CN106259084A - 一种厚壳贻贝的三倍体化学诱导方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种适用于厚壳贻贝的三倍体化学诱导方法，实现对厚壳贻贝稳定、高效的三倍体诱导。本发明将排精或排卵的厚壳贻贝个体隔离，便于人工选择质量较好的精子和卵子，这样做可以提高受精卵发育的同步性和三倍体的诱导率。采用6‑DMAP作为诱导剂，费用低、毒性小，且诱导率可以达到65‑75％。

Description

一种厚壳贻贝的三倍体化学诱导方法

技术领域

本发明涉及水产动物遗传育种技术领域，具体涉及一种适用于厚壳贻贝的三倍体化学诱导方法。

背景技术

厚壳贻贝(Mytilus coruscus)隶属软体动物门(Mollusca)，双壳纲(Bivalvia)，贻贝属(Mytilus)，是我国重要的经济贝类之一，目前的年产量在15万吨左右。近两年商品贝的销售价格也一路上涨，2014年比2011年翻了一番，在福州市场的批发价就高达每公斤14元以上。所以，厚壳贻贝在国内的潜在市场正在不断被开发，加工出口也在年年递增，备受欧美消费者喜爱，每年大约有2000多吨产品出口欧美等市场。更有对厚壳贻贝抗菌肽、降血压活性肽、免疫多糖等活性药用物质的发现和开发。

据发明人几年来的跟踪观察，结合对其生殖周期和性腺组织学研究，厚壳贻贝在浙江海区每年有两个繁殖期，即每年的12月中旬有一次小规模的精卵排放活动，翌年的3月中旬又有一次大规模的排放，每次可持续半个月左右。伴随着精卵的大量排放，海区养殖的成贝不仅会出现死亡，而且肥满度迅速下降，会变得很瘦，出肉率降至排放前的1/4。因此，每年的12月下旬至1月中旬，以及3月下旬至4月底，是厚壳贻贝最瘦的时期，且由于排放后肉质带有“腥味”，大大影响了厚壳贻贝的口感品质。因此，如果能减少其性成熟或控制其性腺成熟排放，就能有效解决这一问题。从而提高养殖厚壳贻贝的经济价值，增加养民的收入。

诱导厚壳贻贝三倍体技术是解决上述问题的的有效途径。目前，三倍体技术在海洋贝类的育种上应用十分广泛，三倍体贝类具有不育性，生长速度快、出肉率高、可显著缩短养殖周期等优点。从细胞遗传学角度来看，三倍体是非偶数染色体组，在第一次减数分裂的后期没有联会的同源染色体，故阻碍了生殖细胞正常的减数分裂，结果常常导致性腺发育的衰退或非整倍体配子的产生。三倍体贝类由于达不到性成熟，故其最明显的优势在于其具有不育性，使其只有极少能量用于性腺发育，更多的能量用于生长。不至于因繁殖季节消耗营养体质差而引起死亡,从而提高了成活率。同时，厚壳贻贝味道鲜美的成分主要是肝糖,随着性成熟排放,体内肝糖降低,因此味美不再，甚至会出现腥臊味，而三倍体厚壳贻贝由于不育,繁殖季节其体内的肝糖不降低，一年四季便都可吃到美味可口的厚壳贻贝。这些事实已在许多贝类上得到了证实。但使用目前的贝类三倍体育种方法在厚壳贻贝上的效果并不明显。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，而提出一种适用于厚壳贻贝的三倍体化学诱导方法，实现对厚壳贻贝稳定、高效的三倍体诱导。

本发明的厚壳贻贝的三倍体化学诱导方法，包括如下步骤：

1)厚壳贻贝亲贝的选择及促熟：

选取滩涂采捕亲贝，藻类强化培养，在室内升温促熟，达到性腺充分成熟；

2)亲贝处理及配子排放：

将亲贝阴干8-10小时后置入砂滤海水中进行催产，然后将开始排放配子的亲贝选出，单个置于容器中排放配子，获得卵液和精液；

3)卵液处理：

将收集的卵液以90μm筛绢过滤去除组织碎片，再以30μm筛绢清洗3次后制成卵子悬浮液；

4)精液处理：

将收集的精液用30μm筛绢滤除组织碎片，作为精子备用；

5)受精：

取步骤4)制备的精子加入到上述步骤3)的卵子悬浮液中，精卵比为3:1-5:1，然后将受精卵分成处理组和对照组；

6)在处理组的受精卵中加入6‐DMAP(6‐二甲基氨基嘌呤)：

观察对照组受精卵出现第一极体的比例达到总卵数的50％时，向处理组加入温度为17℃的6-DMAP溶液进行浸泡处理；其中6‐DMAP至终浓度为400μM/L；

7)去除受精卵溶液中的6‐DMAP及孵化；观察对照组中80％至90％的第一极体下方出现第二极体时，以30μm筛绢洗卵，砂滤海水清洗，去除6‐DMAP，然后孵化发育。

所述步骤1)中亲贝为4-5龄厚壳贻贝，壳长大于80mm。

所述步骤2)中砂滤海水的温度为13-17℃，盐度为千分之20-30。

所述步骤6)加入的6‐DMAP溶液具体配制方法为：将6‐DMAP溶于蒸馏水中，配制成400μM/L的溶液，然后加入到受精卵溶液中，至体积比1:1000。

作为一种优选，步骤6)是对照组受精卵出现第一极体的比例达到总卵数的50％时，将处理组的受精卵移入海水中，5min内将海水温度从17℃升温到25℃，然后在移入浓度为400μM/L、温度为30℃的6-DMAP溶液中进行浸泡处理。

本发明首次公开了一种适用于厚壳贻贝的三倍体化学诱导方法，该方法稳定、高效、操作简单。本发明较传统的海水双壳类三倍体化学诱导方法有如下特点：

1、顺应厚壳贻贝的繁殖生物学特性，可操作性强，容易掌握，能够清楚地观察到厚壳贻贝排精排卵的全过程以便较为准确地获得同步性较高的受精卵。

2、本发明采用单一个体催产的方法，及时将排精或排卵的厚壳贻贝个体隔离，便于人工选择质量较好的精子和卵子，这样做可以提高受精卵发育的同步性和三倍体的诱导率。

3、采用6-DMAP作为诱导剂，费用低、毒性小，且诱导率可以达到65-75％。

4、处理时机不同：以往的化学诱导方法一般规定在受精后特定时间加入诱导剂，本发明以显微镜下观察为基础，在卵子出现第一极体的比例达50％时加入6-DMAP，有效降低非整倍体胚胎的出现几率；诱导剂持续处理的时间以对照组中出现第二极体的受精卵比例达到80％作为去除6-DMAP的时间节点，处理时间以受精卵发育进度作为生物学指标，使第二极体被有效抑制在合子内，有效降低二倍体胚胎的出现几率。

5、采用流式细胞仪检测，省时省力，并且能够在早期就快速准确地确定诱导率。6、获得结果不同：以往在其他双壳类的三倍体诱导率在50-70％间变化，而本发明三倍体诱导率在65-75％之间。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1

1)2015年四月初，在嵊泗某基地，选取当地采捕的4-5龄厚壳贻贝作为亲贝，对亲贝进行培育：挑选贝体完整，壳鼓体肥，壳面光洁，生长正常的厚壳贻贝原种，体长8-15cm，雌雄比5：1，于11℃-15℃蓄养20天，经过藻类培养，性腺充分成熟；

2)将亲贝阴干8-10小时后，置于17℃的砂滤海水催产。将开始排放配子的亲贝选出，淡水反复冲洗后，单个置于2000ml塑料盆内排放配子，约30min后，配子基本排放完毕，获得卵液34盆，精液8盆；

3)镜检每盆卵液，选择质量好的卵子进行合并并置于20L的塑料盆中；

4)镜检上述步骤(2)获得的精液，选取活力良好的一盆，用30μm筛绢滤除组织碎片，作为备用精子；

5)取适量精子，加入卵子悬浮液中，及时搅动卵液使卵子同步受精，镜检每个卵子周围附上2-5个精子。受精后的卵子分成2组，即处理组和对照组，处理组体积10000mL，对照组体积1000mL；

6)厚壳贻贝卵受精20min后，将受精卵迅速移入浓度为200-700μM/L、温度为17℃的6-DMAP溶液中浸泡处理，浸泡18min后，当大部分受精卵出现第二极体时，迅速移入17℃孵化水体中正常孵化。

7)幼虫倍性检测：对于获得的初孵D形幼虫，采用流式细胞术进行倍性检测，结果见表1。

表1不同浓度6-DMAP溶液处理受精卵对三倍体幼虫的影响

处理浓度(400μM/L)	D形幼虫成活率(％)	三倍体诱导率(％)
			200	84.2	33.8
300	81.5	35.4
			400	60.7	65.2
500	55.8	68.9
			600	51.6	72.8
700	42.5	81.6

实施例2

考虑到实例1中400μM/L的6-DMAP能得到较为理想的D形幼虫成活率和三倍体诱导率，因此接下来的实验将6-DMAP的浓度统一为400μM/L。

1)亲贝培育：挑选贝体完整，壳鼓体肥，壳面光洁，生长正常的厚壳贻贝原种，体长16-18cm，贝龄5龄，雌雄比4∶1，于13℃-15℃蓄养30天；

2)将亲贝阴干8-10小时后，置于17℃的砂滤海水催产。将开始排放配子的亲贝选出，淡水反复冲洗后，单个置于500ml烧杯中排放配子，约30min后，配子基本排放完毕，获得卵液18杯，精液5杯；

3)镜检每杯卵液，选择质量好的卵子进行合并置于10L的塑料盆中；

4)镜检上述步骤2)获得的精液，选取活力良好的一杯，用30μm筛绢滤除组织碎片，作为备用精子；

5)取适量精子，加入卵子悬浮液中，及时搅动卵液使卵子同步受精，镜检每个卵子周围附上2-4个精子。受精后的卵子分成2组，即处理组和对照组，处理组体积2000mL，对照组体积500mL；

6)厚壳贻贝卵受精30min后，将受精卵迅速移入浓度为400μM/L、温度为17℃的6-DMAP溶液中浸泡处理，浸泡20min后，当大部分受精卵出现第二极体时，迅速移入17℃孵化水体中正常孵化。

7)幼虫倍性检测：对于获得的初孵D形幼虫，采用流式细胞术进行倍性检测，D形幼虫成活率为61.8％，三倍体诱导率为68.4％。

实施例3

申请人在研究中发现，再进行三倍体诱导前，将受精卵先放入温度升高的海水中，然后再用升高温度的6-DMAP溶液处理；这样的步骤即能保证高的三倍体诱导率，又能明显提高诱导的三倍体的存活率。

1)亲贝培育：挑选贝体完整，壳鼓体肥，壳面光洁，生长正常的厚壳贻贝原种，体长12-14cm，贝龄3龄，雌雄比6∶1，于13℃-15℃蓄养60天；

2)将亲贝阴干8-10小时后，置于17℃的砂滤海水催产。将开始排放配子的亲贝选出，淡水反复冲洗后，单个置于1000ml烧杯中排放配子，约30min后，配子基本排放完毕，获得卵液26杯，精液7杯；

3)镜检每杯卵液，选择质量好的卵子进行合并并置于50L的塑料盆中；

4)镜检上述步骤2)获得的精液，选取活力良好的两杯，用30μm筛绢滤除组织碎片，作为备用精子；

5)取适量精子，加入卵子悬浮液中，及时搅动卵液使卵子同步受精，镜检每个卵子周围附上2-4个精子。受精后的卵子分成2组，即处理组和对照组，处理组体积10000mL，对照组体积2000mL；

6)厚壳贻贝卵受精20min后，将受精卵移入海水中，5min内将海水温度从17℃升温到25℃，然后在移入浓度为400μM/L、温度为30℃的6-DMAP溶液中进行浸泡处理，浸泡20min后，当大部分受精卵出现第二极体时，迅速移入17℃孵化水体中正常孵化。

7)幼虫倍性检测：对于获得的初孵D形幼虫，采用流式细胞术进行倍性检测，D形幼虫成活率为69.7％，三倍体诱导率为70.6％。

与实施例2相比，本实施例将6-DMAP溶液处理的温度提高，从而再保持诱导率的情况下，有效的提高了存活率；重复实验的结果也表明提高6-DMAP溶液处理的温度对于诱导三倍体存活具有统计学上的意义(p＜0.05)。

Claims (6)

1.一种厚壳贻贝三倍体化学诱导方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

1)厚壳贻贝亲贝的选择及促熟：

选取滩涂采捕亲贝，藻类强化培养，在室内升温促熟，达到性腺充分成熟；

2)亲贝处理及配子排放：

将亲贝阴干8-10小时后置入砂滤海水中进行催产，然后将开始排放配子的亲贝选出，单个置于容器中排放配子，获得卵液和精液；

3)卵液处理：

将收集的卵液以90μm筛绢过滤去除组织碎片，再以30μm筛绢清洗3次后制成卵子悬浮液；

4)精液处理：

将收集的精液用30μm筛绢滤除组织碎片，作为精子备用；

5)受精：

取步骤4)制备的精子加入到上述步骤3)的卵子悬浮液中，然后将受精卵分成处理组和对照组；

6)在处理组的受精卵中加入6-DMAP：

观察对照组受精卵出现第一极体的比例达到总卵数的50％时，向处理组加入温度为17℃的6-DMAP溶液进行浸泡处理；其中6-DMAP至终浓度为400μM/L；

7)去除受精卵溶液中的6-DMAP及孵化；观察对照组中80％至90％的第一极体下方出现第二极体时，以30μm筛绢洗卵，砂滤海水清洗，去除6-DMAP，然后孵化发育。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中亲贝为4-5龄厚壳贻贝，壳长大于80mm。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中砂滤海水的温度为13-17℃，盐度为千分之20-30。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5)中精子和卵子数量比为3:1-5:1。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤6)加入6-DMAP溶液，是将6-DMAP溶于蒸馏水中，配制成400μM/L的溶液，然后加入到受精卵溶液中，至体积比1:1000。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤6)是对照组受精卵出现第一极体的比例达到总卵数的50％时，将处理组的受精卵移入海水中，5min内将海水温度从17℃升温到25℃，然后在移入浓度为400μM/L、温度为30℃的6-DMAP溶液中进行浸泡处理。