CN107058574A - 一种鼻咽癌相关的肿瘤标志物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鼻咽癌相关的肿瘤标志物及应用，所述肿瘤标志物为lncRNA，定位于第17号染色体chr17:47785696‑47797422，该lncRNA的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为lncRNA‑KAT7。根据lncRNA‑KAT7序列，设计并合成特异性实时荧光定量PCR引物，制备用于鼻咽癌诊断或者疗效预测的制剂。利用实时荧光定量PCR制剂，在鼻咽癌临床病例标本中检测lncRNA‑KAT7的表达水平，发现lncRNA‑KAT7在鼻咽癌中表达显著下调，lncRNA‑KAT7可制备用于鼻咽癌辅助诊断、疗效预测及预后判断的制剂或试剂盒。

Description

一种鼻咽癌相关的肿瘤标志物及应用

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学领域，涉及一种鼻咽癌相关的肿瘤标志物及应用。

背景技术

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)尽管少见，但是在东南亚高发。其中约80％鼻咽癌发生在中国，因此鼻咽癌又有“中国癌”之称。最新报道预测2015年中国将有6万新增鼻咽癌患者。湖南地处的湖广地带鼻咽癌发病率高达20/10万至30/10万，是鼻咽癌的重灾区。近期有学者建议将鼻咽癌早筛纳入湖南地区常规体检。鼻咽癌与EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)，环境因素以及遗传等多因素有关。发病隐匿，容易忽视，恶性程度高，发现时多为中晚期，影响预后。EBV检测是目前常用的筛查方式，是鼻咽癌的生物标志物。有报道可在鼻咽癌患者血浆中检测到EBV DNA，且放疗后血浆中EBVDNA拷贝数升高。纤维鼻咽喉镜可以观察到鼻腔及咽部情况。CT、MRI和PET可以检测鼻咽癌是否侵犯颅底和远处转移，但其费用较高，不适合作为常规检查。因此需要寻找新的标志物。

长链非编码RNA(Long noncoding RNA,lncRNA)是无蛋白编码能力的转录产物，长度大于200个核苷酸，参与各种生理过程。至今已有成千上万种lncRNA被报道存在于人类基因组中，但绝大部分的lncRNA的功能尚不明确。lncRNA在鼻咽癌，肺癌，乳腺癌，结肠癌，肝癌等多种癌症中发挥着重要的作用。lncRNA似乎参与肿瘤发生发展的各个阶段，包括肿瘤发生，生长和转移。与其他肿瘤一样，原发性鼻咽癌也发现lncRNA失调。一些lncRNA在鼻咽癌中高表达，lncRNA Hotair调控鼻咽癌细胞的转移和侵袭，其表达水平并与肿瘤大小，恶性程度和不良预后有正相关。此外lncRNA Hotair被报道可通过直接激活VEGFA的转录促进肿瘤血管生成。循环中lncRNA GAS5可作为鼻咽癌预测化疗预后的生物标志物。AFAP1-AS1可能作为鼻咽癌不良预后预测标志物和潜在的治疗靶点。因此lncRNA可作为鼻咽癌的肿瘤标记物。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种鼻咽癌相关的肿瘤标志物。所述肿瘤标志物为lncRNA，该lncRNA的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为lncRNA-KAT7。本发明研究证实lncRNA-KAT7在鼻咽癌组织中表达下调，提示lncRNA-KAT7可作为鼻咽癌的肿瘤标记物。lncRNA-KAT7有望成为鼻咽癌诊断和预后判断的标志物，同时为鼻咽癌的治疗提供了新的靶点。因此，lncRNA-KAT7可用于制备鼻咽癌辅助诊断、疗效预测及预后判断制剂。还可用于制备鼻咽癌辅助诊断、疗效预测及预后判断试剂盒。

所述鼻咽癌辅助诊断、疗效预测及预后判断的试剂盒中包括lncRNA-KAT7和内参基因GAPDH的特异性引物，所述lncRNA-KAT7和内参基因GAPDH的特异性引物的上游引物和下游引物，所述lncRNA-KAT7的特异性上游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述lncRNA-KAT7下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所诉GAPDH的上游引物的序列如SEQ ID NO.4所示，所诉GAPDH的下游引物的序列如SEQ ID NO.5所示。

所述试剂盒为实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述特异性引物适用于SYBR Green、Taqman探针、分子信标、双杂交探针、复合探针的检测。另外，试剂盒中还包括标准DNA模板和PCR反应体系，PCR反应体系中的PCR反应液为实时荧光定量PCR反应液，并进一步包含荧光染料。所述实时荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg²⁺、Taq酶及缓冲液，所述荧光染料为SYBRGreen II，Taq酶为热启动酶。

在利用上述试剂盒检测lncRNA-KAT7的过程如下：

1)提取样品总RNA；

2)制备样品cDNA；

3)定量扩增lncRNA-KAT7。

下面对本发明作进一步说明：

lncRNA-KAT7位于17号染色体上，可应用于辅助鼻咽癌诊断的试剂盒中。

本发明通过实时荧光定量PCR分析发现36例鼻咽癌组织中的lncRNA-KAT7表达水平与10例正常的鼻咽内皮组织相比较，lncRNA-KAT7在鼻咽癌组织与正常鼻咽内皮组织中存在差异性表达，且在鼻咽癌组织中表达下调。以上结果表明在lncRNA-KAT7可能作为新型鼻咽癌诊断标志物。

所述鼻咽癌辅助诊断、疗效预测及预后判断的试剂盒包括：(1)从鼻咽癌组织中抽提总RNA所用试剂，包括Trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇、75％乙醇、无酶水；(2)将总RNA逆转录为cDNA所用试剂，包括逆转录缓冲液、氯化镁、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶及随机引物；(3)将cDNA实时荧光定量PCR所需试剂，包括lncRNA-KAT7实时荧光定量PCR特异性引物、GAPDH内参特异性PCR引物、实时荧光定量SYBR染料、无酶水；lncRNA-KAT7特异性PCR引物包括：①lncRNA-KAT7上游引物(SEQ ID NO.2)②lncRNA-KAT7下游引物(SEQ ID NO.3)；GAPDH内参特异性PCR引物包括：①GAPDH上游引物(SEQ ID NO.4)②GAPDH下游引物(SEQ ID NO.5)。

本发明为鼻咽癌的辅助诊断提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

附图说明

图1为lncRNA-KAT7在鼻咽癌中的表达水平。

具体实施方式

所述鼻咽癌辅助诊断、疗效预测及预后判断的试剂盒中包括：

(1)从鼻咽癌和癌盘组织中抽提总RNA所用试剂，包括Trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇、DEPC水。

(2)将总RNA逆转录为cDNA所用试剂：promega逆转录试剂盒(GoScript^TMReverseTranscriptase，A5003)，包括:GoScript^TM5X Reaction Buffer、MgCl₂、PCR NucleotideMix、RecombinantRibonuclease Inhibitor、GoScript^TMReverse Transcriptase、Nuclease-Free Water。

(3)将cDNA实时荧光定量PCR所用试剂，包括lncRNA-KAT7实时荧光定量PCR特异性引物、GAPDH内参特异性引物、实时荧光定量SYBR染料(Roche 4887352001 LightCycler480 SYBR Green I Master)、DEPC水。

检测过程如下：

1、鼻咽癌和癌旁组织总RNA提取

(1)新鲜或-80℃冻存组织约20mg左右，加入1mlTrizol冰上研磨，可先用剪刀剪碎组织，为防止溢出，一般先加400ul Trizol，呆研磨充分，再补齐至1ml。室温放置5-10min。

(2)按Trizol与三氯甲烷的体积比为5比1的比例加入三氯甲烷，涡旋振荡30s，室温放置5min，12000g转速4℃离心15min。

(3)吸取约400ul上清层，尽量小心，避免吸取中间固体层，加入400ul异丙醇，上下颠倒混匀，切勿剧烈振荡。室温放置10min，12000g转速4℃离心10min。

(4)吸弃上清液，用DEPC配制浓度为75％的乙醇加入1ml，在实验台上轻轻磕起沉淀，7500g转速4℃离心5min。

(5)吸弃上清层，室温放置5-10min，加入70左右的PEPC水溶解RNA，-80℃保存。

(6)用1％的琼脂糖凝胶，按1ug的RNA加1ul 6X Loading Buffer混匀，电泳20min左右，凝胶电泳成像系统照相保存，分析。

(7)Nano Drop检测RNA浓度和纯度，用DEPC水调零，将RNA样品充分混匀，滴加2ul样品在Nano Drop检测探头上，放心测量臂，测量RNA的浓度，记录

260/280的比值。

2、将总RNA逆转录为cDNA

采用promega逆转录试剂盒。

配置如下体系:

体系I：

2ugRNA溶于DEPC水中，加1ul随机引物，补齐至10ul。与PCR仪上70℃5分钟，立即冰浴5分钟。

体系II如表1所示:

表1

将体系I和体系II混合，瞬时离心，放入PCR仪中，程序为，

实时荧光定量PCR检测lncRNA-KAT7的表达量

实时荧光定量PCR采用罗氏LightCycler 480 SYBR Green I Master试剂盒。

反应体系如下：

仪器采用Roche 480，实时荧光定量PCR程序为：95℃10min预变性，接40个循环：95℃10s，60℃20s，72℃30s。

本实验数据采用相对定量的分析方法，将GAPDH作为内参基因，计算公式为：

△CT＝△CT_KAT7-△CT_GAPDH

△△CT＝△CT_癌组织-△CT_{非肿瘤组织}

相对表达量＝log2^-△△CT

利用软件SPSS 18.0行分析实时荧光定量PCR lncRNA-KAT7的相对表达量。发现36例鼻咽癌组织与10例非肿瘤组织相比，发现鼻咽癌组织的lncRNA-KAT7的表达下调，结果见图1。

以上结果表明，lncRNA-KAT7可作辅助鼻咽癌诊断的新型分子标志物。为鼻咽癌的辅助诊断提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 郴州市第一人民医院

<120> 一种鼻咽癌相关的肿瘤标志物及应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 575

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

cgggcggcca ggcttctgct gggtcctaat gccaaattcc ttactggagc ttcagcgccg 60

tctagctgct gcccagcgtc agcgacttta cctgctcatt acctaggcac atcactaggc 120

ttccaagggg gagagcggca cagctggtgt ttgtatgctg ctgtttgcgt agccatagcc 180

tgtgaggccc cagagagcag gactcccagt tcccctcgcc caggccaagt gaggcacgga 240

ctgtgggtgc actcagggtg cagccgccac tcaccctcag cagctcctct tctccctgct 300

ccttcacaaa tacctcctcc agctcttggt tgagcccttc caggctcctg tgcaggcagg 360

ggctgagtcg caagacaggg gaccctgagg ggaagctggg aggggacgcc tgaggaagag 420

gcaaatgaca aaatcacaca cagccccacc aggcctagac agtctttcat tctgaccagg 480

ggtaatggtc atgtccacac agcagaactg agtgaatgaa gggtgatttg gggacagtta 540

cagattgcaa taggtccact cagggcagtt ttctc 575

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

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<210> 3

<211> 21

<212> DNA

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<400> 3

ggggctgtgt gtgattttgt c 21

<210> 4

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<213> 人工合成

<400> 4

accacagtcc atgccatcac 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

tccaccctgt tgctgta 17

Claims (6)

1.一种鼻咽癌相关的肿瘤标志物，其特征在于，所述肿瘤标志物为lncRNA，该lncRNA的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为lncRNA-KAT7。

2.如权利要求1所述lncRNA-KAT7作为鼻咽癌相关的肿瘤标志物的用途。

3.如权利要求1所述肿瘤标志物在制备鼻咽癌辅助诊断、疗效预测及预后判断制剂中的应用。

4.如权利要求1所述肿瘤标志物在制备鼻咽癌辅助诊断、疗效预测及预后判断试剂盒中的应用。

5.一种鼻咽癌辅助诊断、疗效预测及预后判断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括lncRNA-KAT7和内参基因GAPDH的特异性引物，所述lncRNA-KAT7和内参基因GAPDH的特异性引物的上游引物和下游引物，所述lncRNA-KAT7的特异性上游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述lncRNA-KAT7下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所诉GAPDH的上游引物的序列如SEQ ID NO.4所示，所诉GAPDH的下游引物的序列如SEQ ID NO.5所示。

6.如权利要求1所述lncRNA-KAT7作为鼻咽癌药物靶点的用途。