CN116159154A - Kcp2基因及其慢病毒载体系统的应用 - Google Patents

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CN116159154A CN202310159761.0A CN202310159761A CN116159154A CN 116159154 A CN116159154 A CN 116159154A CN 202310159761 A CN202310159761 A CN 202310159761A CN 116159154 A CN116159154 A CN 116159154A
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孙萍萍
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Abstract

本发明公开了KCP2基因及其慢病毒载体系统的应用，涉及生物医药技术领域。本发明的KCP2基因和KCP2的慢病毒载体系统用于制备用于治疗胶质瘤的药物，该慢病毒载体系统可高效抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，操作简单，敲除效率高；本发明还公开了将KCP2基因/蛋白作为胶质瘤精准治疗的靶点，制备用于胶质瘤的诊断、治疗或预后判断的试剂盒，也用于制备靶向药物。

Description

KCP2基因及其慢病毒载体系统的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，更具体地说，涉及KCP2基因(KCP2基因ID：200185，蛋白ID：Q8N6L1)及其慢病毒载体系统的应用。
背景技术
胶质瘤发生于神经外胚层，恶性程度高，瘤组织内血管丰富，易于转移和复发，预后较差。目前胶质瘤的治疗标准方法为手术切除和放疗、化疗组合，即术后采用Stupp标准同步放、化疗和替莫唑胺(TMZ)辅助化疗。尽管如此，胶质瘤呈浸润性生长，与周围正常脑组织间无明显的分界，手术难以全部切除，并且易产生化疗耐药性，其复发率仍然较高，因此，急需寻找新的有效策略来走出这个困境。随着二代、三代测序、单细胞测序、蛋白组学，代谢组学等高通量技术的应用，靶向治疗已成为除手术、放疗、化疗之外的治疗恶性肿瘤的新方法。靶向治疗通过干扰癌症的发生和肿瘤生长所需的特定靶向分子来阻止癌细胞的生长，特异性强、疗效明显、不良反应小，但靶向治疗不可避免的需要我们寻找特异性的分子标记物作为治疗靶点。胶质瘤的发展是一个多基因参与的过程，存在众多潜在的治疗靶点。目前，还没有明确效果的胶质瘤检测试剂盒上市，因而，迫切需要研发针对有效靶点的检测试剂及针对性药物。
角质细胞相关蛋白2(KRTCAP2,KCP2)位于人类1号染色体q22染色体上，是具有多个跨膜区的内质网膜蛋白，是寡糖转移酶(OST)复合物的亚单位，催化特定的聚糖从脂质载体胆碱磷酸酯转移到新生多肽链中Asn-X-Ser/Thr的天冬酰胺残基上，是蛋白质N-糖基化的初始步骤，可能参与淀粉样β前体蛋白N-糖基化。在肝癌中，KCP2蛋白在肝癌组织中的表达高于其对照非瘤组织，高表达KCP2蛋白的患者呈现了较差的预后，然而，KCP2与胶质瘤的关系目前还不明确，其在胶质瘤中的表达和具体调节机制也还不清楚。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供KCP2基因及其慢病毒载体系统的应用，用于制备治疗胶质瘤的药物。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
KCP2基因在制备用于治疗胶质瘤的药物中的应用。
进一步地，所述的治疗胶质瘤为抑制细胞的增殖。
进一步地，所述的治疗胶质瘤为抑制细胞的迁移。
进一步地，所述的治疗胶质瘤为抑制细胞的侵袭。
用于胶质瘤的诊断、治疗或预后判断的生物标志物，其特征在于，为KCP2基因。
用于胶质瘤的诊断、治疗或预后判断的试剂盒，其特征在于，含有KCP2基因序列。
KCP2的慢病毒载体系统在制备治疗胶质瘤的药物中的应用，所述的KCP2慢病毒载体系统的序列如下：
KCP2-sh1：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'，
KCP2-sh2：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'，
KCP2-sh3：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'。
进一步地，所述的KCP2慢病毒载体系统为：以KCP2基因作为靶点抑制胶质瘤细胞中KCP2蛋白表达。
进一步地，所述的KCP2慢病毒载体系统为：以KCP2基因作为靶点敲除胶质瘤细胞中KCP2基因。
进一步地，所述的KCP2慢病毒载体系统为：以KCP2基因作为靶点沉默胶质瘤细胞中KCP2基因。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
1)本发明慢病毒载体系统可高效敲除在胶质瘤中过表达的KCP2基因，抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，该系统操作简单，敲除效率高。
2)KCP2基因/蛋白是胶质瘤精准治疗的一个靶点，在制备用于治疗胶质瘤等高表达KCP2基因/蛋白的疾病靶向药物、用于诊断或预后判断的试剂盒。
附图说明
图1为KCP2在胶质瘤外周血及组织中的表达量图(图A为Elisa检测9例胶质瘤患者及8例正常人血清中KCP2的表达情况图，胶质瘤患者血清中KCP2的表达显著低于非瘤体检人群血清；B为多重免疫荧光定量分析胶质瘤组织芯片中KCP2的差异表达情况，肿瘤组织中KCP2的表达显著高于非瘤脑组织)；
图2为免疫荧光检测KCP2在胶质瘤及对照非瘤脑组织中的表达结果图(标尺＝50um)(图A为KCP2在胶质瘤组织中的荧光染色图；B为KCP2在非瘤脑组织中的免疫荧光染色图)；
图3为KCP2蛋白差异表达与胶质瘤患者预后的关系图；
图4为Western Blot检测KCP2在胶质瘤细胞(U87mg细胞、T98G细胞、U251细胞、Hs683细胞)中的表达图(A)与荧光定量检测KCP2在胶质瘤细胞中的表达图(B)；
图5为慢病毒载体结构图；
图6为Western Blot检测(A)以及荧光定量检测(B)KCP2在U251细胞敲除该基因以及在T98G细胞中表达该基因后的表达图；
图7为敲除KCP2基因后对胶质瘤细胞增殖功能的影响图(A)与过表达KCP2基因后对胶质瘤细胞增殖功能的影响图(B)；
图8为敲除KCP2基因后对胶质瘤细胞迁移功能的影响图(A)与过表达KCP2基因后对胶质瘤细胞迁移功能的影响图(B)；
图9为敲除KCP2基因后对胶质瘤细胞侵袭功能的影响图(A)与过表达KCP2基因后对胶质瘤细胞侵袭功能的影响图(B)。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中如无特殊说明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
从南通大学附属医院收集2012.3-2018.3年间胶质瘤组织样本，其中新鲜冰冻胶质瘤组织307例，非瘤脑组织28例。这些组织样本均是由福尔马林固定，石蜡包埋，并根据最新的WHO诊断标准分级。所有的病例均是由两名病理学专家进行病理组织学确定，患者术前没有接受过免疫治疗、化疗或放疗，临床病例资料详细完整。
以下实施例中使用的主要试剂为：
Opal 7色免疫组化试剂盒：美国Perkin Elmer公司。
兔抗人KCP2单克隆抗体：Abcam公司。
辣根过氧化物酶标记鼠兔二抗(免疫荧光实验用)：美国Perkin Elmer公司。
抗体稀释液/封闭液：美国AKOYA公司。
AR6修复液：美国AKOYA公司。
胶质瘤细胞株购自中科院上海细胞库。
DMEM培养基、胎牛血清：美国Gibco公司。
BCA蛋白测定试剂盒：碧云天生物技术公司。
PVDP膜：Merk-Millipore公司。
GAPDH抗体：美国Proteintech公司。
ECL显影液：Vazyme公司。
细胞冻存液：新赛美公司。
DMEM完全培养液：分别加入DMEM与胎牛血清，配成终浓度为含有10％FBS的完全培养基，4℃保存。
1×TBST 1L：取Tris2.42g、NaCl8.0g、Tween-200.5mL，混合溶解，定容至1L，常温保存。1×转膜Buffer 1L：甘氨酸14.4g、Tris3.03g，加适量双蒸水搅拌溶解，再加200mL无水甲醇，定容至1L，混合均匀(用时配制)。
封闭液100mL：取脱脂奶粉5g，加入100mL1×TBS，混合溶解即可(需用时配制)。
Elisa包被稀释液：索莱宝公司。
Elisa封闭液：5％小牛血清/PBS溶液(小牛血清5mL，1*PBS(pH7.4)95mL)。
洗涤液PBST：NaCl 0.8g，KH2PO40.02g，Na2HPO4·12H2O 0.29g，KCl 0.02g，Tween200.05mL，叠氮钠0.01g，加双蒸水至100mL，调至pH7.4。
样本稀释液：NaCl 0.8g，KH2PO40.02g，Na2HPO4·12H2O 0.29g，KCl 0.02g，叠氮钠0.01g，加双蒸水至100mL，调至pH7.4。
酶标二抗(羊抗兔)稀释比1:2000。
底物液A：TMB20mg，无水乙醇10mL，加双蒸水至100mL。
底物液B(0.1moL/L柠檬酸-0.2moL/L磷酸二氢钠缓冲液，pH5.0-5.4)，Na2HPO41.46g，柠檬酸0.933g，0.75％过氧化氢尿素0.64mL，加三蒸水至100mL，调至pH5.0-5.4。
底物A和B按1：1混合即成TMB-过氧化氢尿素溶液。
终止液：索莱宝公司。
以下实施例中使用的主要仪器如下：
组织芯片制作仪：韩国Quick Ray(UNITMA)公司；倒置显微镜：日本Olympus公司；凝胶成像系统：中国天能公司；多功能酶标仪：美国Thermo公司；多光谱病理扫描系统：美国Perkin Elmer公司。
实施例1
直接法酶联免疫吸附(Elisa)：
将所用抗原用包被稀释液稀释空白对照，阴性对照，并设置，每孔抗原加入100uL，置于4℃过夜后弃去孔中液体；5％小牛血清置37℃封闭1h，封闭结束后用洗涤液满孔洗涤3遍，每次3min，倾去液体后在吸水纸上拍干；将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每样品至少3个复孔，每孔100μL，置于37℃孵育1h，用满孔洗涤3遍，每次3min；酶标抗体根据酶结合物提供商提供的参考工作稀释度进行，37℃，30-60min之间(短于30min往往结果不稳定)，每孔加100μL，洗涤同前；加入TMB-过氧化氢尿素溶液，每孔100μL，置37℃避光放置3-5分钟；每孔加入终止液50μL终止反应，于15min内测定实验结果，检测450nm波长处吸光度值，进行读数，并计算。
结果如图1所示，胶质瘤患者外周血中KCP2表达水平稍低于健康人。
实施例2
1、制作组织芯片
1)病理组织切片
取手术切除新鲜组织块(厚度0.5cm)，放入预先配好的10％福尔马林溶液固定，随后，梯度浓度酒精脱水至二甲苯透明；将透明的组织块置于溶化的石蜡中，待石蜡完全浸入组织块后进行包埋；冷却凝固后连续切片(厚度5-8um)，随后置于45℃恒温箱中烘干。
2)HE染色
将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟；盐酸酒精及氨水分色；流水冲洗1小时后，置入蒸馏水片刻；70％，75％，90％酒精中梯度脱水各5分钟；放入伊红染色液染色2-3分钟；染色后的切片经梯度酒精脱水，再经二甲苯使切片透明，滴上中性树胶，盖上盖玻片封固后，在显微镜下观察，确定肿瘤区域。
3)1：1混合石蜡与蜂蜡，制作空白受体蜡块，在蜡块上设计10×7孔，共350点组织阵列，然后用组织芯片仪制成TMA空白蜡块；根据HE染色切片的镜检结果，将供体蜡块在标记的点上选取最有代表性的肿瘤区域，取直径2mm的组织块，每例各取1个芯；将取好的组织芯转移到受体蜡块的孔中，并取相应非瘤脑组织作为对照；组织阵列块在55℃的恒温烤箱中加热融合10分钟，在快融化之前放至室温冷却，使受体蜡块与供体组织融为一体；将组织芯片置于4℃条件下冷冻4小时左右，随后用全自动组织切片机对组织阵列块进行修正，速度为20mm/转，等修到所有组织芯完全曝露；用切片机对组织阵列块进行切片，将连续切片分别漂在凉水中，使其自然展开，再将切片转移至45℃温水中展片2分钟左右，待展开后将其贴在经过防脱片处理的载玻片上晾干；将切片置于60℃的环境下烤片3分钟，58℃继续烤片16h；将做好的组织芯片保存于切片盒，置于冰箱-20℃保存备用。
2、免疫荧光染色
(1)将切好的石蜡组织芯片放置在烘片仪上70℃烤片1h，接着60℃烘片1h；(2)将已干燥的组织芯片浸于二甲苯中5分钟2次，取出后进行梯度酒精脱水：100％乙醇5分钟，95％乙醇5分钟，75％乙醇5分钟，蒸馏水冲洗组织芯片；(3)将组织芯片置于耐高温切片架上，置于PH为6.0的AR6修复液，高温抗原修复：100％功率加热2.5min，接着20％功率加热15min；(4)自然冷却至室温后，取出蒸馏水中的芯片，用PBS冲洗3次，每次2分钟，用免疫组化笔在组织芯片上画出大概的组织范围，接着滴加一抗封闭液200μL，封闭10分钟；(5)滴加200μL的兔抗人KCP2单克隆抗体工作液(稀释比例为1：100)于组织芯片上，在4℃条件下过夜；(6)第二天，取出组织芯片，复温半小时，回收一抗后用PBS冲洗2分钟，重复3次，之后取出甩干；(7)在组织芯片上滴加200μL的二抗工作液，于室温孵育10分钟，接着用PBS冲洗2分钟，重复3次，之后取出甩干；(8)配制所需的波长的荧光染料，向组织芯片上滴加配好的荧光染料，避光室温孵育10min，接着用PBS冲洗2分钟，重复3次；(9)如要接着孵育第二个抗体，则进行高温抗原修复，方法如上述；如不再孵育抗体，则在干燥透明后，用DAPI封片。
结果如图2所示，显微镜下观察免疫荧光染色结果，细胞相应部位出现染色作为阳性表现。使用Vectra 3成像软件在20倍放大倍率下捕获每个样本。使用inForm 26.1.0(Perkin Elmer)对图像进行分析和评分，并为每个细胞设置阳性或阴性细胞的阈值。计算每个区域的细胞百分比并进行评分(0-100)。KCP2的最终染色得分为染色强度与阳性细胞染色面积的乘积。KCP2表达分数的分界点由X-tile软件根据生存时间及生存状态得出。评分如下：0-39.50为低表达或无表达，39.51-100为高表达。所有数据均用统计软件SPSSV.25.0处理，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，KCP2表达与胶质瘤患者的预后关系分析用Kaplan-Meier生存分析，所有检验结果以P<0.05为差异有统计学意义。结果如图3所示，KCP2在胶质瘤组织中表达低于非瘤脑组织，在肿瘤患者中，高表达KCP2的患者胶质瘤级别高，组织病理学分级恶性程度更高，患者生存期短，预后差。
实施例3
1、胶质瘤细胞系包含：T98G细胞、U87mg细胞、U251细胞、Hs683细胞，分别用含10％胎牛血清的DMEM和MEM完全培养基培养，培养箱内保持温度37℃、5％的CO2湿饱和度，常规传代培养，2-3天换液一次，选取处于对数生长期的细胞进行实验。
2、细胞总蛋白提取
(1)从37℃培养箱取出相应细胞；(2)弃培养基，用预冷的PBS洗涤细胞2次，弃PBS，用移液器将残留的PBS溶液吸取干净，以免稀释细胞蛋白；(3)根据细胞培养瓶的大小和细胞的生长密度，加入RIPA细胞裂解液，后用细胞刮子收集细胞，转移至干净的EP管中；(4)将刮下的细胞蛋白在冰上充分裂解20-30分钟；(5)4℃离心(12000r×15min)；(6)取上清，用BCA法测细胞蛋白的浓度，后加入loading buffer吹打混匀，95℃煮沸5分钟，分装，保存在-80℃冰箱以备用。
3、蛋白免疫印迹(Westernblot)
(1)制备聚丙烯酰胺凝胶(5％浓缩胶，12.5％分离胶)；(2)将玻璃板清洗干净，倾斜晾干，组装玻璃板，加入分离胶，加至距玻璃板上端2cm处，立即加异丙醇液封，放置30min，等分离胶凝固后轻轻倒掉上层异丙醇，再加入浓缩胶至玻璃板顶部，立即插入梳子，静置30min，至浓缩胶凝固；(3)将配置好的胶放入电泳槽内，用电泳缓冲液将内部加满，将Protein Maker及提取的蛋白样品上样后，将剩余的电泳液加入，接通电源，调节电压80V，Protein marker分开后，再将电压调至100V，结束后将胶取出，切取目的条带；(4)剪取大小合适的PVDF膜，先在甲醇中极化30s左右，再放入转膜液中；同时取海绵及滤纸将它们放入转膜液中浸泡20min左右，安装转膜装置，排放顺序为：阴极碳板+海绵+滤纸+胶+PVDF膜+滤纸+海绵+阳极碳板；将转膜装置放入转移槽内，加入冰袋，并加入转膜液至满；接通电源，按恒流调节300mA湿转0.5h，转膜需全程在冰盒中进行；(5)转膜结束后，将PVDF膜放入封闭液(脱脂奶粉5g溶解在100mLTBST中)，摇床上以80r/min转速室温封闭2h；(6)封闭结束后，按一抗稀释比例用封闭液配制一抗稀释液，PVDF膜上均匀滴加稀释的一抗，4℃孵育过夜；(7)第二天，TBST洗膜3次，每次15min；洗膜结束后，按二抗稀释比例用TBST配制二抗稀释液，PVDF膜上均匀滴加稀释的二抗，室温1.5h；孵育结束后，TBST洗膜3次，每次15min；(8)洗膜结束后将PVDF膜用滤纸吸干，平铺于显影仪相应位置，ECL发光液在使用前等比例混合A液和B液，均匀滴加于PVDF膜上，凝胶成像系统拍照、保存。按上述方法分别提取4种胶质瘤细胞的蛋白，用Western blot检测4种胶质瘤细胞中KCP2的表达情况，筛选出高低表达细胞。
结果如图4所示，KCP2在U251胶质瘤细胞中表达相对较高，在T98G胶质瘤细胞中表达相对较低。
3、筛选基因敲除阳性克隆
1)根据KCP2基因序列，由广州复能基因有限公司制成shRNA，特异性靶向KCP2基因的shRNA对应的序列如下所示：
KCP2-sh 1：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'，
KCP2-sh 2：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'，
KCP2-sh 3：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'。
并构建慢病毒载体系统(图5)。
2)在12孔板接种待感染的目的细胞，待细胞完全铺开，汇合度约为60–70％，从相关文献查询目的细胞的最小致死浓度，在该浓度附近设置多个浓度梯度；72小时后，选取致死的最低浓度为筛药浓度。
3)细胞慢病毒感染：在6孔板中接种待感染目的细胞，待细胞完全铺开，汇合度约为60-70％，且细胞状态较好，即可开始利用病毒转染细胞；根据慢病毒原液滴度计算感染时加入的慢病毒原液体积，加入助染试剂Polybrene(10ug/ml),在工作台上轻柔混匀；感染12-16小时后，换液继续培养，同时观察细胞状态是否有异常，在倒置荧光显微镜观察荧光并拍照；感染72-96小时后对感染的细胞进行药物筛选，以收集较多感染成功的细胞。
4)单克隆的制备和生长：有限稀释法稀释细胞至10块96孔板中，37℃，CO2培养箱中静置培养；一周后观察单克隆生长情况，约两周后将单克隆转移至48孔中扩大培养；依次将单克隆转移至24孔板及12孔板中扩大培养；当每株单克隆扩大培养至2个12孔时，取出一个孔的细胞，裂解提蛋白，使用Western blot检测基因敲除的单克隆株。
结果如图6所示，与未处理组相比，经慢病毒处理后的KCP2蛋白相对表达量明显降低，表明KCP2蛋白表达被有效地抑制了。
4、细胞增殖(CCK-8实验)
消化收集转染后48h的各组细胞，离心待用；用完全培养基重悬细胞，将细胞密度调整至30000个/mL；每孔加入100μL细胞悬液，每组设6个复孔，轻轻拍打96孔板，使细胞分布均匀；待细胞贴壁后(约6-8h)，分别在0、24、48、72、96h加入CCK-8试剂(每孔100μL)，轻轻拍打96孔板，放入培养箱2h后取出，在酶标仪上检测450nm下的吸光度值；用GraphpadPrism 9统计处理所测数据，绘制折线图。
结果如图7所示，显示经KCP2敲除后U251细胞增殖活力下降，而过表达KCP2后的T98G细胞增殖活力明显升高。
5、细胞迁移(Transwell小室法)
消化收集转染后48h的各组细胞，离心待用；用基础培养基重悬细胞，调整细胞密度至5×104/mL；在24孔板中加入800μL的完全培养基，放入小室，充分浸润，取100μL的细胞悬液加入上室；常规培养24h后取出，1×PBS洗2次，4％的多聚甲醛固定20min，1×PBS洗2次；在24孔板中加入500μL的结晶紫染液，放入小室，10min后取出，1×PBS洗2次，倒置小室，用棉签轻轻擦去上室内未穿过去的细胞；
结果如图8所示，用倒置显微镜观察，结果显示敲除KCP2(sh-KCP2)后U251细胞的迁移能力下降，而过表达KCP2(oe-KCP2)后T98G细胞的迁移能力提高。
6、细胞侵袭(Transwell小室法)
先配置水凝胶(50μL水凝胶混合于350μL稀释液中，再加入50μL基础培养基混合)，加入Transwell小室的上室，每个100μL，避免产生气泡；消化收集转染后48h的各组细胞，离心待用；用基础培养基重悬细胞，调整细胞密度至5×104/mL；在24孔板中加入800μL的完全培养基，放入小室，充分浸润，取100μL的细胞悬液至上室；常规培养24-48h后取出，1×PBS洗2次，4％的多聚甲醛固定20min，1×PBS洗2次；在24孔板中加入500μL的结晶紫染液，放入小室，10min后取出，1×PBS洗2次，倒置小室，用棉签轻轻擦去上室内未穿过去的细胞；
结果如图9所示，用倒置显微镜观察结果，结果显示敲除KCP2后U251细胞的侵袭能力下降，而过表达KCP2后T98G细胞的侵袭能力提高。

Claims (10)

1.KCP2基因在制备用于治疗胶质瘤的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的治疗胶质瘤为抑制细胞的增殖。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的治疗胶质瘤为抑制细胞的迁移。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的治疗胶质瘤为抑制细胞的侵袭。
5.用于胶质瘤的诊断、治疗或预后判断的生物标志物，其特征在于，为KCP2基因。
6.用于胶质瘤的诊断、治疗或预后判断的试剂盒，其特征在于，含有KCP2基因序列。
7.KCP2的慢病毒载体系统在制备治疗胶质瘤的药物中的应用，所述的KCP2慢病毒载体系统的序列如下：
KCP2-sh1：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′，
KCP2-sh2：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′，
KCP2-sh3：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的KCP2慢病毒载体系统以KCP2基因作为靶点抑制胶质瘤细胞中KCP2蛋白表达。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的KCP2慢病毒载体系统以KCP2基因作为靶点敲除胶质瘤细胞中KCP2基因。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的KCP2慢病毒载体系统以KCP2基因作为靶点沉默胶质瘤细胞中KCP2基因。
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