CN105296650B

CN105296650B - 一种检测rs9263726等位基因的探针和引物组合物

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Publication number: CN105296650B
Application number: CN201510837379.6A
Authority: CN
Inventors: 关蕾; 郑磊; 赖维; 胡熔
Original assignee: Guangzhou Laide Pu Detection Technology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Laide Pu Detection Technology Co Ltd
Priority date: 2015-11-25
Filing date: 2015-11-25
Publication date: 2018-11-13
Anticipated expiration: 2035-11-25
Also published as: CN105296650A

Abstract

本发明的一种rs9263726等位基因检测方法，实现了仅用1条探针进行1次扩增就可区分rs9263726等位基因型的目的；同时，本发明在PCR完成后再加入饱和荧光染料SYTO 9，放大了扩增信号、减少了荧光对PCR的抑制作用；本发明根据大样本测序发现的rs9263726周围干扰位点分布情况，设计引物，有效地避开了干扰位点；本发明设计的unlabeled probe探针，既能涵盖rs9263726，也能有效避开周围的干扰位点，并且确保自身不易形成发卡等二级结构，同时探针3’端作磷酸化封闭防止其延伸。实现了rs9263726等位基因检测方法快速、简便、廉价、不受临近SNP位点干扰并且具有高特异性。

Description

一种检测rs9263726等位基因的探针和引物组合物

技术领域

本发明属于生物技术和基因诊断领域，具体涉及一种检测rs9263726等位基因的方法。

背景技术

当多种原因引起血液中尿酸浓度升高、细胞外液的尿酸盐呈现超饱和时，就会发生高尿酸血症，若尿酸盐在机体组织中沉积造成进一步损害，则转变为痛风，表现为患者关节活动受限、热、痛、肿，伴有关节畸形、结节性痛风结石甚至肾脏病变，给痛风患者带来极大痛苦(Smith et al.,2011)。高尿酸血症和原发性痛风的发病率呈逐年上升趋势。据统计，我国的高尿酸血症患者人数已达1.2亿，其中痛风患者超过7500万人，并且正以每年9.7％的年增长率迅速增加，呈现出年轻化趋势，痛风已经成为我国仅次于糖尿病的第二大代谢类疾病(张心菊等, 2014)。痛风的治疗原则除了严格的低嘌呤饮食、戒酒之外，消炎止痛药和控制尿酸药物的使用也是必不可少的。

在痛风发病间期和慢性期，通常使用降尿酸药物治疗。2012年11月，美国风湿病学会(American College of Rheumatology，ACR)发布了最新的痛风指南(Khanna D et al.,2012)，其中“降尿酸药物治疗建议”中推荐将别嘌醇 (Allopurinol)或非布索坦(Febuxostat)作为一线降尿酸用药。鉴于非布索坦是2009年上市的新药，虽然疗效显著，但其长期服用的安全性以及对4期及以上程度的慢性肾脏疾病患者的安全性尚未得到证实。而自上世纪六十年代起就推向临床的别嘌醇价格低廉、疗效明确，因此具有更好的应用前景。

别嘌醇是一种黄嘌呤氧化酶抑制剂，通过抑制该酶的活性，减少次黄嘌呤和黄嘌呤合成尿酸，从而减少尿酸的生成，使血和尿中的尿酸含量减低到溶解度以下水平，防止尿酸形成结晶沉积在其他组织内，被广泛用于痛风、高尿酸血症的治疗中，还可预防白血病、淋巴瘤或其他肿瘤在化疗或放疗后继发组织内尿酸盐沉积、肾结石，尤其适用于尿酸生成过多、对排尿酸药过敏或无效，以及不宜使用排尿酸药物(如有肾功能不全)的患者(Hamburger M et al.,2011)。但2％-5％患者服用别嘌醇后会发生皮肤反应(Hoskison TK et al.,2006)，虽然只有少于 1％患者(Pluim H J et al.,1998；Kim S C et al.,2013)会转变为包括 Stevens-Johnson综合征(Stevens-Johnson syndrome，SJS)、中毒性表皮坏死松解症(toxic epidermal necrolysis，TEN)和剥脱性皮炎在内的重症药疹，但是死亡率极高，其中SJS死亡率约5％，TEN死亡率约30-50％(Gerull R et al., 2011)。SJS表现为严重的多形性红斑，可累及皮肤与粘膜，包括口、鼻、眼、阴道、尿道、胃肠道和下呼吸道粘膜，患者有失明之虞，可进一步发展形成TEN，全身黏膜溃烂，在红斑上发生松弛性大泡或表皮剥离，若遇轻度触碰或牵拉可导致表皮大面积剥离(Aubock&Fritsch,1982；Arellano&Sacristan,1993)。因此，目前别嘌醇在临床上的使用面临极大的医疗风险。

美国风湿病学会最新发布的2012痛风指南(Khanna D et al.,2012)中建议在HLA-B*5801分布频率较高且与重症药疹关系密切的国家(如中国和韩国)，服用别嘌醇前需进行HLA-B*5801等位基因检测，以作为别嘌醇诱发重症药疹的筛查指标，判断该患者是否是别嘌呤醇所致重症药疹的高危人群。此项检测的推出可以有效降低由别嘌醇引起的严重不良反应，让痛风患者放心服用别嘌醇。但鉴于HLA-B多态性位点的复杂性，HLA-B*5801检测方法操作繁琐、干扰因素多，且可能由于罕见或未知HLA等位基因的干扰导致结果模棱两可难以判读。

2012年，日本学者Maekawa等人(Maekawa K et al.,2012)发现， PSORS1C1基因上的rs9263726等位基因(G>A)与HLA-B*5801呈现完全连锁(r²＝1，D’＝1)，即rs9263726基因型为GA或AA型的人群，必定为HLA-B*5801 等位基因携带者，反之亦然。这个发现意味着可以使用rs9263726等位基因的基因型，替代HLA-B*5801成为别嘌醇诱发重症药疹的预测指标，进行别嘌醇的个体化用药指导。

目前，筛查已知SNP常用检测方法有TaqMan探针法、测序、基因芯片、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)等多种技术。但各有缺点，如TaqMan探针法易受到待测位点周围临近的SNP位点的干扰，且价格昂贵；基因芯片不适宜小样本、少数SNP位点的检测；测序虽然是核苷酸检测的金标准，但成本较高，周期长，不适合向临床推广；而RFLP仅能检测有酶切位点的SNP，无酶切位点不能检测，且要用到电泳方法，灵敏度有限，对环境有污染。

因此，迫切需要建立一种操作简便、不受其他位点干扰的rs9263726检测方法。

发明内容

本发明的目的是建立一种快速、廉价、简便、高特异性、不受临近SNP位点干扰的rs9263726等位基因检测方法。

本发明提供的rs9263726等位基因检测方法，首先通过Sanger测序方法对大样本中国健康人群的rs9263726等位基因上游200bp与下游200bp序列进行测序，构建该位点该区域内的多态性位点分布数据库。测序发现位于PSORS1C1基因的rs9263726位点(NG_021348.1:g.28892G>A)，其附近位置密布SNP和发生频率较高的突变或缺失，包括已经被报道的2种SNP位点rs3132557 (NG_021348.1:g.28802T>C)和rs9501057(NG_021348.1:g.28909C>T)，以及尚未报道的NG_021348.1:g.28852C>A、NG_021348.1:g.28999A>G、 NG_021348.1:g.29036G>A、NG_021348.1:g.28900del C和NG_021348.1:g.28900 ins C共5种点突变和插入缺失突变。其中，最近的突变点距离待测位点rs9263726 仅间隔7个碱基，且自待测点后第二个碱基起存在连续7个胞嘧啶(C)。这些特殊情况导致采用普通Taqman探针检测rs9263726时，探针容易错配，从而干扰正常检测。并且若要达到区分rs9263726等位基因型是GG、GA还是AA型的目的，必须设计2条Taqman探针才能实现，增加了检测量和检测成本。本发明根据rs9263726周围干扰位点分布特点，以HRM法为基础，采用unlabeled probe探针，对待测位点进行精确区分，可做到既能准确辨别rs9263726的GG、GA和 AA基因型，又能同时显示邻近干扰位点突变情况，并且整个反应仅使用了1条探针进行1次扩增即可完成，方便、快捷，准确度高。

具体地，为了实现本发明的上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种检测rs9263726等位基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，从全血中抽提DNA；

步骤二，以步骤一提取的DNA为样本DNA进行不对称PCR扩增；

步骤三，扩增结束后，加入荧光染料SYTO 9，在高分辨率PCR仪上检测熔解温度，分析温度上升时样本荧光信号的变化；

步骤四，对待测样本rs9263726的基因型进行分析；

其中，所述步骤二中PCR扩增中的探针为：

5’-CTCCGAGGAAACTCATCCCCCC-PHO-3’

引物为：

上游引物：5’-ACCCCAGCTTTACAAGGACCC-3’

下游引物：5’-GCTCCATGTGGCAAAGTCGGTCA-3’。

为了优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：

上述步骤二中PCR扩增反应体系优选为：10μl Premix Taq HS，2μΜ上游引物0.5μl，10μΜ下游引物R 0.5μl，探针0.5μl(10μΜ)，25ng样本DNA，以及将体系总体积加至20μl的水。

上述步骤二中PCR扩增反应条件为：95℃预变性2min，95℃30s，55℃30 s，72℃30s，50个循环。

上述步骤三中的检测熔解温度的反应条件和操作优选为：95℃1min，40℃ 1min预处理后，熔解温度从55℃升至90℃，每升高0.5℃采集一次数据，获得高分辨率熔解曲线图。

上述探针在3’端作磷酸化封闭。

本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明在PCR完成后再加入饱和荧光染料SYTO 9，放大扩增信号、减少荧光对PCR的抑制作用；本发明的方法根据大样本测序发现的rs9263726周围干扰位点分布情况，设计引物，以有效地避开干扰位点；本发明设计的unlabeled probe探针，既能涵盖rs9263726，也能有效避开周围的干扰位点，并且确保自身不易形成发卡等二级结构，同时探针3’端作磷酸化封闭，防止其延伸；本发明的上述特定技术方案使得本发明的rs9263726等位基因检测方法快速、简便、廉价、不受临近SNP位点干扰并且具有高特异性。

附图说明

图1：大样本测序获得的PSORS1C1基因(NG_021348.1)rs9263726位点上游200bp至下游200bp序列范围内的常见突变位点分布情况；每一个独立的色块表示一个突变位点，斜线标记的色块为本发明所关注的rs9263726位点。

图2：rs9263726位点的荧光负导数图(-dF/dT)。低于72℃的是探针/产物的熔解峰，高于78℃的是产物/产物的熔解峰。探针/产物的熔解峰中，左侧熔解温度较低(约为61℃)的熔解峰代表GG基因型；右侧熔解温度较高(约为 67℃)的熔解峰代表AA基因型；若为GA基因型，则同时具有这2种熔解峰的特征。黑色曲线代表GG基因型，灰色曲线代表AA基因型，虚线代表GA基因型。

具体实施方式

本发明提供了一种检测rs9263726等位基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，从全血中抽提DNA；

步骤二，以步骤一提取的DNA为样本DNA进行不对称PCR扩增；

步骤四，对待测样本rs9263726的基因型进行分析；

其中，所述步骤二中PCR扩增中的探针为：

5’-CTCCGAGGAAACTCATCCCCCC-PHO-3’

引物为：

上游引物：5’-ACCCCAGCTTTACAAGGACCC-3’

下游引物：5’-GCTCCATGTGGCAAAGTCGGTCA-3’。

下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例1

1.DNA提取：

使用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的真空采血管采集静脉血2ml，使用QIAamp DNAExtract Kit(德国Qiagen公司)试剂盒提取DNA。

2.引物设计：

根据本发明前期大样本测序发现的rs9263726周围干扰位点分布情况，确定引物的大概范围，使用Primer Premier 5软件，设计合适的引物。

上游引物F：5’-ACCCCAGCTTTACAAGGACCC-3’，

下游引物R：5’-GCTCCATGTGGCAAAGTCGGTCA-3’。

引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

3.探针设计：

使用Primer Premier 5软件，设计unlabeled probe探针，既能涵盖rs9263726，也能有效避开周围的干扰位点，并且确保自身不易形成发卡等二级结构。

探针：5’-CTCCGAGGAAACTCATCCCCCC-PHO-3’。

探针由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，3’端作磷酸化封闭，防止探针延伸。

4.样本检测：

使用Premix Taq HS试剂盒(TaKaRa，Japan)扩增，反应体系包括：10μl PremixTaq HS，上游引物F 0.5μl(2μΜ)，下游引物R 0.5μl(10μΜ)，探针0.5μl (10μΜ)。加入25ng样本DNA，加水至总体积20μl。使用ABI 9700基因扩增仪(AB公司，美国)扩增，PCR扩增条件：95℃预变性2min，95℃30s、55℃30 s、72℃30s，50个循环。加入0.6μl荧光染料SYTO9，将样本管转移到高分辨率PCR仪Rotor Gene Q(凯杰公司，德国)，进行高分辨率熔解分析。反应条件为： 95℃1min，40℃1min预处理后，熔解温度从55℃升至90℃，每升高0.5℃采集一次数据，获得高分辨率熔解曲线图。

5.rs9263726基因型分析：

在荧光的负导数图(-dF/dT)中，低于72℃的是熔解温度较低的探针/产物的熔解峰。若模板DNA的rs9263726位点碱基为腺嘌呤(A)，则扩增出的单链产物与探针完全匹配，熔解温度较高，熔解峰偏右(熔解温度约为67℃)；若模板 DNA的该位点碱基为鸟嘌呤(G)，则单链无法与探针完全匹配，熔解温度较低，熔解峰偏左(熔解温度约为61℃)；若模板DNA为杂合子AG，则其熔解曲线会同时具有上述2种熔解峰的特征(附图2)。

高于78℃的是熔解温度较高的产物/产物的熔解峰。当引物覆盖范围内出现除rs9263726外其他位点的改变时，可通过产物/产物的熔解曲线反应出来，可对周围干扰位点的突变情况提供初步判断(附图2)。

由上述实施例可知，本发明实现了仅用1条探针进行1次扩增就可区分 rs9263726等位基因型的目的；同时，本发明在PCR完成后再加入饱和荧光染料SYTO 9，放大了扩增信号、减少了荧光对PCR的抑制作用；本发明的方法根据大样本测序发现的rs9263726周围干扰位点分布情况，设计引物，有效地避开了干扰位点；本发明设计的unlabeled probe探针，既能涵盖rs9263726，也能有效避开周围的干扰位点，并且确保自身不易形成发卡等二级结构，同时探针 3’端作磷酸化封闭，能够防止其延伸。综上所述，本发明的rs9263726等位基因检测方法快速、简便、廉价、不受临近SNP位点干扰并且具有高特异性。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

<110> 广州莱德璞检测技术有限公司

<120> 一种检测rs9263726等位基因的方法

<160> 3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 1

ctccgaggaa actcatcccc cc 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR扩增引物

<400> 2

accccagctt tacaaggacc c 21

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR扩增引物

<400> 3

gctccatgtg gcaaagtcgg tca 23

Claims

1.一种用于检测rs9263726等位基因的探针和引物组合物，其特征在于，

所述探针为：

5’-CTCCGAGGAAACTCATCCCCCC-PHO-3’

所述引物为：

上游引物：5’-ACCCCAGCTTTACAAGGACCC-3’

下游引物：5’-GCTCCATGTGGCAAAGTCGGTCA-3’。

2.根据权利要求1所述的探针和引物组合物，其特征在于，所述探针在3’端作磷酸化封闭。

3.一种根据权利要求1所述的探针和引物组合物，其特征在于，所述探针和引物组合物通过下述步骤以非诊断和非治疗为目的的检测rs9263726等位基因：

步骤一，从全血中抽提DNA；

步骤二，以步骤一提取的DNA为样本DNA进行不对称PCR扩增；

步骤四，对待测样本rs9263726的基因型进行分析；

其中，所述步骤二中PCR扩增中的探针为：

5’-CTCCGAGGAAACTCATCCCCCC-PHO-3’

引物为：

上游引物：5’-ACCCCAGCTTTACAAGGACCC-3’

下游引物：5’-GCTCCATGTGGCAAAGTCGGTCA-3’。

4.根据权利要求3所述的探针和引物组合物，其特征在于，所述步骤二中PCR扩增反应体系包括：10μl Premix Taq HS，2μΜ上游引物0.5μl，10μΜ下游引物0.5μl，10μΜ的探针0.5μl，25ng样本DNA，以及将体系总体积加至20μl的水。

5.根据权利要求3所述的探针和引物组合物，其特征在于，所述步骤二中PCR扩增反应条件为：95℃预变性2min，95℃30s，55℃30s，72℃30s，50个循环。

6.根据权利要求3所述的探针和引物组合物，其特征在于，所述步骤三中的检测熔解温度的反应条件和操作为：95℃1min，40℃1min预处理后，熔解温度从55℃升至90℃，每升高0.5℃采集一次数据，获得高分辨率熔解曲线图。