JP2022504663A - セグメント化されたポリ（Ａ）尾部を有するｍＲＮＡをコードする配列を含むプラスミド - Google Patents

Abstract

本開示は、ｍＲＮＡ分子と修飾ポリ（Ａ）尾部とをコードする配列を含むＤＮＡプラスミドを提供し、ここで、その配列のうち修飾ポリ（Ａ）尾部をコードする部分は、５５～６５個のＴヌクレオチドからなるヌクレオチド配列としてそれぞれ定められた少なくとも２つのＡエレメントと、少なくとも１つのＳエレメントであって、各Ｓエレメントが、Ｔヌクレオチドではない１個のヌクレオチド又は２～１０個のヌクレオチド、好ましくは６個のヌクレオチドであって、その２個の末端ヌクレオチドのそれぞれがＴヌクレオチドではないヌクレオチドからなるＳエレメントとからなり、Ａエレメントの総数がＳエレメントの総数よりも１多く、任意の２つのＡエレメントが１つのＳエレメントで隔てられていることを特徴とし；前記ＤＮＡプラスミドは、前記少なくとも１つのＳエレメントのない同じＤＮＡプラスミドと比較して、細菌宿主細胞内での増幅中の組換えの減少を示す。

Description

本発明は、以下を含有するＤＮＡ配列を含むＤＮＡプラスミドに関する：ｍＲＮＡ分子をコードする第１ヌクレオチド配列並びにその下流に位置し、修飾ポリ（Ａ）尾部をコードする第２ヌクレオチド配列であって、５５～６５個のＴヌクレオチドからなるヌクレオチド配列としてそれぞれ定められた少なくとも２つのＡエレメントと、少なくとも１つのＳエレメントであって、各Ｓエレメントが、ｉ）Ｔヌクレオチドではない１個のヌクレオチド又はｉｉ）２～１０個のヌクレオチド、好ましくは６個のヌクレオチドであって、その２個の末端ヌクレオチドのそれぞれがＴヌクレオチドではないヌクレオチドからなるＳエレメントとからなり、Ａエレメントの総数がＳエレメントの総数よりも１多く、任意の２つのＡエレメントが１つのＳエレメントで隔てられていることを特徴とする、第２ヌクレオチド配列。

遺伝情報は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）として細胞内に保存され、必要に応じてリボ核酸（ＲＮＡ）に転写され得る。ＤＮＡ分子もＲＮＡ分子も、窒素塩基、五炭糖、及び少なくとも１つのリン酸基からなるヌクレオチドで構成されている。ＲＮＡ分子には、タンパク質合成のための遺伝情報を運ぶｍＲＮＡ分子など、様々な種類が存在する。真核生物では、これらのｍＲＮＡ分子は、未成熟ｍＲＮＡ分子としてＤＮＡから転写され、その後、例えば３’ポリアデノシン（ポリ（Ａ））尾部を付加することによって修飾される。ポリ（Ａ）尾部は、成熟した機能性ｍＲＮＡ分子に特徴的であるが、数少ない例外の一つとしてヒストンｍＲＮＡが知られている（Ｍａｒｚｌｕｆｆ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．， ９（１１）：８４３－８５４； Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １２：Ｒ１６）。次いで、成熟ｍＲＮＡ分子は、細胞核から細胞質に輸送され、タンパク質に翻訳される。このように、ＤＮＡ配列並びに成熟ｍＲＮＡ分子の量、安定性及び翻訳効率が、主に細胞内でのそれぞれのタンパク質の合成を決定する。

細胞内での目的のタンパク質の合成を最適化するために、例えば治療の場面では、ｍＲＮＡベースの手法が有望な手段となる。ｍＲＮＡ分子を使用すると、タンパク質翻訳のためにはその分子を細胞の細胞質内に導入するだけでよいという利点がある（Ｔａｖｅｒｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ， １５０（３）：２３８－２４７； Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ， ７１（３）：４８４－４８９）。プラスミドなどの適切な運搬体に含まれるそれぞれのＤＮＡ配列を使用する場合と比較して、ｍＲＮＡ分子を使用する場合は、難易度がさらに低く、より効率的であり、プラスミド又はその一部がゲノムに組み込まれた場合に染色体ＤＮＡが変更されるという大きなリスクを回避する。ｍＲＮＡ分子の不安定性及び免疫応答など、ｍＲＮＡ分子を細胞に導入する際に生じる最初の課題は、化学修飾されたヌクレオチドなどを用いてうまく解決されてきた（国際公開第２０１１／０１２３１６； ＥＰ ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ １８ １５ ６４６６．７； Ｋａｒｉｋo ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．， １６（１１）：１８３３－４０）。これまでに、５’キャップの効率及び５’キャップの構造、非翻訳領域の性質、タンパク質コード配列のコドン最適化、タンパク質コード配列及び非翻訳領域におけるｍｉＲＮＡ標的配列の存在並びに３’ポリ（Ａ）尾部の長さなど、ｍＲＮＡ効率のいくつかの決定要因が特定され、調査されてきた（例えば、Ｔｈｅｓｓ， ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．， ２３（９）， １４５６－１４６４； Ｔｒｅｐｏｔｅｃ ｅｔ ａｌ．， ２０１８， Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｐａｒｔ Ａ， ｔｅｎ．ＴＥＡ．２０１７．０４８５； Ｚｉｅｍｎｉａｋ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ５（１０）， １１４１－１１７２）。

ｍＲＮＡベースの手法の効率を向上させるためには、ポリ（Ａ）尾部の長さを最適化することが重要である。ポリ（Ａ）尾部の分解は、５’キャップの加水分解又はさらに３’から５’への分解が起こる前のｍＲＮＡ崩壊の最初の工程であることから、ポリ（Ａ）尾部の長さは、ｍＲＮＡターンオーバーの主要な決定要因と考えられている（例えば、Ｌｏｄｉｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ， ２０００， Ｓｅｃｔｉｏｎ １１．２； Ｒａｍａｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ４４（１６）： ７５１１－７５２６でレビューされている）。例えば哺乳類では、ポリ（Ａ）尾部の平均長は約２００～３００ヌクレオチドであると報告されている。さらに、ポリ（Ａ）尾部は、Ａヌクレオチド以外の末端ヌクレオチドを提示することができ、例えば、末端Ｇヌクレオチドがポリ（Ａ）尾部の分解を遅らせ得ると報告されている（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ ５３（６）：１０４４－１０５２）。しかしながら、ポリ（Ａ）尾部は、それぞれのＤＮＡ配列にコードされているのではなく、転写された未成熟ｍＲＮＡ分子に酵素的に付加されるため、その長さを最適化することは依然として困難である。

ポリ（Ａ）尾部の長さは、ｍＲＮＡの安定性及び翻訳効率に影響を与える最も重要な生理学的要因の１つであることが知られているが、既存の技術では、規定のポリ（Ａ）尾部長のｍＲＮＡ分子を大規模に生産することは困難である。治療用途などでのタンパク質合成用のｍＲＮＡ分子は、主にｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって生成される。そのような手法は、ＤＮＡ鋳型をベースとし、ＤＮＡ鋳型ではポリ（Ａ）尾部はすでにコードされており、ＤＮＡ鋳型はクローニング又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅される。生成されたｍＲＮＡにポリ（Ａ）尾部が酵素触媒により付加される場合に対して、これらの手法は、理論的に、規定の再現可能な長さのポリ（Ａ）尾部を提供するという利点がある（Ｈｏｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．， ２００６， Ｂｌｏｏｄ， １０８（１３）， ４００９－４０１８）。ｍＲＮＡ分子の大規模生産の観点から、プラスミドベースの手法が特に注目されている。プラスミドの製造は十分に確立されており、容易にスケールアップされ、適正製造基準の条件下で実施することができる。ＰＣＲベースの手法と比較して、プラスミドの製造コスト及びｍＲＮＡ分子のコード配列に望ましくない変異が生じるリスクは、比較的低い。しかしながら、鋳型ＤＮＡ配列の細菌増幅にプラスミドを使用することには、１つ主な課題が残っている：それは、ポリ（Ａ）尾部をコードする配列などのホモポリマー配列は、プラスミドＤＮＡの細菌増幅中に組換えを起こす可能性があり、その結果、ポリ（Ａ）尾部をコードする配列が、予測不可能な方法で時間の経過とともに短縮することである（Ｇｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， ５（４）：ｅ３０６）。Ｇｒｉｅｒらは、例えば、７０ヌクレオチド長ポリ（Ａ）尾部をコードする配列は、少なくとも１００ヌクレオチドからなるポリ（Ａ）尾部をコードする配列とは対照的に安定した状態を保つことを報告しているが、これは真核生物において新たに合成された成熟ｍＲＮＡ分子の平均３００ヌクレオチド長ポリ（Ａ）尾部よりも依然としてはるかに短い（Ｇｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， ５（４）：ｅ３０６）。ポリ（Ａ）尾部長を長くする試みとして、最大５００ヌクレオチドのポリ（Ａ）尾部をコードする配列を安定してクローニングすることができる線状プラスミドシステムの使用に焦点を当てた研究が行われた（Ｇｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， ５（４）：ｅ３０６）。特に、ｍＲＮＡ分子をコードする配列は、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を用いてプラスミドに組み込むことができる。部位特異的制限酵素に特有の部位を使用して、比較的短いポリ（Ａ）尾部をコードする配列を反復プロセスで追加することができるため、プラスミドに含まれるポリ（Ａ）尾部をコードする配列を伸長することができる。しかしながら、使用した線状プラスミドが低コピープラスミド（ＢｉｇＥａｓｙ（登録商標） ｖ２．０線形クローニングシステム（ｐＪＡＺＺ（登録商標） Ｖｅｃｔｏｒｓ）、Ｌｕｃｉｇｅｎ）であるため、このシステムを効率的にスケールアップして、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されるｍＲＮＡの鋳型を大規模に生産できるかどうかは不明である。そのため、規定の安定したポリ（Ａ）尾部長のｍＲＮＡ分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写用鋳型を大規模に提供することができる代わりの解決策を手元に用意する必要がある。

本出願は、特許請求の範囲に記載の実施形態を提供することにより、規定のポリ（Ａ）尾部長のｍＲＮＡ分子をコードし、細菌細胞内での増幅中のポリ（Ａ）尾部コード配列の組換えの減少を示すｉｎ ｖｉｔｒｏ転写鋳型の必要性に取り組むものである。

特に、本発明は、以下を含有するＤＮＡ配列を含むＤＮＡプラスミドに関する：（ｉ）ｍＲＮＡ分子をコードする第１ヌクレオチド配列並びにその下流に位置し、（ｉｉ）修飾ポリ（Ａ）尾部をコードする第２ヌクレオチド配列であって、（ａ）５５～６５個のＴヌクレオチドからなるヌクレオチド配列としてそれぞれ定められた少なくとも２つのＡエレメントと、（ｂ）少なくとも１つのＳエレメントであって、各Ｓエレメントが、（ｂ１）Ｔヌクレオチドではない１個のヌクレオチド又は（ｂ２）２～１０個のヌクレオチド、好ましくは６個のヌクレオチドであって、その２個の末端ヌクレオチドのそれぞれがＴヌクレオチドではないヌクレオチドからなるＳエレメントとからなり；Ａエレメントの総数がＳエレメントの総数よりも１多く、任意の２つのＡエレメントが１つのＳエレメントで隔てられていることを特徴とする、第２ヌクレオチド配列。言い換えれば、本発明は、修飾された、すなわちセグメント化されたポリ（Ａ）尾部を有するｍＲＮＡ分子に、好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏで転写され得るＤＮＡ配列を含むＤＮＡプラスミドに関する。

驚くべきことに、修飾ポリ（Ａ）尾部を有するｍＲＮＡ分子をコードするそのようなＤＮＡ配列を含むＤＮＡプラスミドは、同じポリ（Ａ）尾部を有する同じｍＲＮＡ分子をコードするが前記ＳエレメントのないＤＮＡ配列を含む同じＤＮＡプラスミドと比較して、細菌細胞内での前記ＤＮＡプラスミドの増幅中の組換えの減少を示すことが分かった。

本発明の文脈において、「ＤＮＡ」及び「ＲＮＡ」という用語は、一本鎖若しくは二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ分子を指す。別段の記載がない場合、「ＤＮＡ」及び「ＤＮＡ分子」という用語は、Ａ、Ｃ、Ｇ及び／又はＴヌクレオチドで構成された二本鎖ＤＮＡ分子を指し、「ＲＮＡ」及び「ＲＮＡ分子」という用語は、Ａ、Ｃ、Ｇ及び／又はＵヌクレオチドで構成された一本鎖ＲＮＡ分子を指す。本明細書において、前記Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ及びＵヌクレオチドとは、アデニン、シトシン、グアニン、チミン及びウラシルをそれぞれの窒素塩基として含むヌクレオチドを指す。

本発明の文脈において、「ＤＮＡプラスミド」という用語は、二本鎖ＤＮＡ分子からなるプラスミドを指す。別段の記載がない場合、「プラスミド」という用語は環状ＤＮＡ分子を指すが、この用語は線状ＤＮＡ分子を包含する可能性もある。特に、「プラスミド」という用語は、環状プラスミドを制限酵素などで切断して線状化することによって、環状プラスミド分子を線状分子に変換した結果生じる分子も対象とする。プラスミドは、細胞内に染色体ＤＮＡとして保存されている遺伝情報とは独立して、細胞内で複製、すなわち増幅することができ、細菌細胞内でクローニング、すなわち遺伝情報を増幅させるために使用され得る。好ましくは、本発明によるＤＮＡプラスミドは、中コピー又は高コピーのプラスミドであり、より好ましくは高コピーのプラスミドである。そのような高コピープラスミドの例は、ｐＵＣ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）、ｐＧＥＭ（登録商標）、ｐＴＺプラスミド又はプラスミドの高コピーを援助する複製起点を含むその他のプラスミド（例えば、ｐＭＢ１、ｐＣｏｌＥ１）をベースにしたベクターである。

本発明によるプラスミドは、好ましくは、少なくとも複製起点（ＯＲＩ）、マーカー遺伝子若しくはそのフラグメント及び／又はレポーター遺伝子若しくはそのフラグメント並びにＤＮＡエレメントの挿入を可能にする固有の制限部位、好ましくはマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）の形態の制限部位を含む。ＯＲＩは複製に必須である。抗生物質耐性遺伝子などのマーカー遺伝子は、前記マーカー遺伝子を含むプラスミドを含有する細胞を識別するのに有利である。ｌａｃＺ又はルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子は、連結している標的遺伝子の発現の強度及び／若しくは調節を測定するのに有利である又は発現を試験するため及び／若しくは新たな手法若しくはシステムを確立するための代替標的遺伝子として使用することができる。ＭＣＳは、ＤＮＡプラスミド内に固有であり、それぞれが制限酵素によって特異的に認識されるいくつかの制限部位を含む。特に、ＭＣＳは、本発明によるＤＮＡ配列又は第２ヌクレオチド配列などの遺伝因子を、適切なＤＮＡプラスミド、好ましくは高コピーＤＮＡプラスミドに組み込むのに有利である。後者の場合、ＤＮＡプラスミドは、第２ヌクレオチド配列によってコードされる修飾ポリ（Ａ）が連結された標的遺伝子（ｍＲＮＡをコードする）をさらに含む。

ＤＮＡプラスミドなどの二本鎖ＤＮＡ分子は、２本の相補的ＤＮＡ鎖からなる。「相補的」という用語は、その窒素塩基が水素結合で互いに自然に結合することができるヌクレオチド、すなわちＡとＴヌクレオチド、ＡとＵヌクレオチド及びＣとＧヌクレオチドを指す。本発明によれば、二本鎖ＤＮＡ分子の２本の鎖のうち、一方の鎖が「ＤＮＡ配列」を含む。本明細書において、「ＤＮＡ配列」とは、ＤＮＡプラスミドなどの二本鎖ＤＮＡ分子の１本鎖の一部を指す。本発明によれば、前記ＤＮＡ配列は、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴヌクレオチドで構成され、本明細書で定められた第１ヌクレオチド配列と第２ヌクレオチド配列とを含む。

本発明の文脈では、前記ＤＮＡ配列に含まれる「第１ヌクレオチド配列」は、「ｍＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列」である。言い換えれば、前記第１ヌクレオチド配列は、前記ＤＮＡ配列のうち、転写、すなわちｍＲＮＡ分子の合成中に鋳型として使用され得る部分を指す。したがって、第１ヌクレオチド配列から「ｍＲＮＡ分子」が転写される場合、前記ｍＲＮＡは、Ｔヌクレオチドの代わりにＵヌクレオチドがｍＲＮＡ分子の合成に使用されることを除いて、前記第１ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有することになる。ポリ（Ａ）尾部は、本来ＤＮＡ配列にはコードされておらず、転写中及び／又は転写後にｍＲＮＡ分子に酵素的に付加されるため、「ｍＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列」という用語は、前記ＤＮＡ配列のうち、ポリ（Ａ）尾部のないｍＲＮＡ分子の転写中に鋳型として使用され得る部分を指す。

本明細書において、「コードしている」又は「コードする」は、ｉ）ｍＲＮＡ分子に転写され得るＤＮＡ配列に含まれる遺伝情報及び／又はｉｉ）アミノ酸配列に翻訳され得るｍＲＮＡ分子に含まれる遺伝情報を指す。したがって、これらの用語は、ｍＲＮＡ分子の転写を介してタンパク質などのアミノ酸配列に変換され得るＤＮＡに含まれる遺伝情報も対象とする。

本明細書において、「ｍＲＮＡ分子」及び「ｍＲＮＡ」という用語は交換可能に使用されており、ＲＮＡ分子のクラスを指すものであり、１つ又は複数のコード配列を含み、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＵヌクレオチドで構成された一本鎖配列であることが好ましい。前記１つ又は複数のコード配列は、翻訳中のアミノ酸配列の合成中に鋳型として使用され得る。言い換えれば、「ｍＲＮＡ」という用語は、アミノ酸配列の発現に適している又はタンパク質などのアミノ酸配列に翻訳可能な任意のＲＮＡ分子を意味すると理解されるべきである。

ｍＲＮＡ分子をコードする第１ヌクレオチド配列及びコードされたｍＲＮＡ分子のさらなる特徴については、以下でより詳細に説明する。

本発明によれば、ＤＮＡプラスミドに含有されるＤＮＡ配列に含まれる前記第１ヌクレオチド配列の後に、前記ＤＮＡ配列に含まれる第２ヌクレオチド配列が続いており、すなわち、前記第２ヌクレオチド配列が前記第１ヌクレオチド配列の下流に位置している。言い換えれば、前記２つの配列は、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ分子の同じ鎖上に位置しており、転写が行われた場合に第１ヌクレオチド配列が最初に転写され、次に第２ヌクレオチド配列が転写されるようになっている。

特に、前記２つのヌクレオチド配列は、互いに近接して又は直接連結して配置されている。好ましい実施形態では、第１ヌクレオチド配列と第２ヌクレオチド配列は互いに直接連結されており、すなわち、介在するヌクレオチドがない。しかしながら、第１ヌクレオチド配列と第２ヌクレオチド配列が、介在するヌクレオチドで隔てられている可能性もある。好ましくは、第１及び第２ヌクレオチド配列は、１００ヌクレオチド以下、より好ましくは５０、４０又は３０ヌクレオチド以下、最も好ましくは２０、１０又は５ヌクレオチド以下で隔てられている。

本発明によれば、ＤＮＡプラスミドのＤＮＡ配列は、第１ヌクレオチド配列と、その下流に位置する第２ヌクレオチド配列とを含む。前記「第２ヌクレオチド配列」は、「修飾ポリ（Ａ）尾部をコードするヌクレオチド配列」である。本明細書において、これは、前記ＤＮＡ配列のうち、前記ＤＮＡ配列の転写中、好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写中に、修飾ポリ（Ａ）尾部の合成用鋳型として使用され得る部分を指す。

未成熟ｍＲＮＡ分子に酵素的に付加される天然のポリ（Ａ）尾部は、通常、Ａヌクレオチドからなる。そのような天然のポリ（Ａ）尾部を、以下では従来のポリ（Ａ）尾部とも呼ぶ。

本発明によれば、「修飾ポリ（Ａ）尾部」という用語は、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含むセグメント化されたポリ（Ａ）尾部を指す。特に、本発明による修飾ポリ（Ａ）尾部をコードする前記第２ヌクレオチド配列は、（ａ）３５～６５個のＴヌクレオチド、好ましくは５５～６５個のＴヌクレオチドからなるヌクレオチド配列としてそれぞれ定められた少なくとも２つのＡエレメントと、（ｂ）少なくとも１つのＳエレメントであって、各Ｓエレメントが、（ｂ１）Ｔヌクレオチドではない１個のヌクレオチド又は（ｂ２）２～１０個のヌクレオチド、好ましくは６個のヌクレオチドであって、その２個の末端ヌクレオチドのそれぞれがＴヌクレオチドではないヌクレオチドからなるＳエレメントとからなり；Ａエレメントの総数がＳエレメントの総数よりも１多く、任意の２つのＡエレメントが１つのＳエレメントで隔てられていることを特徴とする。

本発明によれば、前記Ａエレメント及び前記Ｓエレメントは、前記第２ヌクレオチド配列において交互に配置されている。したがって、「任意の２つのＡエレメントが１つのＳエレメントで隔てられている」という用語は、「任意の２つの連続するＡエレメントが１つのＳエレメントで隔てられている」と理解されることを意図している。例えば、３つのＡエレメント及び２つのＳエレメントの場合、本発明による第２配列は、１つの、すなわち第１Ａエレメント；１つのＳエレメント；別の、すなわち第２Ａエレメント；別のＳエレメント；及びさらなる、すなわち第３Ａエレメントからなる。したがって、この例では、「任意の２つのＡエレメント」という用語は、第１及び第２Ａエレメント並びに第２及び第３Ａエレメントに言及しているが、第１及び第３Ａエレメントには言及していない。したがって、この用語は、少なくとも２つのＡエレメントのいずれかと、残りのＡエレメントのうち最も近いＡエレメントとを指す。

いくつかの実施形態では、本発明によるＤＮＡ配列は、第１ヌクレオチド配列と、それに続く第２ヌクレオチド配列と、それに続くＴヌクレオチド以外の１つ又は複数の追加のヌクレオチドとを含む。前記追加のヌクレオチドは、好ましくは１～５個のＣヌクレオチドであり、より好ましくは１個のＣヌクレオチドである。言い換えれば、ＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ分子と、修飾ポリ（Ａ）尾部と、追加のヌクレオチド、好ましくは１個のＧヌクレオチドとをコードし得る。

添付の実施例によって示されるように 本発明によるｍＲＮＡ分子及び修飾ポリ（Ａ）尾部をコードする第１及び第２ヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ配列を含むＤＮＡプラスミドを使用すると、同じＤＮＡプラスミドであっても、本発明による第２ヌクレオチド配列によってコードされるのと同じ総数のＡヌクレオチドからなる未修飾ポリ（Ａ）尾部をコードする第２ヌクレオチド配列を有するＤＮＡプラスミドと比較して、細菌細胞内での前記ＤＮＡプラスミドの増幅中の組換えが減少することが分かった。言い換えれば、本発明によるＤＮＡプラスミドを使用すると、同じＤＮＡプラスミドであっても、前記少なくとも２つのＡエレメントの間に前記少なくとも１つのＳエレメントがないＤＮＡプラスミドと比較して、細菌細胞内での前記ＤＮＡプラスミドの増幅中の組換えが減少する。

驚くべきことに、同時に、本発明によるＤＮＡ配列から転写されたポリリボヌクレオチドの安定性及び翻訳効率は、一般的に、上記で定められた修飾ポリ（Ａ）尾部によって悪影響を受けないことも観察されている。

本明細書において、「組換え」という用語は、相同組換えを指し、例えばＤＮＡプラスミド及び／又は染色体などのＤＮＡ分子に含まれる２つの非常に類似した又は同一のヌクレオチド配列の間でヌクレオチド配列が交換されることを指す。「組換え」という用語は、分子内相同組換え事象、すなわち同じＤＮＡ分子に含まれる２つの非常に類似した又は同一のヌクレオチド配列の組換えを含む。本発明の文脈では、これは特に、修飾ポリ（Ａ）尾部及び従来のポリ（Ａ）尾部をコードするヌクレオチド配列それぞれと、同じＤＮＡプラスミドに含まれる別の非常に類似した若しくは同一のヌクレオチド配列との、前記プラスミドの増幅中の組換え並びに／又はそのようなヌクレオチド配列の２つの末端部分の組換えを指す。代替的又は追加的に、「組換え」という用語は、ＤＮＡプラスミドに含まれる修飾ポリ（Ａ）尾部及び従来のポリ（Ａ）尾部をコードするヌクレオチド配列それぞれと、例えば同じ細胞に含まれる別のＤＮＡ分子、例えば別のＤＮＡプラスミドに含まれる非常に類似した又は同一のヌクレオチド配列との間の分子間相同組換え事象を含む。

本発明によれば、「組換えが減少する」という用語は、組換えが少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２５％、さらに好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは１００％減少することを意味する。

組換えの減少は、例えば、以下の手順によって測定することができる：遺伝的に同一の細菌細胞を、本発明によるＤＮＡプラスミドの増幅（グループＩ）及び第２ヌクレオチド配列が前記少なくとも１つのＳエレメントを含まないことを除いて同じＤＮＡプラスミドの増幅（グループＩＩ）にそれぞれ使用する。日常検査法を用いて、細菌細胞を増幅時に溶解し、ＤＮＡプラスミドを得て線状化し、含まれるＤＮＡ配列又は第２ヌクレオチド配列を精製することができる。その後、得られたＤＮＡ配列、特に得られた第２ヌクレオチド配列を、例えば、配列決定及び／又はゲル若しくはキャピラリー電気泳動などの電気泳動によって、ヌクレオチドの組成、配列及び／又は長さの観点から定性的に調査することができる。代替的又は追加的に、第２ヌクレオチド配列の長さを測定し、最初に使用した第２ヌクレオチド配列で規定された予想される長さの第２ヌクレオチド配列と、各グループ内の第２ヌクレオチド配列の総数との割合を計算し、グループごとに得られた割合をグループ間で比較することによって、組換えの発生及び頻度を定量的に決定することができる。あるいは、抽出されたＤＮＡ配列をｉｎ ｖｉｔｒｏで転写してから、第２ヌクレオチド配列の場合に上述したように、転写されたポリ（Ａ）尾部の長さをグループＩ及びＩＩの間で調べることもできる。

そのような組換えの減少は、本発明による第２ヌクレオチド配列を含むＤＮＡプラスミドで観察されている。特に、例えば、単一ヌクレオチドからなるＳエレメントは、細菌増幅中の組換えを減少させるのに有利であることが観察されている。したがって、本発明の特に好ましい実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、ｍＲＮＡ分子をコードする第１ヌクレオチド配列と、修飾ポリ（Ａ）尾部をコードする第２ヌクレオチド配列とを含み、ここで、前記Ｓエレメントのいずれか１つは、１個のＣヌクレオチド又は１個のＡヌクレオチドから、好ましくは１個のＣヌクレオチドからなる。

いくつかの実施形態では、本発明による第２ヌクレオチド配列は、１個のＡヌクレオチドで隔てられた２つのＡエレメントからなる。より好ましくは、前記２つのＡエレメントは、１個のＣヌクレオチドで隔てられている。

いくつかの実施形態では、本発明による第２ヌクレオチド配列は、３つのＡエレメントからなり、ここで、任意の２つのＡエレメントは、１個のＡヌクレオチドで隔てられている。好ましくは、前記３つのＡエレメントのうちの任意の２つは、１個のＣヌクレオチドで隔てられている。

いくつかの実施形態では、本発明による第２ヌクレオチド配列は、４つのＡエレメントからなり、ここで、任意の２つのＡエレメントは、１個のＡヌクレオチドで隔てられている。好ましくは、前記４つのＡエレメントのうちの任意の２つは、１個のＣヌクレオチドで隔てられている。

いくつかの実施形態では、本発明による第２ヌクレオチド配列は、５つのＡエレメントからなり、ここで、任意の２つのＡエレメントは、１個のＡヌクレオチドで隔てられている。好ましくは、前記５つのＡエレメントのうちの任意の２つは、１個のＣヌクレオチドで隔てられている。

いくつかの実施形態では、本発明による第２ヌクレオチド配列は、６つのＡエレメントからなり、ここで、任意の２つのＡエレメントは、１個のＡヌクレオチドでそれぞれ隔てられている。好ましくは、前記６つのＡエレメントのうちの任意の２つは、１個のＣヌクレオチドで隔てられている。

いくつかの実施形態では、本発明による第２ヌクレオチド配列は、７つのＡエレメントからなり、ここで、任意の２つのＡエレメントは、１個のＡヌクレオチドで隔てられている。好ましくは、前記７つのＡエレメントのうちの任意の２つは、１個のＣヌクレオチドで隔てられている。

いくつかの実施形態では、本発明による第２ヌクレオチド配列は、８つのＡエレメントからなり、ここで、任意の２つのＡエレメントは、１個のＡヌクレオチドで隔てられている。好ましくは、前記８つのＡエレメントのうちの任意の２つは、１個のＣヌクレオチドで隔てられている。

第２ヌクレオチド配列に複数のＳエレメントが含まれている場合、前記少なくとも２つのＳエレメントは同じ配列を有していてもよいし、その配列が異なっていてもよい。好ましくは、前記少なくとも２つのＳエレメントはそれぞれ、ｉ）１個のヌクレオチドの場合は同じヌクレオチドから又はｉｉ）２～１０個のヌクレオチド、好ましくは６個のヌクレオチドの場合は同じヌクレオチド配列からなる。

したがって、いくつかの実施形態では、本発明による第２ヌクレオチド配列に含まれる少なくとも１つのＳエレメントのそれぞれは、Ａヌクレオチドからなる。好ましくは、本発明による第２ヌクレオチド配列に含まれる少なくとも１つのＳエレメントのそれぞれは、Ｃヌクレオチドからなる。

少なくとも２つのＳエレメントの場合、いくつかの実施形態では、Ｓエレメントの全てではないが少なくとも１つはＡヌクレオチドからなり得、残りの少なくとも１つのＳエレメントのそれぞれは、ｉ）１個のＧヌクレオチド若しくは好ましくはＣヌクレオチドから又はｉｉ）２～１０個のヌクレオチド、好ましくは６個のヌクレオチドであって、その２個の末端ヌクレオチドのそれぞれがＴヌクレオチドではないヌクレオチドからなり得る。

少なくとも２つのＳエレメントの場合、いくつかの実施形態では、Ｓエレメントの全てではないが少なくとも１つはＧヌクレオチドからなることが好ましく、残りの少なくとも１つのＳエレメントのそれぞれは、ｉ）Ａ若しくはＣヌクレオチドから又はｉｉ）２～１０個のヌクレオチド、好ましくは６個のヌクレオチドであって、その２個の末端ヌクレオチドのそれぞれがＴヌクレオチドではないヌクレオチドからなり得る。

いくつかの実施形態では、上記で定められたＤＮＡプラスミドの前記ＤＮＡ配列に含有される修飾ポリ（Ａ）尾部をコードするヌクレオチド配列に含まれるＡエレメントの数は、２、３又は４つである。言い換えれば、特に好ましい実施形態では、修飾ポリ（Ａ）尾部をコードする前記第２ヌクレオチド配列は、ｉ）２つのＡエレメントが１つのＳエレメントを挟んでなる、ｉｉ）３つのＡエレメントと２つのＳエレメントとが交互に並んでなる又はｉｉｉ）４つのＡエレメントと３つのＳエレメントとが交互に並んでなる（Ａ及びＳエレメントは、上記で定められた通りである）。

いくつかの実施形態では、修飾ポリ（Ａ）尾部をコードする前記第２ヌクレオチド配列は、それぞれが同数のＴヌクレオチドからなる２つのＡエレメントと、ｉ）６個のヌクレオチドであって、その２個の末端ヌクレオチドのそれぞれがＴヌクレオチドではないヌクレオチドから又は好ましくはｉｉ）１個のＣヌクレオチドからなる１つのＳエレメントとが交互に並んでなる。

いくつかの実施形態では、修飾ポリ（Ａ）尾部をコードする前記第２ヌクレオチド配列は、それぞれが同数のＴヌクレオチドからなる３つのＡエレメントと、２つのＳエレメントであって、前記２つのＳエレメントの全てが、それぞれｉ）６個のヌクレオチドであって、その２個の末端ヌクレオチドのそれぞれがＴヌクレオチドではないヌクレオチドから又は好ましくはｉｉ）１個のＣヌクレオチドからなる２つのＳエレメントとが交互に並んでなる。

いくつかの実施形態では、修飾ポリ（Ａ）尾部をコードする前記第２ヌクレオチド配列は、それぞれが同数のＴヌクレオチドからなる４つのＡエレメントと、３つのＳエレメントであって、前記３つのＳエレメントの全てが、それぞれｉ）６個のヌクレオチドであって、その２個の末端ヌクレオチドのそれぞれがＴヌクレオチドではないヌクレオチドから又は好ましくはｉｉ）１個のＣヌクレオチドからなる３つのＳエレメントとが交互に並んでなる。

いくつかの実施形態では、修飾ポリ（Ａ）尾部をコードする前記第２ヌクレオチド配列は、２、３又は４つのＡエレメントであって、前記Ａエレメントのうち少なくとも２つでＴヌクレオチドの数が異なる２、３又は４つのＡエレメントと、それぞれ、１、２又は３つのＳエレメントであって、前記Ｓエレメントの全てが、ｉ）６個のヌクレオチドであって、その２個の末端ヌクレオチドのそれぞれがＴヌクレオチドではないヌクレオチドからなる１、２又は３つのＳエレメントとが交互に並んでなる。

いくつかの実施形態では、修飾ポリ（Ａ）尾部をコードする前記第２ヌクレオチド配列は、２、３又は４つのＡエレメントであって、前記Ａエレメントのうち少なくとも２つでＴヌクレオチドの数が異なる２、３又は４つのＡエレメントと、それぞれ、１、２又は３つのＳエレメントであって、好ましくは前記Ｓエレメントの全てが、それぞれ１個のＣヌクレオチドからなる１、２又は３つのＳエレメントとが交互に並んでなる。

上記で定められたＤＮＡプラスミドのいくつかの実施形態では、Ａエレメントの数は４つであり、４つのＡエレメントのヌクレオチド配列は、合わせて２４０ヌクレオチドの全長を有する。

好ましくは、各Ａエレメントは６０ヌクレオチドの長さを有する。言い換えれば、特に好ましい実施形態では、修飾ポリ（Ａ）尾部をコードする前記第２ヌクレオチド配列は、４つのＡエレメントと３つのＳエレメントとが交互に並んでなり、ここで、４つのＡエレメントは合わせて２４０ヌクレオチドからなり、好ましくはそれぞれ同じ長さを有する。

より好ましくは、修飾ポリ（Ａ）尾部をコードする前記第２ヌクレオチド配列は、それぞれが６０個のＴヌクレオチドからなる４つのＡエレメントと、３つのＳエレメントであって、３つのＳエレメント全てが、それぞれｉ）６個のヌクレオチドであって、その２個の末端ヌクレオチドのそれぞれがＴヌクレオチドではないヌクレオチド又は好ましくはｉｉ）１個のＣヌクレオチドからなる３つのＳエレメントとが交互に並んでなる。

上記で定められたＤＮＡプラスミドのいくつかの実施形態では、Ａエレメントの数は２つであり、２つのＡエレメントのヌクレオチド配列は合わせて１２０ヌクレオチドの全長を有する。

好ましくは、各Ａエレメントは６０ヌクレオチドの長さを有する。言い換えれば、特に好ましい実施形態では、修飾ポリ（Ａ）尾部をコードする前記第２ヌクレオチド配列は、合わせて１２０ヌクレオチドの全長を有する２つのＡエレメントからなる。言い換えれば、特に好ましい実施形態では、修飾ポリ（Ａ）尾部をコードする前記第２ヌクレオチド配列は、２つのＡエレメントと１つのＳエレメントとが交互に並んでなり、ここで、２つのＡエレメントは合わせて１２０ヌクレオチドからなり、好ましくはそれぞれ同じ長さを有する。

より好ましくは、修飾ポリ（Ａ）尾部をコードする前記第２ヌクレオチド配列は、それぞれが６０個のＴヌクレオチドからなる２つのＡエレメントが、ｉ）６個のヌクレオチドであって、その２個の末端ヌクレオチドのそれぞれがＴヌクレオチドではないヌクレオチド又は好ましくはｉｉ）１個のＣヌクレオチドからなる１つのＳエレメントを挟んでなる。

上記で定められたＤＮＡプラスミドのいくつかの実施形態では、前記ＤＮＡプラスミドは、修飾ポリ（Ａ）尾部をコードするヌクレオチド配列中に、合わせて１２０ヌクレオチドの全長を有する３つのＡエレメントを含む。言い換えれば、上記で定められたＤＮＡプラスミドの本実施形態では、Ａエレメントの数は３つであり、３つのＡエレメントの前記ヌクレオチド配列は、合わせて１２０ヌクレオチドの全長を有し、好ましくは、各Ａエレメントは４０ヌクレオチドの長さを有する。したがって、前記修飾ポリ（Ａ）尾部をコードする第２ヌクレオチド配列は、３つのＡエレメントと２つのＳエレメントとが交互に並んでなり得る。好ましくは、３つのＡエレメントのそれぞれは、４０個のＴヌクレオチドからなり、２つのＳエレメントのそれぞれは、ｉ）好ましくは１個のＣヌクレオチド又はｉｉ）６個のヌクレオチドであって、その２個の末端ヌクレオチドのそれぞれがＴヌクレオチドではないヌクレオチドからなる。

本発明によれば、ＤＮＡプラスミドは、上記で定められたように、第１ヌクレオチド配列と、それに続く第２ヌクレオチド配列とを含むＤＮＡ配列を含む。好ましくは、第１ヌクレオチド配列の前には、ＤＮＡ配列又はＤＮＡプラスミドに含まれるプロモーターが存在する。プロモーターは、第１ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ配列又は第１ヌクレオチド配列などの後続のヌクレオチド配列の転写を制御し、開始することに関与する。そのため、ＤＮＡプラスミドに含まれるプロモーター、好ましくは強力なプロモーターは、ｍＲＮＡ分子をコードする後続のヌクレオチド配列の転写持続時間及び／又は強度に対する他の遺伝因子の影響を比較するのに有利であり得る。一方、ＤＮＡ配列中に含まれるプロモーター、好ましくは強力なプロモーターは、ｍＲＮＡ分子をコードする後続のヌクレオチド配列の転写持続時間及び／又は強度を最適化するのに有利であり得る。

プロモーターは、少なくとも認識部位とそれに続く結合部位とを含む。認識部位及び結合部位は、転写を媒介又は制御するアミノ酸配列と相互作用し得る。結合部位は、認識部位と比較して、本発明によるＤＮＡ配列に含まれる第１ヌクレオチド配列の近くに位置する。例えば、認識部位は、転写開始部位の約３５ヌクレオチド前及び１０ヌクレオチド前の距離にそれぞれ位置する－３５ボックス及び－１０ボックスであり得る。結合部位は、例えば、原核生物ではプリブノーボックスであり得、真核生物ではＴＡＴＡボックスであり得る。好ましくは、結合部位は、ＤＮＡプラスミド又は第１ヌクレオチド配列に近いＤＮＡ配列に含まれるプリブノーボックスである。

任意選択で、プロモーターは、転写開始部位の約４０及び／又は６０ヌクレオチド前に位置するＡＴリッチ上流エレメント及び／又は認識部と結合部位の間に位置し、プロモーターの活性を高める追加の調節エレメントなど、少なくとも１つの追加の調節エレメントを含む。

特に好ましい実施形態では、プロモーターは強力なプロモーターである。 言い換えれば、プロモーターは、本発明による後続のＤＮＡ配列の転写を促進する配列を含む。強力なプロモーターは、当業者に知られており、例えば、大腸菌のＲｅｃＡプロモーター由来のＯＸＢ１８、ＯＸＢ１９及びＯＸＢ２０プロモーターなどであり、あるいは、通常の実験手順によって同定又は合成することができる。

任意選択で、本発明によるＤＮＡ配列の転写を促進するエンハンサーなどの追加の調節要素がプロモーターに先行してＤＮＡプラスミドに含まれる。

ＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ分子をコードする、すなわち、転写中にｍＲＮＡ分子に変換され得る第１ヌクレオチド配列を含み、ここで、ｍＲＮＡ分子の合成は、その５’末端から始まり、その３’末端で終わる。ｍＲＮＡ分子をコードする第１ヌクレオチド配列の特徴は、コードされたｍＲＮＡ分子に関連して以下でより詳細に説明する。

第１ヌクレオチド配列は、非翻訳領域（ＵＴＲ）をコードする少なくとも１つの領域と、少なくとも１つのコード領域とを含む。好ましくは、第１ヌクレオチド配列は、少なくともコードされるｍＲＮＡ分子の５’ＵＴＲとコード領域とをコードする。コード領域は、非コード部分とコード部分とを含み得る。好ましくは、コード領域は、アミノ酸配列に翻訳され得るｍＲＮＡ分子の部分又はその一部をコードする少なくとも１つのコード部分からなる。

特に好ましい実施形態では、第１ヌクレオチド配列は、コードされたｍＲＮＡ分子の５’ＵＴＲをコードする領域と、それに続くコード領域と、それに続く３’ＵＴＲをコードする領域とを含む。

本発明によれば、第１ヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡ分子をコードする。好ましくは、第１ヌクレオチド配列は、５’ＵＴＲ、コード配列及び３’ＵＴＲを含むｍＲＮＡをコードする。

５’ＵＴＲの５’末端は転写開始点によって画定され、その３’末端にはコード配列が続く。コード配列は、開始コドンと終止コドン、すなわち、翻訳され得るｍＲＮＡ分子の最初と最後のそれぞれ３つのヌクレオチドで終端される。３’ＵＴＲは、コード配列の終止コドンの後に始まり、その後に本発明による第２ヌクレオチド配列によってコードされる修飾ポリ（Ａ）尾部が続く。

５’ＵＴＲは一般に、原核生物ではシャイン・ダルガノ配列、真核生物ではコザック配列又は翻訳開始部位などの少なくとも１つのリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含む。ＲＢＳは、翻訳開始時にリボソームを動員することで、ｍＲＮＡ分子の効率的で正確な翻訳を促進する。所与のＲＢＳの活性は、その長さ及び配列、並びに開始コドンまでの距離を変えることで最適化することができる。代替的にまたは任意選択で、５’ＵＴＲは、内部リボソーム侵入部位、すなわちＩＲＥＳを含む。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ分子の安定性を高めるアミノ酸配列の結合部位、ｍＲＮＡ分子の翻訳を促進するアミノ酸配列の結合部位、リボスイッチなどの調節エレメント、ｍｉＲＮＡ分子などの調節ＲＮＡ分子の結合部位及び／又は翻訳の開始にプラスの影響を与えるヌクレオチド配列などの１つ又は複数の追加の調節配列をさらに含む５’ＵＴＲを含む。さらに、５’ＵＴＲ内には、好ましくは、機能性上流オープンリーディングフレーム、フレーム外の上流の翻訳開始部位、フレーム外の上流の開始コドン及び／又は翻訳を抑制若しくは防止する二次構造を生じさせるヌクレオチド配列が存在しない。そのようなヌクレオチド配列が５’ＵＴＲに存在すると、翻訳に悪影響を及ぼす可能性がある。

コード配列は、第１ヌクレオチド配列の少なくとも１つのコード部分によってコードされ、アミノ酸配列に翻訳され得るコドンを含む。コードされたアミノ酸配列のさらなる特徴は、以下で詳細に説明する。

コード配列は、天然に存在するコード配列のコドンを含むものであっても、部分的又は完全に合成されたコード配列であってもよい。あるいは、コード配列は、使用する天然配列に由来する部分的又は完全にコドン最適化された配列であってもよい。ほとんどのアミノ酸は、複数のコドン、すなわちアミノ酸に翻訳され得るｍＲＮＡ分子の連続する３つのヌクレオチドによってコードされている。種によっては、所与のアミノ酸に対して優先的に使用されるコドンが存在する。より頻繁に発生するコドンの存在は、同じｍＲＮＡ分子であっても比較的稀なコドンを含むものと比べて、所与のｍＲＮＡ分子に基づいて翻訳されるアミノ酸配列の量を増加させることができる。したがって、稀なコドンを回避し、所与のアミノ酸について多くあるコドンの出現率を高めることにより、所与のコード配列におけるコドンを種特異的に適応させ、前記ｍＲＮＡの翻訳を向上させることが有利である。

ｍＲＮＡは、任意選択で３’ＵＴＲを含んでいてもよい。３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡ分子の安定性を高めるアミノ酸配列の結合部位、ｍｉＲＮＡ分子などの調節ＲＮＡ分子の結合部位及び／又はｍＲＮＡ分子の細胞内輸送に関与するシグナル配列などの１つ又は複数の調節配列を含んでいてもよい。

特に好ましい実施形態では、第１ヌクレオチド配列によってコードされるｍＲＮＡ分子は、少なくとも１つのＲＢＳ及び／又はＩＲＥＳを有する５’ＵＴＲと、最適化されたコドンを有するコード配列と、上記で定められた少なくとも１つの調節配列を有する３’ＵＴＲとを含む。

本発明によるｍＲＮＡ分子は、コード配列、すなわちアミノ酸配列をコードする配列を含む。コードされたアミノ酸配列の機能に関しては、特に制限はなく、前記ポリリボヌクレオチドによってコードされる可能性のあるアミノ酸配列について、以下でさらに説明する。本明細書において、「アミノ酸配列」という用語は、あらゆる種類のアミノ酸配列、すなわちそれぞれがペプチド結合を介して結合している２つ以上のアミノ酸の鎖を包含し、目的のあらゆるアミノ酸配列を指す。好ましくは、コードされたアミノ酸配列は、少なくとも５アミノ酸長、より好ましくは少なくとも１０アミノ酸長、さらに好ましくは少なくとも５０、１００、２００又は５００アミノ酸長である。言い換えれば、「アミノ酸配列」という用語は、短いペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質、タンパク質だけでなく、それらのフラグメント、例えば既知タンパク質の部分、好ましくは機能的部分も包含する。これらは、例えば、タンパク質の生物学的に活性な部分又は抗体を産生するのに有効であり得るエピトープなどの抗原性部分などであり得る。

細胞内又は細胞の近傍でのコードされたアミノ酸配列の機能が必要とされる又は有益なものであることが好ましい（例えば、その欠失又は欠損形態が病気又は疾患の引き金となるアミノ酸配列、その提供により病気又は疾患を緩和若しくは予防することができるアミノ酸配列、又は細胞若しくはその近傍において、身体に有益なプロセスを促進することができるアミノ酸配列）。コードされたアミノ酸配列は、完全なアミノ酸配列又はその機能性変異体であり得る。さらに、コードされたアミノ酸配列は、因子、誘導因子、調節因子、刺激因子若しくは酵素又はそれらの機能的フラグメントとして作用することができ、ここで、このアミノ酸配列は、障害、特に代謝障害を治療するために又は新しい血管、組織等の形成などのｉｎ ｖｉｖｏでのプロセスを開始するために、その機能が必要とされるものである。本明細書において、機能性変異体とは、細胞内でその機能が必要とされているアミノ酸配列の機能を担うことができるフラグメント又はその欠如若しくは欠陥形態が病原性であるフラグメントを意味すると理解される。

好ましくは、そのようなアミノ酸配列は、準最適なアミノ酸配列の生合成によって引き起こされる生理学的機能をもたらす又は再生するための補助的又は医療目的の用途に関して有利であり、したがって、疾患の経過に直接的又は間接的に有利な影響を与えることもできる。遺伝的基盤が知られている疾患には、例えば、嚢胞性線維症、血友病、高血圧、コレステロール値の上昇、がん、神経変性疾患、精神疾患などがある。現在、２２，９９３件のヒト遺伝子及び遺伝性疾患のエントリを、それぞれの遺伝子及びそれらの表現型の説明とともに掲載したオンラインカタログが、ＯＮＩＭ（Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ）のウェブページ（ｈｔｔｐ：／／ｏｎｉｍ．ｏｒｇ）で入手可能である：それぞれの配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）から入手可能である。非限定的な例として、以下の表１にいくつかの先天性疾患と、それに対応する遺伝子（単数又は複数）の一覧を示す。細胞シグナル伝達経路は高度に相互作用しているため、ある遺伝子の変異は複数の病的症状を引き起こすが、そのうちの特徴的なもののみを表１に示す。

本発明によるポリリボヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、例えば、抗原として作用する免疫原性反応を誘発する可能性も有し得る。したがって、本発明によるポリリボヌクレオチドは、ワクチン接種を含む補助的又は医療目的での用途に適している。

ＵＴＲ、調節配列及び結合部位などの上述の遺伝因子の適切なヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡ分子の作用及び／又は作用の持続時間を増加させるヌクレオチド配列である。そのようなヌクレオチド配列並びに上述のコード領域及び／又はコード配列は、天然に存在するヌクレオチド配列、変異誘発されたヌクレオチド配列若しくは合成されたヌクレオチド配列又はそれらの組み合わせであり得、当業者に知られている通常の実験によって同定及び適合させることができる。

本発明はさらに、上述のようなＤＮＡプラスミドを含む細菌宿主細胞に関する。本発明によるＤＮＡプラスミドは、形質転換に対してコンピテントである細菌宿主細胞内で保存及び／又は増幅することができる。コンピテント宿主細胞とは、ＤＮＡプラスミドなどの遊離細胞外遺伝物質を、その配列とは無関係に取り込む能力を有する細胞のことである。天然にコンピテントな細菌は、例えば受容体タンパク質又はタンパク質複合体を用いて細胞外遺伝物質に結合する能力を有する。さらに、前記細胞は、ペプチド、タンパク質又はＤＮＡトランスロカーゼなどのタンパク質複合体などを用いて、細胞外空間から細胞内に遺伝物質を移す能力を有する。当業者に知られている広範な細菌細胞は、もともと環境から外因性ＤＮＡを取り込む能力があり、したがって本発明による細菌宿主細胞として機能することができる。さらに、コンピテント細菌宿主細胞は、例えばエレクトロポレーション又は高温への曝露を伴うカルシウムイオンでの処理などの化学薬品を用いて、天然にコンピテントではない細菌細胞から得ることができる。取り込まれたＤＮＡプラスミドは、好ましくは、分解されず、細菌宿主細胞のゲノム情報に組み込まれることもない。

細菌宿主細胞としては、当業者によく知られている大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞が挙げられる。大腸菌細胞では、宿主細胞の遺伝物質への細胞外遺伝物質の組み込みは、ＲｅｃＡ依存プロセス、すなわちＲｅｃＡタンパク質に依存するプロセスで発生し得る。このタンパク質は、ＤＮＡの修復及び維持に必須であり、相同組換えに関与する。したがって、いくつかの実施形態では、本発明による細菌宿主細胞は、大腸菌細胞、好ましくは大腸菌ＲｅｃＡ^－細胞である。これは、本発明によるＤＮＡプラスミドに含まれる遺伝情報が大腸菌細胞の元の遺伝物質に組み込まれるのを回避するのに有利となり得る。

本発明はさらに、細菌宿主細胞内での増幅中の組換えの減少を示すＤＮＡプラスミドを調製するための、上記で定められた修飾ポリ（Ａ）尾部をコードするヌクレオチド配列の使用であって、前記ヌクレオチド配列が、ｍＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列の下流に位置するものである、使用に関する。

本発明によるＤＮＡプラスミドは、当業者に知られている方法で調製することができる。好ましくは、部位特異的制限酵素を用いて、ＤＮＡプラスミドに含まれるＭＣＳを切断し、生成したＤＮＡプラスミドの末端をＤＮＡ配列の末端にライゲーションする。このように、本発明によるＤＮＡ配列は、好ましくは、両部位が前記ＭＣＳで終端される。

修正ポリ（Ａ）尾部をコードするヌクレオチド配列、ｍＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列、ＤＮＡプラスミド及び細菌宿主細胞内での前記ＤＮＡプラスミドの増幅中の組換えの減少に関しては、本発明によるＤＮＡプラスミド及びＤＮＡ配列に関連して上述したことと同じことが当てはまる。さらに、そのようなＤＮＡプラスミド及びＤＮＡ配列の他の特徴も、上述した通りとすることができる。

本発明はさらに、細菌宿主細胞内でのＤＮＡプラスミドの増幅中の組換えを減少させるための、上記で定められた修飾ポリ（Ａ）尾部をコードするヌクレオチド配列の使用に関する。言い換えれば、上記で定められた修飾ポリ（Ａ）尾部をコードするヌクレオチド配列を使用して、細菌細胞におけるこのヌクレオチド配列を含むＤＮＡプラスミドの増幅中の組換えを、同じＤＮＡプラスミドであっても従来のポリ（Ａ）尾部をコードする配列を有するものと比較して、特にポリ（Ａ）尾部をコードするヌクレオチド配列がＳエレメントを含まない同じＤＮＡプラスミドと比較して、減少させることができる。ＤＮＡプラスミドは、好ましくは、ｍＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドであり、修飾ポリ（Ａ）尾部をコードするヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列の下流に配置される。従来のポリ（Ａ）尾部をコードするヌクレオチド配列を、上記で定められた修飾ポリ（Ａ）尾部をコードするヌクレオチド配列で置き換えることによりプラスミドの組換えを減少させることは、特に有利である。

修正ポリ（Ａ）尾部をコードするヌクレオチド配列、ｍＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列、ＤＮＡプラスミド及び細菌宿主細胞内での前記ＤＮＡプラスミドの増幅中の組換えの減少に関しては、本発明によるＤＮＡプラスミドに関連して上述したことと同じことが当てはまる。さらに、そのようなＤＮＡプラスミドの他の特徴も、上述した通りとすることができる。

本発明はさらに、ｍＲＮＡ分子と、その下流に位置するポリ（Ａ）尾部とをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡプラスミドの、細菌宿主細胞内での増幅中の組換えを減少させるための方法であって、前記減少が、ポリ（Ａ）尾部をコードするＤＮＡ配列の部分を、上記で定められた修飾ポリ（Ａ）尾部をコードするヌクレオチド配列で置き換えることによって達成される方法に関する。

ＤＮＡ配列の一部分の置換は、例えば、ＤＮＡ配列の前記部分に隣接するＭＣＳ及び置換に使用されるヌクレオチド配列を用いて行うことができる。したがって、制限酵素を用いて前記ＭＣＳでＤＮＡプラスミドを切断し、得られたフラグメントを、例えばキャピラリー電気泳動又はゲル電気泳動を用いて調査することができる。次いで、前記ＭＣＳを用いて、ポリ（Ａ）尾部をコードするＤＮＡ配列の部分を含まないＤＮＡプラスミドの部分と、修飾ポリ（Ａ）尾部をコードするヌクレオチド配列とをライゲーションすることができる。

修正ポリ（Ａ）尾部をコードするヌクレオチド配列、ｍＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列、ＤＮＡプラスミド、細菌宿主細胞及び細菌宿主細胞内での前記ＤＮＡプラスミドの増幅中の組換えの減少に関しては、本発明によるＤＮＡプラスミドに関連して上述したことと同じことが当てはまる。さらに、そのようなＤＮＡプラスミドの他の特徴も、上述した通りとすることができる。

本発明はさらに、アミノ酸配列及び上記で定められたヌクレオチド配列によってコードされる修飾ポリ（Ａ）尾部をコードする配列を含むポリリボヌクレオチドを製造する方法であって、本発明によるＤＮＡプラスミドからｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって前記ポリリボヌクレオチドを製造する工程を含む方法に関する。

本明細書において、「ポリリボヌクレオチド」という用語は、一本鎖ＲＮＡ分子を指す。本発明によるポリリボヌクレオチドは、第１ヌクレオチド配列によってコードされるｍＲＮＡ分子と、第２ヌクレオチド配列によってコードされる修飾ポリ（Ａ）尾部とを含む。言い換えれば、ポリリボヌクレオチドは、５’ＵＴＲと、コード配列と、任意選択で３’ＵＴＲと、修飾ポリ（Ａ）尾部とを含む。

特に好ましい実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つのＲＢＳ及び／又はＩＲＥＳを有する５’ＵＴＲと、最適化コドンを有するコード配列と、任意選択で少なくとも１つの調節配列を有する３’ＵＴＲと、修飾ポリ（Ａ）尾部とを含む。

任意選択で、ポリリボヌクレオチドは、修飾ポリ（Ａ）尾部に続くＡヌクレオチド以外の追加のヌクレオチド、好ましくは１個のＧヌクレオチドを含む。これにより、例えば、生成されたポリリボヌクレオチドが細胞内に取り込まれたときの寿命、ひいては作用時間を伸ばすことができる。

５’ＵＴＲ、コード配列、３’ＵＴＲ及び修飾ポリ（Ａ）尾部に関しては、上述したことと同じことが当てはまる。さらに、そのような遺伝因子の他の特徴についても、上述した通りとすることができる。

本発明によるポリリボヌクレオチドは、当技術分野で知られている任意の方法で製造することができる。好ましくは、ポリリボヌクレオチドは、本発明によるＤＮＡ配列を鋳型として使用し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写される。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写には、プロモーターを含む精製された線状ＤＮＡ鋳型、リボヌクレオチド三リン酸、緩衝系及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼなどの適切なＲＮＡポリメラーゼが必要である。したがって、本発明によるＤＮＡプラスミドは、一般に、細胞溶解によって得られ、精製される。その後、精製されたＤＮＡプラスミドは、例えば部位特異的制限酵素を用いて、ｉ）第１ヌクレオチド配列に先行するプロモーターの前及びｉｉ）修飾ポリ（Ａ）尾部をコードする第２ヌクレオチド配列の直後又は追加のヌクレオチドがＴヌクレオチドではない場合には前記追加のヌクレオチドの直後、好ましくは１個のＣヌクレオチドの後で切断される。次に、得られた線状鋳型配列は、標準的な実験プロトコルを用いて、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＵヌクレオチドの存在下で、本発明によるポリリボヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に使用される。鋳型はｉ）及びｉｉ）の位置で切断されるため、転写用の鋳型は、目的の修飾ポリ（Ａ）尾部又はＴヌクレオチドではない目的の追加ヌクレオチドで正確に終了する。したがって、例えば、所与の位置で転写を終了させる能力を有するＲＮＡポリメラーゼも、有していないＲＮＡポリメラーゼも使用することができ、その結果、ランオフ転写が可能となる。このように、ＤＮＡプラスミドをｉ）及びｉｉ）の位置で切断し、生成されたヌクレオチド配列を転写のための鋳型、好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のための鋳型として使用することで、ｍＲＮＡ分子及び規定の長さの修飾ポリ（Ａ）尾部を含む本発明によるポリリボヌクレオチドの合成が確実に行われる。Ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたポリリボヌクレオチドの量及び質は、例えば、分光光度法、キャピラリー電気泳動及び／又は配列決定によって測定することができる。

好ましい実施形態では、生成されたポリリボヌクレオチドは、Ｃ１－ｍ７Ｇキャップ又はｍ７ＧｐｐｐＧキャップなどの５’キャップを酵素的に付加することによってさらに修飾される。これは、細胞内でのポリリボヌクレオチドの作用の持続時間を調整及び／又は延長するのに有利な場合がある。

本発明のいくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、未修飾及び／又は修飾ヌクレオチドの存在下でのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって生成される。言い換えれば、上述のポリリボヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により、少なくとも、ｍＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列と、本発明による修飾ポリ（Ａ）尾部をコードするヌクレオチド配列とを含むＤＮＡ配列を鋳型として使用し、未修飾及び／又は修飾ヌクレオチドを使用して合成することができる。

本明細書で使用する「未修飾ヌクレオチド」という用語は、上述のようなＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ及びＵヌクレオチドを指す。特に、ポリリボヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の場合、前記用語はＡ、Ｃ、Ｇ及びＵヌクレオチドを指す。後者の４つを、本明細書では、ポリリボヌクレオチドに含まれる４つのヌクレオチドタイプと呼ぶ。

本明細書で使用する「修飾ヌクレオチド」という用語は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ及びＵヌクレオチドの天然由来又は化学合成された異性体並びに天然由来又は化学合成された類似体、代替体又は例えば化学修飾若しくは置換残基を有する修飾ヌクレオチド又はその異性体を指す。修飾ヌクレオチドは、塩基修飾及び／又は糖修飾を有し得る。修飾ヌクレオチドはまた、リン酸基の修飾を、例えばタンパク質をコードする配列を含むポリリボヌクレオチドの５’キャップに対して有し得る。修飾ヌクレオチドには、ヌクレオチドの共有結合修飾によって転写後に合成されたヌクレオチドも含まれる。さらに、非修飾ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドとの適切な混合物が可能である。修飾ヌクレオチドの非限定的ないくつかの例を、文献に見出すことができ（例えば、Ｃａｎｔａｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ２０１１， ３９（Ｉｓｓｕｅ ｓｕｐｐｌ＿１）：Ｄ１９５－Ｄ２０１； Ｈｅｌｍ ａｎｄ Ａｌｆｏｎｚｏ， Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ， ２０１４， ２１（２）：１７４－１８５； Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ， ２０１２， ５１（２９）：７１１０－３１）、いくつかの好ましい修飾ヌクレオチドを、それぞれのヌクレオシド残基に基づいて、以下に例示的に記載する：１－メチルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン、２－メチルアデノシン、２－Ｏ－リボシルホスフェートアデノシン、Ｎ６－メチル－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－アセチルアデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン、１，２－Ｏ－ジメチルアデノシン、Ｎ６，２－０－ジメチルアデノシン、２－０－メチルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６，０－２－トリメチルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、７－メチルアデノシン、２－メチルチオ－アデノシン、２－メトキシ－アデノシン、２’－アミノ－２’－デオキシアデノシン、２’－アジド－２’－デオキシアデノシン、２’－フルオロ－２’－デオキシアデノシン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－アデノシン、７－デアザ－８－アザ－アデノシン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、２－チオシチジン、３－メチルシチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－ヒドロキシシチジン、リシジン、Ｎ４－アセチル－２－０－メチルシチジン、５－ホルミル－２－０－メチルシチジン、５，２－Ｏ－ジメチルシチジン、２－Ｏ－メチルシチジン、Ｎ４，２－０－ジメチルシチジン、Ｎ４，Ｎ４，２－０－トリメチルシチジン、イソシチジン、プソイドシチジン、プソイドイソシチジン、２－チオシチジン、２’－メチル－２’－デオキシシチジン、２’－アミノ－２’－デオキシシチジン、２’－フルオロ－２’－デオキシシチジン、５－ヨードシチジン、５－ブロモシチジン及び２’－アジド－２’－デオキシシチジン、２’－アミノ－２’－デオキシシチジン、２’－フルオロ－２’－デオキシシチジン、５－アザシチジン、３－メチル－シチジン、１－メチル－プソイドシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－プソイドシチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－プソイドシチジン、４－チオ－ｌ－メチル－プソイドシチジン、４－チオ－ｌ－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、１－メチル－ｌ－デアザ－プソイドイソシチジン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－プソイドイソシチジン、４－メトキシ－ｌ－メチル－プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン；１－メチルグアノシン、Ｎ２，７－ジメチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、２－Ｏ－リボシルホスフェートグアノシン、７－メチルグアノシン、ヒドロキシウイブトシン、７－アミノメチル－７－デアザグアノシン、７－シアノ－７－デアザグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、Ｎ２，７，２－０－トリメチルグアノシン、Ｎ２，２－０－ジメチルグアノシン、１，２－０－ジメチルグアノシン、２－０－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２，２－０－トリメチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２Ｊ－トリメチルグアノシン、イソグアノシン；４－デメチルワイオシン、エポキシクエオシン、化低修飾ヒドロキシウイブトシン、メチル化低修飾ヒドロキシウイブトシン、イソワイオシン、ペルオキシウイブトシン、ガラクトシル－クエオシン、マンノシル－クエオシン、クエオシン、アルケオシン、ウイブトシン、メチルワイオシン、ワイオシン、７－アミノカルボキシプロピルデメチルワイオシン、７－アミノカルボキシプロピルワイオシン、７－アミノカルボキシプロピルワイオシンメチルエステル、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メ－チルグアノシン、８－オキソグアノシン、７－メチル－８－オキソグアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ１－メチルグアノシン、２’－アミノ－３’－デオキシグアノシン、２’－アジド－２’－デオキシグアノシン、２’－フルオロ－２’－デオキシグアノシン；２－チオウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン、３－メチルウリジン、４－チオウリジン、５－メチル－２－チオウリジン、５－メチルアミノメチルウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン、５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５－タウリノメチルウリジン、５－カルバモイルメチルウリジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル、ジヒドロウリジン、５－メチルジヒドロウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）－２’－Ｏ－メチルウリジンメチルエステル、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２－チオウリジン、３，２－Ｏ－ジメチルウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－Ｏ－メチルウリジン、５－カルバモイルヒドロキシメチルウリジン、５－カルバモイルメチル－２－０－メチルウリジン、５－カルバモイルメチル－２－チオウリジン、５－メトキシカルボニルメチル－２－Ｏ－メチルウリジン、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２－０－メチルウリジン、５，２－０－ジメチルウリジン、２－Ｏ－メチルウリジン、２－Ｏ－メチル－２－チオルジン、２－チオ－２－０－メチルウリジン、ウリジン５－オキシ酢酸、５－メトキシカルボニルメチルウリジン、ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル、５－メトキシウリジン、５－アミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン、５－タウリノメチル－２－チオウリジン、プソイドウリジン、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）プソイドウリジン、１－メチルプソイドウリジン、３－メチルプソイドウリジン、２－０－メチルプソイドウリジン、５－ホルミルウリジン、５－アミノメチル－２－ゲラニルウリジン、５－タウリノメチルウリジン、５－ヨードウリジン、５－ブロモウリジン、２’－メチル－２’－デオキシウリジン、２’－アミノ－２’－デオキシウリジン、２’－アジド－２’－デオキシウリジン、及び２’－フルオロ－２’－デオキシウリジン；イノシン、１－メチルイノシン、１，２－０－ジメチルイノシン及び２－０－メチルイノシン、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－ｌ－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－ｌ－メチル－プソイドウリジン、１－メチル－ｌ－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－ｌ－デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン；最も好ましくは、プソイドウリジン、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン、２’－フルオロ－２’－デオキシシチジン、５－ヨードシチジン、５－メチルシチジン、２－チオウリジン、５－ヨードウリジン及び／又は５－メチルウリジンである。

「修飾ヌクレオチド」という用語は、重水素などの同位体を含有するヌクレオチドを含む。「同位体」という用語は、同じ数の陽子を有するが、異なる数の中性子を有し、結果として質量数が異なる元素を指す。したがって、例えば水素の同位体は重水素に限定されず、トリチウムも含まれる。さらに、ポリリボヌクレオチドは、炭素、酸素、窒素及びリンなどの他の元素の同位体を含むこともできる。修飾ヌクレオチドが重水素化されていたり、水素又は酸素、炭素、窒素若しくはリンの別の同位体を含む可能性もある。

本発明によるポリリボヌクレオチドが、４つのヌクレオチドタイプ、すなわちＡ、Ｃ、Ｇ及びＵヌクレオチドの存在下でのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により製造される場合、修飾ヌクレオチドタイプの総数は、０、１、２、３又は４であり得る。言い換えれば、いくつかの実施形態では、１つのヌクレオチドタイプの少なくとも１個のヌクレオチド、例えば、少なくとも１個のＵヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、合計２つのヌクレオチドタイプのうちの少なくとも１個のヌクレオチド、例えば、少なくとも１個のＵヌクレオチド及び少なくとも１個のＣヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、合計３つのヌクレオチドタイプのうちの少なくとも１個のヌクレオチド、例えば、少なくとも１個のＧヌクレオチド、少なくとも１個のＵヌクレオチド及び少なくとも１個のＣヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、４つのヌクレオチドタイプ全てのうちの少なくとも１個のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであり得る。これら全ての実施形態において、ヌクレオチドタイプあたり１個又は複数個のヌクレオチドが修飾され得、ヌクレオチドタイプあたりの前記修飾ヌクレオチドのパーセンテージは、０％、２．５％、５％、７．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は１００％である。

いくつかの実施形態では、本発明によるポリリボヌクレオチドに含まれる修飾ヌクレオチドの総パーセンテージは、０％、２．５％、５％、７．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は１００％である。

好ましくは、本発明によるポリリボヌクレオチドは、Ｕヌクレオチドの５～３０％及びＣヌクレオチドの５～３０％が修飾されていることを特徴とする。前記修飾Ｕヌクレオチドは、好ましくは５－ヨードリジンであり、前記修飾Ｃヌクレオチドは、好ましくは５－ヨードシチジンである。

より好ましくは、本発明によるポリリボヌクレオチドは、Ｕヌクレオチドの７．５～２５％及びＣヌクレオチドの７．５～２５％が修飾されていることを特徴とする。前記修飾Ｕヌクレオチドは、好ましくは５－ヨードリジンであり、前記修飾Ｃヌクレオチドは、好ましくは５－ヨードシチジンである。

本発明はさらに、上述した方法のいずれかによって得られるポリリボヌクレオチドに関する。

上述したように、本発明によるポリリボヌクレオチドは、第１及び第２ヌクレオチド配列によってコードされるように、５’ＵＴＲ、コード配列、任意選択で３’ＵＴＲ及び修飾ポリ（Ａ）尾部を含む。好ましくは、ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つのＲＢＳ及び／又はＩＲＥＳを有する５’ＵＴＲ、最適化コドンを有するコード配列、任意選択で少なくとも１つの調節配列を有する３’ＵＴＲ及び修飾ポリ（Ａ）尾部を含む。さらに、ポリリボヌクレオチドは、任意選択で、修飾ポリ（Ａ）尾部の後に続くＡヌクレオチド以外の追加のヌクレオチド、好ましくは１個のＧヌクレオチドを含み得る。

本発明のポリリボヌクレオチド及び前記ポリリボヌクレオチドを得る方法に関しては、ｍＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列及び修飾ポリ（Ａ）尾部をコードするヌクレオチド配列、ｍＲＮＡ分子及び修飾ポリ（Ａ）尾部並びにアミノ酸配列及び本発明による修飾ポリ（Ａ）尾部をコードする配列を含むポリリボヌクレオチドを製造する方法に関連して上述したことと同じことが当てはまる。さらに、そのようなポリリボヌクレオチドの他の特徴についても、上述した通りとすることができる。

いくつかの実施形態では、上述のポリリボヌクレオチドは、１種又は複数種の修飾ヌクレオチドを含む。これは、前記ポリリボヌクレオチドで細胞をトランスフェクトする場合に、免疫原性を減少させるのに有利な場合がある。さらに、前記ポリリボヌクレオチドによって細胞内で得られ得るアミノ酸配列の量を増加させるのにも有利な場合がある。

本発明のポリリボヌクレオチド及び前記ポリリボヌクレオチドを得る方法に関しては、ｍＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列及び修飾ポリ（Ａ）尾部をコードするヌクレオチド配列、ｍＲＮＡ分子及び修飾ポリ（Ａ）尾部並びにアミノ酸配列及び本発明による修飾ポリ（Ａ）尾部をコードする配列を含むポリリボヌクレオチドを、修飾ヌクレオチドを使用して製造する方法に関連して上述したことと同じことが当てはまる。さらに、そのようなポリリボヌクレオチドの他の特徴についても、上述した通りとすることができる。

本発明はさらに、上述のポリリボヌクレオチドを、薬学的に許容される担体と共に含む医薬組成物に関する。ポリリボヌクレオチドは、好ましくは、有効量、すなわち、医薬組成物が投与される被験体において検出可能な治療反応を誘導するのに十分な量で含まれる。本発明のポリリボヌクレオチド又は医薬組成物は、無菌の水溶液又は非水溶液、懸濁液及びエマルション並びにクリーム及び坐剤であり得るが、粉末、錠剤又はエアロゾルの形態を取ることもできる。

本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応又はその他の問題若しくは合併症を伴わずに、合理的なベネフィット／リスク比に見合って、ヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに適した化学化合物、材料、成分並びに／又は組成物を指す。したがって、薬学的に許容される担体とは、投与量、吸着性、溶解性又は薬物動態学的考察などの観点から薬学的に活性な物質の取り扱いを容易にするために、薬学的に活性な物質と一緒に配合される不活性物質のことである。

適切な薬学的に許容される担体の例は、当該技術分野でよく知られており、リン酸緩衝生理食塩水、緩衝液、水、油／水エマルションなどのエマルション、各種湿潤剤及び滅菌溶液が挙げられる。特に、水性担体には、生理食塩水及び緩衝液などの水、アルコール／水溶液、エマルション又は懸濁液が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油及びオレイン酸エチルなどの有機エステルである。さらに、薬学的に許容される担体のさらなる例としては、生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース液、クエン酸塩、リン酸塩及びその他の有機酸；塩形成対イオン、例えばナトリウム及びカリウム；低分子量（＞１０アミノ酸残基）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン又はゼラチン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；ヒスチジン、グルタミン、リジン、アスパラギン、アルギニン又はグリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンなどの炭水化物；単糖類；二糖類；その他の糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；非イオン性界面活性剤、例えばモノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎという商品名で市販されている）、プロピレングリコール、プルロニック又はポリエチレングリコール；メチオニン、アスコルビン酸、トコフェロールなどの酸化防止剤及び／又は防腐剤、例えば オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；並びにｍ－クレゾール）が挙げられるが、これらに限定されない。適切な薬学的に許容される担体及びそれらの製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １７ｔｈ ｅｄ．， １９８５， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．にさらに詳細に記載されている。さらに、防腐剤、安定剤及びその他の添加剤として、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤及び不活性ガス、ナノシステム又はリポソームなども存在し得る。

本発明の医薬組成物は、針注射、吸入器の使用、クリーム、泡沫、ゲル、ローション及び軟膏など、当業者に知られている広範囲のクラスの投与形態を介して投与することができる。投与量及び作用の持続時間は、前記ポリリボヌクレオチドが果たす機能に依存し、それぞれの場合で意図的に調整しなければならない。例えば、前記ポリリボヌクレオチドがある欠損遺伝子に起因する疾患の長期治療に使用される場合、作用の持続時間を可能な限り長くすることができる一方、他の適応症では、特定の時間枠に調整することができる。さらに、上記のような前記１つ又は複数のポリリボヌクレオチドの全身投与が可能である。

本発明のポリリボヌクレオチドに関しては、ｍＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列及び修飾ポリ（Ａ）尾部をコードするヌクレオチド配列並びにアミノ酸配列及び修飾ポリ（Ａ）尾部をコードする配列を含むポリリボヌクレオチドを製造する方法及び本発明によるポリリボヌクレオチドに関連して上述したことと同じことが当てはまる。さらに、そのようなポリリボヌクレオチドの他の特徴についても、上述した通りとすることができる。

ポリ（Ａ）_１２０、ポリ（Ａ）_{３ｘ４０＿６}及びポリ（Ａ）_{２ｘ６０＿６}コンストラクトの組換えクローンのパーセンテージに基づく、ポリ（Ａ）尾部組換えの定量化。 異なる１ヌクレオチドスペーサーを用いた組換えクローンのパーセンテージに基づくポリ（Ａ）尾部組換えの定量化。 異なるポリ（Ａ）コンストラクトでトランスフェクション（２５０ｎｇ／ウェル）した２４時間後のＡ５４９細胞における、ルシフェラーゼタンパク質活性及びｍＲＮＡ崩壊動態の測定。（ａ）異なるポリ（Ａ）コンストラクトでトランスフェクトしたＡ５４９細胞からのタンパク質溶解液中のルシフェラーゼ活性。（ｂ）Ａ５４９細胞におけるルシフェラーゼｍＲＮＡの定量化。（ｃ）ｍＲＮＡ生産性は、ルシフェラーゼ発光値（ＲＬＵ；ａ）をｍＲＮＡ量（リアルタイムｑＰＣＲデータ；ｂ）で割り、これらの割合をポリ（Ａ）_１２０コンストラクトで観察されたもので正規化することにより算出した。統計的有意性は、二元配置ＡＮＯＶＡ検定により、ｐ値：＊ｐ＜０．５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎ＝６で評価した。 ポリ（Ａ）_１２０又はポリ（Ａ）_{２ｘ６０＿６}コンストラクトのいずれかでトランスフェクション（２５０ｎｇ／ウェル）した２４時間後のＨＥＫ２９３細胞からの上清においてＥＬＩＳＡにより測定した、分泌されたヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）タンパク質濃度の定量化を示す。数値は３回繰り返しの平均±標準偏差を表す。統計的有意性は、二元配置ＡＮＯＶＡ検定により、ｐ値：＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎ＝３で評価した。 異なるポリ（Ａ）尾部コンストラクトでトランスフェクション（２５０ｎｇ／ウェル）した２４時間後のＡ５４９細胞における、ルシフェラーゼタンパク質活性の測定及びｍＲＮＡ定量化。（ａ）異なるポリ（Ａ）尾部コンストラクトでトランスフェクトしたＡ５４９細胞からのタンパク質溶解液中のルシフェラーゼ活性。（ｂ）異なるポリ（Ａ）尾部コンストラクトでトランスフェクトしたＡ５４９細胞におけるルシフェラーゼｍＲＮＡの定量化。（ｃ）ルシフェラーゼｍＲＮＡ生産性は、ルシフェラーゼ発光値（ＲＬＵ；ａ）をｍＲＮＡ量（リアルタイムｑＰＣＲデータ；ｂ）で割り、これらの割合をポリ（Ａ）_１２０コンストラクトで観察されたもので正規化することにより算出した。統計的有意性は、二元配置ＡＮＯＶＡ検定により、ｐ値：＊ｐ＜０．５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎ＝６で評価した。

本発明の他の態様及び利点が以下の実施例に記載されているが、これらは例示の目的で与えられたものであり、限定するためのものではない。本出願で引用されている各刊行物、特許、特許出願又は他の文書は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本開示で使用するための方法及び材料が本明細書に記載されているが、当技術分野で知られている他の適切な方法及び材料を使用することもできる。材料、方法及び例は例示にすぎず、限定することを意図したものではない。

本明細書で使用する略語及びそれぞれの説明を、表２に示す。

（材料及び方法）
（使用した材料、デバイス、ソフトウェア及び試験システム）
材料を表３に示す。

デバイスを表４に示す。

ソフトウェアを表５に示す。

試験システムを表６に示す。

（プラスミドの調製）
合成ポリ（Ａ）尾部配列を、アニーリングした相補的オリゴヌクレオチド又はＰＣＲ法で作製したフラグメントのいずれかとして、ｐＵＣ５７－カナマイシンベクターバックボーンに導入した。相補的オリゴヌクレオチドの特定のセットを、ポリ（Ａ）_{２ｘ６０＿６}コンストラクト及びポリ（Ａ）_{３ｘ４０＿６}コンストラクトを含む配列用に設計し、アニーリングした。ポリ（Ａ）_１２０、ポリ（Ａ）_{２ｘ６０＿Ｃ}、ポリ（Ａ）_{２ｘ６０＿Ｇ}及びポリ（Ａ）_{２ｘ６０＿Ｔ}の合成ポリ（Ａ）コンストラクトをＰＣＲで作製した。

２セットの相補的オリゴヌクレオチドを以下の方法でアニーリングした：各オリゴヌクレオチド１００μＭを４０μｌのアニーリング緩衝液と混合し、９５℃で５分間インキュベートした（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）。反応後、混合液を室温まで冷却してから制限消化（ＢｇｌＩＩ－ＢｓｔＢＩ）を行った。

ＰＣＲ反応の高性能化のために、ＰｈｕｓｉｏｎハイフィデリティＰＣＲマスターミックスを使用した。２倍Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼを含むマスターミックスに加えて、ヌクレオチド、ＭｇＣｌ_２、０．５μＭのフォワード及びリバースプライマー、３％ＤＭＳＯ、１００ｎｇの鋳型ＤＮＡを含む最適化された反応緩衝液を反応に加えた。１回の反応につき２５μｌの総量を、最初に９８℃で３０秒間変性させた後、９８℃で１０秒間、７２℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒／ｋｂの伸長を行った。最終的な伸長は７２℃で１０分間行った。ＰＣＲ産物のサイズを１％アガロースゲルで確認し、ＮｅｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ及びＰＣＲクリーンアップキットを用いて目的のバンドを精製した。精製したＰＣＲ産物をＮｈｅＩ－ＢｓｔＢＩで消化し、使用するまで－２０℃で保存した。

アニーリングしたオリゴヌクレオチド（ＢｇｌＩＩ－ＢｓｔＢＩ）及びＰＣＲフラグメント（ＮｈｅＩ－ＢｓｔＢＩ）の制限酵素消化後、ポリ（Ａ）尾部コンストラクトを、それに応じて消化され、選択したコード領域（ホタルルシフェラーゼ、ｈＥＰＯ、ｄ２ＥＧＦＰ）を含むｐＵＣ５７－カナマイシンベクターにクローニングした。

セグメント化されたポリ（Ａ）配列のリスト及びＰＣＲプライマーセット又はオリゴヌクレオチドを用いた対応するクローニング法を、表７に示す。

（大腸菌へのクローニング）
ライゲーションをクロロホルム－エタノール沈殿で精製し、大腸菌ＤＨ１０Ｂ株にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションにはＢｉｏｒａｄ社のＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩを使用した。エレクトロポレーションの条件は以下の通りである：２５μＦ、２００Ω、１．８ｋＶ。エレクトロポレーション後、２ｍＬのＬＢ培地を用いて３０℃で１．５時間培養した。続いて、培養液を５０００ｒｐｍで１０分間、室温で遠心分離した。上清を捨て、ペレットを２００μＬの新しいＬＢ培地に再懸濁した。この中から１００μＬを、適切な抗生物質（最終濃度５０μｇ／ｍＬのカナマイシン又は最終濃度１００μｇ／ｍＬのアンピシリン）を含むＬＢ寒天プレートに播種した。プレートを３０℃で一晩インキュベートした。

（ミニプレップキットを用いたプラスミドの調製）
適切な抗生物質（最終濃度５０μｇ／ｍＬのカナマイシン又は最終濃度１００μｇ／ｍＬのアンピシリン）を含むＬＢ培地にクローンを接種し、細菌シェーカー（２５０ｒｐｍ）で、３０℃で一晩培養した。その後、ミニプレップキットを用い、一晩培養液からプラスミドを単離した。制限酵素を用いてプラスミドの挿入を調べ、シーケンシングによって確認した。正しいクローンを得るために、８００μＬの一晩細菌培養液に２００μＬのオートクレーブ処理したグリセロールを加えてグリセロールストックを調製した。グリセロールストックは－８０℃で保存した。

（マキシプレップキットを用いたプラスミドの調製）
マキシプレップキットを用いてＲＮＡ産生用プラスミドを調製した。目的のクローン（単数又は複数）のグリセロールストックを、適切な抗生物質（最終濃度５０μｇ／ｍＬのカナマイシン又は最終濃度１００μｇ／ｍＬのアンピシリン）を含むＬＢ培地５ｍＬに接種し、培養液を細菌シェーカー（２５０ｒｐｍ）中で、３０℃で一晩培養した。このスターター培養液から３ｍＬを使用し、適切な抗生物質（カナマイシン：最終濃度５０μｇ／ｍＬ又はアンピシリン：最終濃度１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地３００ｍＬに接種し、細菌シェーカー（２５０ｒｐｍ）中で、３０℃で一晩培養した。上清を捨て、細菌ペレットを用いてプラスミドを単離した。

（ｍＲＮＡの生成）
Ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたｍＲＮＡを生成するために、プラスミドをＢｓｔＢＩ消化によって線状化し、クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって精製した。精製した線状プラスミドをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の鋳型として使用した。プラスミド鋳型（０．５μｇ／μｌ）を、３Ｕ／μｌのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、転写緩衝液ＩＩ、１Ｕ／μｌのＲｉｂｏＬｏｃｋ ＲＮアーゼインヒビター、０．０１５Ｕ／μｌの無機ピロホスファターゼ１を用いて、定められ選択したリボヌクレオチドでのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写にかけた。完全ＩＶＴミックスを３７℃で２時間インキュベートした。その後、０．０１Ｕ／μｌのＤＮアーゼＩを加え、さらに３７℃で４５分間培養し、プラスミド鋳型を除去した。ＲＮＡを最終濃度２．５ｍＭの酢酸アンモニウムで沈殿させた後、７０％エタノールで２回洗浄した。ペレットをａｑｕａ ａｄ ｉｎｊｅｃｔａｂｉｌｉａに再懸濁した。Ｃ１－ｍ７Ｇキャップ構造を、０．５ｍＭのワクシニアウイルスキャッピング酵素により、８０℃で５分間かけて、先に変性させた転写産物（１ｍｇ／ｍｌ）の５’末端に酵素的に付加した。また、キャッピング反応ミックスには、１倍キャッピング緩衝液、０．５ｍＭのＧＴＰ、０．２ｍＭのＳ－メチルアデノシン、２．５Ｕ／μｌのＭｒｎａ Ｃａｐ ２´－ｏ－メチルトランスフェラーゼ及び１Ｕ／μｌのＲｉｂｏＬｏｃｋ ＲＮアーゼインヒビターも含まれていた。キャッピング混合液を３７℃で６０分間インキュベートした後、最終濃度２．５ｍＭの酢酸アンモニウムでＲＮＡを沈殿させ、７０％エタノールで２回洗浄した。ペレットをａｑｕａ ａｄ ｉｎｊｅｃｔａｂｉｌｉａに再懸濁した。

ＲＮＡの品質及び濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００Ｃにて分光光度法で測定した。そのサイズ及び純度は、自動キャピラリー電気泳動で決定した。

（細胞培養）
Ａ５４９（ＡＣＣ－１０７）及びＨＥＫ２９３（ＡＣＣ－３０５）細胞は、ＤＳＭＺから購入した。全ての細胞は、Ｇｌｕｔａｍａｘを含む最小必須培地（ＭＥＭ）で培養した。培地には、１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加した。細胞を、加湿５％ＣＯ_２インキュベーターにおいて３７℃で培養した。

（Ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション）
Ａ５４９及びＨＥＫ２９３の両細胞株を、１ウェルあたり２５０ｎｇのｍＲＮＡでトランスフェクトした。Ａ５４９及びＨＥＫ２９３細胞を９６ウェルプレートにそれぞれ２ｘ１０４細胞／ウェル及び４ｘ１０４細胞／ウェルの密度で播種し、ホタルルシフェラーゼ及びｈＥＰＯのＥＬＩＳＡアッセイを行った。播種から２４時間後、市販のトランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００を用いて細胞をトランスフェクトした。複合体は、１μｇのｍＲＮＡに対して２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００の比率で調製した。

ｍＲＮＡを水で１：２０に希釈し、これとは別にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００を無血清ＭＥＭで１：１０に希釈した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００溶液にｍＲＮＡを添加した後、室温で２０分間インキュベートした。最終的なｍＲＮＡ／Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００溶液の濃度を２５ｎｇ／μｌとし、１：２の段階希釈を行った。１０μｌの複合溶液を細胞に加え、細胞をそれぞれ２４時間及び４８時間インキュベートした。全てのｍＲＮＡコンストラクトについて、３又は６つの複製を用意した。

（ｄ２ＥＧＦＰのフローサイトメトリー解析）
細胞をＰＢＳで洗浄し、ＴｒｙｐＬＥで剥離し、フローサイトメトリー緩衝液（１０％ＦＢＳを添加したＰＢＳ）に再懸濁した。測定の少し前に、細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、生細胞と死細胞とを区別した（１μｇ／ｍＬ）。生細胞（＞９７％）をさらにゲーティングして、ｄ２ＥＧＦＰを発現している細胞と発現していない細胞とを区別した。分析は、Ａｔｔｕｎｅサイトメトリーソフトウェア（バージョン２．１）及びＦｌｏｗＪｏ（バージョン１０）を備えたＡｔｔｕｎｅアコースティックフォーカシングサイトメーターで行った。

（ホタルルシフェラーゼアッセイ）
ホタルルシフェラーゼ活性の検出については、トランスフェクションの２４時間後にアッセイを行った。適切な時点で、細胞をＰＢＳで洗浄した後、１００μｌの溶解緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、ｐＨ７．４）を加えた。室温で２０分間細胞を振とうした。溶解後、細胞溶解液５０μｌを用いて、ＩｎｆｉｎｉｔｅＲ ２００ ＰＲＯを用いて５秒間の光子ルミネセンス発光によるルシフェラーゼ活性を測定した。各サンプルのタンパク質量は、ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイにより、ウシ血清アルブミンを標準として使用し、細胞溶解液５μｌ中で定量した。ルシフェラーゼ値をタンパク質濃度に対して正規化した。

（ＲＮＡの単離及び逆転写）
トランスフェクションの２４時間後の実際のｍＲＮＡ量を測定するために、培養細胞（Ａ５４９、ＨＥＫ２９３）を溶解し、Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｈｏｔ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓキットを用いて、製造元のプロトコルに従ってＲＮＡを単離した。溶解物（１μｇのＲＮＡ）から、ｉＳｃｒｉｐｔ Ｓｅｌｅｃｔ ｃＤＮＡ合成キットを用いて、製造元の指示に従い、オリゴ（ｄＴ）プライマーでｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡは－２０℃で保存した。

（定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ））
リアルタイムｑＰＣＲは、Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ９６にて、ｄ２ＥＧＦＰ及びルシフェラーゼ標的用の短い加水分解プローブ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｌｉｂｒａｒｙ ＃３７及び＃２９）を用いて行った。以下のｄ２ＥＧＦＰプライマーを使用した：５’－ｃｃｔｇａａｇｔｔｃａｔｃｔｇｃａｃｃａ－３’及び５’－ｃｔｃｇｔｇａｃｃａｃｃｃｔｇａｃｃ－３’；並びにルシフェラーゼ標的用：５’－ａｃｇｃｃｇａｇｔａｃｔｔｃｇａｇａｔｇ－３’及び５’－ａｔｔｃａｇｃｃｃａｔａｇｃｇｃｔｔｃ－３’。ｍＲＮＡの絶対値は、標準曲線から補間して算出した。

（統計解析）
各実験は、サンプルごとに少なくとも３つの技術的複製で行った。特に明記しない限り、結果を平均値±ＳＤとして示す。統計解析はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン６）を用いて行った。Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ－Ｐｅａｒｓｏｎオムニバス正規性検定を用いて、データの正規分布を検定した。多重比較は、二元配置ＡＮＯＶＡで行い、続いてシダック検定（一対比較）又はダネット検定（多対一比較）によって行った。ｐ値≦０．０５を統計的に有意とした。

（セグメント化されたポリ（Ａ）尾部は細菌の組換えを大幅に減少させる）
セグメント化されたポリ（Ａ）尾部の使用が、大腸菌への形質転換後のプラスミドの組換えに影響を与えるかどうかを調べた。これを調べるために、異なる遺伝子（ルシフェラーゼ、ｄ２ＥＧＦＰ、ｈＥＰＯ）のオープンリーディングフレーム配列を、ポリ（Ａ）_１２０、ポリ（Ａ）_{２ｘ６０＿６}、ポリ（Ａ）_{３ｘ４０＿６}の３つのポリ（Ａ）コンストラクトのいずれかと組み合わせえｔ、ｐＵＣ５７－カナマイシンベクターにクローニングした。大腸菌への形質転換後、クローンを挿入物についてスクリーニングし、目的の挿入物を含む陽性クローンを、それぞれのポリ（Ａ）尾部の長さについてさらにスクリーニングした。３つのポリ（Ａ）尾部コンストラクトのそれぞれについて、ポリ（Ａ）尾部を制限酵素で消化し、消化物をフラグメントアナライザー（キャピラリーゲル電気泳動）で分解して、それぞれのポリ（Ａ）尾部のサイズを測定した。ポリ（Ａ）尾部の組換えは、相同ポリ（Ａ）尾部であるポリ（Ａ）_１２０を含むクローンの５０％以上で観察された。ポリ（Ａ）尾部をポリ（Ａ）_{３ｘ４０＿６}又はポリ（Ａ）_{２ｘ６０＿６}のいずれかに分割することで、大腸菌内での組換えを大幅に減少させることができ、ポリ（Ａ）_{２ｘ６０＿６}を含むプラスミドでは最も安定したクローン（組換え＜２０％）が得られた（図１；表８）。この傾向は、試験した３つのオープンリーディングフレーム配列の全てで観察され、この組換えの減少が配列に依存しないことを示している。最も良好な効果は、組換えが２０％以下のポリ（Ａ）_{２ｘ６０＿６}コンストラクトで観察された。

（ポリ（Ａ）尾部内の１ヌクレオチド長スペーサーが組換えに及ぼす影響）
ポリ（Ａ）_２ｘ６０コンストラクト中の１ヌクレオチド長スペーサー（Ｃ、Ｔ、Ｇ）が大腸菌での組換えに及ぼす影響を、ホタルルシフェラーゼのオープンリーディングフレーム配列とポリ（Ａ）_{２ｘ６０＿Ｃ}、ポリ（Ａ）_{２ｘ６０＿Ｇ}又はポリ（Ａ）_{２ｘ６０＿Ｔ}コンストラクトとをそれぞれ含むクローンを調査することにより調べた。興味深いことに、ポリ（Ａ）尾部にＧをスペーサーとして含むコンストラクトは、全く組換えしなかった。単一のＴを持つスペーサーは１０％のケースで組換えし、Ｃをスペーサーヌクレオチドとして持つものは５０％のケースで組換えした（図２）。これは一見、Ａ１２０で観察された組換え効率（図１）に匹敵するように見えるが、それでも著しく低い。このことは、図１及び図２で試験したコンストラクトで観察された組換え効率をまとめた次の表９から明らかである。

（６ヌクレオチド長スペーサーがｍＲＮＡ及びタンパク質濃度に及ぼす影響）
ポリ（Ａ）_{２ｘ６０＿６}、ポリ（Ａ）_{３ｘ４０＿６}又はポリ（Ａ）_１２０コンストラクトのいずれかを含むルシフェラーゼｍＲＮＡをトランスフェクトして２４時間後のＡ５４９細胞において、ルシフェラーゼタンパク質及びｍＲＮＡの崩壊を調べた。セグメント化されたポリ（Ａ）_{２ｘ６０＿６}コンストラクトを使用すると、ポリ（Ａ）_１２０ベンチマークと比較して、トランスフェクション後のタンパク質濃度が大幅に増加した（図３）。ルシフェラーゼｍＲＮＡを含む異なるポリ（Ａ）フォーマットのｍＲＮＡ量には、修飾による有意差は認められなかった。

さらに、生理学的標的の転写及び翻訳に対するポリ（Ａ）セグメント化の効果を、分泌タンパク質及び短いｍＲＮＡ（０．９ｋｂ）のプロトタイプとしてヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）を使用して検証した。ｈＥＰＯをコードするコドン最適化配列を、ポリ（Ａ）_１２０又はポリ（Ａ）_{２ｘ６０＿６}コンストラクトの上流でｐＵＣ５７－カナマイシンベクターにクローニングした。ｈＥＰＯタンパク質濃度を、トランスフェクションの２４時間後にＥＬＩＳＡで測定した（図４）。２つのポリ（Ａ）尾部コンストラクトの間には有意差が観察され、ポリ（Ａ）_{２ｘ６０＿６}は、標準的なポリ（Ａ）_１２０コンストラクトと比較して有意に多くのタンパク質をもたらした。

（１ヌクレオチド長スペーサーがｍＲＮＡ及びタンパク質濃度に及ぼす影響）
ポリ（Ａ）_２ｘ６０尾部内の単一スペーサーヌクレオチドが、タンパク質発現及びｍＲＮＡの生産性に与える影響を検証した。ルシフェラーゼのｍＲＮＡ発現及びタンパク質活性は、それぞれのポリ（Ａ）_２ｘ６０尾部内に単一のＣ、Ｔ又はＧのスペーサーヌクレオチドを含むｍＲＮＡコンストラクトをＡ５４９細胞にトランスフェクトすることで測定した。ベンチマークとして、標準的なポリ（Ａ）_１２０コンストラクトを使用した。３つの単一ヌクレオチドスペーサーコンストラクト全ての間で、タンパク質発現に有意差はなかったが、いずれもポリ（Ａ）_１２０コンストラクトと比較して有意に多くのタンパク質をもたらした（図５）。ｍＲＮＡの生産性を計算すると、Ｃをスペーサーとしたコンストラクトが全体的に最も高い生産性を示すようである。ポリ（Ａ）_１２０のｍＲＮＡ生産性は、試験した３つのセグメント化されたコンストラクト、ポリ（Ａ）_{２ｘ６０＿Ｃ}、ポリ（Ａ）_{２ｘ６０＿Ｇ}、ポリ（Ａ）_{２ｘ６０＿Ｔ}のいずれと比較しても著しく低かった。

Claims (15)

1. （ｉ）ｍＲＮＡ分子をコードする第１ヌクレオチド配列と、
   その下流に位置し、
   （ｉｉ）修飾ポリ（Ａ）尾部をコードする第２ヌクレオチド配列であって、
   （ａ）５５～６５個のＴヌクレオチドからなるヌクレオチド配列としてそれぞれ定められた少なくとも２つのＡエレメントと、
   （ｂ）少なくとも１つのＳエレメントであって、各Ｓエレメントが、
   （ｂ１）Ｔヌクレオチドではない１個のヌクレオチド又は
   （ｂ２）２～１０個のヌクレオチド、好ましくは６個のヌクレオチドであって、その２個の末端ヌクレオチドのそれぞれがＴヌクレオチドではないヌクレオチドからなるＳエレメント
   とからなり；
   Ａエレメントの総数がＳエレメントの総数よりも１多く、
   任意の２つのＡエレメントが１つのＳエレメントで隔てられていることを特徴とする、第２ヌクレオチド配列と、
   を含有するＤＮＡ配列を含む、ＤＮＡプラスミド。
2. 前記Ｓエレメントのいずれか１つが、１個のＣヌクレオチド又は１個のＡヌクレオチドから、好ましくは１個のＣヌクレオチドからなる、請求項１に記載のＤＮＡプラスミド。
3. Ａエレメントの数が２、３又は４つである、請求項１又は２に記載のＤＮＡプラスミド。
4. Ａエレメントの数が４つであり、前記４つのＡエレメントのヌクレオチド配列が合わせて２４０ヌクレオチドの全長を有し、好ましくは各Ａエレメントが６０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１～３のいずれか一項に記載のＤＮＡプラスミド。
5. Ａエレメントの数が２つであり、前記２つのＡエレメントのヌクレオチド配列が合わせて１２０ヌクレオチドの全長を有し、好ましくは各Ａエレメントが６０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１～３のいずれか一項に記載のＤＮＡプラスミド。
6. 請求項１～５のいずれか一項に記載のＤＮＡプラスミドを含む細菌宿主細胞。
7. 大腸菌細胞、好ましくは大腸菌ｒｅｃＡ^－細胞である、請求項６に記載の細菌宿主細胞。
8. 細菌宿主細胞内での増幅中の組換えの減少を示すＤＮＡプラスミドを調製するための、請求項１（ｉｉ）及び請求項２～５で定められた修飾ポリ（Ａ）尾部をコードするヌクレオチド配列の使用であって、前記ヌクレオチド配列が、ｍＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列の下流に位置するものである、使用。
9. 細菌宿主細胞内でのＤＮＡプラスミドの増幅中の組換えを減少させるための、請求項１（ｉｉ）及び請求項２～５で定められた修飾ポリ（Ａ）尾部をコードするヌクレオチド配列の使用。
10. ｍＲＮＡ分子と、その下流に位置するポリ（Ａ）尾部とをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡプラスミドの、細菌宿主細胞内での増幅中の組換えを減少させるための方法であって、前記減少が、前記ポリ（Ａ）尾部をコードするＤＮＡ配列の部分を、請求項１（ｉｉ）及び請求項２～５で定められた修飾ポリ（Ａ）尾部をコードするヌクレオチド配列で置き換えることによって達成される、方法。
11. アミノ酸配列並びに請求項１（ｉｉ）及び請求項２～５で定められたヌクレオチド配列によってコードされた修飾ポリ（Ａ）尾部をコードする配列を含むポリリボヌクレオチドを製造する方法であって、請求項１～５のいずれか一項に記載のＤＮＡプラスミドからｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって前記ポリリボヌクレオチドを製造する工程を含む、方法。
12. 前記ポリリボヌクレオチドが、未修飾及び／又は修飾ヌクレオチドの存在下でのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により製造される、請求項１１に記載の方法。
13. 請求項１１又は１２に記載の方法で得られるポリリボヌクレオチド。
14. 前記ポリリボヌクレオチドが、１種又は複数種の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１３に記載のポリリボヌクレオチド。
15. 請求項１３～１４のいずれか一項に記載のポリリボヌクレオチドを、薬学的に許容される担体と共に含む、医薬組成物。

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