CN1683010A - 人乳头瘤病毒型双价病毒样颗粒混合蛋白抗原及构建方法 - Google Patents

Abstract

人乳头瘤病毒型双价病毒样颗粒混合蛋白抗原及构建方法，它涉及一种人乳头瘤病毒型双价病毒样颗粒混合体及该混合体的构建方法。本发明包含一种致宫颈癌病毒HPV16的L1抗原和一种尖锐湿疣病毒HPV11的L1抗原，它按照下述方法构建双价病毒样颗粒混合蛋白抗原：首先利用分子生物学方法从尖锐湿疣组织中克隆HPV11L1基因；再将从宫颈癌克隆的HPV16L1基因与HPV11L1基因双表达于杆状病毒昆虫细胞表达系统，构建重组病毒株Bacmid/HPV16－HPV11L1。通过上述构建所得的重组蛋白经动物免疫验证具有良好的免疫原性和免疫反应性，可作为基因工程多价疫苗的候选抗原，用于预防尖锐湿疣和宫颈癌。

Description

人乳头瘤病毒型双价病毒样颗粒混合蛋白抗原及构建方法

技术领域：

本发明涉及一种人乳头瘤病毒型双价病毒样颗粒混合体及该混合体的构建方法。

背景技术：

尖锐湿疣作为性传播疾病严重威胁人类健康，在我国的发病率已占性传播性疾病的首位。由于缺乏理想的治疗方法，尖锐湿疣的复发率高达30％到70％。因此寻求理想的治疗和预防手段应成为我国迫在眉睫的大事。在我国宫颈癌发病率在妇科肿瘤中占第二位，每年新发病例约13万。作为发展中国家的中国，由于临床脱落细胞筛查不能普及，致使宫颈癌的发病率仍居高不下。

人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)的高危型别HPV16型引起宫颈癌(约50％)；低危型别HPV11型主要引起尖锐湿疣。HPV至今不能人工增殖，其核酸有潜在致癌性，所以研究预防性基因工程疫苗的意义重大。目的基因的选择主要为L1基因(具有保守性)，L1蛋白可自组装成类病毒颗粒(Virus like partic1es，VLPs)，携带有与天然病毒相近的抗原表位，可以刺激机体产生保护性中和抗体，可预防HPV感染。由于HPV型别多，型别间无交叉保护，HPV多价基因工程疫苗可提供多重保护。

发明内容：

本发明的目的是提供一种可作为双价预防疫苗用以预防宫颈癌和尖锐湿疣的人乳头瘤病毒型双价病毒样颗粒混合蛋白抗原及构建方法。本发明的人乳头瘤病毒型双价病毒样颗粒混合蛋白抗原包含一种致宫颈癌病毒HPV16的L1抗原和一种尖锐湿疣病毒HPV11的L1抗原，它按照下述方法进行构建：利用分子生物学方法从尖锐湿疣组织中克隆HPV11L1基因，将HPV16L1基因与HPV11L1基因双表达于杆状病毒昆虫细胞表达系统，构建重组病毒株Bacmid/HPV16-HPV11L1，并使其在杆状病毒-昆虫表达系统进行表达。表达产物经电镜证实存在较大量VLP。SDS-PAGE和Western blot分析鉴定了HPV16L1和HPV11L1病毒样颗粒的表达量及特异性。在免疫小鼠后，小鼠可获得针对16型和11型两种型别的乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1的血清抗体。双价病毒样颗粒混合体的制备为研制同时预防宫颈癌和尖锐湿疣等多种疾病的HPV16-11型基因工程多价疫苗奠定基础。通过上述构建所得的重组蛋白经验证具有良好的免疫原性和免疫反应性，可作为基因工程多价疫苗的候选抗原，用于预防尖锐湿疣和宫颈癌。

具体实施方式：

具体实施方式一：本实施方式的双价病毒样颗粒混合蛋白抗原包含一种致宫颈癌病毒HPV16的L1抗原和一种尖锐湿疣病毒HPV11的L1抗原。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是，它还包含一种载体，所述载体为Bacmid质粒。

具体实施方式三：本实施方式按照下述方法构建双价病毒样颗粒混合蛋白抗原：利用分子生物学方法从尖锐湿疣组织中克隆HPV11L1基因，将HPV16L1基因与HPV11L1基因双表达于杆状病毒昆虫细胞表达系统，构建重组病毒株Bacmid/HPV16-HPV11L1。

具体实施方式四：本实施方式将对本发明的技术措施作进一步的说明。

一、重组杆状病毒转染载体的构建、转染和表达：

用PCR方法从尖锐湿疣组织标本中扩增HPV11L1基因，构建pSP73-HPV11L1重组质粒，并对HPV11L1基因进行测序；从宫颈癌克隆构建的pCR2.1-HPV16L1重组质粒中亚克隆HPV16L1基因，构建pBluescriptM13-16L1重组质粒，并对HPV16L1基因进行测序验证；再将HPV11L1和HPV16L1基因片段插入重组杆状病毒转移质粒pFastBacDUAL，构建HPV16型和11型L1基因双价重组杆状病毒转移质粒pFastBacDUAL-HPV16L1-HPV11L1，然后转染杆状病毒线状DNA并用之感染SF-9昆虫细胞使HPV16L1和HPV11L1基因得到表达。昆虫细胞Sf9培养3～5天后收获细胞，经离心、超声破碎和CsCl密度梯度离心后收集1.29g/ml密度带，并进行透析。

HPV16型和11型L1基因双价重组杆状病毒转移质粒pFastBacDUAL-HPV16L1-HPV11L1中，其含有的HPV11L1和HPV16L1的氨基酸序列详见序列表。

二、制备重组杆状病毒转移质粒和重组Bacmid：

1、构建双价重组杆状病毒转移质粒pFastBacDual-HPV16L1-HPV11L1：

从pSP73-HPV11L1质粒酶切取L1基因，从pBluescript M13-16L1取HPV16L1基因；将两段基因片段分别插入重组杆状病毒转移质粒pFastBacDUAL，16L1片段插入到Ppolh强启动子下游，11L1片段插入p10弱启动子之下，构建HPV16型和11型L1基因双价重组杆状病毒转移质粒pFastBacDUAL-HPV16L1-HPV11L1，酶切鉴定证实构建成功。

2、制备重组Bacmid：

a、位点特异性转座：

①制备DH10Bac感受态细菌：将提取的pFastBacDUAL-HPV16L1-11L1质粒2μl(约5ng)加至新制备的DH10Bac感受态细胞中，轻弹管底混匀；

②冰浴30min，在42℃热休克45s，冰浴2min，加入900μl SOB液体培养基混匀，置于37℃，以1 50rpm振荡培养4h；

③将菌液以10-1、10-2、10-3梯度稀释后，各取100μl均匀地涂布已准备的LB平板，同时将DH10Bac感受态菌涂于无抗生素培养基平板和仅含有氨苄青霉素的培养基平板作为对照，将平板倒置于37℃恒温箱培养48h(24h之前蓝色菌落不容易辨别)，4℃使蓝斑充分显现；

b、分离重组Bacmid DNA：

使用Concert High Purity Plasmid miniPrep System高纯度质粒纯化试剂盒提取Bacmid DNA，将转染重组Bacmid DNA孔的上清吸至离心管中，500g离心5min，将上清转移至新管，标记后储存于-70℃或4℃，避光保存。

三、病毒的定量和大量制备：

a、病毒的大量制备：

①培养sf9昆虫细胞：在直径35mm的6孔板加入9×105个细胞/孔，细胞处于对数生长期，97％的存活率；吸出含有抗生素的Grace培养基，加入无抗生素无血清的空Grace培养基，让细胞贴壁至少1h(27℃或室温)；

②准备溶液A液：吸取5？l重组Bacmid质粒DNA加到100μl无抗生素无血清的Grace培养基；

③准备溶液B液：将6μl CellFECTIN加到100？l无抗生素无血清的空Grace培养基，将A液与B液混合，轻轻混匀，室温孵育30min；

④将贴壁细胞在用无抗生素无血清的Grace培养基洗两遍，吸出液体，加入800μl空Grace培养基至A、B混合液中，轻轻混匀，加至6孔板的一个孔中，27℃孵育5h；

⑤移出转染混合物，向其孔中加入含有血清、两性霉素、青霉素和链霉素的全Grace培养基2ml，27℃培养84h后分别收获病毒上清和细胞；

b、噬斑分析进行病毒液定量：

①6孔板中每孔加入2ml细胞悬浮液(5～6×105/ml)，细胞在室温贴壁至少1h；将4％的低熔点琼脂糖加入等体积的去离子水，配制成2％的低熔点琼脂糖，置于42℃待用；将2×含有血清的Grace培养基放置于37℃待用；

②准备病毒稀释液：分别取150μl病毒液加到1350μl的1×全Grace培养基，混匀后吸取其中150μl液体致第二管培养基，依次做倍量稀释，得到10-1、10-2等病毒稀释液，从已贴壁的细胞的每孔中吸出培养液，分别加入稀释病毒液，做好标记，27℃孵育1h；

③从水浴中取出2％的低熔点琼脂糖，同时从温箱中取出2×含有血清的Grace培养基，将此两种物质等体积混合；连续移出六孔板中的病毒液，将上述混匀后的液体在其温度＜37℃时，以每孔加入2.5ml混合液为准，迅速加至六孔板中；

④待琼脂糖凝胶在室温完全凝固后，倒置于27℃恒温培养箱的湿盒内培养7天，第七天可见六孔板上出现乳白或灰色透亮的噬斑，控制孵育时间，直到连续两天噬斑无改变；

⑤中性红染色：每孔加入0.1％(w/v)中性红1ml，27℃培养3h；用无菌吸管吸出染料，将6孔板倒置放置于27℃培养箱的湿盒中，孵育3h；噬斑清楚显现后计数，计算出pfu/ml；

c、扩增病毒，准备大量病毒毒种：

①MOI值按下列公式进行计算：

②扩增病毒MOI的优化：用MOI值分别为0.05、0.1、0.2的病毒量感染昆虫细胞，感染72小时收集细胞培养上清液，做噬斑分析定量各病毒液的滴度，结果显示MOI值为0.1时，病毒扩增效果最好；通过三代病毒扩增后得到的四代病毒液滴度为：7.5×107 pfu/ml；以此法大量扩增病毒。

四、蛋白的表达与鉴定：

a、目的蛋白的制备：

分别以MOI值为10时感染昆虫细胞，培养76h收获细胞，离心3000rpm 5min，弃上清，共收集约3.5×109个细胞，将细胞沉淀冻存于-20℃待用；

b、超速离心纯化VLP：

1.5×109个细胞用PBS冲洗悬浮，3000g离心10min，将细胞沉淀集中于1个50ml的塑料试管，弃上清；再加入PBS到沉淀的细胞中，至终体积为19ml；超声波400赫兹强度破碎3次，每次45秒，间歇20秒，将此细胞裂解液缓慢加到等体积的40％蔗糖-PBS垫层上，在4℃、25000rpm(141000g，BACKMAN离心机SW-28转子)条件下离心150min，弃上清，将沉淀中加入27％(w/w)CsCl-PBS，超声波悬浮；补充27％(w/w)CsCI-PBS致离心管口0.5cm处，在4℃、25000rpm(141000g，Backman离心机SW-28转子)条件下离心20h，用毛细管收集1.29g/ml密度的带；

c、透析蛋白：

用直径为1.5cm的透析袋对收集的区带进行透析，于4℃在PBS-NaCl(0.5mol/L)的透析液中透析24h，取出透析袋，放入无菌平皿，聚乙二醇8000包埋，吸收水分适量，所获蛋白经核酸蛋白定量仪定量后保存于-70℃待用。

五、表达蛋白的分析：

a、分子量检测：

将重组病毒转染后培养收获的细胞用PBS吹悬，移至离心管中，室温3000g/min离心3min，弃上清，将沉淀加入100μl 1×SDS上样缓冲液，100℃作用5min，取10μl用于10％的SDS-PAGE，分析蛋白表达情况；

b、特异性检测：

取10μl于10％的SDS-PAGE电泳后转移到硝酸纤维素膜上，分别用HPV16L1和HPV11L1单克隆抗体检测其蛋白表达的特异性，HPV11由于其表达量不高，用化学发光法进行检测；

在第二部分中进行转膜、封闭和加入第一抗体，第二抗体改变为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体，1∶10000倍稀释；按1∶1比例混合底物工作A液和B液，将洗好的转印膜放入含有5ml A+B混合液，室温孵育5min，将转印膜放到滤纸上吸干残留液体；在暗室将转印膜放置到X光片上，设置不同曝光时间，对其进行曝光，将曝光后的X光片上分别通过显影、定影、洗涤后拍照；

c、电镜检测VLP形成：

上述感染的细胞沉淀中取出3×106个细胞约2ml和未感染杆状病毒的正常昆虫细胞分别用2.5％的戊二醛4℃固定24小时，PBS充分洗涤，于4℃用1％锇酸固定2小时；丙酮脱水，每步3分钟，100％丙酮更换两次；用丙酮和Epon812以1∶1混合包埋，于室温下浸泡30min；Epon812包埋，37℃过夜；60℃聚合24h；用LKBIII型超薄切片机切片，捞于铜网上进行1％的醋酸双氧铀染、柠檬酸铅双染色，冲洗后干燥；在JEM1010透射电镜上观察正常细胞阴性对照和杆状病毒感染所致的细胞病变、重组杆状病毒的产生情况及VLP在昆虫细胞内存在情况。

六、双表达HPV11型和16型L1VLP的免疫原性鉴定：

a、120μl VLP(约含60μg)与90μl PBS混合，加入210μl弗氏完全佐剂，经1ml注射器反复抽吸，形成油包水乳剂，对照组加入200μl PBS与200μl的弗氏完全佐剂同样进行乳化；

b、6～8周BalB/C雌性小鼠8只，18～20g，随机分成2组，采用腹部皮肤多点注射；实验组5只，每只注射VLP乳剂70μl，约含10μgVLP，对照组3只，每只注射不含VLP液体70μl，免疫共计3次，分别在第2、4周以同样剂量进行加强免疫，末次免疫后的14天，引颈处死小鼠，心脏取血，于4℃凝固后，收集VLP抗血清，分装后-70℃保存；

c、免疫血清中抗体检测：采用原核细胞中表达的HPV16型和11型L1蛋白与小鼠血清进行Western blot反应。

①将原核表达质粒pGEX4T-1-HPV16L1在大肠杆菌BL21/DE3中IPTG诱导后，蛋白进行表达，4.5h收获细菌，制作Western blot的HPV16L1蛋白的抗原膜；

②将pBAD-HPV11L1原核表达质粒在TOP10中，经L-Arabinose诱导后表达蛋白，4h收获细菌，用于制作Western blot的HPV11L1蛋白的抗原膜；

③上述两种细菌沉淀中加入SDS加样缓冲液，每个涌道加入10？l样品，进行SDS-PAGE电泳及转移蛋白致硝酸纤维膜，4℃封闭过夜；

④取免疫后小鼠血清作为第一抗体，按1∶100、1∶200、1∶400和1∶1000倍量稀释，二抗采用碱性磷酸酶偶联的羊抗鼠IgG(1∶5000倍稀释)，进行Western blot反应以验证血清抗体情况。

                             序列表

<110>哈尔滨医科大学

<120>人乳头瘤病毒型双价病毒样颗粒混合蛋白抗原及构建方法

<160>2

<170>Patent-In 3.1

<210>1

<211>501

<212>氨基酸

<213>HPV11L1的氨基酸序列

<400>1

mwrpsdstvy vpppnpvskv vatdayvkrt nifyhasssr llavghpyys ikkvnktvvp     60

kvsgyqyrvf kvvlpdpnkf alpdsslfdp ttqrlvwact glevgrgqpl gvgvsghpll    120

nkyddvensg gyggnpgqdn rvnvgmdykq tqlcmvgcap plgehwgkgt qcsntsvqng    180

dcpplelits viqdgdmvdt gfgamnfadl qtnksdvpld icgtvckypd ylqmaadpyg    240

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aitcqkptpe kekqdpykdm sfwevnlkek fsseldqfpl grkfllqsgy rgrtsartgi    480

krpavskpst apkrkrtktk k                                              501

<210>2

<211>505

<212>氨基酸

<213>HPV16L1的氨基酸序列

<400>1

mslwlpseat vylppvpvsk vvstdeyvar tniyyhagts rllavghpyf pikkpnnnki     60

lvpkvsglqy rvfrihlpdp nkfgfpdtsf ynpdtqrlvw acvgvevgrg qplgvgisgh    120

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tlgkrkatpt tsststtakr kkrkl                                          505

Claims (5)

1、人乳头瘤病毒型双价病毒样颗粒混合蛋白抗原，其特征在于它包含一种致宫颈癌病毒HPV16的L1抗原和一种尖锐湿疣病毒HPV11的L1抗原。

2、根据权利要求1所述的人乳头瘤病毒型双价病毒样颗粒混合蛋白抗原，其特征在于HPV11L1基因的氨基酸序列为：MWRPSDSTVYVPPPNPVSKVVATDAYVKRTNIFYHASSSRLLAVGHPYYSIKKVNKTVVPKVSGYQYRVFKVVLPDPNKFALPDSSLFDPTTQRLVWACTGLEVGRGQPLGVGVSGHPLLNKYDDVENSGGYGGNPGQDNRVNVGMDYKQTQLCMVGCAPPLGEHWGKGTQCSNTSVQNGDCPPLELITSVIQDGDMVDTGFGAMNFADLQTNKSDVPLDICGTVCKYPDYLQMAADPYGDRLFFYLRKEQMFARHFFNRAGTVGEPVPDDLLVKGGNNRSSVASSIYVHTPSGSLVSSEAQLFNKPYWLQKAQGHNNGICWGNHLFVTVVDTTRSTNMTLCASVSKSATYTNSDYKEYMRHVEEFDLQFIFQLCSITLSAEVMAYIHTMNPSVLEDWNFGLSPPPNGTLEDTYRYVQSQAITCQKPTPEKEKQDPYKDMSFWEVNLKEKFSSELDQFPLGRKFLLQSGYRGRTSARTGIKRPAVSKPSTAPKRKRTKTKK。

3、根据权利要求1所述的人乳头瘤病毒型双价病毒样颗粒混合蛋白抗原，其特征在于HPV16L1基因的氨基酸序列为：MSLWLPSEATVYLPPVPVSKVVSTDEYVARTNIYYHAGTSRLLAVGHPYFPIKKPNNNKILVPKVSGLQYRVFRIHLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGVEVGRGQPLGVGISGHPLLNKLDDTENASAYAANAGVDNRECISMDYKQTQLCLIGCKPPIGEHWGKGSPCTNVAVNPGDCPPLELINTVIQDGDMVDTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDICTSICKYPDYIKMVSEPYGDSLFFYLRREQMFVRHLFNRAGAVGENVPDDLYIKGSGSTANLASSNYFPTPSGSMVTSDAQIFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMSLCAAISTSETTYKNTNFKEYLRHGEEYDLQFIFQLCKITLTADVMTYIHSMNSTILEDWNFGLQPPPGGTLEDTYRFVTSQAIACQKHTPPAPKEDPLKKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAKPKFTLGKRKATPTTSSTSTTAKRKKRKL。

4、根据权利要求1所述的人乳头瘤病毒型双价病毒样颗粒混合蛋白抗原，其特征在于它还包含一种载体，所述载体为Bacmid质粒。

5、人乳头瘤病毒型双价病毒样颗粒混合蛋白抗原的构建方法，其特征在于它按照下述方法构建双价病毒样颗粒混合蛋白抗原：利用分子生物学方法从尖锐湿疣组织中克隆HPV11L1基因，和从宫颈癌组织中克隆的HPV16L1基因双表达于杆状病毒昆虫细胞表达系统，构建重组病毒株Bacmid/HPV16-HPV11L1。