ES2769877T3 - Marcador de selección novedoso para la transfección celular y la producción de proteínas - Google Patents

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Abstract

Una línea de células de ovario de hámster chino (CHO) que comprende un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una deshidroorotato deshidrogenasa (DHODH) de mamífero y al menos un casete de expresión para expresar una proteína recombinante, en la que dicha DHODH comprende una secuencia idéntica en al menos el 90% a la secuencia de SEQ ID NO: 2 o a la secuencia de SEQ ID NO: 4 y en la que dicha DHODH es sensible a al menos un inhibidor de DHODH.

Description

DESCRIPCIÓN
Marcador de selección novedoso para la transfección celular y la producción de proteínas
Campo de la invención
La presente invención está dentro del campo de la producción industrial de proteínas. La invención proporciona un sistema de expresión novedoso que usa deshidroorotato deshidrogenasa (DHODH) como marcador de selección en combinación con un inhibidor de DHODH, en particular con teriflunomida, particularmente para su uso en líneas de células CHO. También se proporcionan vectores de expresión que codifican para DHODH, líneas de células CHO que comprenden dichos vectores y métodos de producción de proteínas recombinantes.
Antecedentes de la invención
La producción de proteínas recombinantes a escala industrial requiere el aislamiento de clones que producen altas cantidades de proteínas recombinantes. La introducción de genes heterólogos en células huésped animales y el examen para la expresión de los genes añadidos es un proceso largo y complicado. El proceso implica la transfección y la selección de clones con expresión estable a largo plazo, y el examen de clones que tienen altas tasas de expresión para la proteína recombinante correspondiente.
Cuando se generan clones que expresan una proteína recombinante a partir de vectores de expresión, las células huésped se transfectan habitualmente con un vector de ADN que codifica para tanto la proteína de interés como el marcador de selección en el mismo vector. Por tanto, un vector de expresión de este tipo comprende un marcador seleccionable que permite la selección de clones en los que está presente el vector de expresión. Un marcador seleccionable de este tipo también puede conducir a una amplificación conjunta de ADN transfectado, permitiendo de ese modo el aislamiento de clones altamente productores.
La mayoría de los marcadores seleccionables son o bien una proteína que confiere resistencia a un antibiótico o bien otra sustancia tóxica o bien una proteína esencial para la supervivencia celular. Varios de tales marcadores seleccionables se conocen en la técnica, incluyendo, por ejemplo, G418, higromicina, puromicina, zeomicina, dihidrofolato reductasa (DHFR), glutamina sintetasa (GS) e hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (HPRT). En particular, la GS se usa ampliamente como marcador seleccionable en el campo de la producción industrial de proteínas recombinantes en células eucariotas. El gen de GS permite la síntesis de glutamina, esencial para el crecimiento celular, y se inhibe mediante MSX (L-metionina sulfoximina). En presencia de MSX, solo sobreviven las células que expresan una cantidad mayor de GS. Tras un examen apropiado, es posible seleccionar células que producen las proteínas exógenas.
El desarrollo de sistemas de expresión adicionales que permitan el aislamiento de un alto número de clones que expresan la proteína recombinante, al menos algunos de los cuales expresan la proteína a un alto nivel, ampliará las opciones disponibles a la hora de producir proteínas recombinantes y aumentará las posibilidades de identificar clones de alta expresión adecuados para su uso en la producción de proteínas a gran escala.
Sumario de la invención
Los inventores han desarrollado un nuevo sistema de expresión basado en el uso de deshidroorotato deshidrogenasa (DHODH) como marcador seleccionable para líneas de células CHO. La DHODH es una enzima requerida para la síntesis de pirimidina. Los compuestos que inhiben la DHODH inhiben por tanto la síntesis de ADN y por consiguiente la proliferación celular. Los inventores especularon que la sobreexpresión de DHODH de tipo natural en células pueden conferir resistencia a inhibidores de DHODH, basándose en el principio de que la toxicidad de un compuesto puede aliviarse mediante la sobreexpresión de su diana. Desarrollaron un vector de expresión de anticuerpo que codifica para DHODH para su uso en combinación con inhibidores de DHODH que incluyen leflunomida (nombre IUPAC: 5-metil-W-[4-(trifluorometil)fenil]-isoxazol-4-carboxamida) y teriflunomida (nombre IUPAC: (2Z)-2-ciano-3-hidroxi-W-[4-(trifluorometil)fenil]but-2-enamida). Encontraron sorprendentemente que el aislamiento de clones que producen anticuerpos era más eficiente cuando el inhibidor de DHODH es teriflunomida. Mostraron que el uso de un sistema de expresión que comprende dicho vector en células CHO (significa ovario de hámster chino) cultivadas con teriflunomida posibilita el aislamiento de clones que producen anticuerpos a niveles comparables con el marcador de GS convencional.
Esta es la primera vez que la DHODH se ha usado como marcador seleccionable en el contexto de la producción de proteínas recombinantes en cultivo de células CHO.
El documento US2003/0166201 describe el uso de DHODH resistente a inhibidor o alterada que no se inhibe mediante el agente de selección como marcador seleccionable. Sin embargo, el documento US2003/0166201 no describe DHODH como marcador para el uso en la producción de proteínas recombinantes. Además, el documento US2003/0166201 no da a conocer el uso de una DHODH de tipo natural o DHODH alterada que se inhiba mediante el agente de selección, sino que está limitado al uso de DHODH que no está inhibida mediante el agente de selección.
Ganesan et al (2011), Molecular and Biochemical Parasitology 177: 29-34 dan a conocer el uso de DHODH de levadura como marcador seleccionable para la transfección de P falciparum, usando atovacuona y los inhibidores DSM1 y DSM74 específicos de P falciparum como agente de selección. Sin embargo, Ganesan et al no describen la DHODH como marcador para su uso en la producción de proteínas recombinantes. Además, sus resultados son específicos para la transformación de genes de P falciparum usando la DHODH de levadura.
En resumen, los inventores han mostrado por primera vez que la DHODH es un marcador seleccionable efectivo para obtener clones que producen proteínas recombinantes en líneas de células CHO. Además, también han demostrado que una DHODH de tipo natural que es sensible al agente de selección usado puede usarse para este propósito.
Por tanto, la presente invención proporciona una línea de células CHO que comprende un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una deshidroorotato deshidrogenasa (DHODH) de mamífero y al menos un casete de expresión para expresar una proteína recombinante. Dicha DHODH puede ser tal como se define más adelante, y puede comprender en particular la secuencia de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 o una variante de las mismas que tenga actividad DHODH. En una realización, dicha variante es sensible a inhibidores de la actividad DHODH tal como se describe en el presente documento, preferiblemente sensible a teriflunomida. En algunas realizaciones, los codones triplete de dicha secuencia que codifica para DHODH se han sesgado para la expresión en células específicas, por ejemplo, células CHO o células humanas. En algunas realizaciones, dicha secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1 o la secuencia de SEQ ID NO: 3.
En algunas realizaciones, dicha proteína recombinante es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal), una quimiocina, una linfocina, una hormona (por ejemplo, insulina), una proteína inmunogénica para inducir una respuesta de anticuerpo o una enzima para terapia de reemplazo de enzimas o para uso industrial. Cuando dicha proteína es un anticuerpo, dicho vector puede comprender un primer casete de expresión adecuado para clonar una cadena ligera de anticuerpo, y un segundo casete de expresión adecuado para clonar una cadena pesada de anticuerpo.
La invención proporciona además el uso de una secuencia de nucleótidos que codifica para DHODH tal como se define en el presente documento como marcador de selección para aislar clones de CHO que producen proteínas recombinantes.
En una realización, dicha secuencia de nucleótidos que codifica para DHODH se usa en combinación con al menos un inhibidor de DHODH, en particular con teriflunomida, preferiblemente a una concentración de teriflunomida de 25 a 200 gM, más preferiblemente de 50 a 100 gM, todavía más preferiblemente 50 gM.
La invención también proporciona una línea de células CHO según la reivindicación 1.
Además, se proporciona un sistema de expresión que comprende una línea de células CHO según la invención. El sistema de expresión puede comprender además al menos un agente de selección que es un inhibidor de DHODH tal como se describe en el presente documento. En una realización, el inhibidor de DHODH es teriflunomida, preferiblemente a una concentración de 25 a 200 gM, más preferiblemente de 50 a 100 gM, todavía más preferiblemente 50 gM.
Por tanto, la invención proporciona un sistema de expresión que es una combinación de (i) una línea de células CHO; y (ii) un vector de expresión adecuado para la producción de una proteína recombinante, en el que dicho vector comprende una secuencia que codifica para una glutamina sintetasa de mamífero (DHODH) (homóloga o heteróloga con respecto a la línea de células CHO) y al menos un casete de expresión para expresar una proteína recombinante, y (iii) un inhibidor de DHODH. En una realización, el inhibidor de DHODH es teriflunomida, preferiblemente a una concentración de 25 a 200 gM, más preferiblemente de 50 a 100 gM, todavía más preferiblemente 50 gM.
En realizaciones específicas, la secuencia que codifica para la DHODH comprendida en el vector de expresión no es una secuencia de DHODH de hámster.
Cuando el sistema de expresión se usa para producir una proteína recombinante, el vector se introduce en la línea celular (puede, por ejemplo, transfectarse de manera estable o de manera transitoria en la línea celular). Por tanto, la presente invención proporciona un sistema de expresión que es (i) una combinación en la que el vector está presente dentro de la línea de células CHO.
El sistema de expresión según la invención puede proporcionarse, por ejemplo, en forma de un kit, por ejemplo, con un vial que comprende el vector de expresión, y otro vial que comprende la línea celular. La invención proporciona en general un kit que comprende un vector de expresión tal como se describe en el presente documento, y una línea celular de la invención y un inhibidor de DHODH. En una realización, el inhibidor de DHODH es teriflunomida, preferiblemente a una concentración de 25 a 200 pM, más preferiblemente de 50 a 100 pM, todavía más preferiblemente 50 pM.
La invención también proporciona un método de producción de una proteína recombinante que comprende las etapas de: proporcionar una línea celular de la invención tal como se define en el presente documento; cultivar dicha línea celular obtenida en condiciones adecuadas para la producción de la proteína recombinante; y aislar y/o purificar dicha proteína recombinante. El método puede comprender además la etapa de formular dicha proteína recombinante en una composición farmacéutica.
También se proporciona el uso de un vector de expresión, una línea celular, un sistema de expresión o un kit según la invención para producir una proteína recombinante.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra en forma esquemática los vectores usados en los ejemplos.
La Figura 2 muestra la estructura de la leflunomida (Fig. 2A) y su metabolito teriflunomida (Fig. 2B).
La Figura 3 muestra las productividades conseguidas por 14 semiclones obtenidos durante la producción de anticuerpo anti-13C3 en células CHO 9E4 usando DHODH humana como marcador de selección.
La Figura 4 muestra las productividades conseguidas por 19 semiclones obtenidos durante la producción de anticuerpo anti-CD38 en células CHO 9E4 usando DHODH humana como marcador de selección.
La Figura 5 muestra las productividades conseguidas por 5 semiclones obtenidos durante la producción de anticuerpo anti-13C3 en células CHO 9E4 usando GS humana como marcador de selección.
Descripción detallada de la invención
Dihidroorotato deshidrogenasa
Tal como se usa en el presente documento, el término “dihidroorotato deshidrogenasa” o “DHODH” se refiere a un polipéptido capaz de catalizar la conversión de dihidroorotato (ácido 4,5-dihidroorótico o ácido 2,6-dioxo-1,3-diazinano-4-carboxílico) a orotato (ácido orótico o ácido 1,2,3,6-tetrahidro-2,6-dioxo-4-pirimidinocarboxílico), tal como se representa mediante la siguiente reacción:
(S)-dihidroorotato O2 ^orotato H2O2
Un polipéptido de este tipo se clasifica bajo el número de la Comisión de Enzimas (EC) 1.3.3.1. Los polipéptidos capaces de catalizar la reacción anterior presentan “actividad DHODH”.
La reacción anterior es la cuarta etapa en la síntesis de novo de uridina monofosfato (rUMP) requerida para la síntesis de ADN y ARN. Por tanto, la inhibición de DHODH tiene el efecto de inhibir la síntesis de ADN y ARN y por consiguiente inhibe la proliferación celular.
La DHODH que se usa en la presente invención (denominada adicionalmente “DHODH de la invención”) puede comprender o consistir en una secuencia idéntica en al menos el 90%, 91%; 92%; 93%, 94%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% o 100% a la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4. También puede comprender o consistir en un fragmento de al menos 100, 150, 200, 250, 300 o 350 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, siempre que la proteína conserve la actividad DHODH y su sensibilidad a inhibidores de DHODH.
En algunas realizaciones, la DHODH que se usa en la invención comprende o consiste en una secuencia idéntica en al menos el 90%, 91%; 92%; 93%, 94%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% o 100% tanto a la secuencia de SEQ ID NO: 2 como a la secuencia de SEQ ID NO: 4.
En algunas realizaciones, la DHODH que se usa en la invención es una DHODH humana, es decir, una DHODH de origen humano. Tal como se usa en el presente documento, el término “DHODH humana” se refiere a una secuencia que comprende o consiste en SEQ iD NO: 4, así como variantes de la misma que presentan actividad DHODH. Tales variantes pueden corresponder, por ejemplo, a variantes que aparecen de manera natural en especies humanas (tal como variantes alélicas o variantes de corte y empalme). Alternativamente, tales variantes pueden corresponder a variantes obtenidas mediante ingeniería genética. En una realización, tales variantes solo difieren de la secuencia de SEQ ID NO: 4 en la presencia de como máximo 25, 24, 23, 22, 21,20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 variaciones de aminoácido en comparación con SEQ ID NO: 4 (incluyendo dichas variaciones sustituciones, inserciones y deleciones).
En algunas realizaciones, la DHODH es una DHODH de hámster, es decir, una DHODH de origen de hámster. La DHODH de hámster puede ser, por ejemplo, DHODH de hámster chino (Cetulus griseus). Tal como se usa en el presente documento, el término “DHODH de hámster chino” se refiere a una secuencia que comprende o consiste en SEQ ID NO: 2, así como variantes de la misma que presentan actividad DHODH. Tales variantes pueden corresponder, por ejemplo, a variantes que aparecen de manera natural en especies de hámster (tal como variantes alélicas o variantes de corte y empalme). Alternativamente, tales variantes pueden corresponder a variantes obtenidas mediante ingeniería genética. En una realización, tales variantes solo difieren de la secuencia de SEQ ID NO: 2 en la presencia de como máximo 25, 24, 23, 22, 21,20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 variaciones de aminoácido en comparación con SEQ ID NO: 2 (incluyendo dichas variaciones sustituciones, inserciones y deleciones).
En otra realización, la DHODH variante tendrá actividad DHODH, opcionalmente el mismo nivel de actividad que la proteína de tipo natural, o el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140% o más del nivel de actividad que la proteína de tipo natural.
En otra realización, la DHODH variante conservará la sensibilidad a inhibidores de actividad DHODH, por ejemplo, teriflunomida.
En algunas realizaciones, la DHODH es sensible a al menos un inhibidor de DHODH, en particular a teriflunomida. Los inhibidores de DHODH incluyen ácido cinconínico, brequinar (ácido 6-fluoro-2-(2’-fluoro-1,1’-bifenil-4-il)-3-metil-4-quinolincarboxílico), derivados de naftoquinona tales como dicloroalilawsona, derivados de isoxazol tales como leflunomida (5-metil-W-[4-(trifluorometil) fenil]-isoxazol-4-carboxamida) y su metabolito activo teriflunomida ((2Z)-2-ciano-3-hidroxi-N-[4-(trifluorometil)fenil]but-2-enamida), ácidos quinoloncarboxílicos, naftoquinonas, isoxazoles, fenoxiquinolinas, redoxal y derivados, lawsona, lapachol, atovacuona y (8-cloro-4-(2-cloro-4-fluoro-fenoxi)quinolina). Un inhibidor de DHODH puede inhibir la actividad DHODH en al menos el 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 o 100%. Dicho inhibidor puede usarse a una concentración de, por ejemplo, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 nM, 1, 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 pM, 1 mM o más. En realizaciones particulares, el inhibidor de DHODH es teriflunomida y se usa a una concentración de 25 y 200 pM, preferiblemente de 50 a 100 pM, más preferiblemente 50 pM.
Por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos “idéntica” en al menos, por ejemplo, el 95% a una secuencia de aminoácidos problema de la presente invención, quiere decirse que la secuencia de aminoácidos del polipéptido objeto es idéntica a la secuencia problema excepto porque la secuencia de polipéptido objeto puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácido por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos problema. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 95% a una secuencia de aminoácidos problema, hasta el 5% (5 de 100) de los residuos de aminoácido en la secuencia objeto pueden insertarse, delecionarse o sustituirse con otro aminoácido.
La identidad de secuencia puede determinarse por la longitud completa de la secuencia variante, la longitud completa de la secuencia de referencia, o ambas. Por ejemplo, el porcentaje de identidad puede calcularse usando un alineamiento global (es decir, las dos secuencias se comparan en toda su longitud). En la técnica se conocen ampliamente métodos para comparar la identidad y homología de dos o más secuencias. El programa «needle», que usa el algoritmo de alineamiento global Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48:443-453) para encontrar el alineamiento óptimo (incluyendo huecos) de dos secuencias cuando se considera su longitud completa, puede usarse, por ejemplo, cuando se realiza un alineamiento global. Este programa needle está disponible, por ejemplo, en el sitio world wide web ebi.ac.uk. El porcentaje de identidad según la invención se calcula preferiblemente usando el programa EMBOSS::needle (global) con un parámetro “Gap Open” igual a 10,0, un parámetro “Gap Extend” igual a 0,5 y una matriz Blosum62.
Las variantes de una secuencia de referencia pueden comprender mutaciones tales como deleciones, inserciones y/o sustituciones en comparación con la secuencia de referencia. En el caso de sustituciones, la sustitución corresponde preferiblemente a una sustitución conservativa tal como se indica en la tabla a continuación.
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Vectores
El vector es adecuado para la producción de una proteína recombinante, y comprende una secuencia que codifica para dihidroorotato deshidrogenasa (DHODH). El vector es preferiblemente un vector de ADN.
El vector comprende una secuencia que codifica para una DHODH de este tipo según la invención. La secuencia que codifica para una DHODH de este tipo según la invención puede ser la secuencia de nucleótidos que aparece de manera natural. Alternativamente, los codones triplete de la secuencia que codifica para una DHODH de este tipo puede sesgarse para la expresión en células CHO. En la técnica se conocen software y algoritmos para sesgar una secuencia con el fin de obtener una expresión óptima e incluyen, por ejemplo, el algoritmo descrito en Raab et al. (2010, Syst Synth Biol. 4:215-25). Este algoritmo no solo proporciona los mejores codones disponibles para la expresión, sino que también tiene en cuenta el contenido de GC y la ausencia de motivos de ADN no deseados. Por ejemplo, la secuencia que codifica para la DHODH que se usa en la invención puede comprender o consistir en una secuencia idéntica en al menos el 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% a la secuencia de SeQ ID NO: 3 (es decir una secuencia que codifica para la DHODH humana de SEQ ID NO: 4, que se ha diseñado para la expresión óptima en células CHO) y/o a la secuencia de SEQ ID NO: 1 (es decir una secuencia que codifica para una DHODH de hámster de SEQ ID NO: 2, que se ha diseñado para la expresión óptima en células CHO).
En una realización, la secuencia que codifica para la DHODH que se usa en la invención comprende o consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.
En el vector, la secuencia que codifica para la DHODH puede ponerse bajo el control de cualquier promotor conocido por los expertos en la técnica.
Por ejemplo, la secuencia que codifica para la DHODH puede ponerse, por ejemplo, bajo el control de un promotor adecuado para dirigir la expresión de DHODH, por ejemplo, un promotor del virus vacuolizante del simio 40 (SV40) (por ejemplo, el promotor tardío o el temprano de SV40), promotor de CMV, promotor del factor de elongación 1, promotor de GAPDH, promotor de RPL37, promotor de actina. Un promotor de SV40 temprano se describe, por ejemplo, en Benoist y Chambon (1981, Nature. 290:304-10) y en Moreau et al. (1981, Nucleic Acids Res. 9:6047-68). En particular, dicho promotor de SV40 es un promotor de longitud completa. Dicho promotor de SV40 puede tener también un origen de replicación que contiene una repetición de 72 pb.
En algunas realizaciones, dicho promotor de SV40 no es un promotor de SV40 en el que las posiciones 128 a 270 se han eliminado, es decir dicho promotor de SV40 no es el promotor de SV40 descrito en la patente coreana n° 10­ 0267720 y transformando el transformante de E. coli depositado en el Gene Bank, Institute of Bioengineering, KIST el 17 de diciembre de 1997 con el número de depósito: KCTC 8860 P.
En otras realizaciones, la secuencia que codifica para la DHODH que se usa en la invención no está puesta bajo el control de un promotor de SV40.
Los expertos en la técnica conocen vectores que son adecuados para la producción de proteínas recombinantes. Tales vectores corresponden normalmente a vectores de expresión que comprenden un origen de replicación y al menos un casete de expresión que permite la clonación y la expresión de la proteína recombinante para la que se desea la producción. Un casete de expresión comprende normalmente una región no traducida 5’ (que comprende o consiste en un promotor, y opcionalmente una secuencia potenciadora), uno o más sitios de restricción que permiten la clonación de una secuencia que codifica para la proteína recombinante, una región no traducida 3’ (por ejemplo, una señal de poliA) y opcionalmente uno o más intrones. La secuencia promotora puede corresponder a cualquier promotor fuerte ampliamente conocido en la técnica, tal como por ejemplo, el promotor de CMV humano. Opcionalmente, los vectores según la invención comprenden un origen de replicación procariota (por ejemplo, un replicón procariota tal como ColE1 en E. coli) y al menos un gen marcador selectivo de procariota, también conocido como marcador seleccionable procariota, de modo que los vectores permiten la replicación en células procariotas. Las células que replican los vectores también expresan el gen marcador selectivo de procariota, y por tanto puede identificarse y seleccionarse. El experto en la técnica conoce ampliamente genes marcadores selectivos de procariota. Ejemplos de genes marcadores selectivos de procariota son, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico que codifican para una proteína que confiere resistencia a antibióticos (por ejemplo, una secuencia que codifica para una proteína que confiere resistencia a ampicilina, cloranfenicol, blasticidina o kanamicina). El vector según la invención puede tener, por ejemplo, la estructura representada en la Figura 1, que se explica en más detalle en el ejemplo 1, en el que las secuencias que codifican para la cadena pesada y la cadena ligera de anticuerpo 13C3 o anticuerpo anti-CD38 pueden reemplazarse por otras dos secuencias codificantes (por ejemplo, secuencias que codifican para la cadena pesada y la cadena ligera de otro anticuerpo).
La proteína recombinante puede corresponder a cualquier proteína que sea de interés para los expertos en la técnica. Tal como se usa en el presente documento, el término “proteína” pretende abarcar péptidos (es decir cadenas de aminoácidos de menos de 50 aminoácidos), polipéptidos (es decir cadenas de aminoácidos de al menos 50 aminoácidos), proteínas monoméricas (es decir proteínas que consisten en una cadena de aminoácidos) y proteínas multiméricas (es decir proteínas que consisten en dos o más cadenas de aminoácidos, tales como por ejemplo, anticuerpos monoclonales).
El vector comprende normalmente un número de casetes de expresión que es idéntico al número de cadenas de aminoácidos diferentes que constituyen la proteína (por ejemplo, un casete de expresión en el caso de una proteína monomérica o proteína homodimérica, dos en el caso de una proteína heterodimérica o de un anticuerpo monoclonal, etc.).
Alternativamente, el vector de ADN puede comprender solo un casete de expresión incluso cuando se desee la producción de una proteína heterodimérica o de un anticuerpo monoclonal. En un caso de este tipo, la(s) secuencia(s) que codifica(n) para la(s) otra(s) cadena(s) de aminoácidos de la proteína está(n) presente(s) en un vector de expresión independiente, que se transfecta conjuntamente con el vector en la línea celular huésped. El vector de ADN puede carecer de casete de expresión. En un caso de este tipo, el/los casete(s) de expresión adecuado(s) para la expresión de la proteína recombinante está(n) presente(s) en un vector independiente, que se transfecta conjuntamente con el vector en la línea celular huésped, en particular en la línea de células CHO.
Por tanto, en algunas realizaciones, el vector de expresión comprende:
- una secuencia que codifica para DHODH, puesta bajo el control del promotor de SV40 temprano;
- un primer casete de expresión, en el que la secuencia que codifica para la cadena ligera del anticuerpo se pone bajo el control del promotor de CMV;
- un segundo casete de expresión, en el que la secuencia que codifica para la cadena pesada del anticuerpo se pone bajo el control del promotor de CMV;
- un origen de replicación procariota; y
- un marcador seleccionable para su uso en células procariotas, concretamente una secuencia que codifica para una proteína que confiere resistencia a ampicilina, puesta bajo el control de su promotor natural.
A lo largo de la presente memoria descriptiva, el término “proteína recombinante” se refiere a cualquier proteína recombinante para la que se desee la producción. Puede corresponder, por ejemplo, a una proteína terapéutica y/o una profiláctica, es decir una proteína prevista para su uso como medicamento (incluyendo vacunas). En una realización específica, la proteína recombinante para la que se desea la producción no es una DHODH. En otra realización específica, la proteína recombinante para la que se desea la producción es un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal. En todavía otra realización específica, la proteína recombinante para la que se desea la producción es una proteína antigénica.
El término “anticuerpo” se usa en el presente documento en el sentido más amplio y abarca específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa) de cualquier isotipo tal como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (incluyendo anticuerpos biespecíficos), fragmentos de anticuerpo (tal como, por ejemplo, fragmentos Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab’ o F(ab’)2) y proteínas de fusión que comprenden un fragmento de anticuerpo. Un anticuerpo que reacciona con un antígeno específico puede generarse mediante métodos recombinantes tal como selección de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en fago o vectores similares, o inmunizando un animal con el antígeno o un ácido nucleico que codifica para antígeno.
Un “anticuerpo monoclonal”. tal como se usa en el presente documento, es un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir los anticuerpos que forman esta población son esencialmente idénticos excepto por posibles mutaciones que aparecen de manera natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Estos anticuerpos se dirigen frente a un único epítopo (o un único grupo de epítopos en el caso de anticuerpos monoclonales multiespecíficos) y por tanto son altamente específicos.
Un anticuerpo monoclonal típico está compuesto por dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas que están unidas mediante enlaces disulfuro. Cada cadena pesada y ligera contiene una región constante y una región variable. Cada región variable contiene tres segmentos denominados “regiones determinantes de complementariedad” (“CDR”) o “regiones hipervariables”, que son responsables principalmente de la unión a un epítopo de un antígeno. Habitualmente se denominan CDR1, CDR2, y CDR3, numeradas secuencialmente a partir del extremo N-terminal (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, National Institute of Health, Betesda, MD, 1991). Las porciones más altamente conservadas de las regiones variables se denominan “regiones de entramado”.
El anticuerpo monoclonal puede ser, por ejemplo, un anticuerpo murino, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo completamente humano.
Cuando la proteína recombinante para la que se desea la producción es un anticuerpo monoclonal, el vector puede comprender un primer casete de expresión adecuado para clonar la cadena ligera de anticuerpo, y un segundo casete de expresión adecuado para clonar la cadena pesada de anticuerpo.
En una realización específica, dichos casetes de expresión primero y segundo comprenden cada uno el promotor de citomegalovirus (CMV), por ejemplo, un promotor de CMV de un ser humano o un CMV murino. Más específicamente, dichos casetes de expresión primero y segundo pueden comprender:
- un promotor potenciador temprano inmediato de CMV (por ejemplo, el que tiene la secuencia descrita en Teschendorf etal., 2002, Anticancer Res. 22:3325-30); o
- una región potenciadora/de promotor IE2 de CMV de ratón (por ejemplo, la que tiene la secuencia descrita en Chatellard et al., 2007, Biotechnol Bioeng. 96:106-17); o
- un elemento regulador de CMVh-MIE (por ejemplo, el que tiene la secuencia descrita en el documento WO 89/01036).
El término “proteína antigénica” se usa en el presente documento en el sentido más amplio y abarca cualquier proteína capaz de generar una respuesta inmunitaria, o bien sea sola o bien en combinación con un adyuvante. Puede estar prevista para su uso o bien en una vacuna profiláctica o bien en una vacuna terapéutica. En una realización específica, la proteína antigénica es una proteína de vacuna, es decir una proteína prevista para su uso en una vacuna profiláctica.
El vector de expresión puede comprender o bien al menos una secuencia que codifica para la proteína recombinante de interés (por ejemplo, una secuencia que codifica para una proteína monomérica, una secuencia que codifica para una cadena de anticuerpo, o dos secuencias, que codifican para una cadena ligera de anticuerpo y una cadena pesada de anticuerpo, respectivamente), o bien puede estar vacío (es decir carecer de una secuencia de este tipo que codifica para la proteína recombinante de interés).
Líneas celulares
La invención proporciona una línea de células CHO según la reivindicación 1. En una realización, dicha línea celular está transfectada (transfectada de manera estable o de manera transitoria) con dicho vector. En otra realización, dicha línea celular comprende dicho vector integrado en su genoma.
La línea celular es una línea de células CHO.
Más específicamente, la invención proporciona una línea de células CHO que comprende un vector de expresión de ADN, y en la que dicho vector comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una DHODH de mamífero (homóloga o heteróloga con respecto a la línea de células CHO) y al menos un casete de expresión para expresar una proteína recombinante.
Las líneas de células CHO se usan comúnmente para la producción industrial de proteínas, y los expertos en la técnica conocen muchas líneas de células CHO. Por ejemplo, tales líneas de células CHO incluyen cepas que están disponibles públicamente de la Colección Americana de Cultivos Tipo tal como la línea celular CHO-K1 (número ATCC: CCL-61), la línea celular CHO-S (comercializada, por ejemplo, por Invitrogen y Gibco), la línea celular CHO DP-12 (n.os ATCC: CRL-12444 y 12445) y la línea celular CHO 1-15 (número ATCC: CRL-9606). Otra línea celular adecuada para la producción industrial de proteínas es la línea celular CHO 9E4. La línea celular 9E4 se estableció a partir de un clon de la línea celular CHO-K1 a través de un proceso de clonación celular simple. La línea celular CHO-K1 se obtuvo por Puck en 1957 y se ha depositado en la ATCC con el número CCL-61.
En una realización específica, la línea celular es una línea de células CHO y la DHODH es de origen heterólogo (es decir DHODH no es una DHODH de hámster).
También pueden usarse células humanas tales como células HEK293 (número ATCC CRL-1573), HKB11 (número ATCC CRL-12568), PER-C6 (Crucell), HT1080 (número ATCC CRL-121), Jurkat, Daudi, Raji y cAp (número ATCC CRL-1098) para la producción de proteínas, con el fin de obtener un patrón de glicosilación nativo para proteínas humanas recombinantes.
En una realización, la línea celular es capaz de crecer en medio libre de suero (por ejemplo, un medio definido químicamente) y/o en suspensión. Una línea celular de este tipo puede obtenerse fácilmente por los expertos en la técnica adaptando la línea celular parental para crecer en medio libre de suero y/o en suspensión (por ejemplo, a través de clonación celular simple, a través de adaptación progresiva y/o a través de un proceso “privación y almacenamiento”). La línea celular puede ser o bien una línea celular deficiente en DHODH o bien una línea celular que comprende un gen de DHODH endógeno que codifica para un polipéptido de DHODH de tipo natural.
Kits, métodos y usos según la invención
La invención proporciona un kit que comprende o consiste en todo el o parte de un sistema de expresión según la invención. El kit comprende un vector de expresión que codifica para DHODH tal como se describe en el presente documento. En un kit de este tipo, el vector está preferiblemente vacío, dado que esto permite la clonación de la proteína de interés para los expertos en la técnica. Además, el vector de ADN está preferiblemente aislado de la línea celular en un kit de este tipo. El kit puede comprender además una línea celular tal como se describe en el presente documento, al menos un agente de selección tal como al menos un inhibidor de DHODH tal como se describe en el presente documento, medios adecuados para el cultivo de la línea celular, medios adecuados para la transfección del vector en la línea celular, un material de envasado y/o instrucciones para el uso del sistema de expresión. En una realización, el inhibidor de DHODH es teriflunomida, preferiblemente a una concentración de 25 a 200 pM, más preferiblemente de 50 a 100 pM, todavía más preferiblemente 50 pM.
La invención proporciona además el uso del sistema de expresión según la invención, o de la línea celular según la invención, o del kit según la invención, para producir una proteína recombinante in vitro. En una realización, al menos un inhibidor de DHODH, en particular teriflunomida, se usa para implementar el uso del sistema de expresión según la invención, de la línea celular según la invención, o del kit según la invención, para producir una proteína recombinante in vitro. Cuando se usa teriflunomida, se usa preferiblemente a una concentración de 25 a 200 pM, más preferiblemente de 50 a 100 pM, todavía más preferiblemente 50 pM.
La invención proporciona además el uso del sistema de expresión según la invención, o de la línea celular según la invención, o del kit según la invención, para aislar una célula clonal que produce altos niveles de una proteína recombinante (“clones altamente productores”) in vitro. En una realización, al menos un inhibidor de DHODH, en particular teriflunomida, se usa para implementar el uso del sistema de expresión según la invención, de la línea celular según la invención, o del kit según la invención, para producir una proteína recombinante in vitro. Cuando se usa teriflunomida, se usa preferiblemente a una concentración de 25 a 200 pM, más preferiblemente de 50 a 100 pM, todavía más preferiblemente 50 pM.
En el contexto de la invención, el término “alto nivel de una proteína recombinante” pretende significar que en el medio de cultivo la concentración de proteína recombinante es de al menos 0,05 g/l, preferiblemente al menos 0,1 g/l, todavía preferiblemente al menos 0,2 g/l, más preferiblemente entre 0,3 y 1 g/l. La concentración de proteína recombinante puede determinarse mediante métodos que conoce ampliamente el experto en la técnica, incluyendo en particular ensayo de inmunosorción ligado a enzima (ELISA), inmunotransferencia de tipo Western, una tecnología de calibre y un intervalo de concentración de la proteína purificada correspondiente a la proteína recombinante. La invención proporciona además un método in vitro de producción de una proteína recombinante, comprendiendo o consistiendo dicho método en las siguientes etapas:
a) proporcionar una línea de células CHO;
b) transfectar dicha línea celular con un vector
c) cultivar la línea celular transfectada obtenida en la etapa (b) en condiciones adecuadas para la producción de la proteína recombinante; y
d) aislar y/o purificar dicha proteína recombinante.
En una realización particular, la etapa (c) del método anterior se lleva a cabo en presencia del inhibidor de DHODH y comprende una subetapa que consiste en seleccionar las células transfectadas que son resistentes al inhibidor de DHODH. En una implementación de esta realización particular, el inhibidor de DHODH es teriflunomida. En otra implementación de esta realización específica citada anteriormente, la etapa (c) se lleva a cabo en presencia de una concentración de teriflunomida que comprende de 25 a 200 pM, preferiblemente de 50 a 100 pM, más preferiblemente 50 pM.
Tal como resultará inmediatamente evidente para los expertos en la técnica, el aspecto anterior se refiere a un sistema de expresión según la invención, en el que el vector de ADN se aísla de la línea celular en la etapa (a). La divulgación proporciona además un método in vitro de aislamiento de una célula clonal que produce altos niveles de una proteína recombinante, comprendiendo o consistiendo dicho método en las siguientes etapas:
a) proporcionar una línea celular;
b) transfectar dicha línea celular con un vector
c) cultivar la línea celular transfectada obtenida en la etapa (b) en condiciones adecuadas para la producción de la proteína recombinante; y
d) aislar una célula clonal que produce altos niveles de una proteína recombinante.
La etapa (c) del método anterior se lleva a cabo en presencia del inhibidor de DHODH y comprende una subetapa que consiste en seleccionar las células transfectadas que son resistentes al inhibidor de DHODH. En una implementación de esta realización particular, el inhibidor de DHODH es teriflunomida. En otra implementación de esta realización específica citada anteriormente, la etapa (c) se lleva a cabo en presencia de una concentración de teriflunomida que comprende de 25 a 200 pM, preferiblemente de 50 a 100 pM, más preferiblemente 50 pM.
La invención proporciona además un método in vitro de producción de una proteína recombinante, comprendiendo o consistiendo dicho método en las siguientes etapas:
a) proporcionar un sistema de expresión según la invención;
b) cultivar la línea celular transfectada en condiciones adecuadas para la producción de la proteína recombinante;
y
c) aislar y/o purificar dicha proteína recombinante.
En una realización específica, la etapa (b) del método anterior se lleva a cabo en presencia del inhibidor de DHODH y comprende una subetapa que consiste en seleccionar las células transfectadas que son resistentes al inhibidor de DHODH. En una implementación de esta realización específica, el inhibidor de DHODH es teriflunomida. En otra implementación de esta realización específica citada anteriormente, la etapa (b) del método anterior se lleva a cabo en presencia de una concentración de teriflunomida que comprende de 25 a 200 pM, preferiblemente de 50 a 100 pM, más preferiblemente 50 pM.
La invención proporciona además un método in vitro de aislamiento de una célula clonal que produce altos niveles de una proteína recombinante, comprendiendo o consistiendo dicho método en las siguientes etapas:
a) proporcionar un sistema de expresión según la invención;
b) cultivar la línea celular transfectada en condiciones adecuadas para la producción de la proteína recombinante;
y
c) aislar una célula clonal que produce altos niveles de una proteína recombinante.
En una realización específica, la etapa (b) del método anterior se lleva a cabo en presencia del inhibidor de DHODH y comprende una subetapa que consiste en seleccionar las células transfectadas que son resistentes al inhibidor de DHODH. En una implementación de esta realización específica, el inhibidor de DHODH es teriflunomida. En otra implementación de esta realización específica citada anteriormente, la etapa (b) del método anterior se lleva a cabo en presencia de una concentración de teriflunomida que comprende de 25 a 200 pM, preferiblemente de 50 a 100 pM, más preferiblemente 50 pM.
Tal como resultará inmediatamente evidente para los expertos en la técnica, el aspecto anterior se refiere a un sistema de expresión según la invención, en el que la línea celular comprende el vector de ADN (por ejemplo, la línea celular se ha transfectado previamente con el vector de ADN) en la etapa (a).
La divulgación proporciona además un método in vitro de producción de una proteína recombinante, que comprende o consiste en las siguientes etapas:
a) proporcionar un vector, en el que dicho vector comprende al menos una secuencia que codifica para una proteína recombinante;
b) transfectar una línea celular con dicho vector;
c) cultivar la línea celular transfectada obtenida en la etapa (b) en condiciones adecuadas para la producción de la proteína recombinante; y
d) aislar y/o purificar dicha proteína recombinante.
Los expertos en la técnica conocen ampliamente condiciones adecuadas para la producción de proteínas recombinantes. Pueden usarse, por ejemplo, los protocolos descritos en los ejemplos.
En una realización específica, se añade al menos un inhibidor de DHODH tal como leflunomida o teriflunomida cuando se cultiva la línea celular según la invención. En otra realización específica, se añaden concentraciones crecientes de tal inhibidor cuando se cultiva la línea celular. Esto permite seleccionar clones en los que se ha amplificado el gen de DHODH derivado del vector (y por tanto la secuencia que codifica para la proteína recombinante). En una implementación de las realizaciones específicas citadas anteriormente el inhibidor de DHODH es teriflunomida. En otra implementación de las realizaciones específicas citadas anteriormente, se añaden de 25 a 200 pM, preferiblemente de 50 a 100 pM, más preferiblemente 50 pM de teriflunomida cuando se cultiva la línea celular según la invención.
Los métodos anteriores pueden comprender además la etapa de formular la proteína recombinante en una composición farmacéutica.
La divulgación proporciona además un método in vitro de aislamiento de una célula clonal que produce altos niveles de una proteína recombinante, que comprende o consiste en las siguientes etapas:
a) proporcionar un vector, en el que dicho vector comprende al menos una secuencia que codifica para una proteína recombinante;
b) transfectar una línea celular con dicho vector;
c) cultivar la línea celular transfectada obtenida en la etapa (b) en condiciones adecuadas para la producción de la proteína recombinante; y
d) aislar una célula clonal que produce altos niveles de una proteína recombinante.
En una realización específica, se añade al menos un inhibidor de DHODH tal como leflunomida o teriflunomida cuando se cultiva la línea celular según la invención (es decir la etapa (c)). En otra realización específica, se añaden concentraciones crecientes de tal inhibidor cuando se cultiva la línea celular. Esto permite seleccionar clones en los que se ha amplificado el gen de DHODH derivado del vector (y por tanto la secuencia que codifica para la proteína recombinante). En una implementación de las realizaciones específicas citadas anteriormente el inhibidor de DHODH es teriflunomida. En otra implementación de las realizaciones específicas citadas anteriormente, se añaden de 25 a 200 pM, preferiblemente de 50 a 100 pM, más preferiblemente 50 pM de teriflunomida en la etapa (c). La divulgación proporciona además un método para amplificar conjuntamente una secuencia de ADN recombinante que codifica para una proteína recombinante, que comprende o consiste en las siguientes etapas:
a) proporcionar un vector, en el que dicho vector comprende una secuencia que codifica para dicha proteína recombinante;
b) proporcionar una línea celular;
c) transfectar dicha línea celular con dicho vector; y
d) cultivar dicha línea celular transfectada en condiciones que permiten seleccionar transformantes que contienen un número amplificado de copias de una secuencia derivada del vector que codifica para DHODH, en el que dichos transformantes también contienen un número amplificado de copias de la secuencia que codifica para la secuencia de aminoácidos completa de la proteína recombinante.
En una realización específica, la etapa (d) del método anterior puede comprender cultivar la línea celular transfectada en medio que contiene un inhibidor de DHODH y seleccionar células transformantes que son resistentes al inhibidor de DHODH, en particular hasta un nivel aumentado progresivamente del inhibidor de DHODH. En una implementación de la realización específica anterior, el inhibidor de DHODH es teriflunomida. En otra implementación de la realización específica citada anteriormente, el inhibidor de DHODH es teriflunomida y se usa a una concentración de 25 a 200 pM, preferiblemente de 50 a 100 pM, más preferiblemente 50 pM.
La divulgación proporciona además un método in vitro de aislamiento de una célula clonal que produce altos niveles de una proteína recombinante, que comprende o consiste en las siguientes etapas:
a) proporcionar un vector, en el que dicho vector comprende una secuencia que codifica para dicha proteína recombinante;
b) proporcionar una línea celular;
c) transfectar dicha línea celular con dicho vector; y
d) cultivar dicha línea celular transfectada en condiciones que permiten seleccionar transformantes que contienen un número amplificado de copias de una secuencia derivada del vector que codifica para DHODH, en el que dichos transformantes también contienen un número amplificado de copias de la secuencia que codifica para la secuencia de aminoácidos completa de la proteína recombinante;
e) aislar de las células transfectadas de la etapa (d) una célula clonal que produce altos niveles de una proteína recombinante.
En una realización específica, la etapa (d) del método anterior puede comprender cultivar la línea celular transfectada en medio que contiene un inhibidor de DHODH y seleccionar para células transformantes que son resistentes al inhibidor de DHODH, en particular hasta un nivel aumentado progresivamente del inhibidor de DHODH. En una implementación de la realización específica anterior, el inhibidor de DHODH es teriflunomida. En otra implementación de la realización específica citada anteriormente, el inhibidor de DHODH es teriflunomida y se usa a una concentración de 25 a 200 pM, preferiblemente de 50 a 100 pM, más preferiblemente 50 pM.
La divulgación proporciona además un método para usar un vector de ADN como marcador seleccionable dominante en un proceso de transformación conjunta, en el que dicho método comprende o consiste en las siguientes etapas:
a) proporcionar un vector, en el que dicho vector comprende una secuencia que codifica para una proteína recombinante;
b) proporcionar una línea celular;
c) transfectar dicha línea celular con dicho vector; y
d) seleccionar células transformantes que son resistentes a inhibidor(es) de DHODH, mediante lo cual se seleccionan células transformantes en las que una secuencia derivada del vector de ADN recombinante que codifica para DHODH sirve como marcador seleccionable dominante y que puede amplificarse conjuntamente. En una realización específica del método anterior, las células transformantes seleccionadas son resistentes al inhibidor de DHODH teriflunomida. En otra realización del método anterior, las células transformantes seleccionadas son resistentes una concentración de 25 a 200 pM, preferiblemente de 50 a 100 pM, más preferiblemente 50 pM de teriflunomida.
A lo largo de la memoria descriptiva, términos tales como ‘comprende’, ‘comprendido’ y ‘que comprende’ pueden tener el significado atribuido a los mismos en la mayoría de las jurisdicciones de patentes, preferiblemente en la jurisdicción en cuestión; por ejemplo, pueden significar ‘incluye’, ‘incluido’, ‘que incluye’, etc. Términos tales como ‘que consiste en’, ‘que consiste esencialmente en’ y ‘consiste esencialmente en’ tienen el significado asignado a los mismos en la mayoría de las jurisdicciones de patentes, preferiblemente en la jurisdicción en cuestión; por ejemplo, implican la exclusión de todos, la mayoría o todos excepto una cantidad insignificante de otros elementos, permiten para elementos no citados explícitamente, pero excluyen elementos que se encuentran en la técnica anterior o que afectan a una característica básica o novedosa de la invención.
A lo largo del texto de esta memoria descriptiva se citan varios documentos. Sin embargo, no hay ninguna admisión de que cualquier documento citado en el presente documento sea de hecho técnica anterior con respecto a la presente invención.
La invención se describirá adicionalmente mediante referencia a los siguientes dibujos y ejemplos, que son solo ilustrativos, y no pretenden limitar la presente invención. La invención está definida mediante las reivindicaciones, que deben interpretarse con la ayuda de la descripción y los dibujos.
Breve descripción de las secuencias
La SEQ ID NO: 1 muestra una secuencia de ADNc que codifica para DHODH de origen de hámster chino (Cricetulus griseus).
La SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia de aminoácidos de DHODH de origen de hámster chino.
La SEQ ID NO: 3 muestra una secuencia de ADNc que codifica para DHODH de origen humano.
La SEQ ID NO: 4 la secuencia de aminoácidos de DHODH de origen humano
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Creación de vectores de expresión que comprenden marcador de DHODH
Los inventores pretendieron desarrollar nuevos vectores para la expresión y producción de proteínas recombinantes en líneas celulares eucariotas. Se diseñaron dos conjuntos de vectores para la expresión de anticuerpos, que incorporan respectivamente DHODH humana y de hámster chino como marcadores seleccionables.
El primer conjunto de vectores comprendía dos ADNc que codifican para una versión humanizada del anticuerpo 13C3 (un ADNc que codifica para la cadena pesada de 13C3 y otro ADNc que codifica para la cadena ligera de 13C3, respectivamente, formando la combinación de dichas cadenas el anticuerpo 13C3 humanizado). El anticuerpo 13C3 murino es un anticuerpo que se une específicamente a la forma protofibrilar de la proteína p-amiloide humana, tal como se describe en el documento WO 2009/065054. Tal como se usa adicionalmente en el presente documento, el término “13C3” se refiere a la versión humanizada del anticuerpo 13C3 murino.
El segundo conjunto de vectores comprendía dos ADNc que codifican para un anticuerpo anti-CD38 (un ADNc que codifica para la cadena pesada y otro ADNc que codifica para la cadena ligera, respectivamente, formando la combinación de dichas cadenas el anticuerpo anti-CD38).
Los vectores se representan esquemáticamente en la Figura 1. Estos vectores comprenden:
- una secuencia que codifica para DHODH, puesta bajo el control del promotor de SV40 temprano;
- un primer casete de expresión, en el que la secuencia que codifica para la cadena ligera del anticuerpo se pone bajo el control del promotor de CMV;
- un segundo casete de expresión, en el que la secuencia que codifica para la cadena pesada del anticuerpo se pone bajo el control del promotor de CMV;
- un origen de replicación procariota; y
- un marcador seleccionable para su uso en células procariotas, concretamente una secuencia que codifica para una proteína que confiere resistencia a ampicilina, puesta bajo el control de su promotor natural.
Más específicamente, la secuencia que codifica para DHODH se pone bajo el control del promotor de SV40, que incluye el potenciador de SV40. Un promotor temprano de SV40 de este tipo contiene los potenciadores de repetición de tándem de 72 pb de SV40 ligados a las repeticiones no de tándem de 21 pb, y la secuencia proteica líder temprana de SV40 excluyendo cualquier secuencia codificante. El uso de esta región como promotor fuerte se describió por Benoist y Chambon (1981, Nature. 290:304-10) y en Moreau et al. (1981, Nucleic Acids Res. 9:6047-68). Se usa clásicamente como promotor para la expresión de marcadores de selección en células de mamífero. En los siete vectores pBH3694 a pBH3700, el sitio de restricción HindIII natural que se alteró, y sitios de restricción únicos (Sall y Xmal) se añadieron en el extremo 5’ y el 3’ de la región promotora, de una manera tal como para permitir un intercambio fácil de los diferentes ADNc de DHODH.
En cada conjunto de vectores, se clonaron secuencias que codifican para DHODH que tienen diferentes orígenes en los vectores.
Más específicamente, se generaron ADNc que codifican respectivamente para DHODH de hámster chino (Cricetulus griseus) y humana (Homo sapiens) usando las secuencias de aminoácidos que aparecen de manera natural (de tipo natural) disponibles en bases de datos públicas. Partiendo de estas secuencias, las proteínas se sometieron a traducción inversa usando una matriz de los codones más frecuentes usados en células CHO. Después, se modificaron las ADNc para contener sitios de clonación apropiados y se optimizaron las secuencias de nucleótidos. Debe indicarse que, aunque las secuencias de nucleótidos se optimizaron para la expresión de CHO, la secuencia de aminoácidos de proteínas codificadas sigue siendo idéntica a la de las proteínas codificadas de manera natural. Más específicamente, las secuencias codificantes que aparecen de manera natural para las diferentes DHODH se tomaron como punto de partida. La secuencia de aminoácidos de DHODH humana corresponde a la que se muestra en la secuencia de referencia de NCBI: NP_001352.2 (SEQ ID NO: 4). La secuencia de aminoácidos de DHODH de hámster chino corresponde a la que se muestra en la secuencia de referencia de NCBI: XP_007634457.1 (SEQ ID NO: 2). Partiendo de las secuencias de ADNc que aparecen de manera natural, los codones triplete de la secuencia que codifica para una DHODH de este tipo se sesgaron para la expresión en células CHO usando un software desarrollado por Wagner y colaboradores, que se basa en el algoritmo descrito en Raab et al. (2010, Syst Synth Biol.
4:215-25). Esta técnica no solo proporciona los mejores codones disponibles para la expresión, sino que también tiene en cuenta el contenido de GC y la ausencia de motivos de ADN no deseables.
Los ADNc obtenidos se clonaron en la estructura principal que porta los casetes de expresión para anticuerpo anti-CD38 y 13C3, proporcionando de ese modo los vectores representados en la Figura 1.
El nombre de estos vectores así como el origen y la secuencia de la DHODH codificada se muestra en la tabla a continuación.
Figure imgf000014_0001
Ejemplo 2: Uso de vectores en sistema de expresión de CHO con leflunomida y teriflunomida como agente de selección
Experimentos preliminares realizados usando células CHO 9E4 indicaron que la leflunomida podía usarse como agente de selección. Brevemente, los experimentos preliminares mostraron que cultivar células CHO 9E4 con leflunomida no destruía las células, pero inhibía el crecimiento a 50 y 100 gM. Se transfectaron células CHO 9E4 con plásmidos que portaban el ADNc que codifica para DHODH de hámster y el material genético para la producción de anticuerpos 13C3 y se cultivaron en placas de 96 pocillos con leflunomida 40 gM. Esto obtuvo 27 pocillos con células en crecimiento. De estos 27, 4 produjeron una cantidad baja pero significativa de anticuerpo 13C3. Sin embargo, la producción era inestable y la eficiencia era baja por debajo del 0,1%. Estos experimentos sirvieron como prueba del principio de que la DHODH puede usarse como marcador seleccionable para la producción de proteínas recombinantes, así que se realizaron experimentos adicionales.
La línea celular CHO 9E4 se transfectó con dos plásmidos diferentes que portaban el ADNc que codifica para ADNc de DHODH humana y el material genético para la producción de anticuerpos anti-CD38 o 13C3 (vectores pBH4952 y pBH4967). Como vector de control para la selección, el plásmido que portaba un ADNc que codifica para ADNc de GS humana en lugar de DHODH (pBH3695) se transfectó usando en líneas celulares CHO 9E4. El material genético se transfectó usando técnicas de electroporación convencionales.
Veinticuatro horas tras la transfección, se inició el proceso de selección. Para la DHODH tanto humana como de hámster, se diluyeron las células en medio CD-CHO que contiene ya sea leflunomida o teriflunomida 50 gM o 100 gM. El vector de control se transfectó igualmente y se sometió al mismo proceso de selección.
En cada caso, se sembraron 480 pocillos con 2000 células/pocillo. Para el vector de control no se observó crecimiento en ninguno de los pocillos a teriflunomida tanto 50 como 100 gM incluso tras 25 días.
La selección con leflunomida a tanto 50 como 100 gM fue ineficaz: en presencia de DHODH de origen humano o de hámster tras 20 días, todos los pocillos presentaban clones en crecimiento. Todos los sobrenadantes que corresponden a los 480 pocillos se sometieron a prueba para su capacidad para producir anticuerpos, y ninguno de los sobrenadantes mostró una cantidad detectable de anticuerpos, confirmando que la leflunomida es difícil de usar para esta clase de experimentos.
En la transfección seleccionada para teriflunomida, aparecieron células en crecimiento dos semanas más tarde en aproximadamente el 8-10% de los pocillos para células transfectadas con vector que porta el ADNc que codifica para ADNc de DHODH humana y el material genético para la producción de anti-CD38, así como para células transfectadas con vector que porta el ADNc que codifica para ADNc de DHODH humana y el material genético para la producción de anticuerpos anti-13C3 (vectores pBH4967 y pBH4952, respectivamente). Una proporción de los pocillos produjeron anticuerpo, algunos a más de 10 gg/ml, tal como se muestra en las tablas 1 y 2. En contraste, no se observó crecimiento en ninguno de los pocillos que comprendían células transfectadas con vector que porta el ADNc que codifica para ADNc de DHODH de hámster y el material genético para la producción de anticuerpos anti-CD38 o anti-13C3 (vectores pBH4940 y pBH4939, respectivamente).
Tabla 1: Resultados con anticuerpos 13C3. Los pocillos ocupados muestran clones en crecimiento tras de 15 a 20 días.
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Figure imgf000015_0001
Tabla 2: Resultados con anticuerpos anti-CD38. Los pocilios ocupados muestran clones en crecimiento tras de 15 a 20 días.
Figure imgf000015_0002
En global, en el caso de 13C3, 14 pocilios de 480 pocilios contenían clones que producen más de 10 pg/ml de anticuerpo, mientras que para anti-CD38, 29 pocillos de 480 pocillos contenían clones que producen más de 10 pg/ml de anticuerpo. Esta eficiencia era comparable con el ADNc de GS humana de marcador de selección convencional y el inhibidor de enzima GS acompañante metionina sulfoximina (MSX), oscilando el porcentaje de pocillos ocupados entre el 1 y el 10%. Un resultado típico de un experimento de este tipo se facilita en la tabla 3. Tabla 3: Resultados con anticuerpos 13C3 usando el sistema de expresión GS/MSX. Los pocillos ocupados muestran clones en crecimiento tras de 15 a 20 días.
Figure imgf000015_0003
Ejemplo 3: Evaluación de productividad usando teriflunomida como agente de selección
Con el fin de medir la cantidad de anticuerpos producidos en más profundidad, los clones más prometedores se amplificaron y evaluaron para determinar productividades en un protocolo que imita condiciones de biorreactor. Se eligieron células de los pocillos que producían el mayor nivel de anticuerpos en el ejemplo 1 para su amplificación adicional. Cada pocillo contenía 2000 células al principio del experimento, por tanto, cada pocillo no contiene un clon per se. Cada célula de pocillo se denomina en este caso semiclón.
Se hicieron crecer 14 pocillos que correspondían a semiclones que producen anticuerpos 13C3 y 19 pocillos que correspondían a semiclones que producen anticuerpos anti-CD38 en condiciones adecuadas.
Como control positivo se amplificaron 5 semiclones que correspondían a la transfección MSX/GS.
Todos los experimentos de amplificación se realizaron en medio CD-CHO (Life Technologies) que contenía teriflunomida 50 pM o MSX 25 pM, respectivamente para selección de DHODH humana o GS humana, a 37°C con el 5% de CO2 y el 80% de humedad.
Las células en crecimiento de 96 pocillos de cada anticuerpo producto se transfirieron a 1 ml de medio en placas de 24 pocillos. Tras 3 días de crecimiento, la suspensión celular de 1 ml se transfirió a un matriz de 25 cm2 que contenía 4 ml de medio nuevo y se hicieron crecer las células con agitación durante otros 3 días. Tras 3 días de incubación se añadieron 5 ml de medio nuevo. Tras numerar la suspensión celular, se sembró otro cultivo a 0,3x106 células por ml y se hizo crecer durante otros 3 días. Tras este crecimiento se inició un cultivo final para la producción de anticuerpos sembrado a 0,3x106 células por ml en CD-CHO 30% de Feed B.
La suspensión celular se incubó durante 13 días y se tomaron muestras a los 10 y 13 días de incubación para la evaluación de la concentración de anticuerpo.
La Figura 3 muestra la productividad de los 14 semiclones DHODH/13C3 el día 10 y el día 13 en presencia de teriflunomida 50 pM.
La Figura 4 muestra la productividad de los 19 semiclones DHODH/anti-CD38 el día 10 y el día 13 en presencia de teriflunomida 50 pM.
En global, las productividades (de 0,5 a 0,8 g/l el día 13) y frecuencias (aproximadamente del 3 al 10% de los semiclones productos de 96 pocillos) conseguidas estaban en el mismo intervalo que la GS humana de referencia en células CHO 9E4 (véase la tabla 3) o GS de hámster en células CHO K1SV. Esto puede verse a partir de la Figura 5, que muestra la productividad de semiclones GS/13C3 CHO 9E4 los días 8 y 13 en presencia de MSX 25 pM.
Ejemplo 4: Transfección transitoria de células CHO usando el vector GS de referencia y el vector a base de DHODH.
Experimento A: El anticuerpo 13C3 se usó para medir la eficiencia de transfección de vectores que portan marcador de selección de DHODH.
Para hacer esto, se prepararon vectores según la especificación de Maxcyte, por ejemplo, bajo contenido en endotoxina, relación 260 nm/280 nm próxima a 2, concentración a 5 mg/ml. Se sometieron a electroporación células CHO-9E4 usando el protocolo de electroporación de alta eficiencia desarrollado por Maxcyte en el aparato Maxcyte STX® por cuadruplicado con un vector de control que porta un ADNc que codifica para ADNc de GS humana en lugar de DHODH, concretamente el plásmido pBH3695, y con un vector que porta DHODH concretamente pBH4952. Se dividieron las células a 1x10624 h antes de la transfección. Para cada condición de transfección se centrifugaron 80x106 células durante 10 min a 300 g. Se resuspendió el sedimento con 200 pl de tampón Hyclone (Maxcyte). Se añadió ADN a 0,3 pg/pl y se transfirió la mezcla (células, tampón y ADN) a un casete de electroporación Maxcyte de 400 pl. El conjunto de procesamiento usado fue el OC-400 específico para el casete de 400 pl, y se seleccionó el programa optimizado para HEK-293FS. Para la fase de recuperación se transfirieron células transfectadas a un matraz de 125 ml y se incubó a 37°C durante 40 min, sin agitación. Se añadieron 20 ml de medio Freestyle precalentado (Invitrogen) y se hicieron crecer las células durante 24 h a 37°C, el 5% de CO2, el 80% de humedad y agitación a 110 rpm. Se detuvo el crecimiento celular mediante la adición de butirato de sodio 1 M (Merck) hasta alcanzar una concentración final de 1 mM. Se mantuvieron las células de cultivo a 32°C durante 10 días y se alimentaron con el 3,6% de un alimento producto especial (el 2,5% de EfficientFeedA (Invitrogen), el 0,5% Yeastcolate (Invitrogen), 2 g/l de glucosa (Sigma) y GlutaMAX 0,25 mM (Invitrogen)) durante 13 días.
Se midió la concentración de anticuerpos producida mediante las células transfectadas de manera transitoria, 7, 10, 11, 12 y 13 días tras la transfección, usando la tecnología de calibre y un intervalo de concentración del anticuerpo purificado humano. Estas concentraciones se presentan en la tabla 4.
Tabla 4: Concentración de anticuerpo 13C3 (facilitada en mg/l) producida mediante las líneas celulares transfectadas de manera transitoria.
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Experimento B:
Este experimento pretendía principalmente (i) comparar la producción de anticuerpo 13C3 de células transfectadas de manera transitoria con diferentes vectores (es decir vector pBH3695 que codifica para GS humana como marcador de selección y vector pBH4952 que codifica para DHODH humana como marcador de selección), y (ii) comparar la producción de dos anticuerpos diferentes (es decir anticuerpos 13C3 y anti-CD38) usando el vector pBH4952 y pBH4967.
El procedimiento experimental usados es el mismo que el dado a conocer anteriormente para el experimento A. Sin embargo, en el experimento B se sometieron a prueba dos líneas de células CHO diferentes (es decir CHO 9E4 y CHO 30D12 (una línea celular en la que se ha inactivado el gen que codifica para glutamina sintetasa)) y se midió la concentración de anticuerpos producida mediante las células a los 20 días. Además se sometieron a prueba tres procesos de purificación alternativos de vector pBH4952 (procesos que usan una columna Qiagen clásica, una columna HiSpeed - comercializada por Qiagen - y una columna de Macherey-Nagel, respectivamente) para investigar el efecto potencial del proceso de purificación sobre la producción final de anticuerpos.
Como resulta evidente a partir de la tabla 5 a continuación que resume los resultados de este experimento, cualquiera que sea el protocolo de purificación usado para purificar el vector, las cantidades de anticuerpos producidos son similares. Además, la producción de anticuerpos es similar en CHO 9E4 y CHO 30D12. Además, dado que las concentraciones de anticuerpos 13C3 y anti-CD38 producidas por las células transfectadas con vectores que expresan DHODH como marcador de selección son similares (véanse los datos relativos a los vectores pBH4952 y pBH4967), puede concluirse que la producción de anticuerpo no depende de la naturaleza del anticuerpo.

Claims (21)

  1. REIVINDICACIONES
    1 Una línea de células de ovario de hámster chino (CHO) que comprende un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una deshidroorotato deshidrogenasa (DHODH) de mamífero y al menos un casete de expresión para expresar una proteína recombinante, en la que dicha DHODH comprende una secuencia idéntica en al menos el 90% a la secuencia de SEQ ID NO: 2 o a la secuencia de SEQ ID NO: 4 y en la que dicha DHODH es sensible a al menos un inhibidor de DHODH.
  2. 2. - La línea de células de ovario de hámster chino (CHO) según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1 o la secuencia de SEQ ID NO: 3.
  3. 3. - La línea de células de ovario de hámster chino (CHO) según una cualquiera de la reivindicación 1 y 2, en la que dicha proteína recombinante es un anticuerpo monoclonal.
  4. 4. - La línea de células de ovario de hámster chino (CHO) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho vector de expresión comprende un primer casete de expresión adecuado para clonar una cadena ligera de anticuerpo, y un segundo casete de expresión adecuado para clonar una cadena pesada de anticuerpo.
  5. 5. - La línea de células de ovario de hámster chino (CHO) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha DHODH es sensible a teriflunomida.
  6. 6. - Un sistema de expresión que comprende una línea de células CHO según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
  7. 7. - El sistema de expresión según la reivindicación 6, que comprende además al menos un inhibidor de DHODH.
  8. 8. - El sistema de expresión según la reivindicación 7, en el que el al menos un inhibidor de DHODH es teriflunomida.
  9. 9. - El sistema de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que la DHODH codificada por la secuencia de nucleótidos que codifica para una DHODH comprendida en el vector de expresión no es una DHODH de hámster.
  10. 10. - Un kit que comprende la línea de células CHO según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y al menos un inhibidor de DHODH.
  11. 11. - El kit según la reivindicación 10, en el que el al menos un inhibidor de DHODH es teriflunomida.
  12. 12. - Un método in vitro de producción de una proteína recombinante que comprende las etapas de:
    a) proporcionar una línea de células CHO según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5;
    b) cultivar dicha línea de células CHO obtenida en condiciones adecuadas para la producción de la proteína recombinante; y
    c) aislar y/o purificar dicha proteína recombinante.
  13. 13. - El método según la reivindicación 12, en el que la etapa (b) se lleva a cabo en presencia de al menos un inhibidor de DHODH.
  14. 14. - El método según la reivindicación 12, en el que el al menos un inhibidor de DHODH es teriflunomida.
  15. 15. - Un método de producción de una composición farmacéutica, comprendiendo dicho método un método según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que la proteína recombinante obtenida en la etapa c) se formula adicionalmente en una composición farmacéutica.
  16. 16. - Uso de una línea de células CHO según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, sistema de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 o kit según la reivindicación 10 u 11 para producir una proteína recombinante.
  17. 17. - El uso según la reivindicación 16, en el que la línea de células CHO, el sistema de expresión o el kit se usa en combinación con al menos un inhibidor de DHODH.
  18. 18. - El uso según la reivindicación 17, en el que el al menos un inhibidor de DHODH es teriflunomida.
  19. 19. - Uso de una secuencia de nucleótidos que codifica para DHODH tal como se define en la reivindicación 1 como marcador de selección para aislar clones de células CHO que producen proteínas recombinantes.
  20. 20.- El uso según la reivindicación 19, en el que dicha secuencia de nucleótidos que codifica para DHODH se usa en combinación con al menos un inhibidor de DHODH.
  21. 21.- El uso según la reivindicación 20, en el que el al menos un inhibidor de DHODH es teriflunomida.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CL2016001661A1 (es) 2016-06-29 2017-03-03 Univ Chile Promotor hibrido de ß-actina (de cricetulus griseus) y citomegalovirus (cmv), con región rica en dinucleótidos, citosina-guanina, vectores, líneas celulares, procedimiento para producir proteínas recombinantes.
JP7287972B2 (ja) * 2018-02-14 2023-06-06 ユニバーシティ オブ ヒューストン システム 循環腫瘍細胞のユニバーサル検出のためのプローブ
US20220177909A1 (en) 2019-03-19 2022-06-09 Sanofi Novel Selection Marker-Comprising Cell Line and Uses Thereof for Protein Production
TW202227622A (zh) 2020-09-21 2022-07-16 法商賽諾菲公司 用於生產治療蛋白之高生產重組中國倉鼠卵巢細胞株之世代

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
KR100267720B1 (ko) 1997-12-29 2001-03-02 박호군 사람 글루타민 합성효소 유전자를 포함하는 발현벡터 및 이를 이용하여 동물세포에서 에리트로포이에틴을 고수율로 생산하는 방법
US20030166201A1 (en) * 2001-04-30 2003-09-04 Jensen Michael C. Selection systems for genetically modified cells
GB0808029D0 (en) 2008-05-01 2008-06-11 F2G Ltd Antifungal target
EP2430164B1 (en) 2009-05-11 2017-07-19 Pfenex, Inc. Production of recombinant proteins utilizing non-antibiotic selection methods and the incorporation of non-natural amino acids therein
US20140031383A1 (en) * 2011-02-08 2014-01-30 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for treatment of melanoma
EP2674495A1 (en) * 2012-06-14 2013-12-18 Sanofi CHO expression system
WO2014100073A2 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Expression vectors for recombinant protein production in mammalian cells

Also Published As

Publication number Publication date
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US10557125B2 (en) 2020-02-11
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