JPWO2019022222A1 - 培地添加用組成物及び培地添加用化合物並びにそれらを用いた細胞又は組織の培養方法 - Google Patents
培地添加用組成物及び培地添加用化合物並びにそれらを用いた細胞又は組織の培養方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
[2]Xが、−NHCO−である、[1]記載の組成物。
[3]R2が、炭素数1〜6のアルキル基であり、nが0である、[1]または[2]に記載の組成物。
[4]R1が、−Y−W−Z−Arであり、Yが、炭素数1〜6のアルキル基を有していてもよいメチレン基であり、Wが、N(R4)であり、Zが、単結合であり、Arが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数1〜6のアルキル基または炭素数1〜6のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、[1]〜[3]のいずれかに記載の組成物。
[5]アリール基が、フェニル基である、[4]に記載の組成物。
[6]R1が、−Y−W−Z−Arであり、Yが、単結合であり、Wが、N(R4)であり、R4が、水素原子であり、Zが、単結合または炭素数1〜6のアルキル基を有していてもよいメチレン基であり、Arが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数1〜6のアルキル基または炭素数1〜6のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、[1]〜[3]のいずれかに記載の組成物。
[7]アリール基が、フェニル基である、[6]に記載の組成物。
[8]Zが、メチレン基である、[6]または[7]に記載の組成物。
[9]R1が、−Y−W−Z−Arであり、Yが、単結合であり、Wが、酸素原子であり、Zが、炭素数1〜6のアルキル基を有していてもよいメチレン基であり、Arが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数1〜6のアルキル基または炭素数1〜6のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、[1]〜[3]のいずれかに記載の組成物。
[10]アリール基が、フェニル基であり、Zが、メチレン基である、[9]に記載の組成物。
[11]化合物が、以下からなる群より選択される化合物またはその塩である、[1]〜[5]のいずれかに記載の組成物。
[15]細胞が、正常細胞株、がん細胞株および幹細胞からなる群から選択される、[14]記載の組成物。
[16]正常細胞株が、アフリカミドリザル腎臓上皮由来細胞(Vero細胞)、イヌ腎臓尿細管上皮細胞(MDCK細胞)、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞(CHO−K1)、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)またはマウス胚線維芽細胞(C3H10T1/2)である、[15]記載の組成物。
[17]がん細胞株が、ヒト卵巣がん由来細胞株SKOV3、ヒト子宮頚がん由来細胞株HeLa、ヒト悪性黒色腫由来細胞株A375、ヒト上皮様細胞がん由来細胞株A431、ヒト胃腺がん由来細胞株AGS、ヒト前立腺がん由来細胞株LNCap clone FGC、ヒト結腸腺がん由来細胞株HCT116、ヒト肺胞基底上皮腺がん由来細胞株A549、およびヒト前立腺がん由来細胞DU145からなる群から選択される1以上である、[15]記載の組成物。
[18]幹細胞が、ヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)またはヒト間葉系幹細胞(MSC)である、[15]記載の組成物。
[19]スフェア形成、オルガノイド形成、またはCyst形成の促進に用いられる、[1]〜[13]のいずれかに記載の組成物。
[20]スフェアが、がん細胞株、ヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)またはヒト間葉系幹細胞(MSC)である、[19]記載の組成物。
[21]オルガノイドが、小腸由来細胞である、[19]記載の組成物。
[22]Cystが、腎臓由来細胞である、[19]記載の組成物。
[23][1]〜[13]のいずれかに記載の培地添加用組成物を含む、培地。
[24]細胞増殖促進用である、[23]記載の培地。
[25]三次元細胞培養培地である、[23]または[24]に記載の培地。
[26]スフェア形成、オルガノイド形成、またはCyst形成の促進に用いられる、[23]記載の培地。
[27][1]〜[13]のいずれかに記載の培地添加用組成物を培地へ添加することを含む、細胞増殖を促進させる方法。
[28]細胞が、正常細胞株、がん細胞株および幹細胞からなる群から選択される、[27]記載の方法。
[29]正常細胞株が、アフリカミドリザル腎臓上皮由来細胞(Vero細胞)、イヌ腎臓尿細管上皮細胞(MDCK細胞)、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞(CHO−K1)、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)またはマウス胚線維芽細胞(C3H10T1/2)である、[28]記載の方法。
[30]がん細胞株が、ヒト卵巣がん由来細胞株SKOV3、ヒト子宮頚がん由来細胞株HeLa、ヒト悪性黒色腫由来細胞株A375、ヒト上皮様細胞がん由来細胞株A431、ヒト胃腺がん由来細胞株AGS、ヒト前立腺がん由来細胞株LNCap clone FGC、ヒト結腸腺がん由来細胞株HCT116、ヒト肺胞基底上皮腺がん由来細胞株A549、およびヒト前立腺がん由来細胞DU145からなる群から選択される1以上である、[28]記載の方法。
[31]幹細胞が、ヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)またはヒト間葉系幹細胞(MSC)である、[28]記載の方法。
[32]培地が、三次元細胞培養培地である、[27]〜[31]のいずれかに記載の方法。
[33][1]〜[13]のいずれか記載の培地添加用組成物を培地へ添加することを含む、スフェア形成、オルガノイド形成またはCyst形成を促進させる方法。
[34]スフェアが、がん細胞株、ヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)またはヒト間葉系幹細胞(MSC)である、[33]記載の方法。
[35]オルガノイドが、小腸由来細胞である、[33]記載の方法。
[36]Cystが、腎臓由来細胞である、[33]記載の方法。
[37]下記式(I)で示される化合物、またはその塩:
[38]Xが、−NHCO−である、[37]記載の化合物またはその塩。
[39]R2が、炭素数1〜6のアルキル基であり、nが0である、[37]または[38]に記載の化合物またはその塩。
[40]R1が、−Y−W−Z−Arであり、Yが、メチレン基であり、Wが、N(R4)であり、Zが、単結合であり、Arが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数1〜6のアルキル基または炭素数1〜6のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、[37]〜[39]のいずれかに記載の化合物またはその塩。
[41]アリール基が、フェニル基である、[40]に記載の化合物またはその塩。
[42]R1が、−Y−W−Z−Arであり、Yが、単結合であり、Wが、N(R4)であり、R4が、水素原子であり、Zが、単結合または炭素数1〜6のアルキル基を有していてもよいメチレン基であり、Arが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数1〜6のアルキル基または炭素数1〜6のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、[37]〜[39]のいずれかに記載の化合物またはその塩。
[43]アリール基が、フェニル基である、[42]に記載の化合物またはその塩。
[44]Zが、メチレン基である、[42]または[43]に記載の化合物またはその塩。
[45]R1が、−Y−W−Z−Arであり、Yが、単結合であり、Wが、酸素原子であり、Zが、炭素数1〜6のアルキル基を有していてもよいメチレン基であり、Arが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数1〜6のアルキル基または炭素数1〜6のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、[37]〜[39]のいずれかに記載の化合物またはその塩。
[46]アリール基が、フェニル基であり、Zが、メチレン基である、[45]に記載の化合物またはその塩。
[47]以下からなる群より選択される、[37]〜[41]のいずれかに記載の化合物またはその塩。
[51][50]に記載の培地添加用組成物を含む、培地。
[52][50]に記載の培地添加用組成物を培地へ添加することを含む、細胞増殖を促進させる方法。
[53][50]に記載の培地添加用組成物を培地へ添加することを含む、スフェア形成、オルガノイド形成またはCyst形成を促進させる方法。
[54]下記一般式(I−a)で示される化合物、またはその塩:
(2)水酸基、
(3)シアノ基、
(4)ニトロ基、
(5)カルボキシル基、
(6)アルケニル基(C2−10アルケニル基;例、ビニル、アリル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、へキセニル、ヘプテニル、ブタジエニル、ヘキサトリエニル、およびその各異性体)、
(7)アルキニル基(C2−10アルキニル基;例、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、および、その各異性体)、
(8)ハロゲノアルキル基(例、モノフルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、モノフルオロエチル、ジフルオロエチル、トリフルオロエチル、クロロメチル、クロロエチル、ジクロロエチル、およびその各異性体)、
(9)環状アルキル基(環中にヘテロ原子を含んでもよい)(例、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、アジリジニル、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル)、
(10)アリール基(例、フェニル、ナフチル)、
(11)ヘテロアリール基(例、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、フリル、チオフェニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル(例、1,2,3−トリアゾリル、1,2,4−トリアゾリル)、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル(例、1,2,3−オキサジアゾリル、1,2,4−オキサジアゾリル、1,3,4−オキサジアゾリル)、チアジアゾリル(例、1,2,3−チアジアゾリル、1,2,4−チアジアゾリル、1,3,4−チアジアゾリル)、ベンゾフリル、ベンゾチオフェニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズイミダゾリル、インダゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、プリニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、プテリジニル、イミダゾオキサゾリル、イミダゾチアゾリル、イミダゾイミダゾリル)、
(12)アルコキシ基(例、メトキシ、エトキシ、n−プロポキシ、イソプロポキシ、n−ブトキシ、イソブトキシ、sec−ブトキシ、tert−ブトキシ、n−ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、tert−ペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、2−ペンチルオキシ、3−ペンチルオキシ、n−ヘキシルオキシ、2−ヘキシルオキシ)、
(13)アルキルチオ基(例、メチルチオ、エチルチオ、n−プロピルチオ、イソプロピルチオ、n−ブチルチオ、イソブチルチオ、sec−ブチルチオ、tert−ブチルチオ、n−ペンチルチオ、イソペンチルチオ、tert−ペンチルチオ、ネオペンチルチオ、2−ペンチルチオ、3−ペンチルチオ、n−ヘキシルチオ、2−ヘキシルチオ)、
(14)アリール基(上記(10)と同義)で置換された、アルコキシ基(上記(12)と同義)、
(15)アリール基(上記(10)と同義)で置換された、アルキルチオ基(上記(13)と同義)、
(16)ヘテロアリール基(上記(11)と同義)で置換された、アルコキシ基(上記(12)と同義)、
(17)ヘテロアリール基(上記(11)と同義)で置換された、アルキルチオ基(上記(13)と同義)、
(18)環状アルキル(環中にヘテロ原子を含んでもよい)オキシ基(例、シクロプロピルオキシ、シクロブチルオキシ、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシ、テトラヒドロフラニルオキシ、テトラヒドロピラニルオキシ、アジリジニルオキシ、アゼチジニルオキシ、ピロリジニルオキシ、ピペリジニルオキシ、モルホリニルオキシ)、
(19)アリールオキシ基(例、アリール基(上記(10)と同義)が酸素原子に結合した基)、
(20)ヘテロアリールオキシ基(例、ヘテロアリール基(上記(11)と同義)が酸素原子に結合した基)、
(21)ハロゲノアルコキシ基(例、ハロゲノアルキル基(上記(8)と同義)が酸素原子に結合した基)、
(22)ハロゲノアルキルチオ基(例、ハロゲノアルキル基(上記(8)と同義)が硫黄原子に結合した基)、
(23)水酸基で置換された、アルコキシ基(上記(12)と同義)、
(24)アルコキシ基(上記(12)と同義)で置換された、アルコキシ基(上記(12)と同義)、
(25)アミノ基、
(26)アルキル基でモノまたはジ置換されたアミノ基、
ここで、「アルキル基」とは、C1−6アルキル基が挙げられ、具体的には、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、n−ペンチル、イソペンチル、tert−ペンチル、ネオペンチル、2−ペンチル、3−ペンチル、n−ヘキシル、2−ヘキシル等が挙げられる。
(27)カルバモイル基、
(28)アルキル基(上記(26)における「アルキル基」と同義)でモノまたはジ置換されたカルバモイル基(例、メチルカルバモイル、エチルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、エチルメチルカルバモイル)
(29)スルファモイル基、
(30)アルキル基(上記(26)における「アルキル基」と同義)でモノまたはジ置換されたスルファモイル基(例、メチルスルファモイル、エチルスルファモイル、ジメチルスルファモイル、ジエチルスルファモイル、エチルメチルスルファモイル)、
(31)アルカノイル基(例、水素原子若しくはアルキル基(上記(26)における「アルキル基」と同義)が炭素原子に結合したカルボニル基)、
(32)アロイル基(例、アリール基(上記(10)と同義)が炭素原子に結合したカルボニル基)、
(33)アルキルスルホニルアミノ基(例、アルキル基(上記(26)における「アルキル基」と同義)で置換されたスルホニルアミノ基)
(34)アリールスルホニルアミノ基(例、アリール基(上記(10)と同義)で置換されたスルホニルアミノ基)、
(35)へテロアリールスルホニルアミノ基(例、ヘテロアリール基(上記(11)と同義)で置換されたスルホニルアミノ基)、
(36)アシルアミノ基(例、アシル基で置換されたアミノ基)、
ここで、「アシル基」とは、C1−6アルキル基、またはC6−10アリール基を有するアシル基である。ここで、「C1−6アルキル基」とは、上記「アルキル基」のうち、炭素数が1〜6のものであり、「C6−10アリール基」とは、上記「アリール基」のうち、炭素数が6〜10のものである。アシル基としては、具体的には、アセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、イソブチロイル基、バレロイル基、イソバレロイル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、アクリロイル基、メタクリロイル基、クロトノイル基、イソクロトノイル基、ベンゾイル基、ナフトイル基等が挙げられる、
(37)アルコキシカルボニルアミノ基(例、アルコキシ基(上記(12)と同義)で置換されたカルボニルアミノ基)、
(38)アルキルスルホニル基(例、アルキル基(上記(26)における「アルキル基」と同義)で置換されたスルホニル基)、
(39)アルキルスルフィニル基(例、アルキル基(上記(26)における「アルキル基」と同義)で置換されたスルフィニル基)、
(40)アルコキシカルボニル基(例、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基)、
(41)アルキル基(C1−10アルキル基;例、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、n−ペンチル、イソペンチル、tert−ペンチル、ネオペンチル、2−ペンチル、3−ペンチル、n−ヘキシル、2−ヘキシル等)等が挙げられる。
[反応式1]
上記、kおよび100のうちのあるものは、市販品として購入が可能であり、それ以外のものも公知の合成方法に準じて合成することができる。
前記、合成方法1に準じた方法で、H2N−X−R1のうち、Xが−NHCO−であり、R1が−Y−W−Z−Arであり、WがN(R4)であり、Yが置換基を有していてもよい炭素数1〜6のアルキレン基であり、R2、R3、R4、Z、Arおよびnが前記の意味を表すヒドラジド化合物を用いることにより、式(I)に示される化合物うち、ケトン化合物およびヒドラジド化合物の組合せからなる化合物を合成することができる。
上記、ヒドラジド化合物のあるものは、市販品として購入が可能であり、それ以外のものも公知の合成方法に準じて合成することができる。
前記のケトン化合物(k)[例えば、2’,4’−ジヒドロキシ−3’−メチルプロピオフェノン(k−1)等]と、H2N−X−R1のうち、Xが単結合または−CH2COO−であり、R1が前記の意味を表す所望の一級アミン[例えば、n−オクチルアミン(A−3)等]またはその塩[例えば、グリシンエチル塩酸塩(A−1)等]を用いることにより、式(I)に示される化合物のうち、ケトン化合物およびアミン化合物の組合せからなる化合物を合成することができる。前記原料それぞれを1当量ずつ用い、トルエン、1,4−ジオキサン、N,N−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の溶媒中、100℃以上の温度範囲で、1時間から24時間反応を行なうのが好ましい。アミンの塩としては、塩酸塩、p−トルエンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩等を用いることができる。
前記のケトン化合物(k)[例えば、2’,4’−ジヒドロキシ−3’−メチルプロピオフェノン(k−1)等]を、公知の合成方法に準じて、アンモニアのメタノール溶液に溶解させ、アンモニアガスを注入しながら撹拌することで、イミン化合物(k−1’)を合成し、その後、対応するイソシアネート[例えば、フェニルイソシアネート(A−5)]と反応させることで、式(I)に示される化合物のうち、Xが−CONH−であり、R1、R2、R3およびnが前記の意味を表す、ウレア化合物を合成することができる。
本発明の組成物、培地、方法に用いる化合物は、式(I):
本発明は、本発明に用いられる化合物を有効成分として含む、培地添加用組成物(以下、「本発明の組成物」と称することがある)を提供する。本発明の組成物は、細胞培地、特に3次元細胞培養培地に添加することにより、細胞増殖の促進、スフェア形成の促進、オルガノイド形成の促進、およびCyst形成の促進のいずれかまたはこれらの任意の組合せを達成することができる。
(1)細胞増殖促進;
(2)スフェア形成促進;
(3)オルガノイド形成促進;
(4)Cyst形成促進;
(5)細胞増殖促進およびスフェア形成促進;
(6)細胞増殖促進およびオルガノイド形成促進;
(7)細胞増殖促進およびCyst形成促進;
(8)スフェア形成促進およびオルガノイド形成促進;
(9)スフェア形成促進およびCyst形成促進;
(10)オルガノイド形成促進およびCyst形成促進;
(11)細胞増殖促進、スフェア形成促進およびオルガノイド形成促進;
(12)細胞増殖促進、スフェア形成促進およびCyst形成促進;
(13)細胞増殖促進、オルガノイド形成促進およびCyst形成促進;
(14)スフェア形成促進、オルガノイド形成促進およびCyst形成促進;または、
(15)細胞増殖促進、スフェア形成促進、オルガノイド形成促進およびCyst形成促進。
本発明の組成物の培地(特に、3次元細胞培養培地)への添加により、細胞増殖促進等が達成される細胞種としては、所望の効果を得られる限り特に限定されないが、精子や卵子などの生殖細胞、生体を構成する体細胞、正常細胞株、がん細胞株、前駆細胞、幹細胞、生体から分離され人為的に遺伝子改変が成された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等の細胞種が挙げられる。なお、これらの細胞の由来も特に限定されないが、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、リス、ハムスター、ハタネズミ、カモノハシ、イルカ、クジラ、イヌ、ネコ、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ゾウ、コモンマーモセット、リスザル、アカゲザル、チンパンジー、ヒト等の哺乳動物由来の細胞が好ましい。また、細胞が由来する組織または臓器も、本発明の所望の効果を得られる限り特に限定されないが、前記組織としては、皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、脾臓、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臓、眼、脳または神経組織等の組織が挙げられるが、これらに限定されず、また、前記臓器としては、肝臓、肺、腎臓、心臓、膵臓、胃、脾臓、小腸、大腸、生殖器等の臓器が挙げられるが、これらに限定されない。なお、オルガノイド形成の促進を目的とする場合、オルガノイドは小腸由来細胞が好ましい場合がある。また、Cyst形成の促進を目的とする場合、Cystは腎臓由来細胞が好ましい場合がある。
本発明は、本発明に用いられる化合物または本発明の組成物を含む、培地(以下、「本発明の培地」と称することがある)を提供する。本発明の培地を用いることにより、細胞増殖の促進、スフェア形成の促進、オルガノイド形成の促進、およびCyst形成の促進のいずれかまたはこれらの任意の組合せを達成することができる。なお、本発明の培地は、特に3次元細胞培養培地であることが好ましい。
本発明は、本発明に用いられる化合物または本発明の組成物を培地へ添加することを含む、細胞増殖を促進する方法、スフェア形成を促進する方法、オルガノイド形成を促進する方法、またはCyst形成を促進する方法(以下、これらをまとめて、「本発明の方法」と称することがある)を提供する。
(材料と方法)
以下に図示されるケトン4種[1−(2,4−ジヒドロキシ−3−メチルフェニル)プロパン−1−オン(以下、k−1と略称する。)、1−(2,4−ジヒドロキシ−3−メチルフェニル)エタン−1−オン(以下、k−2と略称する。)、1−(2,4,6−トリヒドロキシ−3−メチルフェニル)プロパン−1−オン(以下、k−3と略称する。)、1−(2,4−ジヒドロキシ−3−メチルフェニル)−3−メチルブタン−1−オン(以下、k−5と略称する。)]及びヒドラジド10種[2−(フェニルアミノ)アセトヒドラジド(以下、H−1と略称する。)、2−(o−トリルアミノ)アセトヒドラジド(以下、H−2と略称する。)、2−(m−トリルアミノ)アセトヒドラジド(以下、H−3と略称する。)、2−(p−トリルアミノ)アセトヒドラジド(以下、H−4と略称する。)、2−[(4−フルオロフェニル)アミノ]アセトヒドラジド(以下、H−5と略称する。)、2−(ナフタレン−1−イルアミノ)アセトヒドラジド(以下、H−6と略称する。)、2−(フェニルアミノ)ブタンヒドラジド(以下、H−7と略称する。)、2−[(4−エトキシフェニル)アミノ]アセトヒドラジド(以下、H−9と略称する。)、2−[(4−ヒドロキシフェニル)アミノ]アセトヒドラジド(以下、D−2と略称する。)、2−[(2−ヒドロキシフェニル)アミノ]アセトヒドラジド(以下、D−4と略称する。)]より化合物を合成した。
[第1表]
2,4,6−トリヒドロキシベンズアルデヒド(2.22g、14.4mmol)をTHF(40mL)に溶解させ、氷冷下NaBH3CN(2.7g、43mmol)、酢酸(8mL)を加えて室温で2時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチル(50mL)で希釈し、水(50mLx2)、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(50mL)、ブライン(50mL)で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル50g、酢酸エチル/ヘキサン=20/80〜50/50)で精製し、中間化合物(1.20g、8.56mmol、収率59%)を白色固体として得た。
2−ブロモ酪酸メチル(8.0g、44mmol)、アニリン(8.0mL、88mmol)をトルエン(10mL)に溶解させ、5時間加熱還流した。放冷後、反応溶液を水(30mL)、2M塩酸(25mL)、水(30mL)、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(30mL)、ブライン(30mL)で順次洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル100g、酢酸エチル/ヘキサン=1/99〜10/90)で精製し、中間化合物(5.11g、26.4mmol、収率60%)を黄色液体として得た。
上記のようにして得られた中間化合物(5.11g、26.4mmol)をメタノール(26mL)に溶解させ、ヒドラジン・1水和物(12.8mL、264mmol)を加えて室温で4.5時間撹拌した。水(150mL)を加えて、塩化メチレン(30mLx5)で抽出した。有機層を飽和食塩水(100mL)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた固体をIPEで洗浄し、H−7(4.60g、23.8mmol、収率90%)を白色固体として得た。
k−1(100mg、0.555mmol)、H−1(110mg、0.666mmol)をDMSO(1.1mL)に溶解させ、100℃で14時間撹拌した。放冷後、蒸留水(11mL)を加え、再度100℃で撹拌後、熱時ろ過してk−1:H−1(70.1mg、0.214mmol、収率39%)を薄黄色固体として得た。
k−1(50mg、0.28mmol)、H−2(69mg、0.33mmol)をDMSO(0.55mL)に溶解させ100℃で18時間撹拌した。放冷後、蒸留水(6mL)を加えてデカンテーションし、残った固体を塩化メチレン、酢酸エチルで順次洗浄した。得られた残渣をDMSO(0.2mL)に溶解させ、水を加えて析出した固体をメタノールで洗浄し、k−1:H−2(19.6mg、0.0574mmol、収率21%)を薄橙色固体として得た。
k−1(100mg、0.555mmol)、H−3(119mg、0.666mmol)をDMSO(1.1mL)に溶解させ100℃で14時間撹拌した。同温で蒸留水(11mL)を加えて放冷後、析出した固体をろ取、メタノールで洗浄してk−1:H−3(98.9mg、0.290mmol、収率52%)を白色固体として
得た。
k−1(50mg、0.28mmol)、H−4(65mg、0.36mmol)をDMSO(0.55mL)に溶解させ100℃で19時間撹拌した。放冷後、蒸留水(6mL)を加えて析出した固体をろ取、酢酸エチルで洗浄してk−1:H−4(28.6mg、0.0838mmol、収率30%)を薄黄色固体として得た。
k−1(100mg、0.555mmol)、H−5(122mg、0.666mmol)をDMSO(1.1mL)に溶解させ100℃で14時間撹拌した。同温で蒸留水(11mL)を加えて放冷後、析出した固体をろ取、メタノールで洗浄してk−1:H−5(55.6mg、0.161mmol、収率29%)を薄黄色固体として得た。
k−1(100mg、0.555mmol)、H−6(143mg、0.666mmol)をDMSO(1.1mL)に溶解させ100℃で14時間撹拌した。放冷後、蒸留水(11mL)を加えて析出した固体をろ取、塩化メチレンで洗浄してk−1:H−6(86.5mg、0.229mmol、収率41%)を茶色固体として得た。
k−1(50mg、0.28mmol)、H−7(54mg、0.28mmol)をDMSO(0.55mL)に溶解させ100℃で17時間撹拌した。放冷後、蒸留水(6mL)を加えてデカンテーションし、残渣を塩化メチレン(0.5mL)に溶解させた。ヘキサン(0.5mL)を加えて析出した固体をろ取してk−1:H−7(56.8mg、0.160mmol、収率57%)を白色固体として得た。
k−1(150mg、0.83mmol)、H−9(226mg、1.08mmol)をDMSO(0.55mL)に懸濁させ100℃で17時間撹拌した。放冷後、蒸留水(20mL)を加えてデカンテーションし、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル10g、酢酸エチル/ヘキサン=10/90〜60/40)で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してk−1:H−9(40.2mg、0.108mmol、収率13%)を白色固体として得た。
k−2(80mg、0.48mmol)、H−1(95.4mg、0.578mmol)をDMSO(1.0mL)に溶解させ100℃で15時間撹拌した。放冷後、蒸留水(10mL)を加えて析出した固体をろ取、塩化メチレンで洗浄してk−2:H−1(80.4mg、0.257mmol、収率53%)を黄色固体として得た。
k−2(80mg,0.48mmol)、H−2(112mg、0.625mmol)をDMSO(1mL)に溶解させ100℃で19時間撹拌した。放冷後、蒸留水(30mL)、酢酸エチル(30mL)を加えて分液し、有機層を飽和食塩水(30mL)で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル10g、酢酸エチル/ヘキサン=10/90〜80/20)で精製してk−2:H−2(34mg、0.10mmol、収率21%)を薄黄色固体として得た。
k−2(80mg、0.48mmol)、H−3(104mg、0.578mmol)をDMSO(1mL)に溶解させ100℃で15時間撹拌した。放冷後、蒸留水(10mL)を加えてデカンテーションし、得られた残渣を塩化メチレン(3mL)に溶解させ、ヘキサン(3mL)を加えて析出した固体をろ取した。得られた固体を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル10g、酢酸エチル/ヘキサン=50/50〜80/20)で精製してk−2:H−3(46.9mg、0.143mmol、収率30%)を薄黄色固体として得た。
k−2(80mg、0.48mmol)、H−4(112mg、0.625mmol)をDMSO(1mL)に溶解させ100℃で19時間撹拌した。放冷後、蒸留水(10mL)を加えてデカンテーションし、残渣を塩化メチレンで洗浄してk−2:H−4(58.7mg、0.179mmol、収率37%)を薄黄色固体として得た。
k−2(80mg、0.48mmol)、H−5(106mg、0.578mmol)をDMSO(1mL)に溶解させ100℃で15時間撹拌した。放冷後、蒸留水(10mL)を加えてデカンテーションし、得られた残渣を塩化メチレン(3mL)に溶解させ、ヘキサン(1mL)を加えて析出した固体をろ取した。得られた固体を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル10g、酢酸エチル/ヘキサン=50/50〜80/20)で精製してk−2:H−5(36.6mg、0.110mmol、収率23%)を白色固体として得た。
k−2(100mg、0.602mmol)、H−6(155mg、0.722mmol)をDMSO(1mL)に溶解させ100℃で15時間撹拌した。放冷後、蒸留水(10mL)を加えてデカンテーションし、得られた残渣を塩化メチレンで洗浄してk−2:H−6(59.3mg、0.163mmol、収率27%)を薄茶色固体として得た。
k−2(80mg、0.48mmol)、H−7(121mg、0.626mmol)をDMSO(0.55mL)に溶解させ100℃で17時間撹拌した。放冷後、蒸留水(20mL)、酢酸エチル(20mL)を加えて分液し、有機層を飽和食塩水(20mL)で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル10g、酢酸エチル/ヘキサン=5/95〜50/50)で精製してk−2:H−7(109mg、0.319mmol、収率66%)を薄黄色固体として得た。
k−2(100mg、0.60mmol)、H−9(164mg,0.784mmol)をDMSO(1.2mL)に懸濁させ100℃で18時間撹拌した。放冷後、蒸留水(12mL)、酢酸エチル(20mL)を加えて分液し、有機層を飽和食塩水(20mL)で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル10g、酢酸エチル/ヘキサン=10/90〜60/40)で精製し、得られた固体を塩化メチレンで洗浄してk−2:H−9(63.1mg、0.177mmol、収率30%)を薄黄色固体として得た。
k−3(200mg、1.02mmol)、H−1(253mg、1.53mmol)をDMSO(2.0mL)に溶解させ100℃で3日撹拌した。放冷後、蒸留水(15mL)を加えてデカンテーションし、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル30g、酢酸エチル/ヘキサン=40/60〜70/30)で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してk−3:H−1(25.0mg,0.0728mmol、収率7.1%)を薄茶色固体として得た。
k−3(200mg、1.02mmol)、H−2(237mg、1.33mmol)をDMSO(2mL)に溶解させ100℃で4日撹拌した。放冷後、蒸留水(15mL)を加えて析出した固体をろ取し、メタノールで洗浄した。得られた固体を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル30g、酢酸エチル/ヘキサン=40/60〜70/30)で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してk−3:H−2(10.3mg、0.0288mmol、収率2.8%)を薄茶色固体として得た。
k−3(200mg、1.02mmol)、H−3(219mg、1.22mmol)をDMSO(2mL)に溶解させ100℃で5日撹拌した。放冷後、蒸留水(15mL)を加えて析出した固体をろ取し、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル30g、酢酸エチル/ヘキサン=40/60〜70/30)で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してk−3:H−3(17.9mg、0.0501mmol、収率4.9%)を薄茶色固体として得た。
k−3(200mg、1.02mmol)、H−4(237mg、1.33mmol)をDMSO(2mL)に溶解させ100℃で4日撹拌した。放冷後、蒸留水(15mL)を加えて析出した固体をろ取し、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル30g、酢酸エチル/ヘキサン=40/60〜70/30)で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してk−3:H−4(17.9mg、0.0501mmol、収率4.9%)を薄茶色固体として得た。
k−3(200mg、1.02mmol)、H−5(224mg、1.22mmol)をDMSO(2mL)に溶解させ100℃で6日撹拌した。放冷後、蒸留水(15mL)を加えてデカンテーションし、得られた残渣を塩化メチレン(3mL)に溶解させ、ヘキサン(1mL)を加えて析出した固体をろ取し、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル30g、酢酸エチル/ヘキサン=40/60〜70/30)で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してk−3:H−5(13.7mg、0.0379mmol、収率3.7%)を薄茶色固体として得た。
k−3(100mg、0.510mmol)、H−6(121mg、0.561mmol)をDMSO(2mL)に溶解させ100℃で4日撹拌した。放冷後、蒸留水(15mL)を加えてデカンテーションし、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル30g、酢酸エチル/ヘキサン=40/60〜70/30)で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してk−3:H−6(17.0mg、0.0432mmol、収率8.5%)を橙色固体として得た。
k−3(200mg、1.02mmol)、H−7(256mg、1.33mmol)をDMSO(2mL)に溶解させ100℃で3日撹拌した。放冷後、蒸留水(15mL)を加えてデカンテーションし、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル30g、酢酸エチル/ヘキサン=40/60〜70/30)で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄しk−3:H−7(28.3mg、0.762mmol、収率7.5%)を白色固体として得た。
k−3(200mg,1.02mmol)、H−9(277mg、1.33mmol)をDMSO(2mL)に溶解させ100℃で4日撹拌した。放冷後、蒸留水(15mL)を加えて析出した固体をろ別し、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル30g、酢酸エチル/ヘキサン=40/60〜70/30)で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してk−3:H−9(11.2mg、0.0289mmol、収率2.8%)を薄茶色固体として得た。
k−5(100mg、0.48mmol)、H−1(95.2mg、0.576mmol)をDMSO(1mL)に溶解させ100℃で4日撹拌した。放冷後、蒸留水(10mL)を加えて析出した固体をろ取し、塩化メチレン、メタノールで順次洗浄してk−5:H−1(38.1mg、0.107mmol、収率22%)を黄色固体として得た。
k−5(100mg、0.48mmol)、H−2(112mg、0.625mmol)をDMSO(1mL)に溶解させ100℃で3日撹拌した。蒸留水(10mL)を加えてデカンテーションし、残渣を塩化メチレン(2mL)に溶解させ、芒硝乾燥した。ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣に塩化メチレン(1mL)を加え、超音波に晒して析出した固体をろ取してk−5:H−2(18.6mg、0.0503mmol、収率10%)を黄色固体として得た。
k−5(100mg、0.480mmol)、H−3(103mg、0.576mmol)をDMSO(1mL)に溶解させ100℃で4日撹拌した。放冷後、蒸留水(10mL)を加えて析出した固体をろ取し、塩化メチレンで洗浄してk−5:H−3(44.6mg、0.121mmol、収率25%)を黄色固体として得た。
k−5(100mg,0.480mmol)、H−4(112mg,0.625mmol)をDMSO(1mL)に溶解させ100℃で3日撹拌した。蒸留水(10mL)を加えて析出した固体をろ取し、塩化メチレンで洗浄してk−5:H−4(44.4mg、0.120mmol、収率25%)を黄色固体として得た。
k−5(100mg、0.480mmol)、H−5(106mg、0.576mmol)をDMSO(2mL)に溶解させ100℃で4日撹拌した。放冷後、蒸留水(10mL)を加えて析出した固体をろ取してk−5:H−5(37.4mg、0.100mmol、収率21%)を黄色固体として得た。
k−5(100mg、0.480mmol)、H−6(124mg、0.576mmol)をDMSO(1mL)に溶解させ100℃で5日撹拌した。放冷後、蒸留水(10mL)を加えて析出した固体をろ取し、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル10g、酢酸エチル/ヘキサン=20/80〜50/50)で精製した。得られた固体をメタノールで洗浄してk−5:H−6(28.1mg、0.0693mmol、収率14%)を薄黄色固体として得た。
k−5(100mg、0.480mmol)、H−7(121mg、0.626mmol)をDMSO(1mL)に溶解させ100℃で4日撹拌した。放冷後、蒸留水(10mL)を加えて析出した固体をろ取し、酢酸エチル、塩化メチレン、メタノールで順次洗浄してk−5:H−7(43.6mg、0.114mmol、収率24%)を白色固体として得た。
k−5(150mg、0.72mmol)、H−9(196mg、0.937mmol)をDMSO(1.4mL)に懸濁させ100℃で3日撹拌した。放冷後、蒸留水(12mL)、塩化メチレン(20mL)を加えて分液し、有機層を飽和食塩水(20mL)で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル10g、酢酸エチル/ヘキサン=10/90〜50/50)で精製しk−5:H−9(72.0mg、0.180mmol、収率25%)を薄黄色固体として得た。
[第3表]
本発明に用いられる化合物を3次元培地に添加した際の細胞の増殖促進効果を検討した。具体的には、前培養(接着培養)したSKOV3細胞(ヒト卵巣がん由来細胞株)を回収し、3次元細胞培養培地(「FCeM(登録商標)」(日産化学株式会社))に懸濁し、細胞懸濁液を調製した。該細胞懸濁液を384ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3827)のウェルに1ウェル当たり1000 cells/40μL/ウェルになるように播種した。プレートに播種された細胞懸濁液を37℃、5%CO2下で一晩静置した。次いで、本発明に用いられる化合物のDMSO希釈溶液を、終濃度5μM(または、5μMおよび10μMの2段階)となるように4.44μLを添加した(添加後撹拌なし)。各化合物の添加後、37℃、5%CO2下で4日間静置培養した。5日目の培養液に対してATP試薬44.4μL(CellTiter−Glo(登録商標)Luminescent Cell Viability Assay, Promega社製)を添加し懸濁させ、15分間室温で静置した。FlexStation3(Molecular Devices社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、細胞増殖を評価した。
特許文献1(WO2014/017513)の方法に従い、0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG−LA、三昌株式会社製)及び15%(v/v)FBS、100ng/mLヒトHB−EGF(PEPROTECH社製)を含有するMcCoy’s5a培地(シグマアルドリッチ社製)の組成物をホモミキサーにて調製した。また、対照として、脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。次いで、ヒト卵巣がん細胞株SKOV3(DSファーマバイオメディカル社製)を上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に懸濁した後、384ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3827)のウェルに1ウェル当たり1000 cells/40μL/ウェルになるように分注した(3次元培養(3D))。単層培養(2D)は、ヒト卵巣がん細胞株SKOV3を上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に懸濁した後、384ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製、#3712)のウェルに1ウェル当たり400個/40μLになるように分注した。各プレートはCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養した。培養1日目に、ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解した本発明に用いられる化合物を終濃度0、0.5、1、5、10、20μMになるように、それぞれ4.4μLずつ添加し、引き続き培養を4日間継続した。5日目の培養液に対してATP試薬44.4μL(CellTiter−Glo(登録商標)Luminescent Cell Viability Assay, Promega社製)を添加し懸濁させ、15分間室温で静置した後、FlexStation3(Molecular Devices社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。化合物無添加のRLU値(ATP測定、発光強度)を100%としたときの、それぞれの化合物添加時の相対値を第7表に示す。本試験の結果、SKOV3細胞を3次元培養(3D)した条件において、k−1:H−7およびk−1:H−10が幅広い濃度で細胞増殖促進作用を示し、さらにSKOV3細胞は培地内でスフェアを形成していた。一方、SKOV3細胞を単層培養(2D)下で培養した場合は、k−1:H−7およびk−1:H−10を培地に添加しても、良好な細胞増殖促進効果は見られなかった。
特許文献1(WO2014/017513)の方法に従い、0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG−LA、三昌株式会社製)及び15%(v/v)FBS、30ng/mLヒトEGF(PEPROTECH社製)を含有するMcCoy’s5a培地(シグマアルドリッチ社製)の組成物をFCeM−series Preparation Kit(和光純薬工業社製)にて調製した。また、単層培養として、脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。次いで、ヒト卵巣がん細胞株SKOV3(DSファーマバイオメディカル社製)を上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に懸濁した後、384ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3827)のウェルに1ウェル当たり1000 cells/36μL/ウェルになるように分注した(3次元培養(3D))。単層培養(2D)は、ヒト卵巣がん細胞株SKOV3を上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に懸濁した後、384ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製、#3712)のウェルに1ウェル当たり400cells/36μLになるように分注した。分注後に、ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解した本発明に用いられる化合物を終濃度0、1、5、10、20μMになるように、それぞれ4μLずつ添加した。各プレートはCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で4日間培養した。4日目の培養液に対してATP試薬40μL(CellTiter−Glo(登録商標)Luminescent Cell Viability Assay、Promega社製)を添加し、15分間プレートシェーカー(アズワン社製、Micro plate mixer NS−P)で室温にて撹拌した後、EnSpire(Perkin Elmer社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。化合物無添加のRLU値(ATP測定、発光強度)を100%としたときの、それぞれの化合物添加時の相対値を第8表に示す。
マウス小腸約20cmを摘出し、氷上で脂肪組織及び血管組織を取り除いた後、PBSで内容物を十分に洗浄、ハサミで切り開き2mm程度に断片化した。15mLのPBSで20回洗浄し、上清を除去後、25mLのGentle Cell Dissociation Reagent(STEMCELL社製)を添加し20rpmで撹拌しながら15分間室温にてインキュベーションした。上清を除去後、沈殿物に10mLの冷0.1% BSA/PBSを添加し3回ピペッティングを行い、上清を70μmセルストレイナー(BD Bioscience社製)で濾過し、ろ液を回収した。残った沈殿物へ同様に0.1% BSA/PBSの添加とピペッティング、濾過を3回繰り返し、ろ液を4段階分調製した。各ろ液を4℃、290gにて5分間遠心し、上清除去後、10mLの冷0.1% BSA/PBSで再度懸濁し、4℃、200gにて3分間遠心した。上清を除去後、10mLのDMEM/F12(和光純薬社製)を添加して懸濁し、1mLを分取して顕微鏡下で観察し、小腸断片(陰窩、Crypt)が十分にあるろ液を選択し、Crypt数を血球計算板にて計数した。細胞懸濁液と等量の冷Matrigel(登録商標)Matrix GFR(Corning社製)を添加、混合し、すばやく37℃に温めておいた24ウェルプレートに500crypts/50μL/ウェルとなるよう分注した。プレートを37℃で10分間静置し、ゲル化を完了させ、各ウェルに750μLのIntestiCult(登録商標)Organoid Growth Medium(STEMCELL TECHNOLOGIES社製)を添加し、さらにDMSOに溶解した本発明に用いられる化合物を終濃度5μMになるよう加えた。コントロールとして化合物未添加のウェルを作成した。7日間培養後、形成された小腸オルガノイドの数と直径を顕微鏡下で計測し、無添加(対照)と比較したものを第9表に示す。本試験の結果、k−1:H−7がマウスの小腸オルガノイド培養においてオルガノイド形成を促進することが明らかになった。この際、オルガノイドの直径は大きく変わっておらず、k−1:H−7の添加によりCryptからのオルガノイド形成率が向上した。
各種ヒト由来がん細胞を下記の通り各々の培地にて前培養(単層培養)を行った。ヒト子宮頸がん由来細胞株HeLa(American Type Culture Collection(以下、ATCCと記載する。)社製、10%ウシ胎児血清(FBS、Corning社製)含有Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(以下、DMEMと略称する。)(和光純薬工業社製))、ヒト悪性黒色腫由来細胞株A375(ATCC社製、10%FBS含有DMEM)、ヒト上皮様細胞がん由来細胞株A431(ATCC社製、10% FBS及び1%MEM非必須アミノ酸溶液(MEM Non−Essential Amino Acids solution(以下、NEAAと略称する。)(和光純薬工業社製))含有Eagle's Minimum Essential Medium(以下、EMEMと略称する。)(和光純薬工業社製))、ヒト胃腺がん由来細胞株AGS(DSファーマバイオメディカル社製、10%FBS含有Ham's F−12(和光純薬工業社製))、ヒト前立腺がん由来細胞株LNCaP clone FGC(ATCC社製、10%FBS含有RPMI1640(和光純薬工業社製))、ヒト結腸腺がん由来細胞株HCT116(DSファーマバイオメディカル社製、10%FBS含有McCoy’s 5A Medium(シグマアルドリッチ社製))、ヒト肺胞基底上皮腺がん由来細胞株A549(DSファーマバイオメディカル社製、10%FBS含有DMEM)、ヒト前立腺がん由来細胞DU145(ATCC社製、10%FBS含有EMEM)。対数増殖期にある上記細胞をPBS洗浄後、接着細胞は0.25w/v%トリプシン−1mmol/L EDTA(エチレンジアミン四酢酸)溶液(和光純薬工業社製)を添加して37℃にて1〜5分間インキュベートして剥離し、各々の培地を添加、遠心して同培地で再懸濁後、各々単細胞にて回収した。
各種ヒト由来がん細胞を下記の通り各々の培地にて前培養(単層培養)を行った。ヒト卵巣がん細胞株SKOV3(DSファーマバイオメディカル社製、15%ウシ胎児血清(FBS、Corning社製)含有McCoy’s5a培地(シグマアルドリッチ社製))、ヒト肺胞基底上皮腺がん由来細胞株A549(DSファーマバイオメディカル社製、10%FBS含有DMEM(和光純薬工業社製))、ヒト子宮頸がん由来細胞株HeLa(ATCC社製、10%FBS含有DMEM)、ヒト悪性黒色腫由来細胞株A375(ATCC社製、10%FBS含有DMEM)、ヒト上皮様細胞がん由来細胞株A431(ATCC社製、10% FBS及び1%MEM非必須アミノ酸溶液(MEM NEAA、和光純薬工業社製)含有EMEM(和光純薬工業社製))、ヒト胃腺がん由来細胞株AGS(DSファーマバイオメディカル社製、10%FBS含有Ham's F−12(和光純薬工業社製))、ヒト前立腺がん由来細胞DU145(ATCC社製、10%FBS含有EMEM)。対数増殖期にある上記細胞をPBS洗浄後、接着細胞は0.25w/v %トリプシン−1mmol/L EDTA(エチレンジアミン四酢酸)溶液(和光純薬工業社製)を添加して37℃にて1〜5分間インキュベートして剥離し、各々の培地を添加、遠心して同培地で再懸濁後、各々単細胞にて回収した。
イヌ腎臓尿細管上皮細胞(MDCK細胞、DSファーマバイオメディカル社製)を10% FBS及び1% NEAA含有EMEM培地にて前培養した。冷Matrigel(登録商標)Matrix GFR(Corning社製)を24穴プレートに50μLずつ塗り広げ、37℃にて15分間インキュベートし固化させた。前述のMDCK細胞を20000 cells/mL濃度で培地に懸濁し、さらに冷Matrigel(登録商標)Matrix GFRを20μL/mL加えて1mL/ウェルにて播種した。終濃度10μMとなるように培地に溶解した本発明に用いられる化合物を添加し、37℃、5%CO2の条件下、インキュベーターにて7日間培養した。対照(化合物無添加)として、DMSOを終濃度0.1%となるよう添加した。7日後、PBSで洗浄後(1mL/ウェル)、4% Paraformaldehyde/PBS(和光純薬社製)を添加し(1mL/ウェル)、室温にて20分間固定した。その後、上清を除去し、IFバッファー(0.2%TritonX−100(シグマアルドリッチ社製)、0.05% Tween20(シグマアルドリッチ社製)含有PBS)を1mL/ウェル添加し30分間静置し、除去した。浸透化バッファー(0.5% Triton X−100(シグマアルドリッチ社製)/PBS)を1mL/ウェル添加し、室温で30分間インキュベートした。上清を除去し、IFバッファーにて5分置きに3回洗浄し、ブロッキングバッファー(1%BSA(シグマアルドリッチ社製)/IFバッファー)を0.5mL/ウェル添加して30分間インキュベートした。上清を除去し、ブロッキングバッファーに抗βカテニン抗体(BD Bioscience社製)を100倍希釈して250μL/ウェルで添加し、4℃、遮光にて一晩インキュベートした。翌日、IFバッファーで5分置きに3回洗浄し、ブロッキングバッファーに2次抗体(Alexa Fluor 555、Thermo Fisher Scientific社製)とPhalloidin(Alexa Fluor 488、Thermo Fisher Scientific社製)を各々250倍希釈し250μL/ウェルにて添加し、室温、遮光下で60分間インキュベートした。IFバッファーで5分置きに3回洗浄後、VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI(Vector Laboratories社製)を滴下し蛍光顕微鏡(ArrayScan、Thermo Fisher Scientific社製)にて観察及び解析を行った。
イヌ腎臓尿細管上皮細胞(MDCK細胞、DSファーマバイオメディカル社製)を10% FBS及び1% NEAA含有EMEM培地にて前培養した。冷Matrigel(登録商標)Matrix GFR(Corning社製)を24穴プレートに50μLずつ塗り広げ、37℃にて15分間インキュベートし固化させた。前述のMDCK細胞を10000 cells/mLで培地に懸濁し、さらに冷Matrigel(登録商標)Matrix GFRを20μL/mL加えて1mL/ウェルにて播種した。終濃度5μM及び10μMとなるように培地に溶解した本発明に用いられる化合物を添加し、37℃、5%CO2の条件下、インキュベーターにて6日間培養した。対照(化合物無添加)として、DMSOを終濃度0.1%となるよう添加した。6日後、Cell3iMager(スクリーン社製)にて形成したCystの大きさ及び個数を測定した。全体のCystのうち、70μm以上のCystの割合を第14表に示す。
ヒト間葉系幹細胞(hMSC、東洋紡社製)を、MF−medium間葉系幹細胞増殖培地(東洋紡社製)を用いた単層培養法(2D)にて前培養した。3次元培養法(3D)では、脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物にhMSCを懸濁した後、6ウェル平底超低接着表面プレート(コーニング社製、#3471)に1.2×105 cells/2mL/ウェルとなるように播種した。2Dでは、hMSCを脱アシル化ジェランガム不含培地組成物に懸濁した後、6ウェル平底プレート(コーニング社製、#3516)に4.0×104 cells/2mL/ウェルとなるように播種した。引き続き、終濃度10μMとなるように、培地に溶解した本発明に用いられる化合物の溶液を添加し、37℃、5% CO2インキュベーターにて7日間培養した。対照として、DMSOを終濃度0.1%となるよう添加した。7日後、3次元培養法ではウェルから細胞を回収し、PBSで洗浄して上清を除去後、トリプシン0.25 w/v %トリプシン−1mmol/L EDTA(エチレンジアミン四酢酸)溶液(和光純薬工業社製)を添加して37℃にて2〜5分間インキュベートしてスフェアを単細胞に分散させ、培地を添加、遠心して上清を除去した。その後、同培地で再懸濁した後、一部をトリパンブルー(和光純薬工業社製)で懸濁して全自動セルカウンターTC20(BIO−RAD社製)にて生細胞数をカウントした。
骨髄由来ヒト間葉系幹細胞(BM−hMSC、プロモセル社製)を、間葉系幹細胞増殖培地(プロモセル社製)を用いた単層培養法(2D)にて前培養した。3次元培養法(3D)では、脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物にhMSCを懸濁した後、96ウェル平底超低接着表面プレート(コーニング社製、#3474)に6000 cells/90μL/ウェルとなるように播種した。また、EZSPHEREを用いた3次元培養法(EZSPHERE)では、hMSCを脱アシル化ジェランガム不含培地組成物に懸濁した後、96ウェルEZSPHEREプレート(旭テクノグラス社製、#4860−900)に2000cells/90μL/ウェルとなるように播種した。2Dでは、hMSCを脱アシル化ジェランガム不含培地組成物に懸濁した後、96ウェル平底プレート(コーニング社製、#3585)に2000cells/90μL/ウェルとなるように播種した。引き続き、終濃度1μM、5μM、10μM及び20μMとなるように、培地に溶解した本発明に用いられる化合物を10μL/ウェル添加し、37℃、5% CO2インキュベーターにて4日間培養した。対照として、DMSOを終濃度0.1%となるよう添加した。4日後、培養液に対してATP試薬100μL(CellTiter−Glo(登録商標)Luminescent Cell Viability Assay、 Promega社製)を添加し、2分間プレートシェーカー(アズワン社製、Micro plate mixer NS−P)で室温にて撹拌し、10分間室温にて静置した後、Enspire(Perkin Elmer社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。化合物無添加のRLU値(ATP測定、発光強度)を100%としたときの、それぞれの化合物添加時の相対値を算出し、その結果を第17表に示す。
マウス胚線維芽細胞C3H10T1/2(DSファーマバイオメディカル社製)は、10(v/v)%FBS(Corning社製)とL−グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン安定化溶液(Sigma−Aldrich社製)を含むBME培地(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用いて培養を行った。対数増殖期にある上記細胞をPBSにて洗浄後、0.25w/v %トリプシン−1mmol/L EDTA(エチレンジアミン四酢酸)溶液(和光純薬工業社製)を添加して37℃にて3分間インキュベートして剥離し、培地を添加、遠心して上清を除去した。
ヒト上皮様細胞がん由来細胞株A431(ATCC社製)は、10% FBS及び1%MEM非必須アミノ酸溶液(MEM NEAA、和光純薬工業社製)含有EMEM(和光純薬工業社製))を用いて培養を行った。また、骨髄由来ヒト間葉系幹細胞(BM−hMSC、プロモセル社製)は、間葉系幹細胞増殖培地(プロモセル社製)を用いて培養を行った。対数増殖期にあるそれぞれの上記細胞をPBSにて洗浄後、0.25w/v %トリプシン−1mmol/L EDTA(エチレンジアミン四酢酸)溶液(和光純薬工業社製)を添加して37℃にて3分間インキュベートして剥離し、培地を添加、遠心して上清を除去した。
引き続き、それぞれの細胞を上記培地に100000 cells/2mLとなるように懸濁し、更にDMSOに溶解させた本発明に用いられる化合物を、終濃度5μMとなるように培地に添加した。本細胞懸濁液を3.5cmディッシュ(ファルコン社製、#351008)のフタの裏面に10μLずつ15滴播種し、液滴を作成した。この際、対照としてはDMSOを添加した培地(DMSO終濃度0.05%)を10μLずつ15滴播種した。このフタを2mLのPBSを添加した3.5cmディッシュに戻し、37℃、5%CO2インキュベーターにて2日間培養した。培養した液滴を1.5mLのチューブに回収し、最終容量が150μLになるように培地を添加した。更にATP試薬150μL(CellTiter−Glo(登録商標)Luminescent Cell Viability Assay、Promega社製)を添加し縣濁させ、10分間室温で静置した後、Enspire(Perkin Elmer社製)にて発光強度(RLU値)を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。化合物無添加のRLU値(ATP測定、発光強度)を100%としたときの、それぞれの化合物添加時の相対値を第19表及び第20表に示す。
hiPS細胞株253G1(理化学研究所より分譲)は、ビトロネクチンVTN−N(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)をコーティングしたディッシュ上にてmTeSR1(登録商標)培地(ステムセルテクノロジーズ社製)を用いて培養を行った。増殖期にある上記細胞をPBS(富士フイルム和光純薬社製)にて洗浄後、TrypLE Select(登録商標)(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を添加して37℃にて3分間インキュベートして剥離液を除去した後、培地を添加してピペッティングにより剥離した。この後、遠心して上清を除去した。
ヒト臍帯静脈内皮細胞(PromoCell社製)をEndothelial Cell Growth Medium(PromoCell社製)培地にて前培養(単層培養)を行った。対数増殖期にある上記細胞をPBS洗浄後、接着細胞はDetachKit(PromoCell社製)を添加して37℃にて3分間インキュベートして剥離し、培地を添加、遠心して同培地で再懸濁した。
各種動物細胞株を下記の通り各々の培地にて前培養(単層培養)を行った。チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株CHO−K1(DSファーマバイオメディカル社製、10%ウシ胎児血清(FBS、Corning社製)含有Ham’s F−12培地(富士フイルム和光純薬社製))、アフリカミドリザル腎臓上皮由来細胞株Vero(JCRB細胞バンクより分譲、5%FBS含有Medium199培地(Life Technologies社製))。対数増殖期にある上記細胞をPBS洗浄後、接着細胞は0.25w/v %トリプシン−1mmol/L EDTA(エチレンジアミン四酢酸)溶液(富士フイルム和光純薬社製)を添加して37℃にて3分間インキュベートして剥離し、各々の培地を添加、遠心して同培地で再懸濁した。
Claims (32)
- 下記式(I)で示される化合物、またはその塩を含む、培地添加用組成物:
{式中、Xは、単結合、−CH2COO−、−CONH−、または−NHCO−であり、R1は、置換基を有していてもよい炭素数1〜10のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または−Y−W−Z−Arであり(式中、Y、およびZは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数1〜6のアルキレン基であり、Wは、酸素原子、硫黄原子またはN(R4)であり、R4は、水素原子または炭素数1〜6のアルキル基であり、Arは、置換基を有していてもよいアリール基である。)、R2は、置換基を有していてもよい炭素数1〜6のアルキル基であり、R3は、水酸基であり、nは、0、1または2である。} - Xが、−NHCO−である、請求項1記載の組成物。
- R2が、炭素数1〜6のアルキル基であり、nが0である、請求項1または2に記載の組成物。
- R1が、−Y−W−Z−Arであり、Yが、炭素数1〜6のアルキル基を有していてもよいメチレン基であり、Wが、N(R4)であり、Zが、単結合であり、Arが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数1〜6のアルキル基または炭素数1〜6のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
- アリール基が、フェニル基である、請求項4に記載の組成物。
- R1が、−Y−W−Z−Arであり、Yが、単結合であり、Wが、N(R4)であり、R4が、水素原子であり、Zが、単結合または炭素数1〜6のアルキル基を有していてもよいメチレン基であり、Arが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数1〜6のアルキル基または炭素数1〜6のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
- アリール基が、フェニル基である、請求項6に記載の組成物。
- Zが、メチレン基である、請求項6または7に記載の組成物。
- R1が、−Y−W−Z−Arであり、Yが、単結合であり、Wが、酸素原子であり、Zが、炭素数1〜6のアルキル基を有していてもよいメチレン基であり、Arが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数1〜6のアルキル基または炭素数1〜6のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
- アリール基が、フェニル基であり、Zが、メチレン基である、請求項9に記載の組成物。
- 化合物が、以下からなる群より選択される化合物またはその塩である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物。
および、
- 化合物が、以下からなる群より選択される化合物またはその塩である、請求項1〜3、6、及び7のいずれか一項に記載の組成物。
および、
- 化合物が、以下で示される化合物またはその塩である、請求項1〜3、9及び10のいずれか一項に記載の組成物。
- 細胞増殖促進用である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の組成物。
- 細胞が、正常細胞株、がん細胞株および幹細胞からなる群から選択される、請求項14記載の組成物。
- スフェア形成、オルガノイド形成、またはCyst形成の促進に用いられる、請求項1〜13のいずれか一項に記載の組成物。
- 請求項1〜13のいずれか一項に記載の培地添加用組成物を含む、培地。
- 請求項1〜13のいずれか一項に記載の培地添加用組成物を培地へ添加することを含む、細胞増殖を促進させる方法。
- 細胞が、正常細胞株、がん細胞株および幹細胞からなる群から選択される、請求項18記載の方法。
- 下記式(I)で示される化合物、またはその塩:
{式中、Xは、単結合、−CH2COO−、−CONH−、または−NHCO−であり、R1は、置換基を有していてもよい炭素数1〜10のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または−Y−W−Z−Arであり(式中、Y、およびZは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数1〜6のアルキレン基であり、Wは、酸素原子、硫黄原子またはN(R4)であり、R4は、水素原子または炭素数1〜6のアルキル基であり、Arは、置換基を有していてもよいアリール基である。)、R2は、置換基を有していてもよい炭素数1〜6のアルキル基であり、R3は、水酸基であり、nは、0、1または2である(ただし、Xが−NHCO−であり、R2がエチル基であり、nが0であるとき、R1は、−CH2−NH−C6H5ではない。)。} - Xが、−NHCO−である、請求項20記載の化合物またはその塩。
- R2が、炭素数1〜6のアルキル基であり、nが0である、請求項20または21に記載の化合物またはその塩。
- R1が、−Y−W−Z−Arであり、Yが、メチレン基であり、Wが、N(R4)であり、Zが、単結合であり、Arが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数1〜6のアルキル基または炭素数1〜6のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、請求項20〜22のいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
- アリール基が、フェニル基である、請求項23に記載の化合物またはその塩。
- R1が、−Y−W−Z−Arであり、Yが、単結合であり、Wが、N(R4)であり、R4が、水素原子であり、Zが、単結合または炭素数1〜6のアルキル基を有していてもよいメチレン基であり、Arが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数1〜6のアルキル基または炭素数1〜6のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、請求項20〜22のいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
- アリール基が、フェニル基である、請求項25に記載の化合物またはその塩。
- Zが、メチレン基である、請求項25または26に記載の化合物またはその塩。
- R1が、−Y−W−Z−Arであり、Yが、単結合であり、Wが、酸素原子であり、Zが、炭素数1〜6のアルキル基を有していてもよいメチレン基であり、Arが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数1〜6のアルキル基または炭素数1〜6のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、請求項20〜22のいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
- アリール基が、フェニル基であり、Zが、メチレン基である、請求項28に記載の化合物またはその塩。
- 以下からなる群より選択される、請求項20〜24のいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
および、
- 以下からなる群から選択される、請求項20〜22、25及び26のいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
および、
- 以下で示される化合物またはその塩である、請求項20〜22、28及び29のいずれか一項に記載の化合物。
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