PT1015561E

PT1015561E - Método in vitro para desorganização/reorganização de partículas semelhantes ao vírus papilomavírus (vlps)

Info

Publication number: PT1015561E
Application number: PT98942011T
Authority: PT
Inventors: Michael P Mccarthy; Joann Suzich
Original assignee: Medimmune Inc
Priority date: 1997-09-05
Filing date: 1998-08-19
Publication date: 2006-11-30
Also published as: LU91314I9; US6416945B1; JP4199416B2; JP2009057377A; JP2001515922A; ES2572628T3; AU9015498A; ES2268787T3; HK1030797A1; DE122007000015I2; EP1700911B1; FR07C0012I1; DE122007000015I1; EP1015561B1; CA2302545C; US6261765B1; DE69835294T2; EP1015561A1; AU742409B2; CY2007007I2

Description

DESCRIÇÃO "MÉTODO IN VITRO PARA DESORGANIZAÇÃO/REORGANIZAÇÃO DE PARTÍCULAS SEMELHANTES AO VÍRUS PAPILOMAVÍRUS (VLPS)"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um meio altamente eficiente de desorganização de partículas semelhantes ao vírus papilomavírus (VLPs), em capsómeros e/ou subunidades mais pequenas, e reorganização em VLPs. Estas composições contendo VLP reorganizada produzida pela invenção, expressam epitopos conformacionais, neutralizadores e possuem homogeneidade elevada e, por esse motivo, compreendem agentes profilácticos e de diagnóstico eficazes para diagnóstico ou prevenção da infecção por papilomavírus. A presente invenção refere-se, também, à utilização de tais VLPs para encapsulação das porções desejadas, e. g., agentes terapêuticos ou de diagnóstico e à sua utilização como "pseudoviriões" para avaliar a eficácia de supostas vacinas ou terapêuticas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os papilomavírus infectam uma vasta variedade de espécies diferentes de animais, incluindo humanos. A infecção é, tipicamente, caracterizada pela indução de tumores epiteliais e fibro-epiteliais benignos, ou verrugas, no local da infecção. Cada espécie de vertebrados é infectada por um conjunto específico da espécie de papilomavírus, compreendendo, ela 1 própria, vários tipos diferentes de papilomavirus. Por exemplo, foram isolados mais de sessenta genótipos diferentes de papilomavirus humanos (HPV). Os papilomavirus são agentes altamente infecciosos específicos para a espécie. Por exemplo, os papilomavirus caninos e de coelhos não podem induzir papilomas em espécies heterólogas, tais como humanos. A imunidade neutralizadora à infecção contra um tipo de papilomavirus, geralmente, não confere imunidade contra outro tipo, mesmo quando os tipos infectam uma espécie homóloga.

Em humanos, os papilomavirus causam verrugas genitais, uma doença prevalente sexualmente transmitida. Os HPV do tipo 6 e 11 estão, normalmente, muito associados com verrugas genitais benignas, condylomata acuminata. As verrugas genitais são muito comuns e a infecção por HPV, não óbvia ou subclinica, é ainda mais comum que a infecção clinica. Enquanto a maioria das lesões induzidas por HPV são benignas, as lesões que surgem de certos tipos de papilomavirus, e. g., HPV-16 e HPV-18, podem sofrer progressão maligna. Além disso, a infecção por um dos tipos de papilomavirus com malignidade associada é considerada como sendo um factor de risco significativo no desenvolvimento do cancro cervical, o segundo cancro mais comum no mundo, em mulheres. Dos genotipos de HPV envolvidos no cancro cervical, o HPV-16 é o mais comum, sendo observado em cerca de 50% dos cancros cervicais.

Considerando os riscos significativos para a saúde colocados pela infecção por papilomavirus, no geral, e infecção por papilomavirus humanos, em particular vários grupos descreveram o desenvolvimento de antigénios de papilomavirus recombinantes e a sua utilização como agentes de diagnóstico e como vacinas profiláticas. De forma geral, tal pesquisa foi 2 direccionada no sentido da produção de vacinas profiláticas contendo a principal proteína da cápside (Ll) isolada ou em combinação com a proteína da cápside menor (L2) . Por exemplo, Ghim et al., Virology, 190: 548-552 (1992), descreveu a expressão da proteína Ll do HPV-1, utilizando uma expressão de vaccinia em células Cos, que apresentam epitopos conformacionais e a sua utilização como uma vacina ou para typing ou detecção serológica. Este trabalho é também a base do pedido de patente, U.S. N°. de série 07/903109, apresentado a 25 de Junho de 1992 (abandonada a favor do documento U.S. N°. de Série 08/216506, apresentado a 22 de Março de 1994), que foi licenciada pelo requerente deste pedido. Também, Suzich et al., Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A., 92: 11553-11557 (1995), descreve que a imunização de cães com um papilomavírus oral canino recombinante (COPV) expresso num sistema de baculovírus/célula de insecto previniu, completamente, o desenvolvimento de papilomas mucosais virais. Estes resultados são importantes, devido às semelhanças significativas entre muitos HPVs e COPV. Por exemplo, o COPV, semelhante aos HPVs associados com cancro genital e anogenital, infecta e induz lesões num local mucosal. As sequências Ll do COPV partilham também semelhanças estruturais com as sequências Ll do HPV. Consideradas estas semelhanças, o modelo COPV/beagle é útil para investigação de vacinas contendo a proteína Ll, e. g., investigação da resposta imunitária protectora, protecção da infecção natural e optimização de protocolos de vacinação. (Id.)

Um grupo de investigação da Universidade de Rochester referiu também a produção da proteína principal da cápside do papilomavírus humano (Ll) e partículas semelhantes a vírus, utilizando um sistema de expressão baculovírus/célula de insecto (Rose et al., University of Rochester, documento WO 94/20137, publicado a 15 de Setembro de 1994) . Em particular, descreve a 3 expressão da proteína principal da cápside LI do HPV-6 e HPV-11 e a produção de partículas semelhantes a vírus HPV-6, HPV-11, HPV-16 e HPV-18.

Ainda, o grupo de investigação da Universidade de Queensland revelou, supostamente, também a preparação recombinante das proteínas LI e/ou L2 do papilomavírus e partículas semelhantes a vírus, bem como a sua potencial utilização como vacinas (Frazer et al., documento WO 93/02189, publicado a 4 de Fevereiro de 1993).

Ainda também, um grupo de investigação do governo dos Estados Unidos descreveu proteínas da cápside de papilomavírus recombinante, supostamente, capazes de se auto-organizarem em estruturas capsoméricas e cápsides virais que compreendem epitopos antigénicos conformacionais (Patente U.S. N°. 5437951, Lowy et al., concedida a 1 de Agosto de 1995). As reivindicações desta patente são direccionadas para uma sequência de ADN de HPV-16 específica que codifica uma proteína LI capaz de se auto-organizar e sua utilização para expressar cápsides de HPV-16 recombinantes, contendo a referida proteína LI de HPV-16.

No que se refere às vacinas contendo a proteína da cápside de HPV, é largamente aceite pelos especialistas na técnica que um pré-requisito necessário de uma vacina eficaz, baseada na principal proteína da cápside LI do HPV, é que a proteína LI apresente epitopos conformacionais expressos pelas proteínas principais da cápside do papilomavírus humano nativo (ver, e. g., Hines et al., Gynecologic Oncology, 53: 13-20 (1994); Suzich et al., Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A., 92: 11553-11557 (1995)). 4

Ambas as partículas e não partículas de proteínas LI de HPV recombinante que apresentam epitopos LI de HPV conformacionais nativos foram referidas na literatura. Sabe-se que a LI é estável em várias configurações oligoméricas, e. g., (i) capsómeros que compreendem pentâmeros da proteína LI e (ii) cápsides que são constituídas por setenta e dois capsómeros numa estrutura icosaédrica T=7. Sabe-se também que a proteína Ll, quando expressa em células eucariótas por si própria, ou em combinação com L2, é capaz de auto-organização eficaz em estruturas semelhantes a cápsides referidas, geralmente, como partículas semelhantes a vírus (VLPs).

As VLPs foram apresentadas como sendo morfologicamente e antigenicamente semelhantes a autênticos viriões. Além disso, a imunização com VLPs tem sido apresentada como induzindo a produção de anticorpos neutralizadores de vírus. Mais especificamente, os resultados com vários papilomavírus animais (papilomavírus oral canino e papilomavírus-4 bovino) sugeriram que a imunização com VLPs resulta na protecção contra subsequente infecção por papilomavírus. Consequentemente, as VLPs constituídas por proteínas Ll de HPV foram propostas como vacinas para prevenir doenças associadas com infecções por papilomavírus humano.

Por exemplo, tem sido verificado que a proteína Ll pode organizar-se em VLPs, quando expressa utilizando baculovírus recombinantes e vectores de vírus da vaccinia e em leveduras recombinantes (Hagensee et al., J. Virol., 68: 4503-4505 (1994);

Hofmann et al., Virology, 209: 506-518 (1995); Kirnbauer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89: 12180-12184 (1992); Kirnbauer et al., J. Virol., 67: 6929-6936 (1993); Rose et al., J. Virol., 67: 1936-1944 (1993); Sasagawa et al., Virology, 206: 126-135 5 USA, 92: 11553- 504-512 (1994); (1995); Suzich et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 11557 (1995); Volpers et al., Virology, 200:

Zhou et al., J. Virol., 68: 619-625 (1994)). A maioria das preparações anteriores de LI recombinante isoladas de células eucariótas resultaram numa população variável de VLPs aproximando-se dos 55 nm de diâmetro, que são semelhantes em aspecto, aos viriões intactos. No entanto, a organização VLP é, um pouco sensivel ao tipo de célula. Por exemplo, a LI expressa em Escherichia coli é amplamente expressa na forma de capsómeros ou mais pequenos, com poucas ou nenhumas cápsides aparentes, quer na célula ou após purificação (Rose et al., J. Virol., 67: 1936-1944 (1993); Li et al., J. Virol., 71: 2988-2995 (1997)). São observados resultados semelhantes quando a proteina do poliomavirus VP1 é expressa em E. coli (Salunke et al., Biophys. J., 56: 887-900 (1989)).

Até à data não foi apresentado um método in vitro eficaz para a desorganização quantitativa e subsequente reorganização das VLPs do papilomavírus. Tal método seria altamente vantajoso na medida em que poderia, potencialmente, permitir a preparação de VLPs de papilomavírus mais estáveis e/ou homogéneas. Isto seria benéfico na medida em que a homogeneidade e estabilidade são ambos aspectos significativos na preparação e caracterização de vacinas durante a preparação. Além disso, a capacidade para desorganizar e organizar VLPs tem aplicações importantes para a purificação de VLP. Como discutido acima, as proteínas LI de HPV expressas em células eucariótas, organizam-se espontaneamente para formar as VLPs. No entanto, a maioria dos processos de purificação de proteínas foi estruturado para purificar proteínas muito mais pequenas do que ~20 milhões de dalton, VLP de 55 nm. O potencial para desorganizar as VLPs extraídas de 6 células eucariótas para o nível dos capsómeros de LI ou mais pequenos, purificar os componentes mais pequenos por técnicas convencionais e, depois, reorganizar para formar VLPs no estado desejado do processo de purificação é muito potente e está, actualmente, a ser utilizado na purificação das VLPs do HPV-16Tr, como discutido abaixo (composto por uma forma mutante da proteína LI do HPV-16 da qual foram delectados os 34 aminoácidos do C-terminal). Finalmente, a capacidade para desorganizar e reorganizar as VLPs in vitro permite o encapsulamento de compostos exógenos desejados no interior da VLP reorganizada.

Tentativas anteriores na desorganização das VLP do papiloma incluíam experiências baseadas no trabalho anterior desenvolvido em papilomavírus, um papovavírus relacionado, em que foi observado que quer a redução dos dissulfuretos e quelação dos catiões foram essenciais para a desorganização dos viriões (Brady et al., J. Virol., 23: 717-724 (1977)). No entanto, no caso das VLPs do HPV foi observado que os baixos níveis de agente de redução (DTT 1-10 mM) , que proporcionam uma desorganização do poliomavírus óptima na presença de baixos níveis de agentes quelantes (e. g., EGTA 0,5-10 mM) , foram apenas ligeiramente eficazes na desorganização das VLPs dos papilomavírus (ver Tabela 1, Li et al., J. Virol., 71: 2988-2995 (1997)) . Em contraste, foi descrito que VLPs da LI de HPV-11 parcialmente tripsinizadas se dissociam, eficazmente, sob tais condições (Li et al., J. Virol., 71: 2988-2995 (1997)). No entanto, esta é uma desvantagem uma vez que a utilização de protease pode resultar em efeitos adversos, e. g., remoção de epitopos de neutralização.

Também, Sapp e colaborador demonstraram que a "desorganização parcial" das VLPs do HPV-33 poderia ser 7 alcançada por tratamento com o agente isolado de redução (DTT 20 mM). No entanto, não foi determinada a extensão da quebra da VLP (Sapp et ai., J. Gen. Virol., 76: 2407-2412 (1995)).

Como discutido acima, a organização da cápside de HPV necessita da proteína LI correctamente dobrada. No entanto, factores adicionais significativos para a formulação e estabilidade da VLP não foram ainda bem elucidados. No que se refere a isto, sabe-se, geralmente, que a organização da VLP pode ser afectada por diversos factores. Por exemplo, factores e condições conhecidos por afectarem a organização para outros vírus incluem, por exemplo: pH, força iónica, alterações pós-tradução de proteínas da cápside virai, ligações dissulfureto e ligação catiónica divalente, entre outros. Por exemplo, a importância da ligação catiónica, especificamente cálcio, na manutenção da integridade do virião tem sido demonstrada para o paliomavírus (Brady et al., J. Virol., 23: 717-724 (1977)), e rotovírus (Gajardo et al., J. Virol., 71: 2211-2216 (1997)). Parece também que as ligações dissulfureto são significativas para a estabilização do poliomavírus (Walter et al., Cold Spring Har. Symp. Quant. Biol., 39: 255-257 (1975);

Brady et al., J. Virol., 23: 717-724 (1977)); e vírus SV40 (Christansen et al., J. Virol., 21: 1079-1084 (1977)). Sabe-se também que factores, tais como o pH e força iónica influenciam a estabilidade da cápside do poliomavírus, presumivelmente, ao afectar as interacções electrostáticas (Brady et al., J. Virol., 23: 717-724 (1977); Salunke et al., Cell, 46: 895-904 (1986);

Salunke et al., Biophys. J., 56: 887-900 (1980)). Sabe-se também que alterações pós-tradução de algumas proteínas da cápside virai podem afectar a estabilidade e organização da cápside, e. g., glicosilação, fosforilação e acetilação (Garcea et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80: 3613-3617 (1983); Xi et al., J.

Gen. Virol., 72: 2981-2988 (1991)). Assim, existem inúmeros factores inter-relacionados que podem afectar a estabilidade, organização e desorganização da cápside que variam, largamente, mesmo para virus relacionados.

Por esse motivo, existe uma necessidade na técnica para a elucidação dos factores que afectam a organização e desorganização da VLP do papilomavirus. Além disso, com base nisto, existe uma necessidade na técnica para um método in vitro eficaz de desorganização e organização das VLPs do papilomavirus que resulte em VLPs com boa homogeneidade, estabilidade e propriedades imunogénicas, i. e., aquelas que apresentam epitopos conformacionais e, de um modo mais particular, de neutralização expressos na superfície de viriões nativos do papilomavirus intactos, . Além disso, existe uma necessidade significativa de métodos para desorganização e organização das VLPs do papilomavirus que obviam os problemas da desorganização parcial da VLP e que evitam a utilização de protease utilizada em métodos anteriores de preparação de VLPs de papilomavirus.

OBJECTIVOS DA INVENÇÃO

Assim, é um objectivo da invenção resolver os problemas da técnica anterior.

Mais especificamente, é um objectivo da invenção proporcionar um novo método para a desorganização e organização das VLPs do papilomavirus. 9

Ainda mais especificamente, é um objectivo da invenção proporcionar um novo método para a desorganização e organização das VLPs do papilomavírus humano. É também um objectivo da invenção proporcionar um método que permite a desorganização e organização quantitativa das VLPs de papilomavírus em grandes quantidades. É outro objectivo da invenção proporcionar composições contendo VLP de papilomavírus, de um modo preferido, composições contendo VLP de papilomavírus humano, de qualidade melhorada, e. g., homogeneidade, imunogenicidade e/ou estabilidade melhoradas. É outro objectivo da invenção proporcionar um meio melhorado de purificação de VLP por incorporação da desorganização/organização de VLP dentro do processo de purificação. É ainda outro objectivo da invenção proporcionar um método para encapsular porções desejadas em VLPs de papilomavírus, e. g., agentes terapêuticos ou de diagnóstico. É outro objectivo da invenção proporcionar VLPs de papilomavírus, de um modo preferido, VLPs de papilomavírus humano, que contenham agentes de diagnóstico ou terapêuticos desejados nelas contidos, e. g., agentes anticancerigenos ou agentes antivirais.

É ainda outro objectivo da invenção preparar "pseudoviriões" para tipos de virus HPV, em que as quantidade recuperáveis de viriões HPV não estão normalmente disponíveis pela encapsulação de compostos exógenos em VLPs de HPV 10 construídos utilizando proteínas LI e L1/L2 do referido papilomavírus de HPV, em particular, um ADN correspondente ao genoma do referido HPV ou um seu fragmento ou um ADN codificando um marcador seleccionável, tal como a β-galactosidase. É ainda outro objectivo da invenção proporcionar um novo método de distribuição de uma porção desejada, e. g., um ADN para as células desejadas, em que o veículo de distribuição para tal porção, e. g., ADN sentido ou anti-sentido, compreende uma VLP de papilomavírus. É ainda outro objectivo da presente invenção utilizar pseudovíriões baseados em VLPs do HPV num ensaio in vitro, para avaliar a eficácia das potenciais vacinas de HPV, que analisa a capacidade dos anticorpos neutralizadores para inibir a inserção de um ADN aqui encapsulado em células normalmente infectadas pelo referido HPV.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Por isso, a invenção refere-se geralmente, a um novo método para desorganização e reorganização de VLPs do papilomavírus, de um modo preferido, VLPs de papilomavírus humano in vitro. A presente invenção proporciona um método para produzir uma composição homogénea contendo partículas semelhantes ao vírus papilomavírus (VLP), cujo método compreende os seguintes passos: (i) desorganização de uma composição contendo uma partícula semelhante a vírus (VLP) por tratamento da referida composição contendo partículas semelhantes a 11 vírus, com uma solução compreendendo um agente de redução de sulfidrilo para desorganizar as referidas VLPs; e (ii) reorganizar as referidas VLPs, desorganizadas pela remoção ou oxidação do agente de redução sulfidrilo, em que as referidas VLPs reorganizadas são capazes de induzir anticorpos neutralizadores de vírus.

Como discutido acima, as VLPs do papilomavírus são constituídas, principalmente, por uma proteína estrutural Ll, que é estável como capsómeros pentaméricos ou cápsides compostos por 72 capsómeros. Tais VLPs podem também compreender a proteína L2. Em particular, pela escolha judiciosa de condições experimentais, os presentes requerentes descobriram, de um modo surpreendente que a desorganização quantitativa das VLPs do papilomavírus (quase inteiramente ao nível dos capsómeros ou mais pequenos), e subsequente reorganização pode ser alcançada, de um modo coerente, pela exposição prolongada das VLPs a uma solução compreendendo uma elevada concentração de, pelo menos, um agente de redução sulfidrilo, de um modo preferido, contido em tampões de força iónica moderada a baixa. Especificamente, o método em causa resulta em composições contendo VLPs reorganizadas de homogeneidade muito elevada, compreendendo predominantemente, partículas na gama de VLPs de tamanho total, em média 56,5 ± 7,0 nm (n=15) com muito poucas VLPs parcialmente reorganizadas ou complexos mais pequenos. Os rendimentos são também muito elevados, i. e., quantitativos, em média 80-90%, em termos de proteína Ll total do material de partida para as VLPs reorganizadas sob condições de desorganização óptimas. Além disso, essencialmente todos os capsómeros previamente 12 dissociados reorganizam-se para produzir VLPs de tamanho total, filtráveis e solúveis.

Verificou-se, de um modo inesperado, que a utilização de tais condições resulta em composições de VLP de papilomavírus de homogeneidade melhorada (relativamente ao material de partida das VLP e a composições de VLP disponíveis), i. e., composições homogéneas constituídas, quase totalmente, por VLPs de papilomavírus que são 55 nm, 150 S. Além disso, observou-se que estas VLPs homogéneas apresentam epitopos de HPV neutralizadores, conformacionais, um pré-requisito de uma vacina profilática baseada em VLP de HPV eficaz. Foi, também, verificado pelos requerentes que, de um modo surpreendente, os quelantes não aumentam a desorganização de VLP e, além disso, podem inibir a reorganização dos capsómeros em VLPs. Como discutido em maior detalhe infra, estas descobertas foram surpreendentes porque para um papovavírus relacionado, poliomavírus, verificou-se que tanto a exposição a níveis baixos de agente de redução de sulfidrilo como a quelantes de iões cálcio, foram essenciais para a desorganização do virião. Por contraste, tais condições são apenas ligeiramente eficazes para a desorganização das VLPs do papiloma.

Como observado, verificou-se também que o capsómero do papilomavírus e composições de VLP, produzidas de acordo com a invenção apresentam epitopos específicos da estrutura (conformacional) , em particular de neutralização que se encontram na superfície dos viriões do papilomavírus intacto. Isto foi demonstrado quer pela sua reactividade com anticorpos monoclonais de papilomavírus anti-Ll específicos da estrutura e de neutralização num ensaio de ELISA e pela sua capacidade para induzir a síntese de anticorpos que neutralizam a infecção pelo 13 vírus papilomavírus num ensaio de infecção RT-PCT. Por esse motivo, eles são bem adequados para utilização como agentes profiláticos para prevenir a infecção PV e para fins de diagnóstico. Além disso, os métodos em causa para a desorganização e reorganização de VLP podem ser aplicadas a diferentes níveis de pureza de VLP. Isto permite a desorganização de misturas em bruto das VLPs, purificação dos componentes de VLP solúveis, mais pequenos (que é mais simples devido ao seu tamanho reduzido), seguido por reorganização no nível desejado do processo de purificação.

Também, como discutido em maior detalhe infra, os métodos em causa proporcionam também a introdução de porções desejadas, e. g., ADNs, proteínas, péptidos, hormonas, radionucleicos, agentes anticancerígenos e agentes antivirais em VLPs durante a reorganização. Isto é vantajoso na medida em que as VLPs podem ser utilizadas como veículos de distribuição (para inserção das porções desejadas nas células) e como "pseudoviriões" para avaliar a eficácia profilática das vacinas de papilomavírus.

Os presentes requerentes colocaram a hipótese de que a desorganização de VLP do papilomavírus necessita de exposição prolongada a níveis muito elevados de agente de redução devido à presença de ligações dissulfureto estabilizadoras que, provavelmente, estão ocultadas e inacessíveis e que a exposição dessas ligações ao solvente por flutuações estruturais locais não é muito frequente. (Este fenómeno é discutido em maior detalhe no pedido N° de Série 08/888050, apresentado a 3 de Julho de 1997.) Aparentemente, após exposição prolongada a concentrações elevadas de agente de redução e a força iónica moderada a fraca, estas ligações tornam-se acessíveis ao longo do tempo. 14

Definições:

Proteína principal da cápside ou proteína LI

Isto refere-se à proteína estrutural do papilomavírus (PV) que constitui a porção principal da estrutura da cápside do PV. Esta proteína tem aplicação descrita na preparação de vacinas de HPV e como um agente de diagnóstico

Proteína menor da cápside ou proteína L2

Isto refere-se à proteína estrutural do papilomavírus que constitui uma porção menor da estrutura da cápside virai do PV.

Partículas semelhantes a vírus ou VLPs

Isto refere-se a estruturas semelhantes a cápside que resultam após expressão e organização de uma sequência de ADN de LI de papilomavírus isolada ou em combinação com uma sequencia de ADN de L2. As VLPs são morfologicamente e antigenicamente semelhantes aos viriões autênticos. As VLPs podem ser produzidas in vivo, em células hospedeiras adequadas, e. g., células hospedeiras de mamíferos e insectos, ou podem formar-se, espontaneamente, após purificação das proteínas LI recombinantes. 15

Pseudovirião

Isto refere-se a VLPs, contendo compostos marcadores exógenos, compostos por proteínas LI ou LI e L2 de um tipo específico de PV. Os pseudoviriões podem ser utilizados, para testar a eficácia de substâncias, tais como anticorpos, para bloquear a ligação virai específica e/ou absorção em células alvo em casos onde não está disponível o vírus autêntico.

Proteína LI correctamente estruturada

Isto refere-se à proteína Ll, (quer monomérica, na forma de pequenos oligómeros (dimeros-tetrâmeros) ou capsómeros), que está numa conformação adequada para reorganização em VLPs e que retém epitopos presentes em cápsides virais ou VLPs.

Capsómeros

Isto refere-se a uma configuração oligomérica da proteína Ll que é constituída por pentâmeros de Ll. Cápsides

Isto refere-se à porção estrutural do papilomavírus que é constituída por capsómeros. Mais especificamente, é constituída por setenta e dois capsómeros numa estrutura icosaédrica T=7. 16

Epitopo LI de HPV Conformacional

Isto refere-se a um epitopo expresso na superfície da proteína LI correctamente organizada que é também expresso por uma proteína LI de um HPV infeccioso do tipo selvagem correspondente. É bem aceite pelos especialistas na técnica que a apresentação de epitopos conformacionais é essencial para a eficácia (quer como agentes profilácticos quer como de diagnóstico) de imunogénios da proteína LI de HPV.

Epitopo LI de HPV Neutralizador Conformacional

Isto refere-se a um epitopo expresso na superfície da proteína LI correctamente estruturada que é também expresso por uma proteína LI de um HPV infeccioso, do tipo selvagem correspondente e que induz anticorpos neutralizadores. É bem aceite pelos especialistas na técnica que a apresentação de epitopos neutralizadores conformacionais é essencial para a eficácia (quer como agentes profilácticos quer como de diagnóstico) de imunogénios da proteína LI de HPV.

Anticorpo Conformacional

Isto refere-se a um anticorpo que se liga, especificamente, a um epitopo expresso na proteína LI correctamente estruturada mas não na proteína LI desnaturada. 17

Solução de Agente de Redução de Elevada Concentração

Isto refere-se a uma solução contendo uma quantidade de, pelo menos, um agente de redução sulfidrilo, e. g., glutationo, β-mercaptoetanol ou ditiotreitol que proporciona a desorganização de, pelo menos, 70% das VLPs do papilomavírus, quando as VLPs estão em contacto com esta durante períodos prolongados, tipicamente, pelo menos, 2 horas e, de um modo mais preferido, pelo menos, 16 horas. A concentração do agente de redução pode variar dependendo do agente de redução em particular. No caso do β-mercaptoetanol, esta quantidade será, de um modo preferido, pelo menos, 1% em peso, de um modo mais preferido, pelo menos, 3-5% em peso. No caso do ditiotreitol, a quantidade será, de um modo preferido, pelo menos, cerca de 100 mM.

Exposição Prolongada ou Contacto das VLPs com a Solução de Agente de Redução de Elevada Concentração

Isto refere-se ao tempo em que as VLPs estão em contacto com a solução de agente de redução de elevada concentração que é suficiente para proporcionar uma desorganização de, pelo menos, 70% das VLPs em capsómeros. De um modo preferido, tal exposição prolongada irá resultar numa desorganização de 70-90% e uma desorganização de VLP total virtualmente óptima. Este período irá variar para os diferentes tipos de PV e pode também depender das células em que as VLPs são expressas (material de partida) , grau de pureza (presença ou ausência de agregados) , pH e força iónica. Adicionalmente, as VLPs formadas a partir da proteína LI quimicamente alterada ou mutada, e. g., proteína LI truncada no terminal C, podem desorganizar-se sob condições moderadas. 18

Geralmente, esta exposição irá durar, pelo menos, 2 horas (no caso das VLPs de ΗΡν-16τΓ) e, mais tipicamente, durante mais tempo, i. e., pelo menos, 12 horas, de um modo mais preferido, pelo menos, 16 horas (no caso das VLPs de HPV-11).

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FIGURAS

Figura 1: análise por SDS/PAGE da proteína LI de HPV-11 purificada. A proteína foi misturada com tampão de preparação da amostra na ausência (faixa 1) ou presença (faixa 2) de DTT 2 mM e fervida durante 2 minutos antes da electroforese de gel.

Na esquerda são apresentadas as posições para as quais migraram os padrões de peso molecular (em Da x 10‘3) .

Figura 2: análise em almofada de sacarose a 30% da desorganização da VLP de HPV-11. As preparações de HPV-11 foram tratadas a 4 °C como descrito no texto e as amostras foram retiradas do topo (T) ou fundo (B) da almofada de sacarose antes da electroforese de gel. Grupo 1, não tratado, material de partida de VLP de HPV-11 purificada em PBS. Grupo 2, VLPs incubadas com βΜΕ a 5% durante 16 horas. Grupo 3, VLPs incubadas com βΜΕ a 5% durante 1 hora. Grupo 4, VLPs incubadas com βΜΕ a 2% durante 16 horas. Grupo 5, VLPs incubadas com βΜΕ a 0,5% durante 16 horas. Grupo 6, VLPs incubadas com DTT 10 mM, EDTA 5 mM durante 16 horas.

Figura 3: análise de gradiente linear de sacarose de 5-20% de VLPs de HPV-11 desorganizadas. As VLPs em PBS foram 19 incubadas com βΜΕ a 5% (a), ou NaHCC>3 200 mM, pH 9,6 (b) durante 16 horas a 4 °C e, depois, centrifugadas num gradiente linear de sacarose de 5-20% como descrito no texto. O gradiente foi recolhido em 25 fracções (0,5 mL) e o sedimento (P) foi ressuspenso em 0,5 mL de PBS. É apresentada uma imunotransferência demonstrando a posição da proteina LI ao longo do gradiente. São também indicadas as posições máximas até às quais os padrões de sedimentação migraram quando corridos em gradientes separados.

Figura 4: análise do gradiente linear de sacarose de 10-65% de VLPs de HPV-11 em vários estados de desorganização. Foi incubada uma aliquota do material de partida das VLPs purificadas (a) com βΜΕ a 5% durante 16 horas a 4 °C (b) . Foi, depois, desorganizada uma porção de VLPs tratadas com βΜΕ por diálise em PBS-NaCl 0,5 para remover o agente de redução (c) . As amostras foram depois centrifugadas em gradientes lineares de sacarose de 10-65% como descrito no texto. Cada gradiente foi recolhido em 12 fracções (1 mL) e o sedimento (P) foi ressuspenso em 1 mL de PBS. São apresentadas imunotransferências demonstrando as posições nas quais a proteina LI migrou nos diferentes gradientes. São também indicadas as posições máximas até nas quais migraram os padrões de sedimentação, como na Fig. 3.

Figura 5: micrografias electrónicas das VLPs de HPV-11 em vários estados de organização. As VLPs, tratadas como descrito foram coradas com ácido fosfotúngstico a 2%, aplicadas nas grelhas e fotografadas a ampliações de 15-25.000 vezes, a, material de partida de VLP purificada, b, VLPs desorganizadas até ao nivel de capsómeros por incubação com βΜΕ a 5% durante 16 horas a 4 °C. c, VLPs 20 reorganizadas a partir de VLPs desorganizadas por diálise em PBS-NaCl 0,5, d, a região central da imagem c a uma maior ampliação. Barra de escala: a, c = 200 nm; b, d, = 100 nm.

Figura 6: Reacção de VLPs desorganizadas e intactas com anticorpos monoclonais específicos de estrutura para HPV-11. Material de partida de VLP de LI de HPV-11 (A), VLPs desorganizadas por tratamento com βΜΕ a 5%, quer sem (B) ou com (C) subsequente diálise em PBS-NaCl 0,5 M para remover o agente de redução e VLPs desorganizadas na presença de carbonato 200 mM, pH 9,6 e depois dializadas em PBS-NaCl 0,5 M (D) foram ligadas aos poços das placas de microtitulação. Os anticorpos monoclonais de estrutura específica para o HPV-11 H11.F1 (neutralizadores de HPV-11; V ) e H11.A3 (não neutralizadores de HPV-11; ·) foram testados para immunorreactividade para os antigénios ligados num ELISA como descrito nos Materiais e Métodos. A reactividade com o anticorpo monoclonal AU1 () , que reconhece um epitopo linear encontrado na LI de HPV-11, foi utilizada como um controlo para demonstrar a ligação do antigénio aos poços de microtitulação.

Figura 7: Comparação da capacidade do anti-soro criado contra as VLPs de HPV-11 iniciais purificadas e VLPs reorganizadas, para neutralizar o vírus HPV-11. O soro anti-HPV-11 foi incubado com viriões de HPV-11 durante 60 min a 37 °C antes da adição as células HaCaT.

Alternativamente, foram adicionados viriões às células sem pré-incubação com soro. Seis dias após a infecção as células foram recolhidas e o ARN total foi extraído. Foram utilizados dez porcento do ARN total para a transcrição 21 reversa e dez porcento do ADNc resultante foi depois utilizado como molde para PCR interno utilizando iniciadores específicos para a mensagem excisada Ε1ΛΕ4 de HPV-11. Os produtos de PCR foram separados em géis de agarose a 2%. Os géis foram corados com brometo de etideo e examinados sob luz UV para a presença da banda E1aE4 de ~0,6 kb (a). A amplificação por PCR da β-actina foi efectuada em todas as amostras de ADNc como um controlo interno (b) . O tamanho esperado da banda da β-actina é ~0,6 kb. A faixa S contém marcadores de tamanho molecular. A faixa C representa reacções efectuadas com ARN de células incubadas sem virus e a faixa V representa células incubadas com virus que não foram pré-incubadas com soro. Como esperado, a banda E1aE4 é detectada em células infectadas com virus mas não em células não infectadas. As faixas seguintes contêm produtos de PCR de células infectadas com virus que foram pré-incubadas com diluições logio em série de anti-soro anti-HPV-11 (10‘3-1CT7) preparado contra VLPs de HPV-11 iniciais purificadas e VLPs reorganizadas como indicado.

Figura 8: comparação por SDS/Page de VLPs de HPV-16Tr nos estados organizado (-βΜΕ) e desorganizado (+βΜΕ, Run 2), indicando a pureza mais elevada das VLPs purificadas no estado desorganizado. A posição para a qual a proteína LI de HPV-16Tr migra é indicada pela seta.

Figura 9: análise de gradiente linear de sacarose de 5-20% de VLPs de HPV-16Tr desorganizadas. As VLPs Run 2 +βΜΕ purificado finais (ver Tabela 3) em PBS foram incubados com βΜΕ a 4% durante 16 horas a 4 °C e, depois, centrifugadas 22 num gradiente linear de sacarose de 5-20% como descrito na secção Métodos. O gradiente foi recolhido em 25 fracções (0,5 mL) e o sedimento (P) foi ressuspenso em 0,5 mL de PBS. É apresentada uma imunotransferência, sondado com o anticorpo monoclonal 16-E especifico para o HPV-16, demonstrando a posição da proteina ao longo do gradiente. São também indicadas as posições máximas para as quais os padrões de sedimentação migraram quando corridos em gradientes separados.

Figura 10: análise de gradiente linear de sacarose de 10-65% de VLPs de HPV-16Tr em vários estados de organização. Uma aliquota de (a) . material de partida de VLP purificado ( + βΜΕ Run 2; ver Tabela 3) foi incubado com βΜΕ a 4% durante 16 horas a 4 °C (b) . Uma porção de VLPs tratadas com βΜΕ foram reorganizados por diálise em PBS-NaCl 0,5 para remover o agente de redução (c) . As amostras foram depois centrifugadas em gradientes lineares de sacarose de 10-65% como descrito no texto. Cada gradiente foi recolhido em 12 fracções (1 mL) e o sedimento (P) foi ressuspenso em 1 mL de PBS. São apresentadas imunotransferências, sondados com o anticorpo monoclonal 16-E especifico de HPV-16, demonstrando as posições até às quais a proteina LI migrou nos diferentes gradientes. São também indicadas as posições máximas até às quais os padrões de sedimentação migraram, como na Fig. 9.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Como discutido, a presente invenção refere-se, geralmente, a um novo método que proporciona uma desorganização altamente 23 eficaz de VLPs de papilomavírus, i. e., pelo menos, 70% de desorganização, de um modo mais preferido, 70-90% de desorganização e, de um modo muito preferido, desorganização total de VLP, que compreende exposição prolongada das VLPs de papilomavírus, constituídos por a proteína Ll ou uma combinação das proteínas Ll e L2, a uma solução de agente de redução sulfidrilo de elevada concentração. No geral, a concentração do agente de redução será, pelo menos, 1% em peso e, de um modo mais preferido, cerca de 3-5% em peso, em que a solução contendo o agente de redução tem, de um modo preferido, uma força iónica que no máximo é de cerca de 0,5 e, de um modo preferido, inferior.

No entanto, as concentrações do agente de redução e força iónica podem variar para os diferentes tipos de papilomavírus, as células hospedeiras das quais são obtidos, formas quimicamente alteradas e/ou mutadas da proteína Ll e pureza. Mais especificamente, os presentes requerentes elucidaram condições para a desorganização máxima de VLPs purificadas in vitro, o que proporciona uma subsequente reorganização eficaz. Tem sido observado que a incubação prolongada de VLPs de papilomavírus com concentrações relativamente elevadas de agentes de redução a forças iónicas que são no máximo 0,5 M e, de um modo mais preferido, próximas da força iónica fisiológica ou inferiores, é tanto necessário como suficiente para gerar capsómeros solúveis homogéneos a partir de VLPs purificadas. Além disso, verificou-se que após remoção ou, alternativamente, por oxidação do agente de redução, é obtida uma população definida de VLPs intactas, apropriadamente dimensionadas.

Isto tem sido verificado utilizando, em particular, VLPs de HPV-11 produzidas num sistema de baculovírus/célula de insecto, 24 i. e., em células de Trichoplasia ni (High Five®) infectadas com um baculovírus recombinante contendo a sequência de ADN de LI de HPV-11 completa. No entanto, com base nestes resultados, é razoável concluir que serão alcançados resultados semelhantes utilizando VLPs de papilomavírus produzidas a partir de outros tipos e espécies, em particular outros tipos de papilomavírus humanos. Isto é compreensível na medida em que várias proteínas LI do papilomavírus demonstraram resultar em VLPs quando expressas em sistemas de vector de expressão recombinantes adequados.

Da mesma maneira, é razoável esperar que sejam alcançados resultados semelhantes utilizando VLPs de papilomavírus compreendendo uma combinação de proteínas LI e L2, na medida em que se apresentam virtualmente idênticas às VLPs constituídas apenas por proteínas Ll. [No entanto, assumindo que a L2 tem uma função estabilizadora significativa, os presentes Requerentes confirmaram que a desorganização pode necessitar da utilização de concentrações mais elevadas de agente de redução, exposição mais prolongada a este, pH elevado e/ou força iónica reduzida durante a desorganização]. Além disso, espera-se que os métodos em causa sejam adequados para a desorganização/organização das VLPs obtidas a partir de qualquer sistema de célula hospedeira que resulte na produção de VLPs de papilomavírus. Enquanto os Requerentes confirmaram que existem algumas diferenças nas células hospedeiras, como discutido supra, foram referidas muitas células hospedeiras como expressando VLPs de papilomavírus na forma de VLPs.

No geral, o material de partida de VLP desejado será produzido num sistema de célula hospedeira adequado, e. g., um sistema baculovírus/célula de insecto e extraído dele utilizando 25 métodos conhecidos. A técnica de extracção irá depender de factores, tais como as células hospedeiras especificas utilizadas, concentração, se a proteina permanece intracelular ou é secretada, entre outros factores. A desorganização das VLPs pode ser efectuada a diferentes niveis de pureza de VLP. Quando efectuada em conjunto com a purificação, as VLPs serão extraídas das células, desorganizadas, purificadas por técnicas convencionais e reorganizadas no grau desejado de pureza. Nos casos onde as VLPs serão utilizadas para encapsular compostos exógenos, ou quando a desorganização/reorganização é efectuada para melhorar a homogeneidade do produto final, as VLPs utilizadas irão ser de pureza elevada. Nestes casos, as VLPs utilizadas para a desorganização terão, de um modo preferido, pelo menos, 10-30% em peso, de um modo mais preferido, 50% em peso e, de um modo muito preferido, pelo menos, 70-90% em peso. Os métodos para determinar a pureza de VLP são bem conhecidos e incluem métodos densitométricos por SDS-PAGE.

Como discutido em detalhe infra na secção materiais e métodos, os presentes Requerentes desenvolveram um ensaio de rastreio rápido para o estudo da desorganização de VLP que utiliza um sistema de gradiente de sacarose. Neste sistema, o as VLPS intactas sedimentam ao longo de uma almofada de sacarose a 30%, enquanto os capsómeros não agregados, oligómeros de LI ou monómeros de LI mais pequenos permanecem no topo da almofada. Por esse motivo, este método de ensaio é benéfico na medida em que facilita a identificação precisa das condições que resultam na desorganização máxima de VLP. 26

De forma geral, verificou-se que a desorganização máxima de VLP necessita de exposição prolongada das VLPs não agregadas a uma solução contendo uma concentração elevada de agente de redução de sulfidrilo. Como explicado previamente, a exposição prolongada é a duração suficiente para resultar em, pelo menos, 7 0% de desorganização das VLPs, de um modo mais preferido, 70-90% de desorganização de VLP e, idealmente, à desorganização virtualmente total de VLP. No caso das VLPs de HPV-11 recombinante produzidas no sistema de células de insecto exemplificado, a desorganização máxima ocorreu após 16 horas a 4 °C (utilizando uma solução contendo β-mercaptoetanol a 5% em peso). No entanto, tais tempos de exposição podem, potencialmente, ser reduzidos utilizando outros materiais de partida de VLP, diferentes condições de pH, concentrações de agente de redução superiores e forças iónicas inferiores. Por exemplo, verificou-se [resultados não apresentados] que a desorganização substancial das VLPs formadas por uma forma truncada no terminal C da proteina LI do HPV-16 pode ser efectuada pela exposição de tais VLPs com uma solução de β-mercaptoetanol (4%) após cerca de 2 horas a 4 °C. O método de desorganização de VLP em causa tem demonstrado ser eficaz utilizando β-mercaptoetanol e ditiotreitol como os agentes de redução. No entanto, espera-se que outros agentes de redução conhecidos deverão proporcionar resultados semelhantes. Exemplos de agentes de redução adequados na invenção incluem glutationo, β-mercaptoetanol, ditiotreitol, ditioeritritol, cisterna, hidrogenossulforeto e suas misturas.

Como referido, o presente método coloca em contacto VLPs com uma solução com uma elevada concentração de agente de redução sulfidrilo. Aqui, isto é definido como sendo uma 27 resulta numa concentração de agente de redução que desorganização substancial das VLPs, i. e., pelo menos, 70%, de um modo preferido, pelo menos, 70-90% e, de um modo muito preferido, a desorganização virtualmente total de VLP, após exposição prolongada.

Estas elevadas concentrações de agente de redução irão variar dependendo dos agentes de redução, em particular, ou combinação. No caso do β-mercaptoetanol, verificou-se que uma concentração de, pelo menos, cerca de 5% em peso (713 mM) resulta numa desorganização de VLP de LI de HPV-11 óptima à força iónica fisiológica. Concentrações inferiores de agente de redução e períodos de exposição reduzidos resultam numa desorganização de VLP menos eficaz. Por exemplo, verificou-se que soluções de β-mercaptoetanol a 4% proporcionam também uma desorganização eficaz (pelo menos 70%).

Foi também verificado que a força iónica é um parâmetro importante no método de desorganização. De um modo preferido, a desorganização será efectuada utilizando uma solução com uma força iónica que tem no máximo 0,5 e, de um modo preferido inferior, de um modo mais preferido, a desorganização irá ser efectuada a, próximo da, força iónica "fisiológica" (i. e., NaCl 0,15) ou inferior. Verificou-se que forças iónicas superiores tornam o método de desorganização menos eficaz. Em geral, a força iónica irá ser, no máximo, cerca de 0,5, de um modo mais preferido, no máximo, cerca de 0,25, e de um modo muito preferido, no máximo cerca de 0,15.

Foi também verificado que a presença de agregação de VLP tem efeitos adversos na desorganização. Este efeito pode ser evitado por remoção do material agregado ou, potencialmente, 28 pode ser evitado por exposição mais prolongada das VLPs à solução de agente de redução de elevadas concentrações de. Isto ocorre, provavelmente, porque às ligações dissulfureto são ocultadas e, assim, inacessíveis para o agente de redução nos agregados, prevenindo, desse modo, a desorganização.

Também, como discutido, tem sido verificado, de um modo surpreendente que quelantes, mesmo a concentrações elevadas, não têm um efeito significativo na desorganização de VLP de HPV-11. Isto foi apresentado utilizando quer EGTA quer EDTA, ambos quelantes bem conhecidos, sozinhos ou em combinação com ditiotreitol. Como discutido previamente, isto é surpreendente porque os agentes quelantes têm sido referidos como necessários na desorganização de VLP para um papovavirus relacionado.

Além disso, verificou-se que o tampão carbonato (NaHCCb 0,2 M pH 9,6) causou uma desorganização significativa das VLPs de HPV-11. No entanto, ao contrário da desorganização induzida por exposição prolongada aos agentes de redução sulfidrilo, não foi possivel reorganizar as VLPs tratadas com carbonato. Foi colocada a hipótese que o tratamento com carbonato desnatura, parcialmente, a proteina Ll. Isto demonstra que apenas esses métodos (tais como exposição prolongada a concentrações eficazes de agentes de redução sulfidrilo) que desorganizam VLPs enquanto retêm a estrutura da proteina Ll correctamente estruturada, irão produzir material que é competente para reorganizar VLPs de tamanho total solúveis.

Como observado, a desorganização das VLPs de HPV-11 em causa resulta em capsómeros de elevada homogeneidade que apresentam epitopos conformacionais neutralizadores, como demonstrado pela sua reactividade com anticorpos monoclonais 29 conformacionais neutralizadores produzidos contra o papilomavírus em particular (HPV-11 exemplificado). Além disso, sob condições óptimas, o método em causa resulta numa composição em que as VLPs parecem estar totalmente dissociadas em capsómeros. Reciprocamente, a desorganização de VLPs de HPV-16Tr em causa parece resultar numa mistura de capsómeros, oligómeros de LI e monómeros de LI mais pequenos. No entanto, esta mistura de oligómeros de LI é também capaz de desorganização quantitativa. Isto indica que o método em causa proporciona a proteina LI correctamente estruturada, na forma de capsómeros, oligómeros de LI ou monómeros de LI mais pequenos que é competente para a reorganização de VLP.

Como discutido, uma vantagem particular da invenção é que estes capsómeros podem, depois, ser reorganizados quantitativamente em VLPs, simplesmente por remoção da solução do agente de redução. A remoção do agente de redução pode ser efectuada por vários métodos, e. g., diálise ou cromatografia de coluna. Alternativamente, a adição de excesso de oxidantes pode, potencialmente, promover a reformação apropriada das ligações dissulfureto apropriadas, conduzindo à reorganização de VLP. Como discutido acima, a reorganização é afectada pela integridade estrutural do material de partida da proteina LI correctamente estruturada. A solubilidade do material afecta também a reorganização, uma vez que o material agregado não irá reorganizar-se quantitativamente.

Em geral, a reorganização será efectuada por remoção do agente de redução sulfidrilo ou adição de oxidantes e exposição do material de partida da proteina LI correctamente estruturada a condições de força iónica mais elevadas, e. g., pelo menos, cerca de 0,5 ou superior. As concentrações de sal elevadas 30 funcionam para estabilizar as VLPs. No entanto, a adição de agentes quelantes tem o efeito oposto, i. e., inibem, moderadamente a reorganização.

De forma surpreendente, tal reorganização resulta em VLPs que são muito mais homogéneas em tamanho de particula que o material de partida de VLP original. Isto foi demonstrado por

comparação do material de partida de VLP e o produto de VLP reorganizado em gradientes lineares de sacarose de 10-65% e por observação sob microscópio electrónico. Foram detectadas, predominantemente, particulas na gama das VLPs, de tamanho total, medindo em média 56,5 ± 7,0 nm com muito poucas VLPs parcialmente reorganizadas ou complexos mais pequenos aparentes. Os rendimentos são, também, muito superiores, em média cerca de 80-90% em termos de proporção da proteína LI total do material de partida para VLPs reorganizadas utilizando condições de reorganização óptimas. Essencialmente, todo o material de partida reorganizado parece corrigir VLPs de tamanho total, filtráveis e solúveis. Também, estas VLPs exibem epitopos conformacionais neutralizadores encontrados na superfície de viriões de papilomavírus autênticos e induzem anticorpos neutralizadores tão potentes como o material de partida.

Enquanto estes resultados são novos e inesperados, espera-se, contudo, que um especialista na técnica, com base nos ensinamentos do pedido, possa alcançar rendimentos ainda maiores de VLP fazendo variar a concentração de proteína, pH, força iónica e/ou cinéticas.

Como discutido, a presente invenção proporciona também métodos para produzir VLPs de papilomavírus que tenham, nelas 31 encapsulada, uma porção ou porções desejadas. Isto será, geralmente, efectuado pelos seguintes passos: (i) obtenção de VLPs de um papilomavírus desejado, que são constituídas de proteína LI ou uma combinação das proteínas LI e L2; (ii) desorganização de tais VLPs, colocando tais VLPs em contacto com uma solução contendo uma concentração elevada de agente de redução sulfidrilo com uma força iónica que é, no máximo, 0,5; (iii) colocar em contacto as VLPs desorganizadas com uma solução contendo uma porção a ser encapsulada nelas e, opcionalmente, contendo também a proteína L2 purificada (e. g., se as VLPs desorganizadas não compreenderem a proteína L2); e (iv) reorganização das referidas VLPs desorganizadas por remoção do agente de redução sulfidrilo ou por adição de oxidante em excesso, produzindo, deste modo VLPs contendo a(s) porção(ões) desejada(s).

Os passos de desorganização e reorganização são conduzidas como descrito previamente, i. e., a desorganização é efectuada pela utilização de concentrações elevadas de agentes de redução sulfidrilo, tipicamente, pelo menos, 1% em peso ou superior e durante períodos prolongados, i. e., pelo menos, 2 horas e, tipicamente, superiores, e. g., pelo menos, 16 horas. Como discutido, o tempo de exposição e concentração do agente de redução são afectados pelo tipo de VLPs de papilomavírus, o sistema de célula hospedeira no qual são produzidas, mutações na proteína LI (e. g., truncamentos no terminal C), nível de 32 pureza, se estão presentes agregados e, potencialmente, se as VLPs são constituídas por LI ou uma combinação de LI e L2. A reorganização ocorre após a remoção ou oxidação do agente de redução sulfidrilo.

Como discutido previamente, enquanto é razoável assumir que as VLPs que compreendem LI e L2 irão desorganizar-se sob condições semelhantes as VLPs baseadas em Ll, a proteína L2 podem desempenhar uma função estabilizadora. Por esse motivo, a desorganização de VLPs que compreendem Ll e L2 podem, potencialmente, necessitar de concentrações mais elevadas de agente de redução, exposição a estes mais prolongada, força iónica reduzida, pH elevado ou uma combinação destes. Alternativamente, as VLPs constituídas inteiramente de proteínas Ll de PV podem ser desorganizadas como aqui ensinado e pode ser adicionada proteína L2 purificada (produzida por métodos recombinantes) durante o passo de reorganização.

As porções que podem ser encapsuladas nas VLPs incluem porções de diagnóstico e terapêuticas, e. g., sequências de ácido nucleico, radionuclidos, hormonas, péptidos, agentes antivirais, agentes antitumorais, agentes moduladores do crescimento celular, inibidores do crescimento celular, citocinas, antigénios, toxinas, etc.

As VLPs em causa, que contêm uma porção desejada nelas encapsulada, após administração a num hospedeiro desejado, de um modo preferido, humano, deverão ser capturadas por células normalmente infectadas pelo papilomavírus particular, e. g., células epiteliais, queratinócitos, etc., proporcionado, deste modo, a potencial internalização da referida porção encapsulada nestas células. Isto pode facilitar a utilização das VLPs em 33 causa para terapia (como oposto à profilaxia) porque permite a distribuição de um agente terapêutico num local celular desejado, e. g., um local de cancro cervical. Considerando a especificidade dos PVs no geral, isto pode proporcionar meios altamente selectivos de distribuição de porções desejadas às células alvo. Por exemplo, pode proporcionar um meio de distribuição de sequências de ácido nucleico, e. g., um ADN codificando um polipéptido terapêutico ou uma sequência anti-sentido. A porção ou porções encapsuladas não deverão, com certeza, afectar adversamente a organização e/ou estabilidade de VLP. Isto pode ser determinado produzindo VLPs contendo a porção desejada e avaliando os seus efeitos, se existirem, na organização e/ou estabilidade de VLP.

No caso de ADNs ou ARNs, a sequência nucleica encapsulada pode ter até 8 kilobases, o tamanho do genoma do PV. No entanto, tipicamente, as sequências encapsuladas serão mais pequenas, e. g., na ordem de 1-2 kilobases. Tipicamente, estes DNAs irão codificar um polipéptido desejado, e. g., polipéptido terapêutico, tal como uma enzima, hormona, factor de crescimento, etc. Esta sequência irá ser depois ligada operativamente a sequências que facilitam a sua expressão nas células hospedeiras alvo.

Outra aplicação das VLPs contendo ADNs encapsulados são os "pseudoviriões". Quanto a isto, muitos papilomavírus, incluindo os envolvidos em doenças humanas, são raros, não podem ser propagados rapidamente in vitro e não podem ser facilmente purificados de fontes celulares humanas em quantidades que facilitem a sua utilização em ensaios de neutralização com 34 anticorpos. Isto é problemático, na medida em que previne ou torna difícil avaliar a praticabilidade de vacinas ou terapêuticas para protecção contra estes vírus HPV específicos. Exemplos de tipos de HPV para os quais não existem, actualmente, stocks disponíveis, incluem HPV-31, 33, 35 e 45. A presente invenção deverá obviar ou, pelo menos, reduzir tais problemas. Essencialmente, serão construídos "pseudoviriões" correspondendo a estes vírus que compreendem VLPs que são constituídas por LI ou uma combinação das proteínas LI e L2 do PV em particular e, ainda, nelas encapsuladas parte do genoma do referido papilomavírus ou um ADN codificando um marcador seleccionável

Este pseudovirião será utilizado num ensaio de "infectividade" celular in vitro para avaliar a eficácia de vacinas de VLP correspondentes. Essencialmente, isto será efectuado por contacto de células com tais pseudoviriões. Estes pseudoviriões deverão ligar-se a tais células e proporcionar a inserção do referido ADN. Depois disso, a inserção do referido ADN pode ser avaliada por métodos conhecidos, e. g., métodos de hibridação por PCR ou baseados na expressão do marcador seleccionável, e. g., β-galactosidase.

Isto irá ser efectuado quer na presença e ausência de anticorpos gerados contra proteínas LI ou L2 especificas para o HPV em particular. Se a inserção é inibida, como determinado, e. g., com base na expressão reduzida do marcador seleccionável, isto é uma indicação de que a proteína LI ou L2 induz a produção de anticorpos neutralizadores de vírus. 35 A presente invenção é aplicável para a produção de VLPs para qualquer papilomavirus e, em particular, qualquer papilomavirus humano. Têm sido descritos muitos ADNs de LI e L2 de HPV na literatura e estão disponiveis publicamente (ver, e. g., Baker, Sequence Analysis of Papillomavirus, Genomes, pp. 321 -384; Long et al., Patente U.S. N°. 5437931, Cole et <3_Z . r J· Mol Biol., 193: 599- -608 (1987); Danos et al., EMBO J., 1: 231-236 (1982); Cole et al. J. Virol., 38 (3): 991-995 (1986)). É também bem conhecido que os ADNs de LI de HPV exibem homoloqia siqnificativa. Por esse motivo, pode ser facilmente obtido um ADN de LI de HPV desejado, e. g., pela utilização de um ADN de LI de HPV previamente descrito ou um seu fragmento, como uma sonda de hibridação ou como um iniciador durante a amplificação por reacção de polimerização em cadeia (PCR). De facto, têm sido clonados e expressos vários ADNs de LI de HPV.

De um modo preferido, o referido ADN de LI de HPV na invenção em causa será derivado de um HPV que está envolvido no cancro ou condylomata acuminata, e. g., HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52 e HPV-56 estão envolvidos no cancro e o HPV-6, HPV-11, HPV-30, HPV-42, HPV-43, HPV-44, HPV-54, HPV-55 e HPV-70 estão envolvidos em verrugas. No entanto, as VLPs homogéneas em causa podem ser produzidas a partir de qualquer ADN de LI de HPV desejado.

De forma geral, as sequências de LI e, opcionalmente, L2 de HPV seleccionadas serão expressas num sistema de célula hospedeira recombinante desejado e utilizadas para produzir VLPs de HPV para desorganização. 0 hospedeiro e vector de expressão seleccionado serão cultivados sob condições que favorecem a produção de VLPs. Isto 36 irá depender largamente do sistema hospedeiro seleccionado e sequências regulatórias contidas no vector, e. g., caso a expressão necessite de indução. Após a expressão, as VLPs de HPV serão extraídas das células hospedeiras. Os meios de extracção irão também depender, até certa medida, do sistema hospedeiro/vector.

Por exemplo, se for seleccionado um vector de expressão intracelular, será necessário lisar as células hospedeiras e recuperar as VLPs de HPV do lisado. Em contraste, se o vector de expressão contém sequências que facilitam a secreção, as VLPs de HPV podem ser recuperadas directamente do meio de cultura. Os métodos para recuperar proteínas heterólogas de células hospedeiras recombinantes e meio de cultura são bem conhecidos na técnica.

As sequências de LI de HPV podem ser expressas em qualquer célula hospedeira que proporcione a expressão de rendimentos recuperáveis de VLPs de HPV. Os sistemas hospedeiros adequados para expressão de proteínas recombinantes são bem conhecidos e incluem, como meio de exemplo, bactérias, células de mamíferos, leveduras e células de insectos. Um sistema de expressão preferido compreende o sistema baculovírus/célula de insecto utilizando nos exemplos, na medida em que este sistema proporciona rendimentos proteicos elevados. No entanto, as proteínas LI e L2 de HPV podem ser produzidas noutros sistemas, em particular, bactérias e leveduras.

Os vectores adequados para clonagem de expressão das sequências de ADN codificando a LI de HPV em causa são bem conhecidos na técnica e estão disponíveis comercialmente. Além disso, são também bem conhecidas sequências reguladoras 37 adequadas para alcançar a clonagem e expressão, e. g., promotores, sequências de poliadenilação, potenciadores e marcadores seleccionáveis. A selecção de sequências apropriadas para obter rendimentos proteicos recuperáveis é um método rotineiro para os especialistas na técnica.

As VLPs têm sido referidas como tendo aplicação em vacinas profiláticas de HPV e diagnósticos. Os capsómeros produzidos por desorganização podem também ser úteis, uma vez que foi descoberto que eles apresentam epitopos conformacionais neutralizadores e induzem anticorpos neutralizadores. As VLPs em causa podem, além disso, ser vantajosas devido à sua homogeneidade e, potencialmente, estabilidade aumentada.

Como discutido, a presente invenção deverá ser aplicável, de uma maneira geral, a qualquer sequência de LI de HPV. Existem vários tipos de HPV conhecidos na técnica. Além disso, tipos em particular de HPVs estão associados com infecções em particular, tais como verrugas planas, verrugas cutâneas, epidermodysplasia verruciformis, lesões e cancro cervical. Foram identificados mais de 60 tipos diferentes de HPV em lesões clinicas através de estudos de homologia de sequências nucleotidicas virais. Ver, por exemplo, Jenson et al., Em: Belshe, R. ed., Textbook of human virology, Segunda Edição, MASS:PSG, 1989: 951 e Kremsdorf et ai., J. Vi rol., 52: 1013-1018 (1984). O tipo de HPV determina, em parte, o local de infecção, as características patológicas e o aspecto clinico, bem como o curso clinico da respectiva lesão.

Uma vez que se acredita que existe pouca ou nenhuma imunidade cruzada para os tipos de HPV e a imunidade para a infecção é especifica para o tipo de HPV, será necessário 38 produzir VLPs de HPV recombinantes para cada tipo de HPV especifico sobre o qual é necessário protecção ou tratamento. No entanto devido à homologia entre as proteínas LI e genes, podem ser utilizadas técnicas de hibridação para isolar o gene LI particular de interesse. Podem ser utilizadas sondas nucleotídicas seleccionadas de regiões da proteína LI que tenham demonstrado apresentar homologia de sequência, para isolar outros genes de Ll. São conhecidos métodos na técnica para hibridação (ver, por exemplo, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985); Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Maniatis et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982); e Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Segunda Edição, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Alternativamente, podem ser utilizados métodos de PCR para amplificar genes ou fragmentos de gene de Ll (ver, e. g., Patentes U.S. N°s. 4683195; 4683202; e 4800159).

Podem também ser isoladas partículas de vírus de um tipo de papilomavírus particular, o ADN clonado e as sequências de ácido nucleico codificando proteínas Ll isoladas. Têm sido sido descritos métodos para isolamento de partículas virais e clonagem de ADN de vírus (ver, e. g., Heilman et ai., J. Virology, 36: 395-407 (1980); Beaudenon et al., Nature, 321: 246-249 (1986); Georges et al., J. Virology, 51: 530-538 (1984); Kremsdorf et al., J. Virology, 52: 1013-1018 (1984); Clad et al., Virology, 118: 254-259 (1982); DeVilliers et al., J. Virology, 40: 932-935 (1981); e Pedido de Patente Europeia 0133123) .

Alternativamente, pode ser isolada a proteína Ll de um papilomavírus em particular, determinada a sequência de 39 aminoácidos e construídas sondas de ácido nucleico com base na sequência de ADN prevista. Tais sondas podem ser utilizadas no isolamento do gene Ll de uma biblioteca do ADN do papilomovaírus (ver, e. g., Suggs et al., PNAS, 78 (11) : 6613-6617 (1981) e

Young e Davis, PNAS, 80: 1194 (1983)).

Como discutido, a formação de VLP é um tanto sensível ao tipo de célula em que é efectuada a expressão. Por esse motivo, é vantajoso seleccionar sistemas que produzam grandes quantidades de VLPs como o material de partida para a desorganização de VLP. Geralmente, o sistema de expressão irá compreender um vector com a proteína Ll de interesse e as regiões reguladoras apropriadas, bem como uma célula hospedeira adequada.

Como discutido, são utilizados, de um modo preferido, os vectores de baculovírus. Um sistema de baculovírus oferece a vantagem de poder ser induzida uma grande percentagem de células a expressar proteína devido à utilização de técnicas de infecção em vez de transfecção. Enquanto o baculovírus é um vírus de insectos e cresce em células de insecto (Sf9), estas células mantêm muitos dos mecanismos eucariótas para o processamento de proteínas, incluindo glicosilação e fosforilação que podem ser importantes para a produção de proteínas de conformação apropriada. Os sistemas de vector de baculovírus são conhecidos na técnica (ver, e. g., Summers and Smith, Texas Agricultural Experimental Bulletin, N°. 1555 (1987) ; Smith et al., Mol. Cell

Biol., 3: 2156-2165 (1985); Posse, Virus Research, 5: 4359 (1986); e Matsuura, J. Gen. Virol., 68: 1233-1250 (1987)). Foi também referido que as células infectadas com baculovírus expressam proteínas Ll de HPV exibindo a conformação apropriada. 40

Para expressão num sistema de expressão apropriado, um gene LI ou gene LI modificado é ligado, de modo operativo, a um vector de expressão e introduzido numa célula hospedeira para permitir a expressão da proteina LI por essa célula. 0 gene com as regiões reguladoras apropriadas irá ser proporcionado na orientação e região de leitura apropriadas para permitir a expressão. São conhecidos na técnica métodos para a construção de genes (ver, em particular, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Segunda Edição, Cold Spring Harbor, NY (1989)), e as referências ai citadas.

Pode ser empregue uma vasta variedade de sequências de transcrição e reguladoras. Os sinais podem ser derivados de fontes virais, onde os sinais reguladores estão associados com um gene em particular que tem um nivel de expressão elevado. Isto é, poderão ser utilizados promotores fortes, por exemplo, de fontes virais ou de mamíferos. Deste modo, as condições óptimas para efectuar a invenção incluem a clonagem do gene LI num vector de expressão que irá sobre-expressar epitopos neutralizadores de vírus conformacionalmente dependentes da proteína LI em células alvo transfectadas ou infectadas. A adequabilidade das VLPs de HPV, produzidas de acordo com a invenção, como vacinas ou como agentes de diagnóstico é confirmada pela reacção com anticorpos ou anticorpos monoclonais que reagem ou reconhecem epitopos conformacionais presentes no virião intacto, e baseados na sua capacidade para induzir a produção de anti-soro neutralizador. São conhecidos para os especialistas na técnica ensaios adequados para determinar se os anticorpos neutralizadores são produzidos. Isto é uma característica essencial das VLPs de HPV que são para ser 41 utilizadas em vacinas de HPV. Deste modo, pode ser verificado se as VLPs de HPV irão induzir a produção de anticorpos neutralizadores anti-HPV. Assim, podem ser testados outros vectores de expressão e sistemas de expressão para utilização na invenção.

Como discutido, as VLPs da presente invenção podem ser utilizadas para detectar, diagnosticar, serotipar e tratar a infecção por papilomavirus. Quando as VLPs de acordo com a invenção são utilizadas para diagnóstico ou serotipagem, podem ser marcadas utilizando qualquer um de vários marcadores e métodos de marcação. Exemplos de tipos de marcadores que podem ser utilizados na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, marcadores enzimáticos, marcadores radioisotópicos, marcadores isotópicos não radioactivos, marcadores fluorescentes, marcadores de toxinas e marcadores quimioluminescentes.

Exemplos de marcadores enzimáticos adequados, incluem malato hidrogenase, nuclease estafilocócica, delta-5-esteróide isomerase, álcool desidrogenase de levedura, alfa-glicerol fosfato desidrogenase, isomerase de fosfatos de triose, peroxidase, fosfatase alcalina, asparaginase, glucose oxidase, beta-galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, glucose-6-fosfato desidrogenase, glucoamilase, acetilcolinesterase, etc. 3H, 67Cu

Exemplos de marcadores radioisotópicos 125I, 131I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 57To, 58Co, 59 adequados Fe, 75Se, , incluem 152Eu, 90Y, 211

At, 212

Pb, 47

Sc e 109

Pd.

Exemplos de marcadores fluorescentes adequados incluem um 1 ΓΛ marcador Eu, um marcador fluoresceina, um marcador 42 isotiocianato, um marcador rodamina, um marcador ficoeritrina, um marcador ficocianina, um marcador aloficocianina, um marcador o-ftaldeído, um marcador fluorescamina, etc.

Exemplos de marcadores toxina adequados, incluem toxina da difteria, ricina e toxina da cólera. Exemplos de marcadores quimioluminescentes incluem, um marcador luminal, um marcador isoluminal, um marcador éster acridinio aromático, um marcador imidazole, um marcador sal de acridinio, um marcador éster de oxalato, um marcador luciferina, um marcador luciferase, um marcador aequorina, etc.

Ao especialistas na técnica irão conhecer outros marcadores adequados que poderão ser empregues de acordo com a presente invenção. A ligação destes marcadores às VLPs pode ser efectuada utilizando técnicas convencionais normalmente conhecidas por especialistas na técnica. São descritas técnicas típicas por Kennedy et al., Clin. Chim. Acta, 70: 1-31 (1976), e Schurs et ai., Clin. Chim. Acta, 81: 1-40 (1977). As técnicas de junção mencionadas atrás são o método do glutaraldeido, o método do periodato, o método da dimaleimida, o método do éster m-maleimidobenzil-N-hidroxi-sucinimida, todos estes métodos são aqui incorporados por referência. A detecção dos anticorpos anti-HPV utilizando as VLPs em causa pode ser melhorada através da utilização de veículos. Os veículos bem conhecidos incluem, vidro, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilases, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, agaroses e magnetite. Para os objectivos da presente invenção, a natureza do veículo pode ser quer solúvel, até alguma extensão, quer insolúvel. Os especialistas na técnica irão identificar muitos outros veículos 43 adequados para proteínas de ligação ou irão ser capazes de verificar o mesmo pela utilização de experiências de rotina.

No entanto, o aspecto mais importante da presente invenção, envolve o desenvolvimento de vacinas de PV. As vacinas da invenção irão conter uma quantidade das VLPs de HPV em causa, suficiente para induzir a formação de anticorpos neutralizadores no hospedeiro, contidas num veículo farmaceuticamente aceitável. A administração das vacinas contendo VLP em causa pode ser efectuada por qualquer meio farmaceuticamente aceitável, e. g., parentericamente, localmente ou sistemicamente, incluindo, como meio de exemplo, administração oral, intranasal, intravenosa, intramuscular e tópica. 0 modo de administração depende de factores, incluindo a via natural de infecção. A dose administrada irá depender de factores incluindo a idade, saúde, peso, tipo de tratamento concomitante, caso exista, e natureza e tipo do papilomavírus humano em particular. A vacina pode ser empregue em forma de dosagem, tal como cápsulas, soluções líquidas, suspensões ou elixires para administração oral, ou formulações líquidas estéreis, tais como soluções ou suspensões para utilização parentérica ou intranasal. De um modo preferido, é utilizado um veículo inerte, imunologicamente aceitável, tal como solução salina saturada ou solução salina tamponada com fosfato.

As vacinas serão administradas em quantidades terapeuticamente eficazes. Isto é. Em quantidades suficientes para produzir uma resposta imunológica protectora. Geralmente, as vacinas serão administradas em dosagens que variam de cerca de 0,1 mg de proteína até cerca de 20 mg de proteína, mais 44 geralmente, cerca de 0,001 mg até cerca de 100 mg de proteína. Podem ser administradas dosagens únicas ou múltiplas. O método da presente invenção torna possível a preparação de vacinas contendo VLPs de HPV para prevenir a infecção por papilomavírus. Além disso, seguindo os métodos da invenção, podem ser preparadas vacinas para qualquer papilomavírus humano específico.

Como mais do que um tipo de PV pode estar associado nas infecções por PV, as vacinas podem compreender VLPs de HPV estáveis, derivadas de mais de um tipo de PV. Por exemplo, como o HPV-16 e 18 estão associados com carcinomas cervicais, uma vacina para a neoplasia cervical pode, por este motivo, compreender VLPs de HPV 16; de HPV 18; ou ambos HPV 16 e 18.

De facto, são conhecidas várias neoplasias como estando associadas com infecções por PV. Por exemplo, os HPVs 3a e 10 têm sido associados com verrugas planas. Foram descritos vários tipos de HPV como estando associados com epidermodisplasia verruciforme (EV), incluindo HPVs 3a, 5, 8, 9, 10 e 12. Os HPVs I, 2, 4 e 7 têm sido descritos como estando associados com as verrugas cutâneas e os HPVs 6b, 11a, 13 e 16 estão associados com lesões das membranas mucosas (ver, e. g., Kremsdorf et al., J. Virol., 52: 1013-1018 (1984); Beaudenon et al., Nature, 321: 246-249 (1986); Heilman et al., J. Virol., 36: 395-407 (198.0); e DeVilliers et al., J. Virol., 40: 932-935 (1981)). Assim, as formulações de vacina em causa podem compreender uma mistura de VLPs reorganizadas derivadas de diferentes tipos de HPV dependendo da protecção desejada. 45

Como indicado, as VLPs de HPV da invenção podem também ser utilizadas para a serotipagem e para incorporação em kits de serotipagem.

Para testes serológicos, os kits irão compreender as VLPs de HPV em causa e meios para detecção, tais como substratos de enzima, anticorpo marcado e semelhantes.

Tendo sido agora descrita a invenção no geral, são proporcionados os seguintes exemplos como meio de ilustração e não com a intenção de serem limitativo, salvo especificação em contrário.

EXEMPLOS

Nos exemplos foram utilizados os seguintes materiais e métodos.

Materiais e Métodos VLPs de HPV-11

Para utilização em estudos de desorganização e reorganização de VLP utilizando proteína pura, as proteínas LI de HPV-11 foram expressas, heterologamente, em células de Trichoplusia ni (High Five®) infectadas com baculovírus recombinante codificando a grelha de leitura aberta de LI ajusante do promotor de poliedrina como descrito (Ghim et al., Em M.A. Stanley (ed.) Immunology of human papillomaviruses, Plenum, Nova Iorque, p. 147-153 (1993)). As células foram recolhidas, aproximadamente, 72 horas após infecção, sedimentadas por centrifugação e congeladas. Para a preparação 46 das VLPs, a pasta celular foi ressuspensa em tampão de homogeneização (NaH2P04 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, contendo leupeptina 10 pg/mL, aprotinina 1 pg/mL e pepstatina A 1 pg/mL) e lisada num microfluidisador (Microfluidics modelo HC8000/3A). O lisado homogeneizado foi, depois, centrifugado a 100.000 x g durante 90 minutos e o sedimento contendo as VLPs de HPV-11 foi ressuspenso em PBS contendo CsCl (405 g/L). O lisado clarificado foi depois centrifugado de um dia para o outro a 83.000 x g e a banda de VLP foi recolhida. As VLPs foram diluidas em PBS-NaCl 0,5 M e colocadas em camada sobre um gradiente de fase de dois componentes composto por 30% e 63% de sacarose. Os gradientes foram centrifugados a 167.000 x g durante 3 horas e a banda de VLP purificada foi recolhida na interface entre as soluções de 30% e 63% de sacarose. As VLPs foram depois dialisadas nos tampões seleccionados (quer com PBS, ou PBS com NaCl adicionado para uma concentração final de 0,3 M ou 0,5 M) e armazenadas a 4 °C. A concentração proteica foi determinada pelo ensaio de

Bradford (Bradford et al., Anal. Biochem., 72: 248-254 (1976)) utilizando albumina de soro bovino como proteina de referência e foi determinado o conteúdo em LI como descrito (Suzich et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 92: 11553-11557 (1995)). Iniciando com 25-30 g de pasta celular húmida, o protocolo acima proporcionou 15-25 mg de VLPs de HPV-11. VLPs de HPV-16Tr

Para utilização em estudos de desorganização e reorganização de VLP durante a purificação, as proteínas LI de HPV-16Tr (compostas por uma forma mutada de proteína LI de HPV-16 da qual foram delectados 34 aminoácidos do C terminal) foram expressas em células High Five® como descrito acima. A pasta 47 celular foi ressuspensa em tampão de extracção (Tris 10 mM, Triton X-100 a 1,0%, pH 6,0), misturada por agitação e centrifugada durante pouco tempo a 1.000 x g. O sedimento contendo as VLPs de HPV-16Tr foi ressuspenso em tampão Tris 20 mM, NaCl 0,1 M, pH 8,0, vortexada durante pouco tempo a 3.000 x g durante 30 min. O sobrenadante foi recolhido, filtrado através de filtros de seringa de acetato de celulose 0,45 μ e, depois, incubado na presença ou ausência de βΜΕ a 4% durante >2 horas a 4 °C, antes da utilização em ensaios de purificação em coluna. O sobrenadante filtrado, límpido, (+/-βΜΕ) foi aplicado em diferentes resinas de permuta iónica a valores de condutividade baixos (5-15 miliohms), lavadas com vários volumes de coluna de tampão de equilíbrio e eluídas com um gradiente crescente de NaCl a aumentar. Para testar a utilidade de HIC para remover o ADN residual e contaminantes proteicos, foram reunidas as fracções contendo o pico da proteína LI eluída do IEC, ajustadas para 0,7 M em sulfato de amónio e aplicadas numa coluna HIC equilibrada no mesmo tampão. A coluna foi lavada com vários volumes de coluna de tampão de equilíbrio e, depois, a proteína LI foi eluída da coluna HIC a uma concentração de sulfato de amónio baixa. Os produtos finais do processo de purificação ( + /-βΜΕ) foram extensamente dialisados contra PBS (NaCl 0,5 M) , e comparados em termos de pureza, rendimento e ADN residual. O aspecto das VLPs foi caracterizado por microscopia electrónica e análise de gradiente linear de sacarose (ver abaixo).

Centrifugação por gradiente de sacarose três tipos de utilizada uma para identificar

Nestas experiências foram utilizados gradientes de sacarose. Primeiro, foi centrifugação em almofadas de sacarose a 30% 48 condições que favoreceram a desorganização das VLPs em componentes mais pequenos e solúveis. Misturas reaccionais de 100-200 pL contendo VLPs (50- -100 pg de proteína total) mais ou menos potenciais agentes de disrupção, foram colocados em camada no topo de tubos de centrifugação de 5 mL, cheios com 4,8 mL de sacarose a 30% (p/p em PBS-NaCl 0,5 M) e centrifugados a 197.000 x g durante 2 horas a 40 °C num rotor de balde giratório. Foi retirada uma aliquota de 50 pL, mesmo do topo do tubo, e

misturada com tampão de preparação de amostra Laemmli 2X (Laemmli, U.K., Nature, 227: 680-685 (1970)). O restante da almofada de sacarose a 30% foi removido com uma pipeta e o "sedimento" (tipicamente, não foi visível nenhum) foi ressuspenso em 100 pL de tampão de preparação de amostra Laemmli IX. A presença de proteína LI de HPV-11 no topo ou fundo da almofada de sacarose a 30% foi depois determinada por SDS/PAGE e a quantidade relativa de LI quantificada por análise de géis digitalizados. Segundo, o estado de desorganização das VLPs foi determinado por centrifugação zonal de taxa através de gradientes lineares de sacarose de 5-20%. As VLPs desorganizadas (100-200 pg de proteína total em 400 pL) foram colocadas, em camada, no cimo de gradientes pré-formados de 11,6 mL, compostos por 5-20% de sacarose (p/v em PBS-NaCl 0,5M) e centrifugadas a 111.000 x g durante 24 horas a 4 °C, num rotor de balde giratório. Foram recolhidas fracções (0,5 mL) ao longo do gradiente e o "sedimento" (tipicamente, não foi visível nenhum) foi ressuspenso em 0,5 mL de PBS por homogeneização suave. A posição da proteína LI de HPV-11 ao longo do gradiente foi determinada por imunotransferência. Os gradientes foram calibrados utilizando proteínas padrão com coeficientes de sedimentação estabelecidos (β-galactosidase de E. coli, 19 S; catalase bovina do fígado, 11,3 S; albumina do soro bovino, 4,3 49 S) e a percentagem de sacarose nas fracções foi determinada por refractometria.

Terceiro, o estado das VLPs iniciais, desorganizadas e reorganizadas foi determinado por centrifugação zonal de taxa através de gradientes lineares de sacarose de 10-65%. A proteina LI de HPV-11 (100-200 yg de proteina total em 400 yL), em vários estados de organização, foi colocada em camadas no cimo de gradientes pré-formados de 11,6 mL, compostos por 10-65% de sacarose (p/v em PBS-NaCl 0,5 M), e centrifugada a 188.000 x g durante 2,5 horas a 40 °C, num rotor de tubo oscilante. Os

gradientes foram recolhidos (em fracções de 1,0 mL), analisados e calibrados como acima, com parvovirus B19 (70 S) e VLPs de LI de HPV-18 (160 S), utilizadas como padrões de calibração adicionais.

Electroforese em Gel

SDS/PAGE A SDS/PAGE foi efectuada largamente de acordo com o método de Laemmli (Laemmli, U.K., Nature, 227: 680-685 (1970)). As amostras foram misturadas com tampão de preparação de amostra, fervidas durante 2 minutos, brevemente centrifugadas numa minicentrifuga e carregadas em minigéis a 7,5% (Fig. 1) ou 10% (Figs. 2-4) com um gel de empacotamento a 4%. Os géis foram corridos durante, aproximadamente, 1 hora a uma corrente constante de 20 mA à temperatura ambiente e a proteina foi visualizada por coloração com azul brilhante de Coomassie R250. 50

Imunotransferência

Foram preparadas electrotransferências de LI de HPV-11 de géis de SDS/PAGE, largamente, de acordo com o método de Towbin et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76: 4350-4354 (1979)). As transferências foram bloqueadas com proteína de leite magro a 1% em PBS, de um dia para o outro, a 4 °C. As transferências foram sondadas com AU1 (Berkely Antibody Co.), um monoclonal de murganho direccionado contra um epitopo linear em proteínas LI de papilomavírus (25) durante 90 minutos, lavadas com PBS, Triton X-100 a 0,1% e, depois, novamente bloqueadas durante 30 minutos. As transferências foram depois incubadas com IgG de cabra anti-murganho marcadas com HRP (Southern Biotechnology Associates, Inc.) durante 40 minutos e lavadas como anteriormente. As transferências foram depois reveladas com reagente de transferência Western ECL (Amersham) e expostas a película de raio X.

Análise dos géis

Foi determinado o Mr da LI monomérica e oligomérica a partir dos seus valores de Rf em SDS/PAGE a 7,5%, em comparação com proteínas padrão (Ver, Jackowski et al., Em T.E. Creighton (ed.), Protein structure: a practical approach, IRL Press, Nova Iorque, p 1-21 (1989)). Quando indicado, os géis foram digitalizados num densitómetro de leito plano Hewlett Packard Scanjet Plus e foi determinada a intensidade relativa das bandas utilizando software Scan Analysis (Versão 2.2; Specom Research). 51

Microscópio Electrónico

As amostras proteicas foram deixadas a repousar em grelhas de cobre revestidas a carbono e formvar (Electron Microscopy Sciences), secas por transferência, e coradas com ácido fosfotungstico a 2% filtrado de fresco (pH 6,8). As grelhas foram examinadas num microscópio electrónico de transmissão JEOL modelo 1005 numa voltagem de aceleração de 100 KV e fotografadas a amplificações nominais de 15-25.OOOx.

Ensaio de imuno-adsorção ligado à enzima (ELISA)

As VLPs de LI de HPV-11 (0,5-1,0 mg/mL de Ll) em PBS-NaCl 0,3 M foram, quer armazenadas sem tratamento a 4 °C quer incubadas de um dia para o outro a 4 °C, seguido por adição de βΜΕ (para uma concentração final de 5%) ou tampão carbonato 2,0 M, pH 9,6 (para uma concentração final de 200 mM de carbonato). Foi então dialisada uma porção das amostras tratadas contra 4 x IL PBS-NaCl a 0,5 M a 4 °C durante á 24 horas. Todas as amostras foram diluidas para uma concentração de 0,8 pg de Ll/mL e distribuídas em poços de placas de microlitros (80 ng de Ll por poço). As VLPs não tratadas e o material disalisado foram diluidos em PBS. A amostra tratada com βΜΕ sem diálise subsequente foi diluida em PBS contendo βΜΕ a 5% e a amostra não dialisada incubada em carbonato 200 mM foi diluida em carbonato 200 mM, pH 9,6. Após incubação a 37 °C durante 1 h, as placas

foram lavadas com PBS, Tween-20 a 0,1% (PBS-Tw) e bloqueadas com proteina de leite magro a 5% em PBS. Os anticorpos monoclonais (AU1 ou H11.F1 e H11.A3 purificados de ascites, adquirido da Pennsylvania State University (Christensen et al., J. Virol., 64: 5678-5681 (1990)), foram diluidos em leite magro a 1% em PBS 52 e adicionados aos poços. Após uma incubação de 2 horas à temperatura ambiente, as placas foram lavadas com PBS-TW e foi adicionada IgG de cabra anti-murganho marcada com HRP. Após 1 hora à temperatura ambiente, as placas foram lavadas como acima e reveladas com substrato HRP (Kirkegaard and Perry Laboratories). As determinações de densidade óptica foram efectuadas a 405 nm no ponto terminal de 15 min. As médias dos poços em duplicados foram calculadas como os valores de densidade óptica finais.

Ensaio de Neutralização de HPV-11 O anti-soro contra as VLPs de HPV-11 purificadas originais e as VLPs de HPV-11 que foram desorganizadas por exposição prolongada a agente de redução de sulfidrilo e depois reorganizadas após remoção do agente de redução por diálise, foi gerado em murganhos BALB/c (grupos de 5). Os murganhos foram injectados s.c. com 1 pg das VLPs adsorvidas em adjuvante al-hidrogel 1 mg/mL nas semanas 0, 4 e 9, com extracções de sangue finais efectuadas na semana 13. Para determinar se o anti-soro produzido nos murganhos é capaz de neutralizar o virus HPV-11, foi testada a capacidade do anti-soro para bloquear a expressão de um ARNm excisado de HPV-11 especifico numa linha celular (HaCaT). HaCaT, uma linha celular de queratócitos humanos imortalizada (Boukamp et al., J. Cell Biol.r 106: 761-771 (1988)) foi proporcionada pelo Dr. Norbert Fusenig. As células foram crescidas até confluência em 154/HKGS (Cascade Biologics, Inc.) suplementado com penicilina (100 unidades/mL) e estreptomicina (100 pg/mL) em placas de 24 poços. O stock de 53 vírus HPV-llHershey/ adquirido ao Dr. John Kreider (Kreider et al., J. Virol., 61: 590-593 (1987)), foi sonicado durante 25 seg em gelo, diluído em meio 154/HKGS e incubado durante uma hora a 37 °C. O meio foi aspirado das células HaCaT e foram adicionados 0,5 ml do vírus diluído por poço. Como um controlo, um poço de células em cada placa recebeu 0,5 mL de meio sem vírus. Para a neutralização mediada por anticorpo, o anti-soro foi diluído em 154/HKGS e incubado com uma quantidade fixa do stock de vírus HPV-11 num volume final de 0,5 mL durante uma hora a 37 °C antes da adição das células HaCaT. Foi adicionado meio fresco a cada poço de células quatro dias após a infecção e no dia seis as células foram recolhidas e o ARN celular total foi preparado utilizando Reagente Tri (Molecular Research Center, Inc.). Os sedimentos de ARN finais foram ressuspensos em 20 yL de água tratada com DEPC e quantificados por espectrofotometria. A capacidade do anti-soro para bloquear a expressão do ARNm excisado específico do HPV-11 foi determinada por transcripstase reversa (RT)-PCR. As reacções por RT foram efectuadas utilizando um kit de ADNc First Strand (Boehringer Mannheim) com 2 yg de ARN total como molde e oligo dT como o iniciador. Foi necessário PCR interno para detectar ADNc Ε1ΛΕ4 de HPV-11. A primeira fase de amplificação foi efectuada com 25% do ADNc de cada reacção de RT e 5'-TACAAGACCTTTTGCTGGGCACA-3" (localizada nas bases 765-787 na sequência genomica de HPV-11) como o iniciador externo de sentido directo e 5'-AAAGGCAGGAAAATAGCACAC-3' (localizado nas bases 4088-4110 na sequência genómica de HPV-11) como o iniciador externo de sentido reverso durante 30 ciclos de PCR. Foram utilizados dez porcento da mistura de PCR da quinta fase para reacções internas com 5'-ATATTGTGTGTCCCATCTGCG-3" (localizada nas bases 792-812 como iniciador interno de sentido directo e 5'-CAGCAATTTGTACAGGCACTAC-3' (localizado nas bases 54 3877-3898 na sequência genómica de HPV-11) como o iniciador interno de sentido reverso durante 30 ciclos de PCR. As reacções da primeira fase e de PCR interno foram efectuadas com camas Hot Wax (1,5 mM) e tampão a pH 9,5 (InVitrogen) com dNTPs 200 μΜ, 125 ng de cada iniciador de sentido directo e reverso e 2,5 unidades de polimerase Taq (Perkin-Elmer) num volume final de 50 yL. O perfil de temperatura para ambos primeira fase e PCR interno foi de 80 °C/5 min, 95 °C/30 seg, 72 °C/30 seg, com uma extensão final a 72 °C durante 10 min.

Como um controlo, para demonstrar que o ensaio permitiu detectar ARNm extraído de células HaCaT, todas as amostras de ADNc foram utilizadas em reacções de PCR separadas com iniciadores específicos para ARNm celular de β-actina excisado como descrito e amplificado como acima (Smith et al., J. Invest. Dermatol., 105:1-7) (1995)).

Todos os produtos de PCR foram separados por electroforese num gel de agarose a 2% e visualizados por fluorescência com brometo de etídio. EXEMPLO 1

Desorganização quantitativa das VLPs de HPV-11

Foram preparadas quantidades relativamente grandes de VLPs de LI de HPV-11, como material de partida, para o estudo de desorganização e reorganização de VLP. As VLPs de LI de HPV-11 foram isoladas de células High Five® infectadas com baculovírus recombinantes por CsCl e centrifugação de gradiente de sacarose. A pureza calculada destas preparações de Ll, baseadas em análise 55 densitométrica de SDS/PAGE, variaram entre 70-90% (ver Fig. 1, faixa 2) . Além disso, em gradientes lineares de sacarose, a maior parte da proteína migrou, como esperado, para uma mistura de VLPs individuais e amontoados (Fig. 4a) e, no miscroscópio electrónico, foi evidente uma mistura de partículas de tamanho intermédio e total (50-55 nm) (Fig. 5a).

As interacções covalentes e não covalentes que estabilizam as VLPs de LI organizadas não são completamente conhecidas, mas trabalhos recentes em VLPs de papilomavírus e viriões de poliomavírus e VLPs relacionados, sugeriu a importância da força iónica, catiões divalentes (Brady et ai., J. Virol., 23: 717-724 (1977); Salunke et al., Biophys. J. , 56: 887-900 (1987), pontes dissulfureto (Sapp et al., J. Gen. Virol., 76: 2407-2512 (1995);

Volpers et al., Virology, 200: 504-512 (1994)). Em particular,

Sapp e colaboradores demonstraram por imunotransferência que ~50 porcento da proteína LI das VLPs de HPV-33 estão ligadas por pontes de dissulfureto numa gama de oligómeros maiores, com um Mr evidente consistente com trímeros de LI e que as condições de redução moderadas clivam, parcialmente, as VLPs de HPV-33 até ao nível dos capsómeros (Sapp et al., J. Gen. Virol., 76: 2407-2412 (1995); Volpers et al., Virol., 200: 504-512 (1994)). Nos estudos dos investigadores, na ausência de agentes de redução, apenas uma porção da proteína LI de HPV-11 migrou no SDS/PAGE com um Mr evidente de 55.000 Da (Fig. 1, Faixa 1) . Aproximadamente 40% (a percentagem variou entre diferentes preparações de VLP) das VLPs da proteína LI de HPV-11 foi ligada por pontes de dissulfureto em oligómeros grandes (Fig. 1, Faixa 1), com valores de Mr previstos de, aproximadamente, 144.000 Da (possivelmente, trímero de Ll) e 210.000 Da (possivelmente, tetrâmero de Ll) . Os oligómeros de Ll não migram como uma banda única e pareceram ser heterogéneos em tamanho. Foi também 56 observado o oligómero de ~200,000 Da em imunotransferências por Sapp e colaboradores (Sapp et al., J. Gen. Virol., 76: 2407-2412 (1995); Volpers et al., Virol., 200: 504-512 (1994)), como parte de uma banda larga de peso molecular superior. Estes resultados indicam que uma porção das proteinas LI em VLPs de HPV-11 são ligadas por pontes de dissulfureto em oligómeros maiores. Para estudar a função das ligações dissulfureto e outras interacções na estabilidade da VLP, foi desenvolvido um ensaio de rastreio rápido para a desorganização da VLP. As VLPs de LI de HPV, quer antes e após vários tratamento, foram colocadas em camadas no topo de almofadas de sacarose a 30%, centrifugadas e a distribuição de proteina Ll no topo e fundo da almofada a 30% foi visualizada por SDS/PAGE. Espera-se que as VLPs intactas sedimentem ao longo da almofada de sacarose a 30%; espera-se que os capsómeros não agregados e monómeros de Ll permaneçam no topo da almofada. É apresentado um exemplo deste ensaio na Fig. 2. Para quantificar a disposição relativa da proteina Ll, os géis foram digitalizados, foi determinada a intensidade total das bandas Ll no topo e fundo da almofada e, depois, foi calculada a percentagem da intensidade da coloração de Ll observada em ambas as posição. Os resultados de várias determinações são apresentados nas Tabelas 1 e 2. Como demonstrado na Fig. 2, o material de partida de VLP purificado sedimentou ao longo da sacarose a 30%, como previsto, sem Ll aparente no topo. No entanto, após incubação com uma concentração elevada de agente de redução β-mercaptoetanol (βΜΕ), observou-se, largamente, a proteina Ll no topo da almofada de sacarose a 30%, indicando que o agente de redução desorganizou as VLPs de HPV-11 em componentes mais pequenos não agregados. De um modo interessante, a desorganização máxima das VLPs necessita, tipicamentem, de uma exposição a uma concentração muito elevada de agente de redução (neste exemplo, 5% ou 713 mM, βΜΕ) durante 57 um período relativamente longo (—16 horas a 4 °C). Concentrações mais baixas de agente de redução ou durações mais curtas de redução não foram tão seguramente eficazes na desorganização da VLP. A adição de uma concentração baixa de um agente quelante não aumentou a desorganização (Fig. 2 e Tabela 1).

Além dos redutores, as outras variáveis importantes para a desorganização quantitativa das VLPs verificou-se ser a força iónica durante a reacção de desorganização e a solubilidade do material de partida de VLP. Como observado anteriormente para os viriões do poliomavírus, condições de força iónica baixa destabilizam as VLPs (Brady et al., J. Virol., 23: 717-724 (1977)), embora Sapp et al. (J. Gen. Virol., 76: 2407-2412 (1996)) indicou que a produção de capsómeros de HPV-33 a partir das VLPs foi insensível a concentrações de sal entre 0,15 M e 0,6 M NaCl. Para VLPs de HPV-11, a desorganização máxima (—90%) das VLPs expostas a βΜΕ a 5% durante 16 horas foi observada à força iónica "fisiológica" (i. e., NaCl 0,15 M) , mas torna-se, em conformidade, menos eficaz à medida que a força iónica é aumentada (Tabela 1) . O efeito estabilizador da força iónica aumentada pode ser parcialmente ultrapassado por incubação das VLPs com agentes de redução durante períodos mais longos ou a temperaturas elevadas. No entanto, enquanto a incubação das VLPs com βΜΕ a 5% durante 120 horas a 4 °C ou durante 24 horas a 24 °C aumentou a extensão da desorganização para 60-70% a NaCl 0,5 M, a desorganização continuou longe de estar completa (dados não apresentados). Além disso, para a desorganização quantitativa. O grau de agregação do material de partida de VLP foi também importante. Nas experiências aqui referidas, as soluções de VLP foram dialisadas em tampões de força iónica diferentes e armazenados a 4 °C até utilização nos ensaios de desorganização. Após vários dias, particularmente, a NaCl 0,15 58 M, as soluções tornam-se ligeiramente turvas, indicando algum grau de agregação (embora tenha sido observada pouco ou nenhum precipitado). 0 tratamento das soluções de VLP turvas com agentes de redução não proporcionou o mesmo grau de desorganização como foi observado com a solução de VLP solúvel inicial, indicando que as VLPs agregadas foram resistentes à desorganização. No entanto, após remoção do material agregado (que variou de 10-50% das VLPs totais, dependendo do momento da preparação) por filtração, as restantes VLPs solúveis podem ser desorganizadas de novo à mesma extensão que o material de partida de VLP inicial solúvel.

De um modo interessante, mesmo a concentrações elevadas de quelantes, a quelação de catiões não influenciou, significativamente, a desorganização de VLP. A diálise de VLPs em tampões EDTA ou EGTA 200 mM (PBS-NaCl 0,3 M, pH 7,4) não conduziu a desorganização evidente e a adição de ditiotreitol (DTT) 10 mM aos tampões de diálise teve um efeito pequeno (Tabela 2). A incapacidade de concentrações elevadas de quelantes para desorganizar as VLPs foi confirmada por análise por microscópio electrónico, embora o EDTA (mas não o EGTA) pareça aumentar, ligeiramente, o volume das VLPs (dados não apresentados). Qualquer uma destas concentrações de quelante são insuficientes para extrair iões estruturalmente importantes, fortemente ligados ou catiões não essenciais para manter a integridade estrutural de VLP. De modo contrário, a adição de uma aliquota concentrada de tampão NaHC03 (pH 9,6) a uma solução de VLPs, para uma concentração final de carbonato 200 mM (em PBS-NaCl 0,3 M) , causou uma clivagem significativa das VLPs (Tabela 2) . A adição de DTT (para uma concentração final de 10 mM) , não aumentou mais a quebra induzida pelo carbonato. A incubação das VLPs com carbonato 200 mM/DTT 10 mM é normalmente 59 utilizada para desnaturar viriões de HPV ou VLPs em ELISAs (Favre et al., J. Virol., 15: 1239-1237 (1975); Christensen et al., J. Virol., 64: 3151-3156 (1990); Christensen et al., J. Gen. Virol., 75: 2271-2276 (1994)) . O efeito do carbonato parece ser especifico do tampão e não apenas em função do pH, na medida em que a incubação das VLPs de HPV-11 com tampão glicina a pH 9, 6 (concentração final de 200 mM) causou uma clivagem muito pequena da VLP, como determinado pelo ensaio de almofada de sacarose a 30% (Tabela 2) . De um modo semelhante, Brady et al. (J. Virol., 23: 717-724 (1977)), observou que o tampão carbonato a pH alcalino, mas não só pH alcalino, dissociou os viriões de poliomavirus. No entanto, o efeito específico do carbonato a pH 9, 6 não parece ser devido à potencial capacidade quelante do carbonato, como sugerido por Brady et al.

(J. Virol., 23: 717-724 (1977)), uma vez que o EDTA 200 mM a pH 9, 6 ( + /- DTT 10 mM) foi completamente ineficaz na desorganização de VLP (dados não apresentados). EXEMPLO 2

Caracterização das VLPs de HPV-11 desorganizadas

Após exposição prolongada a concentrações elevadas de agente de redução, as VLPs purificadas parecem ser clivadas até ao nivel de capsómeros. Como apresentado na Fig. 3a, as VLPs desorganizadas geradas por incubação com βΜΕ a 5% durante 16 horas a 4 °C, migraram nos gradientes lineares de sacarose de 5-20%, com um coeficiente de sedimentação médio de 11,3 ± 1,5 S (n = 5), determinado relativamente a padrões de sedimentação.

Foram, ocasionalmente, observadas espécies maiores, com um coeficiente de sedimentação calculado de 16-18 S (talvez 60 capsómeros diméricos) e mesmo materiais sedimentados. No entanto, foram detectados menos de 10% de LI no topo do gradiente (posição esperada para o monómero de Ll) ou no sedimento (posição esperada para VLPs intactos ou capsómeros agregados), sugerindo que o material de partida de VLP foi largamente desorganizado até ao nivel de capsómeros individuais após redução prolongada. Esta conclusão é suportada por análise por microscópio electrónico das VLPs após incubação prolongada com βΜΕ a 5%, que representam um campo de capsómeros homogéneo (Fig. 5b) com uma média de diâmetros de 9,7±1,2 nm (n = 15) com, ocasionalmente, algumas estruturas agregadas maiores aparentes (as Ll monoméricas não serão detectadas com esta técnica) . O diâmetro estimado dos capsómeros é ligeiramente mais pequeno que o observado por microscopia crioelectrónica (11-12 nm) (Baker et al., Biophys. J., 60: 1445-1456 (1991); Hagensee et ai., J. Virol., 68: 4503-4505, (1994); Belnap et al., J. Mol. Biol., 259: 249-263 (1996)), talvez devido à concentração durante a preparação das grelhas para o microscópio electrónico. Os dados apresentados nas Figs. 3a e 5b indicam que a exposição prolongada a concentrações elevadas de redutores desorganizam, quantitativamente, VLPs solúveis purificados até a uma população homogénea de capsómeros.

Os capsómeros gerados a partir de VLPs de HPV-11 após exposição prolongada a concentrações elevadas de agente de redução contêm epitopos estruturais encontrados em VLPs intactas. Tem sido descrito um painel de anticorpos monoclonais específicos de HPV-11 que reagem com VLPs de Ll de HPV-11 intactas mas não com Ll "desnaturadas". Estes monoclonais incluem Hll.Fl, quem tem demonstrado reconhecer um epitopo neutralizador dominante nos viriões de HPV-11 e H11.A3, um anticorpo não neutralizante distinto, dependente da estrutura 61 J. Virol., (Christensen e Kreider, J. Virol., 64: 3151-3156 (1990);

Christensen et al., J. Virol., 64: 5678-5681 (1990)). Como antecipado, o H11.F1 e H11.A3 reagem, fortemente, com o material de partida de VLP de HPV-11 purificado quando analisado por ELISA (Fig. 6a). No entanto, estes anticorpos reagem também com capsómeros gerados a partir de material de partida de VLP por exposição a agente de redução (Fig. 6b) . Assim, os capsómeros possuem, pelo menos, alguns dos epitopos dependentes da estrutura encontrados na superfície de VLPs intactas e viriões autênticos, em concordância com estudos efectuados por Li et al., (J. Virol., 71: 2988-2995 (1997)) em capsómeros de HPV-11 expressos em E. coli. Estes resultados demonstram também que os anticorpos monoclonais H11.F1 e H11.A3, embora necessitando de uma conformação "semelhante à nativa" para se ligarem, não são dependentes de VLP como tinha sido previamente descrito (Ludmerer et al., J. Virol., 71: 3834-3839 (1997)).

Por contraste, os anticorpos monoclonais H11.F1 e H11.A3 não reconheceram as VLPs de HPV-11 dissociadas por tratamento com tampão carbonato a pH 9,6 (dados não apresentados; Christensen et al., J. Gen. Virol., 75: 2271-2275 (1994)). O tratamento com carbonato não conduziu a uma solução de capsómeros homogénea mas, em vez disso, surgiu como uma mistura indistinta de pequenos objectos, parcialmente agregados, quando examinados ao microscópio electrónico (dados não apresentados). Esta observação foi parcialmente confirmada por análise das VLPs tratadas com carbonato em gradientes lineares de sacarose de 5-20%, nos quais a proteina LI migrou largamente a ~4 S, embora tenha sido observada uma pequena população a 9-11 S (Fig. 3b), em concordância com os efeitos do tampão carbonato (a pH 10,6, com DTT 10 mM) sobre viriões de BPV (Favre et al., J. Virol., 15: 1239-1247 (1975)). Finalmente, enquanto o tratamento com 62 tampão glicina a pH 9,6 não dissociou as VLPs em pequenas partículas individuais (Tabela 2), teve algum efeito. As VLPs tratadas com glicina a pH 9,6 foram observadas no microscópio electrónico como uma mistura fracamente definida de VLPs intactas, parcialmente clivadas e agregadas (dados não apresentados). EXEMPLO 3

Reorganização quantitativa das VLPs de HPV-11 A reorganização de VLP a partir de capsómeros de HPV-11 ocorreu após remoção do agente de redução, quer por diálise ou cromatografia de coluna. Começando com uma preparação homogénea de capsómeros solúveis, a diálise prolongada na ausência de agentes de redução proporcionou, consistentemente, uma população definida de VLPs reorganizadas (Figs. 4c e 5c, d) . As VLPs reorganizadas retiveram os epitopos estruturais reconhecidos pelos anticorpos monoclonais Hll.Fl e H11.A3 (Fig. 6c).

Para a organização, os capsómeros (1-5 mL a 0,5-1,0 mg/mL de proteina total) foram dialisados versus 4 x 1 L de PBS-NaCl 0,5 M a 4 °C durante 24 h; a elevada concentração de sal foi concebida para estabilizar as VLPs. Enquanto a adição de agentes quelantes não aumentou, consideravelmente, a capacidade dos agentes de redução para desorganizar as VLPs (Tabela 1), a presença de EDTA 2 mM interferiu, moderadamente, com a reorganização, proporcionando VLPs que migraram num gradiente linear de sacarose de 10-65%, como uma população completamente discreta de partículas de 150 S mas que pareciam achatadas e parcialmente abertas, ao microscópio electrónico (dados não 63 apresentados). Contrariamente, a adição de Ca2+ 2 mM durante a reacção de reorganização causou a aderência das VLPs umas às outras, como apresentado na análise de gradiente linear de sacarose de 10-65%, no qual as VLPs reorganizadas na presença de cálcio migraram completamente no sedimento. No entanto, a presença de Ca2+ não pareceu, de outro modo, influenciar a morfologia básica de VLP quando examinadas no microscópio electrónico (dados não apresentados). Finalmente, a diálise das VLPs tratadas com carbonato em PBS-NaCl 0,5 M não conduziu à reorganização das VLPs. Em vez disso, a proteina LI permaneceu quer como pequenos componentes solúveis ou como precipitado agregado amorfo, como evidenciado quer por microscópio electrónico quer por análise de gradiente linear de sacarose de 10-65% (dados não apresentados). A diálise das VLPs tratadas com carbonato não restaurou a reactividade com anticorpos monoclonais de estrutura especifica H11.F1 e H11.A3 (Fig. 6d) . Caracterização das VLPs de HPV-11 reorganizadas

Após a remoção do agente de redução, os capsómeros reorganizados, quantitativamente, em VLPs. Surpreendentemente, as VLPs reorganizadas eram muito mais homogéneas em tamanho de partícula que o material de partida de VLP purificado por gradiente de sacarose e césio. Quando os três estados da reacção de desorganização/reorganização foram comparados por gradientes lineares de sacarose de 10-65%, o material de partida de VLP purificado foi distribuído ao longo do gradiente, com muitas partículas a migrar para a posição esperada para VLPs intactas (150-160 S) , mas com a maior parte da proteína mais baixa no gradiente e no sedimento (Fig. 4a) . De um modo semelhante, quando examinado no microscópio electrónico (Fig. 5a), o material de partida de VLP parecia ser uma mistura de partículas de diferentes tamanhos, incluindo VLPs de diâmetro tamanho total 64 50-55 nm. É possível que ocorra alguma disrupção das VLPs durante a extracção e purificação, uma vez que a análise por gradiente linear de sacarose dos estados iniciais do processo de purificação indicou uma distribuição mais homogénea dos tamanhos de partícula (dados não apresentados).

Após exposição prolongada a concentrações elevadas de agentes de redução, as VLPs foram desorganizadas em capsómeros, como descrito acima. Em comparação com o material de partida de VLP, os capsómeros migraram para o topo dos gradientes lineares de sacarose de 10-65% (sendo detectado pouca ou nenhuma LI no sedimento; Fig 4b) e no microscópio electrónico surgiram como um campo não clivado de capsómeros (Fig. 5b). A reorganização de capsómeros proporcionou uma população homogénea de VLPs esféricas de tamanho total. As VLPs reorganizadas formaram uma banda no meio dos gradientes lineares de sacarose de 10-65%, com um coeficiente de sedimentação previsto de 150,4± 4,6 S (n = 7), com muito menos LI detectada quer no sedimento ou no fundo do gradiente do que a observada com o material de partida de VLP purificado (Fig 4c). A homogeneidade das VLPs reorganizadas foi ainda mais evidente quando examinadas ao microscópio electrónico, como demonstrado na Fig. 5c, d. Foram detectadas, predominantemente, partículas de VLPs na gama de tamanho total, medindo em média 56,5 ± 7,0 nm (n = 15) , com muito poucas VLPs parcialmente organizadas ou pequenos complexos aparentes. Os rendimentos do processo de reorganização foram também impressionantes (em média 83% em termos de proteína LI total do material de partida para VLPs reorganizadas sob condições de desorganização óptimas), na medida em que essencialmente todos os capsómeros pareciam ser VLPs melhoradas de tamanho total, filtráveis e solúveis. 65 EXEMPLO 4

Comparação da Capacidade das VLPs de HPV-11 Iniciais Purificadas e VLPs de HPV-11 Reorganizadas para Gerar Anticorpos Neutralizadores de Vírus

Para que as VLPs reorganizadas funcionem com sucesso como candidatas a vacinas, é essencial que retenham a capacidade para induzir anticorpos neutralizadores de virus quando injectadas em animais de experiência. Para testar isto, foi produzido anti-soro policlonal para VLPs de HPV-11 iniciais purificadas e para VLPs de HPV-11 desorganizadas/reorganizadas, em murganhos BALB/c, como descrito na secção Métodos. Cada anti-soro foi feito reagir, de modo idêntico, contra o imunogénio correspondente quando avaliado num formato ELISA (dados não apresentados). Mais importante, quando testado no ensaio de neutralização por RT-PCR envolvendo viriões infecciosos de HPV-11 (Smith et al., J. Invest. Dermatol., 105: 1-7 (1995)), o anti-soro policlonal especifico de VLP de HPV-11 reorganizado após imunização exibiu um titulo de neutralização de 10~5-10~6, igual ao obtido com o anti-soro produzido contra as VLPs de HPV-11 iniciais purificadas (Fig. 7). Isto demonstra que as VLPs de HPV-11 reorganizadas retêm o dominio antigénico neutralizador de cápside, altamente imunogénico dos viriões de HPV-11 e têm potencial para servirem como vacinas para a prevenção da doença genital por HPV. Além disso, dado que as VLPs reorganizadas representam uma preparação homogénea de VLPs de tamanho total (i. e., o tamanho dos virus infecciosos), é possivel que as VLPs reorganizadas sejam imunogénios mais potentes que as VLPs iniciais purificadas, que são heterogéneas no tamanho, uma 66 possibilidade a ser actualmente testada por doseamento em murganhos com quantidades decrescentes de VLPs reorganizadas e iniciais. EXEMPLO 5

Aplicação da desorganização e reorganização de VLP durante a purificação das VLPs de HPV

Como discutido acima, os métodos de purificação de proteínas convencionais são estão optimizados para utilização com complexos proteicos do tamanho das VLPs (20. 000.000 Da, diâmetro das partículas de 55 nm) . Em particular, o tamanho partilhado das VLPs diminui, drasticamente, a capacidade e utilidade da maioria das resinas cromatográficas, tanto quanto a quimica reactiva na resina está estericamente inacessivel à VLP. No entanto, esta dificuldade pode, potencialmente, ser evitada por desorganização de VLPs em bruto extraidas de células, purificando as VLPs desorganizadas utilizando métodos convencionais e reorganizando as VLPs no estado desejado de pureza. Uma segunda preocupação com a purificação de VLP é a contaminação com ADN residual. Em trabalhos recentes efectuados com VLPs de HPV-11 purificadas, persiste um certo nivel de ADN de fundo que não é removido por tratamento com ADNase, sugerindo que o ADN é quer encapsulado dentro das VLPs ou muito intimamente associado com estas. A desorganização das VLPs deve permitir uma remoção crescente do ADN contaminante, uma importante consideração para qualquer composto biológico com objectivo para utilização clinica. 67

Para testar este potencial, VLPs de HPV-16Tr foram extraídas de células de insecto infectadas com baculovírus e purificadas por cromatografia de HIC e IEC, como descrito na secção Métodos, quer na ausência de agente de redução sulfidrilo (VLPs intactas) ou na presença de βΜΕ a 4% (VLPs desorganizadas) . No último caso, as VLPs extraídas foram incubadas com βΜΕ a 4% durante >2 horas a 4 °C antes da cromatograf ia em colunas HIC e IEC, que foram também equilibradas em βΜΕ. Os produtos purificados finais de ambos os processo de purificação (í. e., na presença ou ausência de agente de redução de sulfidrilo) foram dialisados contra PBS 4 x 1 L (0,5 M NaCl) e foi determinada a pureza, rendimento e níveis de ADN residuais. Como apresentando na Tabela 3, uma preparação representativa purificada na ausência de βΜΕ resultou em VLPs de HPV-16Tr que eram apenas cerca de 60% puras (em termos de contaminação proteica) e continham níveis de ADN superiores ao desejado para utilização em humanos. De modo contrário, três preparações de VLPs purificadas no estado desorganizado foram caracterizadas por elevados rendimentos, uma pureza em proteína significativamente superior e níveis de ADN residual substancialmente reduzidos. A pureza proteica superior das VLPs purificadas no estado desorganizado é facilmente evidente quando analisada por SDS/PAGE, como apresentado na Fig. 8. O tamanho e homogeneidade das VLPs de HPV-16Tr reorganizadas após purificação tem sido mais heterogéneo do que o observado para a reorganização de VLPs de HPV-11 purificadas, mas em média, foram tão homogéneas como as VLPs de HPV-16Tr purificadas sem desorganização e, nalguns casos, formaram VLPs de tamanho total, uniformemente homogéneas, uma coisa nunca observada com VLPs de HPV-16Tr purificadas sem desorganização (dados não apresentados). 68

Existem diferenças interessantes nos efeitos do tratamento prolongado com agentes de redução sulfidrilo entre VLPs de HPV-11 e HPV-16Tr purificadas. Primeiro, as VLPs de HPV-16Tr parecem desorganizar-se quantitativamente a niveis inferiores de agente de redução e/ou a durações mais curtas de exposição (dados não apresentados) . Não é evidente se isto se reflecte numa diferença genuina entre as VLPs de HPV-11 e HPV-16 ou se é devido ao truncamento no terminal C da proteina LI de HPV-16Trí na medida em que foi observado em ensaios preliminares que o ajuste proteolitico do terminal C da proteina LI de HPV-11 também acelera a clivagem das VLPs na presença de agente de redução de sulfidrilo. Uma caracteristica mais interessante é que o tratamento das VLPs de HPV-16Tr purificadas com agente de redução de sulfidrilo parece produzir uma mistura de capsómeros, oligómeros mais pequenos da proteina LI e monómeros de Ll, com base da análise por gradiente linear de sacarose de 5-20% das VLPs de HPV-16Tr desorganizadas (Fig. 9) . No entanto, após remoção do agente de redução por diálise, esta mistura de pequenos componentes solúveis é capaz de se reorganizar em VLPs intactas com um rendimento de -90%, como demonstrado por análise de gradiente linear de sacarose de 10-65% (Fig. 10), e como confirmado por análise ao microscópio electrónico (dados não apresentados). Estes resultados demonstram que as VLPs podem ser desorganizadas até ao nível de capsómeros ou mesmo até oligómeros de Ll mais pequenos e, mesmo assim, serem competentes para se reorganizarem em VLPs de tamanho total intactas, desde que as condições de desorganização gerem proteínas Ll solúveis, correctamente estruturadas. 69 TABELA 1

Desorganização das VLPs de Ll do HPV-11; Efeito dos agentes redutores a

Condições de Desorganização NaCl 0,15 M NaCl 0,3 M NaCl 0,5 M Topo Fundo Topo Fundo Topo Fundo Material de partida 3,8±0,7 96,3±0,8 3,2±1,4 96,8±1,4 4,2±0,34 95,9±0,6 βΜΕ a 5%, 16 h 87,7±3,2 12,4±3,1 70,9±12 29,1±12 53,2±6,8 46,8±6,8 βΜΕ a 5, 1 h 68,1±11 31,9±11 68,0±10 32±10 - - βΜΕ a 2%, 16 h 72,1±2,7 27,9±2,7 67,6±21 32,3±612 - - βΜΕ a 0,5%, 16 h 45,8±18 54,2±16 28,8±16 71,2±16 - - DTT 10 mM, 16 h 44,5±11 55,5±11 43,8±2 0 56,2±2 0 - - DTT 10 mM, 1 h 9,5±6,4 90,5±6,4 - - - DTT 10 mM, EDTA 5 mM, 16 h 55,9+6,2 44,1±6,2 TABELA 2 Desorganização das VLPs de Ll do HPV-11; Efeito dos quelantes e tampões3

Condições de Desorganização Topo Fundo EDTA 200 mM, pH 7,4 4+3 96+3 EDTA 200 mM, DTT 10 mM 10+6 90+6 EGTA 200 mM, pH 7,4 13+11 87+11 EGTA 200 mM, DTT 10 mM 11+6 89+6 NaHC03 200 mM, pH 9,6 81+2 19+2 NaHC03 200 mM, DTT 10 mM 74+11 26+11 glicina 200 mM, pH 9,6 11+1 89+1 glicina 200 mM, DTT 10 mM 41 + 12 59+11 3 VLPs (0,5-1,0 mg/mL de proteína) foram tratadas como indicado durante 16 horas a 4 °C e a distribuição de Ll ao longo da almofada de sacarose a 30% foi determinada como descrito na secção Métodos. São apresentadas as médias das determinações dos duplicados ± desvio padrão. 70 TABELA 3 Comparação entre a purificação de VLP de HPV-16Tr intacta e desorganízadaa

Ensaio Escala Pureza Rendimento ADN - βΜΕ 24 g 59% 5,0% 30 ng/100 pg de Ll + βΜΕ, Run 1 10 g 85% 10, 8% 5,3 ng/100 pg de Ll + βΜΕ, Run 2 10 g 85% 18,4% 0,6 ng/100 pg de Ll + βΜΕ, Run 3 30g 81% 6,1% — aÉ comparada uma purificação de VLPs(-βΜΕ) intactas com três purificações de VLPs(+βΜΕ, Runs 1-3) desorganizadas, e foram preparadas como descrito na secção Métodos. A escala indica as gramas de pasta celular usadas, a pureza foi determinada por análise densitométrica de SDS-PAGE do produto final comparado com a quantidade presente na pasta celular inicial e o ADN foi determinado pelo método Threshold e é apresentado por 100 pg de proteína Ll, a dose individual máxima esperada em humanos.

CONCLUSÕES

Assim, a presente invenção proporciona condições precisas para a desorganização quantitativa e subsequente reorganização das VLPs de papilomavirus in vitro. Como discutido, tentativas recentes de desorganização de VLP de papiloma foram, até alguma extensão, influenciadas por trabalhos efectuados com poliomavirus, um papovavirus relacionado, onde se verificou que quer a redução de dissulfuretos e quelação de iões cálcio foram essenciais para a desorganização dos viriões (Brady et al., J. Virol., (1977)). No entanto, verificou-se, surpreendentemente, que os niveis baixos de agente de redução (DTT 1-10 mM), óptimos 71 para desorganização de poliomavirus na presença de níveis baixos de agentes quelantes (e. g., EDTA 0,5-10 mM) , foram apenas ligeiramente eficazes na desorganização das VLPs de papiloma (Tabela 1, Li et ai., (Id.) (1997)), embora tenham sido dissociadas VLPs de LI de HPV-11 parcialmente tripsinizadas pelas condições anteriores (Li et ai., (Id.) 1997)). No entanto, Sapp e colaboradores demonstraram que os capsómeros podem ser produzidos a partir das VLPs de HPV-33, por tratamento com agente de redução sozinho (DTT 20 mM), embora a extensão da clivagem de VLP não tenha sido determinada (Sapp et ai., (Id.) 1995)) . Nas experiências discutidas previamente, verificou-se que quando se examina a desorganização por análise de gradiente, foi necessário testar a presença da proteína LI no "sedimento". Em muitos casos, a observação de fracções ao longo do gradiente poderá sugerir que foi alcançada uma boa clivagem. No entanto, a observação do sedimento, mesmo que este não seja visível, poderá indicar que uma grande percentagem da proteína se encontra ainda na forma de VLPs de tamanhos variados ou, de outro modo, agregados, como confirmado por análise ao microscópio electrónico. O desenvolvimento da almofada de sacarose a 30% permitiu analisar, rapidamente, várias condições de desorganização e identificar aquelas que desorganizam, consistentemente, as VLPs em componentes mais pequenos, solúveis. Verificou-se que a desorganização quantitativa numa solução homogénea de capsómeros individuais (para VLPs de HPV-11) ou uma mistura de capsómeros e oligómeros de LI mais pequenos, correctamente estruturados, e monómeros de LI (VLPs de HPV-16Tr) pode ser consistentemente alcançada por tratamento prolongado das VLPs não agregadas com níveis elevados de agente de redução em tampões de força iónica moderada a baixa. 72

Como discutido, a observação que a quelação dos catiões não afectou materialmente a desorganização de VLP de HPV-11 foi surpreendente na medida em que é contrária aos estudos recentes com poliomavirus que indicaram que a quelação do cálcio promoveu a desorganização do virião e que esse cálcio adicionado pode ultrapassar o efeito dos quelantes (Brady et al., (Id.) (1977)). De modo semelhante, Montross et al., {Id.) (1991), observou que VLPs de poliomavirus, que normalmente se organizam apenas no núcleo, podem-se formar no citoplasma após adição de um ionóforo de cálcio que, presumivelmente, aumenta a concentração citoplásmatica de cálcio para o nivel necessário. No entanto, o cálcio não é, aparentemente, importante para a estabilidade da cápside de LI de HPV-11. De modo oposto, o tratamento com tampão carbonato a pH alcalino efectuou a "desorganização" das VLPs de LI de HPV-11, semelhante aos resultados observados com viriões de poliomavirus (Brady et al., (Id.) 1977)). No entanto, este tratamento parece mais severo, na medida em que as VLPs não podem ser regeneradas por diálise em PBS-NaCl 0,5 M, após tratamento com carbonato. A desorganização de VLP de HPV-11 por tratamento com carbonato resultou em proteína LI que não reagiu com anticorpos monoclonais específicos de HPV-11, dependentes da estrutura. Em contraste, a desorganização das VLPs de LI de HPV-11 por redução prolongada resultou em capsómeros que possuem epitopos de estrutura específica encontrados na superfície quer de viriões de HPV-11 quer das VLPs de LI de HPV-11 intactas. Estes resultados suportam a ideia que apenas a proteína LI correctamente estruturada retêm a capacidade para se reorganizar em VLPs. 73

De modo a reorganizar VLPs de tamanho total de modo eficiente in vitro, os resultados aqui discutidos indicam que a integridade estrutural, solubilidade e homogenidade do material de partida são significativas. Após a produção de tal população de capsómeros (para VLPs de HPV-11) ou uma mistura de capsómeros e oligómeros de LI e monómeros de LI mais pequenos correctamente estruturados (VLPs de HPV-16Tr) por redução a tiol, a reorganização ocorre espontaneamente após remoção do agente de redução. A reorganização foi alcançada por remoção do agente de redução sulfidrilo, quer por métodos de cromatografia em coluna ou por diálise contra um grande excesso de tampão, produzindo uma população de VLPs de tamanho total reorganizadas, mais homogéneas em tamanho, que o material de partida de VLP. Em estudos recentes de poliomavirus, Salunke et ai., (Id.) (1989) observou que a organização de VLP a partir de capsómeros proporcionou múltiplas organizações icosaedricas polimórficas em função das condições de organização (pH, força iónica e concentração de cálcio). De um modo interessante, a estrutura formada de um modo mais consistente foi um icosaedro de 24 capsómeros, bem como um icosaedro de 12 capsómeros, além do icosaedro de 72 capsómeros da cápside virai. Os autores notaram que a formação da ligação dissulfureto pode auxiliar na organização de VLP de polioma mas isso não foi o essencial, na medida em que, a força iónica elevada (sulfato de amónio 2 M) cápsides de tamanho variado formam-se mesmo na presença de βΜΕ 15 mM. De modo semelhante, Li et al., (Id.) (1997), observou que iónica que à força estudos, os capsómeros de HPV-11 purificados por coluna, expressos em E. coli, têm a capacidade de formar estruturas semelhantes à cápside em NaCl 1 M, novamente na presença de βΜΕ 15 mM. No entanto, enquanto condições de força iónica elevadas favorecem, aparentemente, algum grau de formação de cápside, torna-se evidente a partir destes fisiológica, as ligações dissulfureto são necessárias manter juntas as VLPs de HPV-11 e HPV-16tt umas às outras.

Mesmo considerando que as reacções de desorganização foram, tipicamente efectuadas a 4 °C sem agitação, é interessante que a desorganização máxima tivesse necessitado de uma exposição prolongada a niveis muito elevados de agente de redução. Como foi discutido previamente, a explicação mais provável é que as ligações dissulfureto estabilizadoras estão ocultadas e inacessíveis, e que a exposição dessas ligações ao solvente por flutuações estruturais locais é pouco frequente. A capacidade para reorganizar VLPs de tamanho total em bruto abre várias possibilidades. Como apresentado na Fig. 7, as VLPs reorganizadas a doses elevadas são capazes de induzir anticorpos neutralizadores de vírus como o material de partida de VLP purificado. Os autores estão actualmente a testar a potência das VLPs reorganizadas, para determinar se estas são imunogénios tão potentes como o material de partida de VLP purificada, que é menos homogéneo em tamanho de partícula. Enquanto que são observadas várias partículas de tamanhos e formas diferentes no núcleo de células após infecção in vivo (Kiselev et al. , J. Mol. Biol. , 40: 155-171, (1969)), presumivelmente apenas os vírus de tamanho total são produtivamente infectivos. Como discutido, as VLPs reorganizadas em causa, podem exibir, potencialmente, uma maior estabilidade devido ao método em causa que proporciona partículas VLP mais uniformes. Ainda, como foi discutido acima, a reacção de reorganização pode, potencialmente, ser depois melhorada por variação da concentração de proteína, pH, força iónica e cinéticas, ambos para optimizar a reorganização sob uma maior gama de condições de partida. Finalmente, a invenção em causa 75 permite o empacotamento de compostos exógenos no interior das VLPs ao efectuar a reacção de reorganização na presença de uma solução concentrada do composto seleccionado. A invenção em causa, como discutido acima, pode ser utilizada para gerar pseudoviriões para utilização como substitutos para tipos de virus de HPV que não estão correntemente disponíveis ou como um sistema de distribuição para fármacos ou outros compostos alvo. A invenção pode ser colocada noutras formas especificas sem sair do seu conteúdo ou caracteristicas essenciais. As formas de realização descritas são para ser consideradas em todos os aspectos apenas como ilustrativas e não limitativas e o âmbito da invenção é, por esse motivo, indicado pelas reivindicações em anexo em vez a descrição anterior. Todas as modificações incluídas com o significado e alcance de equivalência legitima das reivindicações são para ser abrangidas nesse âmbito.

Lisboa, 10 de Outubro de 2006 76

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Método para produzir uma composição contendo uma partícula semelhante ao vírus papilomavírus (VLP) homogénea, cujo método compreende os seguintes passos: (i) desorganizar uma composição contendo uma partícula semelhante a vírus (VLP) por tratamento da referida composição contendo a partícula semelhante a vírus com uma solução compreendendo um agente de redução sulfidrilo para desorganizar as referidas VLPs; e (ii) reorganizar as referidas VLPs desorganizadas por remoção ou oxidação do agente de redução sulfidrilo, em que as referidas VLPs reorganizadas são capazes de induzir anticorpos neutralizadores de vírus.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a solução para desorganização no passo (i) tem uma força iónica que não excede 0,50 M.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que a solução para desorganização no passo (i) tem uma força iónica que não excede 0,15 M.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que as referidas VLPs de papilomavírus são VLPs de papilomavírus humano.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que as referidas VLPs de papilomavírus humano são seleccionadas a partir do 1 grupo que consiste em HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-

30, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-41, HPV-42, HPV-43, HPV-44, HPV-45, HPV-52, HPV-54, HPV-55, HPV-56, HPV-70, e suas misturas.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que a referida VLP de papilomavirus humano é uma VLP de HPV-16.
7. Método de acordo com a reivindicação 5, em que as referidas VLPs de papilomavirus humano são uma mistura de HPV-16 e HPV-18.
8. Método de acordo com a reivindicação 1, em que as VLPs incluem a proteina LI ou uma forma truncada no terminal C da proteina LI de HPV-16.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o referido contacto com uma solução compreendendo, pelo menos, um agente de redução sulfidrilo é durante um período prolongado de tempo suficiente para resultar em, pelo menos, 70% de desorganização das referidas VLPs em moléculas contendo proteína LI mais pequenas e/ou formas quimicamente alteradas e/ou mutadas da proteína LI.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que as referidas VLPs de papilomavirus incluem uma ou mais proteínas Ll, proteínas Ll mutadas e proteínas Ll quimicamente alteradas; e incluem proteínas L2.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o referido agente de redução sulfidrilo 2 é oxidado ou removido por diálise, diafiltração ou cromatografia de coluna.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a concentração do agente de redução no passo (i) é, pelo menos, 1% em peso.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o referido agente de redução sulfidrilo é seleccionado do grupo que consiste em glutationo, ditiotreitol, β-mercaptoetanol, ditioeritritol, cisteina, hidrogenossulfureto e misturas destes.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, em que as porções mais pequenas contendo a proteína LI são purificadas produzindo, assim, partículas semelhantes a vírus papilomavírus (VLPs) purificadas após reorganização.
15. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que as VLPs são purificadas no estado de desorganização e reorganizadas para um estado de pureza desejado.
16. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a VLP de papilomavírus é HPV-16 e subsequente à produção de VLPs de HPV-16 homogéneas tais VLPs são combinadas com VLPs de HPV-18 para proporcionar uma composição compreendendo VLPs de HPV-16 e HPV-18. Lisboa, 10 de Outubro de 2006 3