CN109652556A

CN109652556A - circARHGAP12及其在制备鼻咽癌诊断制剂中的应用和诊断制剂

Info

Publication number: CN109652556A
Application number: CN201910151200.XA
Authority: CN
Inventors: 熊芳; 郭灿; 曾朝阳; 熊炜; 范春梅; 莫勇真; 王裕民; 张立身; 邓湘赢; 赵梦瑶; 李小玲; 李桂源
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2019-02-28
Filing date: 2019-02-28
Publication date: 2019-04-19
Anticipated expiration: 2039-02-28
Also published as: CN109652556B

Abstract

本发明属于肿瘤分子生物学技术领域，具体涉及circARHGAP12及其在制备鼻咽癌诊断制剂中的应用和诊断制剂。首次发现circARHGAP12在鼻咽癌临床组织样本和细胞系中高表达，且能促进鼻咽癌细胞的侵袭与转移，提示circARHGAP12可能成为鼻咽癌诊断标记物，以及用于制备诊断鼻咽癌的试剂。具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

Description

circARHGAP12及其在制备鼻咽癌诊断制剂中的应用和诊断制剂

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学技术领域，具体涉及一种环状RNA circARHGAP12及其在制备鼻咽癌诊断制剂中的应用和诊断制剂。

背景技术

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一种高转移的恶性肿瘤，具有不同的发病机制和组织病理学表现。遗传易感性，表观遗传，种族衍生，地理分布，环境因素和EBV病毒感染导致NPC的恶性。鼻咽癌的发生有明显的区域特征，东南亚特别是华南和北非的病例占多数。NPC的治疗策略主要是放疗辅以化疗。虽然早期NPC患者的5年总生存率高达95％，但鼻咽和颈淋巴结复发率为8.6％～23.7％。这是由于NPC的发生和发展涉及复杂的基因调控和多阶段过程，其分子机制尚不清楚，加之肿瘤异质性和放疗抵抗引起的个体差异，传统放疗的治疗效果不是非常的理想。因此，研究治疗鼻咽癌的治疗靶标和诊断的分子标记物至关重要。

circRNA主要来源于蛋白质编码基因的外显子区，也可以由内含子区、UTR区、基因间区、非编码RNA位点及已知转录物的反义位点形成。CircRNA是由前体mRNA(precursormessenger RNA,pre-mRNA)反向拼接而形成的一类不具有5‘末端帽子和3’末端poly(A)尾巴并以共价键形成环状套索结构的非编码RNA分子。

CircRNA形成过程可以分为两大类，即外显子环化(exon circularization)和内含子环化(intron circularization)两大机制。Jeck等提出外显子来源的circRNA(exoniccircRNA,ecircRNA)可以分为套索驱动环化(lariat-driven circularization)和内含子配对驱动环化(intron-pairing-driven circularization)两种形成方式，套索驱动环化是外显子3’端作为剪接供体(splice donor)攻击5’端剪接受体(splice receptor),Alu区共价结合而形成套索结构，套索结构进行内部拼接后切除内含子形成circRNA；内含子配对驱动环化是两个内含子碱基互补配对形成环状结构后，剪除内含子形成circRNA。其实内含子本身也可以环化，可以形成内含子来源circRNA(circular intronic RNA,ciRNA)。CircRNA是由前体mRNA反向拼接而形成的一类不具有5‘末端帽子和3’末端poly(A)尾巴并以共价键形式形成的封闭环形结构的非编码RNA分子。有着高度的稳定性、保守性、特异性，并且含量高的特点。

CircRNA最早在1976年于RNA病毒中首次发现，随后Hsu MT等人使用电子显微镜技术在猴的肾细胞质中发现了circRNA的存在。近年来越来越多的circRNA被发现，目前为止已知的circRNA数目已经达到三万多个。CircRNA也不再被认为是错误的RNA转录本，而是作为非编码RNA研究中的耀眼之星冉冉升起。发现更多的新型circRNA作为肿瘤诊断和预后的生物标志物及其应用，并能尽早在专利领域得到好的保护，能显著提升我国在该技术领域的国际竞争力。

我们检测到一个长度为794bp的circARHGAP12。通过实验发现该环状RNA在鼻咽癌中高表达且能促进鼻咽癌的侵袭转移，有可能作为鼻咽癌诊断标记物，以及治疗的靶点。

发明内容

本发明发现了一个大小794bp的circARHGAP12，并发现了它与鼻咽癌之间存在的关系，有可能作为鼻咽癌诊断标记物和治疗的靶点。

本发明的第一个目的是提供一种环状RNA circARHGAP12，序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供一种检测环状RNA circARHGAP12表达量的试剂在制备诊断鼻咽癌制剂中的应用，所述的环状RNA circARHGAP12序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述的检测环状RNA circARHGAP12表达量的试剂包括但不限于PCR

检测试剂。

进一步的，所述的PCR检测试剂中的引物优选为：

上游引物：5’-ATCTTGTGATTCCGCAGGAG-3’

下游引物：5’-ATGGCTTTATGGCTTGTTGG-3’，

但不限于上述具体的引物。

本发明的第三个目的是提供一种诊断鼻咽癌的制剂，包括检测环状RNAcircARHGAP12表达量的试剂，所述的环状RNA circARHGAP12序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述的检测环状RNA circARHGAP12表达量的试剂包括但不限于PCR检测试剂。

进一步的，所述的PCR检测试剂中的引物优选为：

上游引物：5’-ATCTTGTGATTCCGCAGGAG-3’

下游引物：5’-ATGGCTTTATGGCTTGTTGG-3’，

但不限于上述具体的引物。

进一步的，所述的PCR检测试剂还包括内参对照：

上游引物：5’-TCACCAACTGGGACGACATG-3’

下游引物：5’-GTCACCGGAGTCCATCACGAT-3’，

但不限于上述具体的内参对照。

本发明首次发现circARHGAP12在鼻咽癌临床组织样本和细胞系中高表达，且能促进鼻咽癌细胞的侵袭与转移，提示circARHGAP12可能成为鼻咽癌诊断标记物，以及用于制备诊断鼻咽癌的试剂。具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

附图说明

图1为qRT-RCR检测鼻咽癌组织和非肿瘤鼻咽上皮组织以及鼻咽癌细胞系中circARHGAP12的表达水平；

左图circARHGAP12的表达水平以β-actin作为参照，N为非肿瘤鼻咽上皮组织，样本数为15例；T为鼻咽癌组织，样本数为27例，n为样本数量，均采用t检验，P<0.05具有统计学意义；右图中检测circARHGAP12在鼻咽癌细胞系中的表达，NP69是永生化的正常鼻咽上皮细胞，作为参照，其余均为鼻咽癌细胞系。

图2为Sanger法测序；

a.circARHGAP12由ARHGAP12的2,3号外显子首尾拼接形成，E表示exon(外显子)，下划线序列表示首尾的接头序列；b.circRNA形成的示意图；c.测序结果的峰图，黑色箭头表示从此处头尾相接。

图3为核质分离RNA实验检测circARHGAP12在细胞中的定位；

利用核质分离试剂盒抽提鼻咽癌细胞中的RNA，以GAPDH为胞质的内参，U6为细胞核的内参，结果显示circARHGAP12在细胞质和细胞核中均有(siRNA发挥作用主要在细胞质中，所以需检测下circARHGAP12的定位情况)。

图4为qRT-PCR技术检测鼻咽癌细胞系中circARHGAP12siRNA的沉默效率；

a.qRT-PCR检测在鼻咽癌细胞系HONE1、HNE2和CNE2中circARHGAP12siRNA的沉默效率,circARHGAP12表达水平分析以β-actin作为参照；b.在鼻咽癌细胞系HONE1、HNE2和CNE2中转染siRNA后，检测线性RNA的表达，ns代表无意义，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图5为过表达载体图谱；

图6为qRT-PCR检测circARHGAP12过表达效率；

在HONE1、HNE2和CNE2细胞系中用qRT-PCR实验检测circARHGAP12过表达效率，circARHGAP12表达水平分析以β-actin作为参照，将pcDNA3.1组标准化为1，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图7为体外沉默circARHGAP12对鼻咽癌细胞划痕愈合能力的影响；

在HONE1、HNE2和CNE2细胞中转染siNC、siRNA后，待细胞密度达到100％后划痕，根据细胞愈合速度在不同的时间点拍照，下方为划痕宽度的统计图，将siNC标化为1，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图8为过表达circARHGAP12对鼻咽癌细胞HONE1、HNE2和CNE2划痕愈合能力的影响；

在HONE1、HNE2和CNE2细胞中转染pcDNA3.1、circARHGAP12后，待细胞密度达到100％后划痕，根据细胞愈合速度在不同的时间点拍照，下方为划痕宽度的统计图，将pcDNA3.1标化为1，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图9为沉默circARHGAP12对鼻咽癌细胞侵袭的影响；

用基质胶侵袭实验模拟细胞穿过基质屏障。在HONE1、HNE2和CNE2细胞中转染siNC、siRNA 24小时后，用基质胶侵袭实验检测沉默circARHGAP12对鼻咽癌细胞侵袭的影响，右图为细胞个数的统计图，将siNC标化为1，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图10为过表达circARHGAP12对鼻咽癌细胞侵袭的影响；

用基质胶侵袭实验模拟细胞穿过基质屏障。在HONE1、HNE2和CNE2细胞中转染pcDNA3.1、circARHGAP12 24小时后，用基质胶侵袭实验检测过表达circARHGAP12对鼻咽癌细胞侵袭的影响，右图为细胞个数的统计图，将pcDNA3.1标化为1，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

具体实施方式

以下结合具体实施方式旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

本发明所用的正常炎性鼻咽上皮组织和鼻咽癌组织标本均来自湖南省肿瘤医院治疗的初诊患者，未经放化疗和手术治疗。新鲜鼻咽癌组织采集好后，立即放入液氮罐中保存,随后搜集所有病人的相关临床资料，所有实验用组织样本采集均获得中南大学伦理委员会授权和病人知情同意。

本发明所用HONE1、HNE2和CNE2三株鼻咽癌细胞系均为中南大学肿瘤研究所分子遗传实验室所保存。细胞培养条件为：10％胎牛血清(FBS)和1％双抗(青霉素、链霉素)的RPMI1640液体培养基，37℃、95％湿度、5％CO₂浓度的恒温培养箱内贴壁生长。

本发明环状RNA的引物与线性RNA引物的设计不同，其是根据拼接位点两侧设计，Primer3.0网站上在线设计，最终的引物合成工作，委托擎科生物公司长沙合成部合成。

(1)β-actin

上游引物：5’-TCACCAACTGGGACGACATG-3’，如SEQ ID NO.2所示；

下游引物：5’-GTCACCGGAGTCCATCACGAT-3’，如SEQ ID NO.3所示

(2)环状RNA circARHGAP12实时定量PCR引物

上游引物：5’-ATCTTGTGATTCCGCAGGAG-3’，如SEQ ID NO.4所示，

下游引物：5’-ATGGCTTTATGGCTTGTTGG-3’，如SEQ ID NO.5所示，

(3)扩增circARHGAP12全长引物

上游引物：5’-CGGATCGATGTTTAAATGTGATACTGGTGTAGATCT-3’，如SEQ ID NO.6所示，

下游引物：5’-ATACCGCGGCCTTATCTGTTCAGTGGAGC-3’，如SEQ ID NO.7所示，

本发明为了特定的敲低环状RNA而不影响它的线性基因表达，根据拼接位点设计siRNA，靶向沉默circARHGAP12。

circARHGAP12siRNA序列：

正义链(5'-3')UGAACAGAUAAGGGUUUAAUU，如SEQ ID NO.8所示，

反义链(5'-3')UUAAACCCUUAUCUGUUCAUU；如SEQ ID NO.9所示，

阴性对照：

正义链(5'-3')UGAACAGAUAUGAGCAUCGUU，如SEQ ID NO.10所示，

反义链(5'-3')CGAUGCUCAUAUCUGUUCAUU，如SEQ ID NO.11所示。

本发明试验结果均采用统计学分析：t检验用来评价两组之间的差异。p<0.05用于表示统计学显著性，所有p值均使用双侧检验。统计分析采用SPSS13.0和Graphpad 5.0软件进行。

实施例1：circARHGAP12在鼻咽癌组织和细胞中的表达

1、按照标准样本采集方案，我们从湖南省肿瘤医院收集组织样本42例。所有病例均为湖南省肿瘤医院头颈外科的初诊患者(时间区间：2018年1月至2018年11月)。经病理科确诊鼻咽癌27例，鼻咽炎症患者15例(已排除肿瘤性疾病、无活动性传染病、严重免疫性疾病和其他重大疾病)。

采集的过程中记录完整的个人信息和临床资料，包括姓名、性别、年龄、门诊编号、住院编号、病理类型、病例分期、以及EBV感染情况等。所有样本的采集都征得病人允许，并与病人签署书面协议，建立资料较完整的标本库。

2、鼻咽癌或正常炎性鼻咽组织RNA提取

(1)准备工作：研钵用洗涤剂清洗后浸泡于3％的双氧水(H₂O₂)中4小时以上，冲刷数次，用蒸馏水洗一次，用锡箔纸覆盖研钵(有助于受热均匀，取出时防止污染)，置于180℃干燥箱中干烤8小时以上。达到干烤时间后，关闭干燥箱，待干燥箱温度降至室温时取出研钵，存放于洁净区。

(2)液氮研磨：在研钵中加入液氮预冷，然后夹取冻存管中保存的鼻咽部组织，快速研磨，一边研磨，一边继续加入少量液氮，再研磨，直到将鼻咽组织磨成粉末状。依据最佳比例，即每50-100mg正常或NPC样本(鼻咽癌样本)加1ml Trizol。我们实验过程中，一个鼻咽癌组织样本约200mg左右，因此需要2ml Trizol。然后进一步研磨混匀，置于冰箱4℃大约5-10min，让组织完全裂解。待裂解产物融化成粉红色液体时转移至2ml Tube。每个样品可以分离至2个Tube，保存至-80℃。

(3)水相分离：每1000μl含trizol的组织裂解液添加200μl 4℃预冷的氯仿，震荡约30s进行混匀。低温环境放置5分钟后，进行25分钟离心操作(12,000rpm，4℃)。离心完毕，可观察到管内液体分为3层，上层透明层中存在RNA，中层是膜状的白色沉淀，下层粉红色。因此，进一步吸取含有RNA的上层水相至1.5ml Tube中，用100μl枪轻柔吸取，尽量避免吸到中层和下层物质，造成RNA污染。

(4)RNA沉淀：在上清中加入1:1等体积的异丙醇约500μl，动作轻柔地上下颠倒混匀数次，置于冰箱-20℃放30分钟后，离心30分钟(4℃,12,000rpm)，可见管底有RNA沉淀，用100μl移液枪吸弃去上清，尽量保留RNA沉淀。

(5)RNA洗涤：每管RNA沉淀样品加入1ml用无酶水制备的75％乙醇，温和上下倒置离心管，以洗涤RNA沉淀。然后离心5分钟(4℃,7,600rpm)，用100μl的移液枪尽量弃去上清，室温晾干10～15分钟。

(6)重新溶解RNA并保存：每管样品加入15-30μl DECP水，保存于-80℃。

3、细胞总RNA提取

准备工作：灭菌后的无RNase水、75％乙醇(无RNase配制)、氯仿、异丙醇、1×PBS、无酶tip头和EP管，高速低温离心机预冷至4℃，实验开始前先将实验台面及移液枪用75％酒精擦拭。

(1)取待提取RNA的细胞，用1×PBS或D-hanks清洗两次；

(2)12孔板中每孔加500μl Trizol裂解液，室温裂解1-2分钟，用移液枪轻轻吹下细胞，上下轻柔颠倒10次，室温静置5分钟；

(3)加入100μl的氯仿(按1mlTrizol:0.2ml氯仿:0.5ml异丙醇)，用力震荡15-30s，冰上放置5分钟；

(4)4℃，12000rpm/20min；

(5)取上层水相于预冷的Tube管中，加入250μl异丙醇，用漩涡混合器或移液枪混匀(-20℃>1h)；

(6)4℃，12000rpm/30min，弃上清；

(7)加入75％乙醇(预冷)1ml，混匀；

(8)4℃，7600rpm/5min；弃上清，重复步骤8,9；

(9)闪离10s，尽量吸尽上清，倒置干燥10分钟；

(10)加入20-30μl DEPC，测RNA浓度和OD值。

4、circRNA逆转录PCR反应

(依据abm公司5×All-In-OneRTMasterMix(withAccuRTGenomicDNARemovalKit)(#G492)的实验说明手册操作，)

配置如下反应体系：

逆转录PCR上机反应程序如下：

25℃ 10min，

42℃ 15min，

85℃ 5min。

待反应结束后，-20℃保存产物备用。

5、实时荧光定量PCR

先将逆转录反应产物稀释5倍，然后依据abm公司EvaGreen qPCR MasterMix(MasterMix-R)的实验说明手册操作，配置如下反应体系：

实时荧光定量PCR机上反应程序如下：(Cycle×39)

Bio-RadIQ5实时荧光定量PCR仪进行上述反应完成后，与内参基因β-actin标化,以2-^ΔΔCT值显示目标基因的相对表达量，判定基因的表达差异。采用unpaired t-test检验计算P值。

结果：收集多例鼻咽癌组织和正常炎性鼻咽上皮组织，利用qRT-PCR技术检测了circARHGAP12的表达情况。结果显示，与15例正常炎性鼻咽上皮组织相比，circARHGAP12在27例鼻咽癌组织中明显高表达，两组数据的差异具有统计学意义；此外，我们还检测了circARHGAP12在正常鼻咽上皮细胞和鼻咽癌细胞中的表达，结果显示，鼻咽癌细胞中circARHGAP12的表达明显高于正常鼻咽上皮细胞NP69(结果见图1右)。因此，circARHGAP12在鼻咽癌中高表达，circARHGAP12对鼻咽癌的发生发展可能具有重要的生物学功能，可以作为诊断标记物。

实施例2：sanger测序证明形成的是环状RNA

为了证明circARHGAP12形成的是环状RNA而非线性的，将图一中的qRT-PCR产物回收，送公司进行sanger测序(擎科公司)。将公司返回的序列用DNASTAR软件进行比对，chromas软件看峰图，判断测序的质量。结果显示，circARHGAP12确实是由母基因ARHGAP12的2、3号外显子头尾相接环化形成。a.circARHGAP12由ARHGAP12的2,3号外显子首尾拼接形成，E表示exon(外显子)，下划线序列表示首尾的接头序列；b.circRNA形成的示意图；c.测序结果的峰图，黑色箭头表示从此处头尾相接(见图2)。

实施例3：核质分离RNA检测circARHGAP12在细胞内的定位

由于siRNA发挥作用主要是在细胞质中，因此检测circARHGAP12的定位可判断能否很好地干扰circARHGAP12的表达。利用核质分离试剂盒将细胞核和细胞质的RNA分离，然后用实时荧光定量PCR检测circARHGAP12在核、质中表达所占的比重。以GAPDH为胞质的内参，U6为细胞核的内参，结果显示circARHGAP12在核、质中的分布各占50％(见图3)。

核、质RNA提取：

1、收10⁷个细胞，胰酶消化，10％FBS终止消化，PBS洗一遍，离心，置于冰上；

2、加入100-500ul的Cell Fractionation Buffer，轻轻吹打，防止核破裂；

3、冰上孵育5-10min；

4、4℃离心，1-5min(上层为细胞质部分，下层为细胞核部分)；

5、将上层吸出至一新的EP管，置于冰上(下一步为步骤8，细胞质部分)；

6、在原EP管中加入与步骤2等体积的Cell Fractionation Buffer，温和的重悬，4℃离心，500g/分钟(可再重复一次)；

7、加入与步骤2中等体积的预冷的Cell Disruption Buffer，剧烈震荡，吹打混匀至于冰上；

8、加入等体积的2X Lysis/Binding Buffer(室温)，立即吹打混匀，若混合物过于黏稠。可匀浆；

9、加入与步骤8中等体积的100％乙醇，立即吹打混匀；

10、将混合物移至(过滤器-收集管中)，一次最大体积700ul，12000rpm离心30s，弃废液；

11、700ul Wash Solution I洗一次，12000rpm离心30s，弃废液；

12、500ul Wash Solution 2/3洗一次，12000rpm离心30s，弃废液；

13、重复步骤12；

14、空离30s；

15、将过滤柱移至一个新的EP管，加入40ul预热的Elution Solution，12000rpm离心30s，再加入20ul Elution Solution 12000rpm离心30s，测浓度备用。

实施例4：在鼻咽癌细胞系中沉默circARHGAP12表达的效果检测

根据拼接位点设计了circARHGAP12的siRNA序列，siRNA即一类长度为21-25个核苷酸的双链RNA，能与同源RNA互补结合，特异性降解目的RNA，从而抑制其表达。目前，siRNA已发展成为基因功能研究的重要工具。为了探究circARHGAP12在肿瘤发生发展中的作用，我们根据circARHGAP12的拼接位点设计了siRNA，利用Hiperfect试剂将siRNA和siNC(空白对照)瞬时转染到HONE1、HNE2和CNE2细胞系中沉默circARHGAP12的表达。转染后继续培养36小时收集细胞，利用实时荧光定量PCR技术检测circARHGAP12的表达水平以检测siRNA的转染效率，确认circARHGAP12敲低效果达到0.5以下(见图4a)。然而以circARHGAP12的序列设计线性引物时，实时荧光定量PCR检测发现siRNA并未敲低线性RNA的表达，说明siRNA是特异性沉默circARHGAP12的(见图4b)。

实施例5：在鼻咽癌细胞系中circARHGAP12过表达效果检测

首先我们选择酶切位点，将circARHGAP12全长序列放入NEB cutter 2.0在线网站分析，显示ClaI和SacII酶切位点为circARHGAP12全长序列中不存在的位点，同时在pcDNA3.1质粒载体(购于生工生物工程公司)中单一存在的DNA限制性内切酶。将circARHGAP12全长序列克隆进pcDNA3.1质粒空载，图5为绘制的过表达载体图谱。

为了检测circARHGAP12的成环效率，首先我们将构建的pcDNA3.1/circARHGAP12真核过表达载体在鼻咽癌细胞中进行过表达。把生长状况良好的第三、四代鼻咽癌细胞HONE1、HNE2和CNE2种到12孔板中，待细胞融合度达到60％-80％时，用脂质体法lipofectamine 3000把无内毒素质粒pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1/circARHGAP12过表达载体瞬时转染鼻咽癌细胞HONE1、HNE2和CNE2，继续培养至36小时收集细胞，利用实时荧光定量PCR技术检测circARHGAP12的表达水平及成环效率。qPCR结果显示，与pcDNA3.1空质粒组细胞相比，转pcDNA3.1/circARHGAP12过表达质粒组的细胞中circARHGAP12的表达水平显著升高，结果具有统计学意义(见图6)。

实施例6：细胞划痕愈合迁移实验：

(1)照细胞台：1000μl/10μl Tip头、高温高压灭菌的D-Hank’s，直尺、1000μl/10μl移液枪、marker笔等，用酒精消毒后再放置在超净台内紫外照射30分钟；

(2)待细胞长至50％～70％左右分别转染siRNA和NC组或者转染质粒；

(3)待细胞长满平铺板底后第二天开始划痕：将10μl枪头比着直尺垂直于6孔板底部干脆快速进行十字或井字划痕，不要倾斜，力度大小一致，以确保划痕宽度尽可能一致；

(4)吸弃培养液，用D-hanks轻轻洗涤3次，尽可能洗掉由于划痕引起的碎片细胞；

(5)加入1％双抗2％胎牛血清的1640培养基；

(6)拍照记录此时的十字旁边划痕宽度，记为0h；

(7)将6孔板放回培养箱培养，间隔12h拍摄同一位置，记为12h；

(8)间隔24h时再拍相同位置，直到划痕愈合，整理所有的图片，并进行统计分析。

体外沉默circARHGAP12抑制鼻咽癌细胞的迁移

利用Hiperfect试剂将siRNA和NC瞬时转染到HONE1、HNE2和CNE2细胞系中沉默circARHGAP12的表达。在沉默了circARHGAP12的鼻咽癌细胞系HONE1、HNE2和CNE2中进行划痕实验，验证其对细胞迁移的影响。划痕愈合实验在这些细胞中的多个时间点均证实：相对于NC组，siRNA组细胞的迁移能力明显减弱。划痕宽度差异明显,且具有统计学意义。以上结果显示,沉默鼻咽癌细胞系中circARHGAP12的表达,能够抑制鼻咽癌细胞HONE1、HNE2和CNE2在体外的迁移能力(结果见图7)。

体外过表达circARHGAP12促进鼻咽癌细胞的迁移

利用脂质体法lipofectamine 3000把无内毒素质粒pcDNA3.1和pcDNA3.1/has_circARHGAP12过表达载体瞬时转染鼻咽癌细胞HONE1、HNE2和CNE2。在确定了circARHGAP12过表达质粒的过表达良好效果后，我们在鼻咽癌细胞系HONE1、HNE2和CNE2进行了细胞划痕愈合实验。划痕愈合实验在这些细胞中的多个时间点均证实：相对于空载pcDNA3.1(+)质粒组，pcDNA3.1/circARHGAP12过表达质粒组细胞的迁移能力明显增强。划痕宽度差异较大,且具有统计学意义。以上结果显示,过表达鼻咽癌细胞系中circARHGAP12的表达,能够促进鼻咽癌细胞HONE1、HNE2和CNE2在体外的迁移能力。通过正反两个方向验证证明，circARHGAP12可以促进鼻咽癌细胞的迁移(结果见图8)。

实施例7：细胞transwell侵袭实验：

(1)基质胶准备：提前一天把冻存于-20℃的BD Matrigel胶置于4℃冰箱融化成液态，把稀释胶用的tip头、EP管置于-20℃过夜，这样第二天操作时Matrigel胶在铺胶时不会过快凝固；

(2)基质胶稀释：BD Matrigel胶：无血清培基＝1:8，即20μl基质胶加160μl 1640培基轻吹混匀；

(3)将稀释好的基质胶加入transwell小室100μl，再沿边吸出80μl，依次铺好放入37℃培养箱里孵育2-3小时，当看到铺胶层为白色时，表明液体Matrigel胶已呈固态；

(4)消化转染24小时后的细胞，用无血清培基洗2遍，然后使用无血清的培基重悬细胞，进行细胞计数，调整细胞浓度为每200μl中2万个细胞；

(5)向下层小室添加800μl含有20％FBS的1640培养基，放入小室时将24孔板倾斜45°角，以避免放入小室过程中在小室和液面之间产生气泡；

(6)每室加200μl计好数的细胞悬液到transwell上室内，将24孔板放回37℃培养箱中，根据细胞状态和细胞侵袭速度，孵育约24～48小时。

(7)取出24孔板，用PBS或者D-hanks洗两遍，4％多聚甲醛浸洗10分钟，用清水洗3遍。

(8)染色：用0.1％的结晶紫滴加到transwell小室的底部，室温静置5-10min，用PBS清洗2-3遍，用棉签小心擦掉小室上面的基质胶；

(9)在24孔板中加入蒸馏水800μl，transwell上室中加入蒸馏水约200μl，然后在倒置显微镜下，任选5个不同的视野拍照，用image J软件进行计数和统计学分析差异的显著性。

体外沉默circARHGAP12的表达影响鼻咽癌的侵袭

为了探究沉默circARHGAP12后是否能够影响鼻咽癌的侵袭,我们又在三株细胞系中进行了Transwell小室基质胶侵袭实验，利用Hiperfect试剂将circARHGAP12siRNA和NC瞬时转染到HONE1、HNE2和CNE2细胞系中沉默circARHGAP12的表达。在沉默了circARHGAP12的鼻咽癌细胞系HONE1、HNE2和CNE2中进行Transwell小室基质胶侵袭实验，结果显示，siRNA组可在Transwell小室下表面观察到的肿瘤细胞数目明显少于NC组，且三株细胞系结果的趋势一致。随机拍摄5张照片并记录细胞数目，每一细胞系中两组别数据间均有明显差异，且具有统计学意义。以上结果表明，沉默鼻咽癌细胞系中circARHGAP12的表达,能够抑制鼻咽癌细胞HONE1、HNE2和CNE2在体外的侵袭能力(结果见图9)。

体外过表达circARHGAP12促进鼻咽癌细胞的侵袭

我们在鼻咽癌细胞系HONE1、HNE2和CNE2进行了Transwell小室基质胶侵袭实验，以观察过表达circARHGAP12对细胞侵袭能力的影响。我们同样利用脂质体法lipofectamine 3000把无内毒素质粒pcDNA3.1和pcDNA3.1/circARHGAP12过表达载体瞬时转染鼻咽癌细胞HONE1、HNE2和CNE2，继续培养到48小时后。收集细胞，利用实时荧光定量PCR技术检测circARHGAP12的表达水平及成环效率。在确定了circARHGAP12过表达质粒的过表达良好效果后，我们将细胞接种到铺基质胶的Transwell小室中，发现过表达质粒组的细胞侵袭到小室下表面的数目明显比空载组多，且两株细胞系结果的趋势一致。随机拍摄3张照片并记录细胞数目，每一细胞系中两组别数据间均有明显差异，且具有统计学意义。以上结果表明，过表达鼻咽癌细胞系中circARHGAP12的表达,能够促进鼻咽癌细胞HONE1、HNE2和CNE2在体外的侵袭能力。通过正反两个方向证明，环状RNAcircARHGAP12能够促进鼻咽癌细胞的侵袭(结果见图10)。

序列表

<110> 中南大学

<120> circARHGAP12及其在制备鼻咽癌诊断制剂中的应用和诊断制剂

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 794

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

aaaguuuaac aaugacucac auucuccuaa aguuuccagc cagaauagga cacgcucauu 60

uggucauuuu cccgguccag aguucuugga uguagagaaa acuagcuucu cccaggaaca 120

aucuugugau uccgcaggag aaggcucuga aagaauacau caagauucug aaucugguga 180

ugaacuuagc agcagcucca cugaacagau aaggguuuaa augugauacu gguguagauc 240

uccuuguucu aagcuauauu cauccaacaa gccauaaagc cauaaugugg uauaacaucc 300

uuuuugagag gugaauauua uugaaugaaa auggcugaca gaagugggaa gauuauucca 360

ggacaagugu auauugaggu ggaauaugau uaugaauaug aagcaaagga cagaaagauu 420

gugauaaaac aaggggagag guacaucuug gugaaaaaga ccaaugauga cugguggcaa 480

gucaagccag augaaaacuc caaagcguuu uaugugccag cccaguaugu gaaggagguc 540

acgcgcaaag cucucaugcc accuguuaag cagguagcug gucugccaaa uaacuccacg 600

aaaauaaugc agaguuugca ucuucagaga ucaacagaaa augugaacaa auugccugag 660

cuuucaaguu ucggaaagcc aucgucaucu guucaaggaa caggucuuau ucgugaugcc 720

aaucagaauu uuggacccag uuauaaucaa ggucagacug ucaaccuaag ccuggaccug 780

acccauaaua acgg 794

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

tcaccaactg ggacgacatg 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

gtcaccggag tccatcacga t 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

atcttgtgat tccgcaggag 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

atggctttat ggcttgttgg 20

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

cggatcgatg tttaaatgtg atactggtgt agatct 36

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 7

ataccgcggc cttatctgtt cagtggagc 29

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 8

ugaacagaua aggguuuaau u 21

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 9

uuaaacccuu aucuguucau u 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 10

ugaacagaua ugagcaucgu u 21

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 11

cgaugcucau aucuguucau u 21

Claims

1.一种环状RNA circARHGAP12，序列如SEQ ID NO.1所示。

2.检测环状RNA circARHGAP12表达量的试剂在制备诊断鼻咽癌制剂中的应用，所述的环状RNA circARHGAP12序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的检测环状RNA circARHGAP12表达量的试剂包括PCR检测试剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的PCR检测试剂中的引物为：

上游引物：5’-ATCTTGTGATTCCGCAGGAG-3’

下游引物：5’-ATGGCTTTATGGCTTGTTGG-3’。

5.一种诊断鼻咽癌的制剂，其特征在于，包括检测环状RNA circARHGAP12表达量的试剂，所述的环状RNA circARHGAP12序列如SEQ ID NO.1所示。

6.根据权利要求5所述的诊断鼻咽癌的制剂，其特征在于，所述的检测环状RNAcircARHGAP12表达量的试剂包括PCR检测试剂。

7.根据权利要求6所述的诊断鼻咽癌的制剂，其特征在于，所述的PCR检测试剂中的引物为：

上游引物：5’-ATCTTGTGATTCCGCAGGAG-3’

下游引物：5’-ATGGCTTTATGGCTTGTTGG-3’。

8.根据权利要求6所述的诊断鼻咽癌的制剂，其特征在于，所述的PCR检测试剂还包括内参对照：

上游引物：5’-TCACCAACTGGGACGACATG-3’

下游引物：5’-GTCACCGGAGTCCATCACGAT-3’。