CN116179596A - 长效化重组人白细胞介素2融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

长效化重组人白细胞介素2融合蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116179596A
CN116179596A CN202211028082.1A CN202211028082A CN116179596A CN 116179596 A CN116179596 A CN 116179596A CN 202211028082 A CN202211028082 A CN 202211028082A CN 116179596 A CN116179596 A CN 116179596A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acid
seq
fusion protein
acid sequence
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211028082.1A
Other languages
English (en)
Inventor
李自强
田新生
成健伟
马荣
姜彦静
孙艺萍
张小锐
赵婷婷
张筠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Vdjbio Co ltd
Original Assignee
Beijing Vdjbio Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Vdjbio Co ltd filed Critical Beijing Vdjbio Co ltd
Publication of CN116179596A publication Critical patent/CN116179596A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了白细胞介素2与人血清白蛋白的融合蛋白，通过将带有白细胞介素2与人血清白蛋白融合基因的质粒电转至CHO细胞中，获得稳定、高效表达人源重组蛋白的CHO单克隆细胞株。本发明的单克隆细胞株可分泌表达白细胞介素2与人血清白蛋白的融合蛋白，该融合蛋白可延长人白细胞介素2的血浆半衰期，可用于制备人白细胞介素2类药物或治疗肿瘤、免疫缺陷性疾病等多种疾病的药物。

Description

长效化重组人白细胞介素2融合蛋白及其制备方法和应用
本申请要求申请号为CN2021109823108、申请日为2021年8月25日、发明名称为“长效化重组人白细胞介素2融合蛋白及其制备方法和应用”的中国专利申请的优先权。
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体涉及人白细胞介素2和人血清白蛋白的融合蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
白细胞介素2(IL-2)是T细胞和NK细胞产生的15.5kD糖蛋白，在机体的免疫应答中起重要作用，(人)白细胞介素2((h)IL-2)由133个氨基酸残基组成(SEQ ID NO:1)，有一个链内二硫键和一个位于成熟蛋白第125位氨基酸残基的半胱氨酸，此半胱氨酸易与另外两个半胱氨酸形成错配二硫键，二硫键异常配对的IL-2没有活性。将该半胱氨酸突变为丝氨酸或者丙氨酸可以避免这个问题，而不改变其活性。IL-2主要作用于免疫细胞，包括T细胞、大颗粒淋巴细胞、单核细胞、B细胞，促进细胞增殖和分泌细胞因子。在体内，IL-2有抗肿瘤、抗微生物感染及免疫调节等作用。单独使用或与IFN-α、单克隆抗体、LAK细胞等合用于临床，对肾细胞癌、转移性黑色素瘤和淋巴瘤等有一定的治疗作用，对结肠癌也有疗效，还能提高肿瘤病人对放、化疗的耐受性。目前临床上将其广泛用于肿瘤、病毒性肝炎等的治疗，疗效显著。但上述疾病一般病程较长，因而需长期使用IL-2，而IL-2的血浆半衰期仅为2小时左右，为维持药效需大剂量频繁注射，这不仅大大提高了治疗成本，而且增加了病人的痛苦，增加了副反应。
人们通过构建融合蛋白增加药物分子量的方法来延长药物半衰期。血清白蛋白是血浆的重要成分，也是许多内源因子和外源药物的载体，正常情况下不易透过肾小球。人血清白蛋白(HSA)是一种由585个氨基酸残基组成的蛋白质(SEQ ID NO:2)，其分子量约为66.5KD，血浆半衰期长达2周以上。
专利申请CN104789594A公开了稳定细胞株的3L摇瓶流加培养，其在80mL种子液、密度为4.0×106个细胞/mL的基础上，第3天细胞密度达6.4×106个细胞/mL，第三天后降温细胞密度变化不大，最终蛋白浓度为118mg/L。细胞株的高表达量是近年来生产抗体等生物大分子的基本要求。
因此，需要表达量更高、更长效的人白细胞介素2和血清白蛋白的融合蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供可延长人白细胞介素2血浆半衰期的人白细胞介素2和血清白蛋白的融合蛋白及其编码基因。
为了实现本发明目的，本发明提供长效化重组人白细胞介素2和人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法，利用哺乳动物真核表达系统表达人白细胞介素2和人血清白蛋白的融合蛋白，二者直接连接或者通过连接肽进行连接。
第一方面，本发明提供一种表达系统，所述表达系统表达人白细胞介素2和人血清白蛋白的融合蛋白，所述融合蛋白包括：
人白细胞介素2或其变体，其中所述人白细胞介素2或其变体包括：SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列构成的蛋白；SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的氨基酸序列；或，与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和
人血清白蛋白或其变体，其中所述人血清白蛋白或其变体包括：SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的氨基酸序列；或，与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
本发明所述表达系统为CHO细胞；优选地，所述表达系统为CHO-K1细胞。
本发明意外地发现，当采用CHO细胞时，尤其是采用CHO-K1细胞株时，细胞表达量非常高，可达到4g/L；而且，所表达的融合蛋白具有高活性，可以通过体外对特定的细胞比如NK细胞和/或T细胞有强烈的促进增殖的作用。
在一些实施方案中，所述人白细胞介素2与人血清白蛋白的融合蛋白包括SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列是由133个氨基酸残基组成的人白细胞介素2，SEQID NO:2所示的氨基酸序列是由585个氨基酸残基组成的人血清白蛋白。
在一些实施方案中，所述融合蛋白中，SEQ ID NO:1的第125位氨基酸不是半胱氨酸，优选地，所述第125位氨基酸被取代为丝氨酸或丙氨酸。
在一些实施方案中，所述人白细胞介素2或其变体直接与所述人血清白蛋白或其变体连接，或者所述人白细胞介素2或其变体通过连接肽与所述人血清白蛋白或其变体连接。
在本发明的所述融合蛋白中，为了使所述融合蛋白所包含的两部分之间有较大的间隔，使人细胞介素2部分最大可能的与白细胞介素2受体结合，在人白细胞介素2或其变体与所述人血清白蛋白或其变体之间设有连接肽，优选地，所述连接肽的通式为(GnS)m，n、m分别为1-10的整数；更优选地，n为1-4的整数，m为0-3的整数。
在一些实施方案中，所述融合蛋白的N端带有信号肽；
优选地，所述信号肽为分泌信号肽CD33；更优选地，所述信号肽序列为MPLLLLLPLLWAGALA，如SEQ ID NO:5所示。
在一些实施方案中，所述融合蛋白由SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列编码。
在本发明中，根据NCBI公布的人白细胞介素2和人血清白蛋白的基因序列，按照哺乳动物密码子偏爱性进行基因序列优化，将优化后的融合蛋白的基因序列构建于表达载体上，转染宿主细胞，并在宿主细胞中表达，分离纯化目标蛋白。
本发明优化后的融合蛋白基因序列，在其N端添加信号肽，优选添加分泌信号肽CD33序列，构建到表达载体上，所得载体转染宿主细胞，并在宿主细胞中表达，分离纯化目标蛋白。
本发明中，经优化后，N端带有信号肽，构建到表达载体的基因序列如SEQ ID NO:3所示。
在一些实施方案中，所述人白细胞介素2和人血清白蛋白的融合蛋白具有SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列。
其中，SEQ ID NO:4是由728个氨基酸残基序列组成的蛋白质，其中自氨基端的第1位至第133位为人白细胞介素2的编码序列，自氨基端的第134位至第143位为连接肽的编码序列Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser，自氨基端的第144位至第728位为人血清白蛋白的编码序列。
第二方面，本发明提供所述表达系统在制备用于治疗肿瘤、肝炎、肺炎或免疫缺陷性疾病的药物中的用途。
本发明的有益效果
本发明公开了表达白细胞介素2与人血清白蛋白的融合蛋白的表达系统，通过将带有白细胞介素2与人血清白蛋白融合基因的质粒电转至CHO细胞中，获得稳定、高效表达人源重组蛋白的CHO单克隆细胞株，本发明的单克隆细胞株可分泌表达白细胞介素2与人血清白蛋白的融合蛋白，该融合蛋白可延长人白细胞介素2的血浆半衰期，可用于制备人白细胞介素2类药物或治疗肿瘤、免疫缺陷性疾病等多种疾病的药物。
本发明不仅是通过克隆筛选实现高表达量，在细胞构建中，在优化后的融合蛋白基因序列的N端添加信号肽，这也是表达量高的原因之一。
本发明的细胞株不仅表达量高，可达到4g/L，而且表达的融合蛋白具有高活性，对NK细胞和/或T细胞具有很强的促进增殖的作用。
附图说明
图1示出IL-2-HSA/CHOK1克隆筛选的孔板培养上清还原电泳分析结果，上清上样20μL。
图2：A.示出IL-2-HSA/CHOK1克隆筛选的流加培养D13上清非还原电泳分析结果，上清上样5μL；B.示出各细胞株蛋白表达量。
图3示出IL-2-HSA/CHOK1克隆#9进行单克隆筛选的流加培养D13上清非还原电泳分析结果，上清上样3μL。
图4示出IL-2-HSA/CHOK1克隆#9-6进行单克隆筛选的流加培养D13上清非还原电泳分析结果，上清上样2μL。
图5示出IL-2-HSA/CHOK1细胞培养动力曲线。125mL摇瓶流加培养，初始细胞密度为0.3×106个细胞/mL，初始培养体积为25mL，最大活细胞密度达19.3×106个细胞/mL。
图6示出IL-2-HSA/CHOK1细胞经低密度接种培养工艺得到的上清D7-D13的蛋白表达量动力曲线。
图7示出IL-2-HSA/CHOK1细胞表达上清的非还原电泳分析结果，上清上样1μL。
图8示出IL-2-HSA/CHOK1细胞培养动力曲线。1L摇瓶流加培养，初始细胞密度为2×106个细胞/mL，初始培养体积为300mL，最大活细胞密度达16×106个细胞/mL。
图9示出IL-2-HSA/CHOK1细胞经高密度接种培养工艺得到的上清D0-D10的蛋白表达量动力曲线。
图10示出IL-2-HSA/CHOK1细胞表达上清的非还原电泳分析结果，上清上样5μL。
图11示出IL-2-HSA刺激NK-92增殖的曲线。
图12示出IL-2-HSA刺激CTLL-2增殖的曲线。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明，应该理解的是，本发明实施例仅是用于说明本发明，而不是本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1构建稳转细胞株
转染前一天，将CHO-K1细胞调整密度为0.5×106个细胞/mL。转染当天，准备经线性化处理、高浓度无内毒素的质粒，测定CHO-K1细胞密度及活率，保证细胞活率大于97％。CHO-K1细胞经CD CHO培养基洗涤两次后，配置电转反应体系：700μL细胞悬液+40μg质粒，混匀后转入4mm电极杯中。电极杯放入电转仪，设置电击参数为300V，1000μF，电击一次，将电击后的细胞悬液转入预热新鲜CD CHO培养基中，37℃孵育20min。将孵育后的细胞悬液均匀接种于96孔板中，转染24h后，进行加压，加入含有蛋氨酸亚氨基代砜(MSX)的CD CHO培养基，最终筛选压力为25～50μM MSX，5％CO2，37℃静置培养。
实施例2筛选高表达单克隆细胞株
待96孔板中单克隆长至合适大小后，开始挑选单克隆，将所有克隆转至新的96孔板，5％CO2，37℃静置培养。待孔内细胞长满后，取孔板中的上清进行还原电泳，检测融合蛋白表达情况，选出表达量最高的9个克隆株(见图1)，逐步扩大至摇瓶培养。将9个克隆进行25mL体积的摇瓶流加培养，收获培养上清后进行非还原电泳鉴定(见图2A、2B)，选定表达情况最好的细胞株#9。对细胞株#9通过有限稀释法进行单克隆细胞株筛选，按照0.3个细胞/孔接种96孔板，筛选得到11个高表达细胞株，进行25mL体积的摇瓶流加培养，并对上清进行非还原电泳鉴定(见图3)，选定表达情况最好的细胞株#9-6，对细胞株#9-6通过有限稀释法再次进行单克隆细胞株筛选，筛选得到7个高表达细胞株，进行25mL体积的摇瓶流加培养，对上清进行非还原电泳鉴定(见图4)，选定稳定性好、表达量高的细胞株#9-6-7，作为稳定高表达细胞株IL-2-HSA/CHOK1。将该细胞株(IL-2-HSA/CHOK1#9-6-7)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.45173，保藏日期为2022年5月26日。
实施例3稳定细胞株的125mL摇瓶流加培养
IL-2-HSA/CHOK1细胞开始进行培养表达当天，按0.3×106个细胞/mL接种25mL含25～50μM MSX的基础培养基至125mL摇瓶，此时记为D0，5％CO2，37℃，135rpm摇床培养。接种D4开始进行取样计数，细胞密度达10×106个细胞/mL时，将培养温度降为33℃。D5开始进行流加补料培养基，并控制葡萄糖浓度为3-4g/L。培养D13时，终止培养，收集细胞培养液上清，测定融合蛋白表达量为4.36mg/mL。
IL-2-HSA/CHOK1细胞培养动力曲线见图5。由图5可知，培养前期，细胞处于对数生长阶段，密度增加较快；培养后期，细胞进入蛋白生产阶段，细胞密度趋于稳定。最大活细胞密度达19.3×106个细胞/mL。
IL-2-HSA/CHOK1细胞上清表达量动力曲线见图6。由图6可知，从D7-D13，随着培养天数的增加，细胞蛋白表达量呈递增趋势。D13表达量为4.36mg/mL。
IL-2-HSA/CHOK1细胞表达上清非还原电泳分析见图7。由图7可知，从D7-D13，随着培养天数的增加，细胞蛋白表达量呈递增趋势。目的蛋白条带单一，无杂带。
实施例4稳定细胞株的1L摇瓶流加培养
IL-2-HSA/CHOK1细胞按2×106个细胞/mL密度接种50mL至摇瓶，5％CO2，37℃，135rpm摇床培养。每天取样计数，观察细胞状态，并补加含25～50μM MSX的基础培养基，每天调整细胞密度为2×106个细胞/mL直至细胞培养液体积达到300mL，停止补加基础培养基，继续培养，此时记为D0。每天取样计数，并留取1mL培养上清。待细胞密度达到6×106～7×106个细胞/mL时，将培养温度降为33℃。D2开始进行补料培养基流加培养，并控制葡萄糖浓度为3g/L。培养D10时，终止培养，收集细胞培养液上清，测定D0～D10的上清蛋白表达量。D10收获上清测得融合蛋白表达量为3.12mg/mL。
IL-2-HSA/CHOK1细胞培养动力曲线见图8。由图8可知，培养前期，细胞处于对数生长阶段，密度增加较快；培养后期，细胞进入蛋白生产阶段，细胞密度趋于稳定。最大活细胞密度达16×106个细胞/mL。
IL-2-HSA/CHOK1细胞上清表达量动力曲线见图9。由图9可知，随着培养天数的增加，细胞蛋白表达量呈递增趋势。
IL-2-HSA/CHOK1细胞表达上清非还原电泳分析见图10。由图10可知，随着培养天数的增加，细胞蛋白表达量呈递增趋势。目的蛋白条带单一，无杂带。
与现有技术的摇瓶流加培养相比，本发明的细胞密度、细胞存活率很高，如图8所示，第6-10天细胞密度达14×106～16×106个细胞/mL，而且本发明的细胞蛋白表达量也很高，如图9所示，第10天的表达量为3.12mg/mL。本申请中，细胞密度在14×106～16×106个细胞/mL时，表达量也很高，说明在这样的细胞密度下，细胞活性仍然很好。实施例5融合蛋白的活性实验1：检测IL-2-HSA对NK-92细胞的增殖作用
在本实施例中，利用NK-92细胞(
Figure BDA0003816510630000092
CRL-2407TM，由一位50岁男性恶性非霍奇金淋巴瘤患者的外周血单核细胞衍生而来的IL-2依赖型NK细胞株)评估了IL-2-HSA的生物学活性。
(1)从液氮罐取出一支冻存的NK-92细胞，复苏培养至对数生长期。
(2)离心收集足量细胞，用不含IL-2的完全培养基重悬，饥饿培养24小时。
(3)将饥饿培养的NK-92细胞离心，用不含IL-2的完全培养基重悬，计数；调整细胞密度至5×105个/mL，以每孔90μL体积加入到96孔板中。
(4)样品溶液的制备：用培养基将IL-2-HSA样品和rhIL-2(R&D，货号：202-IL)预稀释至50.67nM，并以4倍梯度稀释成9个浓度。以10μL/well加入到96孔板的相应孔中，每个浓度设三个复孔，阴性对照组相应加入10μL/well培养基，混匀。
(5)于37℃、5％CO2条件下培养72小时后，将融化混匀的MTS检测试剂以20μL/well加入到以上96孔板中，在振荡器中震荡混匀后置于37℃、5％CO2细胞培养箱中继续孵育1～4小时。
(6)孵育结束后，震荡混匀；用酶标仪于490nm波长处测定吸光度。
(7)数据用GraphPad Prism 8软件分析，以药物浓度X的对数值为横坐标，OD490为纵坐标，四参数拟合药物作用曲线。所得的EC50值见表1，增殖曲线见图11。
表1
Figure BDA0003816510630000091
由图11可以看出，IL-2-HSA以剂量依赖性方式诱导NK-92细胞生长。在该实验条件下，IL-2-HSA刺激NK-92增殖的活性优于等摩尔rhIL-2(约4倍左右)。
实施例6融合蛋白的活性实验2：检测IL-2-HSA对CTLL-2细胞的增殖作用
在本实施例中，利用CTLL-2细胞(
Figure BDA0003816510630000101
TIB-214TM，小鼠细胞毒性T淋巴细胞细胞系，IL-2依赖型)评估了IL-2-HSA的生物学活性。
参照中国药典中的人白介素2-生物学活性测定法(CTLL-2细胞/MTT比色法)，CTLL-2细胞以30000个/孔接种于96孔板，加入系列梯度稀释的国家标准品和IL-2-HSA，于37℃、5％CO2条件下培养18～24小时后，加入MTS检测试剂，继续孵育1～4小时，震荡混匀，用酶标仪于490nm波长处测定吸光度。数据用GraphPad Prism 8软件分析，以稀释度X的对数为横坐标，OD490为纵坐标，四参数拟合药物作用曲线，所得的EC50值见表2，增殖曲线见图12。
IL-2-HSA的生物学活性按下式计算：
Figure BDA0003816510630000102
经过计算，IL-2-HSA的比活性为8.38×106IU/mg，与药典规定的IL-2比活性(不低于1×107IU/mg)相当，但二者分子量相差5倍左右，因此IL-2-HSA的比活性更高。
表2
Figure BDA0003816510630000103
本发明列举的实施例仅是本发明优选的技术方案，本发明的保护范围不仅限于上述实施例，如是在本发明的原理条件下进行任何改造及变形，理应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种表达系统，其特征在于，所述表达系统表达人白细胞介素2和人血清白蛋白的融合蛋白，所述融合蛋白包括：
人白细胞介素2或其变体，其中所述人白细胞介素2或其变体包括：SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的氨基酸序列；或，与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和
人血清白蛋白或其变体，其中所述人血清白蛋白或其变体包括：SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的氨基酸序列；或，与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的表达系统，其特征在于，所述表达系统为CHO细胞；优选地，所述表达系统为CHO-K1细胞。
3.根据权利要求1所述的表达系统，其特征在于，所述人白细胞介素2与人血清白蛋白的融合蛋白包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的表达系统，其特征在于，所述融合蛋白中，SEQ ID NO:1的第125位氨基酸不是半胱氨酸；优选地，所述第125位氨基酸被取代为丝氨酸或丙氨酸。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的表达系统，其特征在于，所述人白细胞介素2或其变体直接与所述人血清白蛋白或其变体连接，或者所述人白细胞介素2或其变体通过连接肽与所述人血清白蛋白或其变体连接，
优选地，所述连接肽的通式为(GnS)m，其中n、m分别为1-10的整数；更优选地，n为1-4的整数，m为0-3的整数。
6.根据权利要求1-4任一项所述的表达系统，其特征在于，所述融合蛋白的N端带有信号肽；
优选地，所述信号肽为分泌信号肽CD33。
7.根据权利要求6所述的表达系统，其特征在于，所述信号肽具有SEQ ID NO:5所示的序列。
8.根据权利要求1所述的表达系统，其特征在于，所述融合蛋白由SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列编码。
9.根据权利要求1所述的表达系统，其特征在于，所述人白细胞介素2和人血清白蛋白的融合蛋白具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
10.权利要求1-9任一项所述的表达系统在制备用于治疗肿瘤、肝炎、肺炎或免疫缺陷性疾病的药物中的用途。
CN202211028082.1A 2021-08-25 2022-08-25 长效化重组人白细胞介素2融合蛋白及其制备方法和应用 Pending CN116179596A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2021109823108 2021-08-25
CN202110982310.8A CN113789346A (zh) 2021-08-25 2021-08-25 长效化重组人白细胞介素2融合蛋白及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116179596A true CN116179596A (zh) 2023-05-30

Family

ID=79182127

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110982310.8A Pending CN113789346A (zh) 2021-08-25 2021-08-25 长效化重组人白细胞介素2融合蛋白及其制备方法和应用
CN202280003245.2A Pending CN116075526A (zh) 2021-08-25 2022-07-15 白细胞介素2的融合蛋白及其在ibd中的应用
CN202280003249.0A Pending CN116157420A (zh) 2021-08-25 2022-07-15 白细胞介素2的融合蛋白及其在als中的应用
CN202211028082.1A Pending CN116179596A (zh) 2021-08-25 2022-08-25 长效化重组人白细胞介素2融合蛋白及其制备方法和应用

Family Applications Before (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110982310.8A Pending CN113789346A (zh) 2021-08-25 2021-08-25 长效化重组人白细胞介素2融合蛋白及其制备方法和应用
CN202280003245.2A Pending CN116075526A (zh) 2021-08-25 2022-07-15 白细胞介素2的融合蛋白及其在ibd中的应用
CN202280003249.0A Pending CN116157420A (zh) 2021-08-25 2022-07-15 白细胞介素2的融合蛋白及其在als中的应用

Country Status (5)

Country Link
KR (1) KR20240047459A (zh)
CN (4) CN113789346A (zh)
AU (3) AU2021461372A1 (zh)
CA (3) CA3230023A1 (zh)
WO (3) WO2023024215A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113789346A (zh) * 2021-08-25 2021-12-14 北京伟德杰生物科技有限公司 长效化重组人白细胞介素2融合蛋白及其制备方法和应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100379762C (zh) * 2003-12-08 2008-04-09 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 人血清白蛋白与白细胞介素2的融合蛋白及其编码基因
CN1884520A (zh) * 2006-07-10 2006-12-27 江南大学 人白介素－2与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品
CN101280018A (zh) * 2008-05-23 2008-10-08 江南大学 突变型人白介素-2与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备
WO2014139468A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Admark Healthcare, Llc Fusion protein molecules and method of use
WO2016068428A1 (ko) * 2014-10-30 2016-05-06 순천향대학교 산학협력단 메탄올 자화 효모를 이용한 인터루킨-2 단백질 생산 방법
CN104789594A (zh) 2015-04-27 2015-07-22 江南大学 稳定高效表达人血清白蛋白和白介素ⅱ融合蛋白的cho细胞株的构建方法
US20170204154A1 (en) * 2016-01-20 2017-07-20 Delinia, Inc. Molecules that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases
CN112724259B (zh) * 2020-11-16 2022-12-20 天津林达生物科技有限公司 人血清白蛋白与白介素2的融合蛋白及其用途
CN113789346A (zh) * 2021-08-25 2021-12-14 北京伟德杰生物科技有限公司 长效化重组人白细胞介素2融合蛋白及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023024758A1 (zh) 2023-03-02
AU2022332940A1 (en) 2024-04-11
KR20240047459A (ko) 2024-04-12
AU2022333903A1 (en) 2024-04-11
CN113789346A (zh) 2021-12-14
WO2023024215A1 (zh) 2023-03-02
WO2023024759A1 (zh) 2023-03-02
AU2021461372A1 (en) 2024-04-11
CN116157420A (zh) 2023-05-23
CA3230019A1 (en) 2023-03-02
CA3230014A1 (en) 2023-03-02
CN116075526A (zh) 2023-05-05
CA3230023A1 (en) 2023-03-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105567634A (zh) 一种用于nk细胞体外扩增的培养基及nk细胞体外扩增的方法
US20240075105A1 (en) Fusion Protein of Human Serum Albumin and Interleukin-2, and Use Thereof
CN115466726B (zh) 一种nk细胞的高效基因转导方案
US20240052007A1 (en) Fusion protein containing human interleukin-10 and Fc fragment and medical use thereof
CN116179596A (zh) 长效化重组人白细胞介素2融合蛋白及其制备方法和应用
WO2017071173A1 (zh) 经il-12/cd62l融合蛋白改造的肿瘤治疗剂及其制法和用途
CN112513276B (zh) 蛋白质异二聚体及其用途
CN117343907A (zh) 一种自分泌il7和il21的靶向cdh17的car-t细胞及其应用
CN114250198A (zh) 一种增强免疫细胞抗肿瘤效果的方法
CN117025530B (zh) 用肿瘤坏死因子受体超家族激动剂扩增肿瘤浸润淋巴细胞（til）的方法
KR20220008323A (ko) 면역 세포를 증식하는 il-2 돌연변이 단백질
CN117881704A (zh) 新融合蛋白及其用途
CN112592898B (zh) 一种重编程nk饲养细胞及其制备方法和应用
CN112538462B (zh) 一种用于nk细胞快速扩增的细胞膜及其应用
CN117143815B (zh) 工程化记忆样nk细胞的制备方法及应用
CN117304344B (zh) 一种融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其应用
CN110777115B (zh) 用于促进辅助T细胞产生TNF-α细胞因子的工程化DC细胞及方法
CN113599395B (zh) 含有nk细胞的治疗癌症的药物组合物
CN114645022B (zh) 靶向CD5的CAR-γ δ T细胞及其制备方法与应用
CN107557338A (zh) 特异性识别ny‑eso‑1的t细胞及其与细胞因子的联合的应用
CN113786416B (zh) 转基因的nk细胞在治疗癌症中的用途
CN116970561B (zh) 一种工程化的γδT细胞及其制备方法
CN117143250A (zh) 一种IL-15/IL-15Rα融合基因、载体、工程化脂肪细胞及其制备方法
CN101074266A (zh) 转导肽－人源粒细胞集落刺激因子融合蛋白及其药物组合物
CN117683113A (zh) 表达mIL-15的HER2靶向CAR-NK细胞的制备及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination