CN105994058A - 一种适用于菲律宾蛤仔的四倍体化学诱导方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种适用于菲律宾蛤仔的四倍体化学诱导方法，该方法的主要内容包括，菲律宾蛤仔亲贝经充分促熟，催产后，亲贝单个排放配子；选择未被污染、成熟度高的精卵，通过人工授精获得受精卵；受精后13min，加入细胞松弛素CB处理，处理浓度为0.5mg/L，抑制第一极体释放，受精后19min，洗卵，去除CB；将受精卵置于适宜条件下发育，获得四倍体菲律宾蛤仔胚胎；处理过程及发育过程所用海水为砂滤海水，盐度24‑26，温度24.8‑25℃。本发明利用最佳的精、卵，有效提高了受精卵的发育同步性，显著提高了四倍体诱导率，流式细胞术检测的诱导率稳定在50％以上。
Description
技术领域
本发明属于海洋生物技术中贝类遗传育种技术领域，涉及细胞生物学、发育生物学及染色体工程，特别是一种适用于菲律宾蛤仔的四倍体化学诱导方法。
背景技术
菲律宾蛤仔Ruditapes philippenarum俗称花蛤、蚬子，属双壳类，帘蛤科，蛤仔属，为广温、广盐性种类，我国重要经济贝类，目前已成为世界性养殖贝类。2014年蛤仔产量约占海水贝类产量的1/3，为我国单种养殖产量最高的贝类，产业地位十分重要。目前，在养殖中主要采用野生苗种，导致个体小型化、抗逆性差、繁殖季节死亡率高、单位产量降低。
三倍体贝类因其不育性而具有生长速度快、成活率高、肉质佳等优良的经济性状，三倍体菲律宾蛤仔苗种的应用，有望克服其在养殖中出现的问题，利用四倍体与二倍体杂交，可培育全三倍体贝类，是实现三倍体贝类产业化的关键。
菲律宾蛤仔三倍体的诱导方法已经公开，但四倍体贝类的诱导在原理、技术方法以及胚胎发育的环境因素控制方面均与三倍体诱导存在本质区别。另外，由于抑制PB1对个体胚胎发育的负面影响显著高于抑制PB2，因此，在对菲律宾蛤仔进行四倍体的诱导时，必须考虑到维持胚胎发育的最适环境因素，以提高四倍体诱导率以及胚胎发育的成功率，因此必须通过研究确定好最佳温、盐、照度等主要环境因素。
通过物理、化学以及生物等方法抑制PB1释放是诱导贝类四倍体的基本方法，其中，细胞松弛素B(CB)是一种常用的化学诱导剂，CB诱导法操作流程短、倍化率高。目前，已对长牡蛎、栉孔扇贝、紫贻贝、马氏珠母贝等多种贝类开展四倍体育种相关研究，其中牡蛎类已培育出四倍体成贝，形成了牡蛎多倍体产业。对菲律宾蛤仔的四倍体诱导有以下几个关键点：对受精阶段和早期胚胎阶段的环境条件的严格控制，特别是温度、盐度、pH、光照强度等对胚胎发育速度和畸形率影响显著的环境因子；对精卵的严苛选择，精卵必须充分发育，同步受精，提高受精过程及胚胎发育过程的同步性；对受精卵处理时间、处理时长和处理强度的精确控制。目前，国外曾有研究菲律宾蛤仔的四倍体诱发，但对于上述条件掌握不当，导致诱导率较低，且不稳定，未能形成成熟的菲律宾蛤仔四倍体诱导技术。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，而提出一种适用于菲律宾蛤仔的四倍体化学诱导方法，能够稳定、高效的制备菲律宾蛤仔四倍体胚胎。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
一种适用于菲律宾蛤仔的四倍体化学诱导方法，具体包括步骤如下：
(1)选择菲律宾蛤仔亲贝，人工促熟或自然成熟；
(2)亲贝阴干4h，置入砂滤海水催产，将开始排放配子的亲贝捡出，淡水冲洗10-30s，单个置于烧杯，继续排放配子，排放完毕立即捡出亲贝；
(3)镜检每杯产物，选择卵子发育良好、未被精子污染的卵液合并，卵液以100μm筛绢过滤去除组织碎片，25μm筛绢收集待用；
(4)选择活力良好的精子悬浊液，用25μm筛绢滤除组织碎屑，收集下层液；
(5)按精卵数量比3:1-6:1，将精子迅速加入卵子悬液，迅速搅动卵液使之均匀受精，控制受精卵浓度在800-1000粒/mL；
(6)受精后13min，向受精卵加入CB溶于二甲基亚砜配制的浓度为0.5mg/mL溶液，同时迅速搅动卵液，维持受精卵保持悬浮状态；
(7)受精后19min，受精卵置于25μm孔径的筛绢内，流水洗卵15-20s，去除CB；
(8)受精卵重新悬浮于砂滤海水中进行胚胎发育，培育密度15-20枚卵/ml；
(9)受精后24h，胚胎发育至D形幼虫阶段，四倍体胚胎制备完成，用流式细胞术测定四倍体诱导率；
(10)对上述步骤中所使用的砂滤海水进行紫外线照射30-60min，控制砂滤海水温度为24.8-25℃，盐度为24-26，pH值为8.0。
而且，所述亲贝为2-3龄，壳面花纹清晰，壳长大于4cm的菲律宾蛤仔。
而且，整个试验期间，环境照度低于40lux。
而且，所述发育良好的卵子，指卵膜完整、规格一致、形状呈规则球形、分散度良好；所述活力良好的精子指，镜下检查，分散度好、游动迅速，≥98％的精子具有正常活动能力。
而且，所述CB的使用方法为，CB溶于二甲基亚砜配制的0.5mg/mL的储备液，使用时按体积比1:1000稀释于受精卵悬液中。
而且，所述胚胎发育，应维持水体微充气，每隔1h搅动水体至浮游期，胚胎保持悬浮状态。
本发明的优点和积极效果是：
本发明首次公开了一种适用于菲律宾蛤仔的四倍体化学诱导方法，具有稳定高效、简便易行等优点。对比以往针对海水双壳类的四倍体化学诱导方法，本发明有如下创新效果：
1、采卵方法不同：以往对菲律宾蛤仔进行精、卵采集，一般采用混合催产，精卵排放后即行受精，导致受精过程同步性差，诱导率低，胚胎畸形率高，本发明采用单一个体催产，可对精卵进行精确的人工选择，有效提高受精过程的同步性；
2、处理方法不同：本发明对配子进行了严格筛选，精确把握受精卵的处理时间及处理强度，适度延长了处理时长，显著提高了四倍体诱导率；
3、前期诱导与后期发育相结合：本发明在综合研究了菲律宾蛤仔四倍体诱导的最佳条件及四倍体胚胎发育的适宜环境因子的基础上提出，对比以往只关注诱导率的四倍体诱导方法(例如实施例6)，本发明具有幼虫孵化率及存活率高、实用性强的优点；
4、获得结果不同：以往在其他双壳类的四倍体诱导率在25-50％间变化，而本发明的四倍体诱导率稳定在50％以上。
具体实施方式
以下对本发明实施做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
实施例1
(1)2013年6月初，在河北省海洋与水产科学研究院某基地，利用在某滩涂采捕的2龄蛤仔作为亲贝，亲贝壳长41.1±3.2mm，在室内进行30天促熟，性腺充分成熟；
(2)催产桶内水体50L，海水为经紫外线照射30min的砂滤海水，亲贝阴干4h后放入桶内，间歇性充气，10min后开始有亲贝排放配子，将开始排放配子的亲贝选出，淡水反复冲洗后，单个置于盛有500mL海水的烧杯内，约10min后，配子基本排放完毕，获得卵液11杯，精液12杯；
(3)镜检每杯卵液，选择卵子卵膜完整、规格一致、形状呈规则球形、分散度良好的卵液3杯合并，得卵子约200万枚，卵子悬浮液以100μm孔径的筛绢过滤去除组织碎片，以25μm孔径筛绢清洗1次，收集卵子，置入已有1800mL海水的塑料烧杯；
(4)镜检每杯精液，其中6杯中90％以上的精子具有正常活动能力，且分散度良好，但其中两杯精子游动速度最快，选择这两杯中浓度较高的一杯，迅速用25μm筛绢滤除组织碎片，备用；
(5)取15mL精子，迅速加入(3)步所得卵子悬浮液中，同时，迅速搅动卵液使卵子同步受精，镜检每个卵子周围附上3-5个精子，向烧杯中加入砂滤海水至水体2000mL；
(6)受精后13min，向受精卵中加入2mL CB溶于二甲基亚砜配制的浓度为0.5mg/mL溶液，所述CB的使用方法为，CB溶于二甲基亚砜配制的0.5mg/mL的储备液，使用时按体积比1:1000稀释于受精卵悬液中，同时迅速搅动卵液使药物作用均匀，显微镜观察，受精卵PB1未出现；
(7)受精后19min，受精卵置于25μm孔径的筛绢内，流水洗卵20s，去除CB，受精卵重新悬浮于新鲜的砂滤海水中，孵化密度18粒/mL，24h后胚胎发育至D形幼虫，孵化率77.8％；
(8)利用步骤(7)中获得的初孵D形幼虫作为样本，采用流式细胞术进行倍性检测，四倍体诱导率为52.2％。
(9)试验期间所用海水的温度为25℃，盐度24.5，pH8.0，环境照度20lux。
实施例2
(1)2015年5月底，在青岛某贝类苗种繁育场，利用本地池塘采捕的2龄蛤仔作为亲贝，亲贝壳长41.8±3.8mm，自然状态下基本发育成熟，在室内经过一周左右的强化，性腺充分成熟；
(2)催产桶内水体30L，海水为经紫外线照射50min的砂滤海水，亲贝阴干4h后放入桶内，间歇性充气，每隔1min充气1min，6min后开始有亲贝排放配子，将开始排放配子的亲贝选出，淡水反复冲洗后，单个置于盛有500mL砂滤海水的烧杯内，约8min后，配子基本排放完毕，获得卵液8杯，精液5杯；
(3)镜检每杯卵液，选择卵子卵膜完整、规格一致、形状呈规则球形、分散度良好的卵液2杯合并，得卵子约160万枚，卵子悬浮液以100μm孔径的筛绢过滤去除组织碎片，以25μm孔径筛绢清洗1次，收集卵子，置入已有1800mL海水的塑料烧杯；
(4)镜检每杯精液，其中4杯中90％以上的精子具有正常活动能力，且分散度良好，但其中1杯精子游动速度最快，选择这杯精液，迅速用25μm筛绢滤除组织碎片，得到精液20mL，备用；
(5)取13mL精子，迅速加入卵子悬浮液中，同时，迅速搅动卵液使卵子同步受精，镜检每个卵子周围附上3-6个精子，继续向烧杯中加入砂滤海水，至水体2000mL；
(6)受精后13min，向受精卵中加入2mL CB溶液(CB溶于二甲基亚砜配制的浓度为0.5mg/mL溶液，所述CB的使用方法为，CB溶于二甲基亚砜配制的0.5mg/mL的储备液，使用时按体积比1:1000稀释于受精卵悬液中)，同时迅速搅动卵液使药物作用均匀，显微镜观察，受精卵PB1未出现；
(7)受精后19min，受精卵置于25μm孔径的筛绢内，流水洗卵15s，去除CB，受精卵重新悬浮于新鲜的砂滤海水中，孵化密度20粒/mL，24h后胚胎发育至D形幼虫，孵化率75.2％；
(8)利用步骤(7)中获得的初孵D形幼虫作为样本，采用流式细胞术进行倍性检测，四倍体诱导率为56.1％。
(9)试验期间所用海水的温度控制为24.9℃，盐度26，pH8.0，环境照度25lux。
实施例3
(1)2015年6月初，在天津市某水产生态重点实验室，利用渤海湾浅海采捕的3龄蛤仔作为亲贝，亲贝壳长43.2±3.2mm，性腺自然成熟；
(2)催产桶内水体30L，海水为经紫外线照射30min的砂滤海水，亲贝阴干4h后放入桶内，间歇性充气，每隔1min间断充气1min，8min后开始有亲贝排放配子，将开始排放配子的亲贝选出，淡水反复冲洗后，单个置于盛有500mL砂滤海水的烧杯内，约8min后，配子基本排放完毕，获得卵液12杯，精液4杯；
(3)镜检每杯卵液，选择卵子卵膜完整、规格一致、形状呈规则球形、分散度良好的卵液4杯合并，得卵子约300万枚，卵子悬浮液以100μm孔径的筛绢过滤去除组织碎片，以25μm孔径筛绢清洗1次，收集卵子，置入已有2800mL海水的塑料烧杯；
(4)镜检每杯精液，其中1杯精子游动速度最快，且分散良好，选择这杯精液，迅速用25μm筛绢滤除组织碎片，得到精液100mL，备用；
(5)取25mL精子，迅速加入卵子悬浮液中，同时，迅速搅动卵液使卵子同步受精，镜检每个卵子周围附上3-5个精子。继续向盛有受精卵的烧杯中加入砂滤海水，至水体3000mL；
(6)受精后13min，向受精卵中加入3mL CB溶液(CB溶于二甲基亚砜配制的浓度为0.5mg/mL溶液，所述CB的使用方法为，CB溶于二甲基亚砜配制的0.5mg/mL的储备液，使用时按体积比1:1000稀释于受精卵悬液中)，同时迅速搅动卵液使药物作用均匀，显微镜观察，受精卵PB1未出现；
(7)受精后19min，迅速将受精卵置于25μm孔径的筛绢内，流水洗卵15s，去除CB；受精卵重新悬浮于新鲜的砂滤海水中，孵化密度15粒/mL，24h后胚胎发育至D形幼虫，孵化率77.3％；
(8)利用步骤7中获得的初孵D形幼虫作为样本，采用流式细胞术进行倍性检测，四倍体诱导率为53.8％。
(9)试验期间所用海水的温度为24.8℃，盐度25，pH8.0，环境照度35lux。
实施例4
(1)2016年5月底，在天津某公司苗种繁育车间，利用碱河口滩涂采捕的3龄蛤仔作为亲贝，亲贝壳长42.9±2.8mm，自然状态下基本发育成熟，在室内经过一周左右的强化，性腺充分成熟；
(2)催产桶内水体30L，海水为经紫外线照射45min的砂滤海水，亲贝阴干3.5h后放入桶内，间歇性充气，每隔1min间断充气1min，7min后开始有亲贝排放配子。将开始排放配子的亲贝选出，淡水反复冲洗后，单个置于盛有300mL砂滤海水的烧杯内，约6min后，配子基本排放完毕，获得卵液15杯，精液5杯；
(3)镜检每杯卵液，选择卵子卵膜完整、规格一致、形状呈规则球形、分散度良好的卵液4杯合并，得卵子约280万枚，卵子悬浮液以100μm孔径的筛绢过滤去除组织碎片，以25μm孔径筛绢清洗1次，收集卵子，置入已有2800mL海水的塑料烧杯；
(4)镜检每杯精液，选择精子游动速度最快且分散良好的1杯精液，迅速用25μm筛绢滤除组织碎片，得到精液80mL，备用；
(5)取20mL精子，迅速加入卵子悬浮液中，同时，迅速搅动卵液使卵子同步受精，镜检每个卵子周围附上3-6个精子。继续向盛有受精卵的烧杯中加入砂滤海水，至水体3000mL；
(6)受精后13min，向受精卵中加入3mL CB溶液(CB溶于二甲基亚砜配制的浓度为0.5mg/mL溶液，所述CB的使用方法为，CB溶于二甲基亚砜配制的0.5mg/mL的储备液，使用时按体积比1:1000稀释于受精卵悬液中)，同时迅速搅动卵液使药物作用均匀，显微镜观察，受精卵PB1未出现；
(7)受精后19min，迅速将受精卵置于25μm孔径的筛绢内，流水洗卵18s，去除CB；受精卵重新悬浮于新鲜的砂滤海水中，孵化密度16粒/mL，24h后胚胎发育至D形幼虫，孵化率75.4％；
(8)利用步骤7中获得的初孵D形幼虫作为样本，采用流式细胞术进行倍性检测，四倍体诱导率为54.2％；
(9)试验期间所用海水的温度为24.8-25℃，盐度25，pH8.0，环境照度40lux。
实施例5
(1)2012年6月初，在天津市海发珍品实业发展有限公司育苗车间，利用在大神堂浅海采捕的2龄蛤仔作为亲贝，亲贝壳长40.2±3.4mm，性腺自然发育成熟；
(2)催产桶内水体50L，海水为经紫外线照射30min的砂滤海水，亲贝阴干4h后放入桶内，间歇性充气，12min后开始有亲贝排放配子，将开始排放配子的亲贝选出，淡水反复冲洗后，单个置于盛有500mL海水的烧杯内，约10min后，配子基本排放完毕，获得卵液8杯，精液7杯；
(3)镜检每杯卵液，选择卵子卵膜完整、规格一致、形状呈规则球形、分散度良好的卵液3杯合并，得卵子约180万枚，卵子悬浮液以100μm孔径的筛绢过滤去除组织碎片，以25μm孔径筛绢清洗1次，收集卵子，置入已有1800mL海水的塑料烧杯；
(4)镜检每杯精液，选择精子游动最快、分散均匀的一杯，迅速用25μm筛绢滤除组织碎片，备用；
(5)取20mL精子，迅速加入(3)步所得卵子悬浮液中，同时，迅速搅动卵液使卵子同步受精，镜检每个卵子周围附上3-5个精子，向烧杯中加入砂滤海水至水体2000mL；
(6)受精后15min，向受精卵中加入2mL CB溶于二甲基亚砜配制的浓度为0.5mg/mL溶液，所述CB的使用方法为，CB溶于二甲基亚砜配制的0.5mg/mL的储备液，使用时按体积比1:1000稀释于受精卵悬液中，同时迅速搅动卵液使药物作用均匀，显微镜观察，已有约20％的受精卵出现PB1；
(7)受精后22min，受精卵置于25μm孔径的筛绢内，流水洗卵30s，去除CB，受精卵重新悬浮于新鲜的砂滤海水中，孵化密度20粒/mL，24h后胚胎发育至D形幼虫，孵化率65.7％；
(8)利用步骤(7)中获得的初孵D形幼虫作为样本，采用流式细胞术进行倍性检测，四倍体诱导率为36.2％。
(9)试验期间所用海水的温度为25℃，盐度30，pH 8.0，环境照度500lux。
实施例6
(1)2013年6月中旬，在天津海升水产养殖有限公司育苗车间，利用在碱河口滩涂采捕的2-3龄蛤仔作为亲贝，亲贝壳长41.8±2.6mm，性腺自然发育成熟；
(2)催产桶内水体40L，海水为经紫外线照射60min的砂滤海水，亲贝阴干3.5h后放入桶内，间歇性充气，8min后开始有亲贝排放配子，将开始排放配子的亲贝选出，淡水反复冲洗后，单个置于盛有500mL海水的烧杯内，约8min后，配子基本排放完毕，获得卵液12杯，精液7杯；
(3)镜检每杯卵液，选择卵子卵膜完整、规格一致、形状呈规则球形、分散度良好的卵液2杯合并，得卵子约160万枚，卵子悬浮液以100μm孔径的筛绢过滤去除组织碎片，以25μm孔径筛绢清洗1次，收集卵子，置入已有1800mL海水的塑料烧杯；
(4)镜检每杯精液，选择精子游动最快、分散均匀的一杯，迅速用25μm筛绢滤除组织碎片，备用；
(5)取12mL精子，迅速加入(3)步所得卵子悬浮液中，同时，迅速搅动卵液使卵子同步受精，镜检每个卵子周围附上3-6个精子，向烧杯中加入砂滤海水至水体2000mL；
(6)受精后10min，向受精卵中加入2mL CB溶于二甲基亚砜配制的浓度为0.5mg/mL溶液，所述CB的使用方法为，CB溶于二甲基亚砜配制的0.5mg/mL的储备液，使用时按体积比1:1000稀释于受精卵悬液中，同时迅速搅动卵液使药物作用均匀，显微镜观察，受精卵PB1未出现；
(7)受精后19min，受精卵置于25μm孔径的筛绢内，流水洗卵20s，去除CB，受精卵重新悬浮于新鲜的砂滤海水中，孵化密度18粒/mL，24h后胚胎发育至D形幼虫，孵化率仅为48.2％，大部分胚胎不能变态为D形幼虫；
(8)利用步骤(7)中获得的初孵D形幼虫作为样本，采用流式细胞术进行倍性检测，四倍体诱导率为53.6％。
(9)试验期间所用海水的温度为27.8℃，盐度26，pH 8.0，环境照度30lux。
Claims (6)
1.一种适用于菲律宾蛤仔的四倍体化学诱导方法，其特征在于：具体包括步骤如下：
(1)选择菲律宾蛤仔亲贝，人工促熟或自然成熟；
(2)亲贝阴干4h，置入砂滤海水催产，将开始排放配子的亲贝捡出，淡水冲洗10-30s，单个置于烧杯，继续排放配子，排放完毕立即捡出亲贝；
(3)镜检每杯产物，选择卵子发育良好、未被精子污染的卵液合并，卵液以100μm筛绢过滤去除组织碎片，25μm筛绢收集待用；
(4)选择活力良好的精子悬浊液，用25μm筛绢滤除组织碎屑，收集下层液；
(5)按精卵数量比3:1-6:1，将精子迅速加入卵子悬液，迅速搅动卵液使之均匀受精，控制受精卵浓度在800-1000粒/mL；
(6)受精后13min，向受精卵加入CB溶于二甲基亚砜配制的浓度为0.5mg/mL溶液，同时迅速搅动卵液，维持受精卵保持悬浮状态；
(7)受精后19min，受精卵置于25μm孔径的筛绢内，流水洗卵15-20s，去除CB；
(8)受精卵重新悬浮于砂滤海水中进行胚胎发育，培育密度15-20枚卵/ml；
(9)受精后24h，胚胎发育至D形幼虫阶段，四倍体胚胎制备完成，用流式细胞术测定四倍体诱导率；
(10)对上述步骤中所使用的砂滤海水进行紫外线照射30-60min，控制砂滤海水温度为24.8-25℃，盐度为24-26，pH值为8.0。
2.根据权利要求1所述的适用于菲律宾蛤仔的四倍体化学诱导方法，其特征在于：所述亲贝为2-3龄，壳面花纹清晰，壳长大于4cm的菲律宾蛤仔。
3.根据权利要求1所述的适用于菲律宾蛤仔的四倍体化学诱导方法，其特征在于：整个试验期间，环境照度低于40lux。
4.根据权利要求1所述的适用于菲律宾蛤仔的四倍体化学诱导方法，其特征在于：所述发育良好的卵子，指卵膜完整、规格一致、形状呈规则球形、分散度良好；所述活力良好的精子指，镜下检查，分散度好、游动迅速，≥98％的精子具有正常活动能力。
5.根据权利要求1所述的适用于菲律宾蛤仔的四倍体化学诱导方法，其特征在于：所述CB的使用方法为，CB溶于二甲基亚砜配制的0.5mg/mL的储备液，使用时按体积比1:1000稀释于受精卵悬液中。
6.根据权利要求1所述的适用于菲律宾蛤仔的四倍体化学诱导方法，其特征在于：所述胚胎发育，应维持水体微充气，每隔1h搅动水体至浮游期，胚胎保持悬浮状态。
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