CN116135882A - 一株羊驼源纳米抗体m112及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株羊驼源纳米抗体及其应用，具体涉及一种与SARS‑CoV‑2S2结合的羊驼源纳米抗体M112或其抗原结合片段及其应用，所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含以下的CDR：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的CDR2，以及氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDR3。本发明的纳米抗体M112能有效抑制SARS‑CoV‑2原始毒株及其变异毒株感染，具有巨大的潜在临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一株羊驼源纳米抗体及其应用，更具体地，涉及一种与SARS-CoV-2 S2结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段、编码其的多核苷酸、包含该多核苷酸的核酸构建体、包含该核酸构建体的表达载体、其制备方法、转化的细胞以及包含上述的药物组合物，以及它们在制备预防或新冠病毒的药物中的应用。
背景技术
2019年底以来，由冠状病毒科(family Coronaviridae)的新型冠状病毒(又称SARS-CoV-2或新冠病毒)引起的疫情在全球范围内仍不断蔓延。除此之外，同属冠状病毒科的严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)等也是针对人类呼吸系统的主要病原体，主要通过飞沫、气溶胶和接触等方式传播，其传染性强，易引起群众恐慌，因此这类引起呼吸系统疾病的病毒严重危害公共卫生安全，尤其近年来呼吸性传染病的频发、病毒的不断变异，对人民群众的身体健康、生命安全和国民经济发展、社会稳定造成极大威胁。
中和抗体类药物主要是通过与病原微生物表面的抗原结合，阻止病原微生物表达的特定分子与细胞表面受体结合，达到“中和”的效果。
SARS-CoV和SARS-CoV-2病毒表面都具有糖基化的刺突蛋白(spike protein,S)，该S蛋白能与宿主细胞受体蛋白ACE2相互作用并触发膜融合，因此阻断S蛋白与ACE2的结合是治疗新冠病毒感染的有效途径。S蛋白分为S1亚基和S2亚基，S2亚基与病毒膜和细胞膜的融合相关，靶向S2亚基的抗体可以通过中和机制发挥抗病毒感染的作用。尤其面对新冠病毒这样的RNA病毒，具有易突变、易发生免疫逃逸等特点，单一特异性抗体很难满足长久的治疗需求，因此靶向不同表位的中和抗体的分离鉴定迫在眉睫。
纳米抗体，也称为单域抗体(VHH)，与传统mAb(～150kDa)相比，纳米抗体具有一些独特的优势：分子量小(～15kDa)、免疫原性低、更好的溶解性和稳定性以及更长的CDR3区域。凭借这些特性，纳米抗体可以作为单个域或模块化单元来构建更复杂的分子，例如针对不同抗原的多价抗体以扩展广谱性。重要的是，纳米抗体可以很容易地雾化并通过吸入器直接输送到肺部，这使它们成为治疗呼吸道疾病的有潜力的药物。因此，分离并鉴定具有交叉反应性的纳米抗体，是应对目前新冠病毒大流行及未来可能出现的冠状病毒感染提供潜在的药物储备。
发明内容
发明目的
本发明的目的在于提供一种与SARS-CoV-2S2结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段、编码其的多核苷酸、包含该多核苷酸的核酸构建体、包含该核酸构建体的表达载体、其制备方法、转化的细胞以及包含上述的药物组合物，以及它们在制备预防或新冠病毒的药物中的应用。本发明的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段为高中和活性的纳米抗体，与SARS-CoV-2S2蛋白的结合能力强，能有效抑制SARS-CoV-2原始毒株及其一系列变异毒株感染；该纳米抗体具有分子量小(～15kDa)、免疫原性小、更好的溶解度和稳定性、较长的CDR3区的优点，可以雾化给药，能直达肺部，起效更快，为新冠或其他冠状病毒感染提供了潜在的治疗策略。
解决方案
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种与SARS-CoV-2S2结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含以下的CDR：
氨基酸序列如SEQ ID NO:1(即，GFTFGSYA)所示的CDR1，
氨基酸序列如SEQ ID NO:2(即，IGSFVTNY)所示的CDR2，
以及氨基酸序列如SEQ ID NO:3(即，HARRVQVERSEY)所示的CDR3。
在具体的实施方案中，所述重链可变区还包括4个框架区FR1-4，所述FR1-4与所述CDR1、CDR2和CDR3按顺序交错排列。
在一个优选的实施方案中，所述FR1-4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4(即，QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAVS)、SEQ ID NO:5(即，MAWYRQAPGKERELVAV)、SEQ ID NO:6(即，ADSVKGRFTISRDNAKNMVYLQMSSLKPEDTAVYYC)和SEQ ID NO:7(即，WGQGTQVTVSS)所示。
在一个优选的实施方案中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示：
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFGSYAMAWYRQAPGKERELVAVIGSFVTNYADSVKGRFTI SRDNAKNMVYLQMSSLKPEDTAVYYCHARRVQVERSEYWGQGTQVTVSS，其中，下划线部分分别为框架区FR1-4，标黑部分分别为重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3。
第二方面，本发明提供一种多核苷酸，其编码如上述第一方面所述的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段。
进一步地，所述多核苷酸为DNA或mRNA。
进一步地，所述多核苷酸具有如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列：
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGATTCACCTTCGGTAGCTATGCCATGGCCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGTTGGTCGCAGTTATTGGTAGTTTCGTTACAAACTATGCAGACTCCGTGAAGGGTCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAATATGGTGTATCTGCAAATGAGCAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTCACGCGCGTCGCGTACAGGTTGAAAGATCTGAGTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTGACCGTGAGCTCT。
第三方面，本发明提供一种核酸构建体，其包含如上述第二方面所述的多核苷酸。
进一步优选地，所述核酸构建体还包含与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。例如组氨酸标签、终止密码子等。
第四方面，本发明提供一种表达载体，其包含如上述第三方面所述的核酸构建体。
第五方面，本发明提供了一种转化的细胞，其包括如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体或如上述第四方面所述的表达载体。
第六方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含如上述第一方面所述的与SARS-CoV-2RBD结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的表达载体或如上述第五方面所述的转化的细胞，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
进一步优选地，所述药物组合物为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式。
进一步优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂。
进一步优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片和膏剂。
进一步优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射或可推注制剂。
第七方面，本发明提供了一种如上述第一方面所述的与SARS-CoV-2S2结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的表达载体或如上述第五方面所述的转化的细胞或如上述第六方面所述的药物组合物在制备预防、治疗或检测新冠病毒感染的药物中的应用。
优选地，所述新冠病毒为SARS-CoV-2原始毒株和/或SARS-CoV-2变异毒株。
进一步优选地，所述SARS-CoV-2变异毒株为SARS-CoV-2的Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)、Kappa(B.1.617.1)和/或Delta(B.1.617.2)变异毒株。
第八方面，本发明提供了一种预防或治疗新冠病毒的方法，其包括：向有需要的受试者施用预防或治疗有效量的如上述第一方面所述的与SARS-CoV-2S2结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的表达载体或如上述第五方面所述的转化的细胞或如上述第六方面所述的药物组合物。
第九方面，本发明提供了一种检测新冠病毒的方法，其包括使用如上述第一方面所述的与SARS-CoV-2S2结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段。
优选地，所述新冠病毒为SARS-CoV-2原始毒株和/或SARS-CoV-2变异毒株。
进一步优选地，所述SARS-CoV-2变异毒株为SARS-CoV-2的Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)、Kappa(B.1.617.1)和/或Delta(B.1.617.2)变异毒株。
本发明的药物组合物的有效成分的给药量，根据给药对象、对象脏器、症状、给药方法等不同而存在差异，可以考虑剂型的种类、给药方法、患者的年龄和体重、患者的症状等，根据医生的判断来确定。
有益效果
本发明针对新冠病毒进行纳米抗体药物开发，通过用SARS-CoV-2S蛋白免疫羊驼、构建抗体文库、利用噬菌体展示技术筛选特异性纳米抗体等，筛选到结合SARS-CoV-2S2的纳米抗体，本文命名为纳米抗体M112。通过表面等离子共振技术检测证实，本发明的纳米抗体M112以高亲和力特异性结合SARS-CoV-2S2。此外，通过病毒中和试验(包括真病毒中和实验和假病毒中和实验)证实，本发明的纳米抗体M112能以高中和活性中和SARS-CoV-2原始毒株以其一系列变异毒株。
本发明为新型冠状病毒原始毒株以其一系列变异毒株的临床预防、治疗和检测提供了潜在的纳米抗体新药。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1是本发明实施例1中记载的SARS-CoV-2S蛋白分子筛层析和SDS-PAGE鉴定结果示意图；
图2是本发明实施例1中记载的MERS-CoV S-his蛋白的分子筛层析和SDS-PAGE鉴定结果示意图；
图3是本发明实施例1中记载的SARS-CoV-2S2-his蛋白的分子筛层析和Western-blot鉴定结果示意图；
图4是本发明实施例4中记载的纳米抗体M112的分子筛层析和SDS-PAGE鉴定结果示意图。
图5是本发明实施例5中记载的纳米抗体M112和SARS-CoV-2S2蛋白的亲和力鉴定结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
以下，对本发明进行详述。
定义
“纳米抗体”，即“重链单域抗体”，该类抗体只包含一个重链可变区(VHH，variabledomain of heavy chain of heavy-chain antibody)，相比于其他抗体，轻链天然缺失。
由于纳米抗体自身的生物物理优势，可以很容易地对其进行雾化并通过吸入器直接递送到肺部，从而治疗呼吸系统病毒引起的感染，被认为是非常有潜力的抗体类药物。
当提及配体/受体、抗体/抗原或其它结合对时，“特异性”结合是指在蛋白和/或其它生物试剂的异质群体中确定是否存在所述蛋白例如本发明的纳米抗体与SARS-CoV-2RBD蛋白的结合反应。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著量与样品中存在的其它蛋白结合。
本发明以下实施例中所使用的试剂、酶、培养基、抗生素和牛奶等化学材料均为市售产品，例如，TRIzol购自Invitrogen，Superscript II First-Strand Synthesis Systemfor RT-PCR试剂盒购自Invitrogen。
一些常用的生物材料，如感受态细胞、载体、辅助噬菌体、待转化的细胞等也为市售产品，例如，pCAGGS载体购自MiaoLingPlasmid，293F细胞、HEK293T细胞等购自ATCC；电感受态E.coli TG1细胞购自Lucigen，VCSM13辅助噬菌体购自StrataGene、质粒pMES4购自Addgene；Vero细胞购自ATCC CCL81。
一些合成类生物材料，例如引物、序列等需要人工合成的材料，均委托合成公司完成，例如，本发明中的引物(SED ID NO:16～21)由北京擎科生物科技有限公司合成。
实施例1：SARS-CoV-2S-his、MERS-CoV S-his和SARS-CoV-2S2-his蛋白的表达与纯化
在SARS-CoV-2S蛋白编码序列(如SEQ ID NO:10所示)的5’端连上信号肽(如SEQID NO:11所示)和3’端连上8个组氨酸标签(hexa-His-tag)的编码序列及翻译终止密码子(TGA)，通过限制性内切酶位点EcoRI和XhoI，将其构建入pCAGGS载体中，转染至293F细胞中，进行SARS-CoV-2S-his蛋白的表达。含有目的蛋白的细胞培养液经镍离子亲和层析(HisTrapTMexcel(GE))和凝胶过滤层析(SuperoseTM 6Increase 10/300GL(GE))纯化后，可以获得较纯的目的蛋白SARS-CoV-2S-his。SARS-CoV-2S-his蛋白的SDS-PAGE鉴定大小约为200KD，结果如图1。
在MERS-CoV S蛋白编码序列(如SEQ ID NO:12所示)的5’端连上信号肽(如SEQ IDNO:13所示)和3’端连上8个组氨酸标签(hexa-His-tag)的编码序列及翻译终止密码子(TGA)，通过限制性内切酶位点EcoRI和XhoI，将其构建入pCAGGS载体中，转染至293F细胞中，进行SARS-CoV-2S-his蛋白的表达。含有目的蛋白的细胞培养液经镍离子亲和层析(HisTrapTMexcel(GE))和凝胶过滤层析(SuperoseTM 6Increase 10/300GL(GE))纯化后，可以获得较纯的目的蛋白MERS-CoV S-his。MERS-CoV S-his蛋白的SDS-PAGE鉴定大小约为200KD，结果如图2。
在SARS-CoV-2S2蛋白编码序列(如SEQ ID NO:14所示)的3’端连上6个组氨酸标签(hexa-His-tag)的编码序列及翻译终止密码子(TGA)，通过限制性内切酶位点EcoRI和XhoI，将其构建入pFastBac载体(序列如SEQ ID NO:15所示)中，利用位点特异的Tn7转座子，将构建到pFastBac质粒上的外源基因转座到大肠杆菌DH10Bac中的bacmid中，产生重组bacmid。转染bacmid至sf9细胞中，产生可表达目的基因的重组杆状病毒，噬斑法确认病毒滴度，用确认了滴度的病毒感染sf9细胞大量扩增病毒，P3病毒可直接用于表达蛋白，用病毒感染Hi5细胞进行SARS-CoV-2S2-his蛋白的表达。含有目的蛋白的细胞培养液经镍离子亲和层析(HisTrap TM excel((GE Healthcare))和凝胶过滤层析(SuperdexTM200Increase 10/300GL column(GE Healthcare))纯化后，可以获得较纯的目的蛋白。SARS-CoV-2S2-his蛋白的SDS-PAGE鉴定大小为60KD左右，结果如图3。
实施例2：羊驼免疫和抗体文库构建
实施例1中制备的带有6个组氨酸标签的SARS-CoV-2S蛋白200μg，用PBS稀释至终体积1mL，加1ml完全弗氏佐剂乳化5min，皮下多点注射进行免疫。之后每两周进行一次免疫，并改用MF59水溶性佐剂乳化S蛋白，第五次免疫后的第12天，采集50-60mL的血液，分离PBMCs(外周血单个核细胞)。将分离的PBMCs加入1mL TRIzol，按照说明书的步骤提取总RNA。以提取的总RNA为模板，使用Superscript II First-Strand Synthesis System forRT-PCR试剂盒，用随机引物oligo-dT12-18引物合成cDNA。以cDNA为模板，使用特异性引物CALL001和CALL002(引物序列如表1)进行PCR试验，对700bp大小的条带进行切胶并回收。纯化后的DNA作为模板，使用巢式引物VHH-BACK和PMCF进行巢式PCR，来扩增纳米抗体(VHHs)序列，回收纯化大小在400bp左右VHHs序列。
使用双酶切法，通过限制性酶切位点PstⅠ和BstEⅡ，将VHHs片段连接入质粒pMES4。将纯化的克隆载体和电感受态E.coli TG1细胞混合，使用电转仪(BIO-RAD电转化仪MicroPulser)将克隆载体转化入电感受态E.coli TG1细胞，全部涂布在含有氨苄青霉素的选择性培养基上，37℃过夜培养后，收集所有的菌落于LB培养基中，离心并弃上清，用LB重悬细胞，此为抗体文库。
表1.反应引物
实施例3：噬菌体展示技术筛选特异性的纳米抗体
取实施例2已转染重组质粒的E.coli TG1，以感染复数(multiplicity ofinfection,MOI)约为20的比例，加入VCSM13辅助噬菌体，过夜培养后，4000rpm离心，取上清，0.22μm的膜过滤后，按体积比1:4加入PEG6000/NaCl，混合后，4℃下放置至少1小时，8000×g离心30min，弃上清，沉淀用PBS重悬，即为收集的噬菌体颗粒，测定噬菌体效价。
将2×1011个上述收集的噬菌体与等体积的5％(w/v)脱脂牛奶混合，加到包被有SARS-CoV-2S-his抗原的96孔板中，室温孵育1h后，用0.2M甘氨酸洗脱特异性的噬菌体，并用Tris-HCl(pH 9.1)中和洗脱的噬菌体。然后用该噬菌体感染E.coli TG1细胞，并对噬菌体进行扩增。再次准备包被有MERS-CoV S-his抗原的96孔板，依次进行第2轮淘选，来富集表达有特异性纳米抗体的噬菌体，共进行3轮淘选。每轮淘选后，从长有菌落的琼脂平板上随机挑选不同单一菌落，在37℃摇床中培养，随后加入VCSM13辅助噬菌体过夜扩培，第二天离心培养液，取噬菌体上清进行ELISA实验(采用MERS-CoV S-his蛋白作为包被抗原)，当OD450nM>0.2时，判定为阳性反应，取对应的克隆，使用特异性引物MP57和GⅢ对质粒进行测序(引物序列如表2)，获得其质粒中编码VHHs的序列。通过序列测定，获得M112的核心编码序列。
表2.反应引物
实施例4：纳米抗体M112的表达与纯化
为了使M112的重链可变区更加完整，在实施例3获得的M112的核心编码序列的5’端连上QVQLQ的编码序列(CAGGTGCAGCTGCAG)，3’端连上QVTVSS的编码序列(CAGGTGACCGTGAGCTCT)，得到如SEQ ID NO:9的核苷酸序列，即本申请的纳米抗体M112的编码序列，然后在其前连上信号肽(SED ID NO:22)，并在其后连上6个组氨酸标签(hexa-His-tag)的编码序列及翻译终止密码子TGA，通过限制性酶切位点EcoRI和XhoI，将其构建入pCAGGS载体中，转染293F细胞，培养5天后，收集上清，经过5000rpm离心30min后，经过0.22μm滤膜过滤后，经镍离子亲和层析(HisTrapTMexcel((GE Healthcare))和凝胶过滤层析(SuperdexTM 75Increase 10/300GL column(GE Healthcare))纯化后，获得较纯的目的蛋白。目的峰通过SDS-PAGE确定，结果如图4，得到纯化的纳米抗体M112。
实施例5：表面等离子共振技术检测抗体与SARS-CoV-2S2的结合能力
表面等离子共振分析利用Biacore 8K(Biacore Inc.)进行。具体步骤如下：
选用SA芯片(购自GE Healthcare)，通过SA芯片与biotin的亲和力将实施例1得到的SARS-CoV-2S2-biotin蛋白固定在芯片上，用PBST缓冲液(2.7mM KCl，137mM NaCl，4.3mMNa2HPO4，1.4mM KH2PO4，0.05％吐温)倍比稀释M112抗体蛋白，从低浓度到高浓度逐一上样。纳米抗体M112结合SARS-CoV-2S2蛋白的动力学曲线如图5所示。纳米抗体M112结合SARS-CoV-2S2的动力学结合常数(ka)、解离常数(kd)和平衡解离常数(KD)如表3所示，这些参数的计算是利用BIAevaluation software 8K(Biacore，Inc.)软件进行的。表3结果说明，纳米抗体M112能够以较高的亲和力与SARS-CoV-2S2结合。
表3抗体与SARS-CoV-2S2蛋白结合的结合常数(ka)、解离常数(kd)和平衡解离常数(KD)
实施例6：SARS-CoV-2原始毒株假病毒的包装
1)将编码SARS-CoV-2原始毒株(WT)的S蛋白后18位氨基酸的基因去掉，S蛋白其余序列进行合成(由苏州金唯智提供合成服务)，得到SARS-CoV-2-WT-S-del18基因的核苷酸序列，序列如SEQ ID NO:23所示。
2)将1)中获得的该蛋白基因克隆到pCAGGS载体上，得到表达质粒pCAGGS-SARS-CoV-2-WT-S-del18。
SARS-CoV-2原始毒株的包装步骤如下：
a.细胞准备：在10cm细胞培养皿中铺HEK293T细胞，使第二天细胞汇合密度至80％左右。培养液为含10％FBS的DMEM培养基。
b.转染：取上述步骤2)中的S蛋白的表达质粒，用PEI转染30μg质粒/10cm细胞培养皿，目的质粒与PEI按1:3比例混匀后转染，4-6h换培养液(含10％FBS的DMEM培养基)，37℃培养24h。
c.加毒：将假病毒包装骨架病毒G*VSV-delG(购自武汉枢密脑科学技术有限公司)加入上述转染后的HEK293T细胞，37℃孵育2h，换培养液(含10％FBS的DMEM培养基)，并加入VSV-G抗体(表达该抗体的杂交瘤细胞购自ATCC细胞库)，在培养箱中继续培养30h。
d.收毒：收上清3000rpm离心10min,在超净工作台中经0.45μm无菌滤器过滤，去除细胞碎片，分装，-80℃冰箱冻存。
得到SARS-CoV-2原始毒株(SARS-CoV-2WT)的假病毒。
实施例7：纳米抗体M112中和SARS-CoV-2原始毒株假病毒感染的检测
将实施例4得到的纯化的纳米抗体M112从500μg/mL开始5倍倍比稀释至第9个梯度(1.2ng/mL)，将该稀释的纳米抗体M112与1.6x104 TCID50实施例5获得的SARS-CoV-2原始毒株假病毒混合，在37℃混合孵育1h，然后加入到预先接种Vero细胞(购自ATCC CCL81)的96孔板中。孵育18～20小时后，通过CQ1 Confocal Quantitative Image Cytometer(Yokogawa)检测。根据带GFP荧光的细胞数，计算抗体对上述SARS-CoV-2原始毒株假病毒的中和能力(其IC50结果未示出)。
综上，纳米抗体M112能够作为高中和活性的针对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)原始毒株及其变异毒株的羊驼源纳米抗体。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 一株羊驼源纳米抗体M112及其应用
<130> 1087-210317F
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> PRT
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<220>
<223> 本发明纳米抗体M112的重链可变区的CDR1的氨基酸序列
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<223> 本发明纳米抗体M112的重链可变区的CDR2的氨基酸序列
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<223> 本发明纳米抗体M112的重链可变区的氨基酸序列
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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val
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Ala Val Ile Gly Ser Phe Val Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
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Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Val Tyr Leu Gln
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<223> 本发明纳米抗体M112的核苷酸序列
<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> SARS-CoV-2 S蛋白编码序列
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gacctgttcc tccctttctt cagcaacgtg acatggttcc acgccatcca cgtgtctggc 180
acaaacggca caaagcggtt cgacaacccc gtgctccctt tcaacgacgg cgtgtacttc 240
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gactctagct ctggctggac agccggcgcc gccgcctact acgtgggcta cctgcagcct 780
aggaccttcc tcctgaagta caacgagaac ggcacaatta ccgacgccgt ggactgcgcc 840
ctggacccac tgtccgagac aaagtgcaca ctgaagtcct tcacagtgga gaagggcatt 900
taccagacat ctaacttccg ggtgcagcct acagagtcta ttgtgcggtt cccaaacatc 960
acaaacctgt gccctttcgg cgaggtgttc aacgccaccc ggttcgcctc tgtgtacgcc 1020
tggaaccgga agcggatctc taactgcgtg gccgactact ccgtgctgta caactccgcc 1080
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accaacgtgt acgccgactc tttcgtgatt agaggcgacg aggtgaggca gattgccccc 1200
ggccagacag gcaagatcgc cgactacaac tacaagctgc ccgacgactt cacaggctgc 1260
gtgatcgcct ggaactctaa caacctggac tctaaggtgg gcggcaacta caactacctg 1320
tacagactgt tccggaagtc taacctgaag ccattcgaga gggacattag caccgagatt 1380
taccaggccg gctctacccc atgcaacggc gtggagggct tcaactgcta cttcccactg 1440
cagtcctacg gcttccagcc tacaaacggc gtgggctacc agccttaccg ggtggtggtg 1500
ctgtctttcg agctgctcca cgcccccgcc acagtgtgcg gcccaaagaa gagcacaaac 1560
ctcgtgaaga acaagtgcgt gaacttcaac ttcaacggcc tcacaggcac aggcgtgctc 1620
accgagtcta acaagaagtt cctccctttc cagcagttcg gccgcgacat tgccgacacc 1680
accgacgccg tgcgggaccc tcagacactg gaaattctcg acatcacccc ttgcagcttc 1740
ggcggcgtgt ccgtgatcac cccaggcaca aacacatcta accaggtggc cgtgctgtac 1800
caggacgtga actgcaccga ggtgccagtg gccatccacg ccgaccagct caccccaaca 1860
tggagggtgt acagcacagg ctctaacgtg ttccagaccc gggccggctg cctcattggc 1920
gccgagcacg tgaacaactc ttacgagtgc gacatcccta ttggcgccgg catttgcgcc 1980
tcttaccaga cccagacaaa ctctccatct agcgcctcct ctgtggcctc tcagagcatt 2040
attgcctaca ccatgtctct gggcgccgag aactctgtgg cctactctaa caactctatt 2100
gccatcccta caaacttcac aatttctgtg accaccgaga ttctcccagt gtctatgacc 2160
aagacatctg tggactgcac catgtacatt tgcggcgact ccaccgagtg ctctaacctc 2220
ctgctccagt acggctcttt ctgcacccag ctcaaccgcg ccctgacagg catcgccgtg 2280
gagcaggaca agaacaccca ggaggtgttc gcccaggtga agcagattta caagaccccc 2340
ccaattaagg acttcggcgg cttcaacttc tctcagattc tccccgaccc atccaagcct 2400
agcaagcggt ccttcattga ggacctcctg ttcaacaagg tgacactggc cgacgccggc 2460
ttcattaagc agtacggcga ctgcctgggc gacattgccg cccgggacct gatttgcgcc 2520
cagaagttca acggcctcac agtgctcccc ccactgctca ccgacgagat gattgcccag 2580
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gccctgcaga tccctttcgc catgcagatg gcctaccgct tcaacggcat cggcgtgaca 2700
cagaacgtgc tgtacgagaa ccagaagctg atcgccaacc agttcaacag cgccattggc 2760
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aaccagaacg cccaggccct gaacacactg gtgaagcagc tgtcttctaa cttcggcgcc 2880
atttctagcg tgctgaacga cattctgtcg cggctggacc ctccagaggc cgaggtgcag 2940
attgacaggc tcatcacagg cagactgcag tctctgcaga catacgtgac ccagcagctg 3000
attagagccg ccgagattag agcctccgcc aacctggccg ccaccaagat gagcgagtgc 3060
gtgctcggcc agtctaagcg ggtggacttc tgcggcaagg gctaccacct catgtctttc 3120
cctcagtccg cccctcacgg cgtggtgttc ctccacgtga catacgtgcc cgcccaggag 3180
aagaacttca ccacagcccc cgccatttgc cacgacggca aggcccactt ccctagggag 3240
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cagattatta ccacagacaa cacattcgtg agcggcaact gcgacgtggt gattggcatt 3360
gtgaacaaca cagtgtacga cccactgcag cctgagttgg actctttcaa ggaggaactc 3420
gacaagtact tcaagaacca cacatctcct gacgtggacc tgggcgacat tagcggcatt 3480
aacgcctctg tggtgaacat tcagaaggag attgacagac tgaacgaggt ggccaagaac 3540
ctgaacgagt ctctcattga cctgcaggag ctgggcaagt acgagcagta cattaagtgg 3600
cct 3603
<210> 11
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于表达SARS-CoV-2 S蛋白的信号肽序列
<220>
<221> misc_signal
<222> (1)..(60)
<400> 11
gccaccatgc acagctcagc actgctctgt tgcctggtcc tcctgactgg ggtgagggcc 60
<210> 12
<211> 3828
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV S蛋白编码序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3828)
<400> 12
gttgatgtag ggccagattc tgttaagtct gcttgtattg aggttgatat acaacagact 60
ttctttgata aaacttggcc taggccaatt gatgtttcta aggctgacgg tattatatac 120
cctcaaggcc gtacatattc taacataact atcacttatc aaggtctttt tccctatcag 180
ggagaccatg gtgatatgta tgtttactct gcaggacatg ctacaggcac aactccacaa 240
aagttgtttg tagctaacta ttctcaggac gtcaaacagt ttgctaatgg gtttgtcgtc 300
cgtataggag cagctgccaa ttccactggc actgttatta ttagcccatc taccagcgct 360
actatacgaa aaatttaccc tgcttttatg ctgggttctt cagttggtaa tttctcagat 420
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aattcctata cttcttttgc cacttatcac actcctgcaa cagattgttc tgatggcaat 600
tacaatcgta atgccagtct gaactctttt aaggagtatt ttaatttacg taactgcacc 660
tttatgtaca cttataacat taccgaagat gagattttag agtggtttgg cattacacaa 720
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tttcaatttg ccaccttgcc tgtttatgat actattaagt attattctat cattcctcac 840
agtattcgtt ctatccaaag tgatagaaaa gcttgggctg ccttctacgt atataaactt 900
caaccgttaa ctttcctgtt ggatttttct gttgatggtt atatacgcag agctatagac 960
tgtggtttta atgatttgtc acaactccac tgctcatatg aatccttcga tgttgaatct 1020
ggagtttatt cagtttcgtc tttcgaagca aaaccttctg gctcagttgt ggaacaggct 1080
gaaggtgttg aatgtgattt ttcacctctt ctgtctggca cacctcctca ggtttataat 1140
ttcaagcgtt tggtttttac caattgcaat tataatctta ccaaattgct ttcacttttt 1200
tctgtgaatg attttacttg tagtcaaata tctccagcag caattgctag caactgttat 1260
tcttcactga ttttggatta cttttcatac ccacttagta tgaaatccga tctcagtgtt 1320
agttctgctg gtccaatatc ccagtttaat tataaacagt ccttttctaa tcccacatgt 1380
ttgattttag cgactgttcc tcataacctt actactatta ctaagcctct taagtacagc 1440
tatattaaca agtgctctcg tcttctttct gatgatcgta ctgaagtacc tcagttagtg 1500
aacgctaatc aatactcacc ctgtgtatcc attgtcccat ccactgtgtg ggaagacggt 1560
gattattata ggaaacaact atctccactt gaaggtggtg gctggcttgt tgctagtggc 1620
tcaactgttg ccatgactga gcaattacag atgggctttg gtattacagt tcaatatggt 1680
acagacacca atagtgtttg ccccaagctt gaatttgcta atgacacaaa aattgcctct 1740
caattaggca attgcgtgga atattccctc tatggtgttt cgggccgtgg tgtttttcag 1800
aattgcacag ctgtaggtgt tcgacagcag cgctttgttt atgatgcgta ccagaattta 1860
gttggctatt attctgatga tggcaactac tactgtttgc gtgcttgtgt tagtgttcct 1920
gtttctgtca tctatgataa agaaactaaa acccacgcta ctctatttgg tagtgttgca 1980
tgtgaacaca tttcttctac catgtctcaa tactcccgtt ctacgcgatc aatgcttaaa 2040
cggcgagatt ctacatatgg cccccttcag acacctgttg gttgtgtcct aggacttgtt 2100
aattcctctt tgttcgtaga ggactgcaag ttgcctcttg gtcaatctct ctgtgctctt 2160
cctgacacac ctagtactct cacacctcgc agtgtgagct ctgttccagg tgaaatgcgc 2220
ttggcatcca ttgcttttaa tcatcctatt caggttgatc aacttaatag tagttatttt 2280
aaattaagta tacccactaa tttttccttt ggtgtgactc aggagtacat tcagacaacc 2340
attcagaaag ttactgttga ttgtaaacag tacgtttgca atggtttcca gaagtgtgag 2400
caattactgc gcgagtatgg ccagttttgt tccaaaataa accaggctct ccatggtgcc 2460
aatttacgcc aggatgattc tgtacgtaat ttgtttgcga gcgtgaaaag ctctcaatca 2520
tctcctatca taccaggttt tggaggtgac tttaatttga cacttctaga acctgtttct 2580
atatctactg gcagtcgtag tgcacgtagt gctattgagg atttgctatt tgacaaagtc 2640
actatagctg atcctggtta tatgcaaggt tacgatgatt gcatgcagca aggtccagca 2700
tcagctcgtg atcttatttg tgctcaatat gtggctggtt acaaagtatt acctcctctt 2760
atggatgtta atatggaagc cgcgtatact tcatctttgc ttggcagcat agcaggtgtt 2820
ggctggactg ctggcttatc ctcctttgct gctattccat ttgcacagag tatcttttat 2880
aggttaaacg gtgttggcat tactcaacag gttctttcag agaaccaaaa gcttattgcc 2940
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gagctatcta atacttttgg tgctatttcc gcctctattg gagacatcat acaacgtctt 3120
gatgttctcg aacaggacgc ccaaatagac agacttatta atggccgttt gacaacacta 3180
aatgcttttg ttgcacagca gcttgttcgt tccgaatcag ctgctctttc cgctcaattg 3240
gctaaagata aagtcaatga gtgtgtcaag gcacaatcca agcgttctgg attttgcggt 3300
caaggcacac atatagtgtc ctttgttgta aatgccccta atggccttta cttcatgcat 3360
gttggttatt accctagcaa ccacattgag gttgtttctg cttatggtct ttgcgatgca 3420
gctaacccta ctaattgtat agcccctgtt aatggctact ttattaaaac taataacact 3480
aggattgttg atgagtggtc atatactggc tcgtccttct atgcacctga gcccattacc 3540
tcccttaata ctaagtatgt tgcaccacag gtgacatacc aaaacatttc tactaacctc 3600
cctcctcctc ttctcggcaa ttccaccggg attgacttcc aagatgagtt ggatgagttt 3660
ttcaaaaatg ttagcaccag tatacctaat tttggttccc taacacagat taatactaca 3720
ttactcgatc ttacctacga gatgttgtct cttcaacaag ttgttaaagc ccttaatgag 3780
tcttacatag accttaaaga gcttggcaat tatacttatt acaacaaa 3828
<210> 13
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于表达MERS-CoV S蛋白的信号肽序列
<220>
<221> misc_signal
<222> (1)..(60)
<400> 13
gccaccatgc acagctcagc actgctctgt tgcctggtcc tcctgactgg ggtgagggcc 60
<210> 14
<211> 1571
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 S2蛋白编码序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1571)
<400> 14
agagcgtggc ttcccagtcc atcatcgctt acaccatgtc cctcggtgct gagaacagcg 60
tggcttacag caacaacagc atcgctatcc ctaccaactt caccatctcc gtgaccaccg 120
agatcctgcc tgtgagcatg accaagacct ccgtggactg caccatgtac atctgcggcg 180
acagcaccga gtgcagcaac ctcttgttgc agtacggtag cttctgcacc cagttgaaca 240
gggctttgac cggaatcgct gtggagcagg acaagaacac ccaggaggtg ttcgctcagg 300
tgaagcagat ttacaagacc ccccctatca aggacttcgg cggattcaac ttctcccaaa 360
ttttgcccga ccctagcaag ccaagcaagc gtagcttcat cgaggacctg ctgttcaaca 420
aggtcacctt ggccgacgcc ggtttcatca agcagtacgg cgactgcctg ggtgacatcg 480
ccgctaggga cttgatctgc gctcagaagt tcaacggttt gaccgtcttg cccccattgt 540
tgaccgacga gatgatcgct cagtacacct ccgctctgtt ggctggtacc atcacctccg 600
gatggacctt cggtgctggc gccgctttgc agatcccttt cgccatgcag atggcttaca 660
gattcaacgg aatcggagtg acccagaacg tgttgtacga gaaccagaag ctgatcgcta 720
accagttcaa cagcgctatc ggaaagatcc aggacagcct gtcctccacc gcaagcgctt 780
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acaaggtcga ggctgaggtg cagatcgaca ggttgatcac cggccgtttg cagtccttgc 960
agacctacgt gacccagcag ttgatcaggg ccgccgagat cagggcatct gctaacctgg 1020
ccgctaccaa gatgtccgag tgcgtcttgg gtcagtccaa gagagtggac ttctgcggaa 1080
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<210> 15
<211> 4884
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pFastBac载体序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4884)
<400> 15
gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 60
gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc 120
acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt 180
agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg 240
ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt 300
ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta 360
taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt 420
aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt tcggggaaat 480
gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg 540
agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa 600
catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac 660
ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac 720
atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt 780
ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc 840
gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca 900
ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc 960
ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag 1020
gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa 1080
ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg 1140
gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa 1200
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caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag 1440
cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat 1500
ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct 1560
taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct 1620
tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca 1680
gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc 1740
agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc 1800
aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct 1860
gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag 1920
gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc 1980
tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 2040
agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 2100
cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt 2160
gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac 2220
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ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc 2340
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acagaatagt tgtaaactga aatcagtcca gttatgctgt gaaaaagcat actggacttt 2640
tgttatggct aaagcaaact cttcattttc tgaagtgcaa attgcccgtc gtattaaaga 2700
ggggcgtggc caagggcatg gtaaagacta tattcgcggc gttgtgacaa tttaccgaac 2760
aactccgcgg ccgggaagcc gatctcggct tgaacgaatt gttaggtggc ggtacttggg 2820
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cggagcaagt tcccgaggta atcggagtcc ggctgatgtt gggagtaggt ggctacgtct 3180
ccgaactcac gaccgaaaag atcaagagca gcccgcatgg atttgacttg gtcagggccg 3240
agcctacatg tgcgaatgat gcccatactt gagccaccta actttgtttt agggcgactg 3300
ccctgctgcg taacatcgtt gctgctgcgt aacatcgttg ctgctccata acatcaaaca 3360
tcgacccacg gcgtaacgcg cttgctgctt ggatgcccga ggcatagact gtacaaaaaa 3420
acagtcataa caagccatga aaaccgccac tgcgccgtta ccaccgctgc gttcggtcaa 3480
ggttctggac cagttgcgtg agcgcatacg ctacttgcat tacagtttac gaaccgaaca 3540
ggcttatgtc aactgggttc gtgccttcat ccgtttccac ggtgtgcgtc acccggcaac 3600
cttgggcagc agcgaagtcg aggcatttct gtcctggctg gcgaacgagc gcaaggtttc 3660
ggtctccacg catcgtcagg cattggcggc cttgctgttc ttctacggca aggtgctgtg 3720
cacggatctg ccctggcttc aggagatcgg aagacctcgg ccgtcgcggc gcttgccggt 3780
ggtgctgacc ccggatgaag tggttcgcat cctcggtttt ctggaaggcg agcatcgttt 3840
gttcgcccag gactctagct atagttctag tggttggcta cgtatactcc ggaatattaa 3900
tagatcatgg agataattaa aatgataacc atctcgcaaa taaataagta ttttactgtt 3960
ttcgtaacag ttttgtaata aaaaaaccta taaatattcc ggattattca taccgtccca 4020
ccatcgggcg cggatccaat atgctactag taaatcagtc acaccaaggc ttcaataagg 4080
aacacacaag caagatggta agcgctattg ttttatatgt gcttttggcg gcggcggcgc 4140
attctgcctt tgcggcggat ggaattcaaa ggcctacgtc gacgagctca ctagtcgcgg 4200
ccgctttcga atctagagcc tgcagtctcg aggcatgcgg taccaagctt gtcgagaagt 4260
actagaggat cataatcagc cataccacat ttgtagaggt tttacttgct ttaaaaaacc 4320
tcccacacct ccccctgaac ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt gttaacttgt 4380
ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag 4440
catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg 4500
tctggatctg atcactgctt gagcctagga gatccgaacc agataagtga aatctagttc 4560
caaactattt tgtcattttt aattttcgta ttagcttacg acgctacacc cagttcccat 4620
ctattttgtc actcttccct aaataatcct taaaaactcc atttccaccc ctcccagttc 4680
ccaactattt tgtccgccca cagcggggca tttttcttcc tgttatgttt ttaatcaaac 4740
atcctgccaa ctccatgtga caaaccgtca tcttcggcta ctttttctct gtcacagaat 4800
gaaaattttt ctgtcatctc ttcgttatta atgtttgtaa ttgactgaat atcaacgctt 4860
atttgcagcc tgaatggcga atgg 4884
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物CALL001
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<400> 16
gtcctggctg ctcttctaca agg 23
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物CALL002
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<400> 17
ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物VHH-BA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(29)
<400> 18
gatgtgcagc tgcaggagtc tggrggagg 29
<210> 19
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物PMCF
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(34)
<400> 19
ctagtgcggc cgctgaggag acggtgacct gggt 34
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物MP57
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<400> 20
ttatgcttcc ggctcgtatg 20
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物GⅢ
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<400> 21
ccacagacag ccctcatag 19
<210> 22
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于表达本发明纳米抗体M112的信号肽序列
<220>
<221> misc_signal
<222> (1)..(60)
<400> 22
gccaccatgc acagcagcgc cctgctgtgc tgcctggttc tgctgaccgg agtgagggcc 60
<210> 23
<211> 3786
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 新冠病毒SARS-CoV-2-WT-S-del18的编码核苷酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3786)
<400> 23
atgttcgtgt tcctggtgct gctgcccctg gtgagcagcc aatgcgtgaa cctgaccaca 60
agaacacagc tgccccccgc ctacaccaac agcttcacaa gaggcgtgta ctaccccgac 120
aaggtgttca gaagcagcgt cctccacagc acccaagacc tgttcctgcc cttcttcagc 180
aacgtgacct ggttccacgc catcagcggc accaacggca ccaagagatt cgacaacccc 240
gtgctgccct tcaacgacgg cgtgtacttc gctagcaccg agaagagcaa catcatcaga 300
ggctggatct tcggcaccac cctggacagc aaaacacaga gcctgctgat cgtgaacaac 360
gccacaaacg tggtgatcaa ggtgtgcgag tttcagttct gcaacgaccc cttcctgggc 420
gtgtaccaca agaacaacaa gagctggatg gagagcgagt tccgggtgta cagcagcgcc 480
aacaactgca ccttcgagta cgtgagccaa cccttcctga tggacctgga gggcaagcaa 540
ggcaatttta agaacctgag agagttcgtg ttcaagaaca tcgacggcta cttcaagatc 600
tacagcaagc acacccccat caacctggtg agagacctgc cccaaggctt cagcgccctg 660
gagcccctgg tggacctgcc catcggcatc aacatcacaa gatttcagac cctgctggcc 720
ctgcacagaa gctatctgac ccccggcgac agcagcagcg gctggaccgc cggcgccgcc 780
gcttactacg tgggctacct gcagcctaga accttcctgc tgaagtacaa cgagaacggc 840
acaatcaccg acgccgtcga ctgcgccctg gaccccctga gcgagaccaa gtgcaccctg 900
aagagcttca ccgtggagaa gggcatctat cagacaagca acttcagagt gcagcccacc 960
gagagcatcg tgagattccc caacatcacc aacctgtgcc ccttcggcga ggtgttcaac 1020
gccacaagat tcgctagcgt gtacgcctgg aacagaaaga gaatcagcaa ctgcgtggcc 1080
gactacagcg tgctgtacaa cagcgctagc ttcagcacct tcaagtgcta cggcgtcagc 1140
cccaccaagc tgaacgacct gtgcttcacc aacgtgtacg ccgacagctt cgtgatcaga 1200
ggcgacgagg tgagacagat cgcccccggg cagaccggca agatcgccga ctacaactac 1260
aagctgcccg acgacttcac cggctgcgtg atcgcctgga acagcaacaa cctggactcc 1320
aaggtgggcg gcaactacaa ctacctgtac agactgttca gaaagagcaa cctgaagccc 1380
ttcgagagag acatcagcac cgagatctac caagccggca gcaccccctg caacggcgtg 1440
gagggcttca actgctactt ccccctgcag agctacggct ttcagcccac ctacggcgtg 1500
ggctatcagc cctacagagt ggtcgtgctg agcttcgagc tgctgcacgc ccccgccacc 1560
gtgtgcggcc ccaagaagag caccaacctg gtgaagaaca agtgcgtgaa cttcaacttc 1620
aacggcctca ccgggaccgg cgtgctgacc gagagcaaca agaagttcct gcctttccaa 1680
cagttcggca gagacatcga cgacaccacc gacgccgtca gagaccctca gaccctggag 1740
atcctggaca tcacaccctg cagcttcggc ggcgtgagcg tgatcacccc cggcaccaac 1800
acaagcaacc aagtggccgt gctgtaccaa ggcgtgaact gcaccgaggt gcccgtggcc 1860
atccacgccg atcagctgac ccccacctgg agagtgtaca gcaccggcag caacgtgttt 1920
cagacaagag ccggctgcct gatcggcgcc gagcacgtga acaacagcta cgagtgcgac 1980
atccccatcg gcgccggcat ctgcgctagc tatcagacac agaccaacag ccacagaaga 2040
gctagaagcg tggctagcca aagcatcatc gcctacacca tgagcctggg cgccgagaac 2100
agcgtggcct acagcaacaa cagcatcgcc atccccacca acttcaccat cagcgtgacc 2160
accgaaatcc tgcctgtgag catgaccaag acaagcgtgg actgcaccat gtacatctgc 2220
ggcgacagca ccgagtgcag caacctgctc ctgcagtacg gcagcttctg cattcagctg 2280
aacagagccc tgaccggcat cgccgtggag caagacaaga acacccaaga ggtgttcgcc 2340
caagtgaagc agatctacaa gacccccccc atcaaggact tcggcggctt caacttcagc 2400
caaatcctgc ctgaccctag caagcctagc aagagaagct tcatcgagga cctgctgttc 2460
aacaaggtga ccctggccga cgccggcttc atcaagcagt acggcgactg cctgggcgac 2520
atcgccgcta gagacctgat ctgcgctcag aagttcaacg gcctgaccgt gctgcccccc 2580
ctgctgaccg acgagatgat cgctcagtac acaagcgccc tgctcgctgg caccatcaca 2640
agcgggtgga ccttcggcgc cggggccgcc ctgcagatcc ccttcgccat gcagatggcc 2700
tacagattca acggcatcgg cgtgacacag aacgtgctgt acgagaatca gaagctgatc 2760
gccaatcagt tcaacagcgc catcggcaag atccaagaca gcctgagcag caccgctagc 2820
gccctgggca agctgcaaga cgtggtgaat cagaacgccc aagccctgaa caccctggtg 2880
aagcagctga gcagcaactt cggcgccatc agcagcgtgc tgaacgacat cctggctaga 2940
ctggacaagg tggaggccga ggtgcagatc gatagactga tcaccggcag actgcagagc 3000
ctgcagacct acgtgacaca gcagctgatc agagccgccg agatcagagc tagcgccaac 3060
ctggccgcca ccaagatgag cgagtgcgtg ctggggcaga gcaagagagt ggacttctgc 3120
ggcaagggct accacctgat gagcttccct cagagcgccc cccacggcgt ggtgttcctg 3180
cacgtgacct acgtgcccgc ccaagagaag aacttcacca ccgcccccgc catctgccac 3240
gacggcaagg cccacttccc tagagagggc gtgttcgtga gcaacggcac ccactggttc 3300
gtgacacaga gaaacttcta cgagcctcag atcatcacca cccacaacac cttcgtgagc 3360
ggcaactgcg acgtggtgat cggcatcgtg aacaacaccg tgtacgaccc tctgcagccc 3420
gagctggaca gcttcaagga ggagctggac aagtacttca agaaccacac aagccccgac 3480
gtggacctgg gcgacatcag cgggatcaac gctagcgtgg tgaacattca gaaggaaatc 3540
gacagactga atgaggtggc caagaacctg aacgagagcc tgatcgacct gcaagagctg 3600
ggcaagtacg agcagtacat caagtggccc tggtacatct ggctgggctt catcgccggc 3660
ctgatcgcca tcgtgatggt gaccatcatg ctgtgctgca tgacaagctg ctgctcctgt 3720
ctgaaggggt gctgcagctg cggcagctgc tgcaaggact acaaggacga tgacgacaag 3780
ggcccc 3786
Claims (16)
1.一种与SARS-CoV-2S2结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区，
所述重链可变区包含以下的CDR：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的CDR2，以及氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDR3。
2.根据权利要求1所述的与SARS-CoV-2S2结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区还包括4个框架区FR1-4，所述FR1-4与所述CDR1、CDR2和CDR3按顺序交错排列；
优选地，所述FR1-4分别如SEQ ID NO:4、5、6、7所示。
3.根据权利要求1所述的与SARS-CoV-2S2结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
4.一种多核苷酸，其编码权利要求1至3任一项所述的与SARS-CoV-2S2结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段。
5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为DNA或mRNA；
优选地，所述多核苷酸具有如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。
6.一种核酸构建体，其包含权利要求4或5所述的多核苷酸。
7.根据权利要求6所述的核酸构建体，其特征在于，还包含与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。
8.一种表达载体，其包含权利要求6或7所述的核酸构建体。
9.一种转化的细胞，其包括权利要求4或5所述的多核苷酸、权利要求6或7所述的核酸构建体或权利要求8所述的表达载体。
10.一种药物组合物，其包含权利要求1至3任一项所述的与SARS-CoV-2S2结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段、权利要求4或5所述的多核苷酸、权利要求6或7所述的核酸构建体、权利要求8所述的表达载体或权利要求9所述的转化的细胞，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式；
优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；
优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片和膏剂；
优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射或可推注制剂。
12.一种权利要求1至3任一项所述的与SARS-CoV-2S2结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段、权利要求4或5所述的核苷酸序列、权利要求6或7所述的核酸构建体、权利要求8所述的表达载体、权利要求9所述的转化的细胞或权利要求10或11所述的药物组合物在制备预防、治疗或检测新冠病毒感染的药物中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述新冠病毒为SARS-CoV-2原始毒株和/或SARS-CoV-2变异毒株；
优选地，所述SARS-CoV-2变异毒株为SARS-CoV-2的Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)、Kappa(B.1.617.1)和/或Delta(B.1.617.2)变异毒株。
14.一种预防或治疗新冠病毒的方法，其包括：向有需要的受试者施用预防或治疗有效量的权利要求1至3任一项所述的与SARS-CoV-2S2结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段、权利要求4或5所述的核苷酸序列、权利要求6或7所述的核酸构建体、权利要求8所述的表达载体、权利要求9所述的转化的细胞或权利要求10或11所述的药物组合物。
15.一种检测新冠病毒的方法，其包括使用权利要求1至3任一项所述的与SARS-CoV-2S2结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中，所述新冠病毒为SARS-CoV-2原始毒株和/或SARS-CoV-2变异毒株；
优选地，所述SARS-CoV-2变异毒株为SARS-CoV-2的Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)、Kappa(B.1.617.1)和/或Delta(B.1.617.2)变异毒株。
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