난-단백질 복합체의 분리

예1에서 존속된 알칼리 추출 액상은 도1의 흐름도에서 일반적으로 설명되는 것처럼 추가처리된다. 액체의 pH는 HCl로 7.0으로 조정된다. 용액은 이후 20분간 100℃ 의 온도까지 증기분사에 의해 저온살균된다. 만난 및 만난-단백질은 이후에 하기의 조건하에서 분무건조에 의해 액상으로부터 분리된다.

사료 고형체= 10.0% (범위 5 - 25 %)

건조 파우더 잔여습도 = 8.0 % (범위 5 -15 %)

입구 공기온도 = 400 °F (204 ℃) (범위 400 -750°F)

출구 공기온도 = 200 °F (93 ℃) (범위 200 -240°F)

회전미립화기 (rotary atomizer)를 사용하는 사료 미립화

건조된 만난 및 만난-단백질 물질의 조성은 표2에서 도시된다.

[표 2] 만난 및 만난-단백질 복합체의 조성

¹로트번호 0410-0531

예3: 다양한 효모 β- 글루칸 조성물의 비교효과

다양한 효모 β-글루칸 조성물의 비교효과가 약간의 변형을 갖고 [Baggionlini et al,.(1986) Methods in Enzymology, 132:395]에 의한 매크로파지 유사 세포 RAW 264의 매크로파지 활성화에 의해 결정된다. 간략히, BAC 또는 RAW 264 대상세포는 10% 소태아 혈청(FBS : fetal bovine serum)으로 보충된 무(無)페놀레드 alpha -MEM(alpha-minimum essential medium)에 합류할 때까지 96개의 호(好)조직배양판에 평판되고 배양된다. 이후에, 중간체는 체거되고, 세포는 세척되며 다음으로 기질(호모바닐린산) 및 시험물질이 첨가된다. 1시간의 배양기간에 이어서, 검정반응이 정지되고, 최종 형광발광은 최대 여기(勵起) = 312 mm, 최대 방출 = 420 mm 에서 ELISA-리더로 측정된다. 양(+)의 대조구로서, 상용등급 자이모산(Zymosan)이 사용된다. 시험물질은 제약등급 β-글루칸, MacroGuard ^TM 제품, 및 예1에 의해 제조된 β-글루칸(YBG)을 포함한다. 다양한 β-글루칸 조성으로 처리된 셀에 의해 방출된 H₂O₂의 양을 결정하기 위해서, (검정에 첨가된 외인성의 H₂O₂ 을 갖는) 표준곡선이 성립된다.

비교검정용 결과는 반로그 눈금으로 도3 에서 도시된다. 상기 검정은 1 내지 10 나노몰 H₂O₂ 방출 사이 적량범위에서 매우 유용하다. YBG 조성의 효과는 제약등급 β-글루칸의 조성과 거의 동일함을 보이며 자이모산 및 MacroGuard ^TM 보다 더욱 효과적이다.

예4: β-(1,3/1,6)-D- 글루칸 조성물의 안정성

예1에서 설명된 대로 생산된 β-글루칸 (YBG)의 안정성은 생산물의 저장수명을 결정하기 위해서 검정된다. YBG 로트(lot) 번호 020331 AF 가 밀봉된 용기에서 서늘하고(20- 25℃), 건조한 (예를들면 풀(pool)된 습기가 없는) 장소에서 24시간의 저장후, 12달 후, 생산상태에서 시험된다. 시험결과는 도3에서 도시된다. 또한, YBG의 활성 안정도는 3개의 상이한 YBG 로트용으로 결정된다. 생산품의 활성은 밀봉된 및/또는 플라스틱 라인된 용기에서 서늘하고, 건조한 (예를들면 풀(pool)된 습기가 없는) 장소에서 3,6,12 및 24시간의 저장 후 생산상태에서 예1에서 설명된 대로 측정된다. 상기 검정의 결과는 표4에서 도시된다.

[표 3] YBG 로트번호 020331AF 의 안정성

¹N x 6.25

[표 4] YBG 활성의 안정성

¹ ㎍ Bb/ mg 표본으로 나타냄

² 시험이 미완료됨

표3 및 표4의 결과는 YBG 가 서늘하고 건조한 장소에서 저장될 때 제조날짜로부터 최소 24 달 동안 상당히 안정함을 나타낸다.

예5: 돼지 사료에서의 첨가제로서의 β-(1,3/1,6)-D- 글루칸의 용도 및 효과

예1에서 설명된 대로 생산된 β-글루칸(YBG)을 돼지 사료에 사용하는 효과는 상용의 백신 및 보조약에 비교된다. 이유(離乳)된 돼지에 실시되는 상기 연구는 효모 β-글루칸의 증분량이 3주의 나이 (이유(離乳)시간)에서 시작하여 5주의 기간동안 상용사료에 포함될 때 성장, 건강 및 백신에 대한 응답을 비교한다. 상기 연구는 48 마리의 돼지를 포함하며 이들 돼지는 두 개의 축사에서 유숙하게 된다. 상기 돼지는 하기의 YBG 처리 중이 하나 - 생리식염수(대조구)의 주사, 또는 1000 kg 의 완전배합사료당 0, 40, 80, 또는 120 g YBG 를 구비한 살아있는 돼지 생식기 호흡기 증후군(Porcine Respiratory Reproductive Syndrome , PRRS) 약화된 백신의 주사 -가 실행된다. 각 처리는 3번 반복 수행된다. 또한, 12마리의 돼지는 다수의 수산화 알루미늄 보조약의 주사가 투여되거나, 오일계 보조약의 단일 또는 이중 주사가 투영된다. 혈액표본은 상기 연구의 7일 21일, 및 35일에서 전대정맥(anterior vena cava)으로부터 얻어진다. 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSv) 항체는 IDEXX^TM PRRS ELISA 시험키트를 사용하여 정량된다.

성장효율 및 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSv) 약화 백신 및 생리식염수 대조구로 예방접종된 돼지의 면역응답에 대한 β-(1,3/1,6)-D-글루칸의 영향이 도5에서 예시된다. 상기 결과는 2 정량의 오일 보존제 및 생 바이러스 주사가 이유된 돼지의 성장률 및 사료 전환률에 부정적 영향을 미침을 나타낸다. 예1의 공정에 의해 생산된 β-글루칸(YBG)은 80 g/100 kg 완전배합사료의 정량에서 백신 연 관 성장감소를 줄일 수 있다. 또한, YBG는 80 g/100 kg 완전배합사료에 포함될 때 백신에 대한 항체 반응을 감소시킨다. 그러므로, YBG는 감염성 또는 면역계 공격 중에도 성장률을 개선시키면서 돼지의 면역응답을 증대시킬 수 있다.

[표 5] PRRS 백신으로 예방접종된 돼지의 면역응답 및 성장효율에 대한 YBG의 효과

¹a,b,c 는 p < 0.05에서 통계학적으로 상이한 군을 가리킨다 (즉, 군 "a" 는 각 카테고리에서 군"b" 및 군 "c" 와 현저히 상이하다);동일 문자군에 대한 결 과는 p < 0.05에서 현저히 상이하지 않다.

예 6 : 암퇘지를 잉태시키는 β-(1,3/1,6)-D- 글루칸의 효과

예1 의해 생산되는 β-글루칸(YBG)의 임신한 (잉태한) 암퇘지에 대한 영향 및 이유된 새끼돼지의 생존에 대한 연구가 실시된다. 상기 연구는 세 개의 군으로 나뉜 분만 28일전, 총 207마리의 암퇘지를 포함한다. 제1군(대조구)은 비타민 보충제 없는 보통의 상용사료가 공급되며, 제2군은 비타민 보충제 있는 보통의 상용사료가 공급되며, 마지막 군은 (400g/1000kg에 상등하는) 1g/암퇘지(sow)/일(day) 에서의 YBG 가 공급된다. 모든 암퇘지는 분만실에 임의적으로 지정되며, 상호 약 10일 안의 일단으로서 분만된다. 새끼돼지 치사율은 최초 2주간의 생존 동안 측정된다. 상기 연구는 3번 반복수행된다.

잉태한 암퇘지 및 살아서 출생한 새끼돼지의 수 및 이유된 수에 대한 β-(1,3/1,6)-D-글루칸 영향이도6에서 도시된다. 본 발명에 의해 생산된 β-글루칸이 (400g/1000kg에 상등하는) 1g/암퇘지/일 에서 잉태한 암퇘지에 투여될 때, 대조구와 비교하여 태어난 새끼돼지의 수는 10.8% 이상 증가하고 암퇘지당 이유된 수는 7.3% 이상 증가된다. 상기는 대조구 데이터에 대해 현저한 증가(p < 0.05)를 나타내며, 돼지 생산업자에게는 생산성, 저축 및 비용이익률에서의 현저한 증가로 변형된다.

[표 6] 한배 새끼 크기 및 생존에 대한 TBG의 효과

¹a 및 b는 p < 0.05에서 통계학적으로 상이한 군을 가리킨다 (즉, 군 "a" 는 각 카테고리에서 군 "b"와 현저히 상이하다);동일 문자군에 대한 결과는 p < 0.05에서 현저히 상이하지 않다.

예 7 : 돼지의 초유질에 대한 β-(1,3/1,6)-D- 글루칸의 효과

연구는 임산한 암퇘지에 대한 예1 의해 생산되는 β-글루칸(YBG)을 공급하는 것이 새끼돼지에 대한 항-미코플라스마 항체의 수동수송을 향상시키는지를 결정하도록 수행된다. 150 마리의 돼지가 분만 4주전동안 탑 드레스(top dress)로서 0, 0.5, 또는 1.0 g 의 YBG / 암퇘지/ 일(day)이 공급되는 암퇘지로부터 추출된다. 모든 암퇘지는 상용의 보강제 미코플라스마 히오뉴모니에(hyopneuminiae) (Boehringer Ingelheim, Canada)로 분만 14일 이전에 예방접종되며, 새끼돼지는 출생후 18일에 표본추출된다. 항체 적정농도는 상용의 ( DAKO ^TM ) ELISA 시험키트로 측정된다. 상기 데이터는 리터 크기, 출생무게 및 임의효과로서 출산아수를 제어하는 혼합모델회귀 (mixed model regression)를 사용하여 분석된다. 상기 결과는 표7에서 도시된다.

[표 7] 항체의 수동수송에 대한 YBG의 효과

일반적으로, 규정된 비율 및 기간에서 예비분만 YBG 를 공급한 암퇘지는 초유질의 증대 (즉, 항체 적정농도 증가)를 나타내므로 질병보호를 증가시키고 따라서 새끼돼지의 생존을 증가시킨다. 특히, 상기 결과는 1.0 g YBG / 암퇘지 / 일 의 정량이 새끼돼지에 대한 항-미코플라스카 항체의 모계/수동수송을 현저히 증가시키나, 을 나타낸다. 5.0 g YBG / 암퇘지 / 일 의 정량은 대조구군에 대해 현저한 효과를 나타내지 않음을 나타낸다. 그러므로, YBG로 임신한 암퇘지의 면역촉진은 새끼돼지에 대한 면역글로불린의 수동수송을 개선시킬 수 있으며, 이는 순차로 새끼돼지의 감염에 대한 개선된 보호 및 증가된 성장 및 생산성에 이를 수 있다. YBG는 모계항체를 통하여 미숙 중간면역된(young immune-compromised) 새끼돼지에서 수동면역 및 질병보호를 증진하는 최종효과를 갖는다.

예 8 : 육계(Broiler chickens)의 성장에 대한 β-(1,3/1,6)-D- 글루칸의 효과

연구는 육계(Broiler chickens)의 성장에 대한 예1 의해 생산되는 β-글루칸(YBG)의 효과를 결정하도록 수행된다. 상기 연구는 Nova Scotia, Canada 의 농장 에서 수행된다. 약 6300 마리의 육계가 계사(鷄舍)의 기저단에서 거주되며 2주동안 40 g YBG / 1000 kg 의 완전배합사료를, 다음으로 4주동안 20 g YBG / 1000 kg 의 완전배합사료를 포함하는 사료가 공급된다. 한편, 또다른 약 6300 마리의 육계는 계사(鷄舍)의 최상단에서 거주되며 성장촉진 항생제 Stafac^TM ( Phibro Animal Health Ltd., ON Canada)를 포함하는 사료가 공급된다. 총 4개의 독립된 배치가 유사조건하에서 동일한 헛간을 통해 이루어진다. YBG 및 Stafac^TM 군의 모든 사료는 콕시듐예방제(coccidiostat) Coban^TM (Elanco Animal Health, Guelph, ON Canada)로 보충된다. 6주의 말기에, 하기의 표 준 - 치사, 최종무게, 평균 일당 증체량, 사료 전환률, 및 불량률 - 을 사용하여 성과가 축적된다. 하기 표8에서 요약되는 상기 실험의 결과는 2개의 사료 체제에 관한 육계 사료에서 비교가능한 성장 파라미터를 도시한다. 상기는 성장촉진 항생제없이 육계를 사육하는 것이 가능함을 나타낸다.

[표 8] 육계의 성장에 대해 항생제와 비교된 YBG의 효과

¹표는 약 6300 육계/시험/처리의 4개의 독립적 상용 위치의 총계를 요약한다.

²전환율은 다수의 조류가 소비하는 식품의 비율에 근거한다. 통상적 상용 비율은 1kg의 중량 증체량에 대해 1.5 kg - 1.9 kg의 사료 범위이다.

예 9 : 육계(Broiler chickens)에서 면역 파라미터에 대한 β-(1,3/1,6)-D- 글루칸의 효과

면역증진제로서 예1 에 의해 생산된 β-(1,3/1,6)-D-글루칸 (YBG) 의 효용성이 검정된다. 혈액 표본은 성장촉진 항생제를 포함하는 통상의 사료가 공급된 육계 외에도, 초기 2주 동안 40 g YBG / 1000 kg 의 완전배합사료를, 다음으로 최종 4주동안 20 g YBG / 1000 kg 의 완전배합사료를 포함하는 사료가 공급되는 육계로부터 얻어진다.

혈액표본은 하기의 출아증식적 물질 :

콘카나발린 A(concanavalin A, Con A), 파이토헤마글루틴(phytohemaglutin, PHA), 포볼 미리스테이트 아세테이트(phorbol myristate acetate, PMA) + 이오노마이신(Ionomycin), 리포다당질(LPS) + 덱스트란 황산염(dextran sulfate, DxS) 및 미국자리공 미토겐(poke weed mitogen, PMW)

의 존재하에서 PharmaGap 사 (Ontario, Canada) 에 의해 개발된 독점적 림포사이트 증식능력 검정(proprietary lymphocyte proliferative capacity assay)을 사용하여 분석된다.

[표 9] 육계¹에서 림포사이트 증식에 대한 항생제 요법의 효과

¹자극에 대한 세포수의 증가가 성장촉진 항생제를 포함하는 사료를 먹인 육계에 대한 비자극된 상응 대조구의 퍼센트로 나타남.

표9는 성장촉진 항생제를 포함하는 사료를 공급한 동물에서, 상기 다양한 기질에 대한 림포사이트의 응답이 면역세포의 현저히 낮은 자극을 갖는 이형(heterogeneous)임을 나타낸다. ConA, PWA, 및 LPS에 대한 응답은 상기 대조구에서의 응답과 현저히 상이하지 않으며, 몇몇 동물에서 상기 응답은 대조구에서의 응답보다 현저히 적다(예를들면 제2, 5, 7, 및 20번 동물에서의 PHA 에 대한 응답; 동물13에서의 PMA 에 대한 응답; 동물 13 및 20 에서의 PWM 에 대한 응답; 동물 13에서의 LPS에 대한 응답). 그러므로, 성장촉진 항생제로 사료공급된 동물은 박테리아 감염 및 항생제가 치료하지 못하는 바이러스 감염에 잠재적으로 더욱 민감할 수 있는 비활성화된 면역계를 구비한다. 또한, 항생제는 바이러스 감염을 치료하거나 저지하는데 효과가 없다.

[표 10] 육계¹에서 림포사이트 증식에 대한 YBG 요법의 효과

대조적으로, 표10은 YBG를 포함하는 사료를 먹인 동물에서, 다양한 기질에 대한 림포사이트의 응답은 림포사이트 증식에서의 증가가 비자극된 대조구에 대해 관찰되기 때문에 현저히 증가된다. 응답은 하기의 PMA 및 LPS 자극을 따라서 특히 상승된다. 상기 데이터는 YBG를 먹인 동물에서 박테리아 및 바이러스 감염에 대한 향상된 면역능력 및 증가된 저항성을 나타낸다.

예 10 : 육계(Broiler chickens)에서 성장이행 및 기관 에 대한 β-(1,3/1,6)-D-글루칸의 효과

연구는 성장촉진 항생제와 면역계 성분에 대한 예1 의해 생산되는 β-(1,3/1,6)-D-글루칸의 영향을 결정하도록 수행된다. 각 시험당 912 일된 육계에 대해서 3번 시험된다. 육계는 임의적으로 24개의 축사(한 축사당 38 마리) 및 3개의 식이요법 - 비성장촉진제 (대조구), YBG 또는 버지니아마이신(virginiamycin)- 중의 하나가 지정된다. 0 내지 14일째에서 초기사료를, 14일 내지 24일째에서 성장사 료를, 24일 내지 38일째 최종사료가 조류에 공급된다. 모든 조류는 0, 14, 24, 및 38일째 수동으로 무게가 재어지며 소비된 사료는 연구전체를 통하여 모니터된다. 14일 및 38일째에, 48마리의 육계( 2마리/축사)가 안락사되며, 파브리키우스의 지라 및 소낭은 제거되어 중량측정된다. 21 및 35일째의 혈액 표본이 분별염색을 위해 슬라이드(slide)에 고정된다.

신체무게의 일부로서 기관무게 및 백혈구 세포수는 처리군사이세서 동일하다. 각 식이요법에 대한 사료 효율은 또한 사육기간동안 동일하다. 평균적으로, 24일째까지 항생제가 제공된 조류(818g)는 YBG 가 제공된 조류(771g) 및 대조구군(752g)보다 크다. 그러나, 38일째에는 YBG 가 제공된 조류(1987g)가 p < 0.05에서 항생제 군(2009 g)보다 더이상 현저히 적지 않다. 대조구군은 성장기의 말기에 다른 2개의 처리군보다 작은 평균 신체무게(1934g; p > 0.05)를 나타낸다. 상기 결과는 YBG가 일반적으로 사용되는 항생제만큼 육계의 성장촉진에 효율적임을 나타낸다. 그러므로, YBG로 성장촉진 항생제를 대체함은 가능하다.

예 11: 육계의 성장에 대한 β-(1,3/1,6)-D- 글루칸의 효과

연구는 육계의 성장에 대한 예1 의해 생산되는 β-(1,3/1,6)-D-글루칸의 효과을 결정하도록 수행된다. 총 900마리의 육계는 비성장촉진제(대조구), 성장촉진 항생제, 20g YBG/완전배합사료 1000kg, 또는 40g YBG/완전배합사료 1000kg을 포함하는 사료가 6주간 공급된다. 상기 실험의 결과는 하기의 표11에서 요약된다.

[표 11] 육계의 생산능력에 대한 YBG의 효과

a 및 b는 p < 0.05에서 통계학적으로 상이한 군을 가리킨다 (즉, 군 "a" 는 각 카테고리에서 군 "b"와 현저히 상이하다);동일 문자군에 대한 결과는 p < 0.05에서 현저히 상이하지 않다.

대조구군과 비교하여 YBG 200g/kg 및 40g/kg 군은 0 내지 3주 동안 일당 증체량, 음식섭취, 사료전환률 또는 무게에서 차이를 나타내지 않는다. 그러나, 항생제군은 음식섭취에서는 차이를 보이지 않지만, 일당 증체량, 사료전환률 또는 무게에서는 현저한 차이를 나타낸다. 상기 결과는 YBG의 효과가 처음 3주간 항생제의 효과보다 완만함을 제시한다. 대조적으로, 6주째에는, 40g YBG/완전배합사료 1000kg 을 공급한 육계에서 측정된 일당 증체량은 상이한 처리군중에서 최고치이다. 40g YBG/완전배합사료 1000kg을 공급한 육계는 또한 항생체 처리된 육계와 유사한 평균무게를 나타낸다. 또한, YBG 공급 영계중에서 최저 치사율의 추세가 관측된다. 요약하자면, 상기 결과는 2개의 사료 체제으로 먹이공급된 육계에서 비교가 능한 성장 파라미터를 보여주는데, 이는 성장촉진 항생제없이 육계를 사육하는 것이 가능함을 나타낸다.

예 12: YBG 및 항생제 공급한 칠면조 사이의 성장비교

연구는 칠면조의 성장에 대한 예1 의해 생산되는 β-(1,3/1,6)-D-글루칸의 효과을 결정하도록 수행된다.

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통상적으로 사육된 칠면조는 12주까지 22g YBG/완전배합사료 1000kg 에서 성장 촉진 항생제 Stafac^TM 이 공급된다. YBG 로 사육된 조류는 처음 6주간 40g YBG/완전배합사료 1000kg 에서 YBG 가 공급되며, 이후에 성장기의 나머지(즉 5주) 동안 20g YBG/완전배합사료 1000kg 에서 YBG 가 공급된다. 대조구 및 YBG 공급 사료에서, 항 콕시듐예방제 Coban^TM ^가 22g YBG/완전배합사료 1000kg 의 정량에서 전체에 걸쳐 사용된다. 결과는 표12에서 도시된다.

[표 12] 칠면조의 성장에 대하여 항생제와 비교되는 YBG의 효과

칠면조에서의 응답은 통상적 85 % - 90% "등급 A" 조류로부터 92% 초과 "등급 A"조류까지 상승한다.

예 13: 새우의 생산성 및 생존에 대한 β-(1,3/1,6)-D- 글루칸의 효과

연구는 사육된 새우의 생산성 및 생존에 대한 예1에 의해 생산되는 β-글루칸의 효과를 측정하기 위해서 Kasetsart University, Thailand 및 Atlantic Veterinarian College(AVC), PEI Canada 와 공조하여 수행된다. 약 3백만 마리의 새우 (대하, Penaeus monodon)가 양식으로 입수되며 동일한 집단으로부터 얻어진다. 상기 새우는 10개의 연못으로 나뉘어지며, 처리 연못(5개) 및 대조구 연못(5개)는 크기 및 형상에서 일치된다. 각 양식집단의 50개의 PL 새우는 질병이 존재하지 않음을 보장하기 위해서 초기에 흰반점바이러스(White Spot Syndrome Virus, WSSV), 전염성 피하 및 간췌장 궤사증 (Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis, IHHNV), 핵다면성 바큘로바이러스(Penaeus monodon-type baculovirus, MBV), 간췌장파보바이러스 (Hepatopancreatic Parvovirus, HPV), 타우라증후군바이러스(Taura Syndrome Virus, TSV) 및 엘로후헤드 바이러스(Yellow Head Virus,YHV) 에 대해서 PCR 및 RT-PCR 에 의해 표본된다.

YBG는 각 연령대의 새우용으로 고안된 표준 사료 체제에 따라서 100g /완전배합사료 1000kg 의 수준에서 처리 연못용 사료에 추가된다. 대조구 연못은 YBG의 부재하에서, 연구 연못과 동일한 체제에 따라서 동일사료가 공급된다. 120일 후에, 새우는 수확되며 다음의 파라미터 - 사료 전환률(FCR), 평균 일당 증체량(ADG), 생존률, 에이커당 수율 및 파운드당 수 (즉 크기)- 가 측정된다. 시험의 말기에, 각 집단/연못으로부터의 대표 표본이 표본추출되며 WSSV, IHHNV, HPV, TSV 및 YHV를 용 PCR 및 RT-PCR에 의해 검사된다.

YBG 공급군은 바이러스성 및 박테리아성 질병에 대한 고 저항성을 갖으며, 따라서 현존하는 상기 질병을 보다 더 잘 극복할 수 있다. 결과적으로, 시험동안 대조구 및 YBG 공급 새우가 종속되는 실제 병해허용수준에 따라서 총 성장능력이 향상된다. 또한, YBG 새우에 대한 생존률은 연못에서의 병해허용수준에 따라서 대조구에 대해 약 10% 증가되며, 평균 일당 증체량, 에이커당 수율 및 사료 전환률에 있어서도 유사한 증가를 갖는다.

본 발명은 하나 이상의 실시예와 관련하여 설명되었다. 그러나, 청구항에서 정의된 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 다수의 변화 및 변형이 이루어질 수 있슴은 당업자에게 자명할 것이다.

본 출원을 통하여 인용된 모든 참조문헌 및 특허의 내용은 본 명세서에서 일체로 참고로서 포함된다.

Claims

세포 소스로부터 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 제조하는 공정으로서, 상기 공정은

a) 세포 소스의 알칼리 추출 단계와;

b) 물 추출 단계와;

c) 산 추출 단계와;

d) 건조중량으로 최소 약 70% β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 포함하는 고형체조성물을 제조하기 위한 물 추출 단계를 포함하되,

물 추출의 최소 일 단계는 약 15 내지 약 30분의 시간범위 동안 약 100℃의 온도까지 증기분사에 의한 저온살균 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 소스로부터 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 제조하는 공정.
제1항에 있어서, 상기 2개의 물 추출 단계는 저온살균 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 소스로부터 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 제조하는 공정.
제1항 또는 제2항에 있어서,

상기 알칼리 추출 단계(단계 a)는 세포 소스가 알칼리 용액으로 처리하는 단계, 및 약 30분간 약 45 ℃ 내지 약 80 ℃의 온도범위까지 가열하는 단계를 포함하되,

약 1psi 내지 약 25 psi의 압력범위에서 약 15분 내지 약 120분의 시간범위 동안 약 95 ℃ 내지 약 150 ℃의 온도범위까지 온도상승이 뒤따르는 것을 특징으로 하는 세포 소스로부터 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 제조하는 공정.
제3항에 있어서, 알칼리 추출단계는 약 45분간 약 80 ℃의 온도까지 가열되는 단계를 포함하되, 약 1 psi 내지 약 25 psi의 압력범위에서 약 30분간 약 121 ℃ 까지 온도상승이 뒤따르는 것을 특징으로 하는 세포 소스로부터 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 제조하는 공정.
제3항 또는 제4항에 있어서, 알칼리 용액은 세포 소소 대 알칼리 용액의 비가 약 1:5 내지 약 1: 15 비율 범위인 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액인 것을 특징으로 하는 세포 소스로부터 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 제조하는 공정.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 물 추출단계(단계 b) 및 d))는 약 20 ℃ 내지 약 100 ℃의 온도범위에서 약 15분 내지 약 2.5시간의 시간범위 동안 고형체 대 물 비가 약 1:4 내지 약 1:20인 범위에서 물이 첨가되는 것을 특징으로 하는 세포 소스로부터 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 제조하는 공정.
제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 산 추출단계(단계 c)는 고형체 대 산성 용액의 비가 약 1:4 내지 약 1:20인 산성 용액으로 처리하는 단계를 포함하며, 약 15분 내지 약 2시간의 시간범위 동안 약 45 ℃ 내지 약 120 ℃ 의 온도범위까지 가열되는 것을 특징으로 하는 세포 소스로부터 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 제조하는 공정.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, a) 내지 d)의 각 단계는 상기 처리된 물질을 액상 및 고상으로 분리하는 단계가 뒤따르며, 각각의 후속단계는 고상에서 수행되는 것을 특징으로 하는 세포 소스로부터 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 제조하는 공정.
제8항에 있어서, 상기 처리된 물질의 분리가 뒤따르는 단계 a)의 순서는 1,2 또는 3번 수행되는 것을 특징으로 하는 세포 소스로부터 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 제조하는 공정.
제8항 또는 제9항에 있어서, 단계 c)내지 단계 d)의 순서가 1,2 또는 3번 수행되는 것을 특징으로 하는 세포 소스로부터 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 제조하는 공정.
제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 a)의 액상은 수집되고 화합되는 것을 특징으로 하는 세포 소스로부터 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 제조하는 공정.
제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 a) 이전에 약 15 내지 약 30분의 시간범위 동안 약 100 ℃ 의 온도범위까지 증기분사에 의해 세포 소소가 저온살균되는 단계가 선행되는 것을 특징으로 하는 세포 소스로부터 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 제조하는 공정.
제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포 소스는 빵 효모(Baker' yeast), 맥주 효모(Brewer's yeast), 누룩 효모(spent yeast), 및 효모 세포벽 물질로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 소스로부터 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 제조하는 공정.
효모로부터 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 제조하는 공정으로서,

상기 공정은

a) 약 15 내지 약 30분의 시간 범위동안 약 100 ℃의 온도까지 증기분사에 의해 효모를 저온살균하는 단계와;

b) 상기 저온살균된 효모를 제1 액상 및 제1 고상으로 분리하는 단계와;

c) 고형체 대 알칼리 용액의 비가 약 1:5 내지 약 1:15 인 범위에서 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액으로 상기 제1 고상의 알칼리 추출 단계, 및 약 30분간 약 45 ℃에서 약 80 ℃의 온도범위까지 가열하는 단계와;

d) 알칼리 추출된 혼합물을 형성하기 위해서, 약 1 psi 내지 약 25 psi의 압력범위에서 약 15분 내지 약 120분의 시간범위 동안 약 95 ℃ 내지 약 150 ℃의 온도범위까지 온도를 증가시키는 단계와;

e) 상기 알칼리 추출된 혼합물을 제2 액상 및 제2 고상으로 분리하는 단계와;

f) 물 추출된 혼합물을 형성하기 위해서, 약 20 ℃ 내지 약 100 ℃의 온도범위에서 약 15분 내지 약 2.5 시간의 시간범위 동안 고형체 대 물의 비가 약 1:4 내지 약 1:20인 범위에서 물로 제2 고상을 물 추출하는 단계와;

g) 약 15분 내지 약 30분의 시간범위 동안 약 100 ℃의 온도까지 증기분사에 의해 물 추출된 혼합물을 저온살균하는 단계와;

h) 상기 물 추출된 혼합물을 제3 액상 및 제3 고상으로 분리하는 단계와;

i) 산 추출된 혼합물을 형성하기 위해서, 고형체 대 산성 용액의 비가 약 1:4 내지 약 1:20인 범위에서 산성 용액으로 상기 제3 고상의 산 추출하는 단계 및 약 15분 내지 약 2 시간의 시간범위 동안 약 45 ℃ 내지 약 120 ℃의 온도범위까지 가열하는 단계와;

j) 상기 산 추출된 혼합물을 제4 액상 및 제4 고상으로 분리하는 단계와;

k) 물 추출된 혼합물을 형성하기 위해서, 약 20 ℃ 내지 약 100 ℃의 온도범위에서 약 15분 내지 약 2.5 시간의 시간범위 동안 고형체 대 물의 비가 약 1:4 내지 약 1:20인 범위에서 물로 상기 제4 고상의 물 추출하는 단계와;

l) 약 15 내지 약 30분의 시간 범위 동안 약 100 ℃의 온도까지 증기분사에 의한 상기 물 추출된 혼합물의 저온살균단계와;

m) 상기 물 추출된 혼합물을 건조중량으로 최소 약 70% β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 포함하는 제5 고상, 및 제5 액상으로 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 효모로부터 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 제조하는 공정.
제14항에 있어서, 단계 a) 내지 e)의 순서는 1,2 또는 3번 수행되는 것을 특징으로 하는 효모로부터 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 제조하는 공정.
제14항 또는 제15항에 있어서, 단계 i) 내지 m)은 1,2 또는 3번 수행되는 것을 특징으로 하는 효모로부터 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 제조하는 공정.
제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 공정은

ⅰ) 하나 이상의 일 알칼리 추출단계에서 얻어진 액상을 수집하는 단계와;

ⅱ) 약 5.0 내지 약 8.0의 pH 범위까지 단계ⅰ)의 액상 pH를 산으로 조절하는 단계와;

ⅲ) 약 15분 내지 약 30분 동안 약 100 ℃의 온도까지 증기분사에 의한 단계 ⅱ)의 액상을 저온살균하는 단계와;

ⅳ) 단계 ⅲ)의 저온살균된 액상으로부터 만난 및 만난-단백질 복합체를 분리하는 단계;에 의한 만난 및 만난-단백질 복합체를 제조하는 단계를 부가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 소스로부터 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 제조하는 공정.
제14항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 공정은

ⅰ) 하나 이상의 일 알칼리 추출단계(단계 e)에서 얻어진 상기 제2 액상을 수집하는 단계와;

ⅱ) 약 5.0 내지 약 8.0의 pH 범위까지 단계ⅰ)의 액상 pH를 산으로 조절하는 단계와;

ⅲ) 약 15분 내지 약 30분 동안 약 100 ℃의 온도까지 증기분사에 의해 단계 ⅱ)의 액상을 저온살균하는 단계와;

ⅳ) 상기 단계 ⅲ)의 상기 저온살균된 액상으로부터 만난 및 만난-단백질 복합체를 분리하는 단계;에 의한 만난 및 만난-단백질 제조를 부가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 효모로부터 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 제조하는 공정.
제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 분리단계(단계 ⅳ)는 침전 및 원심분리 또는 건조에 의한 것을 특징으로 하는 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 제조하는 공정.
제17항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 ⅳ)로부터의 고상은 최소 약 30% 만난 및 만난-단백질 복합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 제조하는 공정.
제20항에 있어서, ⅳ)로부터의 고상은 최소 약 5% 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 제조하는 공정.
동물의 면역능력을 향상시키는 유효량으로 상기 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 의한 공정에 의해 제조되는 β-(1,3/1,6)-D-글루칸을 포함하는 것을 특징으로 하는 동물사료.
제22항에 있어서, 상기 동물사료는 가금류, 돼지, 말류, 소, 갑각류로 구성된 군으로부터 선택된 동물용인 것을 특징으로 하는 동물사료.
제23항에 있어서, 상기 유효량은 약 5 g / 1000 kg 내지 약 500 g / 1000 kg 의 사료 농도범위인 것을 특징으로 하는 동물사료.
제24항에 있어서, 동물이 가금류인 경우, 상기 유효량은 약 20 g / 1000 kg 내지 약 50 g / 1000 kg 의 사료 범위인 것을 특징으로 하는 동물사료.
제24항에 있어서, 동물이 돼지인 경우, 상기 유효량은 돼지의 성장주기 및 사용의 기간에 근거하여 약 20 g / 1000 kg 내지 약 500 g / 1000 kg 의 사료 범위인 것을 특징으로 하는 동물사료.
제24항에 있어서, 동물이 말류인 경우, 상기 유효량은 약 25 g / 1000 kg 내지 약 300 g / 1000 kg 의 사료 범위인 것을 특징으로 하는 동물사료.
제24항에 있어서, 동물이 새우인 경우, 상기 유효량은 약 35 g / 1000 kg 내지 약 300 g / 1000 kg 의 사료 범위인 것을 특징으로 하는 동물사료.
돼지의 항체 형성을 강화하는 방법으로서, 상기 공정은 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 의한 공정에 의해 제조되는 β-(1,3/1,6)-D-글루칸의 유효량을 사료에 첨가하는 단계 및 상기 돼지에 동물사료를 공급하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지의 항체 형성을 강화하는 방법.
동물의 항체 형성을 강화하고 일반적으로 백신을 투여함과 관련된 부정적 성장 응답을 감소하는 방법으로서,

상기 공정은 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 의한 공정에 의해 제조되는 β-(1,3/1,6)-D-글루칸의 유효량을 동물사료에 첨가하는 단계 및 상기 동물사료를 동물에 공급하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 동물의 항체 형성을 강화하는 방법.
동물사료로서:

a) 동물의 면역능력을 강화하는 유효량으로 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 공정에 의해 제조되는 β-(1,3/1,6)-D-글루칸 및

b) 동물의 장벽에 박테리아 유착을 억제하는데 충분한 양으로 제17항 내지 제21항 중의 어느 항에 의한 공정에 의해 제조되는 만난 및 만난-단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 동물사료.
제31항에 있어서, 상기 β-(1,3/1,6)-D-글루칸의 양은 약 5 g / 1000 kg 내지 약 500 g / 1000 kg 의 완전배합사료 범위이며, 동물사료에서의 만난 및 만난-단백질의 양은 약 100 g / 1000 kg 내지 약 4000 g / 1000 kg 의 완전배합사료 범위인 것을 특징으로 하는 동물사료.