CN112760377A - lncRNA 068在诊断或治疗恶性黑色素瘤方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种诊断恶性黑色素瘤的生物标志物，所述生物标志物为lncRNA 068。本发明还公开一种治疗恶性黑色素瘤的药物，其特征在于，所述药物具有过量lncRNA 068的表达，抑制了上皮间叶转化，影响恶性黑色素肿瘤的发生。本发明另外还lncRNA 068在诊断或治疗恶性黑色素瘤方面的应用，包括以下过程：材料准备：人来源的恶性黑色素肿瘤细胞系A357和高糖DMEM培养基；过表达实验；敲降实验的过程，本发明通过过表达实验和敲降实验发现lncRNA 068表达量的改变能够有效的诊断恶性黑色素肿瘤的发生，本发明提出lncRNA 068是一个可靠的恶性黑色素肿瘤的诊断标准。
Description
技术领域
本发明属于医疗研究技术领域，具体涉及一种lncRNA 068在诊断或治疗恶性黑色素瘤方面的应用。
背景技术
恶性黑色素瘤是因黑色素细胞异常增殖而引起的恶性程度高、预后较差的肿瘤，常发生于皮肤、消化系统、呼吸系统、生殖系统、粘膜等处。近年来恶性黑色素瘤已经成为发病率增长最快的肿瘤之一，年增长率为3％～5％。虽然早期手术去除病灶是恶性黑色素瘤最有效的治疗手段，但大多恶性黑色素瘤患者通常在就诊时已经是晚期，很多已经扩散至脑部、肺部、肝脏等，患者预后极差。因此，如何寻找一种有效的检测因子，能够较早期诊断疾病的发生，对于该疾病的治疗至关重要。
长链非编码RNA，Long Noncoding RNAs(lncRNAs),是一类不具备蛋白质编码功能的碱基数超过200bp的RNA。随着研究的深入，研究者发现lncRNAs参与了诸如细胞凋亡，增殖，分化，染色体重塑等的生理过程，且在癌症的发生发展过程中起到了重要的调节作用。
上皮间叶转化(epithelial–mesenchymal transition,EMT)过程指上皮到间质细胞的转化，它赋予细胞转移和入侵的能力，包括减少凋亡与衰老和促进免疫抑制，不仅在发育过程中起着关键的作用，而且还参与组织愈合、器官纤维化和癌症发生等过程。EMT与癌症形成过程密切相关。癌症的发生伴随着E-cadherin表达的减少，也是EMT的关键步骤。EMT的调控非常复杂，涉及众多生理功能过程及多条信号通路。其中，炎症反应的调控发生是常见的病理现象。
发明内容
本发明的目的是提供一种lncRNA 068在诊断或治疗恶性黑色素瘤方面的应用，以解决背景技术中所提出的缺陷或问题。
为实现上述发明目的，本发明的实施例提供一种诊断恶性黑色素瘤的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为lncRNA 068。
进一步的，lncRNA 068的低表达提示恶性黑色素瘤的可能性。
本发明的实施例还提供一种治疗恶性黑色素瘤的药物，其特征在于，所述药物具有过量lncRNA 068的表达，抑制了上皮间叶转化，影响恶性黑色素肿瘤的发生。
进一步的，所述药物包括lncRNA 068的特异性小干扰RNA的si-LncRNA 068-1、si-LncRNA 068-2、si-LncRNA 068-3中的一种或多种；其中，
si-LncRNA 068-1的序列为：GATTACCTCTTGCTAATAA；
si-LncRNA 068-2的序列为：GTTACCTTTCACAGTTCTA；
si-LncRNA 068-3的序列为：GGAGAAGATTCTAGATCCT。
优选的，所述药物还包括一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学上可接受的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、促进吸收剂、表面活性剂和增效剂。
本发明的实施例另外还提供lncRNA 068在诊断或治疗恶性黑色素瘤方面的应用，其特征在于，包括以下过程：
S1、材料准备：人来源的恶性黑色素肿瘤细胞系A357和高糖DMEM培养基；
S2、过表达实验：将细胞A357种植于六孔板中，每孔细胞种植密度一致，一孔为转染了pcDNA3.1+空质粒的空质粒对照组，一孔为转染了pcDNA3.1+-lncRNA 068过表达质粒的处理组；对空质粒对照组和处理组进行细胞迁移检测、划痕检测、细胞免疫荧光验证lncRNA 068是否对恶性黑色素肿瘤的发生有作用；通过western blot检测验证lncRNA 068是否通过影响炎症的发生及EMT过程影响恶性黑色素肿瘤的发生；
S3、敲降实验：将细胞种植于六孔板中，每孔细胞种植密度一致，一孔为对照组，一孔为转染了lncRNA 068的特异性小干扰RNA的小干扰实验组；三对特异性siRNA序列分别如下：
si-LncRNA 068-1:GATTACCTCTTGCTAATAA；
si-LncRNA 068-2:GTTACCTTTCACAGTTCTA；
si-LncRNA 068-3:GGAGAAGATTCTAGATCCT；
对对照组及小干扰实验组进行细胞迁移检测、划痕检测、细胞免疫荧光检测验证lncRNA 068是否对恶性黑色素肿瘤的发生有作用；通过western blot检测验证lncRNA 068是否通过影响炎症的发生及EMT过程而影响恶性黑色素肿瘤的发生。
其中，所述步骤S1中细胞总RNA提取及基因检测，包括以下步骤：使用Invitrogen公司Trizol试剂提取恶性黑色素肿瘤细胞A357的总RNA，再用Roche公司的逆转录试剂盒进行cDNA第一链的合成；采用Roche公司的SYBR Green Supermix来做基因表达分析，仪器为Bio-Rad公司的iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System；分析结果采用2-△△Ct法计算mRNA水平；以18S看家基因来校准mRNA的水平。
其中，所述步骤S2或S3中细胞迁移检测，包括以下过程：将处于指数生长期期的各组细胞分别重新接种到Transwell小室，小室上下两个空间培养液的血清浓度不同，上层是无血清培养，下层是高血清培养；常规培养，24小时后观察不同处理的组别细胞迁移能力的差异，从而确定该lncRNA 068是否对恶性黑色素肿瘤的发生有作用。
其中，所述步骤S2或S3中划痕检测，具体包括以下过程：将指数生长期的细胞进行胰酶消化，反复吹打，单个细胞百分率在95％以上，用丝裂霉素C处理A357细胞24小时后，用Pasteur吸管刮过细胞层，形成线性伤口；将细胞洗涤两次，以去除脱落的细胞和碎片；然后分别在0，24，48小时观察并测量划痕面积大小，从而确定该lncRNA 068是否对恶性黑色素肿瘤的发生有作用。
其中，所述步骤S2或S3中细胞免疫荧光检测，包括以下步骤：将种植在玻片上的细胞用4％PFA固定30分钟，PBS清洗两次，羊血清室温封闭30分钟，PBS清洗后，在4℃湿盒中一抗孵育过夜；室温避光下二抗孵育60分钟，PBS清洗后，封片，在荧光显微镜下观察，从而确定该lncRNA 068是否对恶性黑色素肿瘤的发生有作用。
其中，所述步骤S2或S3中细胞总蛋白质提取及western blot检测，包括以下步骤：
细胞总蛋白质提取：将培养恶性黑色素肿瘤细胞的六孔板中每孔都放入加有预冷细胞蛋白裂解液，将细胞全部转移到预冷的1.5ml EP管中，并在冰上充分裂解20分钟，随后冷冻离心20min，离心后将上清转至新的1.5ml离心管中；样品蛋白含量用Pierce公司的BCA蛋白定量试剂盒来测定，根据所得结果将所有样品的蛋白质浓度调至同一水平，加入上样缓冲液并混匀，于100℃煮沸5min，冷却至室温用于Western blot分析。
Western blot检测：将提取的总蛋白质样品用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并将凝胶中的蛋白转印至PVDF膜上；用含5％牛血清白蛋白的TBST缓冲液封闭转印结束的PVDF膜1小时；封闭后的PVDF膜与特异性一抗孵育4℃过夜；随后用TBST清洗PVDF膜三次，再与相应的二抗室温作用1小时，之后再用TBST清洗PVDF膜三次；最后PVDF膜用化学发光反应体系反应，并曝光至X光胶片；各蛋白表达水平的定量用软件Quantity-One分析。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明通过过表达实验和敲降实验发现lncRNA 068表达量的改变能够有效的诊断恶性黑色素肿瘤的发生，因此，本发明提出lncRNA 068是一个可靠的恶性黑色素肿瘤的诊断标准，为恶性黑色素肿瘤的诊断提供了新的诊断标志物。同时，本发明提出一种治疗恶性黑色素肿瘤的药物，该药物具有过表达lncRNA 068的作用，从而抑制肿瘤细胞的迁移过程，抑制了上皮间叶转化过程，并提出可能性药物中含有si-LncRNA068-1、si-LncRNA 068-2、si-LncRNA 068-3中的一种或多种，从而为治疗恶性黑色素肿瘤提供了新的方向。
附图说明
图1为本发明的实施例中lncRNA 068在恶性黑色素肿瘤中的表达情况图。
图2为本发明的实施例中过表达lncRNA 068抑制恶性黑色素肿瘤细胞的运动情况图。
图3为本发明的实施例中敲降lncRNA 068促进恶性黑色素肿瘤细胞的运动的情况图。
图4为本发明的实施例中过表达lncRNA 068抑制恶性黑色素肿瘤细胞的迁移的情况图。
图5为本发明的实施例中敲降lncRNA 068促进恶性黑色素肿瘤细胞的迁移的情况图。
图6为本发明的实施例中过量表达lncRNA 068抑制上皮间叶转化过程(EMT)的情况图。
图7为本发明的实施例中荧光定量PCR技术检测lncRNA 068表达量与炎症、上皮间叶转化过程(EMT)的关系图。
图8为本发明的实施例中Western blot检测验证lncRNA 068表达量与炎症、上皮间叶转化过程(EMT)的关系图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
lncRNA 068，1103bp，位于15号染色体上，首次被发现可能参与了甲状腺乳头瘤的发生过程。而且，本发明发现在恶性黑色素肿瘤的病理组织中，lncRNA 068的表达异常，因此，本发明推测该长链非编码RNA可能与恶性黑色素肿瘤发生有关。
实施例1
材料准备：人来源的恶性黑色素肿瘤细胞系A357和高糖DMEM培养基；对人来源的恶性黑色素肿瘤细胞系A357进行细胞总RNA提取及基因检测；其中，细胞总RNA提取及基因检测，使用Invitrogen公司Trizol试剂提取恶性黑色素肿瘤细胞A357的总RNA，再用Roche公司的逆转录试剂盒进行cDNA第一链的合成。采用Roche公司的SYBR Green Supermix来做基因表达分析，仪器为Bio-Rad公司的iQ5 Multicolor Real-Time PCR DetectionSystem。分析结果采用2-△△Ct法计算mRNA水平。以18S看家基因来校准mRNA的水平。所使用的引物序列如下：(引物方向均为5＇-3＇)
18S rRNA正向引物：AGCTCCAATAGCGTATATTAAAG；
18S rRNA负向引物：CGGTCCTATTCCATTATTCCTA；
LncRNA 068正向引物：CTGGCTCCATAACTGCTT；
LncRNA 068负向引物：TCTGAGAGGTTAAGTGACTTG；
IL6正向引物：TATGAGCGTTAGGACACTATT；
IL6负向引物：TAGCCATTTATTTGAGGTAAGC；
IL10正向引物：GGCTTCCTAACTGCTACA；
IL10负向引物：AACTCCTGACCTCAAGTG。
过表达实验：将细胞A357种植于六孔板中，每孔细胞种植密度一致，一孔为转染了pcDNA3.1+空质粒的空质粒对照组，一孔为转染了pcDNA3.1+-lncRNA 068过表达质粒的处理组。对空质粒对照组和处理组进行细胞迁移检测、划痕检测、细胞免疫荧光检测lncRNA068是否对恶性黑色素肿瘤的发生有作用；通过细胞总蛋白质提取及western blot检测验证lncRNA 068通过影响炎症的发生及EMT过程而影响恶性黑色素肿瘤的发生。
敲降实验：将细胞种植于六孔板中，每孔细胞种植密度一致，一孔为对照组，一孔为转染了lncRNA 068的特异性小干扰RNA的小干扰实验组；三对特异性siRNA序列分别如下：
si-LncRNA 068-1:GATTACCTCTTGCTAATAA；
si-LncRNA 068-2:GTTACCTTTCACAGTTCTA；
si-LncRNA 068-3:GGAGAAGATTCTAGATCCT。
对对照组及小干扰实验组进行细胞迁移检测、划痕检测、细胞免疫荧光检测lncRNA 068是否对恶性黑色素肿瘤的发生有作用；通过细胞总蛋白质提取及western blot检测验证lncRNA 068通过影响炎症的发生及EMT过程而影响恶性黑色素肿瘤的发生。
具体实验方法：
1、细胞迁移检测，包括以下过程：将处于指数生长期期的各组细胞分别重新接种到Transwell小室(Corning公司产品)，小室上下两个空间培养液的血清浓度不同，上层是无血清培养，下层是高血清培养。常规培养，24小时后观察不同处理的组别细胞迁移能力的差异，从而确定该lncRNA 068是否对恶性黑色素肿瘤的发生有作用。
2、划痕检测，包括以下过程：将指数生长期的细胞进行胰酶消化，反复吹打，单个细胞百分率在95％以上，用丝裂霉素C(10μg/ml)处理A357细胞24小时后，用Pasteur吸管刮过细胞层，形成线性伤口。将细胞洗涤两次，以去除脱落的细胞和碎片。然后分别在0，24，48小时观察并测量划痕面积大小，从而确定该lncRNA 068是否对恶性黑色素肿瘤的发生有作用。
3、细胞免疫荧光检测，包括以下过程：将种植在玻片上的细胞用4％PFA固定30分钟，PBS清洗两次，羊血清室温封闭30分钟，PBS清洗后，在4℃湿盒中一抗孵育过夜。室温避光下二抗孵育60分钟，PBS清洗后，封片，在荧光显微镜下观察，从而确定该lncRNA 068是否对恶性黑色素肿瘤的发生有作用。所有的抗体均购自于Cell Signaling Technology公司。
4、细胞总蛋白质提取及western blot检测，包括以下过程：将培养恶性黑色素肿瘤细胞的六孔板中每孔都放入加有预冷细胞蛋白裂解液(25mM Tris-HCl，pH 7.4；100mMNaF；50mM Na4P2O7；10mM Na3VO4；10mM EGTA；10mM EDTA；1％NP-40；10μg/ml Leupeptin；10μg/ml Aprotinin；2mM PMSF；20nM Okadaic acid)，将细胞全部转移到预冷的1.5ml EP管中，并在冰上充分裂解20分钟(其间在振荡器上震荡几次，益于裂解)，随后冷冻离心(13000rpm，4℃)20min，离心后将上清转至新的1.5ml离心管中。样品蛋白含量用Pierce公司的BCA蛋白定量试剂盒来测定，根据所得结果将所有样品的蛋白质浓度调至同一水平，加入上样缓冲液并混匀，于100℃煮沸5min，冷却至室温用于Western blot分析。
将提取的总蛋白质样品用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，并将凝胶中的蛋白转印至PVDF膜上。用含5％牛血清白蛋白的TBST(Tris-buffered saline solution/Tween)缓冲液封闭转印结束的PVDF膜1小时。封闭后的PVDF膜与特异性一抗孵育过夜(4℃)。随后用TBST清洗PVDF膜三次，再与相应的二抗室温作用1小时，之后再用TBST清洗PVDF膜三次。最后PVDF膜用化学发光反应体系(chemiluminescence assay system，Pierce)反应，并曝光至X光胶片(Kodak)。各蛋白表达水平的定量用软件Quantity-One(Bio-Rad)分析。所有的抗体均购自于Cell Signaling Technology公司。
实验结果：
本发明指出病理组织中lncRNA 068表达呈现下降趋势(图1)。为了更好的确定恶性黑色素肿瘤与lncRNA 068之间的关系，本发明在肿瘤细胞系A357中通过过表达实验进行过量表达及通过敲低实验敲低表达lncRNA 068，通过Transwell迁移与划痕形成实验中，本发明发现过量表达lncRNA 068后抑制肿瘤细胞的迁移过程，敲降后，结果相反(图2-图5)。在图2中，左侧为过量表达lncRNA 068后(0h、24h、48h)的划痕实验结果图，通过在A357细胞中过量表达lncRNA 068，结果显示lncRNA 068的高表达抑制了细胞的运动能力；右侧为左侧相应的统计结果图。而在图3中，左侧为敲降lncRNA 068后(0h、24h、48h)的划痕实验结果图，通过在A357细胞中降低lncRNA 068表达量，结果显示lncRNA 068的低表达促进了细胞的运动能力；右侧为相应的统计结果图。
在图4中，左侧为空白组和过表达lncRNA 068组的transwell实验结果图，通过在A357细胞中过量表达lncRNA 068，结果显示lncRNA 068的高表达抑制了细胞的迁移能力；右侧为左侧图相应的统计结果。而在图5中，左侧为空白组和敲降lncRNA 068组的transwell实验结果，通过在A357细胞中敲低lncRNA 068表达量，结果显示lncRNA 068的低表达促进了细胞的迁移能力；右侧为左侧相应的统计结果。从图2与图3的对比，图4与图5的对比结果可以看出，过量表达lncRNA 068后抑制肿瘤细胞的迁移过程；敲降后，结果相反，促进肿瘤细胞的迁移过程。
随后，本发明通过灵敏度更高的细胞免疫荧光实验发现过量表达lncRNA 068抑制了上皮间叶转化(epithelial–mesenchymal transition,EMT)过程(图6)。图6为通过细胞免疫荧光实验验证lncRNA 068表达量与EMT之间的关系。在图6中，上左图为对照组的免疫荧光图，上右图为lncRNA 068过量表达组的免疫荧光图，两者对比实验结果显示β-catenin表达量与lncRNA 068表达量成正比；下左图为对照组的免疫荧光图，下右图为lncRNA 068过量表达组的免疫荧光图；实验结果显示N-cadnin表达量与lncRNA 068表达量成正比；图6可以看出过量表达lncRNA 068抑制上皮间叶转化过程。因此，本发明认为lncRNA 068表达量的变化与恶性黑色素肿瘤的发生密切相关。
最后，本发明通过荧光定量PCR技术检测到lncRNA 068通过影响炎症的发生及EMT过程而影响恶性黑色素肿瘤的发生(图7)，在图7中，左侧图为过表达lncRNA 068在核酸水平上促进炎症因子IL10及EMT因子Claudin-1的表达。右侧图为降低lncRNA 068的表达在核酸水平上抑制炎症因子IL10及EMT因子Claudin-1的表达。随后，通过Western blot实验进一步验证lncRNA 068是通过影响炎症的发生及EMT过程而影响恶性黑色素肿瘤的发生(图8)，在图8中，左侧图为过表达lncRNA 068在蛋白水平上促进炎症因子IL10及EMT因子Claudin-1的表达。右侧图为降低lncRNA 068的表达在蛋白水平上抑制炎症因子IL10及EMT因子Claudin-1的表达情况图。
从上述实验本发明得出，lncRNA 068表达量的改变能够有效的诊断恶性黑色素肿瘤的发生，因此，lncRNA 068是一个可靠的恶性黑色素肿瘤的诊断标准。同时，本发明提出一种治疗恶性黑色素肿瘤的药物，该药物具有过表达lncRNA 068的作用，从而抑制肿瘤细胞的迁移过程，抑制了上皮间叶转化过程，并提出可能性药物中含有si-LncRNA 068-1、si-LncRNA 068-2、si-LncRNA 068-3中的一种或多种，从而为治疗恶性黑色素肿瘤提供了新的方向。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南通大学附属医院
<120> lncRNA 068在诊断或治疗恶性黑色素瘤方面的应用
<141> 2021-01-18
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> lncRNA 068的特异性小干扰RNA-1序列(si-LncRNA 068-1)
<400> 1
gattacctct tgctaataa 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> lncRNA 068的特异性小干扰RNA-2序列(si-LncRNA 068-2)
<400> 2
gttacctttc acagttcta 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> lncRNA 068的特异性小干扰RNA-3序列(si-LncRNA 068-3)
<400> 3
ggagaagatt ctagatcct 19
Claims (10)
1.一种诊断恶性黑色素瘤的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为lncRNA 068。
2.根据权利要求1所述的一种诊断恶性黑色素瘤的生物标志物，其特征在于，lncRNA068的低表达提示恶性黑色素瘤的可能性。
3.一种治疗恶性黑色素瘤的药物，其特征在于，所述药物具有过量lncRNA 068的表达，抑制了上皮间叶转化，影响恶性黑色素肿瘤的发生。
4.根据权利要求3所述的一种治疗恶性黑色素瘤的药物，其特征在于，包括lncRNA 068的特异性小干扰RNA的si-LncRNA 068-1、si-LncRNA 068-2、si-LncRNA 068-3中的一种或多种；其中，
si-LncRNA 068-1的序列为：GATTACCTCTTGCTAATAA；
si-LncRNA 068-2的序列为：GTTACCTTTCACAGTTCTA；
si-LncRNA 068-3的序列为：GGAGAAGATTCTAGATCCT。
5.lncRNA 068在诊断或治疗恶性黑色素瘤方面的应用，其特征在于，包括以下过程：
S1、材料准备：人来源的恶性黑色素肿瘤细胞系A357和高糖DMEM培养基；
S2、过表达实验：将细胞A357种植于六孔板中，每孔细胞种植密度一致，一孔为转染了pcDNA3.1+空质粒的空质粒对照组，一孔为转染了pcDNA3.1+-lncRNA 068过表达质粒的处理组；对空质粒对照组和处理组进行细胞迁移检测、划痕检测、细胞免疫荧光验证lncRNA068是否对恶性黑色素肿瘤的发生有作用；通过western blot检测验证lncRNA 068是否通过影响炎症的发生及EMT过程影响恶性黑色素肿瘤的发生；
S3、敲降实验：将细胞种植于六孔板中，每孔细胞种植密度一致，一孔为对照组，一孔为转染了lncRNA 068的特异性小干扰RNA的小干扰实验组；三对特异性siRNA序列分别如下：
si-LncRNA 068-1:GATTACCTCTTGCTAATAA；
si-LncRNA 068-2:GTTACCTTTCACAGTTCTA；
si-LncRNA 068-3:GGAGAAGATTCTAGATCCT；
对对照组及小干扰实验组进行细胞迁移检测、划痕检测、细胞免疫荧光检测验证lncRNA 068是否对恶性黑色素肿瘤的发生有作用；通过western blot检测验证lncRNA 068是否通过影响炎症的发生及EMT过程而影响恶性黑色素肿瘤的发生。
6.根据权利要求5所述的lncRNA 068在诊断或治疗恶性黑色素瘤方面的应用，其特征在于，所述步骤S1中细胞总RNA提取及基因检测，包括以下步骤：使用Invitrogen公司Trizol试剂提取恶性黑色素肿瘤细胞A357的总RNA，再用Roche公司的逆转录试剂盒进行cDNA第一链的合成；采用Roche公司的SYBR Green Supermix来做基因表达分析，仪器为Bio-Rad公司的iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System；分析结果采用2-△△Ct法计算mRNA水平；以18S看家基因来校准mRNA的水平。
7.根据权利要求5所述的lncRNA 068在诊断或治疗恶性黑色素瘤方面的应用，其特征在于，所述步骤S2或S3中细胞迁移检测，包括以下过程：将处于指数生长期期的各组细胞分别重新接种到Transwell小室，小室上下两个空间培养液的血清浓度不同，上层是无血清培养，下层是高血清培养；常规培养，24小时后观察不同处理的组别细胞迁移能力的差异，从而确定该lncRNA 068是否对恶性黑色素肿瘤的发生有作用。
8.根据权利要求5所述的lncRNA 068在诊断或治疗恶性黑色素瘤方面的应用，其特征在于，所述步骤S2或S3中划痕检测，具体包括以下过程：将指数生长期的细胞进行胰酶消化，反复吹打，单个细胞百分率在95％以上，用丝裂霉素C处理A357细胞24小时后，用Pasteur吸管刮过细胞层，形成线性伤口；将细胞洗涤两次，以去除脱落的细胞和碎片；然后分别在0，24，48小时观察并测量划痕面积大小，从而确定该lncRNA 068是否对恶性黑色素肿瘤的发生有作用。
9.根据权利要求5所述的lncRNA 068在诊断或治疗恶性黑色素瘤方面的应用，其特征在于，所述步骤S2或S3中细胞免疫荧光检测，包括以下步骤：将种植在玻片上的细胞用4％PFA固定30分钟，PBS清洗两次，羊血清室温封闭30分钟，PBS清洗后，在4℃湿盒中一抗孵育过夜；室温避光下二抗孵育60分钟，PBS清洗后，封片，在荧光显微镜下观察，从而确定该lncRNA 068是否对恶性黑色素肿瘤的发生有作用。
10.根据权利要求5所述的lncRNA 068在诊断或治疗恶性黑色素瘤方面的应用，其特征在于，所述步骤S2或S3中细胞总蛋白质提取及western blot检测，包括以下步骤：
细胞总蛋白质提取：将培养恶性黑色素肿瘤细胞的六孔板中每孔都放入加有预冷细胞蛋白裂解液，将细胞全部转移到预冷的1.5mlEP管中，并在冰上充分裂解20分钟，随后冷冻离心20min，离心后将上清转至新的1.5ml离心管中；样品蛋白含量用Pierce公司的BCA蛋白定量试剂盒来测定，根据所得结果将所有样品的蛋白质浓度调至同一水平，加入上样缓冲液并混匀，于100℃煮沸5min，冷却至室温用于Western blot分析；
Western blot检测：将提取的总蛋白质样品用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并将凝胶中的蛋白转印至PVDF膜上；用含5％牛血清白蛋白的TBST缓冲液封闭转印结束的PVDF膜1小时；封闭后的PVDF膜与特异性一抗孵育4℃过夜；随后用TBST清洗PVDF膜三次，再与相应的二抗室温作用1小时，之后再用TBST清洗PVDF膜三次；最后PVDF膜用化学发光反应体系反应，并曝光至X光胶片；各蛋白表达水平的定量用软件Quantity-One分析。
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| CN111088361A (zh) * | 2020-01-20 | 2020-05-01 | 西安交通大学医学院第一附属医院 | 一种可用于恶性黑素瘤早期诊断的长链非编码rna标志物及其应用 |
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