CN102416185A

CN102416185A - miR29在制备抗流感病毒药物中的应用

Info

Publication number: CN102416185A
Application number: CN2011104114830A
Authority: CN
Inventors: 朱应; 房家立; 吴建国
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2011-12-12
Filing date: 2011-12-12
Publication date: 2012-04-18

Abstract

本发明公开了miR29在制备抗流感病毒感染药物中的应用。本发明证实miR29可以通过调节细胞内炎症基因启动子甲基化水平的方式诱导一种重要的炎症因子COX2的表达，并进而增强干扰素λ1，从而增强机体抵抗流感病毒感染的能力。而miR29的反义RNA则能有效抑制COX2和干扰素λ1的表达，并进而抑制由流感病毒引起的炎症反应，揭示miR29可作为抗病毒药物和消炎药治疗的新靶标。

Description

miR29在制备抗流感病毒药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及miR29在制备抗流感药物和消炎药物中的应用。

背景技术

流感病毒是引起流行性感冒的病原，分为甲(influenza A virus)、乙(influenzaB virus)、丙(influenza C virus)三型，其中以甲型流感对人类威胁最大。人流感病毒主要是H1、H2和H3亚型，而目前危害严重的高致病性禽流感病毒多为H5、H7和H9亚型，即H5N1、H7N7、H9N2等，其中以H5N1亚型病死率高。因此本发明主要以H3N2A型流感病毒为研究对象对miR29的抗病毒活性进行了探讨。

流感病毒属正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，具有包膜的8个片段，共编码11种蛋白质的单链负RNA病毒。与其他RNA病毒不同的是，流感病毒所有RNA(mRNA、cRNA、vRNA)的合成均在被感染细胞的核内完成。mRNA在核内合成后转移到胞浆，合成病毒的结构和非结构蛋白；而后开始装配流感病毒，完成后以出芽方式释放出子代病毒颗粒，进一步侵入新的宿主细胞。目前，流感仍属未能有效控制的急性上呼吸道传染病。由于流感病毒的抗原变异能力强，加之个体免疫力的不同，疫苗的保护率并不高，且疫苗只对已知的流感病毒亚型有预防作用，而对于由抗原性漂移或抗原性转换所产生的新型流感病毒无效。流感病毒，尤其是高致病性流感病毒的感染经常会在宿主中引起所谓“细胞因子风暴”。“细胞因子风暴”是指机体感染微生物后引起体液中多种细胞因子(包括干扰素，白介素和炎症因子等)迅速大量产生的现象，它也是引起急性呼吸障碍综合征和多器官衰竭的重要原因之一。著名的1918流感感染的患者中，多数致死病例死于细胞因子风暴造成的肺水肿和窒息。相对于婴幼儿和老年人，青壮年患者由于其免疫系统反应更剧烈也更快，因此受细胞因子风暴影响明显大于老年人和婴幼儿。因此在高致病性流感流行的过程中中青年患者死亡率远高于其他年龄段患者。效控制细胞因子风暴的发生是治疗高致病性流感的重要手段之一。可逆的DNA甲基化是基因表观遗传修饰的一种形式。一般来讲，基因得到甲基化状态与基因的转录调控密切相关。没有被甲基化的CpG二核苷酸一般出现在一些正在表达的基因启动子和第一个外显子区域或一些持家基因及组织特异性表达基因的启动子区。在高等真核生物中，特定DNA位点的甲基化-去甲基化及部分组蛋白的乙酰化与其所在基因的转录活性是紧密联系的。DNA的主要是由DNA甲基转移酶家族的成员来催化完成的，真核生物DNA甲基转移酶家族共有5个成员，分别为DNMT1，DNMT2，DNMT3a，DNMT3b和DNMT3L。DNMT3a和DNMT3b主要负责催化DNA甲基化反应，而DNMT1则主要负责对DNA甲基化的维持。

MicroRNA是一类内源性的约23nt的RNA分子，在真核生物的转录调控过程中起着非常重要的作用。这些小分子RNA并不是简单的RNA大分子的碎片，而是由专门基因编码并加工形成的有特定功能的小RNA分子。MiRNA有着不同于其它RNA的鲜明的的特点，主要体现在以下几方面：①miRNA不编码任何蛋白，没有开放阅读框，没有3’端帽子结构和5’端的polyA尾巴；②一般来说长度在20至24nt之间，但并不绝对。目前发现某些生物体内有26至30nt长的miRNA分子。目前来说对miRNA分子长度学界并没有达成统一的意见。③成熟的miRNA的3’端为羟基，5’端为磷酸基团，这一点与其他功能RNA降解形成的RNA碎片完全不同。④miRNA还有组织特异性，高度保守性和表达时序性。MiR29家族共有3个成员，即miR29a，b和c。目前研究表明，miR29与多种分化现象和人类疾病密切相关，其中包括成骨细胞分化，淋巴细胞白血病，肺部纤维化等。另外还发现miR29家族成员与某些细胞内的重要蛋白的表达密切相关，如重要的抑癌基因P53，细胞凋亡途径中的Bcl-1等。另外，通过基因芯片筛选，还发现miR29在多种癌细胞中表达量异常降低，如原发性肺癌中的表达量不足正常肺上皮细胞中miR29表达量的1％。最近有研究表明，miR29家族的三个成员miR29a，b，c均能与DNA甲基转移酶DNMT3a和3b的基因转录产物mRNA的3’-UTR相结合，并特异性的降低其表达，但对DNMT1则没有影响。由于DNMT家族成员表达的变化经常与基因的表达变化密切相关。因此可以推测，miR29可能通过影响DNMT家族成员的表达量来调控某些基因的表达。

环加氧酶(COX)是一类重要的促炎因子。在炎症反应中，环加氧酶将花生四烯酸转化为促炎前列腺素H2，而这一步也是所有前列腺素(包括PGE2)合成所必须的步骤。环加氧酶主要有两个亚型-COX-1和COX-2。COX-1可以看成是持家基因，几乎在人体各种组织细胞中均有表达，并介导相关的功能。而COX-2则是一种诱导型的炎症因子，出现于各种发生急性和慢性炎症反应的组织中。环加氧酶2(COX-2)作为炎症网络中的重要成员之一绝对不是孤立存在的。它与其他炎症网络成员间有着千丝万缕的联系。目前已证实，COX-2可以诱导多种干扰素和白介素的表达，而这些受到影响的炎症因子又通过不同途径或促进或抑制COX-2自身的表达。

干扰素λ1属于III型干扰素。与传统意义上的I型干扰素(如干扰素α和干扰素β)不同，干扰素λ有自己的特异性受体IFNλR。IFNλR具有很强的干扰素λ家族专一性，只能识别干扰素λ家族成员。IFNλR的表达有严格的细胞特异性，仅在上皮细胞中有较高的表达量，而相对的，I型干扰素受体则在几种细胞中都有所表达。因此相对于I型干扰素，干扰素λ具有更强的组织特异性，在对抗某些病毒感染的过程中起着非常重要的作用。干扰素α的优势则体现在其广谱性和表达细胞的广泛性。

在流感病毒感染细胞后会引起强烈的免疫反应。在上皮细胞中，负责对流感病毒感染进行应答的主要免疫因子是干扰素α和干扰素λ。干扰素λ特异性受体在上皮细胞中有着较高的表达量。虽然就抗病毒能力来讲干扰素λ1并不如一型干扰素的抗病毒能力强，但在对上皮细胞的防护中，干扰素λ1的抗病毒活性却更为显著。这提示我们干扰素λ的抗病毒能力只对特定细胞，尤其是上皮细胞，最为有效。相比之下，干扰素α的优势则体现在其广谱性和表达细胞的广泛性。另外，分化了的ATII细胞是分泌型干扰素λ的主要来源。

发明内容

本发明证明miR29能有效激活验证网络及干扰素λ1的表达并行使抗病毒功能，阐述其可以作为抗流感药物和消炎药物研发的新靶点。

本发明还涉及miR29抗流感病毒的机理及其在作为制备抗流感病毒药物中的应用。

本发明还涉及miR29反义RNA在制备消炎药物中的应用。

通过细胞水平和临床水平检测，证实流感病毒感染可以引起miR29的上调；再由细胞水平实验证明miR29可以抑制甲基化酶DNMT3a和3b的表达，同时促进炎症因子COX2的表达，而COX2的表达则能上调抗病毒基因干扰素λ1的表达，并最终完成抗病毒功能。

研究结果表明miR29在细胞水平上是流感病毒引起炎症反应过程中的重要控制因子，其下游基因COX2和干扰素λ1具有良好的抗病毒作用，表明该位点可以作为研制抗流感药物和消炎药物的重要靶位点，为其进一步开发应用奠定了良好的理论基础。

同时，miR29的反义RNA则具有一定的抗炎症作用，在细胞水平能有效抑制重要的炎症基因COX2的表达，并进而抑制其他多种参与炎症反应的细胞因子的表达。这意味着miR29同时可以作为消炎药物的靶位点被进一步研究和应用。

作为一种序列已知的microRNA，miR29可以通过体外直接合成的方式获得；另外，在流感感染的肺上皮细胞A549中，在感染早期可以检测到明显的miR29表达上升(图1-1)，在流感病人的外周血单核细胞(PBMC)中也可以检测到miR29的明显上升(图1-2)

miR29能有效抑制A549细胞中甲基化酶的表达和活性。我们用Lipo2000转染试剂将miR29家族的3个主要成员miR29a，miR29b和miR29c分别转入A549细胞中，24小时候测定miR29家族成员对细胞核中甲基化酶总活力是否有影响图(图2)。结果表明，miR29家族成员可以有效抑制A549细胞核中甲基化酶的活性。为了进一步验证上述实验结果，我们又分别用蛋白质印迹(Westernblot)法检测了转染了miR29家族成员的A549细胞中DNMT3a和DNMT3b蛋白的表达水平(图3)。结果我们发现，转染了三种miRNA后，DNMT3a和DNMT3b的表达水平有不同程度的下降。而三种miRNA中又以miR29b的作用最为明显。而细胞内甲基化酶表达水平和细胞核内酶活性的降低，又是其下游炎症因子和其他一些抗病毒基因开启的先决条件。

miR29能诱导COX2表达水平上升。我们同样将miR29的三个家族主要成员miR29a，miR29b和miR29c分别转入A549细胞中，24小时后测定细胞上清中前体肾上腺素2(PGE2，即COX2基因下游产物)的表达(图4)。我们发现，转染了后miR29家族成员后，COX2家族的下游产物PGE2的表达均有不同程度的升高，而且由其以miR29b的作用最为明显。而PEG2，也就是前体肾上腺素，是一种重要的炎症因子，其水平的高低能直接反应体内炎症反应剧烈程度。该实验证明miR29可以有效诱发体内验证网络的启动。

为了验证上述结果，我们又用蛋白印迹的方法直接检测了转染miR29a，b，c后细胞中COX2蛋白的表达水平(图5)。结果我们发现，转染了三种miRNA后，COX2的表达水平均有不同程度的上升，这些结果一方面验证了前文提到的前人的研究结果，另一方面又证明COX2的上调确实有可能是由miR29家族成员在病毒感染后上调造成的。

相反地，我们又合成了针对miR29b的反义小RNA作为miR29b的特异性抑制剂，并将其转入A549细胞中，再以流感病毒加以感染，之后测定COX2在mRNA和蛋白水平的表达水平变化(图6)。我们发现，在转染了miR29b的特异性反义小RNA后，经过流感病毒的感染，COX2的表达无论在mRNA水平还是蛋白水平也均被抑制了。这说明miR29的反义RNA能有效抑制流感病毒引发的炎症网络激活，是一个非常有效的消炎药物的潜在靶位点。

miR29引起的COX2上调可诱导抗病毒基因干扰素λ1的表达。前文已经证明miR29能引起COX2基因上调，但这只是一抗病毒网络的开始。当COX2基因在miR29的作用下启动后，一种能有效抑制流感病毒的新型干扰素家族成员——干扰素λ1的表达被激活了。干扰素λ1是近年来新发现的III型干扰素中的一个重要的成员，在多种病毒感染过程中发挥着抗病毒功能。尤其是在流感病毒感染过程中，其抗病毒功能被深入的进行了研究，甚至有研究表明，在上皮细胞中，干扰素λ1的表达水平和抗病毒活性甚至超过了传统意义上的抗病毒作用的主力军I型干扰素。

我们收集了32份流感病人血清和32份正常人血清，分别检测了每份流感病人血清中干扰素λ1和COX2基因下游产物PGE2的表达水平，并以散点图的形式表现两者的相关性(图7)。我们发现，两者间有非常明显的相关性，干扰素λ1在流感病毒感染病人血清中的表达水平随PGE2的升高而升高。这提示我们两者间的表达调控可能存在着紧密的联系。为了进一步验证上述结论，我们设计了COX2特异性干扰RNA(siCOX2)来抑制流感病毒感染过程中产生的内源性COX2，并观察在内源性COX2被抑制的情况下由流感感染造成的干扰素λ1表达是否有变化(图8)。我们发现，在人为抑制了COX2的表达的情况下，干扰素λ1的表达虽然没有被完全抑制，但无论在mRNA还是在蛋白水平均有明显的降低。这说明在流感病毒引起的干扰素λ1表达过程中，COX2可能扮演着重要的角色。然后我们又将flag2b-COX2过表达质粒以浓度梯度的方式转入A549细胞中(图9)结果表明，COX2的过表达对干扰素λ1的表达无论在mRNA水平还是蛋白质水平均有明显的促进作用，并且在一定范围内呈剂量依赖。

最后，我们分别测定了流感病毒感染A549细胞后miR29，COX2和干扰素λ1在细胞内的表达水平(图10)。如图所示，miR29能在病毒感染早期有效诱导COX2和干扰素λ1的表达，发挥其抗病毒功能。

本发明提供了一种新的抗病毒miRNA——miR29，它能有效诱导炎症基因COX2和抗病毒基因IFN-λ1的表达，而其反义mRNA则能有效的抑制两者的表达，从而实现抑制炎症的功能。其最大优点是抗病毒效果明显，具有广谱性，对细胞无毒副作用，是极具临床潜力的生物制剂，为流感的治疗和消炎药物的研究提供了新的靶位点。

附图说明

图1流感病毒感染早期可诱导miR29b表达。

图2miR29家族成员降低细胞核中甲基化酶总活力。

图3miR29降低A549细胞DNMT3a和DNMT3b蛋白的表达水平。

图4miR29提高COX2家族的下游产物PGE2的表达。

图5miR29在蛋白水平提高COX2的表达。

图6miR29反义RNA抑制流感病毒引起的COX2表达。

图7流感病人血清中COX2与干扰素λ1相关性散点图。

图8COX2干扰RNA抑制流感引起的干扰素λ1表达。

图9COX2过表达促进干扰素λ1表达。

图10流感病毒感染48小时内miR29，COX2与干扰素λ1的动力学曲线。

具体实施方式

一，材料和试剂

1，细胞系

文中所用A549细胞系来自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)

2，抗体

DNMT3A抗体(sc-10231，购自Santa Cruz)；

DNMT3B抗体(sc-10236，购自Santa Cruz)；

IL29抗体(IFN-λ1)(sc-130787，购自Santa Cruz)

COX2抗体由本试验室免疫家兔得到并保存于-70℃

3，试剂盒

甲基化酶活性测定试剂盒EpiQuik DNA Methyltransferase Activity/Inhibitionassay kit (Epigentek，Brooklyn，NY)

PGE2检测试剂盒Biotrak Prostaglandin E2 Enzyme Immunoassay system(R &D Systems)

MiRNA29检测引物套装Hairpin-it^TM miRNAs qPCR Qualititation Kit(GenePharma)

4，合成的引物，siRNA和miRNA

(1)COX2检测引物：

上游引物：5’-ACAATGCTGACTATGGCTAC-3’，(SEQ ID NO：1)

下游引物：5’-ATGGGAGGAGTTCAGGGA-3’；(SEQ ID NO：2)

(2)β-actin检测引物：

上游引物：5’-CCATCGAGCACGGCATCG TCACCA-3’，(SEQ ID NO：3)

下游引物：5’-CTCGGTGAGGATCTTC ATGAGGTAGT-3(SEQ ID NO：4)

(3)DNMT3a检测引物：

上游引物：5’-CGTTGGCATCCACTGTGAATGA-3’，(SEQ ID NO：5)

下游引物：5’-TTACACACACGCAAAATACTCCTT-3’；(SEQ ID NO：6)

(4)DNMT3b检测引物：

上游引物：5’-CCTGAGGCCTTCACGTTCAA-3’，(SEQ ID NO：7)

下游引物：5’-ACTTGTGGGTGTTCTCAGGC-3’.(SEQ ID NO：8)

(5)GAPDH检测引物：

上游引物：5‘-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’(SEQ ID NO：9)

下游引物：5‘-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’(SEQ ID NO：10)

(6)miR29家族成员

Has-miR29a：UUGGCUAAAGUCUACCACGAU (SEQ ID NO：11)

Has-miR29b：UUGUGACUAAAGUUUACCACGAU (SEQ ID NO：12)

Has-miR29c：UGGCUAAAGUUUACCACGAU (SEQ ID NO：13)

二，实验方法

1，mRNA提取和RT-PCR

①将细胞样品用冷ph＝7.4的磷酸盐缓冲液洗一遍，弃去缓冲液。

②用胰蛋白酶在37℃消化至细胞全部脱落，收集细胞，2000g离心5分钟，弃去上清。

③将细胞溶于1ml Trizol，4℃消化至少20分钟，保证细胞核完全溶解。

④每个样品加入200ul氯仿，剧烈震荡15秒，在4℃下12000转/秒离心10分钟。吸取上清，(注意不要吸到液体界面分层处的白色沉淀，如吸到可将上清重新离心一次)，向上清中加入2倍体积的无水乙醇。-20℃沉淀30分钟。12000转/秒离心10分钟。

⑤离心后将沉淀用预冷的75％(体积比)乙醇(DEPC水配制)1ml洗一遍，12000转/秒离心10分钟，弃去上清后将沉淀晾干。

⑥向沉淀中加入17.5ul DEPC水，完全溶解沉淀。

⑦将溶于水的mRNA转入DEPC处理过的PCR管，放入PCR仪中85℃10分钟打开mRNA二级结构，然后立即放到冰上防止二级结构重新生成

⑧逆转录反应体系如下

反应条件：37℃，保温1h，72℃保温10min使MLV逆转录酶失活以终止反应。

2，半定量PCR分析

(1)半定量PCR以mRNA逆转录得到的cDNA为模板，以目的DNA片段的特异性引物和内参(通常为β-actin或GAPDH)引物分别进行PCR。以内参基因PCR产物亮度调整cDNA上样量，使各样品PCR起始时的模板量保持一致，再通过对目的基因PCR片段条带的亮度比较确定目的基因的上下调关系。以TAKARA生产的LC taq酶为例，PCR反应体系如下：

反应条件如下：

95℃，3分钟

94℃，30秒

55℃，30秒

72℃，30秒，

72℃保温10分钟

使温度降至室温

注：其中②、③、④步为反应循环，一般进行30个循环左右。如检测低表达基因循环数可适当增加。第四步延伸时间则依照PCR片段大小决定。

PCR完成后，产物用1(质量比)的琼脂糖凝胶电泳法进行检测

(2)Realtime-PCR半定量分析

反应体系

反应条件

反应条件如下：

①95℃，3分钟

②94℃，15秒

③55℃，15秒

④72℃，20秒，于该步测定荧光值

⑤使温度从40℃缓慢升至90℃制作熔解曲线

⑥使温度降至室温

注：其中②、③、④步为反应循环，一般进行30个循环左右。如检测低表达基因循环数可适当增加。

其中第三步的温度一般为为引物Tm值的中间值

3，荧光定量PCR法检测miRNA表达

(1)模板制备

④每个样品加入200ul氯仿，剧烈震荡15秒，在4℃下12000转/秒离心10分钟。

⑤吸取上清，(注意不要吸到液体界面分层处的白色沉淀，如吸到可将上清重新离心一次)，向上清中加入2倍体积的无水乙醇。

⑥-20℃沉淀30分钟。12000转/秒离心10分钟。

⑦离心后将沉淀用预冷的75(体积比)乙醇(DEPC水配制)1ml洗一遍，12000转/秒离心10分钟，弃去上清后将沉淀晾干。向沉淀中加入Xul DEPC水，完全溶解沉淀。(X的体积根据逆转录过程中所需的水量决定)

⑧逆转录反应体系制备

该过程中上一步溶解的总RNA要分成两部分，分别进行样品miRNA和作为内参的U6-miRNA逆转录反应的模板

逆转录程序为16℃30分钟；42℃30分钟；85℃10分钟。

反应结束后立即将产物取出并放置于冰上，后续所有步骤都要在冰上进行，尽量不要将cDNA产物从冰上移走。

(2)miRNA实时荧光定量PCR分析

①miRNA逆转录产物操作

用于miRNA荧光定量分析的逆转录产物一般需要先进行适当比例的稀释，一般稀释3～4倍即可，混匀后从中吸取2ul作为荧光定量PCR反应的模板，剩余的产物应置于-20℃条件下保存。

②荧光定量PCR反应体系

反应程序如下：

①95℃，3分钟

②94℃，12秒

③62℃，40～60秒，于该步测定荧光

④使温度从40℃缓慢升至90℃制作熔解曲线

⑤使温度降至室温

注：其中②、③步为反应循环，一般进行30个循环左右。如检测低表达基因循环数可适当增加。

实验中所有样品均需做至少3个复孔以保证实验数据的可靠性

4，甲基化酶活性检测

参见甲基化酶活性测定试剂盒EpiQuik DNA Methyltransferase Activity/Inhibition assay kit(Epigentek，Brooklyn，NY)说明书

5，PGE2含量检测

参见PGE2检测试剂盒Biotrak Prostaglandin E2 Enzyme Immunoassay system (R& D Systems)说明书

6，蛋白印迹(Westernblot)

(1)样品制备(以6孔板为例)

①吸去培养基，每个孔用500ul磷酸缓冲液清洗细胞，然后吸去缓冲液。

②每孔加入30ul 2x SDS细胞裂解液，于4℃裂解细胞20分钟，使全部细胞脱离细胞培养板。

③吸取细胞裂解液至1.5mlEp管中，超声破碎细胞，直至裂解液澄清透明为止。

④每个样品中加入10ul 4XSDS上样buffer，混匀。

⑤将样品转移至1.5ml EP管中，封口，沸水中煮样5分钟，然后于室温1200转/分钟离心5分钟，吸取上清至新Ep管中。

⑥跑SDS PAGE胶或-20℃保存

(2)SDS-PAGE凝胶的制备

按照下表配制备分离胶，配好后立即加入到制胶器中的两片玻璃平板中，用水封闭，半小时候将水倒掉，并用吸水纸吸干剩余水分。

(以上表中百分比均为质量比)

按照下表制备浓缩胶，加入到分离胶上并插入梳子，待上层胶完全凝固后候拔去梳子

(以上表中百分比均为质量比)

(3)上样以及电泳

①向电泳槽中加入适量Tris-甘氨酸电泳缓冲液，使缓冲液刚好没过较矮的玻璃板

②第一个孔加入5ul蛋白Marker，其他样品依次点在后面的加样孔里

③接通电源，以100伏恒定电压跑胶，直至溴芬蓝跑到上下层胶分界处，将电压改为60V，直至溴芬蓝跑到最底端为止。

(4)转膜

①将包含目的带的凝胶用小刀切下来，并准备好硝酸纤维素膜和滤纸，大小顺序为胶稍大于硝酸纤维素膜稍大于滤纸(上下各3层)

②将PAGE胶、滤纸和硝酸纤维素膜浸泡于转膜缓冲液中，至少20分钟使三者完全被缓冲液浸透。

③按三张滤纸，PAGE胶，硝酸纤维素膜，三张滤纸的顺序将“三明治”夹在转膜夹中并固定

④将转膜夹放在电泳槽中，硝酸纤维素膜需要朝向电源正极

⑤将电泳槽加满转膜缓冲液，4℃，30V转膜过夜

⑥转膜过夜后用1(质量比)丽春红染膜，看是否有目的条带。然后用清水将丽春红洗掉

(5)抗体结合

①将转好的硝酸纤维素膜浸泡在含5％(质量比)脱脂奶粉的TBST缓冲液中(含1％的TritonX100的磷酸缓冲液)，于室温下在以60转/分钟在低转速摇床上封闭1小时

②使用TBST缓冲液清洗洗硝酸纤维素膜一次

③将硝酸纤维素膜浸入含适量一抗和5％(质量比)脱脂奶粉的TBST缓冲液中，于室温下在以60转/分钟的速率在低转速摇床上孵育1小时

④用TBST缓冲液清洗硝酸纤维素膜三次，每次10分钟

⑤将硝酸纤维素膜浸入含适量二抗和5％(质量比)脱脂奶粉的TBST缓冲液中，于室温下在以60转/分钟的速率在低转速摇床上孵育1小时

⑥使用TBST缓冲液清洗硝酸纤维素膜三次，每次20分钟

(6)显色

①按1∶1比例混合显影液底物A和B

②将硝酸纤维素膜浸泡在显色底物混合液中，并轻轻摇动使显色液与膜充分均匀接触，该过程持续约10分钟

③使用Bio-rad生物成像系统，每5秒拍摄一张照片，从中选取最理想的照片进行存档。

7，Elisa(酶联免疫免疫吸附实验)法测定IFN-λ1表达

①溶液配制

样品包被液：1％(质量比)碳酸氢钠溶液

样品洗涤液：PBST溶液

12水合磷酸氢钠 3.5g

2水合磷酸二氢钠 0.25g

氯化钠 8.5g

加去离子水至1L，并调节pH值至7.4，然后加入200ulTritonX100，混匀

②将样品与包被液按1∶1比例混合后，加入Elisa板中。每孔加样品100μL，每个样品平行做3孔。以0.1％(质量比)牛血清白蛋白作为阴性对照，IFN-λ1蛋白稀释1000倍作为阳性对照。4℃条件下避光孵育过夜

③洗板。洗板方法为：吸去样品，并用洗涤液将样品孔注满，1分钟后将洗液甩去。在实验台上铺几层吸水纸，将酶标板用力在吸水纸上排几次，尽量将板内残留的液体拍净。一般重复该过程3-5次。如有自动洗板机也可进行机洗，机洗过程请参见说明书，这里不再赘述。

④向每孔中加入以磷酸缓冲液稀释的一抗(IFN-λ1抗体)，浓度为1∶1000，每孔加入60μL。37℃条件下避光孵育1小时。如背景过高则向配制好的抗体溶液中加入3％(质量比)-5％(质量比)的脱脂奶粉。

⑤洗板。向每孔中加入1∶5000以磷酸缓冲液稀释的二抗(荧光抗体)，每孔60μL，37℃条件下避光孵育半小时。洗板。

⑥向每孔中分别加入30μLTMB显色液A和显色液B，37℃条件下避光孵育15分钟。

⑦向每孔中加入20ul终止液(3M H₂SO₄)，此时孔内液体应由蓝色变为黄色。于15分钟内使用酶标仪测定样品在450nm的吸光值。

⑧结果分析：样品450nm吸光值高于阴性对照20％以上为阳性结果，将阳性结果减去阴性对照作为最终吸光值。如需做绝对定量可在实验中同时将标准品梯度稀释制作标准曲线，通过最终吸光值在标准曲线上得出该吸光值对应的样品蛋白浓度。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉大学

<120> miR29在制备抗流感病毒药物中的应用

<130>

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acaatgctga ctatggctac 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgggaggag ttcaggga 18

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccatcgagca cggcatcgtc acca 24

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctcggtgagg atcttcatga ggtagt 26

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgttggcatc cactgtgaat ga 22

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttacacacac gcaaaatact cctt 24

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cctgaggcct tcacgttcaa 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

acttgtgggt gttctcaggc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agaaggctgg ggctcatttg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aggggccatc cacagtcttc 20

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 11

uuggcuaaag ucuaccacga u 21

<210> 12

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 12

uugugacuaa aguuuaccac gau 23

<210> 13

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 13

uggcuaaagu uuaccacgau 20

Claims

1.MiR29在制备抗流感病毒药物中的应用。

2.MiR29 反义RNA在制备消炎药物中的应用。