CN103540679A - 用于检测人肝癌细胞标志物的引物和探针及其检测试剂盒 - Google Patents

用于检测人肝癌细胞标志物的引物和探针及其检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于特异性检测人肝癌细胞标志物的引物和探针，包括用于检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖cDNA的引物和探针（Seq ID No.1-3）以及用于检测甲胎蛋白cDNA的引物和探针（Seq ID No.4-6）。本发明还提供含有所述引物和探针的用于多重实时荧光定量PCR检测人肝癌细胞标志物的试剂盒。本发明采用多重实时荧光定量PCR技术，从mRNA水平上检测人肝癌细胞中甲胎蛋白信使RNA(AFP mRNA)和磷脂酰肌醇蛋白聚糖信使RNA(GPC3 mRNA)，检测方法简便、快速，灵敏度高，特异性强，整个检测反应只需花费100分钟，为人肝细胞发生癌变的特异检出提供重要技术支持。

Description

用于检测人肝癌细胞标志物的引物和探针及其检测试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体地说，涉及用于特异性检测人肝癌细胞标志物的引物和探针及其检测试剂盒。
背景技术
原发性肝癌(HCC)是世界最常见的恶性肿瘤之一，其所致死亡率在各类肿瘤中排名第三。由于肝癌的早期症状不明显，在发现时病人往往处于中晚期，加之肝癌的治愈率不高，预后评估效果不理想，因此早期发现并确定新的肝癌诊断靶点具有重要的临床价值。甲胎蛋白是原发性肝癌的血清学指标物，然而，临床发现肝癌患者中甲胎蛋白（AFP）假阳性和假阴性率偏高，凭借单一的甲胎蛋白血清学检测早期肝癌的漏诊率在50%以上。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican3，GPC3)是一类分布在细胞膜表面的蛋白聚糖，它是由glypican3基因编码，属Glypican家族成员。GPC3基因组结构全长大于900kb,是人类基因组中最大的基因之一。其5'端朝向端粒区,3'端朝向中心粒区,由8个外显子、7个内含子组成。编码的GPC3蛋白前体为580个氨基酸残基组成的蛋白,分子量大小约为66kD。GPC3在HCC组织中的表达明显增加；而且在HCC患者的血清中也可检测到GPC3。近年来的研究表明，肝癌细胞GPC3mRNA表达与血清AFP水平、肝癌中AFP mRNA水平、肿瘤分级及侵袭程度密切相关；而且在肝癌发展的早期阶段肝癌细胞GPC3mRNA的表达率显著高于血清中AFP和肝癌组织中AFP mRNA的表达率,因此GPC3被认为可作为肝细胞癌早期的敏感标记物。
然而采用传统的肝癌血清标志物检测方法，包括ELISA检测技术，由于检测的敏感性受限，而且对新标志物未建立成熟的定量标准，因而上述传统检测方法具有很大的局限性。
发明内容
本发明的目的是提供用于特异性检测人肝癌细胞标志物的引物和探针及其检测试剂盒。
本发明的另一目的是提供人早期肝癌细胞标志物的多重实时荧光定量PCR检测方法，
为了实现本发明目的，本发明的一种用于检测人肝癌细胞标志物的引物和探针，包括用于检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖cDNA的引物和探针以及用于检测甲胎蛋白cDNA的引物和探针：
其中，用于检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖cDNA的引物和探针为：
上游引物GPC3F：5’-CTGTCCCTTGAAGAACTTGTGA-3’（Seq ID No.1）
下游引物GPC3R：5’-TTGAGAATGGGCACATAACTTG-3’（Seq ID No.2）
探针GPC3Probe：5’-FAM-ACAGAATCTATGACATGGAGAACGT-TAMRA-3’（Seq ID No.3）；
用于检测甲胎蛋白cDNA的引物和探针为：
上游引物AFP F：5’-GACAGCCTCAAGTTGTTCCTC-3’（SeqID No.4）
下游引物AFP R：5’-GGCTGACATTATTATCGGACAC-3’（SeqID No.5）
探针AFP Probe：5’-HEX-TATCAGACATGAAATGACTCCAGTAA-TAMRA-3’（Seq ID No.6）。
本发明还提供含有上述引物和探针的用于多重实时荧光定量PCR检测人肝癌细胞标志物的试剂盒。
优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、二甲基亚砜等中的至少一种。
本发明还提供人早期肝癌细胞标志物的多重实时荧光定量PCR检测方法，通过多重荧光定量PCR技术从mRNA水平上检测人肝癌细胞中表达的甲胎蛋白信使RNA(AFP mRNA)和磷脂酰肌醇蛋白聚糖信使RNA(GPC3mRNA)。
具体地，其是利用上述引物和探针，或上述试剂盒对人早期肝癌细胞标志物磷脂酰肌醇蛋白和甲胎蛋白的cDNA进行多重实时荧光定量PCR检测。包括以下步骤：
1）提取样品组织（例如人体肝硬化穿刺组织、外周血）中的总RNA，反转录成cDNA；
2）以步骤1）中的cDNA为模板，利用上述引物（Seq ID No.1/2和Seq ID No.3/4）和探针（TaqMan探针，即Seq ID No.3和Seq ID No.6），进行多重实时荧光定量PCR扩增反应；
3）利用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的cDNA作为反应内参；
4）绘制扩增曲线，进行结果判定。
步骤4）中进行结果判定的标准为：以检测后的特异性S扩增曲线和阈值（Ct value，Ct值）作为结果判定标准，若无S曲线产生或Ct值≥40判定检测结果为阴性，30＜Ct值<40判定检测的样品组织为正常，Ct值<30判定检测结果为阳性。
多重实时荧光定量PCR反应体系为：1×Taq酶缓冲液、Taq DNA聚合酶2-3U、dNTPS0.5mM、Mg2+1.25-1.5mM、2%二甲基亚砜、引物各0.25-0.5μmol、探针各0.2-0.4μmol和模板1-5μl。
多重实时荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性20sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，共5个循环；95℃变性20sec，50℃退火30sec，72℃延伸30sec，共40个循环。
本发明根据GenBank上公布的编码磷脂酰肌醇蛋白聚糖和甲胎蛋白的核苷酸序列(Accession No.:AAB58754;AAH35972)，设计出特异性引物和探针，并进行不同荧光素标记。最后经过反复试验，优化出多荧光定量PCR反应体系和反应参数，建立一管多检的荧光定量PCR检测方法。
本发明通过建立三重荧光定量PCR反应体系，可采用以下具体实施方案：
1、采用TRIzol Reagent试剂盒进行样品处理和总RNA抽提。
2、采用
Figure BDA0000410099860000041
逆转录试剂盒对总RNA进行反转录，合成第一条cDNA链。
3、加样步骤，优选采用如下方案：取PCR反应混合液18μl加入PCR反应管中，然后分别加入DNA抽提液2μl。另外，设定的阳性对照孔内加入阳性对照cDNA液2μl，阴性对照孔内则加阴性对照cDNA液或ddH202μl。轻微离心，使样品混匀并落入管底，即可准备进行多重实时荧光定量PCR反应。
4、反应程序设置，优选采用如下方案：在多通道检测模式下，分别用不同颜色标记FAM、HEX、ROX三个荧光通道，并将待测样品放入对应的位置。设置反应程序如下：95℃预变性3min；95℃变性20sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，从变性到退火重复5个循环；再将退火温度设置为50℃，重复变性、退火、延伸步骤40个反应。将读荧光信号步骤设置在最后的延伸步骤中。
与现有技术相比，本发明的优点在于：实现了同时检测两种肝癌标志物的RNA表达水平（AFP mRNA和GPC3mRNA），检测方法简便、快速，灵敏度高，特异性强，整个检测反应只需花费100分钟，为人肝细胞发生癌变的特异检出提供重要技术支持。
附图说明
图1为本发明实施例2中检测阳性和阴性样品的HepG2人肝癌细胞系中GPC3及AFP基因的扩增曲线图。
图2为本发明实施例2中检测阳性和阴性样品的Huh7.5人肝癌细胞系中GPC3及AFP基因的扩增曲线图。
图3为本发明实施例2中检测阳性和阴性样品的Huh7人肝癌细胞系中GPC3及AFP基因的扩增曲线图。
图4为本发明实施例2中检测阳性和阴性样品的Huh28人肝癌细胞系中GPC3及AFP基因的扩增曲线图。
图5为本发明实施例2中检测阳性和阴性样品的L02人正常肝细胞系中GPC3及AFP基因的扩增曲线图。
图6为本发明实施例3中检测人肝脏石蜡包埋组织中GPC3及AFP基因的扩增曲线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1人早期肝癌细胞标志物的多重实时荧光定量PCR检测方法的建立
根据GenBank上公布的编码磷脂酰肌醇蛋白聚糖和甲胎蛋白的核苷酸序列(Accession No.:AAB58754;AAH35972)，设计出用于多重实时荧光定量PCR检测的特异性引物和探针，并进行不同荧光素标记。特异性引物和TaqMan探针序列如表1所示：
表1特异性引物和TaqMan探针
Figure BDA0000410099860000051
基于多重实时荧光定量PCR技术检测人类肝癌细胞的方法：
1、检测的对象为由编码肝癌细胞标志物蛋白（磷脂酰肌醇蛋白聚糖和甲胎蛋白）的mRNA反转录形成的cDNA：采用TRIzol Reagent试剂盒进行样品处理和总RNA抽提。采用
Figure BDA0000410099860000062
逆转录试剂盒对总RNA进行反转录，合成第一条cDNA链。
2、利用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的cDNA作为反应内参；
3、利用特异性引物和TaqMan探针进行多重荧光实时定量PCR检测；
4、根据检测后的特异性S扩增曲线和阈值（Ct value）进行结果判断。
步骤3中反应体系为：1×Taq酶缓冲液、Taq DNA聚合酶3U、dNTPS0.5mM、Mg2+1.5mM、2%二甲基亚砜、引物各0.5μmol、探针各0.4μmol和模板2μl。
其中加样步骤采用的方案为：取PCR反应混合液18μl加入PCR反应管中，然后分别加入DNA抽提液2μl。另外，设定的阳性对照孔内加入阳性对照cDNA液2μl，阴性对照孔内则加阴性对照cDNA液或ddH202μl。轻微离心，使样品混匀并落入管底，即可准备进行多重实时荧光定量PCR反应。
反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性20sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，共5个循环；95℃变性20sec，50℃退火30sec，72℃延伸30sec，共40个循环。将读荧光信号步骤设置在最后的延伸步骤中。
步骤4中进行结果判定的标准为：以检测后的特异性S扩增曲线和阈值（Ct value，Ct值）作为结果判定标准，若无S曲线产生或Ct值≥40判定检测结果为阴性，30＜Ct值<40判定检测的样品组织为正常，Ct值<30判定检测结果为阳性。
实施例2细胞系Hep G2、Huh7.5、Huh7、Huh28和L02的检测
1、五种细胞采用TRIzol Reagent试剂盒进行RNA抽提。
2、采用
Figure BDA0000410099860000071
逆转录试剂盒，分别对五种RNA进行反转录。
3、取18μl的PCR反应混合液加入PCR反应管中，然后分别加入2μlcDNA液。设定的阳性对照孔内加入阳性对照cDNA液2μl，阴性对照孔内则加阴性对照cDNA液或2μl ddH2O。
4、轻微离心，使样品混匀并落入管底，即可准备进行多重荧光定量PCR反应。按照程序设置后，将PCR反应管中放入荧光定量PCR仪中进行检测。
5、分析特异性S曲线与待测样品的Ct值，进行结果判定。
PCR反应混合液包括：1×Taq酶缓冲液、Taq DNA聚合酶3U、dNTPS0.5mM、Mg2+1.5mM、2%二甲基亚砜、引物各0.5μmol、探针各0.4μmol和模板2μl。
设置反应程序如下：95℃预变性3min；95℃变性20sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，从变性到退火重复5个循环；再将退火温度设置为50℃，重复变性、退火、延伸步骤40个反应。将读荧光信号步骤设置在最后的延伸步骤中。
在多通道检测模式下，分别用不同颜色标记FAM,HEX,ROX三个荧光通道，并将待测样品放入对应的位置结果判断方法，优选采用如下方案：以检测后的特异性S扩增曲线和阈值（Ct value）作为结果判断标准，对于无S曲线产生Ct值≥40认为检测结果为阴性，30＜Ct值<40认为检测的细胞为正常细胞，Ct值<30认为肝细胞已发生癌变。
如图1所示，被测样品HepG2人肝癌细胞系中GPC3及AFP基因的扩增曲线呈现特异性的S型，且Ct值小于30，表明该细胞系为可能发生癌变的细胞系。
如图2所示，被测样品Huh7.5人肝癌细胞系中GPC3及AFP基因的扩增曲线呈现特异性的S型，且Ct值小于30，表明该细胞系为可能发生癌变的细胞系。
如图3所示，被测样品Huh7人肝癌细胞系中GPC3及AFP基因的扩增曲线呈现特异性的S型，且Ct值小于30，表明该细胞系为可能发生癌变的细胞系。
如图4所示，被测样品Huh28人肝癌细胞系中GPC3及AFP基因的扩增曲线呈现特异性的S型，且Ct值小于30，表明该细胞系为可能发生癌变的细胞系。
如图5所示，被测样品L02人正常肝细胞系中GPC3及AFP基因的扩增曲线呈现特异性的S型，且Ct值大于30，表明该细胞系为正常的细胞系。
实施例3人肝石蜡包埋组织的检测
1、人肝石蜡包埋组织处理后采用RNeasy FFPE试剂盒进行RNA抽提。
2、采用
Figure BDA0000410099860000082
逆转录试剂盒对RNA进行反转录。
3、取18μl的PCR反应混合液加入PCR反应管中，然后分别加入2μlcDNA液。设定的阳性对照孔内加入阳性对照cDNA液2μl，阴性对照孔内则加阴性对照cDNA液或ddH2O2μl。
4、轻微离心，使样品混匀并落入管底，即可准备进行多重荧光定量PCR反应。按照程序设置后，将PCR反应管中放入荧光定量PCR仪中进行检测。
5、分析特异性S曲线与待测样品的Ct值，进行结果判定。
人肝石蜡包埋组织的处理方法：
1）取2-3片厚度为3-4微米石蜡组织切片，置于RNase-Free1.5ml离心管中，加入1ml二甲苯，置于涡旋震荡器上充分震荡。震荡完毕在室温静置5min。
2）在室温下将离心管于14000rad/min离心2min，吸去上清。加入500μl二甲苯，置于涡旋震荡器上充分震荡2-3min，震荡完毕在室温静置5min。加入500μl无水乙醇，置于涡旋震荡器上充分震荡2-3min，震荡完毕在室温静置5min。
3）在室温下将离心管于14000rad/min离心2min，吸去上清。加入1ml无水乙醇，置于涡旋震荡器上充分震荡2-3分钟，在室温下将离心管于14000rad/min离心2min，吸去上清，于37℃金属浴上静置5-10min，使沉淀基本干燥无乙醇味。加入Buffer PKD180μl。
PCR反应混合液包括：1×Taq酶缓冲液、Taq DNA聚合酶2U、dNTPS0.5mM、Mg2+1.25mM、2%二甲基亚砜、引物各0.25μmol、探针各0.2μmol和模板2μl。
设置反应程序如下：95℃预变性3min；95℃变性20sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，从变性到退火重复5个循环；再将退火温度设置为50℃，重复变性、退火、延伸步骤40个反应。将读荧光信号步骤设置在最后的延伸步骤中。
在多通道检测模式下，分别用不同颜色标记FAM、HEX、ROX三个荧光通道，并将待测样品放入对应的位置结果判断方法，优选采用如下方案：以检测后的特异性S扩增曲线和阈值（Ct value）作为结果判断标准，对于无S曲线产生Ct值≥40认为检测结果为阴性，30＜Ct值<40认为检测的肝组织没有发生癌变，Ct值<30认为肝组织已发生癌变。
如图6所示，被测人肝脏石蜡样品中GPC3及AFP基因的扩增曲线呈现特异性的S型，且Ct值小于30，表明该样品中组织已发生癌变。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Figure IDA0000410099940000011
Figure IDA0000410099940000021

Claims (8)

1.用于检测人肝癌细胞标志物的引物和探针，其特征在于，包括用于检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖cDNA的引物和探针以及用于检测甲胎蛋白cDNA的引物和探针：
用于检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖cDNA的引物和探针为：
上游引物GPC3F：5’-CTGTCCCTTGAAGAACTTGTGA-3’
下游引物GPC3R：5’-TTGAGAATGGGCACATAACTTG-3’
探针GPC3Probe：5’-FAM-ACAGAATCTATGACATGGAGAACGT-TAMRA-3’；
用于检测甲胎蛋白cDNA的引物和探针为：
上游引物AFP F：5’-GACAGCCTCAAGTTGTTCCTC-3’
下游引物AFP R：5’-GGCTGACATTATTATCGGACAC-3’
探针AFP Probe：5’-HEX-TATCAGACATGAAATGACTCCAGTAA-TAMRA-3’。
2.含有权利要求1所述引物和探针的用于多重实时荧光定量PCR检测人肝癌细胞标志物的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、二甲基亚砜中的至少一种。
4.人早期肝癌细胞标志物的多重实时荧光定量PCR检测方法，其是利用权利要求1所述引物和探针，或权利要求2或3所述试剂盒对人早期肝癌细胞标志物磷脂酰肌醇蛋白和甲胎蛋白的cDNA进行多重实时荧光定量PCR检测。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）提取样品组织中的总RNA，反转录成cDNA；
2）以步骤1）中的cDNA为模板，利用权利要求1所述引物和探针，进行多重实时荧光定量PCR扩增反应；
3）利用甘油醛-3-磷酸脱氢酶的cDNA作为反应内参；
4）绘制扩增曲线，进行结果判定。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤4）中进行结果判定的标准为：以检测后的特异性S扩增曲线和阈值，即Ct值作为结果判定标准，若无S曲线产生或Ct值≥40判定检测结果为阴性，30＜Ct值<40判定检测的样品组织为正常，Ct值<30判定检测结果为阳性。
7.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，多重实时荧光定量PCR反应体系为：1×Taq酶缓冲液、Taq DNA聚合酶2-3U、dNTPS0.5mM、Mg2+1.25-1.5mM、2%二甲基亚砜、引物各0.25-0.5μmol、探针各0.2-0.4μmol和模板1-5μl。
8.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，多重实时荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性20sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，共5个循环；95℃变性20sec，50℃退火30sec，72℃延伸30sec，共40个循环。
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