CN104975112B - 基于咽拭子样本的流感病毒的检测方法和流感病毒的检测试剂盒 - Google Patents

基于咽拭子样本的流感病毒的检测方法和流感病毒的检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种流感病毒的检测方法，这种流感病毒的检测方法基于miR‑29a‑3p、miR‑181a‑5p、miR‑449b‑5p、miR‑205‑5p、miR‑30c‑5p、miR‑34b‑5p和miR‑34c‑3p在正常人和流感患者中的差异性表达，通过检测得到待检测样本中miR‑29a‑3p、miR‑181a‑5p、miR‑449b‑5p、miR‑205‑5p、miR‑30c‑5p、miR‑34b‑5p和miR‑34c‑3p的PCR相对定量值，从而对待检测样本中是否具有流感病毒以及具有具体什么类型的流感病毒进行判断。本发明还公开了一种流感病毒的检测试剂盒。

Description

基于咽拭子样本的流感病毒的检测方法和流感病毒的检测试 剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术和医学领域，特别涉及一种基于咽拭子样本的miRNA的流感病毒的检测方法和流感病毒的检测试剂盒。
背景技术
流感病毒是一种单股负链RNA病毒，属于正粘病毒科，根据其基质蛋白和核蛋白的不同，分为甲、乙、丙三型。其中甲型流感易发生变异，根据其血红素和神经氨酸酶的不同，可以分为16个亚型，感染人类和多种动物，是引起人源性流感流行的主要原因。自1918年以来，世界上已经出现多次甲型流感流行，如：1918年爆发的甲型H1N1流感、1957年爆发的甲型H2N2流感、1968年爆发的甲型H3N2流感、2009年爆发的甲型H1N1流感以及近来出现的甲型H7N9新亚型流感等，给人们带来巨大的经济损失。而甲型H1N1、H3N2以及乙型流感是最常见的季节性流感病毒毒株，目前已经成为危害公共健康的主要问题，并引起国际重视。由于流感病毒感染病人存在窗口期，在感染初期，不易检出流感病毒。因此，提高流感的早期诊断对提高感染流感的患者生存率具有重要意义。
在目前常用的检测流感的方法中，RT-PCR方法是检测流感的最常用的方法，它具有灵敏、快速，且能区分流感亚型等优点，但是存在操作时间长、对人员操作要求高且必须利用已知的核酸序列，因此不适于大量样本的检测及检测新出现的流感亚型。而检测流感病毒的金标准——病毒分离培养法，存在费时耗力等不足；由于流感病毒感染病人存在窗口期，早期抗体滴度不高或者呈阴性，限制了免疫学方法的应用，无法进行流感早期的诊断。因此，寻找理想的特异性强、敏感性高、稳定性好的诊断流感早期的新型标志物是提高防治的重要手段之一。
微RNA(即miRNA或者microRNA)是一类含19～23个核苷酸的内源性非编码RNA，因其表达具有高度组织特异性、阶段特异性、高保守性以及强稳定性即能够抵抗核糖核酸酶、反复冻融、pH变化、加热而保持稳定等特点而被研究者们广泛研究。研究表明，miRNA能调节如细胞增殖、分化和凋亡等多种生物过程。最近一些研究报道，miRNA与流感相关并能调节流感病毒感染性疾病的复制。在一篇文章中，筛查H7N9病人和阴性对照血清miRNA，有153个miRNA与毒力相关的高致病性H7N9禽流感病毒有关，其中146个miRNA是上调，7个miRNA表达下调。在另一篇文章中指出，36个猪编码miRNAs和22个人编码的miRNA分别在猪流感和2009年甲型H1N1流感病毒有假定的靶基因。此外，细胞miRNA在被两种不同亚型的病毒病毒(H1N1和H3N2)感染的人类肺上皮细胞进行分析(A549)。结果表明，mR-146a的失调，参与调节流感病毒的复制过程。由于咽拭子样本容易获得且具有无创性，这是已报道的首次使用咽拭子标本直接用于检测流感病毒相关miRNA。
发明内容
基于此，有必要提供一种基于咽拭子样本的miRNA的流感病毒的检测方法和流感病毒的检测试剂盒。
一种基于咽拭子样本的流感病毒的检测方法，包括如下步骤：
收集待检测咽拭子样本；
提取所述待检测样本中的总RNA；
以所述待检测样本中的总RNA为模版，以茎环逆转录引物为引物，进行茎环逆转录反应，得到反应液，其中，所述茎环逆转录引物包括第一茎环逆转录引物、第二茎环逆转录引物、第三茎环逆转录引物、第四茎环逆转录引物、第五茎环逆转录引物、第六茎环逆转录引物和第七茎环逆转录引物中的至少一种，所述第一茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ IDNo.1所示的序列组成的miR-29a-3p，所述第二茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.2所示的序列组成的miR-181a-5p，所述第三茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.3所示的序列组成的miR-449b-5p，所述第四茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.4所示的序列组成的miR-205-5p，所述第五茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.5所示的序列组成的miR-30c-5p，所述第六茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.6所示的序列组成的miR-34b-5p，所述第七茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.7所示的序列组成的miR-34c-3p；以及
以所述反应液为模版，以实时定量PCR引物为引物，进行实时定量PCR反应，并分别计算得到miR-29a-3p、miR-181a-5p、miR-449b-5p、miR-205-5p、miR-30c-5p、miR-34b-5p和miR-34c-3p的PCR相对定量值，其中，所述实时定量PCR引物包括第一组引物、第二组引物、第三组引物、第四组引物、第五组引物、第六组引物和第七组引物中的至少一种，所述第一组引物用于扩增miR-29a-3p逆转录后得到的片段，所述第二组引物用于扩增miR-181a-5p逆转录后得到的片段，所述第三组引物用于扩增miR-449b-5p逆转录后得到的片段，所述第四组引物用于扩增miR-205-5p逆转录后得到的片段，所述第五组引物用于扩增miR-30c-5p逆转录后得到的片段，所述第六组引物用于扩增miR-34b-5p逆转录后得到的片段，所述第七组引物用于扩增miR-34c-3p逆转录后得到的片段。
在一个实施例中，所述待检测样本为咽拭子样本。
在一个实施例中，所述茎环逆转录引物包括所述第一茎环逆转录引物、所述第二茎环逆转录引物和所述第七茎环逆转录引物中的至少一种，并且所述茎环逆转录引物包括所述第三茎环逆转录引物、所述第四茎环逆转录引物和所述第六茎环逆转录引物中的至少一种；
所述实时定量PCR引物包括所述第一组引物、所述第二组引物和所述第七组引物中的至少一种，并且所述实时定量PCR引物包括所述第三组引物、所述第四组引物和所述第六组引物中的至少一种。
在一个实施例中，所述茎环逆转录引物包括所述第四茎环逆转录引物、所述第六茎环逆转录引物和所述第七茎环逆转录引物中的至少一种，并且所述茎环逆转录引物包括所述第五茎环逆转录引物；
所述实时定量PCR引物包括所述第四组引物、所述第六组引物和所述第七组引物中的至少一种，并且所述实时定量PCR引物包括所述第五组引物。
在一个实施例中，所述茎环逆转录引物包括所述第一茎环逆转录引物，并且所述茎环逆转录引物包括所述第二茎环逆转录引物、所述第三茎环逆转录引物、所述第五茎环逆转录引物、所述第六茎环逆转录引物和所述第七茎环逆转录引物中的至少一种；
所述实时定量PCR引物包括所述第一组引物，并且所述实时定量PCR引物包括所述第二组引物、所述第三组引物、所述第五组引物、所述第六组引物和所述第七组引物中的至少一种。
在一个实施例中，所述第一茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.8所示，所述第二茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.9所示，所述第三茎环逆转录引物的序列如SEQ IDNo.10所示，所述第四茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.11所示，所述第五茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.12所示，所述第六茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.13所示，所述第七茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.14所示；
所述第一组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.15所示，下游引物序列如SEQ IDNO.16所示；
所述第二组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.17所示，下游引物序列如SEQ IDNO.18所示；
所述第三组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.19所示，下游引物序列如SEQ IDNO.20所示；
所述第四组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.21所示，下游引物序列如SEQ IDNO.22所示；
所述第五组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.23所示，下游引物序列如SEQ IDNO.24所示；
所述第六组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.25所示，下游引物序列如SEQ IDNO.26所示；
所述第七组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.27所示，下游引物序列如SEQ IDNO.28所示。
一种基于咽拭子样本的流感病毒的检测试剂盒，包括：
茎环逆转录引物，所述茎环逆转录引物包括第一茎环逆转录引物、第二茎环逆转录引物、第三茎环逆转录引物、第四茎环逆转录引物、第五茎环逆转录引物、第六茎环逆转录引物和第七茎环逆转录引物中的至少一种，所述第一茎环逆转录引物用于逆转录由SEQID No.1所示的序列组成的miR-29a-3p，所述第二茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ IDNo.2所示的序列组成的miR-181a-5p，所述第三茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.3所示的序列组成的miR-449b-5p，所述第四茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.4所示的序列组成的miR-205-5p，所述第五茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.5所示的序列组成的miR-30c-5p，所述第六茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.6所示的序列组成的miR-34b-5p，所述第七茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.7所示的序列组成的miR-34c-3p；
实时定量PCR引物，所述实时定量PCR引物包括第一组引物、第二组引物、第三组引物、第四组引物、第五组引物、第六组引物和第七组引物中的至少一种，所述第一组引物用于扩增miR-29a-3p逆转录后得到的片段，所述第二组引物用于扩增miR-181a-5p逆转录后得到的片段，所述第三组引物用于扩增miR-449b-5p逆转录后得到的片段，所述第四组引物用于扩增miR-205-5p逆转录后得到的片段，所述第五组引物用于扩增miR-30c-5p逆转录后得到的片段，所述第六组引物用于扩增miR-34b-5p逆转录后得到的片段，所述第七组引物用于扩增miR-34c-3p逆转录后得到的片段。
在一个实施例中，所述茎环逆转录引物包括所述第一茎环逆转录引物、所述第二茎环逆转录引物和所述第七茎环逆转录引物中的至少一种，并且所述茎环逆转录引物包括所述第三茎环逆转录引物、所述第四茎环逆转录引物和所述第六茎环逆转录引物中的至少一种；
所述实时定量PCR引物包括所述第一组引物、所述第二组引物和所述第七组引物中的至少一种，并且所述实时定量PCR引物包括所述第三组引物、所述第四组引物和所述第六组引物中的至少一种。
在一个实施例中，所述茎环逆转录引物包括所述第四茎环逆转录引物、所述第六茎环逆转录引物和所述第七茎环逆转录引物中的至少一种，并且所述茎环逆转录引物包括所述第五茎环逆转录引物；
所述实时定量PCR引物包括所述第四组引物、所述第六组引物和所述第七组引物中的至少一种，并且所述实时定量PCR引物包括所述第五组引物。
在一个实施例中，所述茎环逆转录引物包括所述第一茎环逆转录引物，并且所述茎环逆转录引物包括所述第二茎环逆转录引物、所述第三茎环逆转录引物、所述第五茎环逆转录引物、所述第六茎环逆转录引物和所述第七茎环逆转录引物中的至少一种；
所述实时定量PCR引物包括所述第一组引物，并且所述实时定量PCR引物包括所述第二组引物、所述第三组引物、所述第五组引物、所述第六组引物和所述第七组引物中的至少一种。
在一个实施例中，所述第一茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.8所示，所述第二茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.9所示，所述第三茎环逆转录引物的序列如SEQ IDNo.10所示，所述第四茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.11所示，所述第五茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.12所示，所述第六茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.13所示，所述第七茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.14所示；
所述第一组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.15所示，下游引物序列如SEQ IDNO.16所示；
所述第二组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.17所示，下游引物序列如SEQ IDNO.18所示；
所述第三组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.19所示，下游引物序列如SEQ IDNO.20所示；
所述第四组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.21所示，下游引物序列如SEQ IDNO.22所示；
所述第五组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.23所示，下游引物序列如SEQ IDNO.24所示；
所述第六组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.25所示，下游引物序列如SEQ IDNO.26所示；
所述第七组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.27所示，下游引物序列如SEQ IDNO.28所示。
这种流感病毒的检测方法基于miR-29a-3p、miR-181a-5p、miR-449b-5p、miR-205-5p、miR-30c-5p、miR-34b-5p和miR-34c-3p在正常人和流感患者中的差异性表达，通过检测得到待检测样本中miR-29a-3p、miR-181a-5p、miR-449b-5p、miR-205-5p、miR-30c-5p、miR-34b-5p和miR-34c-3p的PCR相对定量值，从而对待检测样本中是否具有流感病毒以及具有具体什么类型的流感病毒进行判断。
附图说明
图1为一实施方式的流感病毒的检测方法的流程图；
图2a为实施例1得到的正常咽拭子样本、甲型流感咽拭子样本和乙型流感咽拭子样本中的miR-29a-3p的表达丰度对比图；
图2b为实施例1得到的正常咽拭子样本、甲型流感咽拭子样本和乙型流感咽拭子样本中的miR-181a-5p的表达丰度对比图；
图2c为实施例1得到的正常咽拭子样本、甲型流感咽拭子样本和乙型流感咽拭子样本中的miR-205-5p的表达丰度对比图；
图2d为实施例1得到的正常咽拭子样本、甲型流感咽拭子样本和乙型流感咽拭子样本中的miR-34c-3p的表达丰度对比图；
图2e为实施例1得到的正常咽拭子样本、甲型流感咽拭子样本和乙型流感咽拭子样本中的miR-34b-5p的表达丰度对比图；
图2f为实施例1得到的正常咽拭子样本、甲型流感咽拭子样本和乙型流感咽拭子样本中的miR-30c-5p的表达丰度对比图；
图2g为实施例1得到的正常咽拭子样本、甲型流感咽拭子样本和乙型流感咽拭子样本中的miR-449b-5p的表达丰度对比图；
图2h为实施例1得到的正常咽拭子样本、甲型流感咽拭子样本和乙型流感咽拭子样本中的miR-151a-5p的表达丰度对比图；
图2i为实施例1得到的正常咽拭子样本、甲型流感咽拭子样本和乙型流感咽拭子样本中的let-7g-5p的表达丰度对比图；
图2j为实施例1得到的正常咽拭子样本、甲型流感咽拭子样本和乙型流感咽拭子样本中的miR-200c-3p的表达丰度对比图；
图2k为实施例1得到的正常咽拭子样本、甲型流感咽拭子样本和乙型流感咽拭子样本中的miR-671-5p的表达丰度对比图；
图3为实施例2中的甲型H1N1流感咽拭子样本和甲型H3N2流感咽拭子样本中的miR-29a-3p,miR-181a-5p,miR-449b-5p,miR-205-5p,miR-30c-5p,miR-34b-5p和miR-34c-3p的表达丰度的比较图，其中，纵坐标为各个生物标志物的PCR相对定量值；
图4a为是实施例2中根据ROC曲线(Receiver Operating Characteristic Curve,接受者操作特性曲线)判定miR-29a-3p在流感样本中的诊断价值的ROC曲线图；
图4b为是实施例2中根据ROC曲线(Receiver Operating Characteristic Curve,接受者操作特性曲线)判定miR-181a-5p在流感样本中的诊断价值的ROC曲线图；
图4c为是实施例2中根据ROC曲线(Receiver Operating Characteristic Curve,接受者操作特性曲线)判定miR-205-5p在流感样本中的诊断价值的ROC曲线图；
图4d为是实施例2中根据ROC曲线(Receiver Operating Characteristic Curve,接受者操作特性曲线)判定miR-34c-3p在流感样本中的诊断价值的ROC曲线图；
图4e为是实施例2中根据ROC曲线(Receiver Operating Characteristic Curve,接受者操作特性曲线)判定miR-34b-5p在流感样本中的诊断价值的ROC曲线图；
图4f为是实施例2中根据ROC曲线(Receiver Operating Characteristic Curve,接受者操作特性曲线)判定miR-30c-5p在流感样本中的诊断价值的ROC曲线图；
图4g为是实施例2中根据ROC曲线(Receiver Operating Characteristic Curve,接受者操作特性曲线)判定miR-449b-5p在流感样本中的诊断价值的ROC曲线图。
具体实施方式
下面主要结合附图及具体实施例对流感病毒的检测方法和流感病毒的检测试剂盒作进一步详细的说明。
如图1所示的一实施方式的流感病毒的检测方法，包括如下步骤：
S10、收集待检测样本。
待检测样本可以为咽拭子样本。收集待检测样本具体操作可以为：用无菌棉拭子采集的咽拭子置于无菌试管中，加入无菌Hanks液，吸取200μL于EP管中，低温-80℃保存待用。
S20、提取S10得到的待检测样本中的总RNA。
提取S10得到的待检测样本中的总RNA的操作可以采用商业化的购自Qiagen公司miRNeasy Micro Kit抽提试剂盒进行操作，并测量总RNA浓度。
S30、以S20得到的待检测样本中的总RNA为模版，以茎环逆转录引物为引物，进行茎环逆转录反应，得到反应液。
S30中茎环逆转录反应可以采用购自美国Ambion公司的TaqMan microRNA Assays和TaqMan microRNA Reverse Transcripts kit试剂盒进行操作。反转录反应条件为:16℃30min，42℃40min，85℃5min。
茎环逆转录引物包括第一茎环逆转录引物、第二茎环逆转录引物、第三茎环逆转录引物、第四茎环逆转录引物、第五茎环逆转录引物、第六茎环逆转录引物和第七茎环逆转录引物中的至少一种。
第一茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.1所示的序列组成的miR-29a-3p，第二茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.2所示的序列组成的miR-181a-5p，第三茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.3所示的序列组成的miR-449b-5p，第四茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.4所示的序列组成的miR-205-5p，第五茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.5所示的序列组成的miR-30c-5p，第六茎环逆转录引物用于逆转录由SEQID No.6所示的序列组成的miR-34b-5p，第七茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.7所示的序列组成的miR-34c-3p。
本实施方式中，第一茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.8所示，第二茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.9所示，第三茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.10所示，第四茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.11所示，第五茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.12所示，第六茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.13所示，第七茎环逆转录引物的序列如SEQID No.14所示。
S40、以S30得到的反应液为模版，以实时定量PCR引物为引物，进行实时定量PCR反应，并分别计算得到miR-29a-3p、miR-181a-5p、miR-449b-5p、miR-205-5p、miR-30c-5p、miR-34b-5p和miR-34c-3p的PCR相对定量值。
实时定量PCR反应可以采用美国Ambion公司的TaqMan microRNA Assays和TaqManmicroRNA Reverse Transcripts kit试剂盒进行操作。实时定量PCR反应条件为：95℃变性10min，95℃15s，60℃1min，共进行40个循环。
实时定量PCR反应中，可以选择U6snRNA作为内参。本实施方式中，U6snRNA的序列如SEQ ID NO.29所示，U6snRNA的上游引物序列如SEQ ID NO.30所示，U6snRNA的下游引物序列如SEQ ID NO.31所示。
miR-29a-3p、miR-181a-5p、miR-449b-5p、miR-205-5p、miR-30c-5p、miR-34b-5p和miR-34c-3p在正常人和流感患者咽拭子样本中存在差异表达，通过检测得到待检测样本中miR-29a-3p、miR-181a-5p、miR-449b-5p、miR-205-5p、miR-30c-5p、miR-34b-5p和miR-34c-3p的PCR相对定量值，从而对待检测样本中是否具有流感病毒以及具有具体什么类型的流感病毒进行判断。
本实施方式中，使用ΔCt公式来计算每个生物标志物的PCR相对定量值，ΔCt公式：ΔCt＝Ct miRNA-Ct U6snRNA；Ct是域值循环数，CtmiRNA是每个miRNA生物标志物的Ct值，CtU6是U6snRNA的Ct值。
实时定量PCR引物包括第一组引物、第二组引物、第三组引物、第四组引物、第五组引物、第六组引物和第七组引物中的至少一种。
第一组引物用于扩增miR-29a-3p逆转录后得到的片段，第二组引物用于扩增miR-181a-5p逆转录后得到的片段，第三组引物用于扩增miR-449b-5p逆转录后得到的片段，第四组引物用于扩增miR-205-5p逆转录后得到的片段，第五组引物用于扩增miR-30c-5p逆转录后得到的片段，第六组引物用于扩增miR-34b-5p逆转录后得到的片段，所述第七组引物用于扩增miR-34c-3p逆转录后得到的片段。
本实施方式中，第一组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.15所示，下游引物序列如SEQ ID NO.16所示；
第二组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.17所示，下游引物序列如SEQ ID NO.18所示；
第三组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.19所示，下游引物序列如SEQ ID NO.20所示；
第四组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.21所示，下游引物序列如SEQ ID NO.22所示；
第五组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.23所示，下游引物序列如SEQ ID NO.24所示；
第六组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.25所示，下游引物序列如SEQ ID NO.26所示；
第七组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.27所示，下游引物序列如SEQ ID NO.28所示。
具体的，miR-29a-3p、miR-181a-5p、miR-449b-5p、miR-205-5p、miR-34b-5p和miR-30c-5p能用于区分甲型流感。其中，miR-29a-3p、miR-181a-5p和miR-30c-5p在甲型流感中特异性表达上调，miR-449b-5p、miR-205-5p和miR-34b-5p在甲型流感特异性表达下调。在一个优选的实施方式中，茎环逆转录引物包括第一茎环逆转录引物、第二茎环逆转录引物和第七茎环逆转录引物中的至少一种，并且茎环逆转录引物包括第三茎环逆转录引物、第四茎环逆转录引物和第六茎环逆转录引物中的至少一种；实时定量PCR引物包括第一组引物、第二组引物和第七组引物中的至少一种，并且实时定量PCR引物包括第三组引物、第四组引物和第六组引物中的至少一种。
具体的，miR-205-5p、miR-34c-3p、miR-34b-5p和miR-30c-5p能用于区分乙型流感。其中，miR-205-5p、miR-34c-3p和miR-34b-5p在乙型流感中特异性表达下调，miR-30c-5p在乙型流感中特异性表达上调。在一个优选的实施方式中，茎环逆转录引物包括第四茎环逆转录引物、第六茎环逆转录引物和第七茎环逆转录引物中的至少一种，并且茎环逆转录引物包括第五茎环逆转录引物；实时定量PCR引物包括第四组引物、第六组引物和第七组引物中的至少一种，并且实时定量PCR引物包括第五组引物。
具体的，miR-29a-3p、miR-181a-5p、miR-449b-5p、miR-34c-3p、miR-34b-5p和miR-30c-5p能用于区分H1N1与H3N2，其中miR-29a-3p、miR-449b-5p在H1N1中特异性表达下调，miR-181a-5p、miR-34c-3p、miR-34b-5p和miR-30c-5p在H1N1中特异性表达上调在H3N2中有显著的表达上调。在一个优选的实施方式中，茎环逆转录引物包括第一茎环逆转录引物，并且茎环逆转录引物包括第二茎环逆转录引物、第三茎环逆转录引物、第五茎环逆转录引物、第六茎环逆转录引物和第七茎环逆转录引物中的至少一种；实时定量PCR引物包括第一组引物，并且实时定量PCR引物包括第二组引物、第三组引物、第五组引物、第六组引物和第七组引物中的至少一种。
这种流感病毒的检测方法基于miR-29a-3p、miR-181a-5p、miR-449b-5p、miR-205-5p、miR-30c-5p、miR-34b-5p和miR-34c-3p在正常人和流感患者中的差异性表达，通过检测得到待检测样本中miR-29a-3p、miR-181a-5p、miR-449b-5p、miR-205-5p、miR-30c-5p、miR-34b-5p和miR-34c-3p的PCR相对定量值，从而对待检测样本中是否具有流感病毒以及具有具体什么类型的流感病毒进行判断。
本发明还提供一种流感病毒的检测试剂盒，包括：茎环逆转录引物和实时定量PCR引物。
茎环逆转录引物包括第一茎环逆转录引物、第二茎环逆转录引物、第三茎环逆转录引物、第四茎环逆转录引物、第五茎环逆转录引物、第六茎环逆转录引物和第七茎环逆转录引物中的至少一种。
第一茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.1所示的序列组成的miR-29a-3p，第二茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.2所示的序列组成的miR-181a-5p，第三茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.3所示的序列组成的miR-449b-5p，第四茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.4所示的序列组成的miR-205-5p，第五茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.5所示的序列组成的miR-30c-5p，第六茎环逆转录引物用于逆转录由SEQID No.6所示的序列组成的miR-34b-5p，第七茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.7所示的序列组成的miR-34c-3p。
本实施方式中，第一茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.8所示，第二茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.9所示，第三茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.10所示，第四茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.11所示，第五茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.12所示，第六茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.13所示，第七茎环逆转录引物的序列如SEQID No.14所示。
miR-29a-3p、miR-181a-5p、miR-449b-5p、miR-205-5p、miR-30c-5p、miR-34b-5p和miR-34c-3p在正常人和流感患者咽拭子样本中存在差异表达，通过检测得到待检测样本中miR-29a-3p、miR-181a-5p、miR-449b-5p、miR-205-5p、miR-30c-5p、miR-34b-5p和miR-34c-3p的PCR相对定量值，从而对待检测样本中是否具有流感病毒以及具有具体什么类型的流感病毒进行判断。
实时定量PCR引物包括第一组引物、第二组引物、第三组引物、第四组引物、第五组引物、第六组引物和第七组引物中的至少一种。
第一组引物用于扩增miR-29a-3p逆转录后得到的片段，第二组引物用于扩增miR-181a-5p逆转录后得到的片段，第三组引物用于扩增miR-449b-5p逆转录后得到的片段，第四组引物用于扩增miR-205-5p逆转录后得到的片段，第五组引物用于扩增miR-30c-5p逆转录后得到的片段，第六组引物用于扩增miR-34b-5p逆转录后得到的片段，所述第七组引物用于扩增miR-34c-3p逆转录后得到的片段。
本实施方式中，第一组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.15所示，下游引物序列如SEQ ID NO.16所示；
第二组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.17所示，下游引物序列如SEQ ID NO.18所示；
第三组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.19所示，下游引物序列如SEQ ID NO.20所示；
第四组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.21所示，下游引物序列如SEQ ID NO.22所示；
第五组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.23所示，下游引物序列如SEQ ID NO.24所示；
第六组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.25所示，下游引物序列如SEQ ID NO.26所示；
第七组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.27所示，下游引物序列如SEQ ID NO.28所示。
具体的，miR-29a-3p、miR-181a-5p、miR-449b-5p、miR-205-5p、miR-34b-5p和miR-30c-5p能用于区分甲型流感。其中，miR-29a-3p、miR-181a-5p和miR-30c-5p在甲型流感中特异性表达上调，miR-449b-5p、miR-205-5p和miR-34b-5p在甲型流感特异性表达下调。在一个优选的实施方式中，茎环逆转录引物包括第一茎环逆转录引物、第二茎环逆转录引物和第七茎环逆转录引物中的至少一种，并且茎环逆转录引物包括第三茎环逆转录引物、第四茎环逆转录引物和第六茎环逆转录引物中的至少一种；实时定量PCR引物包括第一组引物、第二组引物和第七组引物中的至少一种，并且实时定量PCR引物包括第三组引物、第四组引物和第六组引物中的至少一种。
具体的，miR-205-5p、miR-34c-3p、miR-34b-5p和miR-30c-5p能用于区分乙型流感。其中，miR-205-5p、miR-34c-3p和miR-34b-5p在乙型流感中特异性表达下调，miR-30c-5p在乙型流感中特异性表达上调。在一个优选的实施方式中，茎环逆转录引物包括第四茎环逆转录引物、第六茎环逆转录引物和第七茎环逆转录引物中的至少一种，并且茎环逆转录引物包括第五茎环逆转录引物；实时定量PCR引物包括第四组引物、第六组引物和第七组引物中的至少一种，并且实时定量PCR引物包括第五组引物。
具体的，miR-29a-3p、miR-181a-5p、miR-449b-5p、miR-34c-3p、miR-34b-5p和miR-30c-5p能用于区分H1N1与H3N2，其中miR-29a-3p、miR-449b-5p在H1N1中特异性表达下调，miR-181a-5p、miR-34c-3p、miR-34b-5p和miR-30c-5p在H1N1中特异性表达上调在H3N2血清中有显著的表达上调。在一个优选的实施方式中，茎环逆转录引物包括第一茎环逆转录引物，并且茎环逆转录引物包括第二茎环逆转录引物、第三茎环逆转录引物、第五茎环逆转录引物、第六茎环逆转录引物和第七茎环逆转录引物中的至少一种；实时定量PCR引物包括第一组引物，并且实时定量PCR引物包括第二组引物、第三组引物、第五组引物、第六组引物和第七组引物中的至少一种。
这种流感病毒的检测试剂盒还可以包括dNTP mix、Multiscribe TM RT enzyme、10×RT Buffer、RNase inhibitor、RNaseH-free水以及内参U6snRNA。
以下为具体实施例，实施例中出现的各种仪器和试剂如果没有特别说明，均采用本领域常规仪器或试剂。
下面结合具体实施例对本申请的的流感病毒的检测方法和流感病毒的检测试剂盒做进一步的详细说明。
实施例1、用于流感检测的miRNA生物标志物组合的建立。
1、流感样本的收集和样本基本资料的整理。
发明人于2014年6月-2014年10月总共收集来自深圳出入境检验检疫局的66个咽拭子样本(其中包括25例甲型流感、20例乙型流感以及21例流感阴性样本)，用作建立miRNA生物标志物组合，同时系统收集了完整的样本人口学和流行病学资料。把用无菌棉拭子采集的咽拭子置于无菌试管中，加入无菌Hanks液，吸取200μL于EP管中，低温-80℃保存待用。
2、咽拭子样本中总RNA(包含miRNA)抽提。
每份样本取200μL咽拭子溶液,使用Qiagen公司的miRNeasy Micro Kit试剂盒,按照说明书步骤抽提总RNA,并取1μLRNA,使用NanoDropND-1000SpeCtrophotometer仪器按说明书步骤测量RNA浓度后置于-80℃保存备用。
3、miRNA颈环逆转录反应
对以下高表达miRNA：miR-29a-3p,miR-181a-5p,miR-205-5p,miR-30c-5p,miR-34b-5p,miR-34c-3p,miR-449b-5p,miR-151a-5p,let-7g-5p,miR-200c-3p,miR-671-5p,miR-491-5p和miR-105-3p在流感样本中进行筛查。逆转录试剂盒使用Ambion公司的TaqManmicroRNAReverse Tmscripts kit试剂盒，反应体系为d NTP mix(100mM)0.15μL，Multiscribe TM RT enzyme(50U/uL)1μL，10×RT Buffer 1.5μL，RNase inhibitor(20U/μL)0.19μL，及miRNA颈环引物，总RNA为5ng；最后加RNase Free水将反应液补足至15μL。将上述各试剂混匀，在热循环仪上进行反转录反应，反应条件如下：16℃30min，42℃40min，85℃5min，合成的cDNA于-80℃冰箱保存备用。
4、实时定量PCR(Real time-PCR，RT-PCR)反应。
miRNAs的实时荧光定量PCR反应：取6.75μL的反转录产物作为实时定量PCR反应的模板，使用Ambion公司的TaqMan microRNAAssays试剂盒进行实时定量PCR反应。定量PCR以U6snRNA为内参。根据TaqMan microRNAAssays操作说明书进行实时荧光定量PCR反应。反应体系为20μL，10μL 2×Taqman通用的PCR预混物，1μL 20×miRNA特异的引物，6.75μL cDNA，2.25μL水；95℃变性10min，95℃15s，60℃1min，共40循环。以U6snRNA(U6)作为内参，每个反应设置三个复孔，复孔间CT值不超过1，计算CT平均值。结果分析用△CT表示，ΔCt＝CtmiRNA-CtU6snRNA。各个miRNA生物标志物的PCR相对定量结果使用△CT表示，ΔCt＝CtmiRNA-CtU6snRNA，得到图2a～图2k、表1和表2。
表1：样本中miR-105-3p的表达丰度对比表
样本编号 CT值 样本编号 CT值 样本编号 CT值
1(甲型) - 21(乙型) - 41(阴性) -
2 36.72 22 - 42 -
3 - 23 - 43 -
4 - 24 - 44 34.65
5 - 25 - 45 -
6 - 26 - 46 -
7 - 27 34.8 47 -
8 - 28 - 48 -
9 - 29 - 49 -
10 - 30 - 50 -
11 - 31 - 51 -
12 - 32 - 52 -
13 32.58 33 - 53 36.73
14 - 34 - 54 -
15 - 35 - 55 -
16 - 36 - 56 -
17 - 37 34.44 57 -
18 - 38 - 58 -
19 - 39 - 59 -
20 - 40 - 60 -
表2：样本中miR-491-5p的表达丰度对比表
结合图2a～图2k、表1和表2，可以看出，miR-105-3p的检测率低于10％，miR-491-5p的CT值均大于35，因此，miR-105-3p和miR-491-5p均排除在外。剩下的11个miRNA中，miR-151a-5p,let-7g-5p,miR-200c-3p和miR-671-5p在流感样本中的表达量与在阴性样本中的表达量差异无统计学意义(P>0.05)；miR-29a-3p,miR-181a-5p,miR-205-5p,miR-30c-3p,miR-34b-5p,miR-34c-3p和miR-449b-5p在流感样本中的表达量与在阴性样本中的表达量差异有统计学意义(P<0.05)，用于下一步miRNA生物标志物表达谱进行流感的诊断及分型的方法。
特别的，结合图2a～图2g可以看出，miR-29a-3p、miR-181a-5p和miR-30c-5p在甲型流感中表达量均上调，miR-449b-5p、miR-205-5p和miR-34b-5p在甲型流感中表达量均下调，能用于区分甲型流感；miR-205-5p、miR-34c-3p和miR-34b-5p在乙型流感中表达量均下调，miR-30c-5p在乙型流感中表达量均上调，能用于区分乙型流感。
实施例2、应用miRNA生物标志物表达谱进行流感的诊断及分型的方法
1、流感样本的收集和样本基本资料的整理。
本发明人于2014年6月-2014年10月总共收集来自深圳出入境检验检疫局的86个咽拭子样本(其中包括25例H1N1、20例H3N2、20例乙型流感以及21例流感阴性样本)，用作miRNA生物标志物表达谱进行流感的诊断及分型，同时系统收集了完整的样本人口学和流行病学资料。把用无菌棉拭子采集的咽拭子置于无菌试管中，加入无菌Hanks液，吸取200μL于EP管中，低温-80℃保存待用。
2、咽拭子样本中总RNA(包含miRNA)抽提。
参照实施例1进行操作。
3、miRNA颈环逆转录反应和实时定量PCR反应。
参照实施例1进行操作，得到图3、图4a～图4g。
由图3可以看出，miR-29a-3p在H1N1中表达量均上调，miR-181a-5p、miR-449b-5p、miR-34c-3p、miR-34b-5p和miR-30c-5p在H1N1中表达量均下调，能用于区分甲型H1N1与H3N2。
甲型流感miR-29a-3p的平均PCR相对定量值为-0.755,而乙型流感和正常样本的miR-29a-3p的平均PCR相对定量值分别为-1.70和-1.74，差异有显著性(p＝0.0289)。
甲型流感miR-181a-5p的平均PCR相对定量值为4.51,而乙型流感和正常样本的miR-181a-5p的平均PCR相对定量值分别为3.46和3.16,差异有显著性(p＝0.0174)。
甲型流感miR-30c-5p的平均PCR相对定量值为1.28,而乙型流感和正常样本的miR-30c-5p的平均PCR相对定量值分别为1.40和0.05,差异有显著性(p＝0.0136)。
甲型流感miR-449b-5p的平均PCR相对定量值为-4.53,而乙型流感和正常样本的miR-449b-5p的平均PCR相对定量值分别为-2.15和-2.63,差异有显著性(p一0.019)。
甲型流感miR-205-5p的平均PCR相对定量值为0.29,而乙型流感和正常样本的miR-205-5p的平均PCR相对定量值分别为0.068,差异有显著性(p<0.0001)。
甲型流感miR-34b-5p的平均PCR相对定量值为2.88,而乙型流感和正常样本的miR-34b-5p的平均PCR相对定量值分别为2.51和4.66,差异有显著性(p＝0.0137)。
甲型流感miR-34c-3p的平均PCR相对定量值为5.55,而乙型流感和正常样本的miR-34c-3p的平均PCR相对定量值分别为3.10和6.32,差异有显著性(p＝0.0002)。
结合图4a～图4g，根据ROC曲线判定每个miRNA生物标志物在流感样本中的诊断价值时发现,单用咽拭子miR-29a-3p相对定量值进行流感诊断时的敏感性为51.2％,特异性为77.3％,可产生ROC曲线的AUC面积为0.663；单用咽拭子miR-181a-5p相对定量值进行流感诊断时的敏感性为60.0％,特异性为76.2％,可产生ROC曲线的AUC面积为0.695；单用咽拭子miR-30c-5p相对定量值进行流感诊断时的敏感性为48.8％,特异性为81.0％,可产生ROC曲线的AUC面积为0.690；单用咽拭子miR-449b-5p相对定量值进行流感诊断时的敏感性为73.2％,特异性为71.4％,可产生ROC曲线的AUC面积为0.764；单用咽拭子miR-205-5p相对定量值进行流感诊断时的敏感性为65.9％,特异性为73.3％,可产生ROC曲线的AUC面积为0.724；单用咽拭子miR-34b-5p相对定量值进行流感诊断时的敏感性为55.6％,特异性为94.1％,可产生ROC曲线的AUC面积为0.739；单用咽拭子miR-34c-3p相对定量值进行流感诊断时的敏感性为75％,特异性为85.7％,可产生ROC曲线的AUC面积为0.839。
以上每个单独的生物标志物所产生的AUC面积均在0.65以上,提示这7个生物标志物单独作为流感的诊断标准均有一定的准确性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种非疾病诊断和治疗的基于咽拭子样本的流感病毒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
收集待检测咽拭子样本；
提取所述待检测样本中的总RNA；
以所述待检测样本中的总RNA为模版，以茎环逆转录引物为引物，进行茎环逆转录反应，得到反应液，其中，所述茎环逆转录引物包括第五茎环逆转录引物，并且所述茎环逆转录引物还包括第一茎环逆转录引物、第二茎环逆转录引物、第三茎环逆转录引物、第四茎环逆转录引物、第六茎环逆转录引物和第七茎环逆转录引物中的至少一种，所述第一茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.1所示的序列组成的miR-29a-3p，所述第二茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.2所示的序列组成的miR-181a-5p，所述第三茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.3所示的序列组成的miR-449b-5p，所述第四茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.4所示的序列组成的miR-205-5p，所述第五茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.5所示的序列组成的miR-30c-5p，所述第六茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.6所示的序列组成的miR-34b-5p，所述第七茎环逆转录引物用于逆转录由SEQID No.7所示的序列组成的miR-34c-3p；以及
以所述反应液为模版，以实时定量PCR引物为引物，进行实时定量PCR反应，并分别计算得到miR-29a-3p、miR-181a-5p、miR-449b-5p、miR-205-5p、miR-30c-5p、miR-34b-5p和miR-34c-3p的PCR相对定量值，其中，所述实时定量PCR引物包括第五组引物，并且所述实时定量PCR引物还包括第一组引物、第二组引物、第三组引物、第四组引物、第六组引物和第七组引物中的至少一种，所述第一组引物用于扩增miR-29a-3p逆转录后得到的片段，所述第二组引物用于扩增miR-181a-5p逆转录后得到的片段，所述第三组引物用于扩增miR-449b-5p逆转录后得到的片段，所述第四组引物用于扩增miR-205-5p逆转录后得到的片段，所述第五组引物用于扩增miR-30c-5p逆转录后得到的片段，所述第六组引物用于扩增miR-34b-5p逆转录后得到的片段，所述第七组引物用于扩增miR-34c-3p逆转录后得到的片段。
2.如权利要求1所述的非疾病诊断和治疗的流感病毒的检测方法，其特征在于，
所述茎环逆转录引物包括所述第五茎环逆转录引物，所述茎环逆转录引物还包括所述第一茎环逆转录引物和所述第二茎环逆转录引物中的至少一种，并且所述茎环逆转录引物还包括所述第三茎环逆转录引物、所述第四茎环逆转录引物和所述第六茎环逆转录引物中的至少一种；
所述实时定量PCR引物包括所述第五组引物，所述实时定量PCR引物还包括所述第一组引物和所述第二组引物中的至少一种，并且所述实时定量PCR引物还包括所述第三组引物、所述第四组引物、所述第六组引物和所述第七组引物中的至少一种。
3.如权利要求1所述的非疾病诊断和治疗的流感病毒的检测方法，其特征在于，
所述茎环逆转录引物包括所述第五茎环逆转录引物，并且所述茎环逆转录引物还包括所述第四茎环逆转录引物、所述第六茎环逆转录引物和所述第七茎环逆转录引物中的至少一种；
所述实时定量PCR引物包括所述第五组引物，并且所述实时定量PCR引物还包括所述第四组引物、所述第六组引物和所述第七组引物中的至少一种。
4.如权利要求1所述的非疾病诊断和治疗的流感病毒的检测方法，
所述茎环逆转录引物包括所述第一茎环逆转录引物、所述第二茎环逆转录引物、所述第三茎环逆转录引物、所述第四茎环逆转录引物、所述第五茎环逆转录引物、所述第六茎环逆转录引物和所述第七茎环逆转录引物；
所述实时定量PCR引物还包括所述第一组引物、所述第二组引物、所述第三组引物、所述第四组引物、所述第五组引物、所述第六组引物和所述第七组引物。
5.如权利要求1～4中任一项所述的流感病毒的检测方法，其特征在于，所述第一茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.8所示，所述第二茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.9所示，所述第三茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.10所示，所述第四茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.11所示，所述第五茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.12所示，所述第六茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.13所示，所述第七茎环逆转录引物的序列如SEQ IDNo.14所示；
所述第一组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.15所示，下游引物序列如SEQ ID NO.16所示；
所述第二组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.17所示，下游引物序列如SEQ ID NO.18所示；
所述第三组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.19所示，下游引物序列如SEQ ID NO.20所示；
所述第四组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.21所示，下游引物序列如SEQ ID NO.22所示；
所述第五组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.23所示，下游引物序列如SEQ ID NO.24所示；
所述第六组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.25所示，下游引物序列如SEQ ID NO.26所示；
所述第七组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.27所示，下游引物序列如SEQ ID NO.28所示。
6.一种流感病毒的检测试剂盒，其特征在于，包括：
茎环逆转录引物，所述茎环逆转录引物包括第五茎环逆转录引物，并且所述茎环逆转录引物还包括第一茎环逆转录引物、第二茎环逆转录引物、第三茎环逆转录引物、第四茎环逆转录引物、第六茎环逆转录引物和第七茎环逆转录引物中的至少一种，所述第一茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.1所示的序列组成的miR-29a-3p，所述第二茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.2所示的序列组成的miR-181a-5p，所述第三茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.3所示的序列组成的miR-449b-5p，所述第四茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.4所示的序列组成的miR-205-5p，所述第五茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.5所示的序列组成的miR-30c-5p，所述第六茎环逆转录引物用于逆转录由SEQ ID No.6所示的序列组成的miR-34b-5p，所述第七茎环逆转录引物用于逆转录由SEQID No.7所示的序列组成的miR-34c-3p；
实时定量PCR引物，所述实时定量PCR引物包括第五组引物，并且所述实时定量PCR引物还包括第一组引物、第二组引物、第三组引物、第四组引物、第六组引物和第七组引物中的至少一种，所述第一组引物用于扩增miR-29a-3p逆转录后得到的片段，所述第二组引物用于扩增miR-181a-5p逆转录后得到的片段，所述第三组引物用于扩增miR-449b-5p逆转录后得到的片段，所述第四组引物用于扩增miR-205-5p逆转录后得到的片段，所述第五组引物用于扩增miR-30c-5p逆转录后得到的片段，所述第六组引物用于扩增miR-34b-5p逆转录后得到的片段，所述第七组引物用于扩增miR-34c-3p逆转录后得到的片段。
7.如权利要求6所述的流感病毒的检测试剂盒，其特征在于，
所述茎环逆转录引物包括所述第五茎环逆转录引物，所述茎环逆转录引物还包括所述第一茎环逆转录引物和所述第二茎环逆转录引物中的至少一种，并且所述茎环逆转录引物还包括所述第三茎环逆转录引物、所述第四茎环逆转录引物和所述第六茎环逆转录引物中的至少一种；
所述实时定量PCR引物包括所述第五组引物，所述实时定量PCR引物还包括所述第一组引物和所述第二组引物中的至少一种，并且所述实时定量PCR引物还包括所述第三组引物、所述第四组引物、所述第六组引物和所述第七组引物中的至少一种。
8.如权利要求6所述的流感病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述茎环逆转录引物包括所述第四茎环逆转录引物、所述第六茎环逆转录引物和所述第七茎环逆转录引物中的至少一种，并且所述茎环逆转录引物包括所述第五茎环逆转录引物；
所述实时定量PCR引物包括所述第四组引物、所述第六组引物和所述第七组引物中的至少一种，并且所述实时定量PCR引物包括所述第五组引物。
9.如权利要求6所述的流感病毒的检测试剂盒，其特征在于，
所述茎环逆转录引物包括所述第五茎环逆转录引物，并且所述茎环逆转录引物还包括所述第四茎环逆转录引物、所述第六茎环逆转录引物和所述第七茎环逆转录引物中的至少一种；
所述实时定量PCR引物包括所述第五组引物，并且所述实时定量PCR引物还包括所述第四组引物、所述第六组引物和所述第七组引物中的至少一种。
10.如权利要求6～9中任一项所述的流感病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述第一茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.8所示，所述第二茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.9所示，所述第三茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.10所示，所述第四茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.11所示，所述第五茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.12所示，所述第六茎环逆转录引物的序列如SEQ ID No.13所示，所述第七茎环逆转录引物的序列如SEQ IDNo.14所示；
所述第一组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.15所示，下游引物序列如SEQ ID NO.16所示；
所述第二组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.17所示，下游引物序列如SEQ ID NO.18所示；
所述第三组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.19所示，下游引物序列如SEQ ID NO.20所示；
所述第四组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.21所示，下游引物序列如SEQ ID NO.22所示；
所述第五组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.23所示，下游引物序列如SEQ ID NO.24所示；
所述第六组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.25所示，下游引物序列如SEQ ID NO.26所示；
所述第七组引物：上游引物序列如SEQ ID NO.27所示，下游引物序列如SEQ ID NO.28所示。
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