CN115335695A - 用于灵敏检测和定量生物分子的装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了可用于定量生物分子诸如完整蛋白质和核酸的装置、系统、套件和方法。

Description

用于灵敏检测和定量生物分子的装置和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年3月25日提交的美国临时专利申请号62/994,431的权益和优先权，该临时专利申请的全部内容据此以引用方式并入。
技术领域
本公开提供了可用于定量生物分子诸如完整蛋白质和核酸的装置、系统、套件和方法。
背景技术
定量蛋白质生物分析通常通过配体结合测定(LBA)或用于液相色谱(LC)-质谱(MS)分析的自下而上替代肽方法进行。这两种方法通常可以以互补的方式使用。然而，由于目标分子与表位结合并且不提供结构信息(LBA)或消化成小片段(自下而上LC-MS)，因此无法确定分子的代谢转化。
为了满足这一需求，分析人员可以改为利用MS检测来检测和定量完整蛋白质。高分辨率质谱(HRMS)的最新技术进步加上样品制备的改进使得可以使用反相液相色谱(RPLC)来进行完整蛋白质的生物分析。与替代方法不同，对完整蛋白质进行RPLC-HRMS可以提供关于在任何给定测定中准确定量的内容的更完整的图片。另外，由于相关方法中不使用消化或仅使用有限量的消化，因此可以减少样品制备时间。然而，对这种分析模式的新兴尝试已显示，在LC和MS尺寸两者均未适当优化的情况下，完整蛋白质定量可能相当具有挑战性。
发明内容
本公开提供了解决与生物分子定量(包括完整蛋白质定量)(其中通过采用具有优化的固定相和流动相的短柱装置难以在不损失固定相(即吸附剂颗粒)或柱硬件的情况下实现良好的分辨率和高蛋白质回收率)相关的挑战的装置、系统、套件和方法。本公开还解决了长时间运行不利于高通量、完整质量分析的问题。本公开进一步提供了用于获得质谱灵敏度以进一步改进检测的有用的LC和MS方法。
在各个方面，本公开提供了包括色谱分离装置的色谱系统，该色谱分离装置包括(a)吸附剂颗粒，该吸附剂颗粒具有0.5μm至100μm范围内的宽度，以及(b)外壳，该外壳包括入口、出口和入口与出口之间的内部容积，该内部容积(i)填充有具有5mm至50mm范围内的长度和50μm至10mm范围内的宽度的吸附剂颗粒的体积，或者(ii)被构造成填充有具有5mm至50mm范围内的长度和50μm至10mm范围内的宽度的吸附剂颗粒的体积，其中从外壳的入口到出口的流体流动方向沿着吸附剂颗粒的体积的长度。吸附剂颗粒的体积在本文中也称为床体积。
在可以与上述方面结合使用的各种实施方案中，吸附剂颗粒的体积的长度与宽度的比率在10∶1至2∶1范围内，有利地在8∶1至2∶1范围内。
在可以与上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，吸附剂颗粒是例如包含
Figure BDA0003860207650000021
至
Figure BDA0003860207650000022
范围内(例如，
Figure BDA0003860207650000023
至
Figure BDA0003860207650000024
至
Figure BDA0003860207650000025
至
Figure BDA0003860207650000026
至
Figure BDA0003860207650000027
至
Figure BDA0003860207650000028
至
Figure BDA0003860207650000029
至
Figure BDA00038602076500000210
至
Figure BDA00038602076500000211
任何范围内(换句话讲，介于任何两个前述值之间的范围内))的孔径的多孔颗粒。
在可以与任何上述方面结合使用的各种实施方案中，吸附剂颗粒是非多孔颗粒。
在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，吸附剂颗粒是球形颗粒。
在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，吸附剂颗粒的宽度在1.5μm至5μm范围内。
在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，吸附剂颗粒的体积具有5mm至20mm范围内的长度。
在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，吸附剂颗粒的体积具有1mm至5mm范围内的宽度。
在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，吸附剂颗粒的体积是圆柱形体积(在这种情况下，吸附剂颗粒的体积的宽度对应于圆柱形体积的直径)。
在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，吸附剂颗粒包含有机聚合物。在这些实施方案中的一些中，有机聚合物包含至少一种疏水性有机单体。疏水性单体的具体示例包括例如单官能和多官能芳族单体(诸如苯乙烯和二乙烯基苯)、单官能和多官能烯烃单体(诸如乙烯、丙烯或丁烯、聚碳酸酯单体、对苯二甲酸乙二醇酯)、单官能和多官能氟化单体(诸如氟乙烯、1，1-二氟乙烯、四氟乙烯、氯三氟乙烯、六氟丙烯、全氟丙基乙烯基醚或全氟甲基乙烯基醚)、单官能或多官能丙烯酸酯单体、单官能或多官能甲基丙烯酸酯单体或它们的任何组合等。在特定实施方案中，有机聚合物包括甲基丙烯酸甲酯、苯乙烯、二乙烯基苯或它们的任何组合，在一些实施方案中，苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物是优选的。
在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，外壳是色谱柱。
在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，包围吸附剂颗粒的体积的外壳的内表面具有小于60°的水接触角。
在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，包围吸附剂颗粒的体积的外壳被真空护套或加热单元包围。此类外壳(包括真空护套柱和加热柱)的示例在授予Fogwill等人的美国专利申请号2019/0317062中描述，该美国专利申请据此以引用方式并入。
例如，在这些实施方案中的一些中，柱可包括绝缘构件和/或护套。在各种实施方案中，绝缘构件可由包围柱的真空室形成。在一些实施方案中，绝缘构件可包括其中布置有气体的真空室。在一些实施方案中，气体可以是氦、氢、氖、氮、氧、二氧化碳、氩、六氟化硫、氪和氙中的任何一种。在一些实施方案中，真空室可包含大气气体。在一些实施方案中，柱和绝缘构件可集成到形成绝缘色谱柱的单个部件中。例如，护套可包围柱并且真空室可形成在柱与护套之间的区域中。在一些实施方案中，护套可由钢制成。形成绝缘构件的真空室可为柱提供热绝缘。绝热构件可基本上防止在柱内形成径向热梯度。
在这些实施方案中的一些中，柱的至少一部分可布置在加热器内，或者柱可布置在加热器的外部。另选地或另外，加热器可与柱串联布置，使得流动相在到达柱之前通过加热器。在示例性实施方案中，可提供各种传感器(诸如温度传感器)以监测进入柱和/或离开柱的流动相的温度。在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，色谱系统进一步包括检测器。在各种实施方案中，色谱分离装置的出口直接连接到检测器。在这些实施方案中的一些中，色谱分离装置和检测器设置在单个装置中。这种构造(特别地，柱直接联接到质谱仪离子源装置(诸如电喷射离子化发射器))的示例在授予Fogwill等人的美国专利申请号2019/0317062中描述。
在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，检测器是荧光检测器或者基于UV、可见光和/或近IR光等的检测器。
在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，检测器是质谱仪。在这些实施方案中的某些中，质谱仪是基于四极杆的质谱仪和/或离子迁移质谱仪和/或基于飞行时间的质谱仪。在某些实施方案中，质谱仪可以是基于四极杆的混合高分辨率质谱仪(HRMS)或高分辨率离子迁移质谱仪(HDMS，高清晰度质谱仪)。
在各个方面，本公开提供了用于分离生物分子的方法，该方法包括：(a)将包含生物分子的水性溶液加载到根据任何上述方面和实施方案的色谱分离装置的外壳的入口中，由此将生物分子加载到外壳的内部容积内的吸附剂颗粒上，以及(b)将选自包含水和挥发性酸的水性酸性流动相或包含水和挥发性碱的水性碱性流动相的流动相以足以在来自外壳的出口的洗脱液流中从吸附剂洗脱加载的生物分子的至少一部分的体积引入色谱分离装置的入口中。
在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，流动相还包含一种或多种极性有机溶剂。此类溶剂的示例可选自乙腈、丙酮、四氢呋喃、二氯甲烷、乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二甲醚、甲醇以及它们的组合。
在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，在洗脱过程期间，流动相的组成发生改变。在这些实施方案中的一些中，在洗脱过程期间，流动相中水的浓度降低，并且流动相中极性有机溶剂的浓度增加。
在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，在洗脱过程期间，流动相的温度升高或降低。
在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，流动相、色谱分离装置或两者被加热。
在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，流动相是包含水和挥发性酸的酸性水性流动相。在这些实施方案中的某些中，生物分子包含一种或多种完整蛋白质。挥发性酸的示例包括有机酸(诸如甲酸、乙酸、二氟乙酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、戊二酸)和有机羟基酸(诸如乙醇酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、葡糖酸)和上述的共混物等。
在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，生物分子包含一种或多种完整蛋白质。在这些实施方案中的一些中，吸附剂颗粒的体积在10μL至100μL的范围内，并且在具有介于0.1ng和100ng之间的蛋白质的样品中获得线性质谱检测(R2＞0.90)。在这些实施方案中的一些中，吸附剂颗粒的体积在1μL至10μL的范围内，并且在具有介于0.01ng与10ng之间的蛋白质的样品中获得线性质谱检测(R2＞0.90)。
在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，流动相是包含水和挥发性碱的碱性水性流动相。在这些实施方案中的某些中，生物分子包含一种或多种核酸聚合物。挥发性碱的示例包括氢氧化铵和挥发性胺，包括有机胺诸如甲胺、甲烷二胺、乙胺、乙二胺、二乙胺、二乙醇胺、氨丁三醇、胆碱、吡咯烷、吡咯、哌嗪或吡啶等。
在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，用于分离生物分子的方法还包括用检测器分析洗脱液流。
在各种实施方案中，检测器是荧光检测器。
在各种实施方案中，检测器是质谱仪。
在各种实施方案中，检测器是基于四极杆的质谱仪。在这些实施方案中的一些中，四极杆用作质量过滤器。例如，四极杆可用作质量过滤器以滤除m/z值小于1,000的离子、滤除m/z值为1,500的离子或滤除m/z值小于1,800m/z的离子等。
在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，用于分离生物分子的方法还包括对洗脱液流进行气相离子迁移分离。
在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，洗脱液流包含或被怀疑包含目标分析物，并且用于分离生物分子的方法还包括用锁定喷雾标准品校准质谱仪。在一些实施方案中，在适合产生具有在目标分析物所表现出的锁定质量离子值的+/-50％内的m/z值的锁定质量离子的条件下电喷雾锁定喷雾标准品。在某些实施方案中，在适合产生介于1,000m/z和10,000m/z之间、更特别地介于2,000m/z与4,000m/z之间的锁定质量离子的条件下电喷雾锁定喷雾标准品。
本公开的其他方面涉及包括色谱分离装置的套件，该色谱分离装置包括(a)根据任何上述方面和实施方案的吸附剂颗粒，该吸附剂颗粒由有机聚合物形成并且具有在0.5μm至100μm范围内的宽度，以及(b)外壳，该外壳包含入口、出口和入口与出口之间的内部容积，该内部容积填充有具有2mm至50mm范围内(例如，2mm至5mm至10mm至20mm至30mm至40mm至50mm的任何范围内)的长度和100μm至10mm范围内(例如，100μm至200μm至500μm至1mm至2mm至5mm至10mm的任何范围内)的宽度的吸附剂颗粒的体积，或者被构造成填充有具有2mm至50mm范围内(例如，2mm至5mm至10mm至20mm至30mm至40mm至50mm的任何范围内)的长度和100μm至10mm范围内(例如，100μm至200μm至500μm至1mm至2mm至5mm至10mm的任何范围内)的宽度的吸附剂颗粒的体积，其中从外壳的入口到出口的流体流动方向沿着吸附剂颗粒的体积的长度。
在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，包围吸附剂颗粒的体积的外壳的内表面具有小于60°的水接触角。
在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，套件还包括一个或多个小瓶。在这些实施方案中的一些中，一个或多个小瓶的内表面具有小于60°的水接触角。在某些实施方案中，小瓶包括内表面，该内表面包括O2-等离子体处理的聚合物表面，诸如O2-等离子体处理的聚烯烃(例如聚烯烃，诸如聚乙烯和聚丙烯等)小瓶。
在阅读详细描述和随后的权利要求后，其他方面和实施方案对于本领域技术人员将变得显而易见。
附图说明
图1呈现了如使用2.1×50mm柱观察到在不同固定相上获得的抗桔霉素鼠类mAb蛋白回收的色谱分离数据。
图2呈现了如使用聚(苯乙烯-共-二乙烯基苯)(PS-DVB)固定相的不同长度柱观察到的抗桔霉素鼠类mAb相对于NIST mAb的有效峰容量值。
图3A-3D说明了如通过提取离子色谱图(XIC)(图3A)、来自NIST参考材料8671的低于纳克检测的MS数据(图3B，原始MS数据；图3C，去卷积MS数据)以及绘制NIST mAb从0.025ng到200ng的质量负载的校准曲线所示(图3D)的2.1×15mm PS DVB柱的宽动态检测范围。
图4A-4C表示如用低于1mm ID、5cm长度柱装置使用热梯度(图4A)和洗脱梯度(图4B)进行1ng质量负载检测和使用BSA作为载体蛋白分离曲妥珠单抗(图4C)获得的使用热梯度联合洗脱梯度收集的数据。
图5A-5B示出了在主动预热和柱加热的情况下(图5A)以及在主动预热但不柱加热的情况下(图5B)使用2.1×15mm PS DVB柱进行100ng质量负载分离抗桔霉素鼠类mAb的LCMS色谱选择性比较。
图6A-6B呈现了使用
Figure BDA0003860207650000071
IMS QToF质谱仪并使用自动配置(图6A)和手动配置四极杆(图6B)设置如通过输注抗桔霉素mAb检测到的质谱比较。
图7A-7C表示曲妥珠单抗(25ng质量负载)和牛血清白蛋白的共洗脱混合物的离子迁移谱比较。在IMS提取之前通过全扫描(图7A)和放大光谱(图7B)以及在IMS提取之后用放大光谱(图7C)示出了曲妥珠单抗的质谱。
图8呈现了在进行抗桔霉素鼠类mAb的分离时从锁定喷雾通道的总离子色谱图获得的烯醇酶T37的质谱。
具体实施方式
许多不同类型的柱和吸附剂颗粒可用于蛋白质的色谱分离和分析。在各种实施方案中，表现出最小量的二级相互作用的柱或装置可能是有益的。虽然不限于理论，但拒信在分析低质量负载期间，二级相互作用会对峰形和峰回收产生负面影响。如果存在高亲和力二级相互作用位点，诸如由离子结合位点和疏水性结合位点两者组成的那些位点，则不期望的大量蛋白质可能被过强地吸附，并且峰形和回收可能会受到影响。本发明人已经找到了使这些影响最小化的方式。第一种方式是使用由有机聚合物形成的吸附剂颗粒，并且第二种方式是在柱中使用不多于提供足够的保留和选择性以分辨目标分析物所需的吸附剂颗粒。在各种实施方案中，希望采用具有足够大孔径的吸附剂颗粒以允许感兴趣的蛋白质扩散通过。在各种实施方案中，选择适合在高温和酸性条件下使用的由有机聚合物形成的吸附剂颗粒，因为蛋白质LC-MS通常在高温下使用用于离子配对的疏水性酸性流动相添加剂运行。有机酸(包括甲酸(FA))可用于蛋白质的生物分析以提供高MS灵敏度，但是也可有效地使用比三氟乙酸(TFA)具有更低分辨能力的更弱的酸。
各种不同的吸附剂颗粒已经用于蛋白质生物分析。然而，本发明人已经发现，这些吸附剂颗粒的性能可以根据应用和所需的检测限而显著不同。例如，如上所述，对于非常低的检测限，已经表明使二级相互作用最小化可能是重要的。二氧化硅、有机二氧化硅和聚合物吸附剂颗粒的分析表明，含有硅烷醇的吸附剂颗粒可能不利于蛋白质分析物的痕量水平检测(参见以下实施例1)。虽然有机二氧化硅显示其本身是比100％二氧化硅颗粒更好的选择，但在各种实施方案中，100％基于聚合物的吸附剂颗粒更胜一筹。在一些实施方案中，吸附剂颗粒基于含有苯乙烯、二乙烯基苯、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯或它们的混合物的聚合物。这些吸附剂颗粒本质上可以是无孔的，或者可以是多孔的或表面多孔的，含有
Figure BDA0003860207650000081
至
Figure BDA0003860207650000082
有利地
Figure BDA0003860207650000083
至
Figure BDA0003860207650000084
范围内的孔径。这些吸附剂颗粒还可以表现出1μm至100μm、更理想地1.5μm至5μm的粒径。
虽然不限于理论，但似乎柱装置中二级相互作用的数量与固定相的量或柱床的尺寸成比例，这进而在低质量负载的状态下影响蛋白质峰形和回收。为了证明这一点，本发明人已经比较了使用2.1mm ID×5mm、10mm、15mm、20mm和50mm长的柱装置的分离(参见以下实施例2)。从10mm至50mm长度，分离分辨能力看起来相当，并且仅利用5mm装置的分辨率有显著降低。因此，在某些优选实施方案中，使用具有100μm至4.6mm ID的内径尺寸和5mm至50mm、更优选地10mm至20mm范围内的长度的填充柱。
理论上，具有大孔径联合足够小的粒径的吸附剂颗粒应提供改进的分离性能和检测能力。在这点上，本发明人已经发现，通过研究聚合物聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)颗粒的孔隙率，大于
Figure BDA0003860207650000091
的孔径可以提供分辨率益处。此外，较小的粒度也可能是有益的。3μm的
Figure BDA0003860207650000092
PS-DVB颗粒已显示提供比5μm的
Figure BDA0003860207650000093
颗粒更高的峰容量，并且已显示证明具有低检测限(在不使用载体蛋白的情况下，对于NIST mAb的纯溶液，低至0.025ng质量负载)，表明这些吸附剂颗粒提供了用于蛋白质生物分析的粒度和孔径的良好平衡(参见以下实施例3)。在一些具体实施方案中，具有10μL至100μL空容积室的柱装置填充有1μm至5μm直径的吸附剂颗粒并且用于实现介于0.1ng和100ng蛋白质之间的线性质谱检测(R2＞0.90)。在其他实施方案中，具有1μL至10μL空容积室的柱装置填充有1μm至5μm直径的吸附剂颗粒并且用于实现介于0.01ng与10ng蛋白质之间的线性质谱检测(R2＞0.90)。
使用具有特意短的吸附剂颗粒床的色谱柱，液相色谱技术也得到了优化。例如，柱温可以用于提高灵敏度和改善峰形、加快运行时间以及洗脱分析物(诸如蛋白质或其他生物分子)。本发明人已经发现，具有减少量的色谱材料的短柱此较长的柱或含有更多固定相材料的柱对温度变化更敏感，并且可以更快地到达高温和从高温冷却下来。通过将温度梯度与流动相组成梯度联合，可以获得蛋白质分析物的增强选择性、分辨率和灵敏度(参见实施例4)。在一些实施方案中，可将设定温度与多等度流动相组成分布联合，或可将温度梯度可与多等度流动相组成分布偶联，或可将多等度温度分布可与恒定流动相组成偶联，或可将多等度温度分布与流动相组成梯度偶联，或可将多等度温度分布与多等度流动相组成分布偶联，这在涉及多种蛋白物质的分离(例如，涉及载体蛋白的那些分离)中可能是有益的。
在其他实施方案中，使用等度梯度或热梯度，表明通过单独使用主动预热，或在流动相进入柱时仅仅加热流动相，可以产生与使用柱加热器的那些分离等同或甚至有利的选择性(参见实施例5)。通过避免使用色谱柱加热器，可以使用主动预热将色谱柱直接联接到检测器入口。以这种方式，可以通过减少通向检测器的管道并因此使分散最小化来提高灵敏度。此外，直接集成到具有优化的温度控制的MS接口的短床长度柱可使分散最小化并且甚至进一步增加MS灵敏度。相关地，在具有或不具有优化的温度控制的情况下，将荧光检测器直接或集成联接到短床长度柱装置也可提高可行的低于纳克定量的FLR灵敏度。
还发现，当将单克隆抗体和抗体药物缀合物连续稀释到玻璃样品容器中时，可能发生有问题的样品损失。为了减轻这些样品损失，可采用O2等离子体处理的聚丙烯小瓶。进而，可以在更宽的动态范围内获得更低的检测下限以及改善的线性(参见实施例3)。聚合物或气相沉积涂覆的样品容器、流动相流动路径、柱硬件和检测器部件也可提高分析物回收率。
为了精确地检测低浓度的蛋白质分析物，可结合上述柱技术和液相色谱条件使用高灵敏度MS。特别地，利用基于四极杆的混合质谱仪，分析人员可以通过将四极杆作为仅对高m/z离子具有选择性的质量过滤器来操作而提高灵敏度。因此，四极杆调谐在通过HRMS优化蛋白质检测中可能是非常有用，尤其是当其用于实现低检测限时。对于肽和蛋白质分析，可采用四极杆飞行时间质谱仪(QTOF MS)。四极杆基于施加到其杆的RF和DC电压来管理离子的传输，其中离子的运动任何可以通过Mathieu方程来表征。通过调节这些电压，离子可以穿过四极杆或与杆碰撞，从而在未被检测到的情况下排出。离子的这种选择性过滤可以用于调谐较低m/z的离子或另选地调谐较高m/z的离子。
迄今为止，已经用四极杆的自动设置进行了HRMS蛋白质定量分析，其提供了低和高m/z离子两者的全扫描和传输。然而，本发明人已经观察到，调谐混合仪器的四极杆有显著的优点，使得其仅传输对应于感兴趣的完整蛋白质分析物的自然电荷状态分布的离子。实际上，这大大提高了质谱灵敏度和检测。例如，当输注和检测抗桔霉素鼠类mAb时，将四极杆调谐为仅传输2,000m/z至5,000m/z离子使得显著改善了信噪比(参见实施例6)。进而，这允许当运行LC-MS分离时实现更高的灵敏度，因为本发明人已经示出提取离子色谱图(XIC)峰面积增加两倍。在一些实施方案中，因此将本公开的方法与中和并滤除m/z值小于1,000、有益地小于1,500并且更有益地小于1,800m/z的离子的四极杆质量过滤组合。
本发明人还研究了互补的气相分离和数据处理软件。利用这些技术，可以结合气相离子迁移分离，其根据它们的碰撞横截面和毫秒时间尺度分离来分辨蛋白质构象和关键分析物。当在LC分离与MS检测之间添加离子迁移(如可以用具有离子迁移光谱能力的(IMS)-QTOF质谱仪(诸如
Figure BDA0003860207650000111
IMS-QTOF(Waters Corporation，Milford，MA))完成)时，可以利用离子的漂移时间分析来提高分离的选择性。在这点上，
Figure BDA0003860207650000112
质谱仪能够根据它们在气相离子迁移上的差异来部分地分辨曲妥珠单抗和白蛋白(牛血清白蛋白)(参见实施例7)。
Figure BDA0003860207650000113
的离子迁移分辨率低于其他可商购获得的IMS仪器(诸如SYNAPT G2-Si系统(Waters Corporation))的离子迁移分辨率。因此，可以合理地假设IMS的益处将在使用其他一些类型的仪器时变得甚至更加明显。在一些实施方案中，可采用循环离子迁移分离器，从而进一步增加IMS分辨率。在各种实施方案中，本公开的方法包括使用离子迁移分离来滤除具有不希望的漂移时间的离子或促进更彻底的数据分析。在这点上，可以使用各种算法来将电荷状态分布去卷积成单个不带电离子峰。然后可将定量应用于去卷积数据。另选地，可以单个电荷状态、多个组合电荷状态或提取离子色谱图的形式来定量信号。一般来讲，通常的做法是使用原始数据并测量对应于蛋白质分析物的最高电荷状态的强度或提取离子色谱图；然而，这会牺牲离子信号和相对于噪声的选择性。最大熵一直是用于去卷积的处理工具的主要示例，并且还使用了其他算法，诸如基于简约分析的算法。优化去卷积信号处理可产生甚至更精确的蛋白质定量。
也可在一些实施方案中采用质量校准技术。通过与分析物一起运行参考或锁定喷雾标准品，可以获得精确的质量测量结果。然而，使用的标准品通常是得到此根据完整蛋白质的电喷雾预期的低得多的m/z值的那些标准品。为了提供更精确的校准，可以使用具有目标分析物范围内的MS曲线的参考化合物。因此，在本公开中，已经特别地选择了锁定喷雾化合物和电喷雾条件以得到更合适的锁定喷雾信号。在一个实施方案中，本发明人选择烯醇酶T37肽作为锁定喷雾标准品，因为其分子量为2827.3g/mol，这将在+1电荷状态下得到2828.3m/z。还考虑了含有感兴趣的m/z窗口内的值的其他化合物，包括但不限于蜂毒素、泛素和胰岛素。对于烯醇酶T37，最佳的是以从10mM乙酸铵与0.2％氢氧化铵的混合物开始的稀释浓度电喷雾肽。在实施例8中，也使用优化的四重设置来增加1+电荷状态离子的灵敏度。使用来自酸或碱(诸如三乙胺)的蒸气改变脱溶剂气体流量也可进一步优化1+电荷状态离子并且甚至为生物分子的MS质量提供电荷状态降低优点。在一些实施方案中，在合适的条件下电喷雾锁定喷雾化合物以产生介于2,000m/z与4,000m/z之间的锁定质量离子。在一些实施方案中，可例如使用挡板使电喷雾与柱装置的流出物互换，使得可以实现更精确的实时质量校正。
利用柱装置、液相色谱梯度条件、质谱仪方法和/或处理算法的优化，本公开提供了可以用于使用LC-MS定量分析蛋白质的详细方法。可将具有特意小的床体积的装置与宽孔聚合物固定相配对，以便改善蛋白质回收、提供高通量能力和在更宽的质量负载动态范围内提供更好的峰形。与四重和锁定喷雾调谐联合，可以实现更高的MS灵敏度、更低的检测限和更可靠的峰检出。在其他实施方案中，这些装置可用于分离其他生物分子(诸如核酸聚合物)、用于分离和分析小分子(在这种情况下可采用较小孔径的吸附剂颗粒)或可用于其他应用，诸如用于蛋白质滴定分析、蛋白质脱盐、多维分析等其他应用。
实施例1：用不同吸附剂颗粒进行蛋白质回收
以Waters Intact mAb Mass Check Standard的形式获得抗桔霉素鼠类mAb。将小瓶的内容物在0.1％(w/v)甲酸的水溶液中重构，并且使用相同的样品稀释剂进行系列稀释。使用Waters Corporation ACQUITY UPLC H-Class Bio LC系统和以下概述的分离方法进行该样品的分析。图1呈现了用各种RPLC柱获得的色谱数据。
LC条件
柱：表面多孔C4，
Figure BDA0003860207650000122
2.7μm，2.1×50mm
表面多孔，
Figure BDA0003860207650000121
2.7μm Polyphenyl BioResolveTM RP mAb聚苯基柱)，2.1×50mm
有机二氧化硅
Figure BDA0003860207650000123
3.5μm(Waters BEH(乙烯桥联混合物)TechnologyTM)，2.1×50mm
聚合物PS-DVB
Figure BDA0003860207650000124
4μm，2.1×50mm
聚合物PS-DVB
Figure BDA0003860207650000125
5μm，2.1×50mm
流动相A：0.1％(w/v)甲酸的水溶液
流动相B：0.1％(w/v)甲酸的乙腈溶液
柱温：80℃
进样体积：0.5μL
样品浓度：0.02μg/μL
样品稀释剂：0.1％(w/v)甲酸的水溶液
FLR检测：Ex 280nm(10Hz)，Em 320nm
梯度表：
Figure BDA0003860207650000131
实施例2：具有变化柱长度的峰容量
以Waters Corporation Intact mAb Mass Check Standard的形式获得抗桔霉素鼠类mAb。以Waters Corporation Humanized mAb Mass Check Standard的形式获得NISTmAb。将小瓶的内容物在0.1％(w/v)甲酸的水溶液中重构。使用Waters CorporationACQUITY UPLC H-Class Bio LC系统和以下概述的分离方法进行这些样品的分析。图2呈现了如用聚合物PS-DVB固定相的各种长度柱获得的分离的分辨率。
LC条件：
柱：聚合物PS-DVB
Figure BDA0003860207650000132
5μm，2.1×5mm
聚合物PS-DVB
Figure BDA0003860207650000133
5μm，2.1×15mm
聚合物PS-DVB
Figure BDA0003860207650000134
5μm，2.1×20mm
聚合物PS-DVB
Figure BDA0003860207650000135
5μm，2.1×50mm
流动相A：0.1％(w/v)甲酸的水溶液
流动相B：0.1％(w/v)甲酸的乙腈溶液
柱温：90℃
进样体积：0.5μL或2μL
样品浓度：0.5μg/μL或2μg/μL
样品稀释剂：0.1％(w/v)甲酸的水溶液
FLR检测：Ex 280nm(10Hz)，Em 320nm
梯度表：
Figure BDA0003860207650000141
实施例3：具有动态检测范围的MS
以Waters Corporation Humanized mAb Mass Check Standard的形式获得NISTmAb并将其在0.1％(w/v)甲酸的水溶液中重构。使用相同的样品稀释剂进行系列稀释。使用Waters Corporation ACQUITY UPLC H-Class Bio LC系统和
Figure BDA0003860207650000143
IMS-QTOF质谱仪和以下概述的分离方法进行这些样品的分析。图3A-3D呈现了如用短的原型聚合物PS-DVB固定相获得的分离的动态范围。
LC条件：
柱：聚合物PS-DVB
Figure BDA0003860207650000144
3μm，2.1×15mm
流动相A：0.1％(w/v)甲酸的水溶液
流动相B：0.1％(w/v)甲酸的乙腈溶液
柱温：90℃
进样体积：1μL
样品浓度：0.000025μg/μL至0.2μg/μL
样品稀释剂：0.1％(w/v)甲酸的水溶液
梯度表：
Figure BDA0003860207650000142
Figure BDA0003860207650000151
MS条件：
模式：ESI正离子，灵敏度
质量范围：2000-4000m/z
毛细管：2.25kV
取样锥：140V
源偏移：140V
源温度：150℃
脱溶剂温度：600℃
脱溶剂气体：600L/h
碰撞能量：6V
四极杆选项：自动或手动
手动配置m/z：2000、2750、3500
实施例4：热梯度
将曲妥珠单抗掺入大鼠血浆中并使用蛋白A进行免疫沉淀。从抗体中释放曲妥珠单抗并以0.1mg/mL的浓度添加BSA。图4表示如用低于1mm ID、5cm长的柱装置获得的使用与洗脱梯度联合的热梯度收集的数据。
LC条件：
柱：混合二氧化硅C18，
Figure BDA0003860207650000152
1.7μm，低于1mm×5cm
流动相A：0.1％(w/v)甲酸的水溶液
流动相B：0.1％(w/v)甲酸的乙腈溶液
柱温：90℃
进样体积：1μL
样品浓度：10ng/μL
样品稀释剂：0.1％(w/v)甲酸的水溶液
分析流速：5μL/min
MS条件：
模式：ESI正离子，灵敏度
质量范围：500-4000m/z
毛细管：3.5kV
取样锥：190V
源偏移：150V
源温度：150℃
纳流气体：0.10巴，恒定压力
碰撞能量：关闭
四极杆选项：自动
实施例5：具有直接柱连接的MS
以Waters Corporation Intact mAb Mass Check Standard的形式获得抗桔霉素鼠类mAb。将小瓶的内容物在0.1％(w/v)甲酸的水溶液中重构。使用Waters CorporationACQUITY UPLC H-Class Bio LC系统和以下概述的分离方法进行分析。图5呈现了使用与柱加热一起的主动预热和仅使用主动预热如用短的原型聚合物PS-DVB固定相获得的分离的分辨率。
LC条件：
柱：聚合物PS-DVB
Figure BDA0003860207650000162
5μm，2.1×15mm
流动相A：0.1％(w/v)甲酸的水溶液
流动相B：0.1％(w/v)甲酸的乙腈溶液
柱温：90℃
进样体积：1μL
样品浓度：0.1μg/μL
样品稀释剂：0.1％(w/v)甲酸的水溶液
梯度表：
Figure BDA0003860207650000161
MS条件：
模式：ESI正离子，灵敏度
质量范围：2000-4000m/z
毛细管：2.25kV
取样锥：140V
源偏移：140V
源温度：150℃
脱溶剂温度：600℃
脱溶剂气体：600L/h
碰撞能量：6V
四极杆选项：自动或手动
手动配置m/z：2000、2750、3500
实施例6：具有四重调谐的MS
以Waters Corporation Intact mAb Mass Check Standard的形式获得抗桔霉素鼠类mAb并经由蛋白A对其进行纯化，得到10mM酸铵中的2.5mg/mL溶液。将样品用水稀释至0.1mg/mL，并使用以下概述的MS设置将其输注到
Figure BDA0003860207650000171
IMS-QTOF质谱仪中。图6呈现了在MS曲线下使用自动和手动四极杆选项获得的质谱比较。
MS条件：
模式：ESI正离子，灵敏度
质量范围：2000-4000m/z
毛细管：2.25kV
取样锥：140V
源偏移：140V
源温度：150℃
脱溶剂温度：600℃
脱溶剂气体：600L/h
碰撞能量：6V
输注流速：20.00μL/min
四极杆选项：自动或手动
手动配置m/z：2000、2750、3500
实施例7：具有离子迁移的MS
使用山羊抗人Fc捕获抗体免疫纯化以5μg/mL掺入小鼠血浆的曲妥珠单抗。使用0.1％TFA从抗体中释放曲妥珠单抗并以0.1mg/mL的浓度添加BSA。图7表示在数据采集中具有和不具有离子迁移的情况下收集的数据的比较。
LC条件：
柱：聚合物PS-DVB
Figure BDA0003860207650000182
4μm，2.1×50mm
流动相A：0.1％(w/v)甲酸的水溶液
流动相B：0.1％(w/v)甲酸的乙腈溶液
柱温：80℃
进样体积：1μL
样品浓度：5μg/mL
样品稀释剂：0.1％(w/v)甲酸的水溶液
梯度表：
Figure BDA0003860207650000181
MS条件：
模式：ESI正离子，灵敏度
质量范围：500-4000m/z
毛细管：2.75kV
取样锥：140V
源偏移：140V
源温度：150℃
脱溶剂温度：600℃
脱溶剂气体：800L/h
碰撞能量：6V
四极杆配置选项：自动
实施例8：具有靶向锁定喷雾的MS
烯醇酶T37肽从New England BioLabs(Ipswich，MA)获得并将其在用0.1％甲酸改性的50∶50水∶乙腈中重构。将样品用10mM用0.2％氢氧化铵改性的乙酸铵稀释至0.1mg/mL，并使用如以下概述的方法和Waters Corporation ACQUITY UPLC H-Class Bio LC系统和
Figure BDA0003860207650000192
IMS-QTOF质谱仪作为用于分离抗桔霉素鼠类mAb的锁定喷雾参考标准品进行输注。以Waters Corporation Intact mAb Mass Check Standard的形式获得抗桔霉素鼠类mAb并将其在0.1％(w/v)甲酸的水溶液中重构。图8呈现了在进行抗桔霉素鼠类mAb的分离时从锁定喷雾通道的总离子色谱图获得的烯醇酶T37的质谱。
LC条件：
柱：聚合物PS-DVB
Figure BDA0003860207650000193
3μm，2.1×15mm
流动相A：0.1％(w/v)甲酸的水溶液
流动相B：0.1％(w/v)甲酸的乙腈溶液
柱温：90℃
进样体积：1μL
样品浓度：0.005μg/μL
样品稀释剂：0.1％(w/v)甲酸的水溶液
梯度表：
Figure BDA0003860207650000191
MS条件：
模式：ESI正离子，灵敏度
质量范围：2000-4000m/z
毛细管：2.25kV
取样锥：140V
源偏移：140V
源温度：150℃
脱溶剂温度：600℃
脱溶剂气体：600L/h
碰撞能量：6V
输注流速：20.00μL/min
参考毛细管：2.25kV
四极杆选项：自动或手动
手动配置m/z：2000、2750、3500

Claims (25)

1.一种用于分离完整蛋白质的方法，所述方法包括：
将包含所述完整蛋白质的溶液引入色谱分离装置的外壳入口，所述色谱分离装置包括
(a)吸附剂颗粒，所述吸附剂颗粒由有机聚合物形成并且具有0.5μm至100μm范围内的宽度，所述有机聚合物由一种或多种单官能或多官能芳族单体形成，以及
(b)外壳，所述外壳包括所述外壳入口、外壳出口和所述外壳入口与所述外壳出口之间的内部容积，所述内部容积被填充有具有2mm至50mm范围内的长度和50μm至10mm范围内的宽度的所述吸附剂颗粒的体积，其中从所述外壳入口到所述外壳出口的流体流动方向沿着所述吸附剂颗粒的所述体积的长度，并且其中所述吸附剂颗粒的所述体积的长度与宽度的比率在10∶1至2∶1范围内，
由此将所述完整蛋白质加载到所述吸附剂颗粒上；以及
将包含甲酸、乙酸和/或氟化羧酸的酸性流动相以足以在来自所述色谱装置的所述外壳出口的洗脱液流中从所述吸附剂洗脱所加载的完整蛋白质的至少一部分的体积引入所述色谱分离装置的所述外壳入口中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种单官能或多官能芳族单体包括苯乙烯和二乙烯基苯。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述吸附剂颗粒是具有
Figure FDA0003860207640000011
至
Figure FDA0003860207640000012
范围内的孔径的多孔颗粒或表面多孔颗粒。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述外壳的所述内部容积的内表面具有小于60°的水接触角。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述流动相还包含一种或多种极性有机溶剂。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在洗脱过程期间，所述流动相的组成发生改变。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述流动相还包含一种或多种极性有机溶剂和水。
8.根据权利要求7所述的方法，其中在洗脱过程期间，所述流动相中所述水的浓度降低，并且所述流动相中所述极性有机溶剂的浓度增加。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中在洗脱过程期间，所述流动相的温度升高。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中在所述洗脱过程期间，(a)将恒定温度分布与多等度流动相组成分布联合，(b)将温度梯度与多等度流动相组成分布联合，(c)将多等度温度分布与恒定流动相组成联合，(d)将多等度温度分布与流动相组成梯度联合，或(e)将多等度温度分布与多等度流动相组成分布联合。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，所述方法还包括用检测器分析所述洗脱液流。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述检测器是荧光检测器。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述检测器是质谱仪。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述检测器是基于四极杆的质谱仪，并且其中所述四极杆用作质量过滤器。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述四极杆用于滤除m/z值小于1,000的离子。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述吸附剂颗粒的所述体积在10μL至100μL的范围内，并且在具有介于0.1ng和100ng之间的所述一种或多种完整蛋白质的样品中获得线性质谱检测(R2＞0.90)，或者其中所述吸附剂颗粒的所述体积在1μL至10μL的范围内，并且在具有介于0.01ng与10ng之间的所述一种或多种完整蛋白质的样品中获得线性质谱检测(R2＞0.90)。
17.根据权利要求13-16中任一项所述的方法，所述方法还包括对所述洗脱液流进行气相离子迁移分离。
18.根据权利要求13-17中任一项所述的方法，其中所述方法还包括用锁定喷雾标准品校准所述质谱仪。
19.根据权利要求13-17中任一项所述的方法，其中所述方法还包括用在适合产生具有在目标分析物所表现出的锁定质量离子值的+/-50％内的m/z值的锁定质量离子的条件下电喷雾的锁定喷雾标准品校准所述质谱仪。
20.根据权利要求13-17中任一项所述的方法，其中所述方法还包括用在适合产生介于1,000m/z和10,000m/z之间的锁定质量离子的条件下电喷雾的锁定喷雾标准品校准所述质谱仪。
21.一种套件，所述套件包括：
色谱分离装置，所述色谱分离装置包括(a)吸附剂颗粒，所述吸附剂颗粒由有机聚合物形成并且具有0.5μm至100μm范围内的宽度，所述有机聚合物由一种或多种单官能或多官能芳族单体形成，以及(b)外壳，所述外壳包括外壳入口、外壳出口和所述外壳入口与所述外壳出口之间的内部容积，所述内部容积填充有具有2mm至50mm范围内的长度和50μm至10mm范围内的宽度的所述吸附剂颗粒的体积，或者所述内部容积被构造成填充有具有2mm至50mm范围内的长度和50μm至10mm范围内的宽度的所述吸附剂颗粒的体积，其中从所述外壳入口到所述外壳出口的流体流动方向沿着所述吸附剂颗粒的所述体积的长度，并且其中所述吸附剂颗粒的所述体积的长度与宽度的比率在10∶1至2∶1范围内，以及(b)外壳，所述外壳包括入口、出口和所述入口与所述出口之间的内部容积，所述内部容积填充有具有2mm至50mm范围内的长度和100μm至10mm范围内的宽度的所述吸附剂颗粒的体积，或者被构造成填充有具有2mm至50mm范围内的长度和100μm至10mm范围内的宽度的所述吸附剂颗粒的体积，其中从所述外壳的所述入口到所述出口的流体流动方向沿着所述吸附剂颗粒的所述体积的长度；以及
酸性溶液的容器，所述酸性溶液包含甲酸、乙酸和/或氟化羧酸。
22.根据权利要求21所述的套件，其中所述外壳的所述内部容积的内表面具有小于60°的水接触角。
23.根据权利要求21-22中任一项所述的套件，所述套件还包括一个或多个小瓶，其中所述一个或多个小瓶的内表面具有小于60°的水接触角。
24.根据权利要求21-22中任一项所述的套件，所述套件还包括一个或多个小瓶，其中所述一个或多个小瓶是O2-等离子体处理的聚烯烃小瓶。
25.根据权利要求24所述的套件，其中所述聚烯烃是聚乙烯或聚丙烯。
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