CN105555293B - 布鲁氏菌属2,4-二氧四氢蝶啶合酶和AB5毒素β亚基的嵌合体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及嵌合多肽，所述嵌合多肽作为用于在哺乳动物中诱导针对志贺毒素(Stx)的保护性免疫应答以及中和抗体的免疫原有用。具体而言，本发明涉及嵌合多肽以及由所述嵌合多肽形成的寡聚蛋白复合体，所述嵌合多肽包含与布鲁氏菌属2,4‑二氧四氢蝶啶合酶的单体的N末端融合的志贺2毒素的同五聚体B亚基的单体。本发明还涉及编码所述嵌合多肽的多核苷酸和载体、包含所述多核苷酸和载体的转基因细胞、以及包含所述嵌合多肽和嵌合多核苷酸的药物组合物(如疫苗)。结合本发明的嵌合多肽的抗体、用于获得特异性结合志贺2毒素的B亚基的抗体的方法以及降低哺乳动物中肠出血性大肠杆菌的细菌负荷的方法(所述方法可用于预防特别是溶血性尿毒综合征(HUS))也在本发明的范围内。

Description

布鲁氏菌属2,4-二氧四氢蝶啶合酶和AB5毒素β亚基的嵌合体

技术领域

本发明涉及嵌合多肽，所述嵌合多肽作为用于在哺乳动物中诱导针对志贺毒素(Shiga toxin，Stx)的保护性免疫应答以及中和抗体的免疫原有用。具体而言，本发明涉及嵌合多肽以及由所述嵌合多肽形成的寡聚蛋白复合体，所述嵌合多肽包含与布鲁氏菌属(Brucella)2,4-二氧四氢蝶啶合酶(lumazine synthase)的单体的N末端融合的志贺2毒素的同五聚体(homopentameric)B亚基的单体。本发明还涉及编码所述嵌合多肽的多核苷酸和载体、包含所述多核苷酸和载体的转基因细胞、以及包含所述嵌合多肽和嵌合多核苷酸的药物组合物(如疫苗)。结合本发明的嵌合多肽的抗体、用于获得特异性结合志贺2毒素的B亚基的抗体的方法以及降低哺乳动物中肠出血性大肠杆菌(Escherichia coli)的细菌负荷(bacterial load)的方法(所述方法可用于预防特别是溶血性尿毒综合征(HUS))也在本发明的范围内。

背景技术

肠出血性大肠杆菌(EHEC)菌株是人类重要的食源性致病菌(Kaper等，2004.NatRev Microbiol 2:123-140)。EHEC感染的临床表现从水样腹泻或出血性结肠炎(HC)至最严重的结果，即危及生命的溶血性尿毒综合征(HUS)(Karmali 1989.Clin Microbiol Rev 2:15-38)。感染与受污染的肉或蔬菜的摄取相关，但也通过水或者甚至人对人的接触传播(Caprioli等，2005.Vet Res 36:289-311；Griffin和Tauxe，1991.Epidemiol Rev 13:60-98)。在一些发达国家中报道了零星或大规模爆发。在其它国家(如阿根廷)，HUS显示出地方性特性，并表现为具有高发病率和死亡率值的严重公共卫生问题(Lopez等，2000.InfectDis Clin North Am 14:41-65,viii；Rivas等，2006.Medicina(B Aires)66Suppl 3:27-32)。

EHEC感染的显著特点是强有力的志贺毒素的产生，对HUS发展负有责任(Noel和Boedeker，1997.Dig Dis 15:67-91；O’brien等，Curr Top Microbiol Immunol 180:65-94)。志贺毒素家族是一组在结构上和功能上相关的AB₅外毒素(exotoxins)，包括由痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)血清型1生产的志贺毒素(Stx)和由肠出血性大肠杆菌(EHEC)菌株生产的志贺毒素。EHEC可生产两类Stx，志贺毒素1型(Stx1)和志贺毒素2型(Stx2)以及它们的等位基因变体(allelic variants)。志贺毒素的基因由溶原性λ形细菌噬菌体编码(Schmidt，2001.Res Microbiol 152(8):687-95)，并且给定细菌可表达多于一种Stx，因为它们可能包含多于一种编码Stx的细菌噬菌体。

所有志贺毒素家族成员均具有AB₅分子构型(Stein等，1992.Nature 355(6362):748-50；Fraser等，1994.Nat Struct Biol 1(1):59-64)，其中，酶促活性单体A亚基StxA(具有32kDa的分子量)与负责结合细胞表面受体的B亚基StxB非共价缔合。StxB是一个同五聚体蛋白(相同单体的五聚体，各单体具有7.7kDa的分子量)。StxB形成具有中央孔的环状结构，StxA的羧基末端插入到其中(Fraser等，1994.Nat Struct Biol 1(1):59-64)。StxA亚基和StxB亚基均被分泌到细菌周质中，在细菌周质中它们非共价组装成全毒素，如最初描述的来自大肠杆菌的不耐热肠毒素(Hirst等，1984.Proc Natl Acad Sci U S A 81(24):7752-6)。

StxA具有高度特异性的RNA N-糖苷酶活性，切割位于真核生物核糖体的28S核糖体RNA(rRNA)VI结构域上的α-sarcin环上的4,324位的腺嘌呤碱基，从而抑制延伸因子依赖性的氨酰tRNA结合和随后的链延长(Endo等，1988.Eur J Biochem 171(1-2):45-50)。细菌核糖体也是StxA的底物，并且，暴露于志贺毒素1型(Stx1)导致敏感细菌的增殖减少(Suh等，1998.Biochemistry 37(26):9394-8)。

StxA亚基由通过二硫桥连接的两个片段组成，所述StxA亚基在胞质和内质网中由酶进行蛋白水解切割，从而生成27kDa的A1亚基(负责酶活性)并释放出较小的A2片段(Garred等，1995.J Biol Chem 270(18):10817-21)。Austin和合作者显示出，虽然StxA和StxB可在体外自发形成全毒素，重组A1片段不能结合StxB，这表明片段A2对全毒素的组装至关重要(Austin等，1994.Infect Immun 62(5):1768-75)。

StxA负责毒性作用，而StxB五聚体负责结合真核细胞中的特异性受体。StxB结合中性糖鞘脂神经酰胺三己糖苷(globotriaosylceramide，Gb3；也称为Cd77或Pk血型抗原)(Gb3存在于细胞表面上(Jacewicz等，1986.J Exp Med 163(6):1391-404；Lindberg等，1987.J BiolChem 262(4):1779-85；Waddell等，1990.Proc Natl Acad Sci U S A 87(20):7898-901))，导致毒素随后的内化(internalization)。在没有StxA的情况下，StxB仍采用五聚体结构，在结合受体的能力方面该五聚体在功能上等同于全毒素(Donohue-Rolfe等，1989.Mol Microbiol 3(9):1231-6)。每个B亚基单体包含两个三链反向平行β折叠和一个α螺旋。所述五聚体形成具有直径为约

的中央孔的环状结构，该环状结构由五个α螺旋界定并被来自成对的相邻单体的β折叠包围，形成六链反向平行β折叠(Stein等，1992.Nature 355(6362):748-50)。

与受体Gb3三糖类似物复合的志贺毒素1的B亚基(Stx1B)的晶体结构解析揭示了B亚基的各单体内的三个潜在结合位点(称为位点1、位点2和位点3)(Ling等，1998.Biochemistry 37(7):1777-88)。因此，在StxB五聚体中有15个Gb3结合位点。所有15个Gb3结合位点面向相同方向，远离A亚基，从而鉴定出五聚体中的膜相互作用表面。无论是直接地还是经由构象变化，Gb3结合位点彼此均不相互作用。

位点1位于相邻的B亚基之间的槽中，其特征在于Phe-30的苯环与受体的Galβ之间的疏水相互作用以及涉及Asp-17、Thr-21、Glu-28和Gly-60的氢键。位点2位于Phe-30的苯环相对侧的缝隙(crevice)中，所述缝隙由Gly-63、Asn-32、Arg-33和Ala-56所限定。第三结合位点涉及Galβ针对Trp-34(位于Stx1B的中央孔周围的α螺旋中)的吲哚环的疏水堆积相互作用以及Galα和相邻单体的Trp-34之间的疏水相互作用。此外，Galα氢键合来自相邻单体的Trp34和Asn35以及Asp18。从这些结果可以推断出，至少位点1和位点3需要五聚体的正确组装以具有功能。关于Stx1B的突变研究表明，位点1和位点2介导高亲和力相互作用；Stx1细胞毒活性主要由Gb3结合位点1和位点2介导。然而，位点3介导低亲和力相互作用(Bast等，1999.Mol Microbiol 32(5):953-60)。虽然位点3的亲和力可能太低，以至于无法显著促进细胞结合强度，Ling和合作者提出，它可能用于其它目的。这一观点的一个原因在于如下事实：34位的色氨酸残基是保守的，尽管其完全暴露于溶剂。这些作者提出，位点3可能发挥帮助在毒素下的膜中螯合(sequester)更大数量的Gb3分子的作用(Ling等，2000.Structure 8(3):253-64)。因此，所有三个寡糖结合位点对于完整生物活性而言均是必需的。

由于难以表达大量生物活性形式，Stx2B的研究受到了阻碍(Acheson等，1995.Infect Immun 63(1):301-8)。但是，Stx2的晶体结构分析预测出在其B亚基上存在相应的三糖结合位点，但也证明了位点2的构象与来自志贺氏菌的志贺毒素及Stx1B亚基的构象显著不同(Fraser等，2004.J Biol Chem 279(26):27511-7)。然而，涉及糖结合的残基在志贺毒素家族中要么是保守的，要么是保守置换的(Ling等，2000.Structure 8(3):253-64)。一个例外是Stx2B位点2中的Glu16置换了Stx1B中的天门冬氨酸(在Stx1B中，所见到的关于Glu16的水介导的氢键被替换为关于Asp16的直接相互作用)。这种置换可能对志贺毒素2及其变体的降低的Gb3亲和力负有部分责任。

定点诱变显示，保守残基Gly60对于Stx1和Stx2的细胞毒性而言是必不可少的。该残基的置换将改变β5-β6环的构象，β5-β6环不仅涉及位点1、还涉及位点2(Perera等，1991.J Bacteriol 173(3):1151-60)。定点诱变还显示，Arg33在Stx1和Stx2的细胞毒性中发挥重要作用。该结果可以由以下内容解释：Arg33的侧链广泛参与位点2中与Gb3三糖的末端半乳糖的氢键键合(Ling等，2000.Structure 8(3):253-64)。

志贺毒素家族的原型为由痢疾志贺氏菌产生的Stx，该Stx与由大肠杆菌产生的Stx1几乎相同，区别在于催化亚基中的单个氨基酸(O’Loughlin和Robins-Browne，2001.Microbes Infect 3(6):493-507)。Stx1和Stx2均有不同的变体，Stx2为最多样的。Stx1家族由Stx1和Stx1c组成，而Stx2包括变体Stx2c、Stx2c2、Stx2d、Stx2d_可活化的、Stx2e和Stx2f。Stx1和Stx2在氨基酸序列水平上仅具有56％的一致性(Jackson等，1987.MicrobPathog 2(2):147-53)。Stx2变体与Stx284-99％同源。

虽然Stx1和Stx2之间在它们的基本结构、受体识别和作用的生化机制上存在显著相似性，感染了产Stx1、Stx2或这两者的EHEC菌株的患者的临床影响具有相当大的差异。原则上，将预测Stx1和Stx2都会使患者陷入发展为HUS的风险。然而，大量流行病学研究显示，相比产Stx1菌株或产两种毒素的菌株，产Stx2菌株与HUS发展联系更频繁(Scotland等，1987.Epidemiol Infect 99(3):613-24；Ostroff等，1989.J Infect Dis 160(6):994-8；Donohue-Rolfe等，2000.J Infect Dis 181(5):1825-9)。

关于Stx1和Stx2之间的差异，其中最显著的差异在于对于Gb3受体的亲和力和诱导毒性的能力方面的差异。虽然Stx1和Stx2具有相同的功能性受体，对于Gb3，Stx1具有相比Stx2而言10倍更高的亲和力(Head等，1991.Biol Chem 266(6):3617-21)。使用BIAcore系统进行的研究显示，尽管Stx1与Gb3缔合的速率高于Stx2，Stx2从受体的解离慢于Stx1，这说明虽然Stx2与受体结合较慢，但它也以较慢的速率解离(Nakajima等，2001.J BiolChem 276(46):42915-22)。

尽管Stx1对于Gb3的亲和力较高，与流行病学研究一致的是，Stx2具有低于Stx1400倍的50％小鼠致死剂量(LD₅₀)(Tesh等，1993.Infect Immun 61(8):3392-402)。当将人肾微血管内皮细胞用Stx1或Stx2处理时也获得了类似结果，发现Stx2具有约1000倍高的毒性(Louise和Obrig，1995.J Infect Dis 172(5):1397-401)。不同的研究已弄清楚了，B亚基是体内Stx1和Stx2的差异毒性的关键确定因素。在无细胞体外翻译抑制分析中，Stx1和Stx2A亚基的毒性是无法区分的，这表明这些亚基的酶活性不负责这两种毒素之间的巨大体内差异。相反，对野生型Stx毒性和嵌合Stx毒性进行比较的动物模型证明了，Stx2B亚基的存在是体外和体内致死性的关键决定因素(Weinstein等，1989.Infect Immun 57(12):3743-50；Head等，1991.Biol Chem 266(6):3617-21；Lingwood，1996.TrendsMicrobiol 4(4):147-53；Marcato等，2003.Infect Immun 71(10):6075-8)。

使用质谱技术，Kitova等报道了在5-85μM的亚基浓度范围，Stx1B主要是五聚体，不依赖离子强度(Kitova等，2005.J Am Soc Mass Spectrom 16(12):1957-68；Kitova等，2009.Biochemistry 48(23):5365-74)。这些数据得到显示出高度热稳定五聚体的Stx1B的圆二色性(CD)和动态扫描量热(DSC)研究的支持(Pina等，2003.Biochemistry 42(31):9498-506)。相反，Stx2B亚基的组装程度强烈依赖于温度、亚基浓度和离子强度。在亚基浓度大于50μM时，虽然也明显存在较小的多聚体(二聚体、三聚体和四聚体)，Stx2B亚基主要作为五聚体存在。在较低浓度时，Stx2B亚基主要作为单体和二聚体存在。Conrady和合作者在直接溶液状态技术中确认并定量了Kitova等(2005)所观察到的差异。这些作者报道，Stx2B五聚体在pH 7.4的溶液中的稳定性比Stx1B五聚体低约50倍(Conrady等，2010.PLoSOne 5(12):e15153)。

在免疫水平上观测到Stx1和Stx2之间的另一重要差异。尽管这两种类型的Stx的初步鉴定是由于针对一个变体的抗体并不与另一变体交叉反应，这两种毒素之间的交叉反应性(以及交叉中和)的研究是多年的争论主题。体外研究表明，这两种毒素在血清学上不同，并且针对一种毒素的抗体并不能中和另一种毒素(Scotland等，1985.Lancet 2(8460):885-6；Karmali等，1986.Lancet 1(8473):164-5；Strockbine等，1986.Infect Immun 53(1):135-40)。类似地，Wen等显示，用遗传灭活的Stx1或Stx2类毒素进行的小鼠免疫能够产生针对同源毒素但不针对异源毒素的抗毒素血清IgG，并且，这些抗体提供了对抗仅用同源毒素进行的激发(challenge)的特异性保护性免疫(Wen等，2006.Vaccine 24(8):1142-8)。然而，在用Stx1或Stx2的类毒素制剂免疫的动物的其它研究中，由于产生了针对A亚基的抗体，动物显示出对抗用任一种毒素进行的激发的交叉保护。Bielaszweska等发现，用化学灭活的Stx1或Stx2类毒素、或各毒素的A亚基进行的兔免疫防止了在由毒素介导的全身病变(systemic pathology)的发展期间靶组织中的异源毒素定位(localization)。在这项研究中，Stx1或Stx2的B亚基并未提供异源保护(Bielaszewska等，1997.Infect Immun 65(7):2509-16)。Ludwig等报道了体内交叉保护的进一步证据，其中，通过用化学灭活的Stx2类毒素进行免疫，获得了对抗Stx1激发的兔保护(Ludwig等，2002.Can J Microbiol 48(1):99-103)。

Stx的B亚基之间的交叉反应性也有争议。一些研究表明，针对Stx1或Stx2的B亚基的抗体不提供交叉保护(Wadolkowski等，1990.Infect Immun 58(12):3959-65；Bielaszewska等，1997.Infect Immun 65(7):2509-16)。由于这个原因，一些作者提出了使用Stx2B和Stx1B之间的融合蛋白来提供对抗这两种毒素的保护(Gao等，2009.Vaccine 27(14):2070-6；Zhang等，2011.Vaccine 29(22):3923-9)。然而，Tsuji等报道了，用构建体Stx2B-HIS(具有组氨酸标签的Stx2B)进行的小鼠鼻内免疫能够赋予对抗Stx1的交叉保护，但反过来却行不通(Tsuji等，2008.Vaccine 26(17):2092-9)。

Stx2变体可通过生物活性、免疫反应性或受体特异性方面的差异来区分。Stx2及其变体优先结合Gb3糖鞘脂；Stx2e例外，Stx2e优先结合globotetraosylceramide(Gb4)(Lingwood，1996.Trends Microbiol 4(4):147-53)。Stx2和Stx2c是毒力最强的Stx2变体，并与大多数HUS病例有关(Boerlin等，1999.J Clin Microbiol 37(3):497-503)；而Stx2e为唯一一个不与人的HUS和出血性结肠炎相关的变体，其反而负责猪的水肿病(MacLeod等，1991.Vet Pathol 28(1):66-73)。此外，Stx2d_可活化的与所有其它类型的Stx的不同之处在于它可被弹性蛋白酶(肠粘液的一种组分，切割A亚基的最后两个残基从而释放出片段A2)活化(Scheiring等，2008.Pediatr Nephrol 23(10):1749-60)。

尽管由EHEC感染引起严重的社会和经济问题，目前没有许可的疫苗或有效疗法可供人使用。最大的挑战之一是开发有效且安全的免疫原，以确保无毒性并且对宿主免疫系统具有强输入，以诱导持久的、高亲和性的抗体，从而确保血清中的良好中和能力。Stx2的B亚基(Stx2B)是最有吸引力的候选物，因为在Stx家族中Stx2是最具致病性的毒素，并且基于Stx2B的免疫原将防御与HUS发展最相关的Stx(Smith等，2006.Vaccine 24:4122-4129；Wen等，2006.Vaccine 24(8):1142-8；Tsuji等，2008.Vaccine 26(17):2092-9)。此外，B亚基代表毒素的结合单元，并且对于哺乳动物细胞是无毒的(Donohue-Rolfe等，1991.RevInfect Dis 13Suppl 4:S293-297；Lingwood，1996.Trends Microbiol 4(4):147-53)。能够阻断与哺乳动物细胞中的特异性受体(Gb3)的结合过程的抗体应该能阻止毒性级联(cascade)的第一步骤(Ling等，1998.Biochemistry 37(7):1777-88)。此外，针对HUS的基于Stx的疫苗将不仅防御已知EHEC菌株(通常为O157和非O157血清型)，也将在对抗产志贺毒素的大肠杆菌的新致病菌株或罕见致病菌株中有用，正如同由O104:H4菌株引起的HUS的最近的大爆发的情况(Beutin等，2012.J Virol 86:10444-10455；Scheutz等，2011.EuroSurveill 16)。

尽管存在多种途径，尚未获得成功的基于Stx2B的免疫原，主要是因为Stx2B是非常差的免疫原(Marcato等，2001.J Infect Dis 183:435-443；Imai等，2004.Infect Immun72(2):889-895)。三个结合位点中的两个是由来源于相邻单体的残基形成，因此要求五聚体的正确组装，以使结合位点有活性(Ling等，1998.Biochemistry 37(7):1777-88)。如上述所讨论的，Stx2B五聚体在不存在A亚基的情况下仅勉强稳定，并且，当用作免疫原时，它无法生成针对构象表位(conformational epitopes)的特异性抗体，所述构象表位大部分位于五聚体的单体之间的交界面处。

发明内容

本发明人令人惊奇地发现，可通过制造嵌合肽来生产能够引发对免疫和/或生产抗Stx抗体而言足够的免疫应答的非致病性稳定Stx抗原，所述嵌合肽包含与布鲁氏菌属2,4-二氧四氢蝶啶合酶(BLS)的单体融合的志贺毒素2型的B亚基(Stx2B)的单体。出乎意料的是，当这样的嵌合肽形成五个相同单体的寡聚复合体时，Stx2B亚基中的构象表位得到稳定，使得该高度稳定的BLS-Stx2B融合蛋白成为在对抗HUS的斗争中有价值的免疫原。

因此，根据第一方面，本发明包括嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含与志贺毒素2型的B亚基的单体具有至少95％的氨基酸序列一致性的肽，所述肽与布鲁氏菌属2,4-二氧四氢蝶啶合酶的单体直接融合或通过肽接头融合。

志贺毒素2型的B亚基可与布鲁氏菌属2,4-二氧四氢蝶啶合酶的单体的N末端直接融合或通过肽接头融合。“布鲁氏菌属2,4-二氧四氢蝶啶合酶的单体的N末端”是指10个氨基最末端氨基酸中的任何氨基酸，例如从氨基末端起第一个、第二个、第三个、第四个、第五个、第六个、第七个、第八个、第九个或第十个氨基酸。

布鲁氏菌属2,4-二氧四氢蝶啶合酶的单体可与SEQ ID No.:9具有至少95％的序列一致性，例如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的序列一致性。

布鲁氏菌属2,4-二氧四氢蝶啶合酶的单体可在前8个N末端氨基酸位置内具有一个或多个替换、删除和/或插入，使得删除和插入的组合并未导致相对于SEQ ID No.:9而言延长超过5个氨基酸。例如，布鲁氏菌属2,4-二氧四氢蝶啶合酶的单体在前8个N末端氨基酸位置内可具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个替代、删除和/或插入，使得删除和插入的组合并未导致相对于SEQ ID No.:9而言延长超过5个氨基酸。

在本发明的优选实施方式中，志贺毒素的B亚基的单体(SEQ ID NO:1)通过肽接头(所述肽接头例如为G/S柔性肽，所述G/S柔性肽可为2-20个氨基酸长或5-15个氨基酸长的G/S柔性肽)连接至布鲁氏菌属2,4-二氧四氢蝶啶合酶的单体的N末端，例如包含氨基酸SEQID No:3、SEQ ID No:5或SEQ ID No:7，优选SEQ ID No:5的嵌合肽。

根据另一方面，本发明包括蛋白寡聚复合体，所述蛋白寡聚复合体的特征在于其包含本发明嵌合蛋白的五聚体的二聚物。

根据再一方面，本发明包括编码本发明的嵌合蛋白的多核苷酸，例如含有SEQ IDNo:4、SEQ ID No:6或SEQ ID No:8，优选SEQ ID No:6的DNA分子。

根据又一方面，本发明包括含有编码本发明的嵌合蛋白的多核苷酸的载体，例如含有SEQ ID No:4、SEQ ID No:6或SEQ ID No:8，优选SEQ ID No:6的载体。

本发明还包括含有本发明的多核苷酸或载体的转基因细胞。在具体实施方式中，转基因细胞为大肠杆菌细胞，优选大肠杆菌BL21(DE3)细胞。在另一实施方式中，转基因细胞为哺乳动物细胞，优选293T细胞。在又一实施方式中，转基因细胞为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。

本发明的另一方面包括药物组合物，所述药物组合物包含本发明的蛋白寡聚复合体和/或载体以及药学上合适的赋形剂(vehicle)。本发明的药物组合物优选为疫苗。在优选的实施方式中，本发明疫苗中的寡聚复合体包含选自于由如下氨基酸序列所组成的组中的氨基酸序列：SEQ ID No:3、SEQ ID No:5和SEQ ID No:7，优选SEQ ID No:5。

本发明的另一方面包括生产本发明的嵌合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：a)在合适的条件下培养本发明的转基因细胞，以表达所述嵌合蛋白，所述转基因细胞含有本发明的多核苷酸或载体；以及b)回收所述嵌合蛋白。

在又一方面，本发明包括用于获得特异性结合志贺毒素2的B亚基的抗体的方法，所述方法的特征在于其包括以下步骤：

a)在适于引发针对本发明的蛋白寡聚复合体的中和抗体的免疫方案(immunization scheme)下，向哺乳动物给予所述蛋白寡聚复合体；

b)从所述哺乳动物获得包含所述中和抗体和/或能够生产所述中和抗体的细胞的生物样品；以及

c)将所述生物样品用作所述抗体的来源。

在本发明的用于获得抗体的方法的优选实施方式中，步骤b)中获得的生物样品包含B细胞，将所述B细胞用于步骤c)中以生产杂交瘤。在优选的实施方式中，向其给予蛋白寡聚复合体的哺乳动物为小鼠。在另一优选的实施方式中，向其给予蛋白寡聚复合体的哺乳动物为骆驼科动物(camelid)。通过本发明这一方面的方法所获得的抗体也被考虑在本发明的范围之内。

在另一方面，本发明包括通过向期望降低细菌负荷的动物给予本发明的寡聚复合体来降低动物(例如牛)中的肠出血性大肠杆菌的细菌负荷的方法。

在另一方面，本发明包括通过向期望降低细菌负荷的动物给予本发明的抗体来降低动物(例如牛)中的肠出血性大肠杆菌的细菌负荷的方法。

根据又一方面，本发明包括在哺乳动物受试者中诱导针对溶血性尿毒综合征(HUS)的抵抗力(resistance)的方法，所述方法包括向所述哺乳动物受试者给予本发明的疫苗，例如包含本发明的寡聚复合体的疫苗，所述寡聚复合体包含选自于由如下氨基酸序列所组成的组中的氨基酸序列：SEQ ID No:3、SEQ ID No:5、SEQ ID No:7，优选SEQ ID No:5。

根据又一方面，本发明包括供在哺乳动物受试者中诱导针对溶血性尿毒综合征(HUS)的抵抗力的方法使用的本发明的疫苗。

根据又一方面，本发明包括本发明的嵌合蛋白在制备用于在哺乳动物受试者中诱导针对溶血性尿毒综合征(HUS)的抵抗力的药物中的用途。

本发明的再一方面涉及结合本发明的嵌合蛋白的抗体。此类抗体优选对本发明的嵌合蛋白而言是特异的。在这一背景下，术语“特异的”是指抗体优先结合本发明的嵌合蛋白，但并不排除以较低的程度与其它蛋白结合。本发明的抗体在制备用于在哺乳动物(例如人)中预防或治疗溶血性尿毒综合征的药物组合物中的用途也是本发明的一部分。

本发明的再一方面涉及药物组合物，所述药物组合物包含本发明的抗体和药学上合适的运载体(carrier)。本发明的抗体和药物组合物例如在用于在有需要的受试者中治疗或预防溶血性尿毒综合征(HUS)的方法中有用，这一方法是本发明的又一方面。此类方法优选用于在人受试者中治疗或预防溶血性尿毒综合征(HUS)。

附图说明

图1：BLS-Stx2B-L5(子图A)、BLS-Stx2B-L10嵌合体(子图B)和BLS-Stx2B-L15(子图C)的理论结构。根据实施例1所述，对这些蛋白的结构进行建模。BLS单体的颜色为黑色，而与BLS的结构融合的Stx2B单体的颜色为浅灰色。Stx2B和BLS之间的接头(GSGSG)的颜色为深灰色。该图是用程序Pymol Molecular Graphics Systems构建的。

图2：重组体Stx2B-BLS的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。将所表达和纯化的Stx2-BLS(L10)通过15％SDS-PAGE进行分离，并用考马斯蓝进行染色(A和B)、或者用特异性抗体来显现(C)。对所有三种嵌合体实施相同的方案。A)泳道1，未诱导的pET-Stx2B-BLS转化的大肠杆菌BL21(DE3)的总蛋白质；泳道2，诱导的pET-Stx2B-BLS转化的大肠杆菌BL21(DE3)的不溶性沉淀；泳道3，诱导的pET-Stx2B-BLS转化的大肠杆菌BL21(DE3)的可溶部分。B)泳道1，纯化的Stx2B；泳道2，纯化的BLS；泳道3，纯化的Stx2B-BLS。C)纯化的Stx2B-BLS的蛋白质印迹分析。将SDS-PAGE用多克隆抗Stx2小鼠IgG(泳道1和泳道2)或多克隆抗BLS小鼠IgG(泳道3和泳道4)进行探测，并用过氧化物酶缀合的兔抗小鼠IgG来显现。泳道1，纯化的Stx2B；泳道2，纯化的Stx2B-BLS；泳道3，纯化的BLS；泳道4，纯化的Stx2B-BLS。D)纯化的蛋白的SDS-PAGE。泳道1，纯化的Stx2B；泳道2，纯化的BLS；泳道3，纯化的Stx2B-BLS L5；泳道4，纯化的Stx2B-BLS L10；泳道5，纯化的Stx2B-BLS L15。

图3：具有质粒pCineo-BLS-Stx2B-L5、pCineo-BLS-Stx2B-L10和pCineo-BLS-Stx2B-L15的经转染的293T细胞的蛋白质印迹分析。泳道1，纯化的BLS；泳道2，具有空pCIneo质粒的转染细胞；泳道3，转染分析的阴性对照；泳道4，具有BLS-Stx2B-L5的转染细胞；泳道5，具有BLS-Stx2B-L10的转染细胞；泳道6，具有BLS-Stx2B-L15的转染细胞。

图4：BLSwt(黑色虚线)、Stx2B(黑色实线)和BLS-Stx2B(灰色实线)的三个远UV-CD光谱的比较。各个BLS-Stx2B嵌合体的理论光谱(由Stx2B光谱和BLS光谱的结合计算得到)由灰色虚线表示。

图5：三个BLS-Stx2B嵌合体的尺寸排阻色谱(分析S200柱)偶联SLS分析。以0.5mL/min的流速实施所有分离。通过折射率(实线)和UV280nm(点线)信号对洗脱进行监测。根据其90°和RI信号计算各样品的分子量，并将该值与以BSA作为标准品得到的值进行比较。第一个峰对应于高MW聚集体(aggregates)，主要的峰对应于嵌合体BLS-Stx2B。

图6：BLS的热变性继以随温度变化的蛋白的222nm CD信号。野生型(黑色虚线)、Stx2B(黑色实线)、BLS-Stx2B L5(深灰色实线)、BLS-Stx2B L10(灰色实线)和BLS-Stx2BL15(浅灰色实线)。

图7：通过Gb3结合ELISA检测进行的BLS-Stx2B组装评估。将连续稀释的BLS-Stx2B-L5、BLS-Stx2B-L10、BLS-Stx2B-L15、BLS、rStx2或大肠杆菌BL21裂解物(用作非特异性结合的阴性对照)加入到Gb3涂覆的板中。根据实施例13中所详述的，对结合进行测定。

图8：针对Stx2B的特异性IgG滴度的时程。A)通过ELISA测定来自用BLS-Stx2B-L10或Stx2B(两者均配制于FA中)免疫的小鼠的血清中的Stx2B特异性IgG滴度。每个时间点代表4-6只小鼠/组的平均值±SEM。**P<0.005相对于Stx2B组的相同时间点。B)来自用不同配方或方案(regimens)的Stx2-BLS-L10免疫的小鼠的血清中的Stx2B特异性IgG滴度。每个时间点代表4-6只小鼠/组的平均值±SEM。*P<0.05相对于BLS-Stx2B-L10+无佐剂(N/A)组的相同时间点；**P<0.005相对于所有其它组的相同时间点。黑色箭头表示蛋白免疫；灰色箭头表示DNA免疫。

图9：Stx2B特异性IgG的亚型。根据材料和方法中所详述的，通过ELISA对来自用不同配方的BLS-Stx2B-L10免疫的小鼠的血清进行分析。各个棒代表每组4-6只的平均值±SEM；***P<0.001相对于各组中的IgG2a。

图10：死亡率曲线。A)用来自免疫小鼠的血清进行的rStx2毒性的离体(ex vivo)中和(1LD₁₀₀)。如附图图例中所标明的，根据体外中和滴度对来自各免疫组(4-6只小鼠/池)(最后一次免疫后45天)或未免疫小鼠的血清池(pool of sera)进行稀释。B)保护免疫小鼠抵抗纯化的rStx2的致死激发。在最后一次免疫后45天，用1LD100rStx2i.v.激发以Stx2B+FA或不同配方的BLS-Stx2B；或BLS+FA(4-6只小鼠/组)免疫的成年雄性BALB/c小鼠。*P<0.05相对于Stx2B+FA免疫的小鼠；p<0.005相对于未免疫的小鼠或BLS+FA免疫的小鼠。**p<0.005相对于所有其它组。

图11：长期特异性IgG抗体应答和保护性免疫应答。A)通过ELISA分析的针对Stx2B的特异性IgG滴度，直到给予最后一次免疫后9个月；B)在A部分中所指出的时间(第二次激发)处，使经第一次rStx激发后存活的小鼠接受用2LD100rStx2进行的第二次激发。**P<0.005相对于BLS-Stx2B-L10+无佐剂(N/A)免疫的小鼠或BLS-Stx2B-L10+AH免疫的小鼠。C)在A部分中所指出的时间(第三次激发)处，使经前两次rStx2激发后存活的小鼠接受用3LD100rStx2进行的第三次激发。**P<0.005相对于未免疫的小鼠。

图12：利用一剂量的BLS-Stx2B-L10得到的特异性IgG滴度的时程。通过ELISA对血清中的Stx2B特异性IgG滴度进行测定，所述血清来自用一剂量的BLS-Stx2B-L10(配制于AH中)免疫的小鼠。每个时间点代表6只小鼠的平均值±SEM。灰色箭头表示用rStx2进行激发。

图13：死亡率曲线。保护免疫小鼠抵抗纯化的rStx2的致死激发。用如下对未免疫的成年BALB/c小鼠或BLS-Stx2B-L10免疫(一剂量)的成年BALB/c小鼠(4-6只小鼠/组)进行i.v.激发：(A)免疫后30天，1LD100rStx2；(B)免疫后60天，3LD100rStx2；以及(C)免疫后120天，5LD100rStx2。不同的激发在图12中以灰色箭头示出。**P<0.005相对于未免疫的小鼠。

具体实施方式

本发明提出了克服缺乏成功的基于Stx2B的免疫原的新策略：在BLS蛋白颗粒上展示Stx2B五聚体。BLS(布鲁氏菌属2,4-二氧四氢蝶啶合酶)被描述为非常有效的用于抗原递送的运载体(Laplagne等，2004.Proteins 57:820-828；Cassataro等，2007.Vaccine 25:4437-4446；Bellido等，2009.Vaccine 27:136-145)。BLS是五聚体的具高免疫原性且稳定的二聚物，并且是已用于在其结构上展示外来抗原的支架(Velikovsky等，2003.InfectImmun 71:5750-5755；Zylberman等，2004.J BiolChem 279:8093-8101；Bellido等，2009.Vaccine 27:136-145；Cassataro等，2007.Vaccine 25:4437-4446；Laplagne等，2004.Proteins 57:820-828)。然而，关于使用蛋白聚合支架来展示另一聚合蛋白，可想到很多困难：a)插入的抗原的聚合可发生在不同蛋白颗粒之间，从而产生交叉和巨大的聚集体；b)BLS和B亚基的五聚体的折叠和缔合的动力学可能非常不同，由此融合颗粒的折叠可能会被困在中间状态；c)为了共价连接到BLS五聚体而施加的结构约束(structuralconstrains)可能不足以稳定B亚基的五聚体结构；d)寡聚支架的拓扑学可能与寡聚靶标的拓扑学不兼容；e)不同蛋白的中间构型之间的相互作用可能妨碍融合颗粒的正确折叠和组装；f)融合靶标的低稳定性或低溶解性可能对整个颗粒的稳定性产生不利影响，从而诱导复合体聚集。

寡聚支架上整个蛋白的展示可以受到以下情况的约束：外来蛋白不适合的结构以及它倾向于经历同聚(homomeric)相互作用。候选插入物(insert)倾向于经历同聚相互作用非常关键。由于经由靶亚基的同聚相互作用的聚集和颗粒间交联，在寡聚支架的环境中非单体蛋白的展示可能是有问题的。由于靶寡聚物和BLS之间不均衡的化学计量而使得原聚体(protomers)保持游离时，这种现象可能会更糟。

存在这样的实例：使用已知在展示单体蛋白时正确发挥作用的蛋白聚合支架未能正确地展示另一聚合蛋白。例如，已成功地将由HBcAg形成的乙型肝炎病毒样颗粒(VLP)用于单体eGFP的展示(Kratz等，1999.Proc Natl Acad Sci U S A 96(5):1915-1920)。然而，GFP的二聚化和四聚化颜色变体未能形成VLP(Vogel等，2005.Proteins 58(2):478-488)。在这种情况下，通过替代地使用工程化单体变体时成功地形成VLP，证明了插入物四级结构的关键作用。另一实例是以下尝试：通过重组融合至同五聚体蛋白(如霍乱毒素B亚基、来自细菌的二十面体(icosahedral)2,4-二氧四氢蝶啶合酶(由12个组装好的五聚体形成)和来自酵母的2,4-二氧四氢蝶啶合酶)来可溶性表达并改善烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)的同五聚体细胞外N末端结构域(ECD)的折叠和组装，所有尝试都失败了(Fischer等，2001.ProcNatl Acad Sci U S A 98(6):3567-3570)。这种途径的失败可能是由于融合蛋白的折叠行为/缔合行为。

出乎预料地，Stx2B亚基与BLS支架的连接促进了该毒素的正确五聚化(pentamerization)，并大大地稳定了它的结构，特别是它的热力学稳定性(如由解链温度(melting temperature，Tm)从60℃到几乎90℃的大幅增加所证明的)，从而克服了前文所述的当未与A亚基缔合时Stx2毒素的B亚基缺乏稳定性的情况。此外，所得到的嵌合体(BLS-Stx2B)在诱导持久的体液免疫应答方面显示出了非凡的能力，并能够诱导出对Stx2及其变体具有高中和能力的抗体，达到了以下程度：直到给予最后一次免疫后10个月，用BLS-Stx2B免疫的小鼠完全抵御了高致死剂量的Stx激发(i.p.)。诱导出高度特异性抗体的能力表明了，BLS-Stx2B嵌合体既保留了构成Gb3结合位点的Stx2B的构象表位的天然构型，还允许将它们有效展示给溶剂。

考虑到BLS支架缺乏与StxA的羧基末端相当的中央突起部分(centralprojection)(在全毒素中，所述StxA的羧基末端填充了StxB环状结构的中央孔)，嵌合体中天然构型的维持特别令人惊奇。因此，在BLS-Stx2B中，Stx2B的中央孔未被占据。本领域技术人员将预期这会在Stx2B五聚体的几何结构和/或对称性方面引起至少一些改变，并转而对它的结合位点产生负面影响，特别是位点1和位点3(所述位点需要五聚体正确组装以具有功能)。然而，BLS支架似乎能够在不破坏其Gb3结合位点的情况下使Stx2B五聚体稳定。

如在“技术领域”部分下所讨论的，Stx2(SEQ ID No:1)为最具致病性的志贺毒素，基于Stx2B的免疫原可抵御在HUS发展的大多数病例中发现的Stx变体(Smith等，2006.Vaccine 24:4122-4129；Wen等，2006.Vaccine 24(8):1142-8；Shimizu等，2008.MicrobPathog 35(1):1-9)。更重要的是，由该嵌合体诱导出的抗体显示出对野生型Stx2及其变体类似的中和能力，甚至呈现出交叉中和能力(例如，由BLS-Stx2B嵌合体诱导出的抗体能够中和Stx1)。以前已证明，在这一毒素家族中，所有Gb3结合位点均位于B五聚体的同一个面上，在A亚基对面。因此，血清中和不同Stx家族成员的能力可能主要是由于识别这些结合位点的抗体，所述结合位点在Stx家族的所有成员中都是保守的。这一事实对于预防或治疗HUS非常重要，因为对Gb3结合位点显示出广泛反应性的抗体应该在防止由Stx家族的大部分毒素引起的伤害方面高度有效，这使得本发明能够承兑其将来在由产志贺毒素大肠杆菌的致病性菌株引起的暴发方面的用途。不附属于任何特定解释，本发明人认为，当例如用BLS-Stx2B对小鼠进行免疫时，所引发的强B细胞应答可由Stx2B五聚体的热力学稳定性以及BLS靶向和活化树突细胞的能力解释(Bergueret等，2006.J Immunol 176:2366-2372)。当与由Stx2B引发的抗体相比时，由BLS-Stx2B引发的抗体的特异性ELISA滴度及中和活性显著改善。

根据第一方面，本发明包括嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含与布鲁氏菌属2,4-二氧四氢蝶啶合酶(BLS)的单体融合的志贺毒素2的B亚基(Stx2B)的单体。

志贺毒素2型的B亚基可与布鲁氏菌属2,4-二氧四氢蝶啶合酶的单体的N末端直接融合或通过肽接头融合。“布鲁氏菌属2,4-二氧四氢蝶啶合酶的单体的N末端”是指10个氨基最末端氨基酸中的任何氨基酸，例如从氨基末端起第一个、第二个、第三个、第四个、第五个、第六个、第七个、第八个、第九个或第十个氨基酸。

2,4-二氧四氢蝶啶合酶催化核黄素生物合成途径中的倒数第二步(参见Goldbaum等，1999.J.Med.Microbiol.,48:833-839)。2,4-二氧四氢蝶啶合酶的活性位点位于单体之间的交界面，赋予了该蛋白非常稳定的聚合秩序(polymeric order)(见Ritsert等，1995.J.Mol.Biol.,253:151-167)。

布鲁氏菌属的2,4-二氧四氢蝶啶合酶(BLS)是高度稳定的蛋白。免疫化学酶功能分析和立体结构(通过X射线晶体学测定)分析在天然蛋白和重组表达的蛋白中显示出类似的结果(参见Braden等，.2000.J.Mol.Biol.,297:1031-1036；Goldbaum等，1999.J.Med.Microbiol.,48:833-839；Goldbaum等，1998.J.Struct.Biol.，123:175-178)。该结构显示出，这种18kDa的蛋白在溶液中表现为180kDa的十聚体(decamer)，成为2,4-二氧四氢蝶啶合酶的四级排列的新类型(参见Zylberman等，2004.J.Biol.Chem.,279(9):8093-8101)。结构分析还显示出，BLS单体的N末端展示在对称五聚体的顶点，相互之间的距离为40埃；而氨基末端的10个氨基酸既不参与一般折叠，也不参与单体间的接触。(参见Braden等，2000.J.Mol.Biol.,297:1031-1036)。这意味着至少BLS的最末尾8个N末端氨基酸残基中的一些或全部可以被移除或突变，而不显著影响BLS作为抗原运载体的有用性。因此，在本发明的嵌合肽中，BLS部分可包含完整的BLS野生序列；或BLS部分可在其N末端的前8个位置中的氨基酸中的一个、数个或所有氨基酸中出现置换、插入或删除。不过，由于导致N末端过度延长的大量插入可能会产生负面影响(例如降低的溶解性和/或引发免疫应答的能力)，在本发明的嵌合蛋白中，BLS单体的N末端处的删除和插入的组合优选不应导致相对于SEQ ID No.:9而言延长超过5个氨基酸。在本发明的优选实施方式中，将布鲁氏菌属的2,4-二氧四氢蝶啶合酶N末端处的前8个氨基酸删除。

众所周知，肽的氨基酸序列中的一些变化也能够保持原始肽的生物性质和活性的全部或部分。还已知的是，使生物活性削弱或丧失的机会随背离原始序列的程度而增加。因此，其中的BLS单体相对于野生BLS序列而言存在一些变化的嵌合肽也是本发明的一部分，特别是其中的BLS单体与SEQ ID No:9具有至少95％(例如96％、97％、98％、99％或更高)的序列一致性(如上所讨论的，不考虑前8个氨基酸位置)的嵌合肽。类似地，其中的志贺毒素II型的B亚基根据序列与野生型志贺毒素II型的B亚基具有至少95％(例如96％、97％、98％、99％或更高)的氨基酸序列一致性的嵌合肽也在本发明的范围之内。

在本发明中，志贺毒素2型的B亚基单体与BLS单体的融合可直接完成(即，通过在B亚基单体的C末端和BLS单体的N末端之间建立肽连结(peptidic union))，或者通过肽接头完成。肽接头优选为G/S肽，并且可为2-20个氨基酸长或5-15个氨基酸长，包括5个、10个或15个氨基酸长，例如包含氨基酸SEQ ID No:3、SEQ ID No:5或SEQ ID No:7，优选SEQ IDNo:5的嵌合肽。

当重组表达时，本发明的嵌合蛋白倾向于采取BLS的典型构型，即，五聚体的二聚物。在这一寡聚复合体中，每个五聚体的五个BLS部分面向另一五聚体的五个BLS单体，并且每个五聚体的五个Stx部分暴露在该十聚体的相对端。因此，每个五聚体上的五个Stx单体均保留了天然Stx的分子构型，其结果是，天然B亚基的三糖结合位点得以保留。连同它增加的稳定性，BLS-Stx十聚体中Stx B亚基的构象表位的保留使得它们作为有效和安全的免疫应答诱导子(elicitors)特别有用。因此，根据本发明的另一方面，本发明包括蛋白寡聚复合体，所述蛋白寡聚复合体包含两个本发明的嵌合蛋白的五聚体，或者所述蛋白寡聚复合体由两个本发明的嵌合蛋白的五聚体构成。此类蛋白寡聚复合体不仅对于作为针对HUS对哺乳动物(例如人)进行免疫的免疫原有用，还对于获得在治疗HUS中有用的抗Stx抗体及其衍生物有用。

编码本发明的嵌合蛋白的人工多核苷酸也是本发明的一部分，所述多核苷酸对于生产本发明的嵌合蛋白有用，并且当给予动物时还能够诱导细胞应答或体液应答。此类多核苷酸例如为但不限定于：RNA、基因组DNA或cDNA。在优选的实施方式中，编码本发明的嵌合蛋白的多核苷酸包含含有SEQ ID No:4、SEQ ID No:6或SEQ ID No:8，更优选SEQ ID No:6的DNA分子。编码本发明的嵌合蛋白的多核苷酸例如在载体构建中有用，所述载体例如但不限定于细菌载体或病毒载体。所述载体能够表达本发明的嵌合蛋白，或有利于表达本发明的嵌合蛋白，并构成了本发明的另一方面。包含编码本发明的嵌合蛋白的多核苷酸的载体可通过本领域技术人员公知的标准技术来生产。作为实例，此类载体可通过将编码本发明的嵌合蛋白的多核苷酸插入pCi-neo(Promega，USA)中来生产。在本发明的优选实施方式中，载体包含编码本发明的嵌合蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸为SEQ ID No:4、SEQ IDNo:6或SEQ ID No:8，更优选SEQ ID No:6的多核苷酸。

在本发明的一个实施方式中，将包含编码本发明的嵌合蛋白的多核苷酸的载体用于生产表达本发明的嵌合蛋白的转基因细胞。此类转基因细胞构成了本发明的另一方面。在本发明的情况下可被转化的细胞包括但不限于：昆虫细胞；细菌，例如大肠杆菌；酵母，例如巴斯德毕赤酵母；以及哺乳动物细胞，例如CHO、COS、BHK、Namalwa和Hela。在本发明的优选实施方式中，转基因细胞为大肠杆菌细胞，优选大肠杆菌BL21(DE3)。转基因细胞也可为哺乳动物细胞，例如293T细胞或巴斯德毕赤酵母细胞。

根据本发明的另一方面，提供了药物组合物，所述药物组合物包含本发明的蛋白寡聚复合体和/或含有编码本发明的嵌合蛋白的多核苷酸的载体。本发明的药物混合物或疫苗的活性剂以有效生理剂量存在。

在优选的实施方式中，本发明的药物组合物为疫苗，其中，所述寡聚复合体包含选自于由如下氨基酸序列所组成的组中的氨基酸序列：SEQ ID No:3、SEQ ID No:5和SEQ IDNo:7，优选SEQ ID No:5。根据本发明的另一实施方式，本发明的疫苗是DNA疫苗，所述DNA疫苗包含含有编码本发明嵌合蛋白的多核苷酸的载体。

本发明的药物组合物优选为对在哺乳动物受试者中诱导针对溶血性尿毒综合征(HUS)的抵抗力有用的疫苗和/或在生产抗Stx抗体中有用的疫苗。优选地，本发明的药物组合物进一步包含药学上可接受的运载体。药学上可接受的运载体对于本领域技术人员而言是公知的，并且其确切性质取决于制剂的种类以及它的计划递送途径，所述药学上可接受的运载体包括：溶剂和稀释剂，例如水、盐水、葡聚糖、乙醇、甘油等；分散剂；包衣；稳定剂，例如白蛋白和EDTA碱金属盐；防腐剂；抗细菌剂和抗真菌剂；等渗剂等。在固体制剂的情况下(如计划用于进行口服给药的固体制剂)，运载体包括甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁等。

本发明的疫苗组合物包括治疗性疫苗以及预防性疫苗，所述治疗性疫苗在最初感染后或疾病爆发后给予并且旨在减轻或治愈疾病，所述预防性疫苗在感染前给予并且旨在防止该感染。本发明的疫苗组合物可以通过本领域技术人员公知的标准方法来制备。优选地，如上所述，本发明的疫苗组合物包含药学上可接受的运载体。疫苗组合物优选包含佐剂。佐剂例如为但不限于：油-水乳剂，例如弗氏佐剂；铝化合物；脂质体；非离子型嵌段聚合物；皂苷(saponines)；以及二甲基双十八烷溴化铵(DDA)。本发明的疫苗组合物可通过任何常规途径给予，包括但不限于：口服途径、鼻腔途径和可注射(例如肌内、静脉内、皮下、皮内等)途径。

本发明的药物制剂(例如疫苗)可处于液体状态或处于本领域已知的任何其它药物形式(如可注射的乳剂)。本发明所述的药物混合物或疫苗还可处于用于口服给药的片剂、液体溶液剂、混悬剂或酏剂中，或处于无菌液体(如溶液剂或混悬剂)中。优选地，使用惰性介质(inert medium)，例如嵌合蛋白、核苷酸序列或其片段在其中具有适当溶解性的盐水介质、磷酸盐盐水缓冲液以及任何其它介质。

包含本发明的蛋白寡聚复合体和/或含有编码本发明的嵌合蛋白的多核苷酸的载体的药物组合物对于在哺乳动物受试者中诱导针对溶血性尿毒综合征(HUS)的抵抗力的方法有用，这也是本发明的一部分。在所述方法中，将所述组合物给予所述哺乳动物受试者。剂量、免疫计划和对加强剂量(booster doses)的需要将取决于哺乳动物种类、卫生状况、受试者的年龄和大小等，并且能够由本领域技术人员容易地确定。

用于生成含有与布鲁氏菌属2,4-二氧四氢蝶啶合酶(BLS)单体的N末端融合的志贺毒素2型B亚基的单体的嵌合蛋白的方法也在本发明的范围之内。所述方法包括以下步骤：a)在合适的条件下培养含有编码本发明的嵌合蛋白的多核苷酸的转基因细胞，以表达所述嵌合蛋白；以及b)回收所述嵌合蛋白。如上文所解释的，当重组表达时，本发明的嵌合蛋白采取BLS的典型构型(也就是五聚体的二聚物)，从而自组装成本发明的寡聚复合体。在该方法中使用的转基因细胞可为任何本发明的转基因细胞，包括但不限于大肠杆菌细胞(例如大肠杆菌BL21(DE3))、巴斯德毕赤酵母细胞和哺乳动物细胞(例如293T细胞)。然后可通过本领域技术人员公知的方法对由转化的细胞表达的蛋白进行回收和纯化，例如通过色谱法进行。

由于相比Stx2B亚基的非嵌合形式而言其稳定性增加，本发明的蛋白寡聚复合体作为用于获得特异性结合志贺毒素B亚基的抗体的免疫原特别有用，进而具备医药应用和诊断应用，这对本领域技术人员而言是很显而易见的。因此，本发明的寡聚复合体用于引发免疫应答的能力允许其在用于制造特异性结合志贺毒素B亚基的抗体的方法中的使用，此类方法也在本发明的范围内。此类方法包括以下步骤：a)在适于引发针对所述嵌合蛋白的中和抗体的免疫方案下，向哺乳动物给予本发明的蛋白寡聚复合体；b)从所述哺乳动物获得包含所述中和抗体和/或能够生产所述中和抗体的细胞的生物样品；以及c)将所述生物样品用作所述抗体的来源。生物样品可为不同种类，其确切性质将取决于在步骤c)中获得本发明抗体的具体方法。例如，生物样品可为血液，从中可获得含有多克隆抗体的血清。根据本发明的优选实施方式，步骤b)的生物样品包含B细胞或由B细胞构成，将所述B细胞用于步骤c)中以生产产抗体的杂交瘤。杂交瘤技术对本领域技术人员而言是公知的，并已成为抗体领域中的标准实践。例如，可将来自针对BLS-Stx2B免疫的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，以获得产单克隆抗体的杂交瘤。在本发明更优选的实施方式中，在步骤a)中免疫的哺乳动物为骆驼科动物，例如羊驼属(lama)；生物样品为含有淋巴细胞的血液。从这些淋巴细胞中获得编码特异性VHH结构域的基因区段，并用于重组生产特异性结合志贺毒素B亚基的VHH片段。由于尺寸小且溶解性和稳定性提高，VHH片段(在别处也称为单域抗体(single-domain antibodies)和纳米抗体(nanobodies))更易于配制和给药，并且可被用于靶向常规抗体通常达不到的表位。

通过本发明的方法获得的抗体及其抗原结合片段(特异性结合志贺毒素的B亚基)是针对本发明嵌合蛋白的构象表位而产生的，并且能够在体内有效地中和志贺毒素。这些抗体可为不同来源，这取决于用本发明的嵌合蛋白所免疫的动物。抗体优选为小鼠、人或骆驼科动物抗体或其抗原结合片段。抗体可为多克隆抗体或其抗原结合片段。然而，通过本发明的方法获得的抗体优选为单克隆抗体或重组抗体或它们的抗原结合片段，例如小鼠单克隆抗体或羊驼属抗体或它们的抗原结合片段，优选单域羊驼属抗体或其抗原结合片段，更优选V_HH。编码由本发明的方法产生的抗体的核酸的多核苷酸序列易于由本领域技术人员从讨论中的抗体或V_HH的序列中得到。可通过本领域公知的标准程序将所述核酸用于构建转化载体并随后引入宿主细胞中，所述标准程序例如为Sambrook等中所述的标准程序。(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，纽约，纽约，1989)。

用于在牛中降低肠出血性大肠杆菌的细菌负荷的方法也在本发明的范围内。牛和其它反刍动物是通常与人类HUS相关的产志贺毒素大肠杆菌(STEC)血清型(例如O157:H7)的主要储库。小牛在生命早期通过水平传播或垂直传播感染了STEC(Shaw,D.J.,C.Jenkins,M.C.Pearce,T.Cheasty,G.J.Gunn,G.Dougan,H.R.Smith,M.E.Woolhouse和G.Frankel.2004.Shedding patterns of verocytotoxin-producing Escherichia colistrains in a cohort of calves and their dams on a Scottish beeffarm.Appl.Environ.Microbiol.70:7456-7465)，并且没有发展出感染的临床症状，但可能大量脱落(shed)该细菌数个月(Widiasih,D.A.,N.Ido,K.Omoe,S.Sugii和K.Shinagawa.2004.Duration and magnitude of faecal shedding of Shiga toxin-producing Escherichia coli from naturally infectedcattle.Epidemiol.Infect.132:67-75)。

减少牛中的持续性STEC脱落将大大有助于防止人STEC感染。关于牛免疫接种(vaccination)可为明智的控制选项的证据来自以下研究：在该研究中，在用STEC O157:H7抗原免疫后，牛较少脱落大肠杆菌O157(Potter,A.A.,S.Klashinsky,Y.Li,E.Frey,H.Townsend,D.Rogan,G.Erickson,S.Hinkley,T.Klopfenstein,R.A.Moxley,D.R.Smith和B.B.Finlay.2004.Decreased shedding of Escherichia coli O157:H7by cattlefollowing vaccination with type III secreted proteins.Vaccine 22:362-369)。逐渐增加的证据表明，在感染期间志贺毒素阻抑对STEC抗原的免疫应答。Stx改变了粘膜巨噬细胞(Stamm,I.,M.Mohr,P.S.Bridger,E.Schro¨pfer,M.Ko¨nig,W.C.Stoffregen,E.A.Dean-Nystrom,G.Baljer和C.Menge.2008.Epithelial and mesenchymal cells inthe bovine colonic mucosa differ in their responsiveness to Escherichia coliShiga toxin 1.Infect.Immun.76:5381-5391)和上皮内淋巴细胞(Menge,C.,M.Blessenohl,T.Eisenberg,I.Stamm和G.Baljer.2004.Bovine ileal intraepitheliallymphocytes represent target cells for Shiga toxin 1from Escherichiacoli.Infect.Immun.72:1896-1905)中的细胞因子表达模式，并在体外阻抑了粘膜淋巴细胞和外周淋巴细胞的活化和增殖(Moussay,E.,I.Stamm,A.Taubert,G.Baljer和C.Menge.2006.Escherichia coli Shiga toxin 1enhances IL-4transcripts in bovineileal intraepithelial lymphocytes.Vet.Immunol.Immunopathol.113:367-382)。另外，相比用Stx阴性大肠杆菌O157:H7接种的动物中的情况，用产Stx2的STEC O157:H7实验性感染小牛后，适应性细胞免疫应答的发展显著延迟(Hoffman,M.A.,C.Menge,T.A.Casey,W.Laegreid,B.T.Bosworth和E.A.Dean-Nystrom.2006.Bovine immune response toShiga-toxigenic Escherichia coli O157:H7.Clin.Vaccine Immunol.13:1322-1327)。

因此，虽然仍不知晓O157:H7大肠杆菌特异性细胞免疫应答如何影响长期STEC脱落和间歇性STEC脱落(Cray,W.C.,Jr.和H.W.Moon.1995.Experimental infection ofcalves and adult cattle with Escherichia coli O157:H7.Appl.Environ.Microbiol.61:1586-1590)，已提出了在用于牛疫苗的抗STEC制剂中包含Stx作为抗原将是有益的，因为它是所有STEC菌株共有的唯一毒力因子，还因为Stx中和可以改善整个抗STEC免疫应答(

J1,Baljer G,Menge C.Maternally andnaturally acquired antibodies to Shiga toxins in a cohort of calves sheddingShiga-toxigenic Escherichia coli.Appl Environ Microbiol.2009Jun；75(11):3695-704)。

此外，在小鼠模型中进行的研究表明，抗Stx抗体能够抑制EHEC定殖(colonization)(Mohawk KL,Melton-Celsa AR,Robinson CM,O'Brien AD.Neutralizingantibodies to Shiga toxin type 2(Stx2)reduce colonization of mice by Stx2-expressing Escherichia coli O157:H7.Vaccine 2010.,28:4777-4785)。在提出的不同机制中，已证明Stx2可通过增强核仁素(nucleolin)的表面表达来积极推动EHEC粘附，核仁素用作紧密粘附素(intimin)的真核受体(Sinclair JF,O'Brien AD.Cell surface-localized nucleolin is a eukaryotic receptor for the adhesin intimin-gamma ofenterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7.J Biol Chem 2002,277:2876-2885；Robinson CM,Sinclair JF,Smith MJ,O'Brien AD.Shiga toxin of enterohemorrhagicEscherichia coli type O157:H7promotes intestinal colonization.Proc Natl AcadSci U S A 2006,103:9667-9672)。

在本发明的用于在哺乳动物(如牛)中降低肠出血性大肠杆菌的细菌负荷的方法中，向期望降低细菌负荷的动物给予本发明的寡聚复合体，由此引发针对志贺毒素2的B亚基的有效免疫应答。转而，这防止了志贺毒素所产生的对针对STEC抗原的免疫应答的阻抑，从而导致牛中持续性STEC脱落的减少。

在本发明的用于在哺乳动物(如牛)中降低肠出血性大肠杆菌的细菌负荷的替代方法中，向期望降低细菌负荷的动物给予本发明的抗体。

本发明的再一方面涉及结合本发明的嵌合蛋白的抗体。此类抗体优选对本发明的嵌合蛋白而言是特异的。在这一背景下，术语“特异的”是指抗体优先结合本发明的嵌合蛋白，但并不排除以较低的程度与其它蛋白结合。

本发明的抗体在制备用于在哺乳动物(例如人)中预防或治疗溶血性尿毒综合征的药物组合物中的用途也是本发明的一部分。在这种情况下，本发明的抗体与药学上可接受的运载体联用，以将其给予需要预防或治疗HUS的哺乳动物。药物运载体和药物制品(pharmaceutical presentations)已在上面进行了讨论，并且是专业人员公知的。

本发明的再一方面涉及药物组合物，所述药物组合物包含本发明的抗体和药学上合适的运载体。本发明的抗体和药物组合物例如在用于在有需要的受试者中治疗或预防溶血性尿毒综合征(HUS)的方法中有用，这是本发明的又一方面。此类方法优选用于在人受试者(例如被肠出血性大肠杆菌菌株感染的人受试者)中治疗或预防溶血性尿毒综合征(HUS)。

实施例

实施例1

嵌合蛋白BLS-Stx2的分子建模

嵌合体的设计通过以下方式进行：用程序PyMOL 1.5(www.pymol.org)对它的理论结构进行建模，将Stx2B(PDB编码：IR4P)结构的C末端与BLS(PDB编码：ID10)晶体结构的N末端融合，这是与以前由Laplagne等所描述的策略类似的策略(Laplagne等，2004.Proteins57:820-828)。将BLS N末端前8个残基的编码序列替换为Stx2B以及连接两个蛋白的柔性G/S五肽肽接头、十肽肽接头或15个氨基酸的肽接头的编码序列。Stx2B和BLS二者形成相同C5对称的五聚体结构，其中，每个原聚体与其它两个相互作用。通过分子建模获得的嵌合体的理论结构(图1)说明，所使用的所有接头都足够长，从而允许将Stx2B五聚体组装至BLS的五聚体模块上，这没有任何空间位阻。在十聚体BLS颗粒中，两个Stx2B五聚体将以相对的方向展示在该结构的顶部和底部。值得注意的是，在这个模型中，Stx2B的C端表面(与Stx2全毒素中的A亚基相互作用)将面向BLS支架，并可能被保护免于与免疫系统相互作用，而神经酰胺三己糖苷(Gb3)结合位点将会完全暴露出来。

实施例2

通过以下方案构建含有具有SEQ.ID.No.4的基因的pET11a-BLS-Stx2B-L5(具有5个氨基酸的接头)质粒：

a)为了克隆布鲁氏菌属(Brucella spp.)的2,4-二氧四氢蝶啶合酶(BLS)的编码基因，利用特异性引物通过PCR扩增从流产布鲁氏菌(B.abortus)的基因组DNA获得BLS序列，并克隆到pET11a载体(Novagen，USA)中。为了开发表达盒(cassette)，对编码布鲁氏菌属2,4-二氧四氢蝶啶合酶(BLS)的开放阅读框的序列进行定向诱变(Laplagne等，2004)。在BLS基因的5’区域中插入两个新的限制性位点：位于5’端的前两个密码子中的NsiI位点；以及位于包含BLS天然氨基酸序列的第8位和第9位残基的两个密码子中的一个AflII位点。

b)为了将所编码的序列插入Stx2B蛋白(SEQ.ID.No.1)中，我们设计了扩增Stx2B蛋白的寡核苷酸，所述寡核苷酸在序列的5’端具有NsiI酶的位点(下划线)，在序列的3’端具有AflII酶的位点(下划线)，并具有编码5个氨基酸的接头的序列(粗体)。以pGEM-T载体中的以前克隆的序列为模板，通过PCR获得Stx2B基因(Seq.ID.No.2)(Capozzo等，2003.Infect Immun 71:3971-3978)。

因此，制备以下寡核苷酸以用作PCR中的引物：

正向引物(Seq.ID.NO.10)：

5’ATCAACATGCATGCGGATTGTGCTAAAGGT 3’

反向引物5(Seq.ID.NO.11)：

5’TAAAATCTTAAGACCAGAACCAGAACCGTCATTATTAAACTGCAC 3’

用以下物质进行PCR反应：0.2mM脱氧核苷三磷酸(dNTP)(Promega Inc.)、1.5mMMgCl₂

0.15单位DNA Taq聚合酶

和0.5μM引物。循环模式为：94℃2分钟，1个循环；92℃10秒，62℃12秒和72℃30秒，35个循环；以及，72℃2分钟，1个最终循环。

使用琼脂糖凝胶对PCR产物进行检查，然后使用Qiagen提取试剂盒(Qiagen，UK)进行纯化。

c)用NsiI和AflII限制性酶对pET11a-BLS质粒和纯化的PCR Stx2B-L5产物进行消化。用处于缓冲液Tango^TM 2×(终浓度)中的3单位NsiI(Fermentas Inc.)和3单位AflII(Fermentas Inc.)在37℃实施消化4小时。用5单位DNA T4连接酶(Fermentas Inc.)将消化产物在16℃连接过夜。将连接物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并利用特异性引物(正向和反向5)通过PCR对菌落进行筛选。通过测序确认插入。测序分析显示，布鲁氏菌属2,4-二氧四氢蝶啶合酶的前8个氨基酸被来自Stx2B蛋白的70个氨基酸(Seq.ID.No.1)替换。由此获得了编码具有Seq.ID.No.3的嵌合融合蛋白(称为BLS-Stx2B(L5))的基因。

实施例3

通过以下方案构建pCI-neo-BLS-Stx2B-L5质粒：

将克隆在pET11a载体中的BLS-Stx2B(L5)的基因序列Seq.ID.No.4亚克隆到载体pCi-neo(Promega，USA)中。因此，制备以下寡核苷酸以用作PCR中的引物：ACCATG

BLS-DNA-嵌合体all(Seq.ID.No.12)：5’GTTTAAGAATTCGAAGGAGATACCACCATGCAT3′

BLS-Back(Seq.ID.No.13)：3′CGTAGCGCGAACAGACTCGATCGTACTGACCACCTGT 5′

引物BLS-DNA-嵌合体all添加了用于EcoRI酶的限制性位点(粗体)和Kozak共有序列(下划线)；BLS-Back引物添加了用于NheI酶的限制性位点(粗体)。

使用pET11a-BLS-Stx2B(L5)质粒作为模板，通过PCR来扩增此类序列。如实施例2C所述的进行PCR反应。循环模式为：94℃5分钟，1个循环；94℃1分钟，55℃1分钟和74℃1分钟，40个循环；以及74℃8分钟，1个最终循环。将PCR产物用EcoRI酶和NheI酶进行消化，并将pCI-neo载体用EcoRI和XbaI进行消化。EcoRI/NheI消化按照如下进行：用处于缓冲液Tango^TM 1×(终浓度)中的5单位NheI(Fermentas Inc.)在37℃进行4小时。然后，根据式V＝A/8(其中，V是待添加的缓冲液的体积，A是反应的初始体积)，加入5单位EcoRI(FermentasInc.)和缓冲液Tango^TM。在37℃下将消化反应物(digestion)再孵育另外3个小时。EcoRI/XbaI消化用处于缓冲液Tango^TM 2×(终浓度)中的4单位EcoRI和4单位XbaI(FermentasInc.)在37℃进行4小时。

然后，如实施例2C中所描述的实施连接反应(NheI和XbaI酶具有兼容的末端)。将连接物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并利用特异性引物(BLS-DNA-嵌合体all/BLS-Back以及正向/反向5)通过PCR对菌落进行筛选。通过测序对获得的构建体进行检查。在大肠杆菌DH5α细胞中对pCI-neo-BLS-Stx2B(L5)质粒进行扩增，并进一步通过“mini prep”柱(Qiagen，UK)进行纯化。DNA的纯度和浓度通过分光光度计在260/280nm处进行评估。

实施例4

通过以下方案构建含有具有SEQ ID.No.6的基因的pET11a-BLS-Stx2B-L10(具有10个氨基酸的接头)质粒：

a)为了克隆布鲁氏菌属的2,4-二氧四氢蝶啶合酶(BLS)的编码基因，利用特异性引物通过PCR扩增从流产布鲁氏菌的基因组DNA获得BLS序列，并克隆到pET11a载体(Novagen，USA)中。为了开发表达盒，对编码布鲁氏菌属2,4-二氧四氢蝶啶合酶(BLS)的开放阅读框的序列进行定向诱变(Laplagne等，2004.Proteins 57:820-828)。在BLS基因的5’区域中插入两个新的限制性位点：位于5’端的前两个密码子中的NsiI位点；以及位于包含BLS天然氨基酸序列的第8位和第9位残基的两个密码子中的一个AflII位点。

b)为了将所编码的序列插入Stx2B蛋白(SEQ.ID.No.1)中，我们设计了包含编码该Stx2B蛋白的核苷酸序列的序列，该序列在序列的5’端具有NsiI酶的位点(下划线)，在序列的3’端具有AflII酶的位点(下划线)，并具有编码10个氨基酸的接头的序列(粗体)。

以pGEM-T载体中的以前克隆的序列为模板，通过PCR获得Stx2B基因(Seq.ID.No.2)(Capozzo等，2003.Infect Immun 71:3971-3978)。

因此，制备以下寡核苷酸以用作PCR中的引物：

正向引物(Seq.ID.No.14)：

5’ATCAACATGCATGCGGATTGTGCTAAAGGT 3’

反向引物10(Seq.ID.No.15)：

5’TAAAATCTTAAGAGAACCAGAACCAGAACCAGAACCAGAACCGTCATTATTAAACTGCAC 3’

如实施例2C中所述的进行PCR反应。循环模式为：94℃2分钟，1个循环；92℃10秒，68℃12秒和72℃30秒，35个循环；以及，72℃2分钟，1个最终循环。

使用琼脂糖凝胶对PCR产物进行检查，然后使用Qiagen提取试剂盒(Qiagen，UK)进行纯化。

c)如实施例2(C)中所述的，用NsiI和AflII限制性酶对pET11a-BLS质粒和纯化的基因进行消化，并在16℃用DNA T4连接酶进行连接。将连接物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并利用特异性引物(正向和反向10)通过PCR对菌落进行筛选。通过测序确认插入。测序分析显示，布鲁氏菌属2,4-二氧四氢蝶啶合酶的前8个氨基酸被来自Stx2B蛋白的70个氨基酸(Seq.ID.No.1)替换。由此获得了编码具有Seq.ID.No.5的嵌合融合蛋白(称为BLS-Stx2B(L10))的基因。

实施例5

通过以下方案构建pCI-neo-BLS-Stx2B-L10质粒：

将克隆在pET11a载体中的BLS-Stx2B(L10)的基因序列Seq.ID.No.6亚克隆到载体pCi-neo(Promega，USA)中。因此，制备以下寡核苷酸以用作PCR中的引物：

BLS-DNA-嵌合体all(Seq.ID.No.16)：

5’GTTTAA GAATTCGAAGGAGATACCACCATGCAT 3′

BLS-Back(Seq.ID.No.17)：

3′CGTAGCGCGAACAGACTCGATCGTACTGACCACCTGT 5′

引物BLS-DNA-嵌合体all添加了用于EcoRI酶的限制性位点(粗体)和Kozak共有序列(下划线)；BLS-Back引物添加了用于NheI酶的限制性位点(粗体)。

使用pET11a-BLS-Stx2B(L10)质粒作为模板，通过PCR来扩增此类序列。如实施例3所述的进行PCR。如实施例3所述的，将PCR产物用EcoRI酶和NheI酶进行消化，并将pCI-neo载体用EcoRI和XbaI进行消化。然后，如实施例2(C)中所述的实施连接反应(NheI和XbaI酶具有兼容的末端)。将连接物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并利用特异性引物(BLS-DNA-嵌合体all/BLS-Back以及正向/反向10)通过PCR对菌落进行筛选。通过测序对获得的构建体进行检查。在大肠杆菌DH5α细胞中对pCI-neo-BLS-Stx2B(L10)质粒进行扩增，并进一步通过“mini prep”柱(Qiagen，UK)进行纯化。DNA的纯度和浓度通过分光光度计在260/280nm处进行评估。

实施例6

通过以下方案构建含有具有SEQ ID.No.8的基因的pET11a-BLS-Stx2B(具有15个氨基酸的接头)质粒：

a)为了克隆布鲁氏菌属的2,4-二氧四氢蝶啶合酶(BLS)的编码基因，利用特异性引物通过PCR扩增从流产布鲁氏菌的基因组DNA获得BLS序列，并克隆到pET11a载体(Novagen，USA)中。为了开发表达盒，对编码布鲁氏菌属2,4-二氧四氢蝶啶合酶(BLS)的开放阅读框的序列进行定向诱变(Laplagne等，2004，Proteins 57:820-828)。在BLS基因的5’区域中插入两个新的限制性位点：位于5’端的前两个密码子中的NsiI位点；以及位于包含BLS天然氨基酸序列的第8位和第9位残基的两个密码子中的一个AflII位点。

b)为了将所编码的序列插入Stx2B蛋白(SEQ.ID.No.1)中，我们设计了包含编码该Stx2B蛋白的核苷酸序列的序列，该序列在序列的5’端具有NsiI酶的位点，在序列的3’端具有AflII酶的位点，并具有编码15个氨基酸的接头的序列(粗体)。

以pGEM-T载体中的以前克隆的序列为模板，通过PCR获得Stx2B基因(Seq.ID.No.2)(Capozzo等，2003.Infect Immun 71:3971-3978)。

因此，制备以下寡核苷酸以用作PCR中的引物：

正向引物(Seq.ID.No.18)：

5’ATCAACATGCATGCGGATTGTGCTAAAGGT 3’

反向引物15(Seq.ID.No.19)：

5’TAAAATCTTAAGACCAGAACCAGAACCAGAACCAGAACCAGAACCAGAACCAGAACCGTCATTATTAAACTGCAC 3’

如实施例2C中所述的进行PCR反应。循环模式为：94℃2分钟，1个循环；92℃10秒，68℃12秒和72℃30秒，35个循环；以及，72℃2分钟，1个最终循环。

使用琼脂糖凝胶对PCR产物进行检查，然后使用Qiagen提取试剂盒(Qiagen，UK)进行纯化。

c)如实施例2(C)中所述的，用NsiI和AflII限制性酶对pET11a-BLS质粒和纯化的基因进行消化，并在16℃用DNA T4连接酶进行连接。将连接物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并利用特异性引物(正向和反向15)通过PCR对菌落进行筛选。通过测序确认插入。测序分析显示，布鲁氏菌属2,4-二氧四氢蝶啶合酶的前8个氨基酸被来自猫科动物Stx2B蛋白的70个氨基酸(Seq.ID.No.1)替换。由此获得了编码具有Seq.ID.No.7的嵌合融合蛋白(称为BLS-Stx2B(L15))的基因。

实施例7

通过以下方案构建pCI-neo-BLS-Stx2B-L15质粒：

将克隆在pET11a载体中的BLS-Stx2B(L15)的基因序列Seq.ID.No.8亚克隆到载体pCi-neo(Promega，USA)中。因此，制备以下寡核苷酸以用作PCR中的引物：

BLS-DNA-嵌合体all(Seq.ID.No.20)：

5’GTTTAAGAATTCGAAGGAGATACCACCATGCAT 3′

BLS-Back(Seq.ID.No.21)：

3′CGTAGCGCGAACAGACTCGATCGTACTGACCACCTGT 5′

引物BLS-DNA-嵌合体all添加了用于EcoRI酶的限制性位点(粗体)和Kozak共有序列(下划线)；BLS-Back引物添加了用于NheI酶的限制性位点(粗体)。

使用pET11a-BLS-Stx2B(L15)质粒作为模板，通过PCR来扩增此类序列。如实施例3所述的进行PCR。如实施例3所述的，将PCR产物用EcoRI酶和NheI酶进行消化，并将pCI-neo载体用EcoRI和XbaI进行消化。然后，如实施例2(C)中所述的实施连接反应(NheI和XbaI酶具有兼容的末端)。将连接物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并利用特异性引物(BLS-DNA-嵌合体all/BLS-Back以及正向/反向15)通过PCR对菌落进行筛选。通过测序对获得的构建体进行检查。在大肠杆菌DH5α细胞中对pCI-neo-BLS-Stx2B(L15)质粒进行扩增，并进一步通过“mini prep”柱(Qiagen，UK)进行纯化。DNA的纯度和浓度通过分光光度计在260/280nm处进行评估。

实施例8

BLS-Stx2B(具有5个、10个和15个氨基酸的接头)嵌合体的纯化

将三种pet11a-BLS-Stx2B质粒转化进大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，以表达重组蛋白。在37℃下使细胞在补充有氨苄青霉素的LB肉汤中生长并伴随振摇(250rpm)。将过夜培养物用新鲜的LB-氨苄青霉素培养基1:100稀释，并生长达到OD_600nm＝1。在这个点上，通过添加1mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(Sigma)，对培养物进行诱导，并在28℃下伴以振摇(250rpm)孵育3h。在4℃下，将细菌以15,000g离心20min。将收获的细胞重悬于缓冲液50mM Tris-HCl(pH 8.0)中，并通过超声进行裂解。

所有的Stx2B-BLS嵌合体均表达为包涵体(图2A)。通过在室温下在8M尿素、50mMTris/HCl、5mM EDTA(pH 8)的缓冲液中伴随振摇孵育过夜，使包涵体溶解。用12-14,000MWCO膜(Spectrum Laboratories，Inc.，Rancho Dominguez，CA，USA)将蛋白以1M尿素、50mM Tris/HCl、5mM EDTA(pH 8.5)的缓冲液进行透析。通过在Q-Sepharose(Pharmacia，GEHealthcare Life Sciences)柱中的阴离子交换层析，使用与UV/vis检测器(Gilson，model152)连接的HPLC装置(Gilson model 320)对溶解的蛋白进行纯化。使用处于1M尿素、50mMTris/HCl、1mM PMSF(pH 8.5)的缓冲液中的0-1M线性梯度的NaCl进行洗脱。将蛋白用10,000MWCO

浓缩系统(Millipore，Carrigtwohill，Co.Cork，Ireland)进行浓缩。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE(15％，w/v)测定制剂的纯度(图2B和图2D)，并通过标准方法进行定量。每次免疫之前，将蛋白以磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行透析。如由SDS-PAGE所测定的，该蛋白具有预期的分子量(图2D)；并且，通过蛋白质印迹分析，该蛋白被抗BLS抗体和抗Stx2抗体识别(图2C)。

实施例9

用pCIneo-BLS-Stx2B L5、L10和L15转染293T细胞

为了证实BLS-Stx2B在真核细胞内的正确表达，使用

Reagent(QiagenInc.)，用PCI-BLS-Stx2B转染293T细胞。简要来说，在37℃下5％CO₂中，在6孔培养板中使6×10⁵个细胞/孔生长于具有Antibiotic-Antimycotic(AA)和5％胎牛血清(FBS，Natocor)的RPMI 1640培养基中。将2μg pCIneo-BLS-Stx2B用RPMI培养基稀释至100μl，并加入20μl

试剂。将混合物在室温下孵育10min，以允许复合体形成。将转染混合物用RMPI培养基稀释至1ml，加入至细胞，并在37℃下5％CO₂中于具有AA和2％FBS的RPMI 1640培养基中孵育48h。48小时后，用PBS收获细胞，并在1500rpm下离心5分钟。将细胞沉淀重悬于SDS-PAGE样品缓冲液(用于细胞裂解)中，并进行蛋白质印迹分析。将细胞裂解蛋白产物进行15％SDS-PAGE，并电转移到硝酸纤维素膜上。将膜用稀释于PBS-吐温0.1％中的5％牛奶在室温下封闭2h，并在4℃下与稀释于3％牛奶、PBS-吐温0.1％中的BLS特异性抗体(1:2000)孵育过夜。将膜进行洗涤，并在室温下与缀合过氧化物酶的兔抗小鼠IgG(1:3000)(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)孵育2h。将反应物用ECL溶液进行显影(图3)。

图3显示，所有三种pCIneo-BLS-Stx2B构建体均能够在真核细胞系293T中表达相应的蛋白，在蛋白质印迹分析中揭示为预期分子量(约25kDa)的特定条带。

实施例10

通过圆二色性(circular dichroism)进行的结构分析

为了评价纯化的嵌合体的二级结构，对远UV(200nm-250nm波长范围)中的圆二色性(CD)信号进行测量。

在JASCO J-810分光偏振计(spectropolarimeter)上，使用1mm或2mm光程的石英比色皿，在25℃下的PBS(pH 7.0)缓冲液中，对远UV区(250nm-200nm)中的BLS-Stx2B、BLS和Stx2B的CD谱进行测量。使用ProtParamExPASy工具(http://web.expasy.org/protparam/)，利用获得的每种蛋白的理论分子量值，将数据转换为摩尔椭圆率[θ](molarellipticity，以单位°cm²μmol_prot ^-1计)。

证明了BLS-Stx2B的远UV-CD谱与由单独的BLS和单独的Stx2B的CD信号的结合从理论上计算出的该蛋白的远UV-CD谱实际上相同。这些结果表明在三种嵌合体的结构中，BLS和Stx2B二者的二级结构均得以保留(图4)。

实施例11

通过静态光散射进行的结构分析

在与高效液相色谱系统(包含Waters 486UV检测器和LKB 2142差示折光计)串联连接的Precision Detectors PD2010光散射仪上，对BLS-Stx2B的平均分子量(M_w)进行测定。一般而言，将BLS-Stx2B L5、L10和L15(0.5-1mg/ml)各200μl-400μl加载到Superdex200HR-10/30柱上，并用具有1M尿素的50mM Tris/HCl、0.15M NaCl(pH 8)的缓冲液洗脱。在PC计算机上记录洗脱材料的90°光散射和折射率信号，并用由Precision Detectors提供的Discovery32软件进行分析。使用牛血清白蛋白(M_w：66.5kDa)作为标准品，对90°光散射检测器进行校准。所得到的MW与理论MW之间的相似性表明，每种嵌合体结构的合适折叠与天然BLS的四级结构一致(图5)。

实施例12

热变性分析

在对处于PBS(pH 7.0)缓冲液中的BLS-Stx2B L5、L10和L15以及BLS野生型和Stx2B样品热诱导变性后，在JASCO J-810分光偏振计上对这些蛋白的222nm CD信号随温度的变化进行测量。通过用Peltier系统(Jasco)升高温度将样品缓慢加热。温度扫描范围为25-100℃，速度为4℃/min。每0.5℃测量222nm处的摩尔椭圆率。由此，热转变的温度中点被视为表观熔融温度(T_m)。嵌合体的适当折叠结构还得到了与单独的Stx2B模块和单独的BLS模块比较的热稳定性分析的支持。通过CD谱对这些蛋白的热变性进行分析(图6)。BLS的结构直到85℃都是稳定的。在高于此温度时，蛋白以不可逆的过程协作解折叠(cooperatively unfolds)，具有89℃的表观T_m。另一方面，Stx2B直到50℃都保持稳定，然后协作且不可逆地解折叠，表观T_m为60℃。

相反，所有BLS-Stx2B嵌合体直到85℃都保持稳定，在高于此温度时，蛋白以复杂的过程进行解折叠。嵌合体的CD信号减少，推测是由于嵌合体的十聚体结构中变性的Stx2B结构域的聚集现象，该聚集现象扰乱BLS模块的结构，促进它们解折叠。然而，所有三种嵌合体中显示出的在60℃时STXB的热转变丧失表明，BLS分子使志贺样B毒素的亚基得到稳定，从而将五聚体的变性延迟到83℃。

实施例13

GB₃结合分析

因为Stx2B的五聚体构型对GB3结合是必需的，将Gb3结合ELISA分析用于在功能上确认具有5个、10个或15个氨基酸长的肽接头的嵌合蛋白形式(分别为BLS-Stx2B-L5、BLS-Stx2B-L10和BLS-Stx2B-L15)是否组装成天然全毒素B亚基的构型。如以前所述的实施该分析(Akenazi等，1989.J.ClinMicrobiol 27:1145-1150)。将溶于氯仿:甲醇(2:1)中的GB3(Matreya，State College，PA)用于涂覆96孔ELISA板(Greiner Bio-One，Frickenhausen，Germany)，1μg每孔。将来自BLS-Stx2B免疫的小鼠的血清池用作一抗(1:1000稀释)，将缀合有过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG(Zymed，Invitrogen，Carisbad，CA，USA)用作二抗(1:3000稀释)。将反应物用邻苯二胺(Sigma，St Louis，MO，USA)显影，并读取492nm处的吸光度。将BLS和大肠杆菌BL21提取物用作非特异性结合的阴性对照。

关于嵌合体和重组Stx2全毒素，观测到剂量依赖性模式的阳性反应，但在BLS中并未观测到(图7)。由这些发现可推论出，在三种嵌合蛋白形式中，BLS十聚体顶部上的B亚基均正确组装，并且均维持了它们的Gb3结合能力。

实施例14

免疫期间抗体-滴度的时程

为了评估相比单独的重组纯化的Stx2B亚基(Stx2B)而言BLS-Stx2B改善体液免疫应答的能力，在弗氏佐剂(FA)存在的情况下用Stx2B或具有10个氨基酸长的G/S接头肽的嵌合体(BLS-Stx2B-L10)i.p.注射小鼠组。在室温下，将氢氧化铝凝胶(AH)悬浮液(1mg/ml)与Stx2B-BLS混合，并在伴随振摇的情况下孵育30分钟。将AH吸附的抗原以10,000g离心10min，并将沉淀重悬于PBS中。

在超过两个月的时间中，对来自免疫接种小鼠血清中的特异性IgG抗体进行分析。在两个免疫接种组中均引发出Stx2B特异性IgG滴度(图8A)。BLS-Stx2B-L10组的ELISA滴度在前三次免疫接种期间上升，并在第三次免疫接种后14天达到高峰。同时，Stx2B免疫的小鼠在给予第三次免疫接种后45天之前没有显示出特异性抗体应答，个体之间具有高的滴度变化。在所有分析的时间处，由BLS-Stx2B-L10产生的抗体滴度均显著高于Stx2B组的抗体滴度(P<0.005)(图8A)。

另外，为了评价在不同配方或免疫接种方案下BLS-Stx2B刺激免疫系统以及产生抗体的能力，我们用具有弗氏佐剂(FA)或氢氧化铝(AH)的BLS-Stx2B-L10蛋白以及无任何佐剂的BLS-Stx2B-L10蛋白免疫小鼠组，或者根据DNA-蛋白初免-加强(prime-boost)程序免疫小鼠组。在免疫接种后的不同时间收集血清样品，并通过ELISA对特异性IgG的滴度进行测定。结果表明，在测试的所有方案下，即便是在不具有任何外源佐剂的情况下，BLS-Stx2B嵌合体均刺激免疫应答(图8B)。另一方面，DNA-蛋白初免-加强方案较晚地诱发出Stx2B特异性抗体(蛋白加强(protein boost)后35天)，但在该时间点达到了与具有AH的BLS-Stx2B-L10相同的滴度。就最大滴度和达到最大滴度的时间而言，缺乏佐剂的蛋白诱发出最低体液应答。

在0、15和30天，将成年BALB/c小鼠用具有以下物质的3个剂量的BLS-Stx2B-L10进行免疫：弗氏佐剂(FA)(腹膜内，i.p.)；AH(皮下，s.c.)；或无佐剂(NA)(i.p.)。在FA的情况中，将第一剂与完全FA一起给予，将第二剂与不完全FA一起给予，并将最后一剂在无佐剂的情况下给予。对于AH，在室温下将1mg/ml的悬浮液与BLS-Stx2B-L10混合并伴随振摇孵育30min。将AH吸附的抗原以10,000g离心10min，将沉淀重悬于PBS中，并接种到小鼠中。另外，用处于FA中的BLS和Stx2Bi.p.免疫小鼠组。BLS和BLS-Stx2B-L10的剂量通过它们的分子量进行校正，以接种相比Stx2B而言等摩尔量的各蛋白(剂量等同于20μg Stx2B)。

为了初免-加强免疫，在0天、14天和28天通过肌内(i.m.)途径将100μg pCI-BLS-Stx2B-L10注射到小鼠后肢中，接着在第40天用处于不完全FA中的BLS-Stx2B-L10实施最终的i.p.加强免疫(booster)。

在每次免疫之前以及每15或30天，将小鼠麻醉，通过眼眶静脉丛穿刺(punctureof the retro-orbital plexus)取血，从而获得血清样品。

通过ELISA分析对免疫接种小鼠血清样品中的Stx2B特异性IgG进行分析。简要来说，将96孔Maxisorp板(Greiner Bio-One，Frickenhausen，Germany)用0.5μg纯化的Stx2B涂覆，并在37℃下用0.4％BSA(PBS-吐温0.05％)封闭2h。然后，在37℃下将板与连续稀释的小鼠血清孵育2h。洗涤后，在37℃下将板与稀释于PBS-Tween 0.05％中的缀合有过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG(Zymed，Invitrogen，Carisbad，CA，USA)(1:3000)孵育1.5h。将板进行洗涤，并将反应物用处于柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液中的2mg/ml邻苯二胺(Sigma)和0.3％过氧化氢进行显影。将反应用2M H₂SO₄终止，并在微量滴定板阅读器ASYS UVM340(BiochromLtd.，Cambridge，England)上对492nm处的吸光度进行测量。结果表示为终点滴度，计算为具有高于免疫前血清样品的培养基的光学密度的最后稀释度的倒数值±2×标准差(SD)。

实施例15

抗体亚分型(subtyping)和抗体亲和力

除了在初免-加强程序中外，BLS-Stx2B-L10抗原在分析的所有方案中均诱导出比IgG2a滴度高的抗Stx2B特异性IgG1滴度(P<0.001)，其中，两种IgG亚类之间不存在显著差异(图9)。对于IgG亚分型而言，如上所述的，使用缀合有过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG1和IgG2a(1:1000)(BD-Pharmigen，New Jersey，USA)作为二抗进行ELISA。

相比来自用处于FA中的纯化的Stx2B免疫的小鼠的血清，来自用FA或AH配制的BLS-Stx2B-L10免疫的小鼠(如实施例14中所述)的血清展现出对Stx2B具有较高亲和力的抗体。在从用无佐剂的BLS-Stx2B-L10免疫的小鼠或初免-加强方案中的小鼠收集的血清中，观测到相似的亲和力结果(表1A)。通过基于硫氰酸盐洗脱的ELISA测定免疫小鼠中产生的抗体的Stx2B亲和力。该过程类似于所描述的关于Stx2B-ELISA的过程，包含一个额外的步骤。在与标准化(normalized)浓度的血清孵育后，对板进行洗涤，并将稀释于PBS中的硫氰酸铵(Anedra，San Fernando，Bs.As.，Argentina)以0-4M的浓度范围加入到孔中。将板在室温下静置15min，然后对它们进行洗涤，并继续进行分析。测定使50％结合的抗体解离所需的硫氰酸铵浓度。结合百分比按照如下进行计算：存在硫氰酸铵时的OD_492nm×100/不存在硫氰酸铵时的OD_492nm。

实施例16

针对重组Stx2(rStx2)的中和滴度

为了测定中和Stx2的抗体滴度，将1CD₅₀的rStx2(670pg Stx2，杀死50％Vero细胞的细胞毒性剂量)和如实施例14中免疫的小鼠的实验血清样品的连续稀释液在37℃下预孵育1h，接着在4℃下预孵育1h。将混合物覆盖到含有10⁴个Vero细胞的各孔，并在37℃下5％CO₂中孵育48h。将细胞用PBS洗涤，用结晶紫染料染色，并在具有570nm滤光片的微量滴定板阅读器(Biochrom Ltd.)上进行读取。中和活性表示为阻断针对Vero细胞的Stx2毒性的50％的最高稀释度的倒数值。

来自用FA配制的BLS-Stx2B-L10免疫的小鼠的所有血清显示出最高的中和滴度(P<0.001)。与此相反，来自用单独的Stx2B(即便是配制于FA中时)免疫的小鼠的血清显示出最低的中和活性(表1)。

表1

***显著不同于其它组

*显著不同于Stx2B+弗氏佐剂

表1：来自免疫小鼠的血清的抗体亲和力以及中和能力

抗体亲和力以如下表示：使50％结合的抗体解离(ELISA测试中)所需的硫氰酸铵的摩尔浓度。结果表示为4-6只小鼠/组的平均值±SEM。

将来自免疫小鼠(最后一次免疫后45天)的血清在体外与rStx2预孵育，并如材料和方法中所详述的在Vero细胞上分析其毒性。每个值表示4-6只小鼠/组的平均值±SEM。*P<0.05相对于Stx2B+FA组；***P<0.001相对于所有其它免疫接种方案。

实施例17

小鼠血清的交叉反应性

为了这一目的，将来自产Stx2、或Stx2c变体或Stx2d变体的人分离EHEC株的上清液与来自用BLS-Stx2B-L10+FA或Stx2B+FA免疫的小鼠(如实施例14中所述)的血清进行孵育，并评价了对Vero细胞的毒性。我们还评价了针对重组Stx1(rStx1)的中和能力。来自用BLS-Stx2B-L10免疫的小鼠的血清强烈中和野生Stx2及其变体以及rStx1。与此形成鲜明对比的是，用纯化的Stx2B免疫的六只小鼠中，只有从一只小鼠中收获的血清样品能够微弱地中和野生Stx2，并且它们中没有一者中和Stx2变体或rStx1(表2)。

表2

表2：针对纯化的rStx1、野生Stx2及其变体的中和滴度。来自用Stx2B或BLS-Stx2B-L10(均用FA配制)免疫的小鼠(最后一次免疫后45天)的血清与1CD50的各Stx在体外孵育，如材料和方法中所详述的分析对Vero细胞的毒性并表示结果。每个值表示6只小鼠/组的平均值±SEM。

实施例18

保护免疫小鼠抵抗rStx2激发：离体rStx2中和活性

对于离体分析，将2.2ng/小鼠的rStx2(一个致死剂量100％，1LD₁₀₀)与来自如实施例14中所免疫的小鼠的血清在37℃下预孵育1h，并在4℃下预孵育1h。将该混合物静脉内(i.v.)接种到未经处理的(naive)成年BALB/c小鼠中，并对存活进行观测。该rStx2剂量导致注射后96h内100％死亡率。如图10A中所说明的，rStx2与从在不同方案下用BLS-Stx2B-L10免疫的小鼠收获的血清的预孵育完全消除了rStx2毒性，然而来自Stx2B免疫接种的小鼠的血清没有防止rStx2毒性。

实施例19

用rStx2进行的静脉内激发和长期应答

在最后一次免疫后50天，通过用1LD₁₀₀的rStx2进行i.v.接种对如实施例14中所免疫的小鼠进行激发。图10B显示，100％的BLS-Stx2B-L10免疫接种小鼠和33％的Stx2B免疫接种小鼠在rStx2致死激发中存活。根据所使用的rStx2剂量，0％的用BLS免疫的动物或未免疫小鼠在该激发中存活(图10B)。

长期收获来自存活BLS-Stx2B免疫小鼠的血清，以研究特异性抗体应答的持续时间(图11A)。根据ELISA抗Stx2抗体评价，所有BLS-Stx2B方案均诱导出长期持久性的免疫应答。在最后一次给药后8个月用2LD₁₀₀(4.4ng/小鼠)rStx2、并在最后一次给药后10个月用3LD₁₀₀(6.6ng/小鼠)rStx2再次激发(re-challenged)小鼠(图11B)。所有BLS-Stx2B-L10免疫接种小鼠在最后一次免疫给药后8个月时用2LD₁₀₀进行的激发中以及在最后一次免疫给药后11个月时用3LD₁₀₀进行的激发中均得以存活。

实施例20

由用一剂量BLS-Stx2B-L10进行免疫产生的抗体的保护能力

为了进一步分析由用BLS-Stx2B-L10蛋白免疫所产生的抗体的保护能力，将成年BALB/c小鼠用配制在氢氧化铝中的一剂量BLS-Stx2B-L10(剂量相当于20μg Stx2B)进行免疫。将氢氧化铝凝胶(AH)悬浮液(1mg/ml)与BLS-Stx2B-L10混合并在室温下伴随振摇孵育30分钟。将AH吸附的抗原以10000g离心10分钟，将沉淀重悬于PBS中。在免疫接种后的不同时间收集血清样品，并通过ELISA测定特异性IgG的滴度。如实施例14所述的通过ELISA测定法对免疫接种小鼠的血清样品中的Stx2B特异性IgG进行分析。

图12显示，一剂量BLS-Stx2B-L10足以发展出特异性IgG体液应答。

为了测试免疫应答的保护能力，在免疫后一个月，用1LD₁₀₀rStx2对小鼠进行激发。图13A示出了BLS-Stx2B-L10免疫接种的小鼠在rStx2致死激发中100％存活，而未免疫小鼠在激发中0％存活。

在免疫后2个月和免疫后4个月，分别以3LD₁₀₀和5LD₁₀₀对存活小鼠进行再激发。图13B和图13C表明，所有小鼠在用高剂量rStx2进行的两次激发中均能够存活，这说明由用BLS-Stx2B-L10进行免疫产生的抗体具有高保护能力。

Claims (31)

1.一种嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含肽，所述肽由SEQ ID No.:1的志贺毒素2型的B亚基(Stx2B)的单体组成，所述肽与SEQ ID No.:9的9-158位的氨基酸的布鲁氏菌属2,4-二氧四氢蝶啶合酶的单体的N末端通过肽接头融合，所述肽接头为长度为5-15个氨基酸的G/S柔性肽，其中，所述嵌合蛋白形成五个相同单体的寡聚复合体，其保留了构成Gb3结合位点的Stx2B的构象表位的天然构型。

2.一种嵌合蛋白，所述嵌合蛋白由肽组成，所述肽由SEQ ID No.:1的志贺毒素2型的B亚基(Stx2B)的单体组成，所述肽与SEQ ID No.:9的9-158位的氨基酸的布鲁氏菌属2,4-二氧四氢蝶啶合酶的单体的N末端通过肽接头融合，所述肽接头为长度为5-15个氨基酸的G/S柔性肽。

3.如权利要求1或2所述的嵌合蛋白，其中，所述肽接头为长度为10个氨基酸的G/S柔性肽。

4.如权利要求1所述的嵌合蛋白，所述嵌合蛋白由选自于由以下氨基酸序列所组成的组中的氨基酸序列组成：SEQ ID No:3、SEQ ID No:5和SEQ ID No:7。

5.如权利要求4所述的嵌合蛋白，所述嵌合蛋白由氨基酸序列SEQ ID No:5组成。

6.由权利要求1-5中任一项所述的嵌合蛋白的五聚体的二聚物组成的蛋白寡聚复合体。

7.编码权利要求1-5中任一项所述的嵌合蛋白的多核苷酸。

8.如权利要求7所述的多核苷酸，所述多核苷酸由选自于由以下核苷酸序列所组成的组中的核苷酸序列组成：SEQ ID No:4、SEQ ID No:6和SEQ ID No:8。

9.如权利要求8所述的多核苷酸，所述多核苷酸由核苷酸序列SEQ ID No:6组成。

10.包含权利要求7-9中任一项所述的多核苷酸的载体。

11.如权利要求10所述的载体，所述载体包含核苷酸序列SEQ ID No:6。

12.包含权利要求7所述的多核苷酸的转基因细胞。

13.如权利要求12所述的转基因细胞，其中，所述细胞为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞或巴斯德毕赤酵母细胞。

14.如权利要求13所述的转基因细胞，其中，所述细胞为大肠杆菌BL21(DE3)细胞。

15.如权利要求13所述的转基因细胞，其中，所述细胞为哺乳动物293T细胞。

16.如权利要求13所述的转基因细胞，其中，所述细胞为巴斯德毕赤酵母细胞。

17.包含权利要求6所述的蛋白寡聚复合体和/或权利要求10或11所述的载体以及药学上合适的赋形剂的药物组合物。

18.如权利要求17所述的药物组合物，其中，所述药物组合物为疫苗。

19.如权利要求18所述的药物组合物，其中，所述寡聚复合体由五聚体的二聚物组成，其中，各单体由选自于由以下氨基酸序列所组成的组中的氨基酸序列组成：SEQ ID No:3、SEQ ID No:5和SEQ ID No:7。

20.如权利要求19所述的药物组合物，其中，所述寡聚复合体由五聚体的二聚物组成，其中，各单体由氨基酸序列SEQ ID No:5组成。

21.一种生产权利要求1-5中任一项所述的嵌合蛋白或权利要求6所述的蛋白寡聚复合体的方法，其中，所述方法包括：a)在适合表达所述嵌合蛋白的条件下培养权利要求12-16中任一项所述的转基因细胞；以及b)回收所述嵌合蛋白。

22.一种用于生产特异性结合志贺毒素2型的B亚基的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在适于引发针对权利要求6所述的蛋白寡聚复合体的中和抗体的免疫方案下，向非人哺乳动物给予所述蛋白寡聚复合体；

b)从所述非人哺乳动物获得包含所述中和抗体和/或能够生产所述中和抗体的细胞的生物样品；以及

c)将所述生物样品用作所述抗体的来源。

23.如权利要求22所述的方法，其中，步骤b)中获得的所述生物样品包含B细胞，将所述B细胞用于步骤c)中以生产杂交瘤。

24.如权利要求23所述的方法，其中，所述非人哺乳动物为小鼠。

25.如权利要求23所述的方法，其中，所述非人哺乳动物为骆驼科动物。

26.权利要求6所述的寡聚复合体在制备用于降低非人哺乳动物中的肠出血性大肠杆菌的细菌负荷的药物中的用途，所述非人哺乳动物是产志贺毒素大肠杆菌(STEC)血清型的主要储库。

27.如权利要求26所述的用途，其中，所述非人哺乳动物为牛。

28.权利要求10或11所述的载体在制备用于在哺乳动物受试者中诱导针对溶血性尿毒综合征(HUS)的抵抗力的药物中的用途。

29.供在哺乳动物受试者中诱导针对溶血性尿毒综合征(HUS)的抵抗力的方法使用的权利要求18-20中任一项所述的疫苗。

30.权利要求1-5中任一项所述的嵌合蛋白或权利要求6所述的寡聚复合体在制备用于在哺乳动物受试者中诱导针对溶血性尿毒综合征(HUS)的抵抗力的药物中的用途。

31.如权利要求28或30所述的用途，其中，所述受试者为人。

Images