TW201909890A - 培養基添加用組成物及培養基添加用化合物以及使用此等之細胞或組織的培養方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種培養基添加用組成物，係含有下述式(I)表示的化合物或其鹽。

Description

培養基添加用組成物及培養基添加用化合物以及使用此等之細胞或組織的培養方法

本發明是關於培養基添加用組成物等，詳細而言，是關於促進細胞增殖用的培養基添加用組成物等，以及使用該培養基添加用組成物等的細胞或組織的培養方法。

近年來，使用細胞的實驗是以釐清生命現象的作用機制及確立疾病的治療法等為目的，而極為頻繁地在生命科學領域為首的多個領域實行。例如，就在藥物開發的領域的一例而言，有以候選化合物對成為治療標靶的癌細胞作用，篩選能抑制癌細胞的增殖的化合物的方法。在其篩選中，也有要篩選數萬種的候選化合物的情況，如此的態樣需要大量地準備均質的細胞。但是，就人類等高等生物的細胞而言，即使是分裂比較快的細胞也需要1日左右的時間，而且，癌細胞或幹細胞中也存在1次細胞分 裂所需的時間達數個月以上者，而成為妨礙迅速地調度細胞的重要原因。由於此種背景，要求建立能夠促進分裂緩慢的細胞的增殖之手段，例如有具有特定結構的硫醇化合物會促進造血前驅細胞的增殖、聚異戊二烯基(polyprenyl)系化合物會促進肝細胞的增殖等的報告(專利文獻1、2)。

另一方面，在藥物開發篩選的領域中，細胞的三維培養在近年來備受矚目。三維培養是介於活體外(in vitro)及活體內(in vivo)之間的細胞培養技術。在三維培養中，細胞可形成球體(sphere)(也稱為球狀體(spheroid))等立體結構，因此，相較於通常的二維培養可成為更接近活體的試驗。因此，三維培養可能能夠鑑定使用二維培養的藥物開發篩選所未能鑑定的疾病治療用化合物(非專利文獻1)。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]日本特表平11-504000號公報

[專利文獻2]國際公開第2008/155920號

[非專利文獻]

[非專利文獻1]Susan Breslin, Drug Discovery Today, 2013年，第18卷，第5號，p.240-249

本發明的目的在於提供一種在細胞培養(尤其是三維細胞培養)中能夠促進細胞增殖之新穎的化合物。

本發明者等對於上述課題精心進行檢討，結果發現本次所新穎地合成的化合物能極為良好地促進三維培養下的各種細胞的增殖，有鑒於此而進一步推進研究，遂完成本發明。亦即，本發明如下所述。

[1]一種培養基添加用組成物，其係含有下述式(I)表示的化合物或其鹽：

[式中，X是單鍵結、-CH₂COO-、-CONH-或-NHCO-，R₁是可具有取代基的碳數1至10的烷基、可具有取代基的芳基、或-Y-W-Z-Ar(式中，Y及Z是單鍵結或可具有取代基的碳數1至6的伸烷基(alkylene)，W是氧原子、硫原子或N(R₄)，R₄是氫原子或碳數1至6的烷基，Ar是可具有取代基的芳基)，R₂是可具有取代基的碳數1至6的烷基，R₃是羥基，n是0、1或2]。

[2]如[1]所述的培養基添加用組成物，其中，X是-NHCO-。

[3]如[1]或[2]所述的培養基添加用組成物，其中，R₂是碳數1至6的烷基，n是0。

[4]如[1]至[3]中任一項所述的培養基添加用組成物，其中，R₁是-Y-W-Z-Ar，Y是可具有碳數1至6的烷基的亞甲基，W是N(R₄)，Z是單鍵結，Ar是可具有鹵原子、羥基、碳數1至6的烷基或碳數1至6的烷氧基的芳基。

[5]如[4]所述的培養基添加用組成物，其中，芳基是苯基。

[6]如[1]至[3]中任一項所述的培養基添加用組成物，其中，R₁是-Y-W-Z-Ar，Y是單鍵結，W是N(R₄)，R₄是氫原子，Z是單鍵結或可具有碳數1至6的烷基的亞甲基，Ar是可具有鹵原子、羥基、碳數1至6的烷基或碳數1至6的烷氧基的芳基。

[7]如[6]所述的培養基添加用組成物，其中，芳基是苯基。

[8]如[6]或[7]所述的培養基添加用組成物，其中，Z是亞甲基。

[9]如[1]至[3]中任一項所述的培養基添加用組成物，其中，R₁是-Y-W-Z-Ar，Y是單鍵結，W是氧原子，Z是可具有碳數1至6的烷基的亞甲基，Ar是可具有鹵原子、羥基、碳數1至6的烷基或碳數1至6的烷氧基的芳基。

[10]如[9]所述的培養基添加用組成物，其中，芳基是苯基，Z是亞甲基。

[11]如[1]至[5]中任一項所述的培養基添加用組成物， 其中，化合物是從由下列者所組成群組選出的化合物或其鹽； 及

[12]如[1]至[3]、[6]及[7]中任一項所述的培養基添加用組成物，其中，化合物是從由下列者所組成群組選出的化合物或其鹽； 及

[13]如[1]至[3]、[9]及[10]中任一項所述的培養基添加用組成物，其中，化合物是以下表示的化合物或其鹽；

[14]如[1]至[13]中任一項所述的培養基添加用組成物，其係促進細胞增殖用者。

[15]如[14]所述的培養基添加用組成物，其中，細胞是從由正常細胞株、癌細胞株及幹細胞所組成群組選出。

[16]如[15]所述的培養基添加用組成物，其中，正常細胞株是源自非洲綠猴(african green monkey)腎臟上皮的細胞(Vero細胞)、犬腎臟腎曲小管上皮細胞(MDCK細胞)、源自中國倉鼠卵巢的細胞(CHO-K1)、人類臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)或小鼠胚胎纖維母細胞(C3H10T1/2)。

[17]如[15]所述的培養基添加用組成物，其中，癌細胞株是從由源自人類卵巢癌的細胞株SKOV3、源自人類子宮頸癌的細胞株HeLa、源自人類惡性黑色腫瘤的細胞株A375、源自人類表皮樣細胞癌的細胞株A431、源自人類胃腺癌的細胞株AGS、源自人類前列腺癌的細胞株LNCap clone FGC、源自人類結腸腺癌的細胞株HCT116、源自人類肺胞基底上皮腺癌的細胞株A549、及源自人類前列腺癌的細胞DU145所組成群組選出的1種以上。

[18]如[15]所述的培養基添加用組成物，其中，幹細胞是人類誘導性多潛能幹細胞(iPS細胞)或人類間葉系幹細胞(Mesenchymal Stem Cells，MSC)。

[19]如[1]至[13]中任一項所述的培養基添加用組成物，其係用於促進球體形成、類器官(organoid)形成或胞囊(以下亦稱Cyst)形成。

[20]如[19]所述的培養基添加用組成物，其中，球體 是癌細胞株、人類誘導性多潛能幹細胞(iPS細胞)或人類間葉系幹細胞(MSC)。

[21]如[19]所述的培養基添加用組成物，其中，類器官是源自小腸的細胞。

[22]如[19]所述的培養基添加用組成物，其中，Cyst是源自腎臟的細胞。

[23]一種培養基，係含有[1]至[13]中任一項所述的培養基添加用組成物。

[24]如[23]所述的培養基，係促進細胞增殖用者。

[25]如[23]或[24]所述的培養基，係三維細胞培養用培養基。

[26]如[23]所述的培養基，係用於促進球體形成、類器官形成或Cyst形成。

[27]一種促進細胞增殖的方法，係包含：將[1]至[13]中任一項所述的培養基添加用組成物添加於培養基。

[28]如[27]所述的方法，其中，細胞是從由正常細胞株、癌細胞株及幹細胞所組成群組選出。

[29]如[28]所述的方法，其中，正常細胞株是源自非洲綠猴腎臟上皮的細胞(Vero細胞)、犬腎臟腎曲小管上皮細胞(MDCK細胞)、源自中國倉鼠卵巢的細胞(CHO-K1)、人類臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)或小鼠胚胎纖維母細胞(C3H10T1/2)。

[30]如[28]所述的方法，其中，癌細胞株是從由源自人類卵巢癌的細胞株SKOV3、源自人類子宮頸癌的細胞株 HeLa、源自人類惡性黑色腫瘤的細胞株A375、源自人類表皮樣細胞癌的細胞株A431、源自人類胃腺癌的細胞株AGS、源自人類前列腺癌的細胞株LNCap clone FGC、源自人類結腸腺癌的細胞株HCT116、源自人類肺胞基底上皮腺癌的細胞株A549、及源自人類前列腺癌的細胞DU145所組成群組選出的1種以上。

[31]如[28]所述的方法，其中，幹細胞是人類誘導性多潛能幹細胞(iPS細胞)或人類間葉系幹細胞(MSC)。

[32]如[27]至[31]中任一項所述的方法，其中，培養基是三維細胞培養用培養基。

[33]一種促進球體形成、類器官形成或Cyst形成的方法，其係包含：將[1]至[13]中任一項所述的培養基添加用組成物添加於培養基。

[34]如[33]所述的方法，其中，球體是癌細胞株、人類誘導性多潛能幹細胞(iPS細胞)或人類間葉系幹細胞(MSC)。

[35]如[33]所述的方法，其中，類器官是源自小腸的細胞。

[36]如[33]所述的方法，其中，Cyst是源自腎臟的細胞。

[37]一種下述式(I)表示的化合物或其鹽：

[式中，X是單鍵結、-CH₂COO-、-CONH-、或-NHCO-，R₁是可具有取代基的碳數1至10的烷基、可具有取代基的芳基、或-Y-W-Z-Ar(式中，Y及Z是單鍵結或可具有取代基的碳數1至6的伸烷基，W是氧原子、硫原子或N(R₄)，R₄是氫原子或碳數1至6的烷基，Ar是可具有取代基的芳基)，R₂是可具有取代基的碳數1至6的烷基，R₃是羥基，n是0、1或2(惟，當X是-NHCO-、R₂是乙基、n是0時，R₁不會是-CH₂-NH-C₆H₅)。]

[38]如[37]所述的化合物或其鹽，其中，X是-NHCO-。

[39]如[37]或[38]所述的化合物或其鹽，其中，R₂是碳數1至6的烷基，n是0。

[40]如[37]至[39]中任一項所述的化合物或其鹽，其中，R₁是-Y-W-Z-Ar，Y是亞甲基，W是N(R₄)，Z是單鍵結，Ar是可具有鹵原子、羥基、碳數1至6的烷基或碳數1至6的烷氧基的芳基。

[41]如[40]所述的化合物或其鹽，其中，芳基是苯基。

[42]如[37]至[39]中任一項所述的化合物或其鹽，其中，R₁是-Y-W-Z-Ar，Y是單鍵結，W是N(R₄)，R₄是氫 原子，Z是單鍵結或可具有碳數1至6的烷基的亞甲基，Ar是可具有鹵原子、羥基、碳數1至6的烷基或碳數1至6的烷氧基的芳基。

[43]如[42]所述的化合物或其鹽，其中，芳基是苯基。

[44]如[42]或[43]所述的化合物或其鹽，其中，Z是亞甲基。

[45]如[37]至[39]中任一項所述的化合物或其鹽，其中，R₁是-Y-W-Z-Ar，Y是單鍵結，W是氧原子，Z是可具有碳數1至6的烷基的亞甲基，Ar是可具有鹵原子、羥基、碳數1至6的烷基或碳數1至6的烷氧基的芳基。

[46]如[45]所述的化合物或其鹽，其中，芳基是苯基，Z是亞甲基。

[47]如[37]至[41]中任一項所述的化合物或其鹽，係從由下列者所組成群組選出； 及

[48]如[37]至[39]、[42]及[43]中任一項所述的化合物或其鹽，其係從由下列者所組成群組選出； 及

[49]如[37]至[39]、[45]及[46]中任一項所述的化合物，係以下表示的化合物或其鹽；

在另一態樣中，本發明如下。

[50]一種培養基添加用組成物，係含有下述通式(I-a)表示的化合物或其鹽；

[式中，X是單鍵結、-CH₂COO-、-CONH-、或-NHCO-，R_1a是，可具有取代基的碳數1至10的烷基、可具有取代基的芳基、或-Y-NH-Z-Ar(式中，Y及Z是單鍵結，或可具有取代基的碳數1至6的伸烷基，Ar是可具有取代基的芳基)，R₂是可具有取代基的碳數1至6的烷基，R_3a是氫原子或羥基]。

[51]一種培養基，係含有[50]所述的培養基添加用組成物。

[52]一種促進細胞增殖的方法，係包含：將[50]所述的培養基添加用組成物添加於培養基。

[53]一種促進球體形成、類器官形成或Cyst形成的方法，係包含：將[50]所述的培養基添加用組成物添加於培養基。

[54]一種下述通式(I-a)表示的化合物或其鹽：

[式中，X是單鍵結、-CH₂COO-、-CONH-、或-NHCO-，R_1a是可具有取代基的碳數1至10的烷基、可具有取代基的芳基、或-Y-NH-Z-Ar(式中，Y及Z是單鍵結或可具有取代基的碳數1至6的伸烷基，Ar是可具有取代基的芳基)，R₂是可具有取代基的碳數1至6的烷基，R_3a是氫原子或羥基(惟，當X是-NHCO-、R₂是乙基、R_3a是氫原子時，R_1a不會是-CH₂-NH-C₆H₅)]。

式(I)表示的化合物或其鹽係具有促進三維培養下的細胞的增殖活性，因此，可顯著地促進細胞的增殖、球體形成、類器官形成及/或Cyst形成。

第1圖是使用共軛焦螢光顯微鏡觀察到的在添加有本 發明組成物的培養基中培養的MDCK細胞的Cyst形成之圖。

在本說明書使用的用語係定義如下。

本說明書中，「n-」是「正」，「i-」是「異」，「sec-」是「二級」及「tert-」是「三級」的意思。又，本說明書中，「o-」是「鄰」，「m-」是「間」及「p-」是「對」的意思。

「鹵原子」為氟原子、氯原子、溴原子、碘原子。「鹵基」為氟、氯、溴、碘。

「烷基」及「碳數1至10的烷基」意指直鏈或分枝狀的烷基，具體可列舉：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、二級丁基、三級丁基、正戊基、異戊基、三級戊基、新戊基、2-戊基、3-戊基、正己基、2-己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基等基團。「碳數1至6的烷基」意指直鏈或分枝狀的烷基，具體可列舉：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、二級丁基、三級丁基、正戊基、異戊基、三級戊基、新戊基、2-戊基、3-戊基、正己基、2-己基等基團。

「芳基」係至少1個環是芳香族，可列舉各環具有5至8的環原子之單環式、二環式、三環式及四環式碳環式基，具體可列舉：苯基、茚基、萘基、茀基等。特別是芳基可為碳數6至10的環之苯基、茚基、萘基。

「伸烷基」及「碳數1至6的伸烷基」意 指直鏈或分枝狀的伸烷基，具體可列舉：亞甲基、伸乙基、伸丙基、伸丁基、伸戊基、伸己基等基團。

「烷基」、「芳基」及「伸烷基」可具有取代基，這種取代基例如以下所列舉者。又，為「烷基」時可列舉下述(1)至(40)，為「芳基」及「伸烷基」時可列舉下述(1)至(41)。

(1)鹵基，(2)羥基，(3)氰基，(4)硝基，(5)羧基，(6)烯基(C_2-10烯基；例如乙烯基、烯丙基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、丁二烯基、己三烯基及其等之各種異構物)，(7)炔基(C_2-10炔基；例如乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基及其等之各種異構物)，(8)鹵烷基(例如單氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、單氟乙基、二氟乙基、三氟乙基、氯甲基、氯乙基、二氯乙基及其等之各種異構物)，(9)環狀烷基(環中亦可含有雜原子)(例如環丙基、環丁基、環戊基、環己基、四氫呋喃基、四氫吡喃基、氮丙啶基(aziridinyl)、氮雜環丁烷基(azetidinyl)、吡咯啶基(pyrrolidinyl)、哌啶基(piperidinyl)、嗎啉基)，(10)芳基(例如苯基、萘基)， (11)雜芳基(例如吡啶基、嗒基、嘧啶基、吡基、呋喃基、苯硫基(thiophenyl)、吡咯基、吡唑基、咪唑基、三唑基(例如1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基)、四唑基、唑基、異唑基、噻唑基、異噻唑基、二唑基(例如1,2,3-二唑基、1,2,4-二唑基、1,3,4-二唑基)、噻二唑基(例如1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基)、苯并呋喃基、苯并苯硫基(benzothiophenyl)、吲哚基、異吲哚基、苯并唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并異唑基、苯并異噻唑基、苯并二唑基、苯并噻二唑基、嘌呤基、喹啉基、異喹啉基、啉基(cinnolinyl)、呔基、喹唑啉基(quinazolinyl)、喹啉基(quinoxalinyl)、喋啶基(pteridinyl)、咪唑并唑基、咪唑并噻唑基、咪唑并咪唑基)，(12)烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、二級丁氧基、三級丁氧基、正戊氧基、異戊氧基、三級戊氧基、新戊氧基、2-戊氧基、3-戊氧基、正己氧基、2-己氧基)，(13)烷硫基(例如甲硫基、乙硫基、正丙硫基、異丙硫基、正丁硫基、異丁硫基、二級丁硫基、三級丁硫基、正戊硫基、異戊硫基、三級戊硫基、新戊硫基、2-戊硫基、3-戊硫基、正己硫基、2-己硫基)，(14)經芳基(與上述(10)同義)取代的烷氧基(與上述(12)同義)，(15)經芳基(與上述(10)同義)取代的烷硫基(與上述(13) 同義)，(16)經雜芳基(與上述(11)同義)取代的烷氧基(與上述(12)同義)，(17)經雜芳基(與上述(11)同義)取代的烷硫基(與上述(13)同義)，(18)環狀烷基(在環中可含有雜原子)氧基(例如環丙氧基、環丁氧基、環戊氧基、環己氧基、四氫呋喃氧基、四氫哌喃氧基、氮丙啶氧基、氮雜環丁烷氧基、吡咯啶氧基、哌啶氧基、嗎啉氧基)，(19)芳氧基(例如芳基(與上述(10)同義)與氧原子鍵結的基團)，(20)雜芳氧基(例如雜芳基(與上述(11)同義)與氧原子鍵結的基團)，(21)鹵烷氧基(例如鹵烷基(與上述(8)同義)與氧原子鍵結的基團)，(22)鹵烷硫基(例如鹵烷基(與上述(8)同義)與硫原子鍵結的基團)，(23)經羥基取代的烷氧基(與上述(12)同義)，(24)經烷氧基(與上述(12)同義)取代的烷氧基(與上述(12)同義)，(25)胺基，(26)經烷基單取代或雙取代的胺基，其中，「烷基」可列舉C_1-6烷基，具體可列舉：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、二級丁基、三 級丁基、正戊基、異戊基、三級戊基、新戊基、2-戊基、3-戊基、正己基、2-己基等。(27)胺甲醯基(carbamoyl)，(28)經烷基(與上述(26)的「烷基」同義)單取代或雙取代的胺甲醯基(例如甲基胺甲醯基、乙基胺甲醯基、二甲基胺甲醯基、二乙基胺甲醯基、乙基甲基胺甲醯基)，(29)胺磺醯基(sulfamoyl)，(30)經烷基(與上述(26)的「烷基」同義)單取代或雙取代的胺磺醯基(例如甲基胺磺醯基、乙基胺磺醯基、二甲基胺磺醯基、二乙基胺磺醯基、乙基甲基胺磺醯基)，(31)烷醯基(例如氫原子或烷基(與上述(26)的「烷基」同義)與碳原子鍵結的羰基)，(32)芳醯基(例如芳基(與上述(10)同義)與碳原子鍵結的羰基)，(33)烷基磺醯胺基(例如經烷基(與上述(26)的「烷基」同義)取代的磺醯胺基)，(34)芳基磺醯胺基(例如經芳基(與上述(10)同義)取代的磺醯胺基)，(35)雜芳基磺醯胺基(例如經雜芳基(與上述(11)同義)取代的磺醯胺基)，(36)醯基胺基(例如經醯基取代的胺基)，其中，「醯基」為具有C_1-6烷基或C_6-10芳基的醯基。其中，「C_1-6烷基」為上述「烷基」中之碳數是1至6者，「C_6-10芳基」為上述「芳基」中之碳數是6至10者。醯 基具體可列舉：乙醯基、丙醯基、丁醯基、異丁醯基、戊醯基、異戊醯基、三甲基乙醯基、己醯基、丙烯醯基、甲基丙烯醯基、巴豆醯基(crotonoyl)、異巴豆醯基、苯甲醯基、萘甲醯基等，(37)烷氧基羰基胺基(例如經烷氧基(與上述(12)同義)取代的羰基胺基)，(38)烷基磺醯基(例如經烷基(與上述(26)的「烷基」同義)取代的磺醯基)，(39)烷基亞磺醯基(例如經烷基(與上述(26)的「烷基」同義)取代的亞磺醯基)，(40)烷氧基羰基(例如甲氧基羰基、乙氧基羰基)，(41)烷基(C_1-10烷基；例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、二級丁基、三級丁基、正戊基、異戊基、三級戊基、新戊基、2-戊基、3-戊基、正己基、2-己基等)等。

取代基存在2個以上時，該等可為相同或不同。

式(I)所示的化合物可為鹽的形態。前述式(I)所示的化合物的鹽可列舉例如：與鹽酸及氫溴酸等無機酸所成的鹽，以及與乙酸、丙酸、酒石酸、福馬酸、馬來酸、蘋果酸、草酸、琥珀酸、檸檬酸及苯甲酸等有機酸所成的鹽。

式(I)所示的化合物係視取代基的種類而有存在具有E型立體配置的E異構物及具有Z型立體配置的 Z異構物的幾何異構物之情況。本發明也包括將該等E異構物、Z異構物、或E異構物及Z異構物以任意的比率含有之混合物。

[合成方法1]式(I)所示的化合物的合成

[式中，X是單鍵結、-CH₂COO-、-CONH-或-NHCO-，R₁是可具有取代基的碳數1至10的烷基、可具有取代基的芳基、或-Y-W-Z-Ar(式中，Y及Z是單鍵結或可具有取代基的碳數1至6的伸烷基，W是氧原子、硫原子或N(R₄)，R₄是氫原子或碳數1至6的烷基，Ar是可具有取代基的芳基)，R₂是可具有取代基的碳數1至6的烷基，R₃是羥基，n是0、1或2。]

上述式(I)所示的化合物如下述反應式所示，可藉由使酮化合物(k)與H₂N-X-R₁[式中，X及R₁是表示前述之意義，例如醯肼(hydrazide)化合物等]反應而合成。較佳為使用前述原料各1當量，在甲苯、1,4-二烷、N,N-二甲基甲醯胺、二甲基亞碸等溶媒中，以100℃以上的溫度範圍反應1小時至3日。

[反應式1]

(式中，R₁、R₂、R₃、X及n表示前述之意義。)

上述k及100之中，有些可由市售品購得，其他者也可依照公知的合成方法進行合成。

[合成方法2]由酮化合物及醯肼化合物的組合所成之化合物的合成

依照前述合成方法1的方法，藉由使用H₂N-X-R₁中之X是-NHCO-，R₁是-Y-W-Z-Ar，W是N(R₄)，Y是可具有取代基的碳數1至6的伸烷基，R₂、R₃、R₄、Z、Ar及n是表示前述之意義者的醯肼化合物，可合成在式(I)所示的化合物中為酮化合物及醯肼化合物的組合所成的化合物。

上述醯肼化合物中，有些可由市售品購得，其他者也可依照公知的合成方法進行合成。

[合成方法3]酮化合物及胺化合物的組合所成的化合物的合成

藉由使用前述的酮化合物(k)[例如2’,4’-二羥基-3’-甲基丙醯苯(k-1)等]與H₂N-X-R₁中之X是單鍵結或-CH₂COO-，R₁是表示前述意義的所希望的一級胺[例如正 辛基胺(A-3)等]或其鹽[例如甘胺酸乙酯鹽酸鹽(A-1)等]，可合成在式(I)所示的化合物中為酮化合物及胺化合物的組合所成的化合物。較佳為分別使用前述原料各1當量，在甲苯、1,4-二烷、N,N-二甲基甲醯胺、二甲基亞碸等溶媒中，以100℃以上的溫度範圍反應1小時至24小時。胺的鹽可使用鹽酸鹽、p-甲苯磺酸鹽、三氟乙酸鹽等。

上述一級胺中，有些可由市售品購得，其他者也可依照公知的合成方法合成。

[合成方法4]脲化合物的合成

將前述的酮化合物(k)[例如2’,4’-二羥基-3’-甲基丙醯苯(k-1)等]依照公知的合成方法溶解於氨的甲醇溶液，注入氨氣同時進行攪拌，藉此合成亞胺化合物(k-1’)，之後藉由與對應的異氰酸酯[例如異氰酸苯酯(A-5)]反應，而可合成式(I)所示的化合物中之X是-CONH-，R₁、R₂、R₃及n是表示前述之意義的脲化合物。

上述異氰酸酯之中，有些可由市售品購得，其他者也可依照公知的合成方法合成。

合成方法1至合成方法4中，反應結束後的反應混合物是添加蒸餾水使其析出，或於不析出之情形實施所謂有機溶媒萃取後濃縮之通常的後處理，而可得到目的之本發明所用的化合物。又，在需要精製時，可藉由再結晶、管柱層析、薄層層析、液相層析分離等任意的精製方法來進行分離、精製。

本說明書的三維細胞培養(3D細胞培養)是 意指例如使用包埋培養法、微載體培養法、球培養法等而將細胞在三維的環境下培養的意思。包埋培養是將細胞埋入至Matrigel(註冊商標)、Geltrex(註冊商標)、瓊脂、甲基纖維素、膠原蛋白、明膠、纖維蛋白、瓊脂糖、藻酸鹽等固形或半固體的凝膠基材中，使其固定並進行培養的方法。微載體培養法是在稍重於水的微粒子(以下亦稱為微載體)的表面上使細胞於單層增殖，並將該微粒子在燒瓶等培養容器內進行攪拌，而在懸浮狀態下實施培養者。球體培養是使目的之細胞形成數十至數百個所成的團塊(以下，也稱為球體或球狀體)後，將該團塊在培養基中靜置或震盪方式培養的方法。又，就本發明的三維細胞培養(3D細胞培養)而言，也可使用使玻尿酸、脫醯基化結蘭膠、三仙膠等多糖類或該等的衍生物分散在培養基中，以形成無定型的三維網格，並將該三維網格作為支架(scaffold)且維持黏著細胞懸浮於培養基中的狀態，藉此以更接近於活體內的三維狀態下培養細胞的手法。這時，三維細胞培養中的細胞被捕捉在該三維網格而不沉澱，所以可以不需要震盪、旋轉操作等而進行培養。三維細胞培養可藉由本身為公知的方法來實施(例如參照WO2014/017513)。

1.化合物

本發明之組成物、培養基及方法所使用的化合物是式(I)表示的化合物(以下亦有將本發明之組成物、培養基、方法所使用的化合物或其鹽統稱為「本發明所用的化合物」之情形)：

[式中，X是單鍵結、-CH₂COO-、-CONH-、或-NHCO-，R₁是可具有取代基的碳數1至10的烷基、可具有取代基的芳基、或-Y-W-Z-Ar(式中，Y及Z是單鍵結或可具有取代基的碳數1至6的伸烷基，W是氧原子、硫原子或N(R₄)，R₄是氫原子或碳數1至6的烷基，Ar是可具有取代基的芳基)，R₂是可具有取代基的碳數1至6的烷基，R₃是羥基，n是0、1或2。]。

一態樣中，前述式(I)中的X是單鍵結時，R₁是可具有取代基的碳數1至10的烷基(較佳為不具有取代基的碳數1至10的烷基，特佳為辛基)，R₂是可具有取代基的碳數1至6的烷基(較佳為不具有取代基的碳數1至6的烷基，特佳為乙基)，n=0。

又，X是-CH₂COO-時，R₁是可具有取代基的碳數1至10的烷基(較佳為可具有取代基的碳數1至6的烷基，特佳為乙基)，R₂是可具有取代基的碳數1至6的烷基(較佳為不具有取代基的碳數1至6的烷基，特佳為乙基)，R₃是氫原子；或R₁是可具有取代基的碳數1至10的烷基(較佳為具有取代基的碳數1至6的烷基，特佳為苄 基)，R₂是可具有取代基的碳數1至6的烷基(較佳為不具有取代基的碳數1至6的烷基，特佳為乙基)，n=0。

又，X是-CONH-時，R₁是可具有取代基的芳基(較佳為不具有取代基的芳基，特佳為苯基)，R₂是可具有取代基的碳數1至6的烷基(較佳為不具有取代基的碳數1至6的烷基，特佳為乙基)，n=0。

又，X是-NHCO-時，R₁是-Y-W-Z-Ar，其中，Y為單鍵結時，W是N(R₄)(較佳為N(R₄)，R₄是氫原子或碳數1至6的烷基，特佳為N(R₄)，R₄是氫原子)或氧原子，Z是單鍵結或可具有取代基的伸烷基(較佳為單鍵結或不具有取代基的伸烷基，特佳為單鍵結或亞甲基)，Ar是可具有取代基(較佳為鹵原子、羥基、甲基或甲氧基)的芳基(更佳為具有羥基的芳基或不具有取代基的芳基，特佳為具有羥基的苯基或不具有取代基的苯基)，R₂是可具有取代基的碳數1至6的烷基(較佳為不具有取代基的碳數1至6的烷基，特佳為乙基)，n=0。

又，X是-NHCO-且R₁是-Y-W-Z-Ar，而且Y是可具有取代基的碳數1至6的伸烷基(較佳為可具有碳數1至6的烷基之碳數1至6的伸烷基，特佳為經亞甲基、甲基或乙基取代的亞甲基)時，W是N(R₄)(較佳為N(R₄)，式中之R₄是氫原子或碳數1至6的烷基，特佳為N(R₄)，式中之R₄是氫原子)，Z是單鍵結，Ar是可具有取代基的芳基(較佳為具有取代基的芳基，特佳為具有鹵基、羥基、甲基或乙氧基的苯基或萘基)，R₂是可具有取代基的碳數1 至6的烷基(較佳為不具有取代基的碳數1至6的烷基，特佳為甲基、乙基或異丙基)，n=0。

又，本發明提供以下的新穎化合物或其鹽(以下，有時稱為「本發明的化合物」)。

本發明的化合物是以下式(I)所示的化合物或其鹽：

[式中，X是單鍵結、-CH₂COO-、-CONH-、或-NHCO-，R₁是可具有取代基的碳數1至10的烷基、可具有取代基的芳基或-Y-W-Z-Ar(式中，Y及Z是單鍵結或可具有取代基的碳數1至6的伸烷基，W是氧原子、硫原子或N(R₄)，R₄是氫原子或碳數1至6的烷基，Ar是可具有取代基的芳基)，R₂是可具有取代基的碳數1至6的烷基，R₃是羥基，n是0、1或2(惟，當X是-NHCO-、R₂是乙基、n是0時，R₁不會是-CH₂-NH-C₆H₅)。]。

本發明的化合物的一態樣中，前述式(I)中的X是單鍵結時，R₁是可具有取代基的碳數1至10的烷基(較佳為不具有取代基的碳數1至10的烷基，特佳為辛基)，R₂是可具有取代基的碳數1至6的烷基(較佳為不具 有取代基的碳數1至6的烷基，特佳為乙基)，n=0。

又，X是-CH₂COO-時，R₁是可具有取代基的碳數1至10的烷基(較佳為可具有取代基的碳數1至6的烷基，特佳為乙基)，R₂是可具有取代基的碳數1至6的烷基(較佳為不具有取代基的碳數1至6的烷基，特佳為乙基)，R₃是氫原子；或R₁是可具有取代基的碳數1至10的烷基(較佳為具有取代基的碳數1至6的烷基，特佳為苄基)，R₂是可具有取代基的碳數1至6的烷基(較佳為不具有取代基的碳數1至6的烷基，特佳為乙基)，n=0。

又，X是-CONH-時，R₁是可具有取代基的芳基(較佳為不具有取代基的芳基，特佳為苯基)，R₂是可具有取代基的碳數1至6的烷基(較佳為不具有取代基的碳數1至6的烷基，特佳為乙基)，n=0。

又，X是-NHCO-時，R₁是-Y-W-Z-Ar，其中，Y是單鍵結時，W是N(R₄)(較佳為N(R₄)，R₄是氫原子或碳數1至6的烷基，特佳為N(R₄)，R₄是氫原子)或氧原子，Z是單鍵結或可具有取代基的伸烷基(較佳為單鍵結或不具有取代基的伸烷基，特佳為單鍵結或亞甲基)，Ar是可具有取代基(較佳為鹵原子、羥基、甲基或甲氧基)的芳基(較佳為具有羥基的芳基或不具有取代基的芳基，特佳為具有羥基的苯基或不具有取代基的苯基)，R₂是可具有取代基的碳數1至6的烷基(較佳為不具有取代基的碳數1至6的烷基，特佳為乙基)，n=0。

又，當X是-NHCO-且R₁是-Y-W-Z-Ar、而 且Y是可具有取代基的碳數1至6的伸烷基(較佳為不具有取代基的碳數1至6的伸烷基，特佳為亞甲基)時，W是N(R₄)(較佳為N(R₄)，式中R₄是氫原子或碳數1至6的烷基，特佳為N(R₄)，式中R₄是氫原子)，Z是單鍵結，Ar是可具有取代基的芳基(較佳為具有取代基的芳基，特佳為具有鹵基、羥基、甲基或乙氧基的苯基，或萘基)，R₂是可具有取代基的碳數1至6的烷基(較佳為不具有取代基的碳數1至6的烷基，特佳為甲基、乙基或異丙基)，n=0。

於較佳的一態樣中，本發明所使用的化合物如下所述。

2.培養基添加用組成物

本發明提供含有本發明所使用的化合物作為有效成分之培養基添加用組成物(以下，有時稱為「本發明之組成物」)。本發明之組成物是藉由添加於細胞培養基、尤其是添加於三維細胞培養用培養基，而可達成細胞增殖的促進、球體形成的促進、類器官形成的促進及Cyst形成的促進之 任一者或該等的任意組合。

亦即，就本發明之組成物的用途而言，具體係如以下所例示：(1)促進細胞增殖；(2)促進球體形成；(3)促進類器官形成；(4)促進Cyst形成；(5)促進細胞增殖及促進球體形成；(6)促進細胞增殖及促進類器官形成；(7)促進細胞增殖及促進Cyst形成；(8)促進球體形成及促進類器官形成；(9)促進球體形成及促進Cyst形成；(10)促進類器官形成及促進Cyst形成；(11)促進細胞增殖、促進球體形成及促進類器官形成；(12)促進細胞增殖、促進球體形成及促進Cyst形成；(13)促進細胞增殖、促進類器官形成及促進Cyst形成；(14)促進球體形成、促進類器官形成及促進Cyst形成；或(15)促進細胞增殖、促進球體形成、促進類器官形成及促進Cyst形成。

本發明之組成物可含有本發明所用的化合物之1種、或者2種以上的組合來作為有效成分。

又，本發明之組成物可含有本發明所用的化合物以外的其他成分。若能得到本發明的所希望的效果即無特別限定，惟在其成分中例如可含有：水、生理食鹽水、二甲基亞碸(DMSO)、甘油、丙二醇、丁二醇及甲醇、乙醇、丁醇、丙醇等各種醇等。又，本發明之組成物亦可視需要而施行滅菌處理。滅菌方法並無特別限制，例如可列舉：放射線滅菌、環氧乙烷氣體滅菌、高壓釜滅菌、過濾器滅菌等。進行過濾器滅菌(以下亦稱為過濾滅菌)時之過濾器部分的材質並無特別的限制，惟例如可列舉：玻璃纖維、尼龍、PES(聚醚碸(polyethersulfone))、親水性PVDF(聚二氟亞乙烯(polyvinylidene fluoride))、纖維素混合酯、乙酸纖維素、聚四氟乙烯等。過濾器的細孔的大小並無特別的限制，惟較佳為0.1μm至10μm，更佳為0.1μm至1μm，最佳為0.1μm至0.5μm。就該等滅菌處理而言，該組成物是固形或溶液的狀態皆可。

就本發明之組成物中作為有效成分的本發明所用的化合物的調配量而言，若為將本發明之組成物添加於培養基(尤其是三維細胞培養用培養基)時，該培養基會成為可發揮本發明所希望的效果之濃度，即無特別限定。又，就可發揮本發明所希望的效果之濃度而言，例如：本發明所用的化合物於培養基(尤其是三維細胞培養用培養基)中的濃度的下限值可以是通常為0.001μM以上、較佳為0.01μM以上、更佳為0.1μM以上、又更佳為1μM以上、特佳為10μM以上。又，其濃度的上限值可以是通常為 100μM以下、較佳為50μM以下、特佳為10μM以下。

本發明之組成物在提供時或保存時可為任意的形狀。該組成物可以是：如錠劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑之經製劑化的固體；如經適當的溶媒以及溶解劑溶解的溶液或懸浮液等液體；或是結合在基板或載體的狀態。就製劑化時的添加物而言，可列舉：p-羥基苯甲酸酯類等防腐劑；乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇等賦形劑；硬脂酸鎂、滑石等潤滑劑；聚乙烯醇、羥丙基纖維素、明膠等黏結劑；脂肪酸酯等界面活性劑；甘油等塑化劑等。該等添加物並不限定於上述者，所屬技術領域中具有通常知識者可自由選用可以利用者。

藉由在培養基(尤其是三維細胞培養用培養基)添加本發明之組成物而能夠達成促進細胞增殖等的細胞物種而言，只要能夠得到所希望的效果便無特別的限定，惟可列舉：精子及卵子等生殖細胞、構成活體的體細胞、正常細胞株、癌細胞株、前驅細胞、幹細胞、由活體分離的經人為改變基因而成的細胞、由活體分離的經人為核交換的細胞等細胞物種。又，該等細胞的來源亦無特別的限定，惟較佳係源自大鼠、小鼠、兔、天竺鼠、松鼠、倉鼠、田鼠、鴨嘴獸、海豚、鯨魚、犬、貓、山羊、牛、馬、綿羊、豬、象、狨(common marmoset)、松鼠猴、，恆河獼猴、黑猩猩、人類等哺乳動物的細胞。又，就細胞來源的組織或臟器而言，若能得到本發明的所希望的效果則亦無特別的限定，惟前述組織可列舉：皮膚、腎臟、脾臟、腎上腺、肝臟、肺、 卵巢、胰臟、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、脾臟、膀胱、前列腺、精巢、胸腺、肌肉、結締組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臟、眼、腦或神經組織等組織，但不侷限於該等組織；又，前述臟器可列舉：肝臟、肺、腎臟、心臟、胰臟、胃、脾臟、小腸、大腸、生殖器等臟器，但不侷限於該等臟器。又，以促進類器官形成為目的時，會有類器官以源自小腸的細胞為佳之情形。又，以促進Cyst形成為目的時，會有Cyst以源自腎臟的細胞為佳之情形。

又，正常細胞株可列舉：C3H10T1/2(小鼠胚胎纖維母細胞)、HEK293(人類胎兒腎細胞)、MDBK(源自牛腎臟的細胞)、MDCK(犬腎臟腎曲小管上皮細胞)、CHO-K1(源自中國倉鼠卵巢的細胞)、Vero細胞(源自非洲綠猴腎臟上皮的細胞)、NIH3T3(小鼠胎兒纖維母細胞)、HepaRG(肝細胞，註冊商標)、HUVEC(人類臍帶靜脈內皮細胞)、人類初代培養肝細胞等。該等之中，尤以MDCK、HUVEC、CHO-K1及Vero細胞為佳。又，就癌細胞株的例而言，並不侷限於以下所述者，但可列舉：人類乳癌細胞株之HBC-4、BSY-1、BSY-2、MCF-7、MCF-7/ADR RES、HS578T、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-N、BT-549、T47D；人類子宮頸癌細胞株之HeLa；人類肺癌細胞株之A549、EKVX、HOP-62、HOP-92、NCI-H23、NCI-H226、NCI-H322M、NCI-H460、NCI-H522、DMS273、DMS114；人類大腸癌細胞株之Caco-2、COLO-205、HCC-2998、HCT-15、HCT-116、HT-29、KM-12、SW-620、WiDr；人 類前列腺癌細胞株之DU-145、PC-3、LNCaP；人中樞神經系癌細胞株之U251、SF-295、SF-539、SF-268、SNB-75、SNB-78、SNB-19；人類卵巢癌細胞株之OVCAR-3、OVCAR-4、OVCAR-5、OVCAR-8、SKOV3、IGROV-1；人類腎癌細胞株之RXF-631L、ACHN、UO-31、SN-12C、A498、CAKI-1、RXF-393L、786-0、TK-10；人類胃癌細胞株之MKN45、MKN28、St-4、MKN-1、MKN-7、MKN-74；皮膚癌細胞株之LOX-IMVI、LOX、MALME-3M、SK-MEL-2、SK-MEL-5、SK-MEL-28、UACC-62、UACC-257、M14；白血病細胞株之CCRF-CRM、K562、MOLT-4、HL-60TBRPMI8226、SR、UT7/TPO、Jurkat等。此等之中，特佳為人類卵巢癌細胞株SKOV3、人類子宮頸癌細胞株HeLa、源自人類惡性黑色腫瘤的細胞株A375、源自人類表皮樣細胞癌的細胞株A431、源自人類胃腺癌的細胞株AGS、源自人類前列腺癌的細胞株LNCap clone FGC、源自人類結腸腺癌的細胞株HCT116、源自人類肺胞基底上皮腺癌的細胞株A549及源自人類前列腺癌的細胞DU145是尤其為佳。再者，幹細胞係兼具自我複製的能力及分化成其他複數種系統的細胞之能力的細胞，其例子並不侷限於以下所列舉者，但可列舉：胚胎幹細胞(ES細胞)、胚胎腫瘤細胞、胚胎生殖幹細胞、誘導性多潛能幹細胞(iPS細胞)、神經幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、胰幹細胞、肌幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛囊幹細胞等。就多潛能幹細胞而言，前述幹細胞中，可 舉ES細胞、胚胎生殖幹細胞、iPS細胞。前驅細胞係指由前述幹細胞分化成特定的體細胞、生殖細胞的中間階段的細胞。就幹細胞而言，尤以iPS細胞及間葉系幹細胞(MSC)為佳。

於一態樣中，當使用添加有本發明之組成物的三維細胞培養用培養基而進行培養MSC等幹細胞時，係可維持該細胞原本的形質(例如未分化性)並促進其細胞增殖。MSC的未分化性的維持可藉由以流動式細胞測量術(flow cytometry)(FCM)解析細胞表面標記的呈現加以確認(例如參照WO2016/136986)，MSC的細胞表面標記可列舉CD29、CD73、CD90及CD105等為陽性。因此，本發明也適合使用於MSC等幹細胞的大量生產。

本說明書中「本發明之組成物」之用語可置換為「本發明的劑」或「本發明的培養基添加用劑」之用語。

3.培養基

本發明提供使用含有本發明所用的化合物或本發明之組成物的培養基(以下有時稱為「本發明的培養基」)。藉由使用本發明的培養基，可以達成細胞增殖的促進、球體形成的促進、類器官形成的促進及Cyst形成的促進之任一者或該等的任意組合。又，本發明的培養基尤以三維細胞培養用培養基為佳。

就在本發明的培養基所含有作為有效成分之本發明所用的化合物的濃度而言，若能得到本發明的所 希望的效果則沒有特別的限定，惟例如其濃度的下限值通常可以是0.001μM以上，較佳為0.01μM以上，更佳為0.1μM以上，又更佳為1μM以上，特佳為10μM以上。又，其濃度的上限值通常可以是100μM以下，較佳為50μM以下，特佳為10μM以下。

本發明的培養基除了調配本發明所用的化合物或本發明之組成物以外，可與公知的培養基的組成相同。

在一態樣中，本發明的培養基可以是在市售的培養基(尤其是三維細胞培養用培養基)中添加本發明所用的化合物或組成物而調製。就能夠藉由添加本發明所用的化合物或本發明之組成物而成為本發明的培養基之市售的培養基而言，若能得到所希望的效果便沒有特別的限定，惟例如可列舉：達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle medium；DMEM)、漢氏F12培養基(Ham’s Nutrient Mixture F12)、DMEM/F12培養基、邁克伊氏5A培養基(McCoy’s 5A medium)、伊格爾氏MEM(伊格爾氏基本成分培養基(Eagle's Minimum Essential Medium)；EMEM)、αMEM(alpha改良型伊格爾氏基本成分培養基(alpha-Modified Eagle’s Minimum Essential Medium)；αMEM)、MEM(基本成分培養基；Minimum Essential Medium)、RPMI1640培養基、伊斯科夫改良之達爾伯克氏培養基(Iscove’s Modified Dulbeecco’s Medium；IMDM)、MCDB131培養基、威廉氏培養基E(William’s Medium E)、IPL41培養基、費雪氏培養基(Fischer’s Medium)、StemPro34(Invitrogen公司製)、X-VIVO 10(Cambrex公司製)、X-VIVO 15(Cambrex公司製)、HPGM(Cambrex公司製)、StemSpan H3000(STEMCELL Technologies公司製)、StemSpanSFEM(STEMCELL Technologies公司製)、StemlineII(Sigma Aldrich公司製)、QBSF-60(Quality Biological公司製)、StemProhESCSFM(Invitrogen公司製)、Essential8(註冊商標)培養基(Gibco公司製)、mTeSR1培養基(STEMCELL Technologies公司製)、mTeSR2培養基(STEMCELL Technologies公司製)、ReproFF(Reprocell公司製)、ReproFF2(Reprocell公司製)、StemFit(註冊商標)AK02N(味之素公司製)、StemFit(註冊商標)AK03N(味之素公司製)、PSGro hESC/iPSC培養基(System Biosciences公司製)、NutriStem(註冊商標)培養基(Biological Industries公司製)、CSTI-7培養基(細胞科學研究所公司製)、MesenPRO RS培養基(Gibco公司製)、MF-Medium(註冊商標)間葉系幹細胞增殖培養基(東洋紡股份公司製)、間葉系幹細胞用培養基(PromoCell公司製)、Sf-900II(Invitrogen公司製)、Opti-Pro(Invitrogen公司製)等的培養基。又，可使用在該等的培養基中添加脫醯基化結蘭膠等多糖類而三維細胞培養用培養基化之培養基。如此的三維細胞培養用培養基可列舉例如FCeM(註冊商標)(和光純藥工業股份公司製)，但不侷限於此。

又，亦可視需要而在上述的培養基中添加鈉、鉀、鈣、鎂、磷、氯、各種胺基酸、各種維生素、抗 生素、血清、脂肪酸、糖、細胞增殖因子、分化誘導因子、細胞黏著因子(cell-adhesion factor)、抗體、酶、細胞激素(cytokine)、激素(hormone)、凝集素、細胞外基質、生理活性物質等。

本發明的培養基之細胞培養(尤其是三維細胞培養)可以使用在細胞培養上通常所用的培養皿(schale)、燒瓶、塑膠袋、鐵氟龍(註冊商標)袋、皿(dish)、佩垂培養皿(petri dish)、組織培養用皿、多功能皿(multi-dish)、微量盤、微孔盤、多功能盤、多孔盤、腔室載玻片(chamber slide)、試管、淺盤(tray)、培養袋、滾瓶(roller bottle)等培養容器而實施。為了避免培養的(黏著性的)細胞黏著在培養容器上，該等培養容器係以細胞低黏著性為佳。就細胞非黏著性的培養容器而言，可使用培養容器的表面未經過以提高與細胞的黏著性為目的之人工處理(例如以細胞外基質等的塗佈處理)者、或使用培養容器的表面經過以減低與細胞的黏著性為目的之人工處理者。如此的容器之例可列舉：Sumilon Cell Tight Plate(住友電木股份公司製)、Prime Surface(註冊商標)plate(住友電木股份公司製)、超低黏著表面盤(Corning公司製)、無菌多孔細胞培養盤(Nunclon sphera plate，Thermo Fisher Scientific公司製)等，但不侷限於此等例。

4.促進細胞增殖方法、促進球體形成方法、促進類器官形成方法及促進Cyst形成方法

本發明提供包含將本發明所用的化合物或本發明之 組成物添加於培養基的下述方法：促進細胞增殖的方法、促進球體形成的方法、促進類器官形成的方法、或促進Cyst形成的方法(以下，有時將該等統稱為「本發明的方法」)。

就本發明的方法中所使用的培養基而言是，只要若能得到所希望的效果則沒有特別的限定。較佳為三維細胞培養用培養基。又，本發明的方法之細胞培養條件(例如：溫度、二氧化碳濃度、培養時間等)可使用本身為公知的方法，或者亦可視目的而適當變化。例如，就培養細胞時的溫度而言，若為動物細胞，則通常在25℃至39℃，較佳為33℃至39℃(例如37℃)。二氧化碳濃度通常是在培養的環境中為4體積%至10體積%，以4體積%至6體積%為較佳。培養時間通常是1至35日，但配合培養的目的而適宜設定即可。

形成細胞團塊(球體)的方法並無特別的限制，所屬技術領域中具有通常知識者可以適當選擇。其例可列舉：使用具有細胞不黏著表面的容器的方法、懸滴法(hanging drop method)、旋轉培養法、三維支架(3D-Scaffold)法、離心法、使用藉由電場或磁場的凝集之方法等。例如就使用具有細胞不黏著表面的容器的方法而言，係將目的之細胞在經施行阻礙細胞黏著的表面處理的培養容器中進行培養，而可使其形成球體。使用此種細胞不黏著性培養容器時，首先，在採取目的之細胞之後，調製其細胞懸浮液，在該培養容器中接種而實施培養。持續培養約一週，細胞會自發性地形成球體。這時所使用的細胞非黏著性表 面，可以使用在通常所用的培養皿等的培養容器的表面塗佈有阻礙細胞黏著的物質者等。如此的物質可列舉：瓊脂糖、瓊脂、聚-HEMA(聚-(2-羥基-甲基丙烯酸乙酯)2-甲基丙烯醯基氧乙基磷酸膽鹼)與其他的單體(例如甲基丙烯酸丁酯等)的共聚物、聚(丙烯酸2-甲氧基甲酯)、聚-N-異丙基丙烯醯胺、Mebiol Gel(註冊商標)等，若無細胞毒性即不侷限於該等。

又，作為形成細胞團塊(球體)的方法，也可以使用在NATURE BIOTECHNOLOGY，VOL.28，NO.4，APRIL 2010，361-366，NATURE PROTOCOLS，VOL.6，NO.5，2011，689-700，NATURE PROTOCOLS，VOL.6，NO.5，2011，572-579，Stem Cell Research，7，2011，97-111，Stem Cell Rev and Rep，6，2010，248-259等所記述的方法。

又，在形成球體的培養時使用的培養基中，也可以含有加速球體的形成或促進其維持的成分。就具有如此效果的成分之例而言，可列舉：二甲基亞碸、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)、血漿銅藍蛋白(ceruloplasmin)、過氧化氫酶、過氧化物酶、L-抗壞血酸、L-抗壞血酸磷酸酯、生育酚、類黃酮、尿酸、膽紅素(bilirubin)、含硒化合物、運鐵蛋白(transferrin)、不飽和脂肪酸、白蛋白、茶鹼、毛喉素(forskolin)、抗胰島素(glucagon)、二丁醯環單磷酸腺苷(Dibutyryl cAMP)等。含硒化合物可列舉：亞硒酸鈉、硒酸鈉、二甲基硒化物、硒 化氫、硒甲硫胺酸(selenomethionine)、Se-甲基硒代半胱胺酸、硒代胱硫醚、硒代半胱胺酸、硒代升半胱胺酸(selenohomocysteine)、腺苷-5’-磷硒酸、Se-腺苷基硒甲硫胺酸、Y-27632、法舒地爾(音譯，Fasudil)(HA1077)、H-1152、Wf-536等ROCK抑制劑。又，為了得到目的之大小均勻的細胞團塊，亦可在所使用的細胞非黏附性培養容器上可導入與目的之細胞團塊相同直徑的複數個凹洞。若該等凹洞是互相連接或是在作為目的之細胞團塊的直徑之範圍內，則在接種細胞時，所接種的細胞不會在凹洞與凹洞中間形成細胞團塊，而是確實地在凹洞中形成對應於其容積的大小之細胞團塊，可得到大小均勻的細胞團塊集團。此時的凹洞形狀係以半球或圓錐狀為佳。

或者亦可是基於具有細胞黏著性的支持體來形成球體。此種支持體之例可列舉：膠原蛋白、聚輪烷(polyrotaxane)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸羥乙酸共聚物(PLGA)、水凝膠等。

又，也可以藉由與飼養細胞(feeder cell)共培養來形成球體。就用以促進球體形成的飼養細胞而言，可使用任何黏著性細胞，惟以對應於各種細胞的飼養細胞為較理想。例如在欲形成源自肝臟及軟骨的細胞的球體時，就其飼養細胞的例子而言，適合的細胞物種可列舉COS-1細胞或血管內皮細胞，但上述例子並非用以設限者。

又，亦可選擇懸滴法來作為形成球體的方法。懸滴法例如可列舉：將細胞懸浮液的液滴(容量為10 至50μL左右)點附於培養容器之蓋體等上部內側，以所載液滴呈倒掛垂下的狀態進行培養的方法。此種培養方式，可使細胞與平面的接觸所造成的影響於最小限度，並在液滴的底端形成球體。如此的液滴也可以使用如GravityPLUS Plate(Perkin Elmer公司製)之特殊的培養容器來調製。具體而言，可使用含有100至100000個細胞，較佳為含有200至10000個細胞，更佳為含有500至10000個的細胞的液滴來調製球體。為使球體形成，以培養6至48小時為佳。

球體的大小係因細胞物種及培養時間有所不同，而沒有特別的限定，但為球形狀或楕圓球形狀時直徑是20μm至1000μm，較佳為直徑40μm至500μm，更佳為直徑50μm至300μm，最較佳為直徑80μm至200μm。

如此的球體即使以其原本狀態持繼靜置培養，也可保持增殖能力達10日以上，較佳為13日以上，更佳為30日以上，而藉由在靜置培養中定期地實施物理性分割、或是進一步實施單細胞化處理及凝集，則能夠實質上無限期地保持增殖能力。

就球體的培養所使用的培養容器而言，若為通常可用於動物細胞的培養者則沒有特別的限定，而可列舉例如：燒瓶、皿、佩垂培養皿、組織培養用皿、多功能皿、微量盤、微孔盤、多功能盤、多孔盤、腔室載玻片、細胞培養瓶、旋轉瓶、培養皿、試管、淺盤、培養袋、滾瓶、EZSPHERE(AGCTechnoglass公司製)、Sumilon Cell Tight Plate(住友電木公司製)等。

該等培養容器中，在實施複數個抗癌劑的評估、醫藥品候選化合物或醫藥品的評估時，可適合使用微量盤、微孔盤、多功能盤、多孔盤。此等盤的孔底形狀並無特別的限制，可使用平底、U字型、V字型者，較佳為使用U字型者。此等培養器材的材質並無特別的限制，可列舉例如：玻璃、聚氯乙烯、纖維素系聚合物、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚碸、聚胺酯、聚酯、聚醯胺、聚苯乙烯、聚丙烯等塑膠等。

實施包埋培養時所使用的培養基可含有細胞黏著因子，其例可列舉：Matrigel(註冊商標)、Geltrex(註冊商標)、膠原蛋白、明膠、聚-L-離胺酸、聚-D-離胺酸、層連結蛋白(laminin)、纖維接合素(fibronectin)、玻連蛋白(vitronectin)、腱生蛋白(tenascin)、選擇素(selectin)、玻尿酸、纖維蛋白等。此等細胞黏著因子也可以是將2種類以上組合而添加。再者，可進一步於包埋培養所使用的培養基混合瓊脂、瓜爾膠、大瑪琳膠、藻酸丙二醇酯、刺槐豆膠、阿拉伯膠、塔拉膠(tara gum)、甲基纖維素、羧甲基纖維素、瓊脂糖、大瑪琳籽膠、聚三葡萄糖(pullulan)等增黏劑。此等增黏劑也可以是將2種類以上組合而添加。

形成類器官(將幹細胞或前驅細胞在三維的環境下於活體外培養而形成的微型臟器)或Cyst(由上皮細胞形成的管腔結構)的方法並無特別的限制，所屬技術領域中具有通常知識者可以適當選擇。其例可列舉使用上述包 埋培養的方法。具體而言，可在含有上述細胞黏著因子的包埋培養用培養基中培養目的之細胞或組織，而形成類器官或Cyst。例如於採取目的之細胞或組織後調製其懸浮液，接種於包埋培養用的培養基中而實施培養。持續培養3至14日，則細胞會自發性地形成類器官或Cyst。

在本發明的方法中所使用的培養基(尤其是三維細胞培養用培養基)可使用本發明的培養基。

本發明的方法中，就在培養基中的本發明所使用的化合物或本發明之組成物的濃度及細胞物種等而言，係與在「2.培養基添加用組成物」處所說明者相同。

以下，以實施例更詳細說明本發明，但本發明不侷限於該等實施例。未特別載明時，所使用的試藥等可由商業通路獲得。

[實施例]

以下係表示本發明所使用的化合物之合成方法及結構式。又，¹H-NMR表示質子核磁共振頻譜，係以270MHz或400MHz在氘代二甲基亞碸中測定。化學位移值是以氘代二甲基亞碸的值而記為2.49ppm。又，s表示單峰，同理，以下分別表示：brs是寬單峰，d是雙重峰，dd是雙雙重峰，t是三重峰，q是四重峰，m是多重峰。

[合成例1]以酮及醯肼為原料的本發明化合物的合成

(材料及方法)

由以下圖示的4種酮[1-(2,4-二羥基-3-甲基苯基)丙烷 -1-酮(以下，簡稱為k-1)、1-(2,4-二羥基-3-甲基苯基)乙烷-1-酮(以下，簡稱為k-2)、1-(2,4,6-三羥基-3-甲基苯基)丙烷-1-酮(以下，簡稱為k-3)、1-(2,4-二羥基-3-甲基苯基)-3-甲基丁烷-1-酮(以下，簡稱為k-5)]及10種醯肼[2-(苯基胺基)乙醯肼(以下，簡稱為H-1)、2-(o-甲苯基胺基)乙醯肼(以下，簡稱為H-2)、2-(m-甲苯基胺基)乙醯肼(以下，簡稱為H-3)、2-(p-甲苯基胺基)乙醯肼(以下，簡稱為H-4)、2-[(4-氟苯基)胺基]乙醯肼(以下，簡稱為H-5)、2-(萘-1-基胺基乙醯肼(以下，簡稱為H-6)、2-(苯基胺基)丁烷醯肼(以下，簡稱為H-7)、2-[(4-乙氧基苯基)胺基]乙醯肼(以下，簡稱為H-9)、2-[(4-羥基苯基)胺基]乙醯肼(以下，簡稱為D-2)、2-[(2-羥基苯基)胺基]乙醯肼(以下，簡稱為D-4)]來合成化合物。

將合成的34化合物記於第1表。表中，Me表示甲基，同理，以下分別表示：Et表示乙基，n-Pr表示正丙基，i-Bu表示異丁基，Ph表示苯基，Naph表示萘基。在(R₃)_n中的「-」表示無取代，結構式所記載的號碼表示(R₃)_n的取代位置。

第1表所述的化合物的¹H-NMR的測定結果示於第2表([第2-1表]至[第2-4表])。

以下說明本發明所使用的化合物及合成中間物的化合物之合成法。

4種酮之中，k-1、k-2及k-5可由公知的方法合成(Sum TH et al.,Tetrahedron.2015 Jul 1；71(26-27)： 4557-4564.)。又，10種醯肼之中，H-1、H-2、H-3、H-4、H-5、H-6、H-9、D-2及D-4可由公知的方法合成(Samal RP et al.,Chem Biol Drug Des.2013 Jun；81(6)：715-29.等)。因此，以下詳述k-3及H-7的合成法。

[k-3的合成]

將2,4,6-三羥基苯甲醛(2.22g，14.4mmol)溶解於THF(40mL)，在冰冷下添加NaBH₃CN(2.7g，43mmol)、乙酸(8mL)而在室溫攪拌2小時。將反應溶液以乙酸乙酯(50mL)稀釋，依序以水(50mLx2)、飽和碳酸氫鈉水溶液(50mL)、鹽水(brine)(50mL)清洗。將經無水硫酸鈉乾燥、過濾、減壓下濃縮所得的殘渣以中壓矽膠管柱層析法(矽膠50g、乙酸乙酯/己烷=20/80至50/50)精製，得到為白色固體的中間化合物(1.20g，8.56mmol，產率59%)。

使上述所得的中間化合物(1.04g，7.42mmol)懸浮於丙酸(7mL)，添加丙酸酐(1.15mL，8.90mmol)、BF₃-Et₂O(1.12mL，8.90mmol)在130℃加熱回流1小時。放冷後，將反應溶液以乙酸乙酯(100mL)稀釋，依序以水(100mLx3)、飽和碳酸氫鈉水溶液(100mLx2)、鹽水(100mL)清洗。將經無水硫酸鈉乾燥、過濾、減壓下濃縮所得的殘渣以中壓矽膠管柱層析法(矽膠100g，乙酸乙酯/己烷=10/90至45/55)精製，將所得的固體以己烷清洗而得到為淡橙色固體的k-3(0.41g)。將濾液在減壓下濃縮，將所得的殘渣再次以中壓矽膠管柱層析法(矽膠30g，乙酸乙酯/己烷=10/90至50/50)精製，得到為淡橙色固體的k-3 (0.70g)。以上共得到為淡橙色固體的k-3(1.11g，5.66mmol，產率76%)。

[H-7的合成]

使2-溴丁酸甲酯(8.0g，44mmol)、苯胺(8.0mL，88mmol)溶解於甲苯(10mL)，加熱回流5小時。放冷後，將反應溶液依序以水(30mL)、2M鹽酸(25mL)、水(30mL)、飽和碳酸氫鈉水溶液(30mL)、鹽水(30mL)清洗，以無水硫酸鈉乾燥。將過濾、減壓下濃縮所得的殘渣以中壓矽膠管柱層析法(矽膠100g，乙酸乙酯/己烷=1/99至10/90)精製，得到為黃色液體的中間化合物(5.11g，26.4mmol，產率60%)。

使上述所得中間化合物(5.11g，26.4mmol)溶解於甲醇(26mL)，添加肼‧1水合物(12.8mL，264mmol)在室溫攪拌4.5小時。添加水(150mL)，以二氯甲烷(30mLx5)萃取。將有機層以飽和食鹽水(100mL)清洗，並將經無水硫酸鎂乾燥、過濾、減壓下濃縮所得的固體以IPE清洗，得到為白色固體的H-7(4.60g，23.8mmol，產率90%)。

[k-1：H-1的合成]

將k-1(100mg，0.555mmol)、H-1(110mg，0.666mmol)溶解於DMSO(1.1mL)，在100℃攪拌14小時。放冷後，添加蒸餾水(11mL)，再次在100℃攪拌後，進行熱過濾而得到k-1：H-1(70.1mg，0.214mmol，產率39%)的淡黃色固體。

[k-1：H-2的合成]

將k-1(50mg，0.28mmol)、H-2(69mg，0.33mmol)溶解 於DMSO(0.55mL)，在100℃攪拌18小時。放冷後，添加蒸餾水(6mL)而進行傾析，將剩下的固體依序以二氯甲烷、乙酸乙酯清洗。使所得的殘渣溶解於DMSO(0.2mL)，將添加水而析出的固體以甲醇清洗，得到為淡橙色固體的k-1：H-2(19.6mg，0.0574mmol，產率21%)。

[k-1：H-3的合成]

使k-1(100mg，0.555mmol)、H-3(119mg，0.666mmol)溶解於DMSO(1.1mL)，在100℃攪拌14小時。在相同溫度下添加蒸餾水(11mL)並放冷後，濾取析出的固體，以甲醇清洗而得到為白色固體的k-1：H-3(98.9mg，0.290mmol，產率52%)。

[k-1：H-4的合成]

使k-1(50mg，0.28mmol)、H-4(65mg，0.36mmol)溶解於DMSO(0.55mL)，在100℃攪拌19小時。放冷後，添加蒸餾水(6mL)並濾取析出的固體，以乙酸乙酯清洗而得到為淡黃色固體的k-1：H-4(28.6mg，0.0838mmol，產率30%)。

[k-1：H-5的合成]

使k-1(100mg，0.555mmol)、H-5(122mg，0.666mmol)溶解於DMSO(1.1mL)，在100℃攪拌14小時。在相同溫度下添加蒸餾水(11mL)並放冷後，濾取析出的固體，以甲醇清洗而得到為淡黃色固體的k-1：H-5(55.6mg，0.161mmol，產率29%)。

[k-1：H-6的合成]

使k-1(100mg，0.555mmol)、H-6(143mg，0.666mmol)溶解於DMSO(1.1mL)，在100℃攪拌14小時。放冷後，添加蒸餾水(11mL)並濾取析出的固體，以二氯甲烷清洗而得到為茶色固體的k-1：H-6(86.5mg，0.229mmol，產率41%)。

[k-1：H-7的合成]

使k-1(50mg，0.28mmol)、H-7(54mg，0.28mmol)溶解於DMSO(0.55mL)，在100℃攪拌17小時。放冷後，添加蒸餾水(6mL)而進行傾析，使殘渣溶解於二氯甲烷(0.5mL)。添加己烷(0.5mL)，並濾取析出的固體而得到為白色固體的k-1：H-7(56.8mg，0.160mmol，產率57%)。

[k-1：H-9的合成]

使k-1(150mg，0.83mmol)、H-9(226mg，1.08mmol)懸浮於DMSO(0.55mL)，在100℃攪拌17小時。放冷後，添加蒸餾水(20mL)而進行傾析，將所得的殘渣以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/己烷=10/90至60/40)精製。將所得的固體以二氯甲烷清洗而得到為白色固體的k-1：H-9(40.2mg，0.108mmol，產率13%)。

[k-2：H-1的合成]

使k-2(80mg，0.48mmol)、H-1(95.4mg，0.578mmol)溶解於DMSO(1.0mL)，在100℃攪拌15小時。放冷後，添加蒸餾水(10mL)並濾取析出的固體，以二氯甲烷清洗而得到為黃色固體的k-2：H-1(80.4mg，0.257mmol，產率53%)。

[k-2：H-2的合成]

使k-2(80mg，0.48mmol)、H-2(112mg，0.625mmol)溶解於DMSO(1mL)，在100℃攪拌19小時。放冷後，添加蒸餾水(30mL)、乙酸乙酯(30mL)而分液，將有機層以飽和食鹽水(30mL)清洗。將經無水硫酸鈉乾燥、過濾、減壓下濃縮所得的殘渣以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/己烷=10/90至80/20)精製而得到為淡黃色固體的k-2：H-2(34mg，0.10mmol，產率21%)。

[k-2：H-3的合成]

使k-2(80mg，0.48mmol)、H-3(104mg，0.578mmol)溶解於DMSO(1mL)，在100℃攪拌15小時。放冷後，添加蒸餾水(10mL)而進行傾析，使所得的殘渣溶解於二氯甲烷(3mL)，添加己烷(3mL)並濾取析出的固體。將所得的固體以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/己烷=50/50至80/20)精製而得到為淡黃色固體的k-2：H-3(46.9mg，0.143mmol，產率30%)。

[k-2：H-4的合成]

使k-2(80mg，0.48mmol)、H-4(112mg，0.625mmol)溶解於DMSO(1mL)，在100℃攪拌19小時。放冷後，添加蒸餾水(10mL)而進行傾析，將殘渣以二氯甲烷清洗而得到為淡黃色固體的k-2：H-4(58.7mg，0.179mmol，產率37%)。

[k-2：H-5的合成]

使k-2(80mg，0.48mmol)、H-5(106mg，0.578mmol)溶解於DMSO(1mL)，在100℃攪拌15小時。放冷後，添 加蒸餾水(10mL)而進行傾析，使所得的殘渣溶解於二氯甲烷(3mL)，添加己烷(1mL)並濾取析出的固體。將所得的固體以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/己烷=50/50至80/20)精製而得到為白色固體的k-2：H-5(36.6mg，0.110mmol，產率23%)。

[k-2：H-6的合成]

使k-2(100mg，0.602mmol)、H-6(155mg，0.722mmol)溶解於DMSO(1mL)，在100℃攪拌15小時。放冷後，添加蒸餾水(10mL)而進行傾析，將所得的殘渣以二氯甲烷清洗而得到為淡茶色固體的k-2：H-6(59.3mg，0.163mmol，產率27%)。

[k-2：H-7的合成]

使k-2(80mg，0.48mmol)、H-7(121mg，0.626mmol)溶解於DMSO(0.55mL)，在100℃攪拌7小時。放冷後，添加蒸餾水(20mL)、乙酸乙酯(20mL)而分液，將有機層以飽和食鹽水(20mL)清洗。將經無水硫酸鈉乾燥、過濾、減壓下濃縮所得的殘渣以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/己烷=5/95至50/50)精製而得到為淡黃色固體的k-2：H-7(109mg，0.319mmol，產率66%)。

[k-2：H-9的合成]

使k-2(100mg，0.60mmol)、H-9(164mg，0.784mmol)懸浮於DMSO(1.2mL)，在100℃攪拌18小時。放冷後，添加蒸餾水(12mL)、乙酸乙酯(20mL)而分液，將有機層以飽和食鹽水(20mL)清洗。將經無水硫酸鈉乾燥、過濾、減 壓下濃縮所得的殘渣以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/己烷=10/90至60/40)精製，將所得的固體以二氯甲烷清洗而得到為淡黃色固體的k-2：H-9(63.1mg，0.177mmol，產率30%)。

[k-3：H-1的合成]

使k-3(200mg，1.02mmol)、H-1(253mg，1.53mmol)溶解於DMSO(2.0mL)，在100℃攪拌3日。放冷後，添加蒸餾水(15mL)而進行傾析，將所得的殘渣以中壓矽膠管柱層析法(矽膠30g，乙酸乙酯/己烷=40/60至70/30)精製。將所得的固體以二氯甲烷清洗而得到為淡茶色固體的k-3：H-1(25.0mg，0.0728mmol，產率7.1%)。

[k-3：H-2的合成]

使k-3(200mg，1.02mmol)、H-2(237mg，1.33mmol)溶解於DMSO(2mL)，在100℃攪拌4日。放冷後，添加蒸餾水(15mL)而濾取析出的固體，以甲醇清洗。將所得的固體以中壓矽膠管柱層析法(矽膠30g，乙酸乙酯/己烷=40/60至70/30)精製。將所得的固體以二氯甲烷清洗而得到為淡茶色固體的k-3：H-2(10.3mg，0.0288mmol，產率2.8%)。

[k-3：H-3的合成]

使k-3(200mg，1.02mmol)、H-3(219mg，1.22mmol)溶解於DMSO(2mL)，在100℃攪拌5日。放冷後，添加蒸餾水(15mL)而濾取析出的固體，以中壓矽膠管柱層析法(矽膠30g，乙酸乙酯/己烷=40/60至70/30)精製。將所得的 固體以二氯甲烷清洗而得到為淡茶色固體的k-3：H-3(17.9mg，0.0501mmol，產率4.9%)。

[k-3：H-4的合成]

使k-3(200mg，1.02mmol)、H-4(237mg，1.33mmol)溶解於DMSO(2mL)，在100℃攪拌4日。放冷後，添加蒸餾水(15mL)而濾取析出的固體，以中壓矽膠管柱層析法(矽膠30g，乙酸乙酯/己烷=40/60至70/30)精製。將所得的固體以二氯甲烷清洗而得到為淡茶色固體的k-3：H-4(17.9mg，0.0501mmol，產率4.9%)。

[k-3：H-5的合成]

使k-3(200mg，1.02mmol)、H-5(224mg，1.22mmol)溶解於DMSO(2mL)，在100℃攪拌6日。放冷後，添加蒸餾水(15mL)而進行傾析，使所得的殘渣溶解於二氯甲烷(3mL)，添加己烷(1mL)而濾取析出的固體，以中壓矽膠管柱層析法(矽膠30g，乙酸乙酯/己烷=40/60至70/30)精製。將所得的固體以二氯甲烷清洗而得到為淡茶色固體的k-3：H-5(13.7mg，0.0379mmol，產率3.7%)。

[k-3：H-6的合成]

使k-3(100mg，0.510mmol)、H-6(121mg，0.561mmol)溶解於DMSO(2mL)，在100℃攪拌4日。放冷後，添加蒸餾水(15mL)而進行傾析，將所得的殘渣以中壓矽膠管柱層析法(矽膠30g，乙酸乙酯/己烷=40/60至70/30)精製。將所得的固體以二氯甲烷清洗而得到為橙色固體的k-3：H-6(17.0mg，0.0432mmol，產率8.5%)。

[k-3：H-7的合成]

使k-3(200mg，1.02mmol)、H-7(256mg，1.33mmol)溶解於DMSO(2mL)，在100℃攪拌3日。放冷後，添加蒸餾水(15mL)而進行傾析，將所得的殘渣以中壓矽膠管柱層析法(矽膠30g，乙酸乙酯/己烷=40/60至70/30)精製。將所得的固體以二氯甲烷清洗而得到為白色固體的k-3：H-7(28.3mg，0.762mmol，產率7.5%)。

[k-3：H-9的合成]

使k-3(200mg，1.02mmol)、H-9(277mg，1.33mmol)溶解於DMSO(2mL)，在100℃攪拌4日。放冷後，添加蒸餾水(15mL)而濾取析出的固體，並以中壓矽膠管柱層析法(矽膠30g，乙酸乙酯/己烷=40/60至70/30)精製。將所得的固體以二氯甲烷清洗而得到為淡茶色固體的k-3：H-9(11.2mg，0.0289mmol，產率2.8%)。

[k-5：H-1的合成]

使k-5(100mg，0.48mmol)、H-1(95.2mg，0.576mmol)溶解於DMSO(1mL)，在100℃攪拌4日。放冷後，添加蒸餾水(10mL)而濾取析出的固體，依序以二氯甲烷、甲醇清洗而得到為黃色固體的k-5：H-1(38.1mg，0.107mmol，產率22%)。

[k-5：H-2的合成]

使k-5(100mg，0.48mmol)、H-2(112mg，0.625mmol)溶解於DMSO(1mL)，在100℃攪拌3日。添加蒸餾水(10mL)而進行傾析，將殘渣溶解於二氯甲烷(2mL)，以芒硝乾燥。 在過濾、減壓下濃縮所得的殘渣中添加二氯甲烷(1mL)，曝露於超音波並濾取析出的固體，而得到為黃色固體的k-5：H-2(18.6mg，0.0503mmol，產率10%)。

[k-5：H-3的合成]

使k-5(100mg，0.480mmol)、H-3(103mg，0.576mmol)溶解於DMSO(1mL)，在100℃攪拌4日。放冷後，添加蒸餾水(10mL)並濾取析出的固體，以二氯甲烷清洗而得到為黃色固體的k-5：H-3(44.6mg，0.121mmol，產率25%)。

[k-5：H-4的合成]

使k-5(100mg，0.480mmol)、H-4(112mg，0.625mmol)溶解於DMSO(1mL)，在100℃攪拌3日。添加蒸餾水(10mL)並濾取析出的固體，以二氯甲烷清洗而得到為黃色固體的k-5：H-4(44.4mg，0.120mmol，產率25%)。

[k-5：H-5的合成]

使k-5(100mg，0.480mmol)、H-5(106mg，0.576mmol)溶解於DMSO(2mL)，在100℃攪拌4日。放冷後，添加蒸餾水(10mL)，濾取析出的固體而得到為黃色固體的k-5：H-5(37.4mg，0.100mmol，產率21%)。

[k-5：H-6的合成]

使k-5(100mg，0.480mmol)、H-6(124mg，0.576mmol)溶解於DMSO(1mL)，在100℃攪拌5日。放冷後，添加蒸餾水(10mL)並濾取析出的固體，以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/己烷=20/80至50/50)精製。將所得的固體以甲醇清洗而得到為淡黃色固體的k-5：H-6(28.1mg， 0.0693mmol，產率14%)。

[k-5：H-7的合成]

使k-5(100mg，0.480mmol)、H-7(121mg，0.626mmol)溶解於DMSO(1mL)，在100℃攪拌4日。放冷後，添加蒸餾水(10mL)並濾取析出的固體，依序以乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇清洗而得到為白色固體的k-5：H-7(43.6mg，0.114mmol，產率24%)。

[k-5：H-9的合成]

使k-5(150mg，0.72mmol)、H-9(196mg，0.937mmol)懸浮於DMSO(1.4mL)，在100℃攪拌3日。放冷後，添加蒸餾水(12mL)、二氯甲烷(20mL)而分液，將有機層依序以飽和食鹽水(20mL)清洗。將經無水硫酸鈉乾燥、過濾、減壓下濃縮所得的殘渣以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/己烷=10/90至50/50)精製而得到為淡黃色固體的k-5：H-9(72.0mg，0.180mmol，產率25%)。

又，化合物號碼k-1：D-2及k-1：D-4亦可依照上述的合成法的方法進行合成。

[合成例2]k-1：A-1的合成

使k-1(100mg，0.55mmol)、甘胺酸乙酯鹽 酸鹽(A-1)(100mg，0.72mmol)、乙酸鈉(64mg，0.78mmol)溶解於DMSO(1.1mL)，在100℃攪拌2小時。放冷後，添加水(20mL)、乙酸乙酯(20mL)而分液，將有機層以飽和食鹽水(20mL)清洗。以無水硫酸鈉乾燥、過濾、減壓下濃縮，將所得的殘渣以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/己烷=10/90至50/50)精製。將所得的固體以IPE清洗而得到為黃色固體的k-1：A-1(21.9mg，0.0825mmol，產率15%)。

¹H-NMR(270MHz)；δ9.69(s,1H),7.32(d,J=8.1Hz,1H),6.30(d,J=10.8Hz,1H),5.76(s,1H),4.48(s,2H),4.19(q,J=8.1Hz,2H),2.67(q,J=8.1Hz,2H),1.94(s,3H),1.24(t,J=8.1Hz,3H),1.08(t,J=8.1Hz,3H).

[合成例3]k-1：A-2的合成

使k-1(100mg，0.55mmol)、甘胺酸苄酯p-甲苯磺酸鹽(A-2)(243mg，0.721mmol)、乙酸鈉(64mg，0.78mmol)溶解於DMSO(1.1mL)，在100℃攪拌2小時。放冷後，添加水(20mL)、乙酸乙酯(20mL)而分液，將有機層以飽和食鹽水(20mL)清洗。以無水硫酸鈉乾燥、過濾、減壓下濃縮，將所得的殘渣以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g， 乙酸乙酯/己烷=5/95至50/50)精製。將所得的固體以IPE清洗而得到為黃色固體的k-1：A-2(25.0mg，0.0764mmol，產率14%)。

¹H-NMR(270MHz)；δ9.69(s,1H),7.45-7.35(m,6H),7.32(d,J=10.8Hz,1H),6.31(d,J=10.8Hz,1H),5.23(s,2H),4.56(s,2H),2.70(q,J=8.1Hz,2H),1.94(s,3H),1.08(t,J=8.1Hz,3H).

[合成例4]k-1：A-3的合成

使k-1(100mg，0.55mmol)溶解於DMSO(1.1mL)，添加正辛基胺(A-3)(120mL，0.72mmol)，在室溫攪拌2小時，在100℃攪拌17小時。放冷後，添加水(20mL)、乙酸乙酯(20mL)而分液，將有機層以飽和食鹽水(20mL)清洗。以無水硫酸鈉乾燥、過濾、減壓下濃縮，將所得的殘渣以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/己烷=0/100至20/80)精製。將所得的固體以IPE清洗而得到為黃色固體的k-1：A-3(60.1mg，0.206mmol，產率37%)。

¹H-NMR(270MHz)；δ9.52(s,1H),7.25(d,J=8.1Hz,1H),6.20(d,J=8.1Hz,1H),5.31(t,J=8.1Hz,2H),2.73(q,J=8.1Hz,2H),1.90(s,3H),1.64(m,2H),1.30-1.05 (m,10H),1.11(t,J=8.1Hz,3H),0.86(t,J=8.1Hz,3H).

[合成例5]k-1：A-5的合成

使k-1(300mg，1.7mmol)溶解於2M氨/甲醇溶液(17mL，33mmol)，在室溫攪拌1週。在該1週間，每日通氨氣起泡15分鐘。將反應溶液在減壓下濃縮，得到為土黃色固體的4-(1-亞胺基丙基)-2-甲基苯-1,3-二醇(k-1’)及k-1的混合物(292mg，k-1’：k-1=1：0.2)。使上述所得的k-1’及k-1的混合物(292mg)溶解於THF(6.5mL)，在冰冷下，添加異氰酸苯酯(A-5)(158mL，1.46mmol)。在相同溫度下攪拌30分鐘後，添加水(30mL)、乙酸乙酯(30mL)而分液，將有機層以飽和食鹽水(30mL)清洗。以無水硫酸鈉乾燥、過濾、減壓下濃縮，將所得的殘渣以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/己烷=5/95至45/55)精製。將所得的固體以IPE清洗而得到為淡黃色固體的k-1：A-5(160mg，0.536mmol，2製程產率32%)。

¹H-NMR(270MHz)；δ13.74(s,1H),10.22(s,1H),10.11(s,1H),7.63(d,J=8.1Hz,2H),7.53(d,J=8.1Hz,1H),7.32(t,J=8.1Hz,2H),7.06(t,J=8.1Hz,1H),6.49(d,J=8.1Hz,1H),2.84(q,J=8.1Hz,2H),2.00(s,3H),1.24(t, J=8.1Hz,3H).

[合成例6]k-1：H-10的合成

使k-1(100mg，0.55mmol)、4-苯基半卡肼(H-10)(109mg，0.721mmol)溶解於DMSO(1.1mL)，在100℃攪拌3.5小時。放冷後，添加水(20mL)、乙酸乙酯(20mL)而分液，將有機層以飽和食鹽水(20mL)清洗。以無水硫酸鈉乾燥、過濾、減壓下濃縮，將所得的殘渣以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/己烷=10/90至50/50)精製。將所得的固體以IPE清洗而得到為白色固體的k-1：H-10(19.1mg，0.0610mmol，產率11%)。

¹H-NMR(270MHz)：δ13.50(s,1H),9.75(s,1H),9.59(s,1H),8.82(s,1H),7.49(d,J=8.1Hz,2H),7.30(t,J=8.1Hz,2H),7.21(d,J=8.0Hz,1H),6.99(t,J=8.1Hz,1H),6.39(d,J=8.1Hz,1H),2.70(q,J=8.1Hz,2H),1.99(s,3H),1.14(t,J=8.1Hz,3H).

[合成例7]k-1：I-1的合成

使肼一水合物(0.26mL，5.3mmol)溶解於二氯甲烷(5.3mL)，於冰冷下徐緩地添加異氰酸苄酯(101)(0.324mL，2.63mmol)。在室溫下攪拌3小時，將析出的固體以IPE清洗後，在減壓下乾燥，得到為白色固體的102(352mg，2.13mmol，產率82%)。

使上述所得的102(155mg，0.938mmol)、k-1(130mg，0.72mmol)溶解於DMSO(1.4mL)，在100℃攪拌3.5小時。放冷後，添加蒸餾水(10mL)，濾取析出的固體，以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/己烷=10/90至55/45)精製。將所得的固體以二氯甲烷清洗後，在減壓下乾燥，得到為白色固體的k-1：I-1(55mg，0.17mmol，產率24%)。

¹H-NMR(400MHz)；δ9.59(s,1H),9.56(s,1H),7.40-7.25(m,5H),7.17(d,J=12.0Hz,1H),6.84(t,J=8.0Hz,NH),6.37(d,J=12.0Hz,1H),4.34(d,J=8.0Hz,2H),2.65(q,J=8.0Hz,2H),1.97(s,3H),1.08(t,J=8.0Hz,3H).(未觀測到NH的一個信號。)

[合成例8]k-1：I-3的合成

使肼一水合物(0.20mL，4.2mmol)溶解於二氯甲烷(4.2mL)，在冰冷下徐緩地添加異氰酸4-氯苄酯(103)(0.278mL，2.09mmol)。在室溫攪拌1.5小時，濾取析出的固體後，在減壓下乾燥，得到為白色固體的104(315mg，1.58mmol，產率75%)。

使上述所得的104(187mg，0.937mmol)、k-1(130mg，0.72mmol)溶解於DMSO(1.4mL)，在100℃攪拌22小時。將反應溶液直接以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/己烷=10/90至65/35)精製，將所得的精製物溶解於乙酸乙酯，添加己烷並濾取析出的固體後，在減壓下乾燥，得到為白色固體的k-1：I-3(155mg，0.428mmol，產率59%)。

¹H-NMR(400MHz)；δ9.63(s,1H),9.56(s,1H),7.41(d,J=8.0Hz,2H),7.34(d,J=8.0Hz,2H),7.17(d,J=8.0Hz,1H),6.89(t,J=8.0Hz,NH),6.36(d,J=8.0Hz,1H),4.31(d,J=8.0Hz,2H),2.65(q,J=8.0Hz,2H),1.97(s,3H),1.08(t,J=8.0Hz,3H).(未觀測到NH的一個信號。)

[合成例9]k-1：I-6的合成

使肼一水合物(0.23mL，4.8mmol)溶解於二氯甲烷(8mL)，在冰冷下徐緩地添加異氰酸4-甲基苄酯(105)(350mg，2.4mmol)。在室溫攪拌2小時，濾取析出的固體後，在減壓下乾燥，得到為白色固體的106(297mg，1.66mmol，產率69%)。

使上述所得的106(168mg，0.937mmol)、k-1(130mg，0.72mmol)懸浮於DMSO(2.8mL)，在100℃攪拌22小時。將反應溶液直接以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/己烷=10/90至60/40)精製，將所得的精製物溶解於乙酸乙酯(30mL)，並依序以水(20mL)、飽和食鹽水(30mL)清洗。將經無水硫酸鈉乾燥、過濾、減壓下濃縮所得的固體以二氯甲烷清洗後，在減壓下乾燥，得到為白色固體的k-1：I-6(118mg，0.346mmol，產率48%)。

¹H-NMR(400MHz)；δ9.56(s,1H),9.55(s,1H),7.20(d,J=8.0Hz,2H),7.16(d,J=8.0Hz,2H),7.15(d,J=8.0Hz,1H),6.78(t,J=8.0Hz,NH),6.36(d,J=8.0Hz,1H),4.29(d,J=8.0Hz,2H),2.64(q,J=8.0Hz,2H),2.28(s,3H),1.97(s,3H),1.07(t,J=8.0Hz,3H).(未觀測到NH的一個信號。)

[合成例10]k-1：I-7的合成

使肼一水合物(0.21mL，4.3mmol)溶解於二氯甲烷(4.3mL)，在冰冷下徐緩地添加異氰酸4-甲氧基苄酯(107)(350mg，2.15mmol)。在室溫攪拌2小時，濾取析出的固體後，在減壓下乾燥，得到為白色固體的108(381mg，1.95mmol，產率93%)。

使上述所得的108(183mg，0.937mmol)、k-1(130mg，0.72mmol)懸浮於DMSO(2.8mL)，在100℃攪拌5小時。放冷後，添加蒸餾水(15mL)，濾取析出的固體，以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/己烷=15/85至65/35)精製，將所得的固體以二氯甲烷清洗後，在減壓下乾燥，得到為白色固體的k-1：I-7(55.0mg，0.154mmol，產率21%)。

¹H-NMR(400MHz)；δ9.55(s,2H),7.25(d,J=8.0Hz,2H),7.16(d,J=8.0Hz,1H),6.91(d,J=8.0Hz,2H),6.75(t,J=8.0Hz,NH),6.36(d,J=8.0Hz,1H),4.26(d,J=8.0Hz,2H),3.73(s,3H),2.63(q,J=8.0Hz,2H),1.97(s,3H),1.07(t,J=8.0Hz,3H).(未觀測到NH的一個信號。)

將依照上述合成法的方法所合成的化合物示於第3表。

又，將第3表所述的化合物之¹H-NMR的測定結果示於第4表。

[合成例11]k-1：B-1的合成

使2-溴丙酸甲酯(109)(500mg，3.0mmol)溶 解於DMSO(6mL)，添加苯胺(0.36mL，3.9mmol)、碳酸鉀(0.54g，3.9mmol)，在室溫攪拌21小時。添加乙酸乙酯(30mL)、水(50mL)而分液，將有機層以飽和食鹽水(30mL)清洗，以無水硫酸鈉乾燥。將過濾、減壓下濃縮所得的殘渣以中壓矽膠層析法(矽膠30g，乙酸乙酯/己烷=2/98至15/85)精製，得到為淡黃色液體的110(343mg，1.91mmol，產率64%)。

將上述所得的110(340mg，1.9mmol)溶解於甲醇(3.8mL)，添加肼一水合物(0.18mL，3.8mmol)，在60℃攪拌24小時。追加肼一水合物(0.36mL，7.4mmol)，在60℃再攪拌17小時。將反應溶液在減壓下濃縮所得的殘渣以中壓矽膠層析法(胺矽膠10g，乙酸乙酯/二氯甲烷=0/100至20/80)精製，得到為白色固體的111(321mg，1.79mmol，產率94%)。

使上述所得的111(168mg，0.937mmol)、k-1(130mg，0.72mmol)溶解於DMSO(1.4mL)，在100℃攪拌19小時。放冷後，添加蒸餾水(15mL)，將析出的固體濾取、乾燥並將所得的黃色固體以二氯甲烷清洗後，在減壓下乾燥，得到為淡黃色固體的k-1：B-1(173mg，0.507mmol，產率70%)。

¹H-NMR(400MHz)：δ10.82(s,1H),9.71(s,1H),7.25(d,J=8.0Hz,1H),7.07(t,J=8.0Hz,2H),6.63(d,J=8.0Hz,2H),6.56(t,J=8.0Hz,1H),6.39(d,J=8.0Hz,1H),5.93(d,J=12Hz,NH),4.28(m,1H),2.80(q,J=8.0Hz,2H),1.95(s, 3H),1.40(d,J=8.0Hz,3H),1.03(t,J=8.0Hz,3H).(未觀測到NH的一個信號。)

[合成例12]k-1：B-2的合成

使2-溴異吉草酸乙酯(112)(700mg，3.3mmol)溶解於DMSO(7mL)，添加苯胺(0.40mL，4.4mmol)、碳酸鉀(0.60g，4.4mmol)，在室溫攪拌21小時，在80℃攪拌6小時，在120℃攪拌20小時。添加乙酸乙酯(30mL)、水(50mL)而分液，將有機層以飽和食鹽水(30mL)清洗，以無水硫酸鈉乾燥。將過濾、減壓下濃縮所得的殘渣以中壓矽膠層析法(矽膠30g，乙酸乙酯/己烷=0/100至5/95)精製，得到為黃色液體的113(110mg，0.497mmol，產率15%)。

使上述所得的113(96mg，0.43mmol)溶解於甲醇(1mL)，添加肼一水合物(0.042mL，0.87mmol)，在50℃攪拌4小時，追加肼一水合物(0.2mL，4.1mmol)並攪拌20小時，追加肼一水合物(0.1mL，2.1mmol)並再攪拌23 小時。將反應溶液在減壓下濃縮，將所得的殘渣以中壓矽膠層析法(胺矽膠10g，乙酸乙酯/二氯甲烷=0/100至5/95)精製，得到為白色固體的114(80.7mg，0.389mmol，產率90%)。

將上述所得的114(75mg，0.36mmol)、k-1(50mg，0.28mmol)溶解於DMSO(0.6mL)，在100℃攪拌18小時。放冷後，將反應溶液直接以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/己烷=10/90至75/25)精製，將所得的固體以二氯甲烷/IPE清洗後，在減壓下乾燥，得到為白色固體的k-1：B-2(37.6mg，0.102mmol，產率36%)。

¹H-NMR(400MHz)：δ10.83(s,1H),9.72(s,1H),7.26(d,J=8.0Hz,1H),7.05(t,J=8.0Hz,2H),6.71(d,J=8.0Hz,2H),6.53(t,J=8.0Hz,1H),6.39(d,J=8.0Hz,1H),5.78(d,J=12Hz,NH),3.97(m,1H),2.82(q,J=8.0Hz,2H),2.03(m,1H),1.95(s,3H),1.06(t,J=8.0Hz,3H),0.97(d,J=8.0Hz,6H).(未觀測到NH的一個信號。)

[合成例13]k-1：B-3的合成

使2-溴-正辛酸(115)(600mg，2.7mmol)溶解於甲醇(5.5mL)，添加濃鹽酸(3滴)，在50℃攪拌18小時。放冷後，添加二乙醚(30mL)、飽和碳酸氫鈉水溶液(20mL)而分液，將有機層以飽和食鹽水(20mL)清洗，以無水硫酸鈉乾燥。過濾、減壓下濃縮而得到為黃色液體的116(588mg，2.48mmol，產率92%)。

使上述所得的116(585mg，2.47mmol)溶解於DMSO(5mL)，添加苯胺(0.29mL，3.2mmol)、碳酸鉀(0.44g，3.2mmol)，在室溫攪拌21小時，在60℃攪拌16小時。添加乙酸乙酯(30mL)、水(50mL)而分液，將有機層以飽和食鹽水(30mL)清洗，以無水硫酸鈉乾燥。將過濾、減壓下濃縮所得的殘渣以中壓矽膠層析法(矽膠30g，乙酸乙酯/己烷=1/99至5/95)精製，得到為黃色液體的117(277mg，1.11mmol，產率45%)。

將上述所得的117(256mg，1.08mmol)溶解於甲醇(2.2mL)，添加肼一水合物(0.10mL，2.2mmol)，在 50℃攪拌4小時，追加肼一水合物(0.50mL，10.3mmol)並攪拌20小時，追加肼一水合物(0.25mL，5.2mmol)並再攪拌23小時。將反應溶液在減壓下濃縮，將所得的殘渣以中壓矽膠層析法(胺矽膠10g，乙酸乙酯/二氯甲烷=0/100至5/95)精製，得到為淡黃色固體的118(268mg，1.07mmol，產率99%)。

將上述所得的118(144mg，0.58mmol)、k-1(80mg，0.44mmol)溶解於DMSO(0.9mL)，在100℃攪拌18小時。放冷後，將反應溶液直接以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/己烷=5/95至75/25)，繼而以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/二氯甲烷=1/99至5/95)精製，將所得的固體以二氯甲烷/IPE清洗後，在減壓下乾燥，得到為白色固體的k-1：B-3(88.7mg，0.216mmol，產率49%)。

¹H-NMR(400MHz)：δ10.82(s,1H),9.72(s,1H),7.25(d,J=8.0Hz,1H),7.06(t,J=8.0Hz,2H),6.65(d,J=8.0Hz,2H),6.54(t,J=8.0Hz,1H),6.39(d,J=8.0Hz,1H),5.87(d,J=8.0Hz,NH),4.19(m,1H),2.81(q,J=8.0Hz,2H),1.95(s,3H),1.73(q,J=8.0Hz,2H),1.33(m,4H),1.27(m,4H),1.03(t,J=8.0Hz,3H),0.86(t,J=8.0Hz,3H).(未觀測到NH的一個信號。)

[合成例14]k-1：B-5的合成

使苯丙酮酸(119)(1.0g，6.1mmol)溶解於DMF(5mL)，在冰冷下添加DBU(1.0mL，6.7mmol)、碘甲烷(0.42mL，6.7mmol)，在室溫下攪拌3小時。添加乙酸乙酯(30mL)、1M鹽酸(50mL)而分液，將有機層以飽和食鹽水(50mL)清洗，以無水硫酸鈉乾燥。將過濾、減壓下濃縮所得的殘渣以中壓矽膠層析法(矽膠30g，乙酸乙酯/己烷=0/100至13/87)精製，得到為白色固體的120a(298mg，1.67mmol，產率27%)。

使上述所得的120a(295mg，1.66mmol)溶解於甲醇(6.6mL)、乙酸(0.66mL)、2M乙胺THF溶液(0.87mL，1.7mmol)，在冰冷下添加甲基吡啶硼烷(0.35g，3.3mmol)，在室溫攪拌2.5小時。添加4M鹽酸(3mL)，在50℃加熱30分鐘，放冷後，添加乙酸乙酯(20mL)、飽和碳酸氫鈉水溶液(50mL)而分液。將有機層以飽和食鹽水(20mL)清洗，將以無水硫酸鈉乾燥、過濾、減壓下濃縮所得的殘渣以中壓矽膠層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/己烷=2/98至30/70) 精製，得到120b(48.9mg，0.236mmol，產率14%)。

將上述所得的120b(45mg，0.22mmol)溶解於甲醇(0.9mL)，添加肼一水合物(0.021mL，0.43mmol)，在50℃攪拌3小時，追加甲醇(0.9mL)、肼一水合物(0.021mL，0.43mmol)並攪拌12小時，追加甲醇(0.9mL、肼一水合物(0.021mL，0.43mmol)並再攪拌3小時。將反應溶液在減壓下濃縮，將所得的殘渣以中壓矽膠層析法(胺矽膠10g，乙酸乙酯/二氯甲烷=0/100至20/80)精製，得到為淡黃色液體的120c(32mg，0.15mmol，產率68%)。

使上述所得的120c(30mg，0.14mmol)、k-1(25mg，0.14mmol)溶解於DMSO(0.3mL)，在100℃攪拌18小時。放冷後，將反應溶液直接以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/二氯甲烷=10/90至60/40)精製，將所得的固體以IPE清洗後，在減壓下乾燥，得到為白色固體的k-1：B-5(18.4mg，0.0498mmol，產率36%)。

¹H-NMR(400MHz)：δ9.72(s,1H),7.30-7.10(m,6H),6.38(d,J=8.0Hz,1H),3.62(m,J=8.0Hz,1H),2.86(q,J=8.0Hz,2H),2.66(q,J=8.0Hz,2H),1.97(s,3H),1.04(d,J=8.0Hz,2H),0.98(t,J=8.0Hz,3H),0.92(t,J=8.0Hz,3H).(未觀測到NH的二個信號及OH的一個信號。)

[合成例15]k-1：C-1的合成

使Boc-Gly-OH(121)(0.70g，4.0mmol)溶解於二氯甲烷(13mL)，添加WSC(0.84g，4.4mmol)、苯基肼(122)(0.47mL，4.8mmol)，在室溫攪拌4小時。添加水(20mL)而分液，將有機層以飽和食鹽水(20mL)清洗。以無水硫酸鈉乾燥、過濾、減壓下濃縮，將所得的殘渣以中壓矽膠管柱層析法(矽膠30g，乙酸乙酯/己烷=15/85至65/35)精製，得到為無色非晶質的123(853mg，3.22mmol，產率81%)。

在上述所得的123(0.64g，2.4mmol)添加4M鹽酸/二烷(6mL)，並在室溫下攪拌3小時。濾取析出的固體，以中壓矽膠管柱層析法(胺矽膠30g，甲醇/二氯甲烷=0/100至8/92)精製，得到為淡黃色固體的124(290mg，1.76mmol，產率73%)的。

使上述所得的124(120mg，0.72mmol)、k-1(100mg，0.55mmol)溶解於DMSO(1.1mL)，在100℃攪拌22小時。放冷後，將反應溶液直接以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/己烷=20/80至90/10)精製，將所 得的固體以二氯甲烷清洗後，在減壓下乾燥，得到為黃色固體的k-1：C-1(20.2mg，0.0617mmol，產率11%)。

¹H-NMR(400MHz)：δ9.89(s,1H),9.67(s,1H),7.83(s,1H),7.25(d,J=8.0Hz,1H),7.14(t,J=8.0Hz,2H),6.77(d,J=8.0Hz,2H),6.71(t,J=8.0Hz,1H),6.29(d,J=8.0Hz,1H),4.35(s,2H),2.74(q,J=8.0Hz,2H),1.92(s,3H),1.13(t,J=8.0Hz,3H).(未觀測到NH的一個信號。)

[合成例16]k-1：C-2的合成

使Boc-Gly-OH(121)(0.70g，4.0mmol)溶解於二氯甲烷(13mL)，添加WSC(0.84g，4.4mmol)、苄胺(125)(0.52mL，4.8mmol)，在室溫下攪拌3小時。添加水(20mL)、二氯甲烷(20mL)而分液，將有機層以飽和食鹽水(20mL)清洗。將以無水硫酸鈉乾燥、過濾、減壓下濃縮所得的殘渣以中壓矽膠管柱層析法(矽膠30g，乙酸乙酯/己烷=10/90至65/35)精製，得到為無色液體的126(937mg， 3.54mmol，產率89%)。

在上述所得的126(0.93g，3.5mmol)添加TFA(7mL)，在室溫攪拌3.5小時。將反應溶液減壓下濃縮所得的殘渣以中壓矽膠管柱層析法(胺矽膠30g，乙酸乙酯/二氯甲烷=10/90至95/5)精製，得到為淡黃色液體的127(457mg，2.78mmol，產率79%)的。

使上述所得的127(120mg，0.72mmol)、k-1(100mg，0.55mmol)溶解於DMSO(1.1mL)，在100℃攪拌22小時。放冷後，將反應溶液直接以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/己烷=10/90至80/20)精製，將所得的固體以IPE、二氯甲烷清洗後，在減壓下乾燥，得到為黃色固體的k-1：C-2(29.9mg，0.0908mmol，產率17%)。

¹H-NMR(400MHz)：δ9.63(s,1H),8.55(m,NH),7.40-7.20(m,6H),6.25(d,J=8.0Hz,1H),4.32(d,J=8.0Hz,2H),4.29(s,2H),2.70(q,J=8.0Hz,2H),1.91(s,3H),1.09(t,J=8.0Hz,3H).(未觀測到OH的一個信號。)

[合成例17]k-1：D-1的合成

使3-苄氧基苯胺(129)(2.44g，12.2mmol)溶解於DMF(24mL)，添加乙酸鈉(1.10g，13.5mmol)、溴乙酸乙酯(128)(1.49mL，13.5mmol)，在室溫攪拌4小時。添加水(300mL)、乙酸乙酯(150mL)而分液，將有機層以飽和食鹽水(100mL)清洗。將以無水硫酸鈉乾燥、過濾、減壓下濃縮所得的殘渣以中壓矽膠管柱層析法(矽膠50g，乙酸乙酯/己烷=2/98至10/90)精製，得到為淡黃色固體的130(2.82g，9.88mmol，產率81%)。

使上述所得的130(1.0g，3.5mmol)懸浮於甲醇(18mL)，添加10%Pd/C(0.1g)，在氫環境下於室溫攪拌5小時。將反應溶液以矽藻土(celite)過濾，將濾液在減壓下濃縮所得的殘渣以中壓矽膠管柱層析法(矽膠30g，乙酸乙酯/己烷=3/97至35/65)精製，得到為淡黃色液體的131(295mg，1.51mmol，產率43%)。

使上述所得的131(0.29g，1.5mmol)溶解於乙醇(3.5mL)，添加肼一水合物(0.32mL，6.5mmol)，在60℃攪拌18小時。將反應溶液在減壓下濃縮，將所得的殘渣 以中壓矽膠層析法(胺矽膠10g，甲醇/二氯甲烷=1/99至10/90)精製。將所得的固體以IPE清洗後，在減壓下乾燥，得到為淡黃色固體的132(239mg，1.32mmol，產率88%)。

使上述所得的132(130mg，0.72mmol)、k-1(100mg，0.55mmol)溶解於DMSO(1.1mL)，在100℃攪拌21小時。放冷後，將反應溶液直接以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/二氯甲烷=5/95至50/50)精製。將所得的固體以水及IPE清洗後，在減壓下乾燥，得到為白色固體的k-1：D-1(95.9mg，0.279mmol，產率51%)。

¹H-NMR(270MHz)；δ 13.66(s,1H),10.76(s,1H),9.70(s,1H),8.98(s,1H),7.25(d,J=10.8Hz,1H),6.86(t,J=10.8Hz,1H),6.40(d,J=8.1Hz,1H),6.20-5.95(m,3H),5.87(t,J=5.4Hz,NH),3.88(d,J=5.4Hz,2H),2.78(q,J=8.0Hz,2H),1.97(s,3H),1.05(t,J=8.1Hz,3H).

[合成例18]k-1：D-3的合成

使合成例17的製程中所得的130(1.2g， 4.2mmol)溶解於DMF(12mL)，添加碳酸鉀(1.16g，8.4mmol)、碘乙烷(1.35mL，16.8mmol)，在100℃攪拌3小時，追加碘乙烷(0.7mL，8.7mmol)並攪拌1.5小時，在室溫攪拌20小時。添加水(100mL)、乙酸乙酯(50mL)而分液，將有機層以飽和食鹽水(50mL)清洗。將以無水硫酸鈉乾燥、過濾、減壓下濃縮所得的殘渣以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/己烷=2/98至10/90)精製，得到為無色液體的133(1.21g，3.86mmol，產率92%)。

將上述所得的化合物133(1.2g，3.9mmol)溶解於甲醇(19mL)，添加10%Pd/C(0.1g)，在氫環境下，於室溫攪拌15小時。將反應溶液以矽藻土過濾，將濾液在減壓下濃縮所得的殘渣以中壓矽膠管柱層析法(矽膠30g，乙酸乙酯/己烷=5/95至25/75)精製，得到134(194mg，0.869mmol，產率22%)。

使上述所得的134(0.20g，0.90mmol)溶解於乙醇(2.2mL)，添加肼一水合物(0.22mL，4.5mmol)，在50℃攪拌18小時，追加肼一水合物(0.22mL，4.5mmol)並再於60℃攪拌24小時。將反應溶液在減壓下濃縮，將所得的殘渣以中壓矽膠層析法(胺矽膠10g，甲醇/二氯甲烷=1/99至6/94)精製。將所得的固體以IPE清洗後，在減壓下乾燥，得到為淡黃色固體的135(151mg，0.722mmol，產率80%)。

將上述所得的135(150mg，0.72mmol)、k-1(100mg，0.55mmol)溶解於DMSO(1.1mL)，在100℃攪 拌23小時。放冷後，將反應溶液直接以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/己烷=15/85至80/20)精製。將所得的固體以IPE/二氯甲烷(1/1)的混合溶媒清洗後，在減壓下乾燥，得到為黃色固體的k-1：D-3(118mg，0.318mmol，產率58%)。

¹H-NMR(270MHz)；δ 13.68(s,1H),10.78(s,1H),9.69(s,1H),9.00(s,1H),7.26(d,J=8.1Hz,1H),6.91(t,J=8.1Hz,1H),6.40(d,J=8.1Hz,1H),6.11(d,J=8.1Hz,1H),6.10-6.05(m,2H),4.12(s,2H),3.42(q,J=8.1Hz,2H),2.79(q,J=8.1Hz,2H),1.96(s,3H),1.13(t,J=8.1Hz,3H),1.05(t,J=8.1Hz,3H).

[合成例19]k-1：E-1的合成

使胺苯酚(137)(500mg，4.6mmol)溶解於THF(5mL)、水(5mL)，添加碳酸氫鈉(0.77g，9.2mmol)，並在冰冷下徐緩地滴下氯甲酸苯酯(136)(0.61mL，4.8mmol)。 以相同溫度攪拌2小時，並添加乙酸乙酯(20mL)、2M鹽酸(20mL)而分液。將有機層以飽和食鹽水(20mL)清洗，並將以無水硫酸鈉乾燥、過濾、減壓下濃縮所得的固體以IPE清洗後，在減壓下乾燥，得到為白色固體的138(0.94g，4.1mmol，產率89%)。

使上述所得的138(0.94g，4.1mmol)溶解於乙腈(4mL)，添加肼一水合物(1.0mL，21mmol)，在60℃攪拌23小時。將反應溶液在減壓下濃縮，將所得的殘渣以中壓矽膠層析法(胺矽膠30g，甲醇/二氯甲烷=0/100至12/88)精製而得到為淡黃色固體的139(664mg，3.97mmol，產率97%)。

使上述所得的139(120mg，0.72mmol)、k-1(100mg，0.55mmol)溶解於DMSO(1.1mL)，在100℃攪拌16小時。放冷後，將反應溶液直接以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/己烷=10/90至80/20)精製，繼而以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，甲醇/二氯甲烷=1/99至5/95)精製。將所得的固體以IPE清洗而得到為白色固體的k-1：E-1(19.7mg，0.0598mmol，產率11%)。

¹H-NMR(400MHz)；δ 9.70(s,1H),9.60(s,1H),9.38(s,1H),8.73(s,1H),7.21(d,J=8.0Hz,1H),7.06(t,J=8.0Hz,1H),7.05(s,1H),6.82(d,J=8.0Hz,1H),6.39(d,J=8.0Hz,2H),5.76(s,1H),2.69(q,J=8.0Hz,2H),1.99(s,3H),1.13(t,J=8.0Hz,3H).

[合成例20]k-1：F-1的合成

使肼一水合物(0.58mL，12mmol)溶解於二氯甲烷(6mL)，在冰冷下添加二異氰酸六亞甲酯(140)(0.48mL，3.0mmol)，在室溫攪拌1.5小時，追加肼一水合物(0.29mL，6.0mmol)並攪拌2小時。濾取產生的固體，在減壓下乾燥，得到為白色固體的141(0.60g，2.6mmol，產率87%)。

使上述所得的141(100mg，0.43mmol)、k-1(233mg，1.29mmol)懸浮於DMSO(1.4mL)，在100℃攪拌20小時。放冷後，添加二氯甲烷濾取不溶物，將濾液在減壓下濃縮。將所得的固體以二氯甲烷及水清洗後，在減壓下乾燥，得到為淡黃色固體的k-1：F-1(88.6mg，0.159mmol，產率37%)。

¹H-NMR(400MHz)；δ 9.44(s,4H),7.15(d,J=8.0Hz,2H),6.40-6.30(m,2H),3.13(q,J=8.0Hz,4H),2.63(q,J=8.0Hz,4H),1.97(s,6H),1.47(m,4H),1.38(m,4H),1.07(t,J=8.0Hz,6H).

[合成例21]k-1：G-1的合成

使N-甲基-苯胺(142)(0.50g，4.7mmol)溶解於乙醇(9mL)，添加碳酸鉀(0.97g，7.0mmol)、溴乙酸乙酯(128)(0.57mL，5.1mmol)，在60℃攪拌21小時。濾取不溶物，在將濾液於減壓下濃縮所得的殘渣中添加乙酸乙酯(30mL)、水(30mL)而分液。將有機層以飽和食鹽水(30mL)清洗，將以無水硫酸鈉乾燥、過濾、減壓下濃縮所得的殘渣以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/己烷=0/100至5/95)精製而得到為淡黃色液體的143(496mg，2.57mmol，產率55%)。

將上述所得的143(0.49g，2.6mmol)溶解於甲醇(5mL)，添加肼一水合物(0.25mL，5.1mmol)，在55℃攪拌15小時。追加肼一水合物(0.50mL，10mmol)，在60℃再攪拌18小時。將反應溶液在減壓下濃縮，並將所得的固體以IPE清洗後，在減壓下乾燥，得到為白色固體的 144(389mg，2.17mmol，產率83%)。

將上述所得的144(130mg，0.72mmol)、k-1(100mg，0.55mmol)溶解於DMSO(1.1mL)，在100℃攪拌7小時。放冷後，將反應溶液直接以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/己烷=10/90至80/20)精製。將所得的固體以IPE清洗後，在減壓下乾燥，得到為白色固體的k-1：G-1(92mg，0.27mmol，產率49%)。

¹H-NMR(270MHz)；δ 13.64(s,1H),10.86(s,1H),9.67(s,1H),7.24(d,J=10.8Hz,1H),7.15(t,J=10.8Hz,2H),6.71(d,J=8.1Hz,2H),6.62(t,J=8.1Hz,1H),6.38(d,J=8.1Hz,1H),4.23(s,2H),3.04(s,3H),2.89(q,J=8.1Hz,2H),1.93(s,3H),1.05(t,J=8.1Hz,3H).

[合成例22]k-1：L-1的合成

以依照上述合成例21的方法，以間苯二酚(resorcinol)作為起始原料，合成k-1：L-1(65mg，白色固體)。

¹H-NMR(270MHz)；δ 13.63(s,1H),10.99(s,1H),9.74(s,1H),9.46(s,1H),7.28(d,J=8.1Hz,1H),7.07(t,J=8.1Hz,1H),6.45-6.35(m,4H),4.72(s,2H),2.81(q,J=8.1 Hz,2H),1.97(s,3H),1.08(t,J=8.1Hz,3H).

[合成例23]k-1：M-1的合成

以依照上述合成例21的方法，以3-羥基苯硫酚(3-mercaptophenol)作為起始原料，合成k-1：M-1(119mg，白色固體)。

¹H-NMR(270MHz)；δ13.64(s,1H),10.96(s,1H),9.72(s,1H),9.57(s,1H),7.26(d,J=8.1Hz,1H),7.11(t,J=8.1Hz,1H),6.82(d,J=8.1Hz,1H),6.80(s,1H),6.62(d,J=8.1Hz,1H),6.40(d,J=8.1Hz,1H),3.88(s,2H),2.78(q,J=8.1Hz,2H),1.97(s,3H),1.06(t,J=8.1Hz,3H).

[合成例24]k-1：G-2的合成

將N-乙基-苯胺(145)(0.50g，4.1mmol)溶解於乙醇(8mL)，添加碳酸鉀(0.86g，6.2mmol)、溴乙酸乙酯(128)(0.50mL，4.1mmol)，在60℃攪拌21小時。濾取不溶物，在將濾液在減壓下濃縮所得的殘渣中添加乙酸乙酯(30mL)、水(30mL)而分液。將有機層以飽和食鹽水(30mL)清洗，將以無水硫酸鈉乾燥、過濾、減壓下濃縮所得的殘渣以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/己烷=0/100至5/95)精製而得到為淡黃色液體的146(473mg，2.28mmol，產率56%)。

使上述所得的146(0.47g，2.3mmol)溶解於甲醇(4.5mL)，添加肼一水合物(0.22mL，4.5mmol)，在55℃攪拌15小時。追加肼一水合物(0.44mL，9.1mmol)，在60℃再攪拌18小時。將反應溶液在減壓下濃縮，將所得的固體以IPE清洗後，在減壓下乾燥，得到為白色固體的147(309mg，1.60mmol，產率70%)。

使上述所得的147(140mg，0.72mmol)、k-1(100mg，0.55mmol)溶解於DMSO(1.1mL)，在100℃攪拌17小時。放冷後，將反應溶液直接以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/己烷=10/90至80/20)精製。將所得的固體以IPE清洗後，在減壓下乾燥，得到為白色固體的k-1：G-2(96mg，0.27mmol，產率49%)。

¹H-NMR(270MHz)；δ 13.66(s,1H),10.82(s,1H),9.68(s,1H),7.25(d,J=8.1Hz,1H),7.13(t,J=8.1Hz,2H),6.65(d,J=8.1Hz,2H),6.59(t,J=8.1Hz,1H),6.38(d, J=10.8Hz,1H),4.17(s,2H),3.46(q,J=8.1Hz,2H),2.79(q,J=8.1Hz,2H),1.94(s,3H),1.13(t,J=8.1Hz,3H),1.03(t,J=8.1Hz,3H).

[合成例25]k-1：J-1的合成

在冰冷的THF(10mL)依序添加氫化鋁(1.0g，26mmol)、3-氰基苯酚(148)(0.63g，5.3mmol)，在室溫攪拌1.5小時，並在60℃攪拌3.5小時。放冷後，追加氫化鋁(1.0g，26mmol)、THF(10mL)，在60℃再攪拌16小時。將反應溶液冰冷，依序添加水(1.5mL)、15%氫氧化鈉水溶液(1.5mL)、水(4.5mL)，並在室溫下攪拌3小時。將懸浮溶液以矽藻土過濾，並將濾液在減壓下濃縮所得的殘渣以中壓矽膠管柱層析法(胺矽膠10g，甲醇/二氯甲烷=0/100至8/92)精製。將所得的固體以IPE清洗後，在減壓下乾燥，得到為白色固體的149(477mg，3.87mmol，產率73%)。

使上述所得的149(200mg，1.6mmol)溶解於二氯甲烷(2mL)、水(2mL)，添加碳酸氫鈉(0.27g，3.2mmol)，在冰冷下徐緩地滴下氯甲酸苯酯(136)(0.22mL，1.7mmol)。 在室溫攪拌20小時，添加乙酸乙酯(20mL)、水(20mL)而分液。將有機層以飽和食鹽水(20mL)清洗，並將以無水硫酸鎂乾燥、過濾、減壓下濃縮所得的殘渣以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/己烷=5/95至35/65)精製，而得到為無色液體的150(369mg，1.52mmol，產率95%)。

使上述所得的150(365mg，1.50mmol)懸浮於乙腈(3.8mL)，添加肼一水合物(0.18mL，3.8mmol)，在室溫攪拌2.5小時，追加肼一水合物(0.18mL，3.8mmol)並在55℃再攪拌20小時。將反應溶液在減壓下濃縮，將所得的固體以IPE/二氯甲烷(3/1)清洗後，在減壓下乾燥，得到為白色固體的151(233mg，1.29mmol，產率86%)。

使上述所得的151(130mg，0.72mmol)、k-1(100mg，0.55mmol)溶解於DMSO(1.1mL)，在100℃攪拌15小時。放冷後，將反應溶液直接以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/二氯甲烷=10/90至55/45)精製。在所得的精製物添加水而濾取析出的固體後，在減壓下乾燥，得到為白色固體的k-1：J-1(102mg，0.297mmol，產率54%)。

¹H-NMR(270MHz)；δ13.45(brs,1H),9.57(s,1H),9.53(s,1H),9.36(s,1H),7.17(d,J=8.1Hz,1H),7.11(d,J=8.1Hz,1H),6.80-6.60(m,4H),6.37(d,J=8.1Hz,1H),4.25(d,J=5.4Hz,2H),2.65(q,J=8.1Hz,2H),1.97(s,3H),1.08(t,J=8.1Hz,3H).

[合成例26]k-1：J-5的合成

使4-苄基-3-硫半卡肼(155)(130mg，0.72mmol)、k-1(100mg，0.55mmol)溶解於DMSO(1.1mL)，在100℃攪拌7小時。放冷後，將反應溶液直接以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/己烷=5/95至80/20)精製，繼而以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/己烷=10/90至50/50)精製。將所得的固體以IPE清洗後，在減壓下乾燥，得到為白色固體的k-1：J-5(49.9mg，0.145mmol，產率26%)。

¹H-NMR(400MHz)；δ10.61(brs,1H),9.69(s,1H),8.43(brs,1H),7.40-7.20(m,6H),6.40(d,J=8.0Hz,1H),4.78(d,J=8.0Hz,2H),2.74(q,J=8.1Hz,2H),1.99(s,3H),1.09(t,J=8.1Hz,3H).(未觀測到NH的一個信號。)

[合成例27]k-1：J-6的合成

使硫半卡肼(152)(0.50g，5.5mmol)懸浮於甲醇(5.5mL)，添加碘甲烷(0.41mL，6.6mmol)，在60℃攪拌1.5小時，打開反應容器的蓋體並在70℃攪拌50分鐘。放冷後，添加苄胺(0.61mL，5.5mmol)，在55℃攪拌7小時。將反應溶液在減壓下濃縮，將所得的殘渣以IPE/二氯甲烷(1/4)的混合溶媒清洗。將所得的粗精製物以中壓矽膠管柱層析法(胺矽膠30g，甲醇/二氯甲烷=0/100至15/85)精製，將所得的固體以二氯甲烷清洗後，在減壓下乾燥，得到為橙色固體的156(626mg，3.81mmol，產率69%)。

使上述所得的156(120mg，0.72mmol)、k-1(100mg，0.55mmol)溶解於DMSO(1.1mL)，在100℃攪拌27小時。放冷後，將反應溶液直接以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/二氯甲烷=10/90至80/20)精製，在所得的粗精製物中添加二氯甲烷、水而分液。將有機層以無水硫酸鎂進行乾燥、過濾、減壓下濃縮所得的殘渣以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/己烷=10/90至60/40)精製而得到為黃色非晶質的k-1：J-6(29.9mg， 0.0916mmol，產率17%)。

¹H-NMR(270MHz)；δ14.51(brs,1H),9.39(s,1H),7.36-7.05(m,6H),6.32(d,J=8.1Hz,1H),6.20(m,NH),5.30(brs,NH),4.34(d,J=5.4Hz,2H),2.84(q,J=8.1Hz,2H),1.96(s,3H),0.96(t,J=8.1Hz,3H).

[合成例28]k-1：N-1的合成

使2-羥基苄醇(1.0g，8.1mmol)懸浮於二氯甲烷(10mL)、水(10mL)，添加碳酸氫鈉(2.0g，24mmol)，並在冰冷下徐緩地滴下氯甲酸苯酯(2.0mL，16mmol)。徐緩地升溫至室溫並攪拌5.5小時，添加二氯甲烷(20mL)、水(20mL)而分液。將有機層以飽和食鹽水(30mL)清洗，將以無水硫酸鎂乾燥、過濾、減壓下濃縮所得的殘渣以中壓矽膠管柱層析法(矽膠30g，乙酸乙酯/己烷=2/98至35/65)精製，得到為白色固體的碳酸3-(羥甲基)苯基苯酯(1.45g，5.94mmol，產率73%)。

使上述所得的碳酸3-(羥甲基)苯基苯酯溶解於二氯甲烷(7mL)，添加吡啶(0.72mL，8.9mmol)、少量DMAP，並在冰冷下徐緩地滴下氯甲酸苯酯(0.90mL，7.1mmol)。在室溫攪拌2小時，添加二氯甲烷(10mL)、水(30mL)而分液。將有機層以飽和食鹽水(30mL)清洗，並將 以無水硫酸鎂乾燥、過濾、減壓下濃縮所得的殘渣以中壓矽膠管柱層析法(矽膠30g，乙酸乙酯/己烷=3/97至25/75)精製，得到為無色液體的碳酸3-[(苯氧基羰基)氧基]苄基苯酯(2.20g，6.04mmol，產率102%)。

使上述所得的碳酸3-[(苯氧基羰基)氧基]苄基苯酯(2.2g，6.0mmol)懸浮於乙醇(10mL)，添加肼一水合物(2.9mL，60mmol)，並在60℃攪拌21小時。濾取不溶物，並將濾液在減壓下濃縮所得的殘渣以中壓矽膠管柱層析法(矽膠30g，甲醇/二氯甲烷=0/100至10/90)精製，將所得的固體以二氯甲烷懸浮清洗而得到為白色固體的肼羧酸3-羥基苄酯(808mg，4.44mmol，產率74%)。

使上述所得的肼羧酸3-羥基苄酯(130mg，0.72mmol)、2’,4’-二羥基-3’-甲基丙醯苯(100)(100mg，0.55mmol)懸浮於DMSO(1.1mL)，在100℃攪拌22小時。放冷後，將反應溶液直接以中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g，乙酸乙酯/二氯甲烷=2/98至30/70)精製，在所得的精製物中添加水而濾取析出的固體，得到為白色固體的k-1：N-1(85.5mg，0.248mmol，產率45%)。

¹H-NMR(270MHz)；δ13.45(brs,1H),10.78(brs,1H),9.63(s,1H),9.49(s,1H),7.21(d,J=8.1Hz,1H),7.18(t,J=8.1Hz,1H),6.84(d,J=8.1Hz,1H),6.83(s,1H),6.73(d,J=8.1Hz,1H),6.38(d,J=8.1Hz,1H),5.14(s,2H),2.75(q,J=8.1Hz,2H),1.97(s,3H),1.03(t,J=8.1Hz,3H).

以下記載使用本發明所用的化合物進行之 作用試驗的結果。

[試驗例1]各化合物的細胞增殖活性的檢討

檢討將本發明所用的化合物添加於三維培養基時之細胞的增殖促進效果。具體而言，係將前培養(黏著培養)的SKOV3細胞(源自人類卵巢癌的細胞株)回收，懸浮於三維細胞培養用培養基(「FCeM(註冊商標)」(日產化學股份公司))，調製細胞懸浮液。將該細胞懸浮液在384孔平底超低黏著表面微量盤(Corning公司製，# 3827)的孔中以每1孔成為1000細胞/40μL/孔之方式接種。將接種在盤中的細胞懸浮液在37℃、5%CO₂下靜置一夜。繼而，將本發明所用的化合物的DMSO稀釋溶液以終濃度成為5μM(或5μM及10μM的2階段)之方式添加4.44μL(添加後不攪拌)。添加各化合物後，在37℃、5%CO₂下靜置培養4日。對第5日的培養液添加ATP試藥44.4μL(CellTiter-Glo(註冊商標)發光法細胞活力檢測試劑盒(Luminescent Cell Viability Assay),Promega公司製)而使其懸浮，在室溫靜置15分鐘。以FlexStation3(Molecular Devices公司製)測定發光強度(RLU值)，評估細胞增殖。

將結果示於第5表及第6表。又，增殖率是以對照組(不含本發明所用的化合物之添加有DMSO的細胞)作為基準(100%)而算出。又，表中所示的值是2次試驗的結果的平均值。

增值率的值表示2次試驗的結果的平均值

[試驗例2]本發明所用的化合物對SKOV3細胞的作用之檢討1

依照專利文獻1(WO2014/017513)的方法，以均質混合 機調製含有0.015%(w/v)的脫醯基化結蘭膠(KELCOGEL CG-LA，三昌股份公司製)、15%(v/v)FBS及100ng/mL人類HB-EGF(PEPROTECH公司製)的邁克伊氏5a培養基(McCoy’s 5a Medium，Sigma Aldrich公司製)的組成物。又，作為對照組，係調製不含脫醯基化結蘭膠的無添加培養基組成物。繼而，使人類卵巢癌細胞株SKOV3(DS Pharma Biomedical公司製)懸浮在上述添加有脫醯基化結蘭膠的培養基組成物後，在384孔平底超低黏著表面微量盤(Corning公司製，# 3827)的孔中以每1孔成為1000細胞/40μL/孔之方式分注(三維培養(3D))。單層培養(2D)是使人類卵巢癌細胞株SKOV3懸浮在上述不含脫醯基化結蘭膠的培養基組成物之後，在384孔平底微量盤(Corning公司製，# 3712)的孔中以每1孔成為400個/40μL之方式分注。各盤是在CO₂恆溫箱(37℃、5%CO₂)內以靜置狀態進行培養。在培養第1日，將於二甲基亞碸(DMSO)的本發明所用的化合物以終濃度成為0、0.5、1、5、10、20μM之方式各分別添加4.4μL，並繼續培養4日。對第5日的培養液添加ATP試藥44.4μL(CellTiter-Glo(註冊商標)發光法細胞活力檢測試劑盒(Luminescent Cell Viability Assay),Promega公司製)而使其懸浮，在室溫靜置15分鐘後，以FlexStation3(Molecular Devices公司製)測定發光強度(RLU值)，扣除只有培養基時的發光值而測定活細胞數。將未添加化合物的RLU值(ATP測定，發光強度)設為100%時，添加各化合物時的相對值係示於第7表。本試驗的結 果是，在將SKOV3細胞以三維培養(3D)的條件下，k-1：H-7及k-1：H-10在廣幅度的濃度範圍顯示促進細胞增殖作用，而且SKOV3細胞在培養基內有形成球體。另一方面，將SKOV3細胞在單層培養(2D)下進行培養時，即使將k-1：H-7及k-1：H-10添加於培養基，亦未顯示良好的促進細胞增殖效果。

[試驗例3]本發明所用的化合物對SKOV3細胞的作用之檢討2

依照專利文獻1(WO2014/017513)的方法，使用FCeM-series Preparation Kit(和光純藥工業公司製)調製含有0.015%(w/v)的脫醯基化結蘭膠(KELCOGEL CG-LA，三昌股份公司製)、15%(v/v)FBS及30ng/mL人類EGF(PEPROTECH公司製)的邁克伊氏5a培養基(McCoy’s 5a Medium，Sigma Aldrich公司製)的組成物。又，就單層培養而言，係調製不含脫醯基化結蘭膠的無添加培養基組成物。繼而，使人類卵巢癌細胞株SKOV3(DS Pharma Biomedical公司製)懸浮於上述的添加有脫醯基化結蘭膠的培養基組成物後，在384孔平底超低黏著表面微量盤(Corning公司製，# 3827)的孔中以每1孔成為1000細胞 /36μL/孔之方式分注(三維培養(3D))。單層培養(2D)是使人類卵巢癌細胞株SKOV3懸浮於上述不含脫醯基化結蘭膠的培養基組成物後，在384孔平底微量盤(Corning公司製，# 3712)的孔中以每1孔成為400細胞/36μL之方式分注。在分注後，將溶解於二甲基亞碸(DMSO)的本發明所用的化合物以終濃度成為0、1、5、10、20μM之方式各分別添加4μL。將各盤在CO₂恆溫箱(37℃、5%CO₂)內以靜置狀態培養4日。對第4日的培養液添加ATP試藥40μL(CellTiter-Glo(註冊商標)發光法細胞活力檢測試劑盒(Luminescent Cell Viability Assay)，Promega公司製)，以盤震盪器(As One公司製，Micro plate mixer NS-P)在室溫攪拌15分鐘後，以EnSpire(Perkin Elmer公司製)測定發光強度(RLU值)，扣除只有培養基時的發光值而測定活細胞數。未添加化合物的RLU值(ATP測定，發光強度)設為100%時的，添加各化合物時的相對值係示於第8表。

本試驗的結果是，在將SKOV3細胞以三維培養(3D)的條件下，k-1：I-1、k-1：B-1、k-1：D-1、k-1：J-1、k-1：D-2、k-1：I-10及k-1：N-1在廣幅度的濃度範圍顯示促進細胞增殖作用，而且SKOV3細胞在培養基內有形成球體。另一方面，將SKOV3細胞以單層培養(2D)進行培養時，即使將k-1：I-1、k-1：B-1、k-1：D-1、k-1：J-1、k-1：D-2、k-1：I-10及k-1：N-1添加於培養基，亦未顯示良好的促進細胞增殖效果。

[試驗例4]本發明所用的化合物對小腸類器官的作用之檢討

將小鼠小腸摘出約20cm，在冰上去除脂肪組織及血管組織後，以PBS充分清洗內容物，用剪刀切開而成為2mm左右的切片。以15mL的PBS清洗20次，除去上清液後，添加25mL的Gentle Cell Dissociation Reagent(STEMCELL 公司製)而以20rpm在攪拌並在室溫培養15分鐘。除去上清液後，在沉澱物添加10mL的冷0.1% BSA/PBS，實施3次的沖吸(pipetting)，將上清液以70μm細胞過濾器(cell strainer)(BD Bioscience公司製)過濾，並回收濾液。對剩下的沉澱物同樣地重覆3次添加0.1% BSA/PBS、沖吸及過濾，調製4階段分量的濾液。將各濾液在4℃，以290g離心5分鐘，除去上清液後，以10mL的冷0.1% BSA/PBS再次懸浮，在4℃，以200g離心3分鐘。除去上清液後，添加10mL的DMEM/F12(和光純藥公司製)而懸浮，分離1mL並在顯微鏡下觀察，選擇具有充分的小腸切片(隱窩，Crypt)的濾液，將Crypt數以血球計算板計數。添加與細胞懸浮液等量的冷Matrigel(註冊商標)Matrix GFR(Corning公司製)、混合，迅速地以成為500crypts/50μL/孔之方式分注於預先加溫至37℃的4孔盤。將盤在37℃靜置10分鐘，使其完成凝膠化，在各孔添加750μL的IntestiCult(註冊商標)類器官生長培養基(Organoid Growth Medium，STEMCELL TECHNOLOGIES公司製)，再將溶解於DMSO的本發明所用的化合物以終濃度成為5μM之方式添加。作為對照組，係製備未添加化合物的孔。培養7日後，在顯微鏡下計測所形成的小腸類器官數及直徑，並將與無添加(對照組)的比較示於第9表。由本試驗的結果，得知在小鼠的小腸類器官培養中k-1：H-7會促進類器官形成。這時，類器官的直徑沒有大變化，藉由添加k-1：H-7而源自Crypt的類器官形成率有所提高。

[試驗例5]本發明所用的化合物對各種人類癌細胞的作用1

將各種源自人類的癌細胞以如下述之各種培養基實施前培養(單層培養)。源自人類子宮頸癌的細胞株HeLa[American Type Culture Collection(以下記為ATCC)公司製，含有10%胎牛血清(FBS，Corning公司製)的達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，以下簡稱為DMEM)(和光純藥工業公司製)]；源自人類惡性黑色腫瘤的細胞株A375(ATCC公司製，含有10%FBS的DMEM)；源自人類表皮樣細胞癌的細胞株A431[ATCC公司製，含有10% FBS及1%MEM非必需胺基酸溶液(MEM Non-Essential Amino Acids solution，以下簡稱為NEAA)(和光純藥工業公司製)的伊格爾氏基本成分培養基(Eagle’s Minimum Essential Medium，以下，簡稱為EMEM)(和光純藥工業公司製)]；源自人類胃腺癌的細胞株AGS[DS Pharma Biomedical公司製，含有10%FBS的漢氏F-12(和光純藥工業公司製)]；源自人類前列腺癌的細胞株LNCaP clone FGC[ATCC公司製，含有10%FBS的RPMI1640 (和光純藥工業公司製)]；源自人類結腸腺癌的細胞株HCT116[DS Pharma Biomedical公司製，含有10%FBS的邁克伊氏5A培養基(McCoy’s 5A Medium，Sigma Aldrich公司製)]；源自人類肺胞基底上皮腺癌的細胞株A549(DS Pharma Biomedical公司製，含有10%FBS的DMEM)；源自人類前列腺癌的細胞DU145(ATCC公司製，含有10%FBS的EMEM)。將在對數增殖期的上述細胞以PBS清洗後，黏著細胞是添加0.25w/v%胰蛋白酶-1mmol/L EDTA(伸乙二胺四乙酸)溶液(和光純藥工業公司製)在37℃培養1至5分鐘而使其剝離，添加各個培養基，進行離心，並以同一培養基再懸浮後，回收各個單細胞。

將前述的各種細胞懸浮於含有或不含脫醯基化結蘭膠的各培養基(脫醯基化結蘭膠濃度是0.015w/v%，但是只有RPMI1640是0.020w/v%)，以1000至12000細胞/135μL/孔的細胞濃度接種在96孔低黏著U底盤(Corning公司製，不含脫醯基化結蘭膠的培養基)或低黏著平底盤(Corning公司製，含有脫醯基化結蘭膠培養基)(均為3D培養)。在37℃、5%CO₂恆溫箱靜置培養一夜後，將本發明所用的化合物之DMSO溶液以終濃度成為5μM或10μM之方式添加於各培養基。各化合物溶液的添加量是15μL/孔。對照組是添加溶解在培養基的DMSO溶液(DMSO終濃度0.1%)。繼而，在37℃、5%CO₂恆溫箱培養4日後，將WST-8溶液(同仁化學研究所公司製)以15μL/孔添加，並在同一恆溫箱反應1至2小時後，以吸光度計 (Molecular Devices公司製，SPECTRA MAX 190)測定450nm的吸光度，扣除只有培養基時的吸光度而測定活細胞數。再者，將未添加化合物(對照組)的吸光度設為100%，算出添加各化合物時的相對值。將與未添加化合物(對照組)進行比較時，顯示119%以下的值者設為-，顯示120%以上的值者設為○，顯示150%以上的值者設為◎，並示於第10表。

由本試驗的結果，得知k-1：H-7及k-1：H-10在三維條件下會使複數種癌細胞株之增殖活性亢進。其中，無論是使用低黏著U底盤、低黏著平底盤中的何者，癌細胞株皆有形成球體。

[試驗例6]本發明所用的化合物對人類各種癌細胞之作用2

將各種源自人類的癌細胞以如下述的各個培養基實施前培養(單層培養)。人類卵巢癌細胞株SKOV3[DS Pharma Biomedical公司製，含有15%胎牛血清(FBS，Corning公司製)的邁克伊氏5a培養基(McCoy’s 5a Medium，Sigma Aldrich公司製)]；源自人類肺胞基底上皮腺癌的細胞株A549[DS Pharma Biomedical公司製，含有10%FBS的DMEM(和光純藥工業公司製)]；源自人類子宮頸癌的細胞株HeLa(ATCC公司製，含有10%FBS的DMEM)；源自人類惡性黑色腫瘤的細胞株A375(ATCC公司製，含有10%FBS的DMEM)；源自人類表皮樣細胞癌的細胞株A431(ATCC公司製，含有10%FBS及1%MEM非必需胺基酸溶液(MEM NEAA，和光純藥工業公司製)的EMEM(和光純藥工業公司製)]；源自人類胃腺癌的細胞株AGS[DS Pharma Biomedical公司製，含有10%FBS的漢氏F-12(和光純藥工業公司製)]；源自人類前列腺癌的細胞DU145(ATCC公司製，含有10%FBS的EMEM)。將在對數增殖期的上述細胞以PBS清洗後，黏著細胞是添加0.25w/v%胰蛋白酶-1mmol/L EDTA(伸乙二胺四乙酸)溶液(和光純藥工業公司製)而在37℃培養1至5分鐘而使其剝離，添加各個培養基，進行離心，並以同一培養基再懸浮後，回收各個單細胞。

將前述的各種細胞懸浮於含有或不含脫醯基化結蘭膠的各培養基(脫醯基化結蘭膠濃度是0.015w/v %)，以700至2000細胞/90μL/孔的細胞濃度接種在96孔低黏著U底盤(Corning公司製，# 4520，不含脫醯基化結蘭膠的培養基)或低黏著平底盤(Corning公司製，# 3474， 含有脫醯基化結蘭膠的培養基)(均為3D培養)。繼而，將溶解於DMSO的本發明所用的化合物以終濃度成為5μM或10μM之方式添加於各培養基。各化合物溶液的添加量是10μL/孔。對照組是添加溶解在培養基的DMSO溶液(DMSO終濃度0.1%)。在37℃、5%CO₂恆溫箱培養4日後，對第4日的培養液添加ATP試藥40μL[CellTiter-Glo(註冊商標)發光法細胞活力檢測試劑盒(Luminescent Cell Viability Assay)，Promega公司製]，使用盤震盪器(As One公司製，Micro plate mixer NS-P)在室溫攪拌15分鐘後，以EnSpire(Perkin Elmer公司製)測定發光強度(RLU值)，扣除只有培養基時的發光值而測定活細胞數。將未添加化合物的RLU值(ATP測定，發光強度)設為100%，而算出添加各化合物時的相對值。與未添加化合物(對照組)比較時，將顯示119%以下的值者設為-，顯示120%以上的值者設為○，顯示150%以上的值者設為◎，並示於第11表及第12表。空欄表示未實施試驗。

由本試驗的結果，得知k-1：I-1、k-1：B-1、k-1：D-1及k-1：J-1在三維條件下能使複數種癌細胞株之增殖活性亢進。其中，無論是使用低黏著U底盤、低黏著 平底盤中的何者，癌細胞株皆有形成球體。

[試驗例7]本發明所用的化合物對MDCK細胞之作用1

將犬腎臟腎曲小管上皮細胞(MDCK細胞，DS Pharma Biomedical公司製)以含有10%FBS及1%NEAA的EMEM培養基進行前培養。將冷Matrigel(註冊商標)Matrix GFR(Corning公司製)以每孔50μL塗在24孔盤，在37℃培養15分鐘使其固化。將前述的MDCK細胞以20000細胞/mL之濃度懸浮在培養基，再添加20μL/mL冷Matrigel(註冊商標)Matrix GFR而接種1mL/孔。於培養基以終濃度成為10μM之方式添加溶解的本發明所用的化合物，在37℃、5%CO₂的條件下，在恆溫箱培養7日。作為對照組(未添加化合物)，係以使終濃度成為0.1%之方式添加DMSO。7日後，在以PBS清洗後(1mL/孔)，添加4%多聚甲醛/PBS(Paraformaldehyde/PBS，和光純藥公司製)(1mL/孔)，在室溫固定20分鐘。之後，除去上清液，將IF緩衝液(0.2%TritonX-100(Sigma Aldrich公司製)、含有0.05% Tween20(Sigma Aldrich公司製)的PBS)以1mL/孔添加並靜置30分鐘後除去。將滲透化緩衝液[0.5% Triton X-100(Sigma Aldrich公司製)/PBS]以1mL/孔添加，在室溫培養30分鐘。除去上清液，以IF緩衝液間隔5分鐘清洗3次，將阻斷緩衝液(blocking buffer)[1%BSA(Sigma Aldrich公司製)/IF緩衝液]添加0.5mL/孔並培養30分鐘。除去上清液，在阻斷緩衝液將抗β連環蛋白抗體(BD Bioscience公 司製)稀釋100倍而添加250μL/孔，在4℃，遮光培養一夜。翌日，以IF緩衝液間隔5分鐘清洗3次，在阻斷緩衝液將二級抗體(Alexa Fluor 555，Thermo Fisher Scientific公司製)及鬼筆環肽(Phalloidin)(Alexa Fluor 488，Thermo Fisher Scientific公司製)各稀釋250倍而添加250μL/孔，在室溫、遮光下培養60分鐘。以IF緩衝液間隔5分鐘清洗3次後，滴下VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI(Vector Laboratories公司製)而以螢光顯微鏡(ArrayScan，Thermo Fisher Scientific公司製)進行觀察及解析。

由本試驗的結果，得知MDCK細胞在Matrigel上形成具有內腔的Cyst時，若將對照組的對象之Cyst面積設為100%，則在化合物k-1：H-7存在下之1個Cyst的面積增大20%以上。其結果表示在第13。

[試驗例8]本發明所用的化合物對MDCK細胞之作用2

將犬腎臟腎曲小管上皮細胞(MDCK細胞，DS Pharma Biomedical公司製)以含有10%FBS及1%NEAA的EMEM培養基進行前培養。將冷Matrigel(註冊商標)Matrix GFR(Corning公司製)以每孔50μL塗在24孔盤，在37℃ 培養15分鐘使其固化。將前述的MDCK細胞以10000細胞/mL懸浮於培養基，再將冷Matrigel(註冊商標)Matrix GFR添加20μL/mL並以1mL/孔接種。以使終濃度成為5μM及10μM之方式添加溶解在培養基的本發明所用的化合物，在37℃、5%CO₂的條件下，在恆溫箱培養6日。作為對照組(未添加化合物)，是以終濃度成為0.1%之方式添加DMSO使。6日後，以Cell³iMager(Screen公司製)測定所形成的Cyst的大小及個數。將全部的Cyst中之70μm以上的Cyst的比率示於第14表。

又，以PBS清洗後(1mL/孔)，添加4%多聚甲醛/PBS(和光純藥公司製)(1mL/孔)，在室溫固定20分鐘。之後，除去上清液，添加IF緩衝液[含有0.2% TritonX-100(Sigma Aldrich公司製)及0.05% Tween20(Sigma Aldrich公司製)的PBS]1mL/孔靜置30分鐘，而後除去。添加滲透化緩衝液[0.5% Triton X-100(Sigma Aldrich公司製)/PBS]1mL/孔，在室溫培養30分鐘。除去上清液，以IF緩衝液 間隔5分鐘清洗3次，添加阻斷緩衝液[1%BSA(Sigma Aldrich公司製)/IF緩衝液]0.5mL/孔而培養30分鐘。除去上清液，在阻斷緩衝液將抗β連環蛋白抗體(BD Bioscience公司製)稀釋100倍而添加250μL/孔，並在室溫培養60分鐘。以IF緩衝液間隔5分鐘清洗3次，在阻斷緩衝液將二級抗體(Alexa Fluor 555，Thermo Fisher Scientific公司製)及鬼筆環肽(Alexa Fluor 488，Thermo Fisher Scientific公司製)各稀釋250倍而添加250μL/孔，在室溫、遮光下培養60分鐘。以IF緩衝液間隔5分鐘清洗3次後，滴下VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI(Vector Laboratories公司製)而以共軛焦螢光顯微鏡(FV1200 IX83，Olympus公司製)進行觀察。

由本試驗的結果，得知MDCK細胞在Matrigel上形成有內腔的Cyst時，在化合物k-1：I-1，k-1：B-1存在下，全部的Cyst中之70μm以上的Cyst的比率有所增大(第13表)。又，以共軛焦螢光顯微鏡觀察的結果為在化合物k-1：I-1或k-1：B-1存在下，確認到形成正常的Cyst(第1圖)。

[試驗例9]本發明組成物對人類間葉系幹細胞之作用1

將人類間葉系幹細胞(hMSC，東洋紡公司製)以使用MF-medium間葉系幹細胞增殖培養基(東洋紡公司製)的單層培養法(2D)進行前培養。就三維培養法(3D)而言，係在添加有脫醯基化結蘭膠的培養基組成物中懸浮hMSC後， 在6孔平底超低黏著表面盤(Corning公司製，# 3471)接種成為1.2×10⁵細胞/2mL/孔。在2D時，係將hMSC懸浮在不含脫醯基化結蘭膠的培養基組成物中之後，在6孔平底盤(Corning公司製，# 3516)接種成為4.0×10⁴細胞/2mL/孔。繼而，以終濃度成為10μM之方式添加溶解在培養基的本發明所用的化合物之溶液，在37℃、5% CO₂恆溫箱培養7日。作為對照組，係以終濃度成為0.1%之方式添加DMSO。7日後，在三維培養法係由孔回收細胞，並以PBS清洗而除去上清液後，添加0.25w/v%胰蛋白酶-1mmol/L EDTA(伸乙二胺四乙酸)溶液(和光純藥工業公司製)而在37℃培養2至5分鐘，使球體分散成單細胞，添加培養基，離心而除去上清液。之後，以同一培養基再懸浮後，將一部分以錐蟲藍(trypan blue)(和光純藥工業公司製)懸浮並用全自動細胞計數器TC20(BIO-RAD公司製)計數活細胞數。

就單層培養法而言，是將細胞以PBS清洗後，添加0.25w/v%胰蛋白酶-1mmol/L EDTA溶液而在37℃培養2至5分鐘以使其剝離，添加培養基，離心而除去上清液。之後，以同一培養基再懸浮後，將一部分以錐蟲藍(和光純藥工業公司製)懸浮並以TC-20(BIO-RAD公司製)計數活細胞數。

在上述細胞懸浮液添加CD34抗體(APC，BD Bioscience公司製)、CD73(BV421，BD Bioscience公司製)、CD29(BB515，BD Bioscience公司製)，在冰上培 養30分鐘。以2% SM緩衝液(2% FBS/PBS)清洗2次後，添加含有1μg/mL的碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)的SM，以FACSAria(Becton Dickinson公司製)進行解析。第15表中算出在將未添加化合物(對照組)的細胞數設為1時之添加各化合物時的相對值。在第16表示以無添加以及添加化合物之條件所三維培養(3D)之細胞的CD34、CD73及CD29的陽性率或陰性率。

由本試驗的結果，確認到k-1：H-7及k-1：H-10在二維及三維細胞培養條件下有使hMSC的細胞數增加的效果。在三維細胞培養條件下，hMSC有形成球體。此時，細胞表面標記之CD34的陰性率、CD73及CD29的 陽性率並未因化合物的添加而改變(第16表)。由以上的結果，得知k-1：H-7及k-1：H-10是在維持hMSC的未分化性之原本狀態下使細胞增殖亢進。

[試驗例10]本發明所用的化合物對人類間葉系幹細胞之作用2

將源自骨髓之人類間葉系幹細胞(BM-hMSC，PromoCell公司製)以使用間葉系幹細胞增殖培養基(PromoCell公司製)的單層培養法(2D)進行前培養。就三維培養法(3D)而言，係使hMSC懸浮在添加有脫醯基化結蘭膠的培養基組成物之後，在96孔平底超低黏著表面盤(Corning公司製，# 3474)接種成為6000細胞/90μL/孔。又，就使用EZSPHERE的三維培養法(EZSPHERE)而言，係使hMSC懸浮在不含脫醯基化結蘭膠的培養基組成物之後，在96孔EZSPHERE盤(旭Technoglass公司製，# 4860-900)接種成為2000細胞/90μL/孔。就2D而言，係使hMSC懸浮在不含脫醯基化結蘭膠的培養基組成物之後，在96孔平底盤(Corning公司製，# 3585)接種成為2000細胞/90μL/孔。繼而，以使終濃度成為1μM、5μM、10μM及20μM之方式在培養基添加溶解之本發明所用的化合物10μL/孔，在37℃、5%CO₂恆溫箱培養4日。作為對照組，係以終濃度成為0.1%之方式添加DMSO。4日後，對培養液添加ATP試藥100μL[CellTiter-Glo(註冊商標)發光法細胞活力檢測試劑盒(Luminescent Cell Viability Assay)，Promega公司製]，以盤震盪器(As One公司製，Micro plate mixer NS-P)在室溫 攪拌2分鐘，在室溫靜置10分鐘後，以Enspire(Perkin Elmer公司製)測定發光強度(RLU值)，扣除只有培養基時的發光值而測定活細胞數。將未添加化合物的RLU值(ATP測定，發光強度)設為100%，算出添加各化合物時的相對值，其結果示於第17表。

本試驗的結果，得知k-1：I-1、k-1：B-1、k-1：D-1及k-1：J-1在三維細胞培養條件下可使BM-hMSC的增殖活性亢進。在三維細胞培養條件下，BM-hMSC有形成球體。又，得知k-1：B-1及k-1：J-1在二維細胞培養條件下也可使hMSC的增殖活性亢進。

[試驗例11]本發明所用的化合物對纖維母細胞株C3H10T1/2的作用

小鼠胚胎纖維母細胞C3H10T1/2(DS Pharma Biomedical公司製)是使用含有10(v/v)%FBS(Corning公司製)及L-麩醯胺酸-青黴素-鏈黴素安定化溶液(Sigma-Aldrich公司製)的BME培養基(Thermo Fisher Scientific公司製)來進行培養。將在對數增殖期的上述細胞以PBS清洗後，添加0.25w/v%胰蛋白酶-1mmol/L EDTA(伸乙二胺四乙酸)溶液(和光純藥工業公司製)而在37℃培養3分鐘使其剝離，添加培養基，離心除去上清液。

將前述的各種細胞懸浮於含有或不含脫醯基化結蘭膠的各培養基(脫醯基化結蘭膠濃度是0.015w/v%，以700至2000細胞/90μL/孔的細胞濃度接種在96孔低黏著U底盤(Corning公司製，# 4520，不含脫醯基化結蘭膠的培養基)(3D培養)。接種後，將溶解在DMSO的本發明所用的化合物以終濃度成為1μM或5μM之方式添加在各培養基，。各化合物溶液的添加量是10μL/孔。對照組是添加溶解在培養基的DMSO溶液(DMSO終濃度0.1%)。在37℃、5%CO₂恆溫箱培養4日後，對培養液添加ATP試藥100μL[CellTiter-Glo(註冊商標)發光法細胞活力檢測試劑盒(Luminescent Cell Viability Assay)，Promega公司製]，以盤震盪器(As One公司製，Micro plate mixer NS-P)在室溫攪拌15分鐘後，以EnSpire(Perkin Elmer公司製)測定發光強度(RLU值)，扣除只有培養基時的發光值 而測定活細胞數。將未添加化合物的RLU值(ATP測定，發光強度)設為100%，算出添加各化合物時的相對值。與未添加化合物(對照組)比較時，顯示119%以下的值者設為-，顯示120%以上的值者設為○，顯示150%以上的值者設為◎，而示於第18。空欄表示未實施試驗。

由本試驗的結果，得知對於纖維母細胞，k-1：I-1、k-1：B-1、k-1：D-1、及k-1：J-1是在三維條件下可使其增殖活性亢進。其中，使用低黏著U底盤之纖維母細胞有形成球體。

[試驗例12]本發明所用的化合物對於以懸滴法培養的細胞之作用

源自人類表皮樣細胞癌的細胞株A431(ATCC公司製)是使用含有10%FBS及1%MEM非必需胺基酸溶液(MEM NEAA，和光純藥工業公司製)的EMEM(和光純藥工業公司製)培養。又，源自骨髓之人類間葉系幹細胞(BM-hMSC，PromoCell公司製)是使用間葉系幹細胞增殖培養基PromoCell公司製)來進行進行培養。將在對數增殖期的上 述各細胞以PBS清洗後，添加0.25w/v%胰蛋白酶-1mmol/L EDTA(伸乙二胺四乙酸)溶液(和光純藥工業公司製)，在37℃培養3分鐘使其剝離，添加培養基，離心而除去上清液。

繼而，將各細胞以成為100000細胞/2mL之方式懸浮在上述培養基，再將溶解於DMSO的本發明所用的化合物以終濃度成為5μM之方式添加於培養基。將本細胞懸浮液以每滴10μL接種15滴在3.5cm皿(Falcon公司製，# 351008)的蓋體內側，製成液滴。這時，對照組是將添加DMSO的培養基(DMSO終濃度0.05%)以每滴10μL接種15滴。將此蓋體放回添加有2mLPBS的3.5cm皿，在37℃、5%CO₂恆溫箱培養2日。回收培養的液滴至1.5mL的試管，添加培養基使最終容量成為150μL。進一步添加ATP試藥150μL[CellTiter-Glo(註冊商標)發光法細胞活力檢測試劑盒(Luminescent Cell Viability Assay)，Promega公司製]而懸浮，在室溫靜置10分鐘後，以Enspire(Perkin Elmer公司製)測定發光強度(RLU值)，扣除只有培養基時的發光值而測定活細胞數。將未添加化合物的RLU值(ATP測定，發光強度)設為100%，算出添加各化合物時的相對值並示於第19表及第20表。

本試驗的結果，確認k-1：H-1，k-1：H-7，及k-1：B-1在以懸滴法三維細胞培養的條件下亦有使A431細胞株及源自骨髓之人類間葉系幹細胞的細胞數增加的效果。這時，A431細胞株及源自骨髓之人類間葉系幹細胞在懸滴法之液滴中有形成球體。

[試驗例13]本發明化合物對於人類多潛能幹細胞(hiPS細胞)之作用

hiPS細胞株253G1(由理化學研究所分贈)是在塗佈有玻連蛋白VTN-N(Thermo Fisher Scientific公司製)的皿上使用mTeSR1(註冊商標)培養基(STEMCELL Technologies公司製)進行培養。將在增殖期的上述細胞以PBS(富士軟片和光純藥公司製)清洗後，添加TrypLE Select(註冊商 標)(Thermo Fisher Scientific公司製)而在37℃培養3分鐘，除去剝離液後，添加培養基並以沖吸使其剝離。之後，進行離心而除去上清液。

將前述的細胞懸浮在含有10μM的Y-27632(富士軟片和光純藥公司製)的培養基中，並以10000細胞/200μL/孔的細胞濃度接種在96孔EZSPHERE盤(AGCTechnoglass公司製，# 4860-900)。接種後，將溶解在經稀釋的DMSO之本發明所用的化合物以終濃度成為5μM之方式添加於各培養基。各化合物溶液的添加量是2μL/孔。對照組是添加溶解在培養基的DMSO溶液(DMSO終濃度0.05%)。每日更換一半量的培養基，並且以使總化合物濃度成為一定之方式添加各化合物溶液。在37℃、5%CO₂恆溫箱培養3日後，除去100μL的培養上清液之後，對剩下的培養液添加ATP試藥100μ[CellTiter-Glo(註冊商標)發光法細胞活力檢測試劑盒(Luminescent Cell Viability Assay)，Promega公司製]，以盤震盪器(As One公司製，Micro plate mixer NS-P)在室溫攪拌15分鐘後，將150μL移到96孔盤(平底，白色/透明，Falcon公司製)，以EnSpire(Perkin Elmer公司製)測定發光強度(RLU值)，扣除只有培養基時的發光值而測定活細胞數。將添加DMSO的RLU值(ATP測定，發光強度)設為100%，算出添加各化合物時的相對值並示於第21表。

由本試驗的結果，得知k-1：H-1、k-1：H-7、k-1：B-1、k-1：D-1、k-1：J-1及k-1：I-10在三維條件下會使對人類多潛能幹細胞之增殖活性亢進。

[試驗例14]本發明化合物對於血管內皮細胞的作用

將人類臍帶靜脈內皮細胞(PromoCell公司製)以內皮細胞增殖培養基(Endothelial Cell Growth Medium，PromoCell公司製)進行前培養(單層培養)。將在對數增殖期的上述細胞以PBS清洗後，添加DetachKit(PromoCell公司製)並在37℃培養3分鐘而剝離黏著細胞，添加培養基，進行離心並以同一培養基再懸浮。

將前述的細胞懸浮於含有或不含脫醯基化結蘭膠的各培養基中(脫醯基化結蘭膠濃度是0.015w/v%)，以700至2000細胞/90μL/孔的細胞濃度接種在96孔低黏 著U底盤(Corning公司製，# 4520，不含脫醯基化結蘭膠的培養基)或低黏著平底盤(Corning公司製，# 3474，含有脫醯基化結蘭膠的培養基)(均為3D培養)。繼而，將溶解於DMSO的本發明所用的化合物以終濃度成為5μM或10μM之方式添加於各培養基。各化合物溶液的添加量是10μL/孔。對照組是添加溶解在培養基的DMSO溶液(DMSO終濃度0.1%)。在37℃、5%CO₂恆溫箱培養4日後，對第4日的培養液添加ATP試藥100μL[CellTiter-Glo(註冊商標)發光法細胞活力檢測試劑盒(Luminescent Cell Viability Assay)，Promega公司製]，以盤震盪器(As One公司製，Micro plate mixer NS-P)在室溫攪拌15分鐘後，以EnSpire(Perkin Elmer公司製)測定發光強度(RLU值)，扣除只有培養基時的發光值而測定活細胞數。將未添加化合物的RLU值(ATP測定，發光強度)設為100%，算出添加各化合物時的相對值並示於第22表。

由本試驗的結果，得知k-1：H-1、k-1：H-7、k-1：I-1、k-1：B-1、k-1：D-1及k-1：J-1在三維條件下會使對人類臍帶靜脈內皮細胞之增殖活性亢進。其中，無論是使用低黏著U底盤、低黏著平底盤中的何者，人類臍帶靜脈內皮細胞皆有形成球體。

[試驗例15]本發明化合物對於動物細胞株之作用

將各種動物細胞株以如下所述的各種培養基進行前培養(單層培養)。源自中國倉鼠卵巢的細胞株CHO-K1[DS Pharma Biomedical公司製，含有10%胎牛血清(FBS，Corning公司製)的漢氏F-12培養基(富士軟片和光純藥公司製)]；源自非洲綠猴腎臟上皮的細胞株Vero[由JCRB細 胞銀行分贈，含有5%FBS的Medium199培養基(Life Technologies公司製)]。將在對數增殖期的上述細胞以PBS清洗後，添加0.25w/v %胰蛋白酶-1mmol/L EDTA(伸乙二胺四乙酸)溶液(富士軟片和光純藥公司製)在37℃培養3分鐘而剝離黏著細胞，添加各培養基，進行離心並以同一培養基再懸浮。

將前述的各種動物細胞懸浮在含有或不含脫醯基化結蘭膠的各培養基中(就脫醯基化結蘭膠濃度而言，漢氏F-12培養基是0.02w/v%，Medium199培養基是0.015w/v%)，以700至2000細胞/90μL/孔的細胞濃度接種在96孔低剝離U底盤(Corning公司製，# 4520，不含脫醯基化結蘭膠的培養基)或剝離附平底盤(Corning公司製，# 3474，含有脫醯基化結蘭膠的培養基)(均為3D培養)。繼而，將溶解於DMSO的本發明所用的化合物以終濃度成為5μM或10μM之方式添加於各培養基。各化合物溶液的添加量是10μL/孔。對照組是添加溶解在培養基的DMSO溶液(DMSO終濃度0.1%)。在37℃、5%CO₂恆溫箱培養4日後，對第4日的培養液添加ATP試藥100μL[CellTiter-Glo(註冊商標)發光法細胞活力檢測試劑盒(Luminescent Cell Viability Assay)，Promega公司製]，以盤震盪器(As One公司製，Micro plate mixer NS-P)在室溫攪拌15分鐘後，以EnSpire(Perkin Elmer公司製)測定發光強度(RLU值)，扣除只有培養基時的發光值而測定活細胞數。將未添加化合物的RLU值(ATP測定，發光強度)設為 100%，算出添加各化合物時的相對值。與未添加化合物(對照組)比較，將顯示119%以下的值者設為-，顯示120%以上的值者設為○，顯示150%以上的值者設為◎，並示於第23表及第24表。

由本試驗的結果，得知k-1：H-1、k-1：H-7、k-1：I-1、k-1：B-1、k-1：D-1及k-1：J-1在三維條件下會使多種動物細胞株之增殖活性亢進。其中，無論是使用低黏著U底盤、低黏著平底盤中的何者，動物細胞株皆有形成球體。

[產業上的可利用性]

依據本發明，可達成細胞增殖的促進、球體形成的促進、類器官形成的促進及Cyst形成的促進之任一者或該等的任意組合。藉由本發明所調製的細胞等例如在藥物開發的領域中非常有用。

本申請案是以在日本申請的日本特願2017-147071(申請日：2017年7月28日)及日本特願 2017-239102(申請日：2017年12月13日)為基礎，並於本說明書包含其全部內容。

Claims (32)

1. 一種培養基添加用組成物，係含有下述式(I)表示的化合物或其鹽： 式中，X是單鍵結、-CH ₂COO-、-CONH-或-NHCO-，R ₁是可具有取代基的碳數1至10的烷基、可具有取代基的芳基或-Y-W-Z-Ar，式中，Y及Z是單鍵結或可具有取代基的碳數1至6的伸烷基，W是氧原子、硫原子或N(R ₄)，R ₄是氫原子或碳數1至6的烷基，Ar是可具有取代基的芳基，R ₂是可具有取代基的碳數1至6的烷基，R ₃是羥基，n是0、1或2。
2. 如申請專利範圍第1項所述的培養基添加用組成物，其中X是-NHCO-。
3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述的培養基添加用組成物，其中，R ₂是碳數1至6的烷基，n是0。
4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述的培養基添加用組成物，其中，R ₁是-Y-W-Z-Ar，Y是可具有碳數1至6的烷基的亞甲基，W是N(R ₄)，Z是單鍵結， Ar是可具有鹵原子、羥基、碳數1至6的烷基或碳數1至6的烷氧基的芳基。
5. 如申請專利範圍第4項所述的培養基添加用組成物，其中，芳基是苯基。
6. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述的培養基添加用組成物，其中，R ₁是-Y-W-Z-Ar，Y是單鍵結，W是N(R ₄)，R ₄是氫原子，Z是單鍵結或可具有碳數1至6的烷基的亞甲基，Ar是可具有鹵原子、羥基、碳數1至6的烷基或碳數1至6的烷氧基的芳基。
7. 如申請專利範圍第6項所述的培養基添加用組成物，其中，芳基是苯基。
8. 如申請專利範圍第6項或第7項所述的培養基添加用組成物，其中，Z是亞甲基。
9. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述的培養基添加用組成物，其中，R ₁是-Y-W-Z-Ar，Y是單鍵結，W是氧原子，Z是可具有碳數1至6的烷基的亞甲基，Ar是可具有鹵原子、羥基、碳數1至6的烷基或碳數1至6的烷氧基的芳基。
10. 如申請專利範圍第9項所述的培養基添加用組成物，其中，芳基是苯基，Z是亞甲基。
11. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述的培養基添加用組成物，其中，化合物是從由下列者所組成群組選出的化合物或其鹽， 及
12. 如申請專利範圍第1項至第3項、第6項及第7項中任一項所述的培養基添加用組成物，其中，化合物是從由下列者所組成群組選出的化合物或其鹽， 及
13. 如申請專利範圍第1項至第3項、第9項及第10項中任一項所述的培養基添加用組成物，其中，化合物是以下表示的化合物或其鹽，
14. 如申請專利範圍第1項至第13項中任一項所述的培養基添加用組成物，其為促進細胞增殖用者。
15. 如申請專利範圍第14所述的培養基添加用組成物，其中，細胞是從由正常細胞株、癌細胞株及幹細胞所組成群組選出。
16. 如申請專利範圍第1項至第13項中任一項所述的培養基添加用組成物，其係用於促進球體形成、類器官形成或Cyst形成。
17. 一種培養基，其係含有申請專利範圍第1項至第13項中任一項所述的培養基添加用組成物。
18. 一種促進細胞增殖的方法，其係包含：將申請專利範圍第1項至第13項中任一項所述的培養基添加用組成物 添加於培養基。
19. 如申請專利範圍第18項所述的方法，其中，細胞是從由正常細胞株、癌細胞株及幹細胞所組成群組選出。
20. 一種下述式(I)表示的化合物或其鹽： 式中，X是單鍵結、-CH ₂COO-、-CONH-或-NHCO-，R ₁是可具有取代基的碳數1至10的烷基、可具有取代基的芳基、或-Y-W-Z-Ar，式中，Y及Z是單鍵結、或可具有取代基的碳數1至6的伸烷基，W是氧原子、硫原子或N(R ₄)，R ₄是氫原子或碳數1至6的烷基，Ar是可具有取代基的芳基，R ₂是可具有取代基的碳數1至6的烷基，R ₃是羥基，n是0、1或2，惟，當X是-NHCO-、R ₂是乙基、n是0時，R ₁不會是-CH ₂-NH-C ₆H ₅。
21. 如申請專利範圍第20項所述的化合物或其鹽，其中，X是-NHCO-。
22. 如申請專利範圍第20項或第21項所述的化合物或其鹽，其中，R ₂是碳數1至6的烷基，n是0。
23. 如申請專利範圍第20項至第22項中任一項所述的化合物或其鹽，其中，R ₁是-Y-W-Z-Ar，Y是亞甲基，W是N(R ₄)，Z是單鍵結，Ar是可具有鹵原子、羥基、碳數1至6的烷基或碳數1至6的烷氧基的芳基。
24. 如申請專利範圍第23項所述的化合物或其鹽，其中，芳基是苯基。
25. 如申請專利範圍第20項至第22項中任一項所述的化合物或其鹽，其中，R ₁是-Y-W-Z-Ar，Y是單鍵結，W是N(R ₄)，R ₄是氫原子，Z是單鍵結或可具有碳數1至6的烷基的亞甲基，Ar是可具有鹵原子、羥基、碳數1至6的烷基或碳數1至6的烷氧基的芳基。
26. 如申請專利範圍第25項所述的化合物或其鹽，其中，芳基是苯基。
27. 如申請專利範圍第25項或第26項所述的化合物或其鹽，其中，Z是亞甲基。
28. 如申請專利範圍第20項至第22項中任一項所述的化合物或其鹽，其中，R ₁是-Y-W-Z-Ar，Y是單鍵結，W是氧原子，Z是可具有碳數1至6的烷基的亞甲基，Ar是可具有鹵原子、羥基、碳數1至6的烷基或碳數1至6的烷氧基的芳基。
29. 如申請專利範圍第28項所述的化合物或其鹽，其中，芳基是苯基，Z是亞甲基。
30. 如申請專利範圍第20項至第24項中任一項所述的化合物或其鹽，係從由下列者所組成群組選出， 及
31. 如申請專利範圍第20項至第22項、第25項及第26項中任一項所述的化合物或其鹽，係從由下列者所組成群組選出， 及
32. 如申請專利範圍第20項至第22項、第28項及第29項中任一項所述的化合物或其鹽，係以下表示的化合物或其鹽，