CN106987638A

CN106987638A - 用于检测与结直肠癌相关的血浆多基因甲基化程度的引物、探针、试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN106987638A
Application number: CN201710285809.7A
Authority: CN
Inventors: 何�轩; 刘宏飞; 曾建新
Original assignee: Zhejiang Weishi Medical Inspection Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Weishi Medical Inspection Co Ltd
Priority date: 2017-04-27
Filing date: 2017-04-27
Publication date: 2017-07-28

Abstract

一种用于检测与结直肠癌相关的血浆多基因甲基化程度的引物及探针，相关的基因包括septin9、HPP1、SFRP1及SFRP2；还涉及包含引物及探针的试剂盒，以及该试剂盒在结直肠癌检测中的应用。将septin9、HPP1、SFRP1、SFRP2四个靶基因结合在一起进行结直肠癌辅助诊断，通过将分别用于检测septin9、HPP1、SFRP1、SFRP2基因片段甲基化的核酸序列联合使用，使得对结直肠癌的灵敏度和特异性得到显著提高，并且通过荧光定量PCR分析血浆中游离DNA的方法，能方便地实现对septin9、HPP1、SFRP1、SFRP2这四个基因标志物的同时间的四通道检测，并能根据荧光定量PCR的荧光数值来判断样本的甲基化频率，提供了一种无创、快速、准确性高及检出率高的癌症定量检测方法。

Description

用于检测与结直肠癌相关的血浆多基因甲基化程度的引物、探针、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术和医学领域，尤其涉及一种用于检测与结直肠癌相关的血浆多基因甲基化程度的引物、探针、试剂盒及检测方法。

背景技术

肿瘤是目前医学上最难攻克的病种之一，根据《2015年中国癌症统计数据》显示，2015年我国新发病例429万，死亡人数281万。结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是一种常见的消化道恶性肿瘤，在胃肠道肿瘤中列第二位，约占所有肿瘤患者的十分之一，据《2013年第九届上海国际大肠癌高峰论坛》数据显示，2000～2012年中国大肠癌发病率与死亡率增长一倍以上，分别达到28.44/10万和14.23/10万。

导致结直肠癌的高死亡率主要原因如下：(1)缺乏兼具覆盖性好、准确性高、即时性强的早期筛查手段，往往诊断发现时已达晚期，使得治疗难度大、效果差、费用高。(2)部分患者治疗好转出院后，由于没有及时性强的复发监测手段，使得病情再次恶化，难以控制。(3)由于癌细胞的高度动态变化性质，同一种治疗方案在不同的人、不同的时间点以及不同的病灶等情况下，治疗效果都不一样，而目前对疗效的评估手段的及时性不够，往往延误治疗方案的调整，错失最佳治疗时机。

当前结直肠癌检测的手段主要有的主要肠镜检查、粪便隐血筛查、蛋白类肿瘤标志物等，现有的各种检测手段的局限性如下：

(1)肠镜检查：此检查缺陷较多，如检查前禁食禁药、需要做肠道清理准备、有肠道创伤风险、有肠道感染风险、有疼痛麻醉风险、需要预约等待、患者羞愧恐惧等心理负担较重，因此对高风险人群的覆盖度不到10％。

(2)粪便隐血筛查：即粪便中血红蛋白检查，在多项大规模结直肠癌相关性临床试验中证明，此方法对结直肠癌的特异性不到15％，且不同方法学的检测结果一致性较差。

(3)蛋白类肿瘤标志物：此类标志物分泌来源除了肿瘤细胞外还有其他细胞，易受身体内环境影响，稳定性较差，且半衰期长达4个月，在多项相关性试验中证明准确性低于40％。

(4)其他影像学检查手段：当肿瘤发展能用影像学方法分辨时，肿瘤细胞已发生百亿数量级别的变化，因此即时性不强，通常在发现时已到Ⅲ期以上，往往延误最佳的干预时机，使病情得不到有效控制。

近年来，基因检测技术在癌症检测中广泛应用，SEPT9基因启动子甲基化与结直肠癌的发生和发展密切相关，它是结直肠癌特异的分子标记，是目前结直肠癌相关性最强的基因标志物，如专利号为ZL201410452285.2(授权公告号为CN104164516B)的中国发明专利公开了一种基于人结直肠癌特异性甲基化检测的引物及试剂盒、如申请号为201610948298.8(公开号为CN106244724A)的中国发明专利公开了一种检测septin9基因甲基化的引物及试剂盒等专利公开的内容。在多项临床研究中证明利用septin9基因检测结直肠癌的灵敏度达74％，特异性为97％，但检出率仍有不足，且只能做定性检测，无法对两份阳性结果进行定量比较。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是针对现有技术而提供一种检测结果准确性高、检出率高的用于检测与结直肠癌相关的血浆多基因甲基化程度的引物及探针。

本发明所要解决的第二个技术问题是针对现有技术而提供一种包含上述引物及探针的检测结果准确性高、检出率高的用于检测与结直肠癌相关的血浆多基因甲基化程度的试剂盒。

本发明所要解决的第三个技术问题是针对现有技术而提供一种上述试剂盒在结直肠癌检测中的应用。

本发明解决第一个技术问题所采用的技术方案为：一种用于检测与结直肠癌相关的血浆多基因甲基化程度的引物及探针，其特征在于，包括以下四组引物和探针：

(1)用于检测septin9基因甲基化程度的特异引物及探针：特异引物如SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.7所示，探针如SEQ ID NO.6所示；

(2)用于检测HPP1基因甲基化程度的特异引物及探针：特异引物如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示，探针如SEQ ID NO.9所示；

(3)用于检测SFRP1基因甲基化程度的特异引物及探针：特异引物如SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.13所示，探针如SEQ ID NO.12所示；

(4)用于检测SFRP2基因甲基化程度的特异引物及探针：特异引物如SEQ IDNO.14和SEQ ID NO.16所示，探针如SEQ ID NO.15所示。

本发明中所采用的上述引物和探针需满足以下要求：(1)可扩增人造的甲基化的所述靶区域，而不能扩增人造的非甲基化的所述靶区域；(2)在以正常的人白细胞提取的DNA为模板时显示没有扩增，但在以结直肠癌病人的血浆提取的DNA为模板时显著扩增；(3)在以正常人的血浆提取的DNA为模板时显示没有扩增，但在从结直肠癌病人的血浆提取的DNA为模板时显著扩增。

本发明所要解决第二个技术问题所采用的技术方案为：一种用于检测与结直肠癌相关的血浆多基因甲基化程度的试剂盒，其特征在于，包括如上所述的特异引物和探针。

进一步，上述试剂盒还包括用于检测内对照ATCB基因的特异引物及探针：特异引物如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.19所示，探针如SEQ ID NO.18所示。

再进一步，上述试剂盒还包括Taq聚合酶、dNTP、PCR Buffer、亚硫酸氢盐试剂及变性剂或清除剂。

作为优选，所述变性剂为正烷基二醇，所述清除剂为色原烷衍生物。

进一步，所述变性剂为二乙二醇二甲基醚，所述清除剂为6-羟基-2,5,7,8-四甲基色原烷2-羟酸或三羟基苯甲酸中的一种。

本发明解决第三个技术问题所采用的技术方案为：一种如上所述的试剂盒在结直肠癌检测中的应用。

作为优选，如上所述的试剂盒在结直肠癌检测中的应用，包括以下步骤：

(1)准备一定数量的人源结直肠癌样本和正常样本；

(2)从步骤(1)的样本中提取基因组DNA，并进行预处理使所述基因组DNA的5’端未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交上不同于胞嘧啶的另一种碱基；

(3)以上述步骤(2)处理过的基因组DNA为模板，利用如上所述的引物与探针组合进行PCR扩增；

(4)基于上述结直肠癌样本和正常样本的septin9、HPP1、SFRP1、SFRP2的平均Ct值所制作的ROC曲线，确定相对于septin9、HPP1、SFRP1、SFRP2的结直肠癌和正常的临界Ct值。

作为优选，所述人源样本选自细胞系、组织切片、活检组织、石蜡包埋组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、由血液中分离的细胞中的一种或多种。

作为优选，所述步骤(2)中的预处理是通过亚硫酸氢盐试剂和变性剂/清除剂进行联用实现。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明创造性地将septin9、HPP1、SFRP1、SFRP2四个靶基因结合在一起进行结直肠癌辅助诊断，通过将分别用于检测septin9、HPP1、SFRP1、SFRP2基因片段甲基化的核酸序列联合使用，使得对结直肠癌的灵敏度和特异性得到显著提高。上述4种靶基因在单独作为辅助诊断依据时，septin9灵敏度为75％，HPP1灵敏度为40％，SFRP1灵敏度为53％，SFRP2灵敏度为58％，当四种基因联合检测时，灵敏度提高到90％，并且通过荧光定量PCR分析血浆中游离DNA的方法，能方便地实现对septin9、HPP1、SFRP1、SFRP2这四个基因标志物的同时间的四通道检测，并能根据荧光定量PCR的荧光数值来判断样本的甲基化频率，提供了一种无创、快速、准确性高及检出率高的癌症定量检测方法。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1：用于检测与结直肠癌相关的血浆多基因甲基化程度的引物及探针设计

本实施例中所采用的用于检测与结直肠癌相关的血浆多基因甲基化程度的引物及探针，是根据NCBI(美国国立生物技术信息中心)公开的人类全基因组序列，使用PrimerPreimer5.0及Methyl Primer Express v1.0设计，引物由Integrated DNATechnologies合成，探针由applied biosystem合成。

具体包括以下四组引物和探针：

本发明用于检测septin9、HPP1、SFRP1、SFRP2中的每个基因的至少一个靶区域内的甲基化程度的核酸序列，具体的靶区域分别选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4的连续的至少18个碱基长度的片段，所述核酸序列等同、互补或杂交于所述靶区域。优选地，所述核酸序列在中等严紧或严紧条件下杂交所述靶区域。

本发明中所采用的上述引物和探针需满足以下要求：(1)可扩增人造的甲基化的所述靶区域，而不能扩增人造的非甲基化的所述靶区域；(2)在以正常的人白细胞提取的DNA为模板时显示没有扩增，但在从结直肠癌病人的血浆提取的DNA为模板时显著扩增；(3)在以正常人的血浆提取的DNA为模板时显示没有扩增，但在从结直肠癌病人的血浆提取的DNA为模板时显著扩增。

实施例2：一种用于检测与结直肠癌相关的血浆多基因甲基化程度的试剂盒

本实施例中的试剂盒包括实施例1中的四组引物及探针，还包括用于检测内对照ATCB基因的引物及探针，Taq聚合酶、dNTP、PCR Buffer、亚硫酸氢盐试剂及变性剂或清除剂。

本实施例中，上述用于检测内对照ATCB基因的引物及探针：引物如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.19所示，探针如SEQ ID NO.18所示。上述变性剂为正烷基二醇，清除剂为色原烷衍生物。优选地，所述清除剂为6-羟基-2,5,7,8-四甲基色原烷2-羟酸或三羟基苯甲酸中的一种。

实施例3：上述试剂盒在结直肠癌检测中的应用。

实施例2中的试剂盒在结直肠癌检测中的应用包括以下步骤：

(1)准备一定数量的人源结直肠癌样本和正常样本，人源样本选自细胞系、组织切片、活检组织、石蜡包埋组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、由血液中分离的细胞中的一种或多种。

(2)从步骤(1)的样本中提取基因组DNA，并进行预处理使所述基因组DNA的5’端未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交上不同于胞嘧啶的另一种碱基；其中，预处理是通过亚硫酸氢盐试剂和变性剂/清除剂进行联用实现，本实施例中采用亚硫酸氢盐试剂和二乙二醇二甲基醚联用。

(3)以上述步骤(2)处理过的基因组DNA为模板，利用实施例1中的四组引物与探针组合进行PCR扩增。本实施例中的PCR扩增为荧光定量PCR扩增，PCR反应混合物包括经亚硫酸氢盐转化的DNA模板25～50ng、引物300～600nm、探针150～300nm、Taq聚合酶1～2U、各个dNTP 200～400μm、2×PCR Buffer缓冲至最终的50ul的体积。PCR反应条件为：95℃持续5分钟，然后进入45～72℃的50个退火变性循环，在60℃下退火一分钟，在95℃下变性30秒。

本实施例中的样本DNA的提取如下：收集21例结直肠癌(由解放军301医院提供，平均年龄53岁，11男，10女)和21例正常人(平均年龄55岁，13男，8女)的样品，并提取该21例结直肠癌和21例正常人的样品的基因组DNA。上述样品的DNA提取可以采用现有技术中的任何标准手段来进行，所有样品DNA是使用Epigenomics公司的EPi ProColon Plasma QuickKit提取。

按上述方法进行荧光PCR扩增，最后，分别测得21例结直肠癌(crc01～crc21)和21例正常人(nom01～nom21)DNA样本对于septin9、HPP1、SFRP1、SFRP2基因的荧光定量PCR的Ct值，并计算平均甲基化率，结果如表1所示。

表1各DNA样本对于septin9、HPP1、SFRP1、SFRP2基因的荧光定量PCR的Ct值

由表1的septin9、HPP1、SFRP1、SFRP2基因的荧光定量PCR的Ct值可以看出，septin9、HPP1、SFRP1、SFRP2基因在结直肠癌样本上高度扩增，而正常DNA很少扩增。由本发明中的试剂盒能快速、准确地区别结直肠癌DNA和正常DNA。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江唯实医学检验有限公司

<120> 用于检测与结直肠癌相关的血浆多基因甲基化程度的引物、探针、试剂盒及应用

<160> 19

<210> 1

<211> 820

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

gattccagac tccagaatcc actgctgcat atacttcatc cccccgactg gtcactgtct 60

gcgacctctc gacgtggagt tcatgaggcg tctcagcaag gtggtcaaca tcgtcccggt 120

cattgctaag gcagatactc tcacgctgga agagagagac ttcttcaaaa agaagatcag 180

ggaagagctg cgagccaatg ggattgatgt gtaccctcag aaggaatttg acgaggacgc 240

agaggacaga atgattaatg aaaagatcag ggagatgatc ccgtttgcgg tcgtgggcag 300

cgatcaggag taccaagtga acggcagaag gttgctgggg aggaagacca agtggggcac 360

tattgaagtt gagaacatcg cccactgcga gttcgcctac ttacgagacc ttctcatcag 420

gacccacatg cagaatatta aggacatcac cagcagcatc cactatgaaa tgtaccgcgt 480

aaggcgcctc aatgagaaca acactgcagt ggctcatgcc aacggcgtcc ctgaacatca 540

cctgactgcc cacgagatgt aggcgccacc tgccccccat tgcagtgtaa cgcaggagat 600

gcgagactct gaccttccct ccagtccaag cctccctcca cccaaccatg atctcacatg 660

tggggtaaaa actctaaatc ccgacagagg gaccttatcg tctgcagctt aaaggactct 720

ttaccagttt attgccttat ttttattttt tcaaacttta ctgatgacaa aacagagaag 780

aaagagttgt gccttaagtt gtgctgcagc tttggtttta 820

<210> 2

<211> 750

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

ttattcacaa agcgaccatt tcttcttccg acgcagaaag tctgcggctt taacggtctc 60

tgcttcaata agagagcctt agtggtgaaa tcgaagagac ccttctcttg caatgccatt 120

tacaatcctc aggtccagac aacccaagaa ggccagtccg aaaccctaga ttacagagtt 180

ttcttccaag atggatccgg aaagaaggta tctccatggc aagatatacc attgcatttg 240

ggagatggag tttttcactt tatagtggag attcctaaag agtcaagtgc aaaaatggag 300

gttgctactg atgaagcttt cactcctatc aagcaagata ctaagaaagg gaaactcaga 360

tattatcctt acaacataaa ctgggactat ggattgcttc cacaaacatg ggaagatcca 420

actcaagcaa actctgaagt tgaaggtgct tttggagaca atgatccagt tgatgttgtt 480

gagattggtg agagtcagag gaagataggt gaggttctaa aggtaaagcc tttagctgct 540

ttggctatga ttgatgaagg agagctggat tggaagattg ttgcgatttc tttagatgat 600

cctaaagctc atcttgtgaa tgatgttgat gatgtcgaga aacatttccc gggtactctt 660

acagctatta gggattggtt tagagactac aagattccag atggaaaacc tgctaacagg 720

tttggtcttg gaaacaaacc agcaaacaaa 750

<210> 3

<211> 440

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

ggattcggct cgtccaactt tcgcggaggc cggtcggacg cagacgcaca gagctgcaga 60

cgcacagagc ggcagagcga agttggagag ccttcctccg cactcgcctc ccgagtctcc 120

tgataaagtg aacgccgcgc gtcgggctcg aaaaacaaca acaaacatga ggtccgtttc 180

tgctctctgg agaacgatcg ggacggtcgt gacggtggcg ttcatgtcgg cgtgcggagc 240

atcggagtac gagtacctga gttggaagac ggagatcgcg gggcccatct acggtaagac 300

cccccagtgc gtggggatcc cggaggacct gcggctctgc cacggcgtgg gctaccccga 360

gatgctgctg cccaacctgc tggagcacga aaccatggcg gaggtgaagc agcaggccag 420

cgaagatcaa tgggtttgat 440

<210> 4

<211> 650

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

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ccgacaacga cctgtgcatt ccgcctgcaa gcattgagaa cgtcgtgcct gtcaccagag 120

aggtgcccag ggtgtgtgat gcttgcaaag aaacggaaga aaatggcaac gaaatcgttg 180

acagtctgtg caagaatgat tttgttatga agatcaaagt caaggagatc tcctacatta 240

atggtgacac caaaatagta ccggagacca agaccaagac catttacacg atgaacggcg 300

tgacggagcg tgacctgcgg aggacagtgc tgtggctgaa ggatgggatg cggtgtatct 360

gtgaggagat gaacgacatc aacggcccta cctggtaatg ggccagaaga tggacagcca 420

tctggtcatc acctccctga agcgctggca gagaggacag cccgagttta agaggatttc 480

ccgcagcctt cgtaagatgc agtgttagga aagaaaggag gctccagatt ttaggttaaa 540

tttagtttag ctttttctgt taagctgaga tgttttttgg tttgttctcg agaacagatt 600

gctccgaggt ctcagacact acatatccca gattcttcca ctattgtttt 650

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggacaggact aggcggaaca 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aggggagagc gggtaagaga 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tagtagcgac gggcggtgtg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 8

cagccacccg agattgagca 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agtaggagag gagcgagcgacc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tgcggaagga tcattaacgga 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ctcgctcctg gaagatggtg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggtgaaggtc ggtgtgaacg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tgcctgcttc accaccttct 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aggccggtgc tgagtatgtc 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tttgagggtg cagcgaactt 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

acagcaacag ggtggtggac 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

aggggccatc cacagtcttc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cagtgccagc ctcgtctcat 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gtgatggcat ggactgtggt 20

Claims

1.一种用于检测与结直肠癌相关的血浆多基因甲基化程度的引物及探针，其特征在于，包括以下四组引物和探针：

(1)用于检测septin9基因甲基化程度的特异引物及探针：特异引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7所示，探针如SEQ ID NO.6所示；

(2)用于检测HPP1基因甲基化程度的特异引物及探针：特异引物如SEQ ID NO.8和SEQID NO.10所示，探针如SEQ ID NO.9所示；

(3)用于检测SFRP1基因甲基化程度的特异引物及探针：特异引物如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.13所示，探针如SEQ ID NO.12所示；

(4)用于检测SFRP2基因甲基化程度的特异引物及探针：特异引物如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.16所示，探针如SEQ ID NO.15所示。

2.一种用于检测与结直肠癌相关的血浆多基因甲基化程度的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的特异引物和探针。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括检测内对照ATCB基因的特异引物及探针：特异引物如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.19所示，探针如SEQ ID NO.18所示。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括Taq聚合酶、dNTP、PCR Buffer、亚硫酸氢盐试剂及变性剂或清除剂。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述变性剂为正烷基二醇，所述清除剂为色原烷衍生物。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述变性剂为二乙二醇二甲基醚，所述清除剂为6-羟基-2,5,7,8-四甲基色原烷2-羟酸或三羟基苯甲酸中的一种。

7.一种如权利要求2～6任一项所述的试剂盒在结直肠癌检测中的应用。

8.如权利要求5所述的应用，其特征在于包括以下步骤：

(1)准备一定数量的人源结直肠癌样本和正常样本；

(2)从步骤(1)的各样本中提取基因组DNA，并进行预处理以使所述基因组DNA的5’端未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交上不同于胞嘧啶的另一种碱基；

(3)以上述步骤(2)处理过的基因组DNA为模板，利用如权利要求1～6中所述的引物与探针组合进行PCR扩增；

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述人源样本选自细胞系、组织切片、活检组织、石蜡包埋组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、由血液中分离的细胞中的一种或多种。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的预处理是通过亚硫酸氢盐试剂和变性剂/清除剂进行联用实现。