TW202227622A - 用於生產治療蛋白之高生產重組中國倉鼠卵巢細胞株之世代 - Google Patents
用於生產治療蛋白之高生產重組中國倉鼠卵巢細胞株之世代 Download PDFInfo
- Publication number
- TW202227622A TW202227622A TW110134938A TW110134938A TW202227622A TW 202227622 A TW202227622 A TW 202227622A TW 110134938 A TW110134938 A TW 110134938A TW 110134938 A TW110134938 A TW 110134938A TW 202227622 A TW202227622 A TW 202227622A
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- gene
- dhodh
- endogenous
- cell line
- sequence
- Prior art date
Links
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 title description 24
- 230000014616 translation Effects 0.000 title description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title description 2
- 108010052167 Dihydroorotate Dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 152
- 102100032823 Dihydroorotate dehydrogenase (quinone), mitochondrial Human genes 0.000 claims abstract description 152
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 91
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 62
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 62
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 claims description 113
- 101150074355 GS gene Proteins 0.000 claims description 97
- 101150102768 Dhodh gene Proteins 0.000 claims description 95
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 91
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 81
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 64
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 64
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 63
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 claims description 57
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 57
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 claims description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 55
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 40
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 30
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 30
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 claims description 25
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 25
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 24
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims description 21
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims description 18
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 15
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 14
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 14
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 14
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 14
- 108020000311 Glutamate Synthase Proteins 0.000 claims description 13
- 229940083266 Dihydroorotate dehydrogenase inhibitor Drugs 0.000 claims description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 6
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 5
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 2
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 abstract 2
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 abstract 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 234
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 97
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 67
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 50
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 50
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 41
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 39
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 36
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 31
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 26
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 25
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 24
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 19
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 18
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 15
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 13
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 13
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 12
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 12
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 12
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 11
- 101100246662 Homo sapiens DHODH gene Proteins 0.000 description 11
- JHRWWRDRBPCWTF-OLQVQODUSA-N captafol Chemical compound C1C=CC[C@H]2C(=O)N(SC(Cl)(Cl)C(Cl)Cl)C(=O)[C@H]21 JHRWWRDRBPCWTF-OLQVQODUSA-N 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 10
- PXQPEWDEAKTCGB-UHFFFAOYSA-N orotic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(=O)NC(=O)N1 PXQPEWDEAKTCGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 10
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 9
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 229960000331 teriflunomide Drugs 0.000 description 8
- UTNUDOFZCWSZMS-YFHOEESVSA-N teriflunomide Chemical compound C\C(O)=C(/C#N)C(=O)NC1=CC=C(C(F)(F)F)C=C1 UTNUDOFZCWSZMS-YFHOEESVSA-N 0.000 description 8
- -1 uracil nucleic acid Chemical class 0.000 description 8
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 7
- 101000888841 Homo sapiens Glutamine synthetase Proteins 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N Phosphinothricin Natural products CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 229960005010 orotic acid Drugs 0.000 description 4
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 4
- 125000000714 pyrimidinyl group Chemical group 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxycytosine 5'-monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 3
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000888808 Canis lupus familiaris Glutamine synthetase Proteins 0.000 description 3
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 3
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 3
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 3
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Natural products O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DJJCXFVJDGTHFX-UHFFFAOYSA-N Uridinemonophosphate Natural products OC1C(O)C(COP(O)(O)=O)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DJJCXFVJDGTHFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IERHLVCPSMICTF-XVFCMESISA-N cytidine 5'-monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 IERHLVCPSMICTF-XVFCMESISA-N 0.000 description 3
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Natural products NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 102200088125 rs267606767 Human genes 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N uridine 5'-monophosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- LCPGTEQSMLUDHW-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(phosphonomethyl)phosphoryl]butanoic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CCP(O)(=O)CP(O)(O)=O LCPGTEQSMLUDHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SODXFOVXZATGPJ-UHFFFAOYSA-N 4-amino-4-phosphonobutanoic acid Chemical compound OP(=O)(O)C(N)CCC(O)=O SODXFOVXZATGPJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000003930 Aegle marmelos Nutrition 0.000 description 2
- 244000058084 Aegle marmelos Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZWIADYZPOWUWEW-XVFCMESISA-N CDP Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 ZWIADYZPOWUWEW-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- RGSFGYAAUTVSQA-UHFFFAOYSA-N Cyclopentane Chemical compound C1CCCC1 RGSFGYAAUTVSQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PCDQPRRSZKQHHS-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Triphosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 PCDQPRRSZKQHHS-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 2
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 2
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- 102100035102 E3 ubiquitin-protein ligase MYCBP2 Human genes 0.000 description 2
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 229930192627 Naphthoquinone Chemical class 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 2
- MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N S-adenosyl-L-methioninate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C[S+](CC[C@H](N)C([O-])=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N TTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N Uridine-5'-Diphosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 2
- BZDVTEPMYMHZCR-JGVFFNPUSA-N [(2s,5r)-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)CC1 BZDVTEPMYMHZCR-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- 229960001570 ademetionine Drugs 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- PHEZJEYUWHETKO-UHFFFAOYSA-N brequinar Chemical compound N1=C2C=CC(F)=CC2=C(C(O)=O)C(C)=C1C(C=C1)=CC=C1C1=CC=CC=C1F PHEZJEYUWHETKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- IERHLVCPSMICTF-UHFFFAOYSA-N cytidine monophosphate Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(COP(O)(O)=O)O1 IERHLVCPSMICTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- FTDHDKPUHBLBTL-SHYZEUOFSA-K dCDP(3-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 FTDHDKPUHBLBTL-SHYZEUOFSA-K 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N dCTP Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- UJLXYODCHAELLY-XLPZGREQSA-N dTDP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 UJLXYODCHAELLY-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- QHWZTVCCBMIIKE-SHYZEUOFSA-N dUDP Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 QHWZTVCCBMIIKE-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- JSRLJPSBLDHEIO-SHYZEUOFSA-N dUMP Chemical compound O1[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 JSRLJPSBLDHEIO-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N desoxyuridine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UFIVEPVSAGBUSI-UHFFFAOYSA-M dihydroorotate Chemical compound [O-]C(=O)C1CC(=O)NC(=O)N1 UFIVEPVSAGBUSI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000034431 double-strand break repair via homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 229960000681 leflunomide Drugs 0.000 description 2
- VHOGYURTWQBHIL-UHFFFAOYSA-N leflunomide Chemical compound O1N=CC(C(=O)NC=2C=CC(=CC=2)C(F)(F)F)=C1C VHOGYURTWQBHIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002791 naphthoquinones Chemical class 0.000 description 2
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 2
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- ATZKMFHSNCHVOI-UHFFFAOYSA-N (1-amino-4-methoxy-4-oxobutyl)phosphonic acid Chemical compound COC(=O)CCC(N)P(O)(O)=O ATZKMFHSNCHVOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTIYGJDWWLIDQY-STHAYSLISA-N (2r,3s)-3-aminooxetane-2-carboxylic acid Chemical compound N[C@H]1CO[C@H]1C(O)=O UTIYGJDWWLIDQY-STHAYSLISA-N 0.000 description 1
- GLQAEKKCNIFCIJ-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-amino-2-ethyl-4-methylsulfanylbutanoic acid Chemical compound CC[C@@](N)(C(O)=O)CCSC GLQAEKKCNIFCIJ-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- UFIVEPVSAGBUSI-REOHCLBHSA-N (S)-dihydroorotic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CC(=O)NC(=O)N1 UFIVEPVSAGBUSI-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZGNLFUXWZJGETL-YUSKDDKASA-N (Z)-[(2S)-2-amino-2-carboxyethyl]-hydroxyimino-oxidoazanium Chemical compound N[C@@H](C\[N+]([O-])=N\O)C(O)=O ZGNLFUXWZJGETL-YUSKDDKASA-N 0.000 description 1
- NQQRXZOPZBKCNF-NSCUHMNNSA-N (e)-but-2-enamide Chemical compound C\C=C\C(N)=O NQQRXZOPZBKCNF-NSCUHMNNSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 2'‐deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- INLYYXLPQFTQLY-UHFFFAOYSA-N 2-[3-[(4-amino-2-ethylpyrimidin-5-yl)methyl]-4-methyl-1,3-thiazol-3-ium-5-yl]ethanol Chemical compound NC1=NC(CC)=NC=C1C[N+]1=CSC(CCO)=C1C INLYYXLPQFTQLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQZIRNIZQHVBMB-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[4-(2-carboxyanilino)-3-methoxyphenyl]-2-methoxyanilino]benzoic acid Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(NC=3C(=CC=CC=3)C(O)=O)=CC=2)=CC=C1NC1=CC=CC=C1C(O)=O IQZIRNIZQHVBMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HONKEGXLWUDTCF-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-methyl-4-phosphonobutanoic acid Chemical compound OC(=O)C(N)(C)CCP(O)(O)=O HONKEGXLWUDTCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WVCHIGAIXREVNS-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-1,4-naphthoquinone Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC(=O)C(=O)C2=C1 WVCHIGAIXREVNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IMOYJFBRHULUCZ-UHFFFAOYSA-N 2-methoxycarbonyl-4-phosphonobutanoic acid Chemical compound COC(=O)C(C(O)=O)CCP(O)(O)=O IMOYJFBRHULUCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XOQQVKDBGLYPGH-UHFFFAOYSA-N 2-oxo-1h-quinoline-3-carboxylic acid Chemical compound C1=CC=C2NC(=O)C(C(=O)O)=CC2=C1 XOQQVKDBGLYPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IDPWXVBDDIYDKT-UHFFFAOYSA-N 2-phenoxyquinoline Chemical compound C=1C=C2C=CC=CC2=NC=1OC1=CC=CC=C1 IDPWXVBDDIYDKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-ULQXZJNLSA-N 4-amino-1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-tritiopyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C([3H])=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-ULQXZJNLSA-N 0.000 description 1
- KSBYEVVCFZZGDC-UHFFFAOYSA-N 4-amino-4-phosphonopentanoic acid Chemical compound OP(=O)(O)C(N)(C)CCC(O)=O KSBYEVVCFZZGDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940117976 5-hydroxylysine Drugs 0.000 description 1
- 102100040131 60S ribosomal protein L37 Human genes 0.000 description 1
- ZXLMSTBJMZJAAH-UHFFFAOYSA-N 8-chloro-4-(2-chloro-4-fluorophenoxy)quinoline Chemical compound ClC1=CC(F)=CC=C1OC1=CC=NC2=C(Cl)C=CC=C12 ZXLMSTBJMZJAAH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-M Aminoacetate Chemical compound NCC([O-])=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000282461 Canis lupus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane Chemical compound C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000008265 DNA repair mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N Deoxycytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1OC(CO)C(O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 description 1
- 102100036263 Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 101000671735 Homo sapiens 60S ribosomal protein L37 Proteins 0.000 description 1
- 101001001786 Homo sapiens Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 1
- MLFKVJCWGUZWNV-UHFFFAOYSA-N L-alanosine Natural products OC(=O)C(N)CN(O)N=O MLFKVJCWGUZWNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- MEPSBMMZQBMKHM-UHFFFAOYSA-N Lomatiol Natural products CC(=C/CC1=C(O)C(=O)c2ccccc2C1=O)CO MEPSBMMZQBMKHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- CGPAXIQZLBKPBG-UHFFFAOYSA-N OCP(=O)C(N)(C)CCC(O)=O Chemical compound OCP(=O)C(N)(C)CCC(O)=O CGPAXIQZLBKPBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 235000016496 Panda oleosa Nutrition 0.000 description 1
- 240000000220 Panda oleosa Species 0.000 description 1
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100037925 Prothymosin alpha Human genes 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- CIEYTVIYYGTCCI-UHFFFAOYSA-N SJ000286565 Natural products C1=CC=C2C(=O)C(CC=C(C)C)=C(O)C(=O)C2=C1 CIEYTVIYYGTCCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 101000910035 Streptococcus pyogenes serotype M1 CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1 Proteins 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037116 Transcription elongation factor 1 homolog Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PGAVKCOVUIYSFO-UHFFFAOYSA-N [[5-(2,4-dioxopyrimidin-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 PGAVKCOVUIYSFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 229950005033 alanosine Drugs 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- ZYVMPHJZWXIFDQ-LURJTMIESA-N alpha-methylmethionine Chemical compound CSCC[C@](C)(N)C(O)=O ZYVMPHJZWXIFDQ-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- KUCQYCKVKVOKAY-CTYIDZIISA-N atovaquone Chemical compound C1([C@H]2CC[C@@H](CC2)C2=C(C(C3=CC=CC=C3C2=O)=O)O)=CC=C(Cl)C=C1 KUCQYCKVKVOKAY-CTYIDZIISA-N 0.000 description 1
- 229960003159 atovaquone Drugs 0.000 description 1
- 230000010310 bacterial transformation Effects 0.000 description 1
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical class C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 229950010231 brequinar Drugs 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 239000003179 convulsant agent Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N delta-DL-hydroxylysine Natural products NCC(O)CCC(N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N erythro-5-hydroxy-L-lysine Chemical compound NC[C@H](O)CC[C@H](N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 125000004216 fluoromethyl group Chemical group [H]C([H])(F)* 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- HBDWQSHEVMSFGY-UHFFFAOYSA-N gamma-hydroxy-L-glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CC(O)C(O)=O HBDWQSHEVMSFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229940049906 glutamate Drugs 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- DMEGYFMYUHOHGS-UHFFFAOYSA-N heptamethylene Natural products C1CCCCCC1 DMEGYFMYUHOHGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- CSFWPUWCSPOLJW-UHFFFAOYSA-N hydroxynaphthoquinone Natural products C1=CC=C2C(=O)C(O)=CC(=O)C2=C1 CSFWPUWCSPOLJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KNOSIOWNDGUGFJ-UHFFFAOYSA-N hydroxysesamone Natural products C1=CC(O)=C2C(=O)C(CC=C(C)C)=C(O)C(=O)C2=C1O KNOSIOWNDGUGFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- CWPGNVFCJOPXFB-UHFFFAOYSA-N lapachol Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(=O)C(CC=C(C)C)=C(O)C2=C1 CWPGNVFCJOPXFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SIUGQQMOYSVTAT-UHFFFAOYSA-N lapachol Natural products CC(=CCC1C(O)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SIUGQQMOYSVTAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 150000004712 monophosphates Chemical class 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910000069 nitrogen hydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000007978 oxazole derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 229940083082 pyrimidine derivative acting on arteriolar smooth muscle Drugs 0.000 description 1
- 230000006824 pyrimidine synthesis Effects 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- BSUXZTMOMIFYBF-FFWSUHOLSA-N tabtoxinine beta-lactam Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC[C@]1(O)CNC1=O BSUXZTMOMIFYBF-FFWSUHOLSA-N 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
- C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
- C12Y103/05—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with a quinone or related compound as acceptor (1.3.5)
- C12Y103/05002—Dihydroorotate dehydrogenase (1.3.5.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
- C12Y603/01—Acid-ammonia (or amine)ligases (amide synthases)(6.3.1)
- C12Y603/01002—Glutamate-ammonia ligase (6.3.1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本發明係關於包括部分或完全不活化之內生性二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)和麩醯胺酸合成酶(GS)基因之細胞株，以及其用於生產重組蛋白之用途。
Description
本發明係關於用於蛋白生產之細胞株和選擇標記。
工業規模生產重組蛋白需要分離出生產高量重組蛋白的選植株。將異源基因導入動物宿主細胞並就加入基因的表現進行篩選為一冗長極複雜的過程。該過程涉及轉染和選擇具有穩定長期表現的選植株，以及篩選對於對應重組蛋白具有高表現率的選植株。
當從表現載體產生表現一重組蛋白的選植株時，通常係以在相同載體上編碼感興趣蛋白和選擇標記二者之DNA載體轉染宿主細胞。此一表現載體因此係包括一能選擇其中有表現載體存在之選擇株的可選擇標記。此一可選擇標記亦能導致轉染的DNA共擴增，藉此得以分離高生產選植株。
最具可選擇性的標記為賦予對抗生素或其他毒性物質阻抗性之蛋白，或細胞存活所必需的蛋白。本項技術中已知有數種此可選擇標記，包括，例如G418、潮黴素(hygromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、博萊黴素(zeomycin)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、麩醯胺酸合成酶(GS)和次黃嘌呤-鳥嘌呤轉磷酸核糖機轉移酶(HPRT)。
在真核細胞之工業重組蛋白生產領域中GS係廣泛地用作為可選擇標記。GS基因容許細胞生長所需之麩醯胺酸合成，且係受到MSX (L-甲硫胺酸磺醯亞胺)抑制。在MSX的存在下，僅表現較高量GS的細胞能存活。在適當的篩選後，可能選出生產外生性蛋白的細胞。
在先前申請案WO2016/062837中，發明者們開發出以使用二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)作為可選擇標記為基礎的表現系統。DHODH為一種嘧啶合成所需的酵素。抑制DHODH的化合物因此抑制DNA合成且因而抑制細胞增生。此選擇標記因此係包括與DHODH抑制劑，例如來氟米特(leflunomide)和特立氟胺(teriflunomide)組合使用之編碼DHODH的表現載體。
然而，大部分與上述選擇標記一起使用的抑制劑為有毒的。在DHODH選擇標記之情況下，例如特立氟胺為一強力的免疫抑制劑且其處理，尤其是大規模處理就安全性理由可能具挑戰性。在GS選擇標記的情況下，MSX在高劑量時為一驚厥劑且可能因此亦造成處理上的問題。在DHFR選擇標記的情況下，胺甲喋呤已知係顯現造血和消化毒性，因而亦造成處理問題。
再者，就製造複合蛋白，例如雙專一性或三專一性單株抗體，需要一單一選植株從數個個別表現載體產生數種個別重組蛋白。在此等情況下，宿主細胞必須以數個DNA載體轉染，於相同的載體上各自編碼一感興趣蛋白和一專一性選擇標記。各表現載體因此係包括一不同的可選擇標記，而得以選擇其中存有表現載體之選植株。
因此，對於能經由數個不同的選擇標記生產數種不同蛋白，且其可在不增加化合物處理困難之下，進行生產感興趣蛋白選植株選擇的表現系統，有其需求。
本發明符合此項需求。
本發明係由發明者們設計的細胞株所產生，其中由於該細胞株內的DHODH基因和GS基因部分或全部不活化，而可以缺乏尿苷和麩醯胺酸的培養基來選擇製造感興趣蛋白的細胞。此細胞株，其中DHODH基因和GS基因為部分或全部不活化，典型地係生長於補充尿苷和麩醯胺酸的培養基中，但當以包括一編碼哺乳動物DHODH，尤其是編碼突變的哺乳動物DHODH之核苷酸序列和一用於表現第一感興趣蛋白之表現匣的表現載體，及以一包括編碼哺乳動物GS之核苷酸序列和一用於表現第二感興趣蛋白之表現匣的表現載體轉染時，培養基典型地係以缺乏尿苷和麩醯胺酸的培養基置換，藉此選出生產第一和第二感興趣蛋白之細胞。
，因為藉由避開使用抑制劑成為選擇壓力，其增加了生產細胞的存活力，所以此一表現系統為特別有利的。本發明者們進一步驗證此毒性的降低係與高生產力有關。再者，此一表現系統能製造複合重組蛋白，例如雙專一性或三專一性單株抗體。
本發明因此係關於包括下列之細胞株：
- 部分或完全不活化的內生性二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)基因，及
- 部分或完全不活化的內生性麩醯胺酸合成酶(GS)基因。
在一特定的具體實例中，該細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株。
在另外特定的具體實例中，該細胞係藉由下列所製造：
(a1) 使一包括內生性DHODH基因和內生性GS基因之細胞中的內生性DHODH基因不活化，特言之藉由基因編輯法，例如藉由CRISPR-Cas法，例如藉由CRISPR-Cas9法，
(b1) 在包括尿苷的培養基中，於適合生產其中內生性DHODH基因為部分或完全不活化之細胞株的條件下培養該細胞，
(c1) 回收該其中內生性DHODH基因為部分或完全不活化之細胞，
(d1) 使該細胞中的內生性GS基因不活化，特言之藉由基因編輯法，例如藉由CRISPR-Cas法，例如藉由CRISPR-Cas9法，及
(e1) 在包括麩醯胺酸的培養基中，於適合生產其中內生性GS基因為部分或完全不活化之細胞株的條件下培養該細胞。
在一替代的特定具體實例中，該細胞係藉由下列所製造：
(a2) 提供一包括內生性GS基因和部分或完全不活化之內生性DHODH基因的細胞，
(b2) 使該細胞中的內生性GS基因不活化，特言之藉由基因編輯法，例如藉由CRISPR-Cas法，例如藉由CRISPR-Cas9法，及
(c2) 在包括麩醯胺酸的培養基中，於適合產生其中內生性GS基因為部分或完全不活化之細胞株的條件下培養該細胞。
又在一替代的特定具體實例中，該細胞係藉由下列所製造：
(a3) 提供一包括內生性DHODH基因和部分或完全不活化之內生性GS基因的細胞，
(b3) 使該細胞中的內生性DHODH基因不活化，特言之藉由基因編輯法，例如藉由CRISPR-Cas法，例如藉由CRISPR-Cas9法，及
(c3) 在包括尿苷的培養基中，於適合產生其中內生性DHODH基因為部分或完全不活化之細胞株的條件下培養該細胞。
在一特定的具體實例中，一或多個或所有的內生性DHODH基因之等位基因為部分或完全不活化，及/或所有的內生性GS基因之等位基因為部分或完全不活化。
在另一具體實例中，該細胞株進一步係包括：
- 一表現載體，其包括編碼外生性哺乳動物DHODH之核苷酸序列(i)和至少一用於表現重組蛋白(I)之表現匣，其中該外生性DHODH係包括與SEQ ID NO: 2序列或與SEQ ID NO: 4序列至少60%相同的序列，及
- 一表現載體，其係包括編碼外生性哺乳動物GS之核苷酸序列(ii)和至少一用於表現重組蛋白(II)之表現匣，其中該外生性GS係包括與SEQ ID NO: 6序列或與SEQ ID NO: 8序列至少94.5%相同的序列。
在一其特定的具體實例中，該核苷酸序列(i)係包括SEQ ID NO: 1序列或 SEQ ID NO: 3序列。
在其另外特定的具體實例中，該核苷酸序列(ii)係包括SEQ ID NO: 5序列或 SEQ ID NO: 7序列。
在其另外特定的具體實例中，該重組蛋白(I)和(II)為單株抗體的不同臂。
又在其另外的特定具體實例中，該載體係分別包括一適用於選殖抗體輕鏈之第一表現匣，及一適用於選殖抗體重鏈之第二表現匣。
本發明另外的目標為包括下列之表現系統：
(A) 包括部分或完全不活化之內生性DHODH基因和部分或完全不活化之內生性GS基因的細胞株，如上所定義，
(B) 一表現載體，其係包括編碼哺乳動物DHODH之核苷酸序列(i)和至少一用於表現重組蛋白(I)之表現匣，其中該DHODH係包括與SEQ ID NO: 2序列或與SEQ ID NO: 4序列至少60%相同的序列，及
(C) 一表現載體，其係包括編碼哺乳動物GS之核苷酸序列(ii)和至少一用於表現重組蛋白(II)之表現匣，其中該GS係包括與SEQ ID NO: 6序列或與SEQ ID NO: 8序列至少94.5%相同的序列。
在一特定的具體實例中，該核苷酸序列(i)係包括SEQ ID NO: 1序列或SEQ ID NO: 3序列。
在另外特定的具體實例中，該核苷酸序列(ii)係包括SEQ ID NO: 5序列或 SEQ ID NO: 7序列。。
在另外特定的具體實例中，該重組蛋白(I)和(II)為單株抗體的不同臂。
又在一特定的具體實例中，該載體係分別包括一適用於選殖抗體輕鏈之第一表現匣，及一適用於選殖抗體重鏈之第二表現匣。
本發明進一步係關於一包括下列之套組：
- 如上所定義之細胞株或如上所定義之表現系統，及
- 缺乏尿苷和麩醯胺酸，進一步特言之缺乏DHODH抑制劑和GS抑制劑，之培養基。
本發明另外的目標係關於活體外生產重組蛋白之方法，該方法係包括下列步驟：
A) a1)提供一進一步包括下列之如上所定義的細胞株；
- 一表現載體，其係包括編碼外生性哺乳動物DHODH之核苷酸序列(i)和至少一用於表現重組蛋白(I)之表現匣，其中該外生性DHODH係包括與SEQ ID NO: 2序列或與SEQ ID NO: 4序列至少60%相同的序列，及
- 一表現載體，其係包括編碼外生性哺乳動物GS之核苷酸序列(ii)和至少一用於表現重組蛋白(II)之表現匣，其中該外生性GS係包括與SEQ ID NO: 6序列或與SEQ ID NO: 8序列至少94.5%相同的序列，
或
a2) 提供一如上所定義之細胞株，及
a2’) 將如上所定義之表現載體導入步驟a2)中所提供的細胞株內；
或
a3) 提供一包括內生性DHODH基因和內生性GS基因之細胞
a3’)使步驟a3)所提供之細胞株中的內生性DHODH基因和內生性GS基因部分或完全不活化，及
a3’’) 將如上所定義之表現載體導入步驟a3’)中所得到的包括部分或完全不活化之內生性DHODH基因和部分或完全不活化之內生性GS基因的細胞株；
或
a4) 提供一包括內生性GS基因和部分或完全不活化之內生性DHODH基因的細胞株，
a4’) 使步驟a4)所提供的細胞株中的內生性GS基因部分或完全不活化，及
a4’’) 將如上所定義之表現載體導入步驟a4’)中所得到的包括部分或完全不活化之內生性DHODH基因和部分或完全不活化之內生性GS基因的細胞株；
或
a5) 提供一包括內生性DHODH基因和部分或完全不活化之內生性GS基因的細胞，
a5’) 使步驟a5)所提供的細胞株中的內生性DHODH基因部分或完全不活化，及
a5’’) 將如上所定義之表現載體導入步驟a5’)中所得到的包括部分或完全不活化之內生性DHODH基因和部分或完全不活化之內生性GS基因的細胞株；
B) 於適合製造該重組蛋白之條件下培養該細胞株；及
C) 分離及/或純化該重組蛋白。
在一特定的具體實例中，該步驟B)係於缺乏尿苷和麩醯胺酸，進一步特言之，缺乏DHODH抑制劑和GS抑制劑的培養基中進行。
在另外特定的具體實例中，該方法進一步係包括一將該重組蛋白調配成醫藥組成物的步驟D)。
本發明進一步係關於如上所定義的細胞株、如上所定義的表現載體、或如上所定義的套組用於製造重組蛋白之用途。
在一特定的具體實例中，細胞株、表現載體或套組係與缺乏尿苷和麩醯胺酸，特言之無DHODH抑制劑和GS抑制劑，的培養基組合使用。
二氫乳清酸脫氫酶
如文中所用，術語「二氫乳清酸脫氫酶」或「DHODH」係指能催化二氫乳清酸(4,5-二氫乳清酸或2,6-二側氧-1,3-二𠯤烷-4-羧酸)轉變成乳清酸(乳清酸或1,2,3,6-四氫-2,6-二側氧-4-嘧啶羧酸)的多肽，如以下列反應表示：
(S)- 二氫乳清酸 + O
2↔乳清酸 + H
2O
2
此一多肽係歸類在Enzyme Commission (EC)編號1.3.3.1下。能催化上述反應之多肽係具有「DHODH活性」。
上述反應為重頭開始合成DNA和RNA合成所需之尿苷單磷酸(rUMP)的第四步驟。抑制或使DHODH不活化因此具有抑制DNA和RNA合成的效應且因而抑制細胞增生。
麩醯胺酸合成酶
如文中所用，術語「麩醯胺酸合成酶」或「GS」係指能催化麩胺酸和氨縮合形成麩醯胺酸之多肽，如以下列生化反應表示：
ATP + L-麩胺酸 + NH3 ↔ ADP + 磷酸+ L-麩醯胺酸
此一多肽係歸類在Enzyme Commission (EC)編號6.3.1.2下。能催化上述反應的多肽係具有「GS活性」。
細胞株
本發明係關於包括部分或完全不活化之內生性二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)基因和部分或完全不活化之內生性麩醯胺酸合成酶(GS)基因的細胞株。
此細胞株為一真核細胞株，例如哺乳動物細胞株，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株，猴子細胞株或人類細胞株。
在一特定的具體實例中，此細胞株為CHO細胞株。
CHO細胞株一般係用於工業蛋白生產，且許多CHO細胞株已為熟習本項技術者所知。例如，此等CHO細胞株係包括可從美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)公開取得的品系，例如CHO-K1細胞株(ATCC編號：CCL-61)，CHO-S細胞株(例如由 Invitrogen和Gibco所銷售)，CHO DP-12細胞株(ATCC編號CRL-12444和12445)和CHO 1-15細胞株(ATCC編號CRL-9606)。適合工業蛋白生產的另外細胞株為CHO 9E4細胞株。9E4細胞株係從CHO-K1細胞株的選植株經由單一細胞選殖過程所建立。9E4細胞株的建立係更深入顯示於
實例 1中。CHO-K1細胞株係由Puck於1957年所獲得並存放於ATCC編號CCL-61。
人類細胞例如HEK293(ATCC編號CRL-1573)、HKB11(ATCC編號CRL-12568)、PER-C6(Crucell)、HT1080(ATCC編號CRL-121)、Jurkat、Daudi、Raji和CAP(ATCC編號CRL-1098)細胞亦可用於蛋白生產，用以得到天然糖基化模式之重組人類蛋白。
在一具體實例中，此細胞株能生長於無血清培養基(例如，化學定義培養基)及/或懸浮液中。此一細胞株可由習知技術者藉由讓親代細胞株適應生長在無血清培養基及/或懸浮液中，容易獲得(例如經由單一細胞選殖，經由漸進性適應及/或經由「飢餓和留存」過程)。
本發明之細胞株為包括部分或完全不活化之內生性二氫乳清酸脫氫酶 (DHODH)基因和部分或完全不活化之內生性麩醯胺酸合成酶(GS)基因的細胞株。
「內生性DHODH基因」在文中係指於特定環境條件下在特定發育階段正常存在該特定細胞內的DHODH基因。
「內生性DHODH基因」與下文定義之「外生性DHODH」的區別係在於該外生性DHODH係由下文定義的表現載體所提供，若該表現載體已導入該細胞株中，則其可能存在本發明之細胞株內。
如習知技術者所了解，內生性DHODH基因將依細胞株而定。例如，在CHO細胞株中，內生性DHODH基因為中國倉鼠 DHODH基因；在人類細胞株，此內生性DHODH基因為人類DHODH基因。
典型地，野生型中國倉鼠DHODH係指包括或由SEQ ID NO: 2所組成的序列，以及具有DHODH活性的其變體。此等變體可例如相當於天然發生在倉鼠物種中的變體(例如等位基因變體或剪接變體)。
典型地，野生型人類DHODH係指包括或由SEQ ID NO: 4所組成的序列，以及具有DHODH活性的其變體。此等變體可例如相當於天然發生在人類中的變體(例如等位基因變體或剪接變體)。
「內生性GS基因」在文中係指於特定環境條件下在特定發育階段正常存在該特定細胞內的GS基因。
「內生性GS基因」與下文定義之「外生性GS」的區別係在於該外生性GS係由下文定義的表現載體所提供，若該表現載體已導入該細胞株中，則其可能存在本發明之細胞株內。
如熟習技術者所了解，內生性GS基因將依細胞株而定。例如，在CHO細胞株中，內生性GS基因為中國倉鼠GS基因；在人類細胞株，此內生性GS基因為人類GS基因。
典型地，野生型中國倉鼠GS係指包括或由SEQ ID NO: 9所組成的序列，以及具有GS活性的其變體。此等變體可例如相當於天然發生在倉鼠物種中的變體(例如等位基因變體或剪接變體)。
典型地，野生型人類GS係指包括或由SEQ ID NO: 6所組成的序列，以及具有GS活性的其變體。此等變體可例如相當於天然發生在人類中的變體(例如等位基因變體或剪接變體)。
如文中所用，「基因」係包括編碼一基因產物的DNA區，以及調節此基因產物生產的DNA區，無論此等調節序列是否與編碼及/或轉錄序列相鄰。因此，基因係包括啟動子序列、終止子、轉譯調節序列例如核糖體結合位點和內部核糖體進入位點、增強子、靜默子、絕緣子、邊界元件、複製起點、基質附著部位和基因座控制區。
基因「不活化」係指相較於對應的野生型細胞，基因表現下降。基因不活化可為完全的(完全不活化或基因剔除)或部分的(例如，其中基因展現低於正常表現量之亞效等位基因(hypomorph)，或顯現活性部分下降之突變基因的產物)。
在一特定的具體實例中，一或多個或所有內生性DHODH基因的等位基因為部分或完全不活化。
在一特定的具體實例中，該內生性DHODH基因為完全不活化的。
在一更特定的具體實例中，一或多個或所有內生性DHODH基因的等位基因為完全不活化的。
在另外特定的具體實例中，一或多個或所有內生性GS基因的等位基因為部分或完全不活化。
在一特定的具體實例中，該內生性GS基因為完全不活化的。
在一更特定的具體實例中，一或多個或所有內生性GS基因的等位基因為完全不活化的。
又在一特定的具體實例中，一或多個或所有內生性DHODH基因的等位基因和所有的內生性GS基因的等位基因為完全不活化的。
在一特定的具體實例中，該內生性DHODH基因及/或內生性GS基因係使用如Aga
et al.(2015)
BMC Proceedings 9(suppl 9):P2中所述的CRISPR-Cas9法，使其不活化。
如習知技術者所熟知的，CRISPR-Cas9系統為一原核生物適應性免疫反應系統，其係使用非編碼RNA引導Cas9核酸酶誘發位點專一性DNA裂解。此DNA損傷係藉由細胞DNA修復機制，經由非同源性末端接合DNA修復路徑(NHEJ)或同源性定向修復(HDR)路徑來修復。單一的嚮導RNA(gRNA)，其係由對此DNA標靶具專一性之crRNA序列，及與Cas9蛋白相互作用的tracrRNA序列所組成，與具有DNA核酸內切酶活性的重組形式Cas9蛋白結合，製造基因破壞。所生成的複合物將造成標靶專一性雙股DNA裂解。此裂解位點將藉由非同源性末端接合(NHEJ)DNA修復路徑來修復，一種可能造成破壞基因功能的插入/刪除(INDEL)之易出錯過程。
在一特定的具體實例中，係以至少一DHODH基因的外顯子為標靶進行不活化，特言之藉由基因編輯法，例如CRISPR-Cas9法。在一更特定的具體實例中，係以編碼DHODH蛋白N-端部分的DHODH基因部分為標靶進行不活化，特言之藉由基因編輯法，例如CRISPR-Cas9法。又在另外的具體實例中，係以DHODH基因的第二外顯子為標靶進行不活化，特言之藉由基因編輯法，例如CRISPR-Cas9法。
在一具體實例中，係將20個核苷酸序列GGATGCAGCCATCATCCTTG (SEQ ID NO: 10)序列或與剔除DHODH基因相容的任何序列在無損害CHO存活下，用作為產生gRNA的對應DNA片段，其係以DHODH基因的第二外顯子為標靶。此gRNA典型地係使用寡核苷酸序列GGATGCAGCCATCATCCTTGGTTTT (SEQ ID NO: 11)和CAAGGATGATGGCTGCATCCCGGTG (SEQ ID NO: 12)所獲得，典型地於質體的獨特限制位點選殖，例如pCM3561質體的
Bael位點(Invitrogen所販售)，使得選殖的DNA序列係在U6啟動子的控制下，且一旦該質體導入細胞，則轉錄成含有crRNA與tracrRNA融合的單一轉錄單元，該crRNA部分對DHODH基因的第二外顯子具專一性且該 tracrRNA部分可被Cas9酵素辨識。
在另外特定的具體實例中，係以至少一GS基因的外顯子為標靶進行不活化，特言之藉由基因編輯法，例如CRISPR-Cas9法。在一更特定的具體實例中，係以GS基因的第6外顯子為標靶進行不活化，特言之藉由基因編輯法，例如CRISPR-Cas9法。又在另外的具體實例中，係以GS基因的第6外顯子附近為標靶進行不活化，特言之藉由基因編輯法，例如CRISPR-Cas9法。
在一具體實例中，係將18個核苷酸序列GAGTATGTGAAGACTTTG (SEQ ID NO: 29)序列或與剔除GS基因相容的任何序列在無損害CHO存活下，用作為產生gRNA的對應DNA片，其係以GS基因的第6外顯子為標靶。在另外的實例中，係將核苷酸序列CCATCTTTATTCTCATGGGG (SEQ ID NO: 30)序列或與剔除GS基因相容的任何序列在無損害CHO存活下，用作為產生gRNA的對應DNA片段，其係以GS基因的第6外顯子附近為標靶。
為了鑑別DHODH基和GS基因不活化的細胞株，典型地係藉由限制稀釋於多孔盤中分離單一細胞，及，在達到適當的滿度，例如90%滿度後，將細胞分成至少2種條件，例如一種係在添加尿苷和麩醯胺酸的培養基中，另一種則在缺乏尿苷和麩醯胺酸的培養基中。感興趣選植株典型地為對缺乏尿苷和麩醯胺酸敏感的選殖株。
一旦分離後，可將這些感興趣細胞以包括嘧啶基的培養基培養，特言之包括尿苷和進一步包括麩醯胺酸的培養基。
「嘧啶基」在文中係指嘧啶本身和具有嘧啶核作為骨架之各種嘧啶衍生物。此等嘧啶基之實例包括尿嘧啶核酸相關的物質，例如尿嘧啶、尿苷、尿苷磷酸鹽，尤其是尿苷單磷酸(UMP)、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷三磷酸(UTP)、去氧尿苷、去氧尿苷磷酸鹽，尤其是去氧尿苷單磷酸(dUMP)，去氧尿苷二磷酸(dUDP)、和去氧尿苷三磷酸(dUTP)；胞嘧啶核酸相關的物質，例如胞嘧啶、胞苷、胞苷磷酸鹽，尤其是胞苷單磷酸(CMP)、胞苷二磷酸(CDP)、胞苷三磷酸(CTP)、去氧胞苷、2’-去氧胞苷、去氧胞苷單磷酸，尤其是去氧胞苷單磷酸(dCMP)、去氧胞苷二磷酸(dCDP)和去氧胞苷三磷酸(dCTP)；胸嘧啶、胸苷、胸苷磷酸鹽，尤其是胸苷單磷酸(TMP)、胸苷二磷酸(TDP)和胸苷三磷酸(TTP)去氧胸嘧啶、去氧胸苷、去氧胸苷磷酸鹽，尤其是去氧胸苷單磷酸(dTMP)、去氧胸苷二磷酸(dTDP)和去氧胸苷三磷酸(dTTP)及乳清酸。
在一特定的具體實例中，該嘧啶基為尿苷。
「尿苷」在文中係指下式之核苷。
「麩醯胺酸」在文中係指下式之胺基酸。
「缺乏尿苷的培養基」係指適合生長特定細胞株之任何基礎培養，其中該培養基係包括低於1 mM的尿苷，特言之該培養基不包括任何尿苷。
「缺乏麩醯胺酸的培養基」係指適合生長特定細胞株之任何基礎培養，其中該培養基係包括低於1 mM的麩醯胺酸，特言之該培養基不包括任何麩醯胺酸。
「缺乏尿苷和麩醯胺酸的培養基」在文中係指適合生長特定細胞株之任何基礎培養基，其中該培養基係包括低於1 mM的尿苷和低於1 mM的麩醯胺酸，特言之該培養基不包括任何尿苷以及麩醯胺酸。
「包括尿苷的培養基」係指適合生長特定細胞株之任何基礎培養，其中該培養基進一步係包括1 mM至25 mM的尿苷，特言之5 mM至10 mM的尿苷。
「包括麩醯胺酸的培養基」係指適合生長特定細胞株之任何基礎培養，其中該培養基進一步係包括1 mM至25 mM的麩醯胺酸，特言之4 mM至6 mM的麩醯胺酸。
「包括尿苷和麩醯胺酸的培養基」係指適合生長特定細胞株之任何基礎培養，其中該培養基係包括1 mM至25 mM的尿苷，特言之5 mM至10 mM的尿苷，以及1 mM至25 mM的麩醯胺酸，特言之4 mM至6 mM的麩醯胺酸。
「基礎培養基」在文中係指適合暴露予細胞，例如CHO細胞之未添加培養基。如習知技術者所了解，所用的基礎培養基將依照所用的細胞類型而定。基礎培養基的實例包括CDCHO培養基、OPTiCHO
TM培養基、Fecto CHO
TM培養基、FortiCHO
TM培養基、ExpiCHO
TM培養基、Ex-Cell
TM培養基、ActiPRO
TM培養基、MAM PF77
TM培養基和PowerCHO
TM培養基。
因此，在一特定的具體實例中，本發明之細胞株係藉由下列所製造：
(a1) 使包括內生性DHODH基因和內生性GS基因之細胞中的內生性DHODH基因不活化，
(b1) 於包括尿苷的培養基中，於適合生產其中內生性DHODH基因為部分或完全不活化之細胞株的條件下，培養該細胞，
(c1) 回收該其中內生性DHODH基因部分或完全不活化之細胞，
(d1) 使該細胞中的內生性GS基因不活化，及
(e1) 於包括麩醯胺酸的培養基中，於適合生產其中內生性GS基因為部分或完全不活化之細胞株的條件下，培養該細胞。
在一替代的具體實例中，本發明之細胞株係藉由下列所製造：
(a2) 提供一包括內生性GS基因和部分或完全不活化之內生性DHODH基因的細胞，
(b2) 使該細胞中的內生性GS基因不活化，及
(c2) 於包括麩醯胺酸的培養基中，於適合生產其中內生性GS基因為部分或完全不活化之細胞株的條件下，培養該細胞。
又在一替代的具體實例中，本發明之細胞株係藉由下列所製造：
(a3) 提供一包括內生性DHODH基因和部分或完全不活化之內生性GS基因的細胞 ，
(b3) 使該細胞中內生性DHODH基因不活化，及
(c3) 於包括尿苷的培養基中，於適合生產其中內生性DHODH基因為部分或完全不活化之細胞株的條件下，培養該細胞。
藉由CRISPR-Cas9法製造包括完全或部分不活化之內生性DHODH基因的CHO細胞株更深入係以
實例 2作為例示。
藉由CRISPR-Cas9法製造包括完全或部分不活化之內生性DHODH基因及進一步包括完全或部分不活化之內生性GS基因的CHO細胞株，係以
實例 3作為例示。
生產包括完全或部分不活化的內生性DHODH基因和完全或部分不活化的內生性GS基因之細胞株，例如CHO細胞株，可藉由本領域中已知的各種其他分子生物技術法來產生。例如，可用於生產具有完全或部分不活化的內生性DHODH基因及完全或部分不活化的內生性GS基因之細胞株的其他基因編輯技術係包括使用鋅指核酸酶(ZFN)或類轉錄因子效應子核酸酶(TALEN)。亦可使用Cre/Lox法來剔除一或多個或所有DHODH基因和GS基因的等位基因。
在一特定的具體實例中，本發明之細胞株進一步係包括如下文「
表現載體」章節中所定義的表現載體。
該表現載體可藉由習知技術者熟知的適合技術導入細胞株中，例如藉由轉染，尤其是藉由電穿孔或化學轉染或轉導。
外生性 DHODH 和外生性 GS
用於本發明的表現載體所編碼的DHODH(另外稱為「外生性DHODH」)可包括或由與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4至少60%、62%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%; 92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.5%或100%相同的序列所組成。其亦可包括或由SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的100個、150個、200個、250個、300個或350個連續胺基酸之片段所組成，其限制條件為該蛋白係保留DHODH活性。
在某些具體實例中，根據本發明之外生性DHODH係包括或由與SEQ ID NO: 2序列和SEQ ID NO: 4序列至少60%、62%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%; 93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.5%或100%相同的序列所組成。
在某些具體實例中，根據本發明之外生性DHODH為一人類DHODH，亦即人類來源的DHODH。
如文中所用，術語「人類DHODH」係指包括或由SEQ ID NO: 4所組成之序列，以及具有DHODH活性之其變體。此等變體可例如相當於天然發生在人類中的變體(例如等位基因變體或剪接變體)。另一種選擇，此等變體可相當於由基因工程所得到的變體。在一具體實例中，相較於SEQ ID NO: 4，此等變體與SEQ ID NO: 4 的差異僅在於最多有150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸變異存在(該變異包括取代、插入和刪除)。
在一特定的具體實例中，該人類DHODH，相較於野生型序列，為一包括G202A突變的變體，典型地包括或由SEQ ID NO: 28胺基酸序列所組成。
在某些具體實例中，該外生性DHODH為一倉鼠DHODH，亦即倉鼠來源的DHODH。該倉鼠DHODH可為，例如，中國倉鼠(Cetulus griseus) DHODH。
如文中所用，術語「中國倉鼠DHODH」係指係包括或由SEQ ID NO: 2所組成的序列，以及具有DHODH活性之其變體。此等變體可例如相當於天然發生在倉鼠物種中的變體(例如等位基因變體或剪接變體)。另一種選擇，此等變體可相當於由基因工程所得到的變體。在一具體實例中，相較於SEQ ID NO: 2，此等變體與SEQ ID NO: 2的差異僅在於最多有150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸變異存在(該變異包括取代、插入和刪除)。
在另外的具體實例中，該變體DHODH應具有DHODH活性，視需要與野生型蛋白具有相同程度的活性，或野生型蛋白之50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%或更高程度的活性。
由其他用於本發明之表現載體所編碼的GS(另外稱為「外生性GS」)可包括或由與SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 8至少其中之一至少94.5%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.5%或100%相同的序列所組成。其亦可包括或由SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 8之至少100、150、200、250、300或350個連續胺基酸的片段所組成，其限制條件為該蛋白係保留GS活性。
在一特定的具體實例中，根據本發明之外生性GS係包括或由與SEQ ID NO: 6序列或SEQ ID NO: 8序列至少94.5 %、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.5%或100%相同的序列所組成。
在一特定的具體實例中，根據本發明之外生性GS係包括或由與SEQ ID NO: 6序列至少97.5%、98%、98.5%、99%、99.5%或100%相同的序列所組成。如國際申請案WO2013/186371中所示，此一GS就用作為CHO細胞，尤其是E94 CHO細胞株中的可選擇標記為特別有利的。
在一特定的具體實例中，根據本發明之外生性GS為人類GS，亦即人類來源之GS。如文中所用，術語「人類GS」係指包括或由SEQ ID NO: 6所組成的序列，以及具有GS活性之其變體。此等變體可例如相當於天然發生在人類中的變體(例如等位基因變體或剪接變體)。另一種選擇，此等變體可相當於由基因工程所得到的變體。最佳地，相較於SEQ ID NO: 6，此等變體與SEQ ID NO: 6的差異僅在於最多有22、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸變異存在(該變異包括取代、插入和刪除)。
在另外特定的具體實例中，根據本發明之外生性GS為狗GS，亦即狗來源之GS。如文中所用，術語「狗GS」係指包括或由SEQ ID NO: 8所組成之序列，以及具有GS活性之其變體。此等變體可例如相當於天然發生在狗物種中的變體(例如等位基因變體或剪接變體)。可替代地，此等變體可相當於由基因工程所得到的變體。最佳地，相較於SEQ ID NO: 8，此等變體與SEQ ID NO: 8的差異僅在於最多有22、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸變異存在(該變異包括取代、插入和刪除)。
在一特定的具體實例中，根據本發明之外生性GS係包括至少1、2、3、4、5、6、10、15、16、20或22個下列胺基酸：12G、16V、18M、19S、33l、49S、80V、82A、91K、116T、191A、269Y、282Q、35OS、355L、356l、2T、68L、98L、107R、169R和2138，其中該編號係表示在SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 8上的位置，而字母為胺基酸種類(使用單字母基因碼)。在一更特定的具體實例中，根據本發明之外生性GS係包括至少1、2、3、4、5或6個下列胺基酸：2T、68L、98L、107R、169R和2138。在另外更特定具體實例中，根據本發明之外生性GS係包括至少1、2、3、4、5、6、10、15或16個下列胺基酸：12G、16V、18M、19S、33l、49S、80V、82A、91K、116T、191A、269Y、282Q、35OS、355L和356I。相較於CHO GS，上述胺基酸顯示對人類及/或狗GS具專一性。
具有與本發明之查詢胺基酸序列，例如至少95%「相同」之胺基酸序列的多肽，其意圖係除了主題多肽序列在每100個查詢胺基酸序列的胺基酸中可能包括至高5個胺基酸改變之外，主題多肽的胺基酸序列係與該查詢序列為相同的。換言之，得到具有與查詢胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列之多肽，在主題序列中至高5%(100個中有5個)的胺基酸殘基可經插入、刪除或以另外的胺基酸取代。
序列同一性可於整個全長的變體序列，全長的參照序列或二者上測定。例如，同一性百分比可使用全局比對(亦即，於其整體長度上比較二條序列)。比較二條或更多條序列之同一性和同源性的方法已為本領域習知。當考量其整體長度時，「needle程式」，其係使用Needleman-Wunsch全局比對演算法(Needleman and Wunsch (1970)
J. Mol. Biol. 48:443-453)，找出二條序列的最佳比對(包括缺位)，例如當進行全局比對時可使用。此needle程式例如可從全球資訊網網址ebi.ac.uk取得。依照本發明之同一性百分比，較佳地係使用EMBOSS::needle (全局)程式以「缺位開放」參數等於10.0，「缺位延伸」參數等於0.5，及Blosum62矩陣來計算。
相較於參照序列，參照序列的變體可包括突變，例如刪除、插入及/或取代。就取代的情況，此取代較佳地係對應如下表中所指的保守性取代。
表現載體
| 保守性取代 | 胺基酸類型 |
| Ala, Val, Leu, Ile, Met, Pro, Phe, Trp | 帶有脂肪系疏水性側鏈的胺基酸 |
| Ser, Tyr, Asn, Gln, Cys | 帶有不帶電但極性側鏈的胺基酸 |
| Asp, Glu | 帶有酸性側鏈的胺基酸 |
| Lys, Arg, His | 帶有鹼性側鏈的胺基酸 |
| Gly | 中性側鏈 |
用於本發明內文中的表現載體係適用於生產重組蛋白，並包括編碼二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)之序列或編碼麩醯胺酸合成酶(GS)之序列。
表現載體較佳地為DNA載體。
用於本發明內文中的一表現載體係包括編碼如上文「
外生性 DHODH 和外生性 GS」章節中所定義的外生性DHODH之序列(i)。
在一特定的具體實例中，導入表現載體的細胞株為一CHO細胞株，而外生性DHODH為異源性來源(亦即，外生性DHODH並非倉鼠DHODH)。
編碼此一外生性DHODH的序列可為天然生成的核苷酸序列。可替代地，編碼此一DHODH序列的三聯體密碼子就CHO細胞中的表現可能偏差。用於找出偏差序列以便得到最佳表現之軟體和演算法已為本領域所知，並包括，例如Raab
et al.(2010)
Syst Synth Biol. 4:215-225中所述的演算法。此演算法不僅提供最佳可取得的表現密碼子，亦考量GC含量以及沒有不需要的DNA模組。
例如，編碼外生性DHODH的序列可包括或由與SEQ ID NO: 3序列(亦即，編碼SEQ ID NO: 4之人類DHODH的序列，其係經設計供CHO細胞中的最佳表現)，及/或與SEQ ID NO: 1序列(亦即，編碼SEQ ID NO: 2之倉鼠DHODH的序列，其係經設計供CHO細胞中的最佳表現)至少 60%、62%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的序列所組成。
在一具體實例中，編碼該外生性DHODH的序列係包括或由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3序列所組成。
用於本發明內文中的其他表現載體係包括編碼如上文「
外生性 DHODH 和外生性 GS」章節中所定義的外生性GS之序列(ii)。
在一特定的具體實例中，導入表現載體的細胞株為一CHO細胞株，而外生性GS為異源性來源(亦即，外生性GS並非倉鼠GS)。
編碼此一外生性GS的序列可為天然生成的核苷酸序列。可替代地，編碼此一GS之序列的三聯體密碼子就CHO細胞中的表現可能偏差。用於找出偏差序列以便得到最佳表現的軟體和演算法已為本項技術所知，並包括，例如Raab
et al.(2010)
Syst Synth Biol. 4:215-225中所述的演算法。此演算法不僅提供最佳可取得的表現密碼子，亦考量GC含量以及沒有不需要的DNA模組。
例如，編碼外生性GS的序列可包括或由與SEQ ID NO: 5序列(亦即，編碼SEQ ID NO: 6之人類GS的序列，其係經設計供CHO細胞中的最佳表現)，及/或與SEQ ID NO: 7序列(亦即，編碼SEQ ID NO: 8之狗GS的序列，其係經設計供CHO細胞中的最佳表現)至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的序列所組成。
在一具體實例中，此編碼GS的序列係包括或由SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7之序列所組成。
在用於本發明內文的表現載體中，編碼如上所定義之外生性DHODH的序列及/編碼如上所定義之外生性GS的序列可置於任何習知技術者已知的啟動子控制下。
例如，編碼如上所定義之外生性DHODH的序列及/或編碼如上所定義之外生性GS的序列可例如置於適合個別驅動DHODH和GS表現之啟動子的控制下，例如猿猴空泡病毒40 (SV40)啟動子(例如，SV40的晚期或早期啟動子)、CMV啟動子、延伸因子1啟動子、GAPDH啟動子、RPL37 啟動子、肌動蛋白P啟動子。早期SV40啟動子例如係描述於Benoist和 Chambon (1981)
Nature 290:304-310及Moreau
et al.(1981)
Nucleic Acids Res. 9:6047-6068中。特言之，該SV40啟動子為全長啟動子。該SV40啟動子亦可具有一包含72 bp重複單元的複製起點。
在某些具體實例中，該SV40啟動子並非其中已移除位置128至270之SV40啟動子，亦即該SV40啟動子並非韓國專利第10-0267720號中所述的SV40啟動子及1997年12月17日存放在Gene Bank, Institute of Bioengineering, KIST中存放編號： KCTC 8860 P的轉型大腸桿菌(
E. coli)轉型株。
在其他的具體實例中，編碼如上所定義之外生性DHODH的序列及/或編碼如上所定義之外生性GS的序列並非置於SV40啟動子的控制下。
適合生產重組蛋白的表現載體已為本領域技術者所知。此等載體典型地係相當於包括一複製起點及至少一表現匣而得以選殖和表現該生產所欲重組蛋白之表現載體。表現匣典型地係包括一5’非轉譯區(包括或由啟動子及視需要增強子序列所組成)、一或更多個得以選殖編碼該重組蛋白之序列的限制位點、3'非轉譯區(例如polyA訊號)、及視需要一或多個內含子。啟動子序列可相當於任何本領域中習知的強力啟動子，例如，舉例而言，人類CMV啟動子。視需要，用於本發明內文中的表現載體係包括一原核生物的複製起點(例如，原核生物複製子，例如大腸桿菌中的ColE1)和至少一原核生物-選擇性標記基因，亦稱為原核生物可選擇標記，使得載體得以於原核細胞中複製。複製此載體的細胞亦表現原核生物-選擇性標記基因，且因此可經鑑別和選擇。原核生物-選擇性標記基因已為本領域所習知。原核生物-選擇性標記基因之實例有例如編碼一賦予抗生素阻抗性之蛋白的核酸序列(例如編碼一賦予抗安比西林(ampicillin)、氯黴素(chloramphenicol)、滅瘟素(blasticidin)或卡那黴素(kanamycin)阻抗性之蛋白的序列)。
可藉由本發明載體表現的重組蛋白(I)和(II)可相當於習知技術者感興趣的任何蛋白。
如文中所用，術語「蛋白」係指涵蓋胜肽(亦即低於50個胺基酸的胺基酸鏈)、多肽(亦即至少50個胺基酸的胺基酸鏈)、單體蛋白(亦即由一條胺基酸鏈所組成的蛋白)及多聚體蛋白(亦即由2條或更多條胺基酸鏈所組成的蛋白，例如，如單株抗體)。
用於本發明內文中的表現載體典型地係包括許多與構成該蛋白之不同胺基酸鏈數目相同的表現匣(例如，就單體蛋白或同二聚體蛋白的情況為1個表現匣，就異二聚體蛋白或單株抗體之情況為2個，等等)。
可替代地，用於本發明內文中的表現載體可僅包括1個表現匣，即使在希望生產異二聚體蛋白或單株抗體時。在此一情況下，編碼此蛋白之另一胺基酸鏈的序列係存在本發明的另一個表現載體中。
在特定的具體實例中，重組蛋白(I)和(II)為單株抗體之不同臂。
因此，在某些具體實例中，一用於本發明內文中的表現載體係包括：
- 一如上所定義之編碼外生性DHODH的序列，其係置於早期SV40啟動子的控制下；
- 一第一表現匣，其中編碼抗體第一臂之輕鏈的序列係置於CMV啟動子的控制下；
- 一第二表現匣，其中編碼該抗體第一臂之重鏈的序列係置於CMV啟動子的控制下；
- 一原核生物的複製起點；及
- 一用於原核細胞的可選擇標記，亦即編碼賦予安比西林阻抗性之蛋白的序列，其係置於其天然啟動子的控制下。
在該具體實例中，另一用於本發明內文中的表現載體係包括：
- 一如上所定義之編碼外生性GS的序列，其係置於早期SV40啟動子的控制下；
- 一第二表現匣，其中編碼該抗體第二臂之輕鏈的序列係置於CMV啟動子的控制下；
- 一第二表現匣，其中編碼該抗體第二臂之重鏈的序列係置於CMV啟動子的控制下；
- 一原核生物的複製起點；及
- 一用於原核細胞的可選擇標記，亦即編碼賦予安比西林阻抗性之蛋白的序列，其係置於其天然啟動子的控制下。
在整個說明書中，術語「重組蛋白」係指任何其生產為所希望的重組蛋白。其可例如相當於治療及/或預防蛋白，亦即希望用作為醫藥品之蛋白(包括疫苗)。在一特定的具體實例中，就其生產為所希望的重組蛋白並非DHODH亦非GS。在另外特定的具體實例中，就其生產為所希望的重組蛋白為抗體，例如，單株抗體。又在另外的特定具體實例中，就其生產為所希望的重組蛋白為抗原蛋白。
術語「抗體」係以最廣義用於文中且具體而言係涵蓋任何同功型之單株抗體(包括全長單株抗體)，例如lgG、lgM、lgA、lgD、和lgE、多株抗體、多專一性抗體(包括雙專一性和三專一性抗體)、抗體片段(例如，如Fv、scFv、ds、Fab、Fab’、或F(ab’)
2片段)、單區抗體及其片段、和包括抗體片段之融合蛋白。與專一性抗原反應的抗體可藉由重組的方法產生，例如噬菌體或類似載體中重組抗體庫之選擇，或藉由以抗原或抗原編碼核酸使一動物免疫。
「單株抗體」，如文中所用，為從實質上均質的抗體群族中所得到的抗體，亦即除了可能存在的小量可能天然生成突變之外，形成此群族之抗體基本上為相同的。這些抗體係針對單一表位(或就多專一性抗體的情況為單一群組的表位)且因此具高專一性。
一典型的單株抗體係包括藉由雙硫鍵連結的二條相同重鏈和二條相同輕鏈所組成。各重鏈和輕鏈含有一恆定區和一可變區。各可變區含有三個稱為「互補決定區」(「CDR」)或「高變區」的部分，其主要係負責結合抗原的表位。其通常係稱為CDR1、CDR2和CDR3，從N-端依序編號(參見，Kabat
et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, National Institute of Health, Bethesda, MD, 1991)。可變區之更高保守性部分係稱為「框架區」。
單株抗體可例如為鼠科抗體、嵌合抗體、人源化抗體或全長人類抗體。
單株抗體可為雙專一性或三專一性。
當就其生產為所希望的重組蛋白為單株抗體時，根據本發明之表現載體可包括適合選殖抗體輕鏈之第一表現匣，和適合選殖抗體重鏈之第二表現匣。
在一特定的具體實例中，該第一和第二表現匣各自係包括巨細胞病毒(CMV)啟動子，例如來自人類或鼠科CMV之CMV啟動子。更特言之，該第一和第二表現匣可包括：
- 一CMV立即早期增強子啟動子(例如，具有Teschendorf
et al.(2002)
Anticancer Res. 22:3325-3330中所述之序列者)；或
- 一來自小鼠CMV之IE2啟動子/增強子區(例如，具有Chatellard
et al.(2007)
Biotechnol Bioeng. 96:106-117中所述之序列者)；或
- 一hCMV-MIE調節元件(例如，具有WO 89/01036中所述之序列者)。
術語「抗原蛋白」係以最廣義用於文中並涵蓋任何能單獨或與佐劑組合產生免疫反應之蛋白。其可能希望用於預防性疫苗或治療性疫苗。在特定的具體實例中，此抗原蛋白為疫苗蛋白，亦即希望用於預防性疫苗的蛋白。
表現載體可包括至少一編碼該感興趣重組蛋白之序列(例如一編碼單體蛋白之序列，一編碼抗體鏈之序列，或分別編碼抗體輕鏈和重鏈之二條序列)，或其可能不含有這些序列(亦即缺乏此一編碼感興趣重組蛋白之序列)。
表現系統、套組、方法和用途
本發明係提供包括下列之表現系統：
(A) 如上文「
細胞株」章節中所定義之細胞株，其係包括如上文「
細胞株」章節中所定義之部分或完全不活化的內生性DHODH基因和部分或完全不活化的內生性GS基因，
(B) 一表現載體，其係包括編碼一哺乳動物DHODH的核苷酸序列(i)和至少一用於表現重組蛋白(I)之表現匣，其中該DHODH，如上文「
表現載體」章節中所定義，係包括與SEQ ID NO: 2序列或與SEQ ID NO: 4序列至少60%相同的序列，及
(C) 一表現載體，其係包括編碼一哺乳動物GS之核苷酸序列(ii)和至少一用於表現重組蛋白(II)之表現匣，其中該GS，如上文「
表現載體」章節中所定義，係包括與SEQ ID NO: 6序列或與SEQ ID NO: 8序列至少94.5%相同的序列。
本發明係提供一套組，該套組係包括(i)包含如上文「
表現載體」章節中所定義之表現載體的根據本發明細胞株，或根據本發明之表現系統，及(ii)如上所定義之缺乏尿苷和麩醯胺酸的培養基。
此套組可包括如上所定義之外生性DHODH-編碼表現載體及/或外生性GS-編碼表現載體(在表現系統中)。在此一套組中，載體較佳的為空白的，因為此項能讓習知技術者得以選殖感興趣蛋白。此外，表現載體較佳地係與此一套組的細胞株隔離。
此套組進一步係包括如上文「
細胞株」章節中所定義之缺乏尿苷和麩醯胺酸的培養基。
此套組進一步係包括適合培養該細胞株的培養基，適合將載體轉染至細胞株的培養基，包裝物質及/或此表現系統之使用說明。
在一特定的具體實例中，此套組係缺乏DHODH抑制劑及/或GS抑制劑。
DHODH抑制劑的實例包括雙辛可寧酸(bicinchoninic acid)、布喹那(brequinar)(6-氟-2-(2'-氟-1,1’-聯苯-4-基)-3-甲基-4-喹啉羧酸)、萘醌衍生物，例如二氯烯烯丙基指甲花醌、㗁唑衍生物，例如來氟米特(5-甲基-
N-[4-(三氟甲基)[苯基]-異㗁唑-4-甲醯胺)及其活性代謝物特立氟胺((2Z)-2-氰基-3-羥基-N-[4-(三氟甲基)苯基]丁-2-烯醯胺)、喹諾酮羧酸、萘醌、苯氧基喹啉、redoxal及衍生物，指甲花醌(lawsone)、拉帕醇(lapachol)、阿托奎酮(atovaquone)及(8-氯-4-(2-氯-4-氟-苯氧基)喹啉)。DHODH之抑制劑能抑制至少20、30、40、50、60、70、80、90、95、99或100%的DHODH活性。
在一特定的具體實例中，此套組並無特立氟胺。
GS抑制劑之實例包括甲硫胺酸磺醯亞胺、甲硫胺酸碸、草銨膦(phosphinothricin)、菸草毒素-β-內醯胺(tabtoxinine-β-lactam)、α-甲基甲硫胺酸磺醯亞胺、α-乙基甲硫胺酸磺醯亞胺、乙硫胺酸磺醯亞胺、α-甲基乙硫胺酸磺醯亞胺、丙硫胺酸磺醯亞胺、α-甲基丙硫胺酸磺醯亞胺、γ-羥基草銨膦、γ-乙醯氧基草銨膦、α-甲基草銨膦、α-乙基草銨膦、環己烷草銨膦、環戊烷草銨膦、四氫呋喃草銨膦、s-膦醯甲基半胱胺酸、s-膦醯甲基半胱胺酸亞碸、s-膦醯甲基半胱胺酸碸、4-(膦醯乙醯基)-L-α-胺基丁酸酯、蘇-4-羥基-D-麩胺酸、蘇-4-氟-D,L-麩胺酸、赤-4-氟-D,L-麩胺酸、2-胺基-4-[(膦醯甲基)羥基氧膦基]丁酸、阿拉諾辛(alanosine)、2-胺基-4-膦醯基丁酸、2-胺基-2-甲基-4-膦醯基丁酸、4-胺基-4-膦醯基丁酸、4-胺基-4-(羥基甲基氧膦基)丁酸、4-胺基-4-甲基-4-膦醯基丁酸、4-胺基-4-(羥基甲基氧膦基)-4-甲基丁酸、4-胺基-4-膦醯基丁醯安、2-醯胺基-4-膦醯基丁酸、2-甲氧基羰基-4-膦醯基丁酸、4-胺基-4-膦醯基丁酸甲酯、oxetin、IF7和IF17多肽、(3-胺基3-羧丙基)-(膦醯基甲基)次膦酸、N-羥基-L-2,4-二胺基丁酸酯、3-胺基-3-羧丙基-磺醯胺和5-羥基離胺酸。GS之抑制劑能抑制至少20、30、40、50、60、70、80、90、95、99或100%的GS活性。
在一特定的具體實例中，此套組無甲硫胺酸磺醯亞胺。
本發明進一步係提供包含如上文「
表現載體」章節中所定義之表現載體的根據本發明細胞株，或根據本發明之表現系統，或根據本發明之套組，用於活體外製造重組蛋白之用途。
在一特定的具體實例中，該細胞株、表現載體或套組係與如上所定義之缺乏尿苷和麩醯胺酸，更特言之，在無DHODH抑制劑及/或無GS抑制劑的培養基組合使用。
本發明進一步係提供根據本發明之表現系統，包含如上文「
表現載體」章節中所定義之表現載體的根據本發明細胞株，或根據本發明之套組之用途，其用於分離活體外生產高量重組蛋白之選植株細胞(「高生產量選植株」)，更特言之，在無DHODH抑制劑及/或無GS抑制劑下。
在本發明內文中，術語「高量重組蛋白」希望係指在培養基中重組蛋白的濃度為至少0.05 g/l，較佳的至少0.1 g/l，又較佳地至少0.2 g/l，更佳地介於0.3至1 g/l之間。重組蛋白的濃度可藉由習知技術者已知的方法來測定，包括特定的酵素結合免疫吸附分析(ELISA)、西方墨點、卡尺技術和一濃度範圍之相當於重組蛋白的純化蛋白。
本發明進一步係提供活體外製造重組蛋白之方法，該方法係包括下列步驟：
A) a1)提供一包含如上文「
表現載體」章節中所定義之表現載體的根據本發明細胞株；
或
a2) 提供一根據本發明之細胞株，及
a2’) 將如上文「
表現載體」章節中所定義之表現載體導入步驟a2)中所提供的細胞株；
或
a3) 提供一包括內生性DHODH基因和內生性GS基因之細胞株，
a3’) 使步驟a3)所提供的細胞株中的內生性DHODH基因和內生性GS基因部分或完全不活化，及
a3’’) 將如上文「
表現載體」章節中所定義之表現載體導入步驟a3’)中所得到之包括部分或完全不活化內生性DHODH基因和部分或完全不活化GS基因的細胞株；
或
a4) 提供一包括內生性GS基因和部分或完全不活化的內生性DHODH基因之細胞，
a4’)使步驟a4)所提供的細胞中的內生性GS基因部分或完全不活化，及
a4’’) 將如上文「
表現載體」章節中所定義之表現載體導入步驟a4’)中所得到的包括部分或完全不活化之內生性DHODH基因和部分或完全不活化之GS基因的細胞株；
或
a5) 提供一包括內生性DHODH基因和部分或完全不活化之內生性GS基因的細胞，
a5’) 使步驟a5)所提供的細胞中的內生性DHODH基因部分或完全不活化，及
a5’’) 將如上文「
表現載體」章節中所定義之表現載體導入步驟a5’)中所得到的包括部分或完全不活化之內生性DHODH基因和部分或完全之不活化GS基因的細胞株；
B) 於適合生產此重組蛋白之條件下培養該細胞株；及
C) 分離及/或純化該重組蛋白。
在一特定的具體實例中，上述方法之步驟B)係於缺乏尿苷和麩醯胺酸的培養基中進行，更特言之亦為缺乏DHODH抑制劑及/或GS抑制劑，且特言之係包括存在於選擇轉染細胞之子步驟，而該細胞儘管無尿苷和麩醯胺酸，進一步特言之無 DHODH抑制劑及/或GS抑制劑仍會生長。
本發明進一步係提供活體外分離生產高量重組蛋白之選植株細胞的方法，該方法係包括或由下列步驟所組成：
A) a1) 提供一包含如上文「
表現載體」章節中所定義之表現載體的根據本發明細胞株；
或
a2) 提供一根據本發明之細胞株，及
a2’) 將如上文「
表現載體」章節中所定義之表現載體導入步驟a2)中所提供的細胞株；
或
a3) 提供一包括內生性DHODH基因和內生性GS基因之細胞株，
a3’) 使步驟a3)所提供的細胞株中的內生性DHODH基因和內生性GS基因部分或完全不活化，及
a3’’) 將如上文「
表現載體」章節中所定義之表現載體導入步驟a3’)中所得到的包括部分或完全不活化之內生性DHODH基因和部分或完全不活化之GS基因的細胞株；
或
a4) 提供一包括內生性GS基因和部分或完全不活化之內生性DHODH基因的細胞，
a4’) 使步驟a4)所提供的細胞株中的內生性GS基因部分或完全不活化，及
a4’’) 將如上文「
表現載體」章節中所定義之表現載體導入步驟a4’)中所得到的包括部分或完全不活化之內生性DHODH基因和部分或完全不活化之GS基因的細胞株；
或
a5) 提供一包括內生性DHODH基因和部分或完全不活化之內生性GS基因的細胞，
a5’) 使步驟a5)所提供的細胞株中的內生性DHODH基因部分或完全不活化，及
a5’’) 將如上文「
表現載體」章節中所定義之表現載體導入步驟a5’)中所得到的包括部分或完全不活化之內生性DHODH基因和部分或完全不活化之GS基因的細胞株；
B) 於適合生產此重組蛋白之條件下培養該細胞株；及
C) 分離出生產高量重組蛋白之選植株。
在一特定的具體實例中，上述方法之步驟B)係於缺乏尿苷和麩醯胺酸的培養基中進行，更特言之亦為缺乏DHODH抑制劑及/或GS抑制劑，且特言之係包括存在於選擇轉染細胞之子步驟，而該細胞儘管無尿苷和麩醯胺酸，進一步特言之無DHODH抑制劑及/或GS抑制劑仍會生長。
在步驟a2')、 a3”)、a4”)或a5”)中，該表現載體可藉由熟習技術者熟知的任何技術，特言之藉由電穿孔或化學轉染或轉導，導入該細胞中。
適合生產此重組蛋白之條件已為習知技術者所熟知。例如可使用該等描述於實例中的方法。
在一特定的具體實例中，步驟B)中所用的培養基係包括漸減濃度的尿苷和漸減濃度的麩醯胺酸。此項能使選擇其中載體衍生外生性DHODH基因和載體衍生的外生性GS基因(及因而編碼重組蛋白的序列)已擴增的選植株得以進行。
上述方法可進一步包括將重組蛋白調配成醫藥組成物的步驟。
在整個說明書中，術語，例如「包括」係具有多數專利法規所歸屬之意義，較佳地所提及之法規內；例如其可指「包含」等。術語，例如「由…組成」和「基本上由…組成」係具有多數專利法規所歸屬之意義，較佳地所提及之法規內；例如，其係意味著排除所有、最多或所有但可忽略量的其他元件，其允許未明確列舉之元件，但排除先前技術中所知道或影響本發明之基本或新穎特徵的元件。
在整個本說明之內文中引用數個文件。文中所引用的各文件(包括任何期刊文章或摘要、公開或未公開的專利申請案、發行的專利、製造商規範、說明書等)係以引用的方式併入。然而，就本發明而言，並非承認任何文中所引述的文件為確實的先前技術。
本發明將藉由參照下列圖式和實例進一步說明，該等圖式和實例僅是舉例說明，且並不希望限制本發明。
本發明係由申請專利範圍來定義，其應在說明書和圖式的輔助下解釋。
序列之簡單說明
實例 實例 1 ：獲得CHO 9E4細胞株
| SEQ ID NO: | 說明 |
| 1 | 編碼中國倉鼠( Cricetulus griseus)來源DHODH之cDNA序列 |
| 2 | 中國倉鼠來源DHODH之胺基酸序列 |
| 3 | 編碼人類來源DHODH之cDNA序列 |
| 4 | 人類來源DHODH之胺基酸序列 |
| 5 | 編碼人類來源GS之cDNA序列 |
| 6 | 人類來源GS之胺基酸序列 |
| 7 | 編碼狗( Canis lupus)來源GS之cDNA序列 |
| 8 | 狗來源GS之胺基酸序列 |
| 9 | 中國倉鼠來源GS之胺基酸序列 |
| 10 | 用於產生DHODH gRNA之對應的DNA片 |
| 11 | 用於獲得DHODH gRNA之寡核苷酸(序列1’) |
| 12 | 用於獲得DHODH gRNA之寡核苷酸(序列1’) |
| 13 | 用於獲得DHODH gRNA之寡核苷酸(序列2’) |
| 14 | 用於獲得DHODH gRNA之寡核苷酸(序列2’) |
| 15 | 用於獲得DHODH gRNA之寡核苷酸(序列3’) |
| 16 | 用於獲得DHODH gRNA之寡核苷酸(序列3’) |
| 17 | 用於獲得DHODH gRNA之寡核苷酸(序列4’) |
| 18 | 用於獲得DHODH gRNA之寡核苷酸(序列4’) |
| 19 | 用於獲得DHODH gRNA之寡核苷酸(序列5’) |
| 20 | 用於獲得DHODH gRNA之寡核苷酸(序列5’) |
| 21 | 用於獲得DHODH gRNA之寡核苷酸(序列6’) |
| 22 | 用於獲得DHODH gRNA之寡核苷酸(序列6’) |
| 23 | 用於獲得DHODH gRNA之寡核苷酸(序列7’) |
| 24 | 用於獲得DHODH gRNA之寡核苷酸(序列7’) |
| 25 | 用於獲得DHODH gRNA之寡核苷酸(序列8’) |
| 26 | 用於獲得DHODH gRNA之寡核苷酸(序列8’) |
| 27 | CHO DHODH基因序列 |
| 28 | 人類DHODH G202A之胺基酸序列 |
| 29 | GS-1 gRNA靶向之DAN序列 |
| 30 | GS-2 gRNA靶向之DNA序列 |
| 31 | CHO GS基因序列 |
| 32 | GS1_F引子 |
| 33 | GS1_R引子 |
| 34 | 編碼GS中國倉鼠來源之cDNA序列 |
| 35 | 實例5之GS F引子 |
| 36 | 實例5之GS R引子 |
本實例係描述從ATCC編號ATCC CCL-61之市售CHO-K1細胞株獲得CHO 9E4細胞株。
1.CHO-K1 細胞株
從ATCC取得1小瓶1969年在牛血清的存在下冷凍的CHO-K1細胞(ATCC CCL-61)。
2. 以 Ex-Cell
TM302
培養基解凍小瓶並製備 CHO-LG-APF 庫
將CHO-K1小瓶直接以添加4 mM麩醯胺酸的Ex-Cell
TM302培養基(SAFC)解凍並於靜態支撐物上擴增，及然後置於旋轉器。在12個繼代和17.3個世代後，將生成的CHO-LG-APF庫冷凍於Ex-Cell
TM302培養基中。
3. 以 Ex-Cell
TM302
培養基解凍 CHO-LG-APF 庫並製備 ABC-024 P22 庫
將CHO-LG-APF小瓶以Ex-CellTM 302培養基解凍並擴增。18.5個世代後，將產生的ABC-024 P22庫解凍。
4. 使 CMV07-024 庫適應 CDCHO 融合培養基並製備 ABC-003 庫
將CMV07-024庫解凍並直接適應培養於添加4 mM麩醯胺酸的Ex-cell
TMCDCHO融合培養基(SAFC)及於震盪器中適應培養12.5個世代，之後將ABC-003庫以Ex-cell
TMCDCHO融合培養基冷凍。
5. 以 CDCHO 融合培養基解凍 ABC-003 庫並以 CDCHO 融合培養基製備 ABC-053 庫
將ABC-003小瓶以CDCHO融合培養基解凍，及稀釋後，於4.2個世代後將ABC-53冷凍。
6. 以 CDCHO 融合培養基解凍 ABC-053 庫，以 CDCHO 融合培養基選擇、選殖及製備 P15A11 庫
將ABC-053庫以添加4 mM麩醯胺酸的Ex-cell
TMCDCHO融合培養基(SAFC)解凍。培養擴增後，將其於培養皿中藉由限制稀釋選殖，及然後於CDCHO融合培養基中擴增。將從該選殖所生成的選植株P15A11庫冷凍。該選殖和擴增係相當於大約94個世代。
7. 以 CDCHO 融合培養基解凍 P15A11 庫，藉由直接於 CDCHO 中傳代將細胞庫適應培養並以 CDCHO 培養基製備 CHOSP10-002 庫
將P15A11庫以添加4 mM麩醯胺酸的Ex-cell
TMCDCHO融合培養基(SAFC)解凍，及於CDCHO融合培養基中2個繼代後，以CDCHO培養基稀釋細胞。於CDCHO培養基中3個繼代後，在總計15.9世代後，將CHOSP10-002庫冷凍。
8. 以 CDCHO 培養基解凍 CHOSP10-00 庫，擴增，藉由離心去除團塊並藉由於 96- 孔盤上無團塊之繼代培養選擇，於 6- 孔盤上及震盪器中擴增以 CDCHO 培養製備 CHOSP10-012 庫
將CHOSP10-002庫以添加6 mM麩醯胺酸的CDCHO培養基(Invitrogen)解凍，然後擴增。將培養物離心以便於消除細胞塊並繼續僅以從上清液分離出的細胞培養。在此階段，由解凍，產生11.3個世代。
將培養以每孔10個細胞分置於96-孔盤。將帶有細胞的孔槽以6-孔盤，然後於震盪器中，以懸浮液多重分離進行擴增。直到有23.2額外的世代，將CHOSP10-012庫冷凍。
9. 解凍 CHOSP10-012 庫，擴增和製備 CHOSP11-00 庫 (9E4 庫)
將CHOSP10-012庫以添加6 mM麩醯胺酸的CDCHO培養基(Invitrogen)解凍，然後從Erlenmeyer三角燒瓶階級擴增至17 L生物培養器。
總計10個世代後將9E4庫冷凍。
實例 2 ：製造其中DHODH基因為無效的CHO細胞株
A -設計和建構CRISPR CAS9嚮導RNA (gRNA)
就使CHO細胞中的DHDOH基因失效，發明者們係由回復倉鼠DHODH基因序列開始及使用可公開取得的Tefor軟體設計不同嚮導RNA (gRNA)用於CHO基因體中以CRISPR-Cas9轉染。帶有內含子和外顯子之CHO DHODH全序列係如
圖 1所示。
此軟體係測定8條可能以DHODH基因為靶向的序列：
序列1’
GGATGCAGCCATCATCCTTGGTTTT (SEQ ID NO: 11)
CAAGGATGATGGCTGCATCCCGGTG (SEQ ID NO: 12)
序列2’
GATGCAGCCATCATCCTTGGGTTTT (SEQ ID NO: 13)
CCAAGGATGATGGCTGCATCCGGTG (SEQ ID NO: 14)
序列3’
GCAGCCATCATCCTTGGGGGGTTTT (SEQ ID NO: 15)
CCCCCAAGGATGATGGCTGCCGGTG (SEQ ID NO: 16)
序列4’
GCCATCATCCTTGGGGGAGGGTTTT (SEQ ID NO: 17)
CCCCCCAAGGATGATGGCCGGTG (SEQ ID NO: 18)
序列5’
GCTATTCGCTTCACGTCCCTGTTTT (SEQ ID NO: 19)
AGGGACGTGAAGCGAATAGCCGGTG (SEQ ID NO: 20)
序列6’
GCCTCTACAAACTGGGCTTTGTTTT (SEQ ID NO: 21)
AAAGCCCAGTTTGTAGAGGCCGGTG (SEQ ID NO: 22)
序列7’
GGCTTTGGGTTTGTCGAGGTGTTTT (SEQ ID NO: 23)
ACCTCGACAAACCCAAAGCCCGGTG (SEQ ID NO: 24)
序列8’
GCTGGTCTGAGGAGCCTACAGTTTT (SEQ ID NO: 25)
TGTAGGCTCCTCAGACCAGCCGGTG (SEQ ID NO: 26)
雖然檢測和選殖了8條序列，但僅轉染8條序列中4條選殖的序列且僅1條成功產生DHODH基因剔除。使用下列20個核苷酸的序列GGATGCAGCCATCATCCTTG (SEQ ID NO: 10)作為用於產生gRNA之對應DNA片。其係以DHODH基因的第二外顯子為靶向。為了得到適宜的gRNA轉錄，係以合成製造二條寡核苷酸GGATGCAGCCATCATCCTTGGTTTT(寡核苷酸1’, SEQ ID NO: 11)和CAAGGATGATGGCTGCATCCCGGTG (寡核苷酸2’, SEQ ID NO: 12)，於pCM3561 (Invitrogen所販售)之獨特的
Bae1位點黏合及選殖。
選殖的DNA序列由此係於U6啟動子的控制下且一旦DNA轉染於CHO細胞中，則其將轉錄成含有crRNA與tracrRNA融合的單一轉錄單元。crRNA部分對於DHODH基因的第二外顯子具有專一性而tracrRNA可被Cas9酵素本身所辨識。
B-製備用於CRISPR-Cas9基因編輯的物質
如實例1中所示，從購自ATCC的CHO K-1細胞分離及選擇CHO 9E4細胞，並於37°C含有8% CO
2和80%濕度培養箱中，以添加 6 mM L-麩醯胺酸、經最適化供中國倉鼠卵巢(CHO)細胞生長之CDCHO無血清和化學定義培養基的懸浮液培養來生長及維持。
將10 µg的 sgRNA表現載體 (pCM3561)以1 µL的
Bael酵素於5個單位/µl添加20 μM S-腺苷甲硫胺酸(SAM)在25°C消化1小時，然後將消化的質體藉由電泳使用1%瓊脂凝膠分離。然後藉由凝膠萃取套組(Qiagen Kit)回收生成的sgRNA選殖載體。
使用T4 DNA連接酶酵素(Biolabs)接合sgRNA選殖載體及黏合的嚮導寡核苷酸並於室溫培養10 min。
將5 µL的綁紮產物加到50 µL的大腸桿菌DH5a勝任細胞(Invitrogen)。
將細胞和DNA於冰上培養30 min，及然後於42°C熱休克45秒。加入500 mL S.O.C培養基後，於37°C(以800 rpm)培養1-小時，給予細菌產生編碼在質體骨架上之抗生素阻抗蛋白的時間。培養後，將各試管鋪開在添加100 µg/mL安比西林之塗覆的LB上。將各盤於37°C培養至隔夜。使用負對照(以水取代插入DNA)評估是否成功轉型。
就擴增步驟，每次構築係選擇二種菌落並植入試管中2 mL添加100 µg/ml安比西林的LB培養基，置入培養箱中至隔夜(37°C, 700 rpm)。以離心收取培養隔夜的培養物。使用QIAprep Miniprep Kit
TM(QIAGEN)回收擴增的DNA (溶析於EB緩衝液)。然後藉由Sanger 定序(同義和反義定序，GATC公司)檢查感興趣之嚮導寡核苷酸的序列。以Vector NTI軟體(Thermofisher Scientific)比對確認後，使用對應的菌落植入200 mL添加100 µg/ml安比西林的的LB培養基。24小時培養後，藉由於4°C以6000 g離心15 min收取細菌。使用EndoFree Plasmid Maxi Kit
TM(QIAGEN)製備MaxiPrep。藉由於室溫加入異丙醇沉澱DNA。1 h-離心(於4°C，8000 rpm)後，以無內毒素的室溫70%乙醇清洗DNA沉澱。短暫再次離心後，將沉澱風乾 1 h並再溶解於適量的無內毒素無菌水，得到的5 mg/mL的DNA濃度。使用nanodrop裝置測量DNA濃度。
製備4種不同的質體，亦即pBH6840質體(KO DHODH 序列1’)、pBH6841質體(KO DHODH 序列2’)、pBH6842質體(KO DHODH 序列5’)和pBH6843質體(KO DHODH 序列7’)。CHO DHODH基因內的標靶係如SEQ ID NO: 27序列所示。
C-CRISPR-Cas9基因編輯
藉由電穿孔使用MaxCyte STX及其CHO定義方法進行轉染。 將其以OC-100(每次轉染2千萬個細胞)處理組裝。
在轉染前一天，將細胞以1.5×10
6個細胞/mL植入添加6 mM L-麩醯胺酸的CDCHO培養基。
在轉染當天，將細胞以ViCell設備(Beckman & Coulter)計數。將所需數目的細胞以250 g離心10 min並將上清液丟棄。
就各轉染條件，係將20×10
6個細胞以250 g離心10 min。將沉澱以70 μL Maxcyte緩衝液再懸浮。加入30 µg的DNA並將混合物(細胞、緩衝液和DNA)轉置於100 μL Maxcyte 電穿孔匣。所用的處理組裝為針對100 μL卡匣之OC-100，並以CHO之最適化程序進行選擇。
進行下列轉染。
| T1 pBH6840 | KO DHODH 序列1’ |
| T2 pBH6841 | KO DHODH 序列4’ |
| T3 pBH6842 | KO DHODH 序列5’ |
| T4 pBH6843 | KO DHODH 序列7’ |
| T5 W/O ADN | H2O |
電穿孔後，將細胞轉置於25 mL工作Erlenmeyer燒瓶。將其放置於37°C，5% CO
2靜態培養箱歷時45 min。然後加入25 mL添加6 mM L-麩醯胺酸的CDCHO培養基懸浮細胞並將Erlenmeyer燒瓶置於37°C，5% CO
2，70%濕度，110 rpm震盪器中。
電穿孔後隔日，藉由限制稀釋從上述CHO9E4轉染池，每孔植入單一細胞。大約20天後，一旦細胞為大約90%滿度且在顯微鏡的檢查下顯現為健康的，則將細胞分成2個有或無尿苷之新的96孔盤。
就其對缺乏尿苷的敏感性選擇數株的選植株。將這些選植株適應培養，生長於添加6 mM麩醯胺酸和5 mM尿苷的CDCHO培養基。
從CRISPR-Cas9選植株細胞使用Qiagen DNeasy kit
TM(Qiagen)萃取基因體DNA，用以確認此基因編輯為成功的。將標靶基因座藉由PCR使用適當的引子就作為CRISPR-Cas9靶向之DHODH基因座區進行擴增，並藉由NGS使用PCR片段覆蓋可能的刪除區將PCR產物定序。
由此產生DHODH剔除的KO2和KO19。
實例 3 ：生產其中DHODH基因和GS基因為失效的CHO細胞株
A -設計和建構CRISPR-Cas9嚮導RNA (gRNA)
就使實例2所得到的KO DHODH KO2和KO19細胞株中之GS基因失效，發明者們係由回復倉鼠GS基因序列開始及使用可公開取得的Tefor軟體設計二種不同嚮導RNA (gRNA)用於CHO基因體中以CRISPR-Cas9轉染。
此軟體係測定2條可能以GS基因為靶向的序列。選擇2條靶向序列，1條係以外顯子6為標靶而另一條係以CHO GS基因的外顯子6附近為標靶。
GS-1 gRNA 序列係以gagtatgtgaagactttg (SEQ ID NO: 29)為標靶，接著CHO GS基因體序列內的PAM 序列 (ngg)。
GS-2 gRNA 序列係以ccatctttattctcatgggg (SEQ ID NO: 30)為標靶，接著CHO GS基因體序列內的PAM 序列 (ngg)。
CHO GS基因內的標靶係如SEQ ID NO: 31序列上所示。
B-製備用於CRISPR-Cas9基因編輯的物質
於轉染前24 h，將KO2和KO19剔除DHODH選植株以預熱過、添加6 mM麩醯胺酸和5 mM尿苷的CD CHO培養基稀釋，達到所欲最終體積中1.5×10
6個細胞/mL之最終細胞密度。將燒瓶於含有8% CO
2氣體之濕化氣壓的37°C培養箱中，於5 mm迴旋式震盪器平台上以115 rpm旋轉培養。
在分子生物實驗室之經典條件下，如下製備crRNA::tracrRNA複合物：個別地就各crRNA – (一個用於GS-1 gRNA及一個用於GS-2 gRNA)；藉由整合的DNA Technologies (IDT, Leuven, Belgium)，提供二個特異性crRNA，恆定tracRNA和純化的spCAS9蛋白。
cr:tracrRNA 混合物
1. 將混合物於95°C培養5 min
a. 循環反應儀的設定如下：
i. 95°C 5 min
ii. 保持在20°C(然後置放在試驗台上)
2. 將複合物於室溫冷卻並如下製備RNP：
RNP 複合物
| 組份 | 量 x1 |
| crRNA | 5 µl (500皮莫耳(pmoles)) |
| tracrRNA | 5 µl (500皮莫耳) |
| 總計 | 10 µl |
| 組份 | 量 x1 (µl) |
| cr:RNA/tracrRNA 混合物 | 10 |
| SpCas9 | 7 (70µg) |
| 總計 | 17 |
將所有的組份混合並於室溫培養20 min，及在培養期間計算細胞數。每個轉染實驗收取計數1百萬個之足夠數目的細胞。於室溫將培養的細胞以250 g離心10 min，及小心地在不擾動細胞沉澱下，移除上清液。
C-CRISPR-Cas9基因編輯
轉染混合物
| 組份 | 量 x1 (µl) |
| RPN 複合物 | 17 |
| MaxCyte 緩衝液 | 73 |
| 總計 | 90 |
就各轉染條件，係將1x10
6個細胞團以90 μl轉染混合物(RNP複合物和含有crRNA::tracrRNA複合物之MaxCyte緩衝液)再懸浮，並轉置於100 μl Maxcyte電穿孔匣。
所用的處理組裝為針對100 μL卡匣之OC-100，並以CHO之最適化程序進行選擇。使用此特定Maxcyte設計程序將細胞電穿孔。
就回收階段，係將轉染的細胞於37°C立即轉置於125 ml燒瓶，40 min無攪動。加入25 ml添加6 mM麩醯胺酸和5 mM尿苷的預加熱CD CHO並將此轉染培養維養於37°C具有8% CO
2和80%濕度的培養箱中。
在轉染後隔天，藉由上述KO2和KO19 DHODH選植株轉染池之限制稀釋，於96孔盤中每孔植入單一細胞，相當每孔0.5個細胞。將含有生長中可能選植株的96孔盤維養於37°C具有8% CO
2和80%濕度的培養箱中。
生長15至25天後，觀察佔有孔槽的細胞且一旦細胞為大約90%滿度且在顯微鏡下檢查顯現為健康的，則將生長的細胞分成2個有或無麩醯胺酸之新的96孔盤，用以確認其麩醯胺酸營養缺陷。
就其對缺乏麩醯胺酸的敏感性選擇96株選植株。將這些選植株適應培養，生長於添加6 mM麩醯胺酸和5 mM尿苷的CD CHO培養基。
從CRISPR-Cas9選植株細胞萃取基因體DNA，確認此基因編輯為成功的，並以靶向NGS定序確認破壞二個GS基因等位基因。
亦即，使用PureLink
TM基因體DNA迷你套組(Invitrogen型號K1820-01)使用1至5 × 10
6個選殖的CHO細胞，製備基因體DNA (gDNA)。
更特言之，將5 × 10
6個細胞於室溫以250 g離心10 min，並小心地移除生長培養基。將沉澱再懸浮於200 µl PBS。將20 μl的蛋白酶 K/RNA酶和200 μl的解離/結合緩衝液加到樣本中並於55°C培養10 min。將樣本試管以10,000 g離心1 min。將200 μl的95-100%乙醇加到溶離液中，然後將其震盪。將一離心管柱中加到一收集試管並將製備的溶離液加到離心管柱中。將離心管柱和收集試管組合於室溫以10,000 g離心1 min，然後將溢流液丟棄。接著，加入500 μl 的清洗緩衝液1，將離心管柱和收集試管組合於室溫以10,000 g離心1 min並將溢流液丟棄。接著，加入500 μl 的清洗緩衝液2，將離心管柱和收集試管組合於室溫以10,000 g離心3 min並將溢流液丟棄。將離心試管加到一新的microfuge試管並將100 μl的溶析緩衝液加到離心試管中。將樣本於室溫培養1 min，然後於室溫以最大速度離心1 min。將管柱移出並丟棄，因為萃取的DNA已收集於microfuge試管中。
從50 ng的基因體DNA開始，使用二個連續PCR使用由NextSeq 500 Mid Output Kit v2.5驅動的Illumina公司技術(300個循環)，將相當於潛在修飾區的感興趣區擴增；Ref: 20024905。第一PCR係相當於使用下列正向和反向PCR引子之引用區的特異性擴增。
| 名稱 | 序列 | SEQ ID NO: |
| GS1_F引子 | ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGGCCTTATTCTAAAGGTCAACA | 32 |
| GS1_R引子 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATTCTCCTCCCGCATGG | 33 |
這些引子為合成製造的且在5’端含有基因銜接子F-銜接子(Rd1SP，33個核苷酸)和R-銜接子(Rd2SP，34個核苷酸)。若無觀察到刪除的話，擴增序列的理論大小為399個核苷酸。
在第二PCR，將此片段再擴增，以便於使用T5 i5索引引子和T7 i7索引引子及以上述基因序列 Rd1SP和Rd2SP為基準索引化。索引化讓多個片段得以混合。
定序後，證實刪除二個GS基因體序列內的等位基因，確定破壞二個GS基因等位基因。
實例 4 ：抗體生產分析
使用實例3中所得到的雙GS DHODH基因剔除細胞製造三專一性抗體。
設計、構築及製造表現載體，濃度5 mg/ml。在這些載體中，表現匣和選擇標記(GS cDNA或DHODH G202A cDNAs)係以ITR(反性終端重複序列)為邊界，而得以使用piggybac轉位子系統進行表現匣和選擇標記的活性整合至CHO生產細胞的基因體中。
將用於突變的piggybac轉位酶之質體(Yusa
et al.(2011)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA108:1531-1536)共轉染，以允許過渡性表現轉位酶。
所用的細胞株為CHO 9E4_SP11(揭示於實例1)和揭示於實例3中的DHODH及GS基因剔除之選植株。
以添加6 mM L-麩醯胺酸的CDCHO培養基培養CHO 9E4_SP11。以添加6 mM L-麩醯胺酸和5 mM尿苷的CDCHO培養基培養雙KO選植株。
將25 mL所欲轉染的細胞在開始時以125 ml Erlenmeyer燒瓶培養並擴增直到活細胞數足以進行所有的轉染。
在FectoPRO® (Polyplus)轉染前一天，將細胞以添加6 mM L-麩醯胺酸和5 mM尿苷的CDCHO培養基稀釋成1.5×10
6個細胞/ml。
在轉染當天，將2.8 ml的稀釋細胞懸浮液以1.1×10
6個細胞/ml散佈於24 DW盤中添加6 mM L-麩醯胺酸和5 mM尿苷的CDCHO培養基。依照製造商推薦的方法，將FectoPRO®試劑渦漩5秒並降速，之後於一空的96 MTP孔盤中每孔加入6.2 µl。在第二96孔MTP盤中，將3.1 µg的DNA(90%的表現匣DNA和10% 轉位酶表現質體)以200 µl的 CD CHO培養基稀釋及然後個別就各孔槽，將培養中稀釋的DNA同時散佈於純的FectoPRO® 試劑。立刻將溶液均質化並於室溫培養10 min。將FectoPRO®/DNA轉染混合物倒入先前製備的散佈於24孔盤的細胞上並將該培養物於37°C，190 rpm和8% CO
2下培養。
電穿孔後24小時(第1天)，以ViCell XR計算細胞數。將全細胞培養物於25°C以250 g離心10 min，並小心地抽吸培養基。就CHO 9E4 WT細胞，係將沉澱以預加熱添加30%的FeedB和25 µM的特立氟胺之CDCHO培養基再懸浮，而就雙KO GS/DHODH細胞，則無任何選擇壓力或麩胺酸/尿苷添加。
在轉染後第3天，以Invitrogen™ Countess™儀器計算細胞數。將全細胞培養物於25°C以250 g離心10 min，並小心地丟棄上清液。就CHO 9E4 WT細胞，係將沉澱以預加熱添加30%的FeedB和25 µM的特立氟胺之CD OPTiCHO培養基再懸浮，而就雙KO GS/DHODH細胞，則無任何選擇壓力或麩胺酸/尿苷添加。
在轉染後第14天，將總計的培養物於4°C以250 g離心10 min，並將含有所產生的感興趣蛋白之上清液經由0.22 μm PES過濾器過濾，及使用Octet機器人測量抗體目標效價。
下表係摘述三專一性抗體之轉染條件。
Gln：麩醯胺酸，Uri：尿苷，TNF：特立氟胺，MSX：L-甲硫胺酸磺醯亞胺
| 用於轉染的表現載體 | 細胞 | 選擇標記 | 轉染當天 培養基 | 轉染後 選擇性培養基 | |
| pVA4-00080/pVA4-0081 | 雙 KO1 | GS/DHODH | CD CHO + Uri + Gln | CD OPTiCHO + FeedB | |
| pVA4-00080/pVA4-0081 | 雙 KO2 | GS/DHODH | CD CHO + Uri + Gln | CD OPTiCHO + FeedB | |
| pVA4-00080/pVA4-0081 | 雙 KO3 | GS/DHODH | CD CHO + Uri + Gln | CD OPTiCHO + FeedB | |
| pVA4-00080/pVA4-0081 | 雙 KO4 | GS/DHODH | CD CHO + Uri + Gln | CD OPTiCHO + FeedB | |
| pVA4-00080/pVA4-0081 | 雙 KO5 | GS/DHODH | CD CHO + Uri + Gln | CD OPTiCHO + FeedB | |
| pVA4-00080/pVA4-0081 | 雙KO6 | GS/DHODH | CD CHO + Uri + Gln | CD OPTiCHO + FeedB | |
| pVA4-00080/pVA4-0081 | 雙 KO7 | GS/DHODH | CD CHO + Uri + Gln | CD OPTiCHO + FeedB | |
| pVA4-00080/pVA4-0081 | 雙 KO8 | GS/DHODH | CD CHO + Uri + Gln | CD OPTiCHO + FeedB | |
| pVA4-00080/pVA4-0081 | 雙 KO9 | GS/DHODH | CD CHO + Uri + Gln | CD OPTiCHO + FeedB | |
| pVA4-00080/pVA4-0081 | 雙 KO10 | GS/DHODH | CD CHO + Uri + Gln | CD OPTiCHO + FeedB | |
| pVA4-00080/pVA4-0081 | 雙 KO11 | GS/DHODH | CD CHO + Uri + Gln | CD OPTiCHO + FeedB | |
| pVA4-00080/pVA4-0081 | 雙 KO12 | GS/DHODH | CD CHO + Uri + Gln | CD OPTiCHO + FeedB | |
| pVA4-00080/pVA4-0081 | 雙 KO13 | GS/DHODH | CD CHO + Uri + Gln | CD OPTiCHO + FeedB | |
| pVA4-00080/pVA4-0081 | 雙 KO14 | GS/DHODH | CD CHO + Uri + Gln | CD OPTiCHO + FeedB | |
| pVA4-00080/pVA4-0081 | 雙 KO15 | GS/DHODH | CD CHO + Uri + Gln | CD OPTiCHO + FeedB | |
| pVA4-00080/pVA4-0081 | 雙 KO16 | GS/DHODH | CD CHO + Uri + Gln | CD OPTiCHO + FeedB | |
| pVA4-00080/pVA4-0081 | 雙 KO17 | GS/DHODH | CD CHO + Uri + Gln | CD OPTiCHO + FeedB | |
| pVA4-00080/pVA4-0081 | 雙 KO18 | GS/DHODH | CD CHO + Uri + Gln | CD OPTiCHO + FeedB | |
| pVA4-00080/pVA4-0081 | 雙 KO19 | GS/DHODH | CD CHO + Uri + Gln | CD OPTiCHO + FeedB | |
| pVA4-00080/pVA4-0081 | 雙 KO20 | GS/DHODH | CD CHO + Uri + Gln | CD OPTiCHO + FeedB | |
| pVA4-00080/pVA4-0081 | 9E4WT | GS/DHODH | CD CHO + Gln | CD OPTiCHO + FeedB | |
| pVA4-00080/pVA4-0081 | 9E4WT | GS/DHODH | CD CHO + Gln | CD OPTiCHO + FeedB | |
| pVA4-00080/pVA4-0081 | 9E4WT | GS/DHODH | CD CHO + Gln | CD OPTiCHO + FeedB + MSX + TNF | |
| pVA4-00080/pVA4-0081 | 9E4WT | GS/DHODH | CD CHO + Gln | CD OPTiCHO + FeedB + MSX + TNF | |
得到下列結果。
| 孔槽數 | |
| 受試 | 192 |
| 有使用的 | 96 |
| 佔用% | 50 |
| Gln敏感的選殖株數目 | 45 |
| Gln敏感性% | 47 |
| 第3天CHO細胞的存活率 | 第7天CHO細胞的存活率 | |||
| 活細胞(×10 6/ml) | 存活率(%) | 活細胞(×10 6/ml) | 存活率(%) | |
| 雙 KO1 | 1.75 | 87.01 | 6.56 | 97.17 |
| 雙KO2 | 2.05 | 87.73 | 6.45 | 97.98 |
| 雙KO3 | 2.7 | 88.75 | 7.57 | 97.77 |
| 雙KO4 | 2.45 | 88.59 | 4.53 | 98.31 |
| 雙KO5 | 2.64 | 86.26 | 6.3 | 94.85 |
| 雙KO6 | 2.77 | 87.12 | 7.71 | 96.58 |
| 雙KO7 | 2.8 | 84.65 | 7.62 | 96.17 |
| 雙KO8 | 2.55 | 87.35 | 7.94 | 96.97 |
| 雙KO9 | 2.45 | 86.18 | 7.42 | 96.7 |
| 雙KO10 | 1.87 | 87.96 | 6.56 | 96.17 |
| 雙KO11 | 2.4 | 83.81 | 7.39 | 95.83 |
| 雙KO12 | 2.01 | 87.9 | 4.89 | 96.85 |
| 雙KO13 | 2.53 | 88.21 | 6.07 | 97.8 |
| 雙KO14 | 2.1 | 84.82 | 7.41 | 96.3 |
| 雙KO15 | 2.17 | 85.85 | 7.03 | 97.82 |
| 雙KO16 | 2.06 | 85.5 | 7.15 | 97.34 |
| 雙KO17 | 2.6 | 85.95 | 8.06 | 97.23 |
| 雙KO18 | 2.4 | 88.15 | 6.96 | 97.38 |
| 雙KO19 | 2.5 | 85.82 | 7.5 | 96.04 |
| 雙KO20 | 2.6 | 88.34 | 7.43 | 98.28 |
| 9E4 WT + MSX+TNF | 1.64 | 68.3 | 4.4 | 91.3 |
第10和14天三專一性抗體生產係如
圖 2所示。
如
圖 2所示，在無任何選擇壓力特立氟胺/L-甲硫胺酸磺醯亞胺或麩胺酸/尿苷添加下，10株選植株展現良好的生產力。
這些雙KO選植株，以等同先前技術選擇系統的範圍，製造三專一性抗體，亦即介於0.3 g/l至0.5 g/l之間，其中雙KO20具有特別高的生產力。
實例 5 ：雙KO20選殖株之表型和基因型分析
因為選植株雙KO20為最有前景的，進一步進行此選植株的分析。
A-基因型分析
進一步以西方墨點研究此選植株中編碼GS的基因之不活化。
製備雙KO GS/DHODH之CHO培養基。其為藉由置放於37°C的培養箱中以37°C預熱大約30 min之帶有6 mM麩醯胺酸和5mM尿苷的CD-CHO培養基。就製備CHO細胞，係以ViCell XR計算細胞數，及以預熱過的補充培養基稀釋。然後將細胞於中含有8% CO
2氣體之濕化氣壓的37°C培養箱中，於迴旋式震盪器平台上以115 rpm旋轉培養。
以800 g於5分鐘期間將1千萬個細胞收取於15 ml試管中。根據供應商的建議，移除上清液並將團丸以1 ml的M-PER緩衝液再懸浮。於4°C培養30 min後，以1.5 mL Eppendorf試管以12000 rpm於15 min期間進行一次新的離心。然後收集800 µL的上清液用於西方墨點分析。以BCA分析測定上清液的蛋白濃度。
將4.4 µg的樣本載入SDS-PAGE上。使用iBlot®凝膠轉移工具(Life Technologies)藉由蛋白轉移於硝基纖維素膜上，進行西方墨點分析。以BSA和5%奶粉溶於PBS-T緩衝液(12 mM磷酸鈉，pH 7.4，137 mM NaCl，2.7 mM KCl，0.05% Tween®20)之混合物阻斷此硝基纖維素膜。然後將硝基纖維素膜於室溫以初級抗體培養(Sigma公司之抗麩醯胺酸合成酶(G2781)1小時，然後以HRP接合的抗-兔二級抗體於室溫培養1小時。然後將含有表位的蛋白使用ECL試劑顯像供西方墨點偵測。
就對照組(野生型CHO)觀察到對應麩醯胺酸合成酶之預期分子量(~ 45 kDa)的條帶，但來自雙KO20選植株的樣本則無。此西方墨點分析因此驗證了在來自雙KO20選植株的樣本中無麩醯胺酸合成酶。此結果確認了在該具生產力的選植株中內生性麩醯胺酸合成酶(GS)基因完全不活化。
以另一分析，進一步的研究此選植株的基因型。目標為鑑別出負責GS基因體序列中KO之突變。CRISPR裂解的目標序列係位於GS基因外顯子6的附近，特言之，介於外顯子6和外顯子7之間的內含子。
為了擴增感興趣序列，係從內含子側，於臨界的外顯子上，設計PCR引子。
| 擴增引子 | 名稱 | 靶向 GS 基因位置 | 序列 | SEQ ID NO: |
| 前置 | PCR_GS_for1 | 外顯子6的3’端 | acctttgaccccaagc | 35 |
| 反置 | PCR_GS_rev2 | 外顯子7的3’端 | cgtcgccagtctcattg | 36 |
如實例3中C部分所述，從雙KO20選殖株萃取基因體DNA。從其得到150 ng/µl之98µl的DNA。
進行PCR並將PCR產物控制在瓊脂凝膠電泳上。預計的分子量為879 bp。發明者們在預計分子量附近觀察到些許條帶及一主要較小的條帶(大約400-500 bp)，其表示來自雙KO20選殖株樣本中數個gDNA群組。因此，所進行的PCR擴增得以獲得2種擴增子。
然後將得到的擴增子選殖至一穿梭載體內。細菌轉型後，已培育出數株選殖株，及然後將質體藉由小量製備純化。DNA小量製備後，將含有質體的擴增子定序，其中引子係與穿梭載體中插入位置接壤。
將得到的序列與GS基因的理論上完整序列比對。
最大擴增子係對應外顯子6和7之間內含子的存在，其中此內含子係經刪除大約39bp。
較短的擴增子係對應外顯子6和7之間的內含子完全刪除。
有關這些分析，本發明者們結論出，雙KO20選殖株為帶有2個群組gDNA(1個為內含子全刪除而1個為刪除內含子內39 bp)之GS的KO。這些編碼GS基因內的修飾導致了GS表現完全不活化。
無
圖 1係顯示參照2018年12月21日於Genebank NCBI可取得之基因ID: 100756632的人類DHODH基因之基因體結構。
圖 2係顯示使用人類DHODH和人類GS選擇標記和DHODH/GS KO(基因剔除)或野生型CHO細胞在第10天和第14天的三專一性抗體生產。
無
Claims (20)
- 一種細胞株，包括： - 部分或完全不活化的內生性二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)基因，及 - 部分或完全不活化的內生性麩醯胺酸合成酶(GS)基因。
- 根據請求項1之細胞株，其為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株。
- 根據請求項1或2之細胞株，其中該細胞株係藉由下列產生： (a1) 使包括內生性DHODH基因和內生性GS基因之細胞中的內生性DHODH基因不活化， (b1) 在包括尿苷的培養基中，於適合產生其中內生性DHODH基因為部分或完全不活化之細胞株的條件下培養該細胞， (c1) 回收該其中內生性DHODH基因為部分或完全不活化之細胞， (d1) 使該細胞中的內生性GS基因不活化，及 (e1) 在包括麩醯胺酸的培養基中，於適合產生其中內生性GS基因為部分或完全不活化之細胞株的條件下培養該細胞。
- 根據請求項1或2之細胞株，其中該細胞株係藉由下列產生： (a2) 提供一包括內生性GS基因和部分或完全不活化之內生性DHODH基因的細胞， (b2) 使該細胞中的內生性GS基因不活化，及 (c2) 在包括麩醯胺酸的培養基中，於適合產生其中內生性GS基因為部分或完全不活化之細胞株的條件下培養該細胞。
- 根據請求項1或2之細胞株，其中該細胞株係藉由下列產生： (a3) 提供一包括內生性DHODH基因和部分或完全不活化之內生性GS基因的細胞， (b3) 使該細胞中的內生性DHODH基因不活化，及 (c3) 在包括尿苷的培養基中，於適合產生其中內生性DHODH基因為部分或完全不活化之細胞株的條件下培養該細胞。
- 根據請求項3至5中任一項之細胞株，其中該內生性DHODH基因及/或內生性GS基因係藉由基因編輯法使其不活化。
- 根據請求項6之細胞株，其中該內生性DHODH基因及/或內生性GS基因係藉由CRISPR-Cas9法使其不活化。
- 根據請求項1至7中任一項之細胞株，其中： - 一或多個或所有的內生性DHODH基因之等位基因為部分或完全不活化，及/或 - 一或多個或所有的內生性GS基因之等位基因為部分或完全不活化。
- 根據請求項1至8中任一項之細胞株，其中該細胞株進一步係包括： - 一表現載體，其包括編碼外生性哺乳動物DHODH之核苷酸序列(i)和至少一用於表現重組蛋白(I)之表現匣，其中該外生性DHODH係包括與SEQ ID NO: 2序列或與SEQ ID NO: 4序列至少60%相同的序列，及 - 一表現載體，其包括編碼外生性哺乳動物GS之核苷酸序列(ii)和至少一用於表現重組蛋白(II)之表現匣，其中該外生性GS係包括與SEQ ID NO: 6序列或與SEQ ID NO: 8序列至少94.5%相同的序列。
- 一種表現系統，係包括： (A) 根據請求項1至9中任一項之細胞株， (B) 一表現載體，其係包括編碼哺乳動物DHODH之核苷酸序列(i)和至少一用於表現重組蛋白(I)之表現匣，其中該DHODH係包括與SEQ ID NO: 2序列或與SEQ ID NO: 4序列至少60%相同的序列，及 (C) 一表現載體，其係包括編碼哺乳動物GS之核苷酸序列(i)和至少一用於表現重組蛋白(II)之表現匣，其中該GS係包括與SEQ ID NO: 6序列或與SEQ ID NO: 8序列至少94.5%相同的序列。
- 根據請求9之細胞株或根據請求項10之表現系統，其中該核苷酸序列(i)係包括SEQ ID NO：1序列或SEQ ID NO：3序列。
- 根據請求9或11之細胞株或根據請求項10或11之表現系統，其中該核苷酸序列(ii)係包括SEQ ID NO：5序列或SEQ ID NO：7序列。
- 根據請求項9、11和12中任一項之細胞株或根據請求項10、11或12中任一項之表現系統，其中該重組蛋白(I)和(II)為單株抗體的不同臂。
- 根據請求項9和11-13中任一項之細胞株或根據請求項10-13中任一項之表現系統，其中該載體係包括適用於選殖抗體輕鏈之第一表現匣，及適用於選殖抗體重鏈之第二表現匣。
- 一種套組，其係包括： - 根據請求項9和11-14中任一項之細胞株或根據請求項10-14中任一項之表現系統，及 - 缺乏尿苷和麩醯胺酸，進一步特言之缺乏DHODH抑制劑和GS抑制劑的培養基。
- 一種於活體外製造重組蛋白之方法，其係包括下列步驟： A) a1)提供根據請求項9和11-14中任一項之細胞株； 或 a2)提供根據請求項1至8中任一項之細胞株，及 a2’)將如請求項10至14中任一項所定義之表現載體導入步驟a2)中所提供的細胞株內； 或 a3) 提供包括內生性DHODH基因和內生性GS基因之細胞株， a3’)使步驟a3)所提供之細胞株中的內生性DHODH基因和內生性GS基因部分或完全不活化，及 a3’’)將如請求項10至14中任一項所定義的表現載體導入步驟a3’)中所得到的包括部分或完全不活化之內生性DHODH基因和部分或完全不活化之內生性GS基因的細胞株； 或 a4) 提供包括內生性GS基因和部分或完全不活化之內生性DHODH基因的細胞株， a4’) 使步驟a4)所提供的細胞株中的內生性GS基因部分或完全不活化，及 a4’’)將如請求項10至14中任一項所定義之表現載體導入步驟a4’)中所得到的包括部分或完全不活化之內生性DHODH基因和部分或完全不活化之內生性GS基因的細胞株； 或 a5) 提供包括內生性DHODH基因和部分或完全不活化之內生性GS基因的細胞， a5’) 使步驟a5)所提供的細胞株中的內生性DHODH基因部分或完全不活化，及 a5’’) 將如請求項10至14中任一項所定義之表現載體導入步驟a5’)中所得到的包括部分或完全不活化之內生性DHODH基因和部分或完全不活化之內生性GS基因的細胞株； B) 於適合生產該重組蛋白之條件下培養該細胞株；及 C) 分離及/或純化該重組蛋白。
- 根據請求項16之方法，其中步驟B)係於缺乏尿苷和麩醯胺酸，進一步特言之缺乏DHODH抑制劑和GS抑制劑的培養基中進行。
- 根據請求項16或17之方法，進一步係包括將該重組蛋白調配成醫藥組成物的步驟D)。
- 一種根據請求項9和11-14中任一項之細胞株、根據請求項10至14中任一項之表現系統、或根據請求項15之套組用於生產重組蛋白之用途。
- 根據請求項19之用途，其中該細胞株、該表現系統、或該套組係與缺乏尿苷和麩醯胺酸，特言之無DHODH抑制劑和GS抑制劑的培養基組合使用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP20306068.6 | 2020-09-21 | ||
| EP20306068 | 2020-09-21 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW202227622A true TW202227622A (zh) | 2022-07-16 |
Family
ID=72840426
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TW110134938A TW202227622A (zh) | 2020-09-21 | 2021-09-17 | 用於生產治療蛋白之高生產重組中國倉鼠卵巢細胞株之世代 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20240043878A1 (zh) |
| EP (1) | EP4214308A1 (zh) |
| JP (1) | JP2023544267A (zh) |
| KR (1) | KR20230068401A (zh) |
| CN (1) | CN116457468A (zh) |
| AU (1) | AU2021342718A1 (zh) |
| BR (1) | BR112023005002A2 (zh) |
| CA (1) | CA3195524A1 (zh) |
| IL (1) | IL301442A (zh) |
| MX (1) | MX2023003278A (zh) |
| TW (1) | TW202227622A (zh) |
| WO (1) | WO2022058603A1 (zh) |
| ZA (1) | ZA202303597B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3942054A1 (en) * | 2019-03-19 | 2022-01-26 | Sanofi | Novel selection marker-comprising cell line and uses thereof for protein production |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8717430D0 (en) | 1987-07-23 | 1987-08-26 | Celltech Ltd | Recombinant dna product |
| KR100267720B1 (ko) | 1997-12-29 | 2001-03-02 | 박호군 | 사람 글루타민 합성효소 유전자를 포함하는 발현벡터 및 이를 이용하여 동물세포에서 에리트로포이에틴을 고수율로 생산하는 방법 |
| US20030166201A1 (en) * | 2001-04-30 | 2003-09-04 | Jensen Michael C. | Selection systems for genetically modified cells |
| EP2674495A1 (en) | 2012-06-14 | 2013-12-18 | Sanofi | CHO expression system |
| AU2015334872B2 (en) | 2014-10-23 | 2021-12-16 | Sanofi | Novel selection marker for cell transfection and protein production |
| WO2020012446A1 (en) * | 2018-07-13 | 2020-01-16 | Enzene Biosciences Limited | Double knock-out cho cell line method of its generation and producing therapeutic proteins therefrom |
| EP3942054A1 (en) * | 2019-03-19 | 2022-01-26 | Sanofi | Novel selection marker-comprising cell line and uses thereof for protein production |
| EP3976799A4 (en) * | 2019-05-31 | 2023-07-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | AUXOTROPHIC PROPAGATION CELL LINE FOR THE PRODUCTION OF RECOMBINANT PROTEINS AND RELATED METHODS |
-
2021
- 2021-09-17 TW TW110134938A patent/TW202227622A/zh unknown
- 2021-09-21 IL IL301442A patent/IL301442A/en unknown
- 2021-09-21 EP EP21777795.2A patent/EP4214308A1/en active Pending
- 2021-09-21 CN CN202180074963.4A patent/CN116457468A/zh active Pending
- 2021-09-21 CA CA3195524A patent/CA3195524A1/en active Pending
- 2021-09-21 MX MX2023003278A patent/MX2023003278A/es unknown
- 2021-09-21 AU AU2021342718A patent/AU2021342718A1/en active Pending
- 2021-09-21 JP JP2023518094A patent/JP2023544267A/ja active Pending
- 2021-09-21 WO PCT/EP2021/075864 patent/WO2022058603A1/en active Application Filing
- 2021-09-21 BR BR112023005002A patent/BR112023005002A2/pt unknown
- 2021-09-21 KR KR1020237009323A patent/KR20230068401A/ko active Search and Examination
- 2021-09-21 US US18/245,872 patent/US20240043878A1/en active Pending
-
2023
- 2023-03-15 ZA ZA2023/03597A patent/ZA202303597B/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116457468A (zh) | 2023-07-18 |
| WO2022058603A1 (en) | 2022-03-24 |
| EP4214308A1 (en) | 2023-07-26 |
| BR112023005002A2 (pt) | 2023-04-18 |
| MX2023003278A (es) | 2023-04-12 |
| ZA202303597B (en) | 2024-08-28 |
| AU2021342718A1 (en) | 2023-06-08 |
| IL301442A (en) | 2023-05-01 |
| US20240043878A1 (en) | 2024-02-08 |
| CA3195524A1 (en) | 2022-03-24 |
| KR20230068401A (ko) | 2023-05-17 |
| JP2023544267A (ja) | 2023-10-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5432117B2 (ja) | 宿主細胞中の組換えタンパク質の発現を増進するための組換え発現ベクター要素（ｒＥＶＥ） | |
| EP4114940A1 (en) | Methods and compositions for modulating a genome | |
| Ho et al. | Generation of monoclonal antibody-producing mammalian cell lines | |
| US20220089775A1 (en) | Multiply auxotrophic cell line for the production of recombinant proteins and methods thereof | |
| JP2015513406A (ja) | 改変グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよびこれを用いた標的タンパク質の製造方法 | |
| EP3821027A1 (en) | Double knock-out cho cell line method of its generation and producing therapeutic proteins therefrom | |
| KR20230157387A (ko) | Cas 효소를 이용한 다중 편집 | |
| JP2023076667A (ja) | 組み換え型タンパク質の効率的な選択性 | |
| TW202227622A (zh) | 用於生產治療蛋白之高生產重組中國倉鼠卵巢細胞株之世代 | |
| RU2551229C2 (ru) | Способы селекции эукариотических клеток, экспрессирующих гетерологичный белок | |
| CN107109435B (zh) | 用于细胞转染和蛋白生产的新型选择性标记物 | |
| WO2016003368A1 (en) | Optimized vectors for the production of recombinant proteins | |
| US20220177909A1 (en) | Novel Selection Marker-Comprising Cell Line and Uses Thereof for Protein Production | |
| RU2820830C2 (ru) | Линия клеток, содержащая новый маркер отбора, и ее применение для продуцирования белков | |
| WO2024211287A1 (en) | Production cell lines with targeted integration sites | |
| Balasubramanian | Study of transposon-mediated cell pool and cell line generation in CHO cells | |
| WO2023288304A2 (en) | Context-specific adenine base editors and uses thereof | |
| BR112017003074B1 (pt) | Vetor, e, métodos de produção de uma proteína recombinante de interesse e de emprego de tunicamicina como um marcador de seleção |