JPH11504801A

JPH11504801A - パピローマウイルス様粒子、融合タンパク質並びにそれらの製造方法

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Publication number: JPH11504801A
Application number: JP8512335A
Authority: JP
Inventors: ラッツギッスマン; ジアンゾウ; マーティンミュラー; ジャネットペインスティル
Original assignee: ラッツギッスマン; ジアンゾウ; マーティンミュラー; ジャネットペインスティル; メディゲンアクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 1994-10-07
Filing date: 1995-10-09
Publication date: 1999-05-11
Also published as: EP0809700B1; AU4270196A; AU1010600A; PT809700E; DE122007000093I1; US20110015376A1; US6066324A; CA2202090C; WO1996011272A3; US6361778B1; AU760615B2; ES2264563T3; DE59511047D1; WO1996011272A2; JP2005270111A; DK0809700T3; US7416732B2; JP2013213034A; CA2202090A1; NL300323I1

Abstract

(57)【要約】Ｌ１および／またはＬ２タンパク質の１個または複数個の部分が欠失したウイルス構造タンパク質Ｌ１および／またはＬ２の発現により得られる組み換えパピローマウイルス様粒子。ウイルス様粒子を形成する能力は本来の生産および／またはインピトロでの生産工程の形成能力と少なくとも同じか、好ましくはそれよりも高い。

Description

【発明の詳細な説明】パピローマウイルス様粒子、融合タンパク質並びにそれらの製造方法本発明は、組み換え的に製造されたパピローマウイルス様粒子、タンパク質、融合タンパク質、並びにこれらの粒子、タンパク質および融合タンパク質の形成および精製のための方法に関する。ヒトにおける一定（高リスク）の型の生殖パピローマウイルス（ＨＰＶ）、例えばＨＰＶ１６、１８または４５による感染は、肛門管の悪性腫瘍の形成の主要な危険因子であると考えられている。これらのうち、子宮頸部癌腫（cervical c arcinom）はとりわけ最高の頻度で生じている。ＷＨＯの見積もりによれば、この疾患では毎年約５０万の新規の症例が生じている。この頻発性の発症率のために、ＨＰＶ感染と子宮頸部癌腫との関連が最も調査されている：ａ）子宮頸部癌腫（子宮頸部上皮新生物：ＣＩＮ）の前駆病変はパピローマウイルス感染によって生じる。ｂ）一定のＨＰＶ型（例えば、１６、１８、３３、３５、４５）のゲノムは腫瘍生体組織検査の９５％以上、並びにそれから誘導した細胞株中で見られることが判明している。腫瘍の地理的起源に応じて、これらの５０〜７０％はＨＰＶ１６を含有している。ｃ）その後研究された全症例において、ＯＲＦｓＥ６およびＥ７が転写されている（Wettstein et al.，in Pfister H．（編）Papilloma viruses and humanc ancer，pp．155〜179，Boca Raton，1990）。ｄ）タンパク質Ｅ６およびＥ７は、全部の子宮頸部癌腫細胞株中、並びにインビトロ形質転換ヒトケラチノサイト中に存在が確認でき、子宮頸部癌腫を有する患昔の大多数はＥ６−またはＥ７−特異抗体を有している。ｅ）Ｅ６／Ｅ７タンパク質の構造的発現がＨＰＶ−陽性腫瘍の形質転換状態を維持するのに必要である。ｆ）ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８のＥ６−およびＥ７−遺伝子は、以下の実験系において生物学的に活性である。 −ヒト細胞における細胞性ＤＮＡ合成の誘導； −培養したヒトケラチノサイトおよび他の細胞の形質転換； −トランスジェニックマウスにおける腫瘍形成：他の型のＨＰＶ（主としてＨＰＶ６および１１）は、良性生殖器イボ（尖圭コンジローム）の原因となり、悪性腫瘍とは非常に稀にしか関連性を有していない（低リスク型）。概して、ヒトの生殖パピローマウイルスは性交中に伝染し、大部分の場合、肛門粘膜中での持続的感染をもたらす。これにより、一次感染は不十分な免疫応答のみを誘導するか、またはウイルスは感染細胞における免疫監視を回避する可能性を発展させていたという結論が導かれた。一方、一次的発現の間に、またはパピローマウイルス感染の悪性度の発達中に免疫系が関与しているということを示唆する十分な指摘がある（概要として、Altmann et al.（1994）in Minson A.， Neil J.，McCrae M．(eds); Viruses and cancer，Cambridge University Press ,pp 71〜80を参照）。ａ）動物パピローマウイルス（ウサギパピローマウイルスおよびウシパピローマウイルス）の場合、一次感染の臨床的発現は、ウイルス構造タンパク質またはイボ抽出物（自己ワクチン）によるワクチン接種により回避することができる。ｂ）げっ歯動物は、ＨＰＶ１６Ｅ６−またはＥ７−陽性ワクシニア組み換え体によるワクチン接種によって、またはＨＰＶ１６−形質転換自己細胞の接種後の腫瘍形成前に合成ペプチドによって保護することができる。ｃ）イボの退行は全身的であることが多く、動物パピローマウイルスの場合は退行動物のリンパ球の転移によって誘導することができる。ｄ）免疫抑制された患者（例えば、腎臓移植を受けた者またはＨＩＶ感染者）の場合、生殖器イボ、ＣＩＮおよび肛門癌の発生率は上昇している。これにより、一次感染および生殖器癌の発生を防止することを目的としたパピローマウイルス特異的ワクチン接種が可能であるという結論が導かれた。１．ＨＰＶ感染の回避にはパピローマウイルスの構造タンパク質Ｌ１およびＬ２によるワクチン接種（予防的ワクチン接種）が適している。パピローマウイルスは細胞培養物または他の実験系において適切な力価まで増やすことができないため、ウイルスタンパク質は組み換えベクターによってのみ製造可能である。最近、ウイルス構造タンパク質Ｌ１およびＬ２（またはそれ自身上のＬ１）の発現後に、組み換えワクシニアまたはバキュロウイルス中に形成されるウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）が記載されている。ＶＬＰｓの精製はＣｓＣ１−またはシュークロース勾配中の遠心処理によって非常に簡単に達成することができる。ＷＯ９３／０２１８４は、診断用途のためにまたはパピローマウイルスによって引き起こされる感染に対するワクチンとして使用されるパピローマウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）を提供する方法を記載している。ＷＯ９４／００１５２は、ヒトおよび動物パピローマビリオン上の構造中和エピトープを模倣した組み換え的に製造されたＬ１主要キャプシドタンパク質を記載している。これらの組み換えタンパク質はパピローマウイルス感染に対して保護するワクチンとして使用することができる。２．持続感染した細胞中で発現する初期パピローマウイルスタンパク質（主としてＥ６およびＥ７）によって補助された免疫治療による子宮頸部癌腫または前駆病変の治療（治療的ワクチン接種）このワクチン接種によって、細胞毒性Ｔ細胞は持続感染した生殖器病変に対して活性化するものと考えられる。標的集団は、ＨＰＶに関連した前悪性または悪性生殖器病変を有する患者である。初期ＨＰＶタンパク質は、大腸菌または真核ベクター（例えば、バキュロウイルスまたは酵母）中での発現によって産生される。しかし、精製は低溶解性のために困難であり、概してイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過およびアフィニティークロマトグラフィーの組み合わせが必要になる。ＰＣＴ特許出願ＷＯ９３／２０８４４には、ＨＰＶまたはＢＰＶからのパピローマウイルスのＥ７タンパク質が哺乳動物におけるパピローマウイルス腫瘍の退行において（しかし、予防においてではない）治療的に有効であることが開示されている。さらに、好ましい抗原性タンパク質断片配列が記載されている。しかしながら、今までのところ、予防的および治療的ワクチン接種の両方に適したＶＬＰｓは記載されていない。最後に述べた方法では、例えは、初期ＨＰＶタンパク質はその低溶解性のために洗浄が常に困難であるという欠点を有している。特に予防的および治療的ワクチン接種のためのワクチンという観点からは、粒子の高度の産生が特に望ましいであろう。今までに記載した方法の欠点は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのＬ１の発現後にＶＬＰｓを産生することができなかったことにある。従って、本発明の目的は、予防的および治療的ワクチン接種のためのワクチンとして好適な組み換え的に製造されたタンパク質並びにＶＬＰｓ、並びにこれらのタンパク質およびＶＬＰｓの製造方法を利用可能にすることにある。同様に、得られた組み換えタンパク質も簡単に精製可能となるべきである。また、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのＬ１の発現後におけるＶＬＰｓの産生も可能となるべきである。本発明は、独立請求項１および１２に記載したＶＬＰｓ；独立請求項３６に記載したタンパク質；独立請求項８および３８に記載した融合タンパク質；請求項４２および４３に記載した方法；および請求項５５および５６に記載した使用によって上記の課題を達成するものである。本発明のさらに好ましい態様、側面および詳細は、本明細書の従属請求項および好ましい態様中に開示されている。本発明によれば、後期および初期ＨＰＶタンパク質（またはその断片）（ＨＶＬＰ）の融合タンパク質からなり、予防的または治療的ワクチン接種のために使用することができるＶＬＰｓが産生される。そのようなワクチンは、従来の調製物と比較した場合、以下の利点を提供する。ａ）予防的ワクチン接種の場合、ＨＶＬＰｓは、Ｌ１／Ｌ２特異的抗体の誘導を通じて細胞内へのウイルスの進入を防止するだけでなく、感染が以前に生じていたか、または体液免疫応答が不適切だった場合には（細胞毒性Ｔ細胞を通じて）既に感染した細胞をも排除する。ｂ）治療的ワクチン接種の場合、ＨＶＬＰｓは、（例えば、ＣＩＮまたは子宮頸部癌腫を有する患者において）持続感染した細胞を排除し、とりわけそれらはＣＩＮ病変を有する女性患者における再感染を防止する。ｃ）ＨＶＬＰｓの精製は、初期ＨＰＶタンパク質を有さないＶＬＰｓの精製と同様に簡単である。本発明によれば、Ｌ１プラスＬ２の、またはそれ自身上でのＬ１の発現後のウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）１型およびヒトパピローマウイルス１１および１６のＶＬＰｓを、ワクシニアまたはバキュロウイルス中で産生することができる。実験例は、ＶＬＰｓの形成能力を損失することなく、複数部分のＬ１タンパク質（ＢＰＶＩのアミノ酸配列３１１−３５１、３３１−３７１、３９１−４３１；ＨＰＶ１６のアミノ酸配列３０６−３１５）を欠失することができることを示している。そのような部分は、全てのパピローマウイルスのＬ１タンパク質中に存在しているため、Ｌ１のこの欠失部分は（パピローマウイルスのまたは他の起源の）他のタンパク質によって置き換えることができ、そしてこのようにして、ハイブリッドウイルス様粒子を産生することができる。同様に、パピローマウイルスタンパク質Ｌ２の複数部分を欠失させて、他の（初期ＨＰＶまたは他の）タンパク質によって置き換えることにより、ＨＶＬＰｓを完全なＬ１タンパク質プラスＬ２融合タンパク質から形成することもできる。異なる型のＨＰＶ（主としてＨＰＶ６、１１、１６、１８、３３、３５、４５）からの欠失したＬ１またはＬ２タンパク質と、各々の初期タンパク質Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７（またはその部分）とを含む融合タンパク質を、非常に短時間で構築できるワクシニア組み換え体中で発現させて産生することができる。Ｌ１融合タンパク質からなるか、または完全Ｌ１タンパク質プラスＬ２融合タンパク質からなるＶＬＰｓの形成は電子顕微鏡下でモニターし、初期ＨＰＶタンパク質の存在は特異的抗血清によるウエスタンブロット分析で試験を行う。ＨＰＬＶｓの大量製造のためには、タンパク質の発現をウイルス系または真核系、好ましくはバキュロウイルスまたは酵母中で実施する。融合タンパク質を産生するための個々の実験は他の起源のタンパク質を使用して実施することができる。ウイルス構造タンパク質Ｌ１および／またはＬ２の発現後に形成される組み換え的に製造されたパピローマウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）が本発明の本質であり、それによりＬ１および／またはＬ２タンパク質の複数部分がＶＬＰｓの形成能力を損なうことなく欠失している。本発明によれば、ウシパピローマウイルス１型のＬ１タンパク質中の欠失部分は、好ましくはアミノ酸配列３１１−３５１、３３１−３７１、３９１−４３１に関係している。ヒトパピローマウイルス１６のＬ１タンパク質の場合、それはアミノ酸配列３０６−３１５に関係しているのが有利である。本発明の好ましい態様では、Ｌ１および／またはＬ２タンパク質の欠失部分は、他のタンパク質またはタンパク質断片で置き換えられており、それにより融合タンパク質が得られる。Ｌ１またはＬ２タンパク質がしめる割合は、約５０〜９９％、好ましくは約６０〜９０％、特に好ましくは約８０％であることが有利である。もっとも、以下に明白には説明されていないとしても、本発明によればＬ１および／またはＬ２タンパク質の１より多くの部分が欠失しているべきであり、それらは他のタンパク質またはタンパク質断片で置き換えられているのが好ましい。Ｌ１またはＬ２タンパク質中の欠失部分をパピローマウイルスの他のタンパク質および／または他の起源のタンパク質で置き換えて、それによりハイブリッドウイルス様粒子（ＨＶＬＰｓ）を製造することができることが特に好ましい。ＶＬＰｓの形成が、Ｌ１融合タンパク質からであるか、またはさらに別の態様に従って、完全Ｌ１タンパク質およびＬ２融合タンパク質からであるものは、本発明において特に好ましいことが示されている。融合タンパク質、特に本発明のさらに別の態様に従うハイブリッドウイルス様粒子を形成するための融合タンパク質は、異なる型のＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）、特に好ましくはＨＰＶ６、１１、１６、１８、３３、３５および４５の欠失したＬ１および／またはＬ２タンパク質と、他のタンパク質またはタンパク質断片とからなることが好ましい。好ましくはこれらの他のタンパク質またはタンパク質断片は、各々の初期タンパク質またはその断片、例えば初期タンパク質Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６および／またはＥ７に関係する。本発明に包含される方法によれば、融合タンパク質およびタンパク質の発現はウイルスまたは真核ベクター中；特に好ましくはバキュロウイルスまたは酵母中で行われる。本発明の方法のさらに別の態様によれば、融合タンパク質はワクシニア組み換え体中での発現により産生される。本発明によれば、予防的および治療的ワクチンの製造のための融合タンパク質またはハイブリッドウイルス様粒子の適用は、好ましくはさらに別の成分の添加後に行われる。現在までのところ、例えばＨＰＶ１６からＶＬＰｓのようなＶＬＰｓの製造のためには、Ｌ１（ＯＲＦ）を真核ベクター、例えばバキュロウイルスを用いて発現させていた。ＶＬＰｓの形成（組立て）は感染細胞のカリオンで生じる。従って、特に本発明の本質は、ウイルス構造タンパク質Ｌ１および／またはＬ２の発現後に形成される組み換え体パピローマウイルス様粒子であって、Ｌ１および／またはＬ２タンパク質の１個または複数個の部分が欠失しており、それによって、ウイルス様粒子を形成する能力が本来的な(native)形成および／またはインピトロでの産生と比較して増加している粒子である。本発明によれは、パピローマウイルスのＬ１および／またはＬ２タンパク質中の欠失部分の少なくとも１個は、好ましくは長さが約１〜３４アミノ酸、好ましくは長さが１から２６のアミノ酸、特には長さが２６アミノ酸のＣ−末端アミノ酸配列における欠失であることが有利である。Ｌ１および／またはＬ２タンパク質中へのＣ−末端欠失の挿入後には、ＶＬＰｓの産生が多数倍、好ましくは少なくとも１０倍、特には約１０〜１００倍増加するのが有利である。本発明の好ましい態様では、Ｌ１および／またはＬ２タンパク質の、特にはウシパピローマウイルスのものの欠失部分は２６個のＣ−末端アミノ酸に関係する。特に好ましくは、Ｃ−末端の欠失、ヌクレオチド位置７０１６から７０９３のＧＧＧＧＣＡＧＧＡＴＧＴＴＣＡＡＣＴＧＴＧＡＧＡＡＡＡＣＧＡＡＧＡＡＴＴＡＧＣＣＡＡＡＡＡＡＣＴＴＣＣＡＧＴＡＡＧＣＣＴＧＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡに対応する長さ２６アミノ酸、（Ｇｌｙ−Ａｌａ− Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ− Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ− Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）がウシパピローマウイルス１型（ＢＰＶ１）のＬ１のＯＲＦ中に挿入されている。Ｌ１および／またはＬ２タンパク質中へＣ−末端欠失を挿入した後に、ＶＬＰｓの産生が少なくとも１０倍増加していることが有利である。本発明のさらに別の好ましい態様によれば、Ｌ１および／またはＬ２タンパク質中に少なくとも１個存在する欠失部分は、ヒトパピローマウイルス１６または他のパピローマウイルスの相同アミノ酸配列に関係している。さらに好ましい態様によれば、Ｌ１および／またはＬ２タンパク質中の欠失部分は、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）の３４個のＣ−末端アミノ酸；好ましくは、ＨＰＶ１６のＬ１のＯＲＦ中に挿入されているヌクレオチド位置７０５２から７１５３：ＧＣＡＧＧＡＴＴＧＡＡＧＧＣＣＡＡＡＣＣＡＡＡＡＴＴＴＡＣＡＴＴＡＧＧＡＡＡＡＣＧＡＡＡＡＧＣＴＡＣＡＣＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＣＴＣＴＡＣＡＡＣＴＧＧＴＡＡＡＣＧＣＡＡＡＡＡＡＣＧＴＡＡＧＣＴＧに対応するアミノ酸配列（Ａｌａ−Ｇｌｙ −Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ −Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ −Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ −Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ）に関係している。Ｌ１および／またはＬ２タンパク質の欠失が核局在シグナル（ＮＬＳ）を含む場合が特に好ましい。Ｌ１タンパク質からの、またはＬ１タンパク質およびＬ２タンパク質からの粒子の産生は特に細胞質中で生じる。粒子が上清液体中に分泌されることが好ましく；粒子の約５から１０％が分泌されることが特に好ましい。さらに好ましい態様によれば、Ｌ１タンパク質またはＬ１タンパク質およびＬ２タンパク質の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での発現が生じる。ここでは、Ｌ１タンパク質中のＣ−末端の欠失部に、特にはさらに６個のヒスチジンが挿入される。ＶＬＰｓの産生は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でＬ１タンパク質またはＬ１およびＬ２タンパク質の発現後に生じるのが都合がよい。本発明によれば、ウシパピローマウイルス１型のＬ１タンパク質中のさらに別の欠失部分が、好ましくは、アミノ酸配列３１１−３５１、３３１−３７１、３９１−４３１に関係している。ヒトパピローマウイルス１６のＬ１タンパク質は、アミノ酸配列３０６−３１５に関係しているのが有利である。本発明の好ましい態様においては、Ｌ１および／またはＬ２タンパク質のさらに別の欠失部分が、他のタンパク質またはタンパク質断片で置き換えられており、それによってタンパク質が得られるが、これを本明細書において融合タンパク質とよぶ。Ｌ１またはＬ２タンパク質の含有量が約５０〜９９％、好ましくは約６０〜９０％、特に好ましくは約８０％であると有利である。もっとも、明示の説明がなされていないとしても、本発明によればＬ１および／またはＬ２タンパク質の１個より多くのさらに別の部分が欠失しているべきであり、好ましくは他のタンパク質またはタンパク質断片により置き換えられているべきである。Ｌ１またはＬ２タンパク質中の欠失部分が、パピローマウイルスの他のタンパク質および／または他の起源のタンパク質で置き換えられており、それによりハイブリッドウイルス様粒子（ＨＶＬＰｓ）を製造することができる場合が特に好ましい。本発明によれば、ＶＬＰｓの形成が、Ｌ１タンパク質、Ｌ１融合タンパク質、Ｌ１タンパク質およびＬ２タンパク質、Ｌ１融合タンパク質およびＬ２タンパク質、Ｌ１タンパク質およびＬ２融合タンパク質、またはＬ１融合タンパク質およびＬ２融合タンパク質から生じることが特に有利であることが判明した。本発明のさらに別の態様によれは、パピローマウイルスのＬ１および／またはＬ２タンパク質中の欠失部分の少なくとも１個はＮ−末端アミノ酸配列に関係している。本発明によれば、さらに別の態様ではパピローマウイルスのＬ１タンパク質および／またはＬ２タンパク質中の欠失部分の少なくとも１個はタンパク質の中間部分中のアミノ酸配列に関係している。本発明の本質は、特にハイブリッドパピローマウイルス様粒子の形成のためのタンパク質であって、それによりＬ１および／またはＬ２タンパク質の１個または複数個の部分が欠失しているタンパク質でもある。特に、Ｌ１および／またはＬ２タンパク質中の少なくとも１個の欠失配列がＣ−末端アミノ酸配列の欠失に関係している。上記の融合タンパク質、特に本発明のさらに別の態様によるハイブリッドパピローマウイルス様粒子の形成のための融合タンパク質は、異なるパピローマウイルスの欠失したＬ１および／またはＬ２タンパク質、特に好ましくは、ＨＰＶ６、１１、１６、１８、３１、３３、３５および４５と、パピローマウイルスまたは他の起源の他のタンパク質またはタンパク質断片とからなることが有利である。これらの他のタンパク質またはタンパク質断片は、それぞれ初期パピローマウイルスタンパク質またはその断片、例えば、初期タンパク質Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６および／またはＥ７に関連していることが好ましい。本発明に包含される方法によれば、タンパク質および／または融合タンパク質の発現、並びにパピローマウイルス様粒子の産生は、ウイルス、真核または原核ベクター中で、特に有利にはワクシニア組換え体中、バキュロウイルス中、酵母中または細菌中、特には大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で行われる。粒子の産生は細胞質中で生じることが好ましい。特に好ましい方法では、粒子は上清液体中に分泌される；約５から１０％の粒子が上清液体中に分泌されることが特に好ましい。特に、本発明によれは、ウシパピローマウイルス１型（ＢＰＶ１）のＬ１のＯＲＦ中のヌクレオチド位置７０１６から７０９３中に、長さ２６のアミノ酸のＣ −末端欠失を挿入することによって、ＶＬＰｓの産生を１０倍以上増加させることができる。例えばウエスタンブロットで実証されるような同一の量のＬ１タンパク質を用いて、粒子数の増加を電子顕微鏡下で実証することができる。欠失は好ましくは核局在シグナル（ＮＬＳ）を含むので、粒子の産生は細胞質で生じ、粒子のかなりの部分は上清液体中に分泌される。これによって精製がかなり容易になるので特に都合がよい。本発明によるタンパク質、好ましくは追加の６個のヒスチジンを有する上記欠失を伴うタンパク質（ＨｉｓＬ１タンパク質）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現される。上記タンパク質、特にＨｉｓＬ１タンパク質を好ましくはＮｉアフィニティクロマトグラフィーにより精製し、有利な態様では、それによってこの時点でタンパク質が変性緩衝液、例えば６Ｍグアニジン塩酸塩中に存在することになる。脱変成は、例えば、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ₂、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２エタンスルホン酸）（ｐＨ７．４）中において行われる。本発明の好ましい態様によれば、ＶＬＰｓの産生（組立）は、タンパク質の透析後に、好ましくは１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＣａ²⁺、１０％のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、及びｐＨ値５．０の１０ｍＭのトリス〔トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン〕酢酸に対する透析後に行われる。全パピローマウイルスのＬ１タンパク質中の配列の欠失がＶＬＰｓの早期の組立を防止し、ＶＬＰ産生において高い収量をもたらす。Ｌ１のＮＬＳが関与するこれらの場合に限って組立てが細胞質で生じる。その結果、本発明によれば、ＶＬＰｓの精製をこれまでのようなカリオンからの精製に代えて細胞質から行うことが可能である。本発明によれば、欠失をより短くすることも可能である。本発明によれば、最低１個までのアミノ酸の欠失および／または最低１個までのアミノ酸の置換を行うことができる。この場合、最低１個またはわずかに数個のアミノ酸の短い欠失または置換では、タンパク質およびその形成されたＶＬＰｓの抗原性が、そのタンパク質またはＶＬＰｓの本来の抗原性と比較した場合に最低限しか変化しないという点で有利である。前に行ったようなＬ１および／またはＬ２融合タンパク質中のＣ−末端の欠失または置換の導入は、ハイブリッドＶＬＰｓの産生増加ももたらす。この場合、Ｌ１融合タンパク質のみを含むＶＬＰｓのほか、Ｌ１またはＬ２融合タンパク質およびＬ２またはＬ１タンパク質を含むハイブリッドＶＬＰｓも含まれるべきである。このために、後期および初期ＨＰＶタンパク質（またはそのタンパク質）（ＨＶＬＰｓ）の融合タンパク質を含み、予防的または治療的ワクチン接種のために使用することができるＶＬＰｓが産生される。そのようなワクチンにより、従来の製剤と比較して以下の有利な点がもたらされる。ａ）予防的ワクチン接種の場合、ＨＶＬＰｓはＬ１／Ｌ２特異的抗体の誘導を通じて細胞内へのウイルスの進入を防止するだけでなく、それらは感染が以前に生じていたかまたは体液免疫応答が不適切だった場合には（細胞障害性Ｔ細胞を通じて）既に感染した細胞をも排除する。ｂ）治療的ワクチン接種の場合、ＨＶＬＰｓは（例えばＣＩＮまたは子宮頸部癌腫を有する患者において）持続感染した細胞を排除し、とりわけそれらはＣＩＮ病変を有する女性患者中において再感染を防止する。ｃ）ＨＶＬＰｓの精製は、初期ＨＰＶタンパク質を有しないＶＬＰｓの精製と同様に簡単である。Ｌ１プラスＬ２またはそれ自身上でのＬ１の発現後のウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）１型およびヒトパピローマウイルス１１および１６のＶＬＰｓは、ワクシニアまたはバキュロウイルス中で産生することができる。実験例は、ＶＬＰｓの形成能力を損失することなく、複数部分のＬ１タンパク質（ＢＰＶ１のアミノ酸配列３１１−３５１、３３１−３７１、３９１−４３１；ＨＰＶ１６のアミノ酸配列３０６−３１５）を欠失できることを示している。そのような部分は、全てのパピローマウイルスのＬ１タンパク質中に存在しているため、Ｌ１の欠失部分は（パピローマウイルスのまたは他の起源の）他のタンパク質によって置き換えることができ、そしてこのようにしてハイブリッドウイルス様粒子を産生することができる。同様に、複数部分のパピローマウイルスタンパク質Ｌ２を欠失させて、他の（初期ＨＰＶまたは他の）タンパク質によって置き換えることによって、ＨＶＬＰｓを完全なＬ１タンパク質プラスＬ２融合タンパク質から形成することもできる。異なる型のＨＰＶ（主として、ＨＰＶ６、１１、１６、１８、３３、３５、４５）からの欠失したＬ１またはＬ２タンパク質と、それぞれの初期タンパク質Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７（またはその部分）とを含む融合タンパク質を、非常に短時間で構築できるワクシニア組み換え体中で発現させて産生することができる。Ｌ１融合タンパク質からなるか、または完全Ｌ１タンパク質プラスＬ２融合タンパク質からなるＶＬＰｓの形成は電子顕微鏡下でモニターし、初期ＨＰＶタンパク質の存在は特異的抗血清によるウエスタンブロット分析によって試験を行う。ＨＰＬＶｓの大量製造のためには、ウイルス、真核または原核系中、好ましくはバキュロウイルス中、酵母中、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でタンパク質の発現を行う。本発明によれば、予防的または治療的ワクチンの製造のための融合タンパク質またはハイブリッドウイルス様粒子の適用を、好ましくはさらに別の成分の添加後に行なう。融合タンパク質を産生するための各々の実験は他の起源のタンパク質を用いて行うことができる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年１月８日【補正内容】請求の範囲１．ウイルス構造タンパク質Ｌ１および／またはＬ２の発現後に形成され、それによってＬ１および／またはＬ２タンパク質の１個または複数個の部分が欠失しており、ウイルス様粒子を形成する能力が残存している組み換え的に製造されたパピローマウイルス様粒子であって、Ｌ１および／またはＬ２タンパク質の欠失部分が融合タンパク質を得るために他のタンパク質またはタンパク質断片で置き換えられていることを特徴とする、上記のパピローマウイルス様粒子。２．Ｌ１タンパク質中の欠失部分がウシパピローマウイルス１型のアミノ酸配列３１１−３５１、３３１−３７１、３９１−４３１に関係していることを特徴とする、請求項１に記載のウイルス様粒子。３．Ｌ１タンパク質中の欠失部分がヒトパピローマウイルス１６のアミノ酸配列３０６−３１５に関係していることを特徴とする、請求項１に記載のウイルス様粒子。４．Ｌ１またはＬ２タンパク質のしめる割合が融合タンパク質の約５０〜９９％、好ましくは約６０〜９０％、特に好ましくは約８０％であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。５．Ｌ１またはＬ２タンパク質中の欠失部分がパピローマウイルスの他のタンパク質および／または他の起源のタンパク質で置き換えられており、それによってハイブリッドウイルス様粒子を製造することができることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。６．ウイルス様粒子の形成がＬ１融合タンパク質または完全Ｌ１タンパク質およびＬ２融合タンパク質から生じることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。７．融合タンパク質が、異なるＨＰＶ型の欠失したＬ１および／またはＬ２タンパク質及びその他のタンパク質またはその断片を含むことを特徴とする、特には請求項１〜６のいずれか１項に記載のハイブリッドパピローマウイルス様粒子の形成のための融合タンパク質。８．他のタンパク質または断片が初期タンパク質または断片であることを特徴とする、請求項７に記載の融合タンパク質。９．初期タンパク質Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７またはその断片に関係することを特徴とする、請求項７および８に記載の融合タンパク質。１０．ＨＰＶ６、１１、１６、１８、３３、３５、４５などの異なるＨＰＶの型の欠失したＬ１および／またはＬ２タンパク質に関係することを特徴とする、請求項７〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。１１．ウイルス構造タンパク質Ｌ１および／またはＬ２の発現後に形成され、それによってＬ１および／またはＬ２タンパク質の１個または複数個の部分が欠失しており、ウイルス様粒子を形成する能力が本来の形成および／またはインビトロ産生と比較して増加している組み換え的に製造されたパピローマウイルス様粒子であって、Ｌ１および／またはＬ２タンパク質の欠失部分が融合タンパク質を得るために他のタンパク質またはタンパク質断片で置き換えられていることを特徴とする、上記のパピローマウイルス様粒子。１２．パピローマウイルスのＬ１および／またはＬ２タンパク質中の欠失部分の少なくとも１個がＣ−末端アミノ酸配列に関係していることを特徴とする、請求項１１に記載のウイルス様粒子。１３．Ｌ１および／またはＬ２タンパク質中のＣ−末端部分に少なくとも１個存在する欠失部分がパピローマウイルスの長さが約１〜３４のアミノ酸、好ましくは１〜２６のアミノ酸のアミノ酸配列に関係していることを特徴とする、請求項１２に記載のウイルス様粒子。１４．挿入後、特にＬ１および／またはＬ２タンパク質中へのＣ−末端欠失の挿入後に、ＶＬＰｓの産生が多数倍、好ましくは少なくとも１０倍、特には約１０〜１００倍増加することを特徴とする、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。１５．Ｌ１および／またはＬ２タンパク質中の欠失部分がウシパピローマウイルスの２６個のＣ−末端アミノ酸に関係することを特徴とする、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。１６．Ｃ−末端の欠失、ヌクレオチド位置７０１６から７０９３：ＧＧＧＧＣＡＧＧＡＴＧＴＴＣＡＡＣＴＧＴＧＡＧＡＡＡＡＣＧＡＡＧＡＡＴＴＡＧＣＣＡＡＡＡＡＡＣＴＴＣＣＡＧＴＡＡＧＣＣＴＧＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡに対応する長さ２６のアミノ酸、（Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ− Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ− Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ− Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）がウシパピローマウイルス１型のＬｌのＯＲＦ中に挿入されていることを特徴とする、請求項１５に記載のウイルス様粒子。１７．Ｌ１および／またはＬ２タンパク質中の欠失部分がヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）の３４個のＣ−末端アミノ酸であることを特徴とする、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。１８．Ｃ−末端の欠失、ヌクレオチド位置７０５２から７１５３：ＧＣＡＧＧＡＴＴＧＡＡＧＧＣＣＡＡＡＣＣＡＡＡＡＴＴＴＡＣＡＴＴＡＧＧＡＡＡＡＣＧＡＡＡＡＧＣＴＡＣＡＣＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＣＴＣＴＡＣＡＡＣＴＧＣＴＡＡＡＣＧＣＡＡＡＡＡＡＣＧＴＡＡＧＣＴＧに対応する長さ３４のアミノ酸、（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ）がヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）のＬ１のＯＲＦ中に挿入されていることを特徴とする、請求項１７に記載のウイルス様粒子。１９．Ｌ１および／またはＬ２タンパク質中のＣ−末端部分に少なくとも１個存在する欠失部分がヒトパピローマウイルス１６または他のパピローマウイルスに相同なアミノ酸配列に関係していることを特徴とする、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。２０．Ｌ１および／またはＬ２タンパク質の欠失が核局在シグナル（ＮＬＳ）を含むことを特徴とする、請求項１１〜１９のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。２１．Ｌ１タンパク質またはＬ１およびＬ２タンパク質からの粒子の産生が細胞質中で生じることを特徴とする、請求項１１〜２０のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。２２．粒子が上清液体中に分泌されることを特徴とする、請求項１１〜２１のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。２３．約５から１０％の粒子が上清液体中に分泌されることを特徴とする、請求項２２に記載のウイルス様粒子。２４．Ｌ１タンパク質またはＬ１およびＬ２タンパク質の発現が大腸菌中で生じることを特徴とする、請求項１１〜２３のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。２５．Ｌ１タンパク質中のＣ−末端の欠失に６個のヒスチジンが挿入されたことを特徴とする、請求項２４に記載のウイルス様粒子。２６．ＶＬＰｓの産生が大腸菌中でのＬ１タンパク質またはＬ１およびＬ２タンパク質の発現後に生じることを特徴とする、請求項２４または２５のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。２７．Ｌ１タンパク質中のさらに別の欠失部分がウシパピローマウイルス１型のアミノ酸配列３１１−３５１、３３１−３７１、３９１−４３１に関係していることを特徴とする、請求項１１〜２６のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。２８．Ｌ１タンパク質中のさらに別の欠失部分がヒトパピローマウイルス１６のアミノ酸配列３０６−３１５に関係していることを特徴とする、請求項２６に記載のウイルス様粒子。２９．Ｌ１またはＬ２タンパク質のしめる割合が、融合タンパク質の約５０〜９９％、好ましくは約６０〜９０％、特に好ましくは約８０％であることを特徴とする請求項１１〜２８のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。３０．Ｌ１またはＬ２タンパク質中の欠失部分が、パピローマウイルスの他のタンパク質および／または他の起源のタンパク質で置き換えられており、それによってハイブリッドウイルス様粒子を製造することができることを特徴とする、請求項１１〜２９のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。３１．ウイルス様粒子の形成が、Ｌ１タンパク質、Ｌ１融合タンパク質、Ｌ１タンパク質およびＬ２タンパク質、Ｌ１融合タンパク質およびＬ２タンパク質、Ｌ１タンパク質およびＬ２融合タンパク質、またはＬ１融合タンパク質およびＬ２融合タンパク質から生じることを特徴とする、請求項１１〜３０のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。３２．パピローマウイルスのＬ１および／またはＬ２タンパク質中の欠失部分の少なくとも１個がＮ−末端アミノ酸配列に関係していることを特徴とする、請求項１１〜３１のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。３３．パピローマウイルスのＬ１および／またはＬ２タンパク質中の欠失部分の少なくとも１個がタンパク質の中間部分中のアミノ酸配列に関係していることを特徴とする請求項１１〜３２のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。３４．融合タンパク質、特には請求項１１〜３３のいずれか１項に記載のハイブリッドパピローマウイルス様粒子の形成のためのＬ１および／またはＬ２タンパク質の１個または複数個の部分が欠失している融合タンパク質であって、異なるパピローマウイルスの欠失したＬ１および／またはＬ２タンパク質、並びにパピローマウイルスまたは他の起源の他のタンパク質または断片を含むことを特徴とする上記の融合タンパク質。３５．Ｌ１および／またはＬ２タンパク質中の少なくとも１個の欠失部分がＣ −末端アミノ酸配列の欠失に関係することを特徴とする、請求項３４に記載のタンパク質。３６．他のタンパク質または断片が初期パピローマウイルスタンパク質またはその断片であることを特徴とする、請求項３４または３５に記載の融合タンパク質。３７．初期タンパク質Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７またはその断片に関係することを特徴とする、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。３８．ＨＰＶ６、１１、１６、１８、３１、３３、３５、４５などの異なるＨＰＶの型の欠失したＬ１および／またはＬ２タンパク質に関係することを特徴とする、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。３９．タンパク質および融合タンパク質の発現をウイルスまたは真核ベクター中で行うことを特徴とする、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質の発現方法。４０．タンパク質および融合タンパク質の発現をウイルス、真核または原核ベクター中で行うことを特徴とする、請求項１１〜３３のいずれか１項に記載のタンパク質および／または融合タンパク質の発現並びにパピローマウイルス様粒子の製造方法。４１．タンパク質または融合タンパク質をワクシニア組換え体中での発現により産生することを特徴とする、請求項３９または４０のいずれか１項に記載の方法。４２．タンパク質および融合タンパク質の発現をバキュロウイルス中または酵母中で行うことを特徴とする、請求項３９または４０のいずれか１項に記載の方法。４３．タンパク質および融合タンパク質の発現を大腸菌中で行うことを特徴とする、請求項４０に記載の方法。４４．精製、特にはＬ１タンパク質の精製をＮｉ−アフィニティクロマトグラフィーおよび脱変性により、好ましくは１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ₂、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）中で行うことを特徴とする、請求項４３に記載の方法。４５．タンパク質が精製の時点で変性緩衝液中に存在していることを特徴とする、請求項４４に記載の方法。４６．変性緩衝液が６Ｍグアニジン塩酸塩であることを特徴とする、請求項４５に記載の方法。４７．ＶＬＰｓの組立てが透析後に生じることを特徴とする、請求項４０〜４６のいずれか１項に記載の方法。４８．透析を１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＣａ²⁺、１０％のＤＭＳＯ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、および１０ｍＭのトリス酢酸（ｐＨ＝５．０）に対して行うことを特徴とする、請求項４７に記載の方法。４９．粒子の産生が細胞質中で生じることを特徴とする、請求項４０〜４８のいずれか１項に記載の方法。５０．粒子が上清液体中に分泌されることを特徴とする、請求項４０〜４９のいずれか１項に記載の方法。５１．約５から１０％の粒子が上清液体中に分泌されることを特徴とする、請求項５０に記載の方法。５２．予防的および／または治療的ワクチン接種のためのワクチンの製造のための、好ましくはさらに別の成分の添加後の請求項７〜１０または３４〜３８のいずれか１項に記載のタンパク質および／または融合タンパク質の使用。５３．予防的および／または治療的ワクチン接種のためのワクチンの製造のための、好ましくはさらに別の成分の添加後の請求項１〜６または１１〜３３のいずれか１項に記載のハイブリッドウイルス様粒子の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ，ＪＰ，ＭＸ，ＵＳ (71)出願人メディゲンアクチエンゲゼルシャフトドイツマルティンスライドＤ−82152、ロッハハメルストラッセ 11 (72)発明者ギッスマンラッツ米国イリノイ 60514、ウイロウブルック、アメリカナドライブ 1201番 6340 (72)発明者ゾウジアン米国イリノイ 60514、ウイロウブルック、ステワートドライブ 1021番 5931 (72)発明者ミュラーマーティン米国イリノイ 60622、シカゴノースホイネ 1351 (72)発明者ペインスティルジャネット米国イリノイ 60154、ウエストチェスターエバーズアベニュー 1441

Claims

【特許請求の範囲】１．ウイルス構造タンパク質Ｌ１および／またはＬ２の発現後に形成される組み換え的に製造されたパピローマウイルス様粒子であって、Ｌ１および／またはＬ２タンパク質の１個または複数個の部分が欠失しており、それによりウイルス様粒子を形成する能力が残存していることを特徴とする、上記のパピローマウイルス様粒子。２．Ｌ１タンパク質中の欠失部分がウシパピローマウイルス１型のアミノ酸配列３１１−３５１、３３１−３７１、３９１−４３１に関係していることを特徴とする、請求項１に記載のウイルス様粒子。３．Ｌ１タンパク質中の欠失部分がヒトパピローマウイルス１６のアミノ酸配列３０６−３１５に関係していることを特徴とする、請求項１に記載のウイルス様粒子。４．Ｌ１および／またはＬ２タンパク質の欠失部分が、融合タンパク質を得るために、他のタンパク質またはタンパク質断片で置き換えられていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。５．Ｌ１またはＬ２タンパク質のしめる割合が、融合タンパク質の約５０〜９９％、好ましくは約６０〜９０％、特に好ましくは約８０％であることを特徴とする請求項４に記載のウイルス様粒子。６．Ｌ１またはＬ２タンパク質中の欠失部分がパピローマウイルスの他のタンパク質および／または他の起源のタンパク質で置き換えられており、それによってハイブリッドウイルス様粒子を製造することができることを特徴とする、請求項４および５に記載のウイルス様粒子。７．ウイルス様粒子の形成が、Ｌ１融合タンパク質または完全Ｌ１タンパク質およびＬ２融合タンパク質から生じることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。８．融合タンパク質が異なるＨＰＶ型の欠失したＬ１および／またはＬ２タンパク質及びその他のタンパク質またはその断片を含むことを特徴とする、特には請求項４〜７のいずれか１項に記載のハイブリッドパピローマウイルス様粒子の形成のための融合タンパク質。９．他のタンパク質または断片が初期タンパク質または断片であることを特徴とする請求項８に記載の融合タンパク質。１０．初期タンパク質Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７またはその断片に関係することを特徴とする、請求項８および９に記載の融合タンパク質。１１．ＨＰＶ６、１１、１６、１８、３３、３５、４５などの異なる型のＨＰＶの欠失されたＬ１および／またはＬ２タンパク質に関係することを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。１２．ウイルス構造タンパク質Ｌ１および／またはＬ２の発現後に形成される組み換え的に製造されたパピローマウイルス様粒子であって、Ｌ１および／またはＬ２タンパク質の１個または複数個の部分が欠失しており、それによりウイルス様粒子を形成する能力が本来の形成および／またはインビトロ産生と比較して増加していることを特徴とする上記のパピローマウイルス様粒子。１３．パピローマウイルスのＬ１および／またはＬ２タンパク質中の欠失部分の少なくとも１個がＣ−末端アミノ酸配列に関係していることを特徴とする請求項１２に記載のウイルス様粒子。１４．Ｌ１および／またはＬ２タンパク質中のＣ−末端部分に少なくとも１個存在する欠失部分が、パピローマウイルスの長さが約１〜３４のアミノ酸、好ましくは１〜２６のアミノ酸のアミノ酸配列に関係していることを特徴とする請求項１３に記載のウイルス様粒子。１５．挿入後、特にＬ１および／またはＬ２タンパク質中へのＣ−末端欠失の挿入後に、ＶＬＰｓの産生が多数倍、好ましくは少なくとも１０倍、特には約１０〜１００倍増加することを特徴とする請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。１６．Ｌ１および／またはＬ２タンパク質中の欠失部分がウシパピローマウイルスの２６個のＣ−末端アミノ酸に関係することを特徴とする請求項１２〜１５のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。１７．Ｃ−末端の欠失、ヌクレオチド位置７０１６から７０９３：ＧＧＧＧＣＡＧＧＡＴＧＴＴＣＡＡＣＴＧＴＧＡＧＡＡＡＡＣＧＡＡＧＡＡＴＴＡＧＣＣＡＡＡＡＡＡＣＴＴＣＣＡＧＴＡＡＧＣＣＴＧＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡに対応する長さ２６のアミノ酸（Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）がウシパピローマウイルス１型のＬ１のＯＲＦ中に挿入されていることを特徴とする請求項１６に記載のウイルス様粒子。１８．Ｌ１および／またはＬ２タンパク質中の欠失部分がヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）の３４個のＣ−末端アミノ酸に関係していることを特徴とする請求項１２〜１５のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。１９．Ｃ−末端の欠失、ヌクレオチド位置７０５２から７１５３：ＧＣＡＧＧＡＴＴＧＡＡＧＧＣＣＡＡＡＣＣＡＡＡＡＴＴＴＡＣＡＴＴＡＧＧＡＡＡＡＣＧＡＡＡＡＧＣＴＡＣＡＣＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＣＴＣＴＡＣＡＡＣＴＧＣＴＡＡＡＣＧＣＡＡＡＡＡＡＣＧＴＡＡＧＣＴＧに対応する長さ３４のアミノ酸、（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ）がヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）のＬ１のＯＲＦ中に挿入されていることを特徴とする請求項１８に記載のウイルス様粒子。２０．Ｌ１および／またはＬ２タンパク質中のＣ−末端部分に少なくとも１個存在する欠失部分が、ヒトパピローマウイルス１６または他のパピローマウイルスの相同アミノ酸配列に関係していることを特徴とする請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。２１．Ｌ１および／またはＬ２タンパク質の欠失が核局在シグナル（ＮＬＳ）を含むことを特徴とする請求項１２〜２０のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。２２．Ｌ１タンパク質またはＬ１およびＬ２タンパク質からの粒子の産生が細胞質中で生じることを特徴とする請求項１２〜２１のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。２３．粒子が上清液体中に分泌されることを特徴とする請求項１２〜２２のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。２４．約５から１０％の粒子が上清液体中に分泌されることを特徴とする請求項２３に記載のウイルス様粒子。２５．Ｌ１タンパク質またはＬ１およびＬ２タンパク質の発現が大腸菌中で生じることを特徴とする請求項１２〜２４のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。２６．Ｌ１タンパク質中のＣ−末端の欠失に６個のヒスチジンが挿入されたことを特徴とする請求項２５に記載のウイルス様粒子。２７．ＶＬＰｓの産生が大腸菌中でのＬ１タンパク質またはＬ１およびＬ２タンパク質の発現後に生じることを特徴とする請求項２５〜２６のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。２８．Ｌ１タンパク質中のさらに別の欠失部分がウシパピローマウイルス１型のアミノ酸配列３１１−３５１、３３１−３７１、３９１−４３１に関係していることを特徴とする、請求項１２〜２７のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。２９．Ｌ１タンパク質中のさらに別の欠失部分がヒトパピローマウイルス１６のアミノ酸配列３０６−３１５に関係していることを特徴とする、請求項２７に記載のウイルス様粒子。３０．Ｌ１および／またはＬ２タンパク質の欠失部分が融合タンパク質を得るために他のタンパク質またはタンパク質断片で置き換えられていることを特徴とする、請求項１２〜２９のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。３１．Ｌ１またはＬ２タンパク質のしめる割合が、融合タンパク質の約５０〜９９％、好ましくは約６０〜９０％、特に好ましくは約８０％であることを特徴とする請求項３０に記載のウイルス様粒子。３２．Ｌ１またはＬ２タンパク質中の欠失部分が、パピローマウイルスの他のタンパク質および／または他の起源のタンパク質で置き換えられており、それによってハイブリッドウイルス様粒子を製造することができることを特徴とする、請求項３０および３１に記載のウイルス様粒子。３３．ウイルス様粒子の形成がＬ１タンパク質、Ｌ１融合タンパク質、Ｌ１タンパク質およびＬ２タンパク質、Ｌ１融合タンパク質およびＬ２タンパク質、Ｌ１タンパク質およびＬ２融合タンパク質、またはＬ１融合タンパク質およびＬ２融合タンパク質から生じることを特徴とする、請求項１２〜３２のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。３４．パピローマウイルスのＬ１および／またはＬ２タンパク質中の欠失部分の少なくとも１個がＮ−末端アミノ酸配列に関係していることを特徴とする、請求項１２〜３３のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。３５．パピローマウイルスのＬ１および／またはＬ２タンパク質中の欠失部分の少なくとも１個が上記タンパク質の中間部分におけるアミノ酸配列に関係していることを特徴とする、請求項１２〜３４のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。３６．Ｌ１および／またはＬ２タンパク質の１個または複数個の部分が欠失していることを特徴とする、特には請求項１２〜３５のいずれか１項に記載のハイブリッドパピローマウイルス様粒子の形成のためのタンパク質。３７．Ｌ１および／またはＬ２タンパク質中の少なくとも１個の欠失部分がＣ −末端アミノ酸配列の欠失であることを特徴とする、請求項３６に記載のタンパク質。３８．異なるパピローマウイルスの欠失したＬ１および／またはＬ２タンパク質、並びにパピローマウイルスのまたは他の起源の他のタンパク質または断片を含むことを特徴とする、特には請求項１２〜３７のいずれか１項に記載のハイブリッドパピローマウイルス様粒子の形成のための融合タンパク質。３９．他のタンパク質または断片が初期パピローマウイルスタンパク質またはその断片であることを特徴とする、請求項３８に記載の融合タンパク質。４０．初期タンパク質Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７またはその断片に関係することを特徴とする、請求項３８または３９に記載の融合タンパク質。４１．ＨＰＶ６、１１、１６、１８、３１、３３、３５、４５などの異なるＨＰＶ型の欠失されたＬ１および／またはＬ２タンパク質に関係することを特徴とする、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。４２．タンパク質および融合タンパク質の発現がウイルスまたは真核ベクター中で実施されることを特徴とする、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質の発現方法。４３．タンパク質および融合タンパク質の発現がウイルス、真核または原核ベクター中で行われることを特徴とする、請求項１２〜３５のいずれか１項に記載のタンパク質および／または融合タンパク質の発現並びにパピローマウイルス様粒子の製造方法。４４．タンパク質または融合タンパク質がワクシニア組換え体中での発現により産生されることを特徴とする、請求項４２または４３のいずれか１項に記載の方法。４５．タンパク質および融合タンパク質の発現をバキュロウイルス中または酵母中で行うことを特徴とする、請求項４２または４３のいずれか１項に記載の方法。４６．タンパク質および融合タンパク質の発現を大腸菌中で行うことを特徴とする請求項４３に記載の方法。４７．精製、特にはＬ１タンパク質の精製をＮｉ−アフィニティクロマトグラフィーおよび脱変性により、好ましくは１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ₂、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）中で行なうことを特徴とする、請求項４６に記載の方法。４８．タンパク質が精製の時点で変性緩衝液中に存在していることを特徴とする、請求項４７に記載の方法。４９．変性緩衝液が６Ｍグアニジン塩酸塩であることを特徴とする、請求項４８に記載の方法。５０．ＶＬＰｓの組立が透析後に生じることを特徴とする請求項４３〜４９のいずれか１項に記載の方法。５１．透析を１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＣａ²⁺、１０％のＤＭＳＯ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、および１０ｍＭのトリス酢酸（ｐＨ＝５．０）に対して行うことを特徴とする、請求項５０に記載の方法。５２．粒子の産生が細胞質中で生じることを特徴とする、請求項４３〜５１のいずれか１項に記載の方法。５３．粒子が上清液体中に分泌されることを特徴とする、請求項４３〜５２のいずれか１項に記載の方法。５４．約５から１０％の粒子が上清液体中に分泌されることを特徴とする請求項５３に記載の方法。５５．予防的および／または治療的ワクチン接種のためのワクチンの製造のための、好ましくはさらに別の成分の添加後の請求項８〜１１または３６〜４１のいずれか１項に記載のタンパク質および／または融合タンパク質の使用。５６．予防的および／または治療的ワクチン接種のためのワクチンの製造のための、好ましくはさらに別の成分の添加後の請求項１〜７または１２〜３５のいずれか１項に記載のハイブリッドウイルス様粒子の使用。