BR112015000483B1

BR112015000483B1 - Vacina imunorreguladora ou sensibilizante, kit para preparar a vacina e metodo usado para preparar a vacina para desencadear uma resposta imune do igg

Info

Publication number: BR112015000483B1
Application number: BR112015000483-0A
Authority: BR
Inventors: Geert Mudde
Original assignee: S-Target Therapeutics Gmbh
Priority date: 2012-07-13
Filing date: 2013-07-02
Publication date: 2022-05-17
Also published as: BR112015000483A2; US20150196636A1; US10434170B2; AU2013289372A1; EP2872169B1; WO2014009209A3; CN109806388A; JP6466327B2; JP2015527313A; AU2013289372B2; ES2897793T3; CN104487083A; EP2872169A2; CN109806387A; RU2650709C2; CN109806388B; CN104487083B; RU2014152908A; CN109806387B; CA2878771A1

Abstract

vacina imunorreguladora ou sensibilizante, kit para preparar a vacina e metodo usado para preparar a vacina para desencadear uma resposta imune do igg. a presente invenção refere-se a uma vacina imunoreguladora compreendendo: - um adjuvante direcionado compreendendo pelo menos uma porção anti-cd32 ligada a um ligando tlr9, e uma primeira alfa-hélice peptídica e - um imunógeno com ao menos um epítopo e uma segunda alfa-hélice peptídica enrolada na primeira alfa-hélice, e um kit para a preparação da vacina e uma vacina sensibilizante compreendendo pelo menos uma porção anti-cd32 ligado a um ligando tlr9 uma alfa-hélice peptídica numa formulação farmacêutica.

Description

[001] A invenção refere-se a uma vacina compreendendo um imunorregulador imunogênico e um adjuvante direcionado a ele ligado, desse modo modulando a resposta imunitária ao imunógeno. A invenção refere-se ainda a uma vacina compreendendo uma composição imunogênica compreendendo - um adjuvante direcionado compreendendo pelo menos uma porção anti-CD32 ligada a um ligando TLR9, e - um imunógeno que está ligado ao adjuvante direcionado; para uso no tratamento de um sujeito para desencadear uma resposta imune do IgG transitório direcionada ao imunógeno.

[002] FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

[003] Para doenças imunes, incluindo alergia, câncer e doenças autoimunes, há um papel central de regulação para o equilíbrio imunológico regulado por células Th1 / Th2 / Th17 /Treg e sua aplicação no desenvolvimento de terapias imunológicas novas.

[004] As células Th1, (células T helper tipo 1) são caracterizadas pela produção de citocinas pró-inflamatórias, como IFN-Y, IL-2, e TNF-β. As células Th1 estão envolvidas na imunidade mediada por células. As citocinas produzidas pelas células Th1 estimulam a fagocitose e a destruição de agentes patogênicos microbianos. Várias doenças inflamatórias crônicas têm sido descritos como doenças Th1- dominantes, ou seja, a esclerose múltipla, diabetes e artrite reumatoide.

[005] As células Th2 (células T helper tipo 2) são caracterizadas pela produção de IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 e IL-13. Acredita-se que as células Th2 desempenham um papel nas respostas alérgicas. As citocinas, como IL-4, geralmente estimulam a produção de anticorpos. A IL-5 estimula as respostas dos eosinófilos, também parte da resposta imune. Crê-se que a atopia e alergia sejam condições Th2-dominantes.

[006] O desequilíbrio da imunidade Th1/Th2 or Th17/Treg torna-se a causa de várias doenças imunes.

[007] A alergia é considerada como sendo uma reação de hipersensibilidade às proteínas no ambiente. Alergenos são antígenos para os quais os pacientes atópicos respondem com respostas de anticorpos IgE levando posteriormente a reações alérgicas. Os antígenos nos complexos ou proteínas de fusão podem ser alergenos ambientais (por exemplo, ácaros caseiros, pólen de bétula, pólen de gramíneas, antígenos do gato, antígenos da barata), ou alergenos alimentares (por exemplo, leite de vaca, amendoim, camarão, soja), ou uma combinação de ambos. As moléculas de IgE são importantes por causa de seu papel na ativação de células efetoras (mastócitos, basófilos e eosinófilos). É geralmente aceito que o IgE também desempenha um papel importante na fase de indução de doenças alérgicas, na suprarregulação do potencial dos antígenos de captura de células B e células dendríticas (DC), tanto por meio de baixa afinidade (CD23) quanto por meio dos receptores de alta afinidade (FcεRI). As funções negativas dos anticorpos IgE podem ser neutralizadas pelos anticorpos IgG específicos de alergenos, por exemplo, porque eles direcionam a resposta imunitária das células B para os monócitos e DC e são capazes de regular negativamente a ativação mediada pelo receptor de IgE das células efetoras através de ligação cruzada do FcεRI com o FcYRIIb (CD32b) nessas células. Além disso, elas competem com moléculas de IgE por sítios de ligação de alergenos. As alergias, por conseguinte, podem ser tratadas, curadas e impedidas pela indução de moléculas específicas de alergenos, especialmente a IgG1.

[008] As moléculas de IgG têm uma meia-vida no soro de aproximadamente 3 semanas, em comparação com cerca de 3 dias para moléculas de IgE. As moléculas de IgE são induzidas pela interação entre as células B (naive) e as células Th2 que fornecem IL-4 e IL-13 juntamente com a expressão de CD40L necessária para induzir uma troca de classe para o IgE nas células B da memória e células plasmáticas. Por contraste, as células Th1, que produzem IFN-Y e IL-2, induzem uma mudança de classe para o IgG. Por conseguinte, a indução de respostas Th1, em vez de respostas de células T helper Th2 contra alergenos, é benéfica para a prevenção, tratamento e cura de doenças alérgicas.

[009] Até o momento, várias formas de vacinação ativa usando alergenos são utilizadas. O mais comum é a chamado "imunoterapia", que depende de imunizações frequentes com concentrações relativamente elevadas de alergenos. Esta técnica só é moderadamente eficaz em uma minoria de doenças alérgicas, tais como a alergia ao veneno de abelha e em alguns casos de rinite e conjuntivite, e sua eficácia tem sido recentemente relatada em formas mais suaves de asma e dermatite atópica. Mais recentemente a imunoterapia rápida, onde quantidades crescentes de alergenos são injetadas em um prazo bastante curto, tem sido aplicada com resultados um pouco melhores. Geralmente, a via subcutânea é utilizada para administração dos alergenos, mas, recentemente, essa rota tem sido comparada à aplicação oral ou mesmo local, os resultados são geralmente positivos, mas nem sempre regulares. Uma técnica diferente de imunoterapia é descrito por Saint-Remy (EP0178085 e EP0287361), que faz uso de anticorpos IgG autólogas, que são complexados in vitro com os alérgénos relevantes. Esta técnica permite que quantidades muito pequenas de alergeno sejam aplicadas com menos efeitos colaterais.

[010] O mecanismo por trás dessas terapias não é claro. Na terapia clássica, parece haver um efeito benéfico caso a terapia induza um aumento de anticorpos IgG específicos, embora nem todos os aumentos significativos de IgG específico estejam correlacionados com uma imunoterapia bem sucedida. Um argumento possível sobre por que isso ocorre, é a afinidade relativamente baixa de anticorpos IgG pela CD32 nas células B, monócitos e mastócitos. O método de Saint-Remy seleciona os anticorpos IgG específicos do paciente, que são subsequentemente misturados com alergenos relevantes in vitro. Desta forma, eles asseguram que o alergeno não poderá reagir livremente com as células ou outros isotipos de anticorpos em células tais como o IgE nos mastócitos. Além disso, eles afirmam que anticorpos anti-idiotípicos são criados contra as moléculas de IgG específicas, o que no futuro prevenirá a alergia.

[011] Na WO 97/07218 são descritas Proteínas de Fusão alergeno-anti-CD32. Nessa publicação os problemas com o isolamento de moléculas de IgG específicas e a baixa afinidade destes anticorpos IgG pela CD32 são contornados e os fatores de risco da imunoterapia clássica, que utiliza alergenos de “ligação IgE” completos, são reduzidos. No entanto, a indução reivindicada de respostas de memória Th1 devido ao fato de direcionar unicamente a vacina contendo anti-CD32 às células dendríticas não é comprovada.

[012] A WO2007098934A1 descreve as moléculas capazes de ligar-se ao TLR9 e à CD32 compreendendo no mínimo um epítopo de ao menos um antígeno, sua produção e seu uso como medicamento, especialmente para o tratamento de alergias.

[013] A imunorregulação pode funcionar não apenas no caso das doenças alérgicas, mas também em várias outras doenças.

[014] Melhorar a resposta imune a agentes infecciosos tais como patógenos microbianos é o objetivo da imunoterapia profilática ou anti-infecciosa.

[015] Nas imunoterapias tumorais, há também o objetivo de utilizar células T helper tipo 1 antígeno-específicas tumorais (Th1) além de linfócitos T citotóxicos (CTL).

[016] O câncer, conhecido medicamente como neoplasia maligna, é um amplo grupo de várias doenças, todas envolvendo um crescimento celular desregulado. No câncer, as células dividem-se e crescem descontroladamente, formando tumores malignos, e invadindo partes vizinhas do corpo. O câncer também pode espalhar-se para partes mais distantes do corpo através do sistema linfático ou corrente sanguínea. Nem todos os tumores são cancerosos. Os tumores benignos não crescem descontroladamente, não invadem tecidos vizinhos e não se espalham por todo o corpo. Existem mais de 200 tipos diferentes de câncer conhecidos que acometem os seres humanos.

[017] Determinar o que causa o câncer é complexo. Sabe-se que muitas coisas aumentam o risco de câncer, incluindo o uso de tabaco, certas infecções, radiação, falta de atividade física, obesidade e poluentes ambientais. Eles podem danificar diretamente os genes ou combinar-se com defeitos genéticos existentes dentro das células para provocar a doença. Cerca de cinco a dez por cento dos cânceres são inteiramente hereditários.

[018] O câncer pode ser detectado de várias formas, incluindo a presença de certos sinais e sintomas, testes de triagem, ou imagiologia médica. Quando um possível câncer é detectado, o mesmo é diagnosticado por exame microscópico de uma amostra de tecido. O câncer é normalmente tratado com quimioterapia, radioterapia e cirurgia. As chances de sobrevida da doença variam muito por tipo e localização do câncer e conforme a extensão da doença no início do tratamento. Embora o câncer possa afetar pessoas de todas as idades, e alguns tipos de câncer sejam mais comuns em crianças, o risco de desenvolver câncer geralmente aumenta com a idade. Em 2007, o câncer ocasionou cerca de 13% de todas as mortes humanas em todo o mundo (7,9 milhões). As taxas estão subindo à medida que mais pessoas vivem até uma idade avançada e à medida que mudanças no estilo de vida ocorrem em massa no mundo em desenvolvimento.

[019] Uma vez que o sistema imunológico responde aos fatores ambientais com os quais ele se depara na base da discriminação entre o que é próprio e externo, muitos tipos de células tumorais que surgem como resultado do aparecimento do câncer são mais ou menos tolerados pelo próprio sistema imunitário do paciente, visto que as células tumorais são, essencialmente, as próprias células do paciente que estão crescendo, dividindo-se e difundindo-se sem um controle regulador adequado.

[020] Tolerância imunológica ou tolerância imunitária é o processo pelo qual o sistema imunológico não ataca um antígeno. Na autotolerância ou tolerância natural, o organismo não organiza uma resposta imunitária aos autoantígenos. Ela ocorre em três formas: tolerância central, tolerância periférica e tolerância adquirida.

[021] Tolerância central1:

[022] A tolerância central ocorre durante o desenvolvimento de linfócitos e ocorre na medula óssea e o timo. Aqui, linfócitos T e B que reconhecem os autoantígenos são excluídos antes que se transformem completamente em células imunocompetentes, evitando a autoimunidade. Esse processo é mais ativo na vida fetal, mas continua por toda a vida à medida que linfócitos imaturos são gerados.

[023] Tolerância periférica2:

[024] A tolerância periférica é a tolerância imunológica desenvolvida após as células T e B amadurecerem e entrarem na periferia. As células T que deixam o timo são relativamente porém não totalmente seguras. Algumas terão receptores (TCRs) que podem responder aos autoantígenos que estão presentes em concentração tão elevada que podem ligar-se a receptores “fracos” que a célula T não encontrou no timo (tais como moléculas específicas de tecidos, como aquelas nas ilhotas de Langerhans, no cérebro ou na coluna espinhal). Essas células T autorreativas que escapam da seleção negativa intratímica no timo podem infligir dano celular, a menos que tenham sido apagadas ou efetivamente amordaçados no tecido periférico. Vários mecanismos de feedback para silenciar essas células T potencialmente autorrreativas são conhecidos. Eles incluem o seguinte: Anergia, Morte celular induzida por ativação e Supressão periférica.

[025] Tolerância adquirida ou induzida3:

[026] A tolerância adquirida ou induzida refere-se à adaptação do sistema imunitário a antígenos externos caracterizados por uma não-reatividade específica dos tecidos linfoides para um dado antígeno, que noutras circunstâncias provavelmente induziriam a imunidade humoral ou mediada por células. Uma das formas naturais mais importantes de tolerância adquirida é a tolerância imunológica na gravidez, em que o feto e a placenta devem ser tolerados pelo sistema imune materno.

[027] Imunoterapia voltada para antígenos associados a tumores:

[028] A imunoterapia do câncer consiste na utilização do sistema imunitário para rejeitar a doença. A premissa principal é estimular o sistema imunitário do doente para atacar as células tumorais malignas que são responsáveis pela doença. Isto pode ser feito quer através de imunização ativa do paciente (por exemplo, por administração de uma vacina contra o câncer celular, tais como Provenge, Dendreon, Seattle, Washington, US)4, caso no qual o próprio sistema imunológico do paciente é treinado para reconhecer células tumorais como alvos a serem destruídos, ou através da administração de anticorpos terapêuticos como drogas, caso em que o sistema imunitário do paciente é recrutado para destruir células tumorais por meio de anticorpos terapêuticos. Outra abordagem para ativar o sistema imunitário do paciente contra tumores é a utilização dos chamados antígenos associados a tumores (TAA 's), os quais são autoproteínas que são, de certa forma, expressas em células normais saudáveis, mas superexpressas em células tumorais ou compreendem hormônios celulares /fatores de crescimento com os quais as células tumorais proliferam5. Estes TAAs são formulados e apresentados ao organismo de uma forma imunogênica de tal modo que o sistema imunitário acaba construindo uma resposta apesar do fato de que estas proteínas são do próprio paciente. Obviamente, esta abordagem só será útil para TAAs contra os quais o paciente desenvolveu tolerância periférica ou adquirida. Quando as células T e B que reconhecem o TAA são excluídas do repertório imunológico, a imunoterapia ativa do câncer não é uma opção.

[029] Gastrina:

[030] Um exemplo de um autoantígeno (fator de crescimento /hormônio) que pode ser utilizado como alvo para o tratamento de cânceres gastrointestinais tais como o do pâncreas é a pequena gastrina (G17)6-9. Além disso, a neutralização de G17 pode também ser benéfica em qualquer a doença relacionada com a gastrina, incluindo úlceras gástricas, e doença do refluxo gastroesofágico (GERD)10, uma vez que o pH do estômago é regulado pela gastrina, e para a insuficiência renal de fase terminal (ESRF)11, uma vez que a gastrina circula em concentrações superiores às normais em pacientes com ESRF.

[031] A US5023077 descreve composições e métodos para o tratamento e prevenção da doença gástrica e úlcera duodenal, cujas composições imunogênicas, são baseadas em peptídeos de gastrina, os quais são acoplados a um carreador imunogênico, tal como o toxoide da difteria, o toxoide do tétano, a hemocianina de lapa californiana ou albumina de soro bovino.

[032] A gastrina tem várias funções importantes no trato gastrointestinal, os dois mais importantes sendo a estimulação da secreção de ácido e estimulação do crescimento de células no trato gastrointestinal. O hormônio existe em pelo menos duas formas moleculares, heptadecagastrina, a assim chamada gastrina ("G17"), e tetratriacontagastrin ("G34"), denominadas de acordo com o número de resíduos de aminoácidos ("AA") em cada molécula, em que o G17 constitui os resíduos do amino-terminal 17 ("N-terminal") da G34.

[033] A US5609870 descreve a preparação de um imunógeno anti-G17 que cria os anticorpos num mamífero contra sua própria G17, que não reagem com G34 compreendendo a conjugação de um peptídeo que consiste numa sequência que corresponde a um fragmento da sequência de aminoácidos N-terminal de G17 até o resíduo de aminoácido número 12 pela sua extremidade C-terminal até um peptídeo espaçador que é conjugado com um carreador imunogênico, tal como o toxoide da difteria, o toxoide do tétano, hemocianina da lapa californiana, e albumina de soro bovino.

[034] Equilíbrio imunitário:

[035] O equilíbrio imunológico regulado por células Th1 / Th2 / Th17 / Treg desempenha um papel significativo no desenvolvimento de terapias imunológicas.

[036] Em doenças autoimunes existe a necessidade de regular o desequilíbrio de Th1 / Th2 / Th17 / Treg, ou seja, em condições em que o sistema imunitário ataca o tecido do próprio organismo.

[037] O papel do TLR9:

[038] Os receptores do tipo Toll (TLRs) são uma classe de proteínas que desempenham um papel chave no sistema imune inato. Eles são receptores simples não-catalíticos, que atravessam a membrana, sendo normalmente expressos na superfície da célula e no compartimento endocítico de células sentinela, tais como macrófagos e células dendríticas. Os TLRs reconhecem padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) e moléculas derivadas de micróbios estruturalmente conservadas e iniciam a sinalização para induzir a produção das citocinas necessárias para a imunidade inata e imunidade adaptativa subsequente.

[039] Os vários TLRs exibem diferentes padrões de expressão. Esse gene é preferencialmente expresso em tecidos ricos em células imunológicas, como o baço, linfonodos, medula óssea e leucócitos do sangue periférico.

[040] Treze TLRs (denominados simplesmente de TLR1 a TLR13) foram identificados em seres humanos e camundongos em conjunto, e formas equivalentes de muitos destes têm sido encontradas em outras espécies de mamíferos. No entanto, nem todos os receptores TLR em camundongos são também encontrados em seres humanos ou vice-versa. Além disso, o ligando e a função não são conhecidos para todos os receptores TLR, por exemplo, o TLR10 é um receptor órfão com função desconhecida.

[041] A ativação dos receptores TLR tem sido utilizada para o tratamento de várias doenças, por exemplo, a ativação de TLR9 por produtos farmacêuticos tem mostrado ser benéfica no tratamento da alergia e na oncologia. Estudos em ratinhos e humanos indicam que os ligandos naturais de TLR9 são sequências de CpG não metiladas em moléculas de DNA. Sítios de CpG são relativamente raros (~ 1%) em genomas de vertebrados em comparação com genomas bacterianos ou DNA viral. TLR9 é expresso por numerosas células do sistema imunitário, tais como células dendríticas, linfócitos B, monócitos e células assassinas naturais (NK). Contudo, em seres humanos saudáveis, a expressão de TLR9 está restrita às células dendríticas plasmocitoides (PDCs) e células B. A expressão é intracelular, no interior dos compartimentos endossomais e funciona para alertar o sistema imunológico de infecções virais e bacterianas através da ligação ao DNA rico em motivos CpG. No entanto, sob condições patológicas, a expressão de TLR9 tem sido relatada também na superfície celular12-14.

[042] Muitas moléculas agonistas sintéticas de TLR9 têm sido relatadas. Os ligandos agonistas (ativação do TLR9) são classificados em três grupos:

[043] O grupo que consiste em CpG classe A, em particular, os oligodesoxinucleotídeos (ODN) CpG-A (D)15, também conhecidos como ODN tipo "D". Tais agonistas TLR9 induzem uma forte indução de IFNa e maturação de células dendríticas, e são aqui chamados de ligando TLR9 de "grupo 1". Um exemplo é o ODN221616: GGGGGACGATCGTCGGGGGG (SEQ ID 48)

[044] O grupo que consiste em CpG classe B, em particular, os oligodesoxinucleotídeos (ODN) CpG-B (D)17, também conhecidos como ODN tipo "K". Tais agonistas TLR9 induzem uma indução fraca de IFNa e maturação de células dendríticas, e são aqui chamados de ligando TLR9 de "grupo 2". Um exemplo é o ODN200618;19: TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID 49)

[045] O grupo que consiste em CpG classe C, em particular, os oligodesoxinucleotídeos (ODN) CpG-C 20. Tais agonistas TLR9 induzem IFNa e a maturação de células dendríticas imaturas, e são aqui chamados de ligando TLR9 de "grupo 3". Um exemplo é o ODNM36221: TCGTCGTCGTTCGAACGACGTTGAT (SEQ ID 69)

[046] Todos os ligandos para o TLR9 descritos até agora são baseados em nucleotídeos. Embora anticorpos específicos para TLR9 sejam relatados e utilizados para demonstrar a presença e localização do receptor, essas moléculas não foram descritas como ligandos para o TLR9, não havia qualquer relato de ativação do TLR9 ou atividade inibitória.

[047] O papel de CD32:

[048] CD32 é fortemente expresso em monócitos /células dendríticas e células B e, assim, estas moléculas são concebidas para dirigir a resposta imune a estas células imunológicas importantes, com a intenção de impedir a apresentação de antígenos pelas células B, enquanto promovem a apresentação de antígenos pelas células dendríticas especialmente (DCs), a segunda conduz a indução de respostas Th1 contra o antígeno, quando suficientemente estimulado. Há pelo menos dois tipos de DCs: mieloides (mDC) e células dendríticas plasmocitoides (pDC), o que levou ao novo conceito de células DC1 e DC2. Neste conceito as células DC1 promovem a indução do desenvolvimento de células Th1 após a estimulação específica do antígeno e as células DC2 sustentam o desenvolvimento de células Th2. DC (ou mDC) derivados de monócitos são geralmente considerados como sendo do tipo DC1, enquanto os pDC são considerados como sendo do tipo DC2. Ambos os tipos de DC expressam CD32a e induzirão uma resposta de células T antígeno-específica; no entanto, não é garantido que o resultado será do tipo Th1. Na verdade, em doadores alérgicos, respostas Th2 são mais prováveis. É importante notar que o pDC expressa o receptor TLR9, que se liga aos ODN CpG (oligodesoxinucleotídeos (ODNs) contendo motivos CpG não metilados). A ativação deste receptor no pDC conduz a uma forte produção de IFN-alfa e IL-12, que promove a indução de Th1 e, assim, transforma o potencial DC2 em células DC1.

[049] Por conseguinte, essas moléculas podem combinar a ativação do receptor TLR9 no pDC com a estimulação específica e a indução de células Th1 antígeno-específicas.

[050] Em imunoterapias tumorais não é o objetivo específico utilizar células T helper de tipo 1 antígeno-específicas tumorais (Th1), além de linfócitos T citotóxicos (CTL).

[051] Espirais Enroladas (Coiled Coils):

[052] As espirais enroladas são constituídas por motivos estruturais em proteínas, em que 2-7 alfa-hélices são enroladas em conjunto como os fios de uma corda; dímeros e trímeros são os tipos mais comuns. As hélices em espiral têm sido utilizadas para estabilizar os fragmentos de anticorpos Fv resultando em domínios coiled coil heterodiméricos22.

[053] A estabilidade e a estrutura dobrada das moléculas proteicas complexas é crucial na concepção dos imunógeno s. É, portanto, o objeto da presente invenção proporcionar uma vacina com uma melhor estabilidade e estrutura para regular a resposta imune a imunógenos específicos.

[054] Existe ainda a necessidade de proporcionar imunoterapias aprimoradas dirigidas à gastrina e doenças dependentes da gastrina. É, portanto, o objeto da presente invenção proporcionar uma vacina com melhor imunogenicidade, estabilidade e estrutura para regular a resposta imune a epítopos específicos da gastrina.

[055] RESUMO DA INVENÇÃO

[056] O objeto é resolvido pelo tema conforme reivindicado.

[057] De acordo com a invenção, é fornecida uma vacina imunorregulatória compreendendo: - um adjuvante direcionado compreendendo pelo menos uma porção anti- CD32 ligada a um ligando TLR9 e uma primeira alfa-hélice peptídica, e - um imunógeno com, pelo menos, um epítopo peptídico e uma segunda alfa- hélice enrolada na primeira alfa-hélice.

[058] Especificamente, o epítopo é uma célula T e/ou epítope de célula B.

[059] De acordo com um aspecto específico da invenção, cada uma das referidas primeira e segunda alfa-hélices compreende 3-5 repetições de aminoácidos de um motivo de aminoácidos, ligando-se especificamente uma a outra com um Kd inferior a 10-6 M, de preferência com um Kd inferior a 10-7 M, mais preferivelmente inferior a 10-8 M ou 10-9 M.

[060] De acordo com um aspecto específico adicional da invenção, a referida porção anti-CD32 é selecionada a partir do grupo que consiste num anticorpo anti- CD32, um fragmento de anticorpo e um peptídeo, de preferência tendo como alvo a CD32a. O fragmento de anticorpo pode, por exemplo, ser especificamente um fragmento Fab, Fv, scFv, dAb, F (ab)2 ou Fcab, ou qualquer outra entidade ligante possível, desde que se ligue especificamente ao receptor e seja internalizado após a ligação.

[061] De acordo com outro aspecto da invenção, o ligando TLR9 é um agonista TLR9 selecionado a partir do grupo que consiste no CpG classe A, em particular, oligodesoxinucleotídeos (ODN) CpG-A (D) 23, também conhecidos como ODN do tipo "D". Tais agonistas TLR9 induzem uma forte indução de IFNa e maturação mínima de células dendríticas, e são aqui chamados de ligando TLR9 de "grupo 1".

[062] De acordo com outro aspecto da invenção, o ligando TLR9 é um agonista TLR9 selecionado a partir do grupo que consiste no CpG classe B, em particular, oligodesoxinucleotídeos (ODN) CpG-B (K) 24, também conhecidos como ODN do tipo "K". Tais agonistas TLR9 induzem uma indução fraca de IFNa e maturação das células dendríticas, e são aqui chamados de ligando TLR9 de "grupo 2".

[063] De acordo com outro aspecto da invenção, o referido ligando TLR9 é especificamente um agonista TLR9 selecionado a partir do grupo que consiste no CpG classe C, também conhecido como oligodesoxinucleotídeos (ODN) CpG-C 25,26. Tais agonistas TLR9 induzem o IFNa e a maturação de células dendríticas imaturas, e são aqui chamados de ligando TLR9 de "grupo 3".

[064] De acordo com outro aspecto da invenção, o referido ligando TLR9 é especificamente um peptídeo imunoestimulante que imita qualquer um dos oligodesoxinucleotídeos CpG classe A, B ou C, isto é, um peptídeo que se liga especificamente ao TLR9 com função agonista e de ativação.

[065] De acordo com outro aspecto da invenção, o ligando TLR9 é um antagonista TLR9 selecionado a partir do grupo que consiste em ODNs27,28 inibitórios; (algumas vezes chamados de CPGs inibitórios), por exemplo, aqueles que contêm o motivo inibitório consistindo em CCx (não-C) (não-C) xxGGG (x = qualquer base)29. Os ODNs inibitórios específicos provaram não induzir o IFNa nem a maturação de células dendríticas, também bloqueando a ativação através de um agonista TLR9.

[066] Tal agonista ou antagonista TLR9 pode ser determinado num ensaio adequado à base de células que mede a expressão estável de um dos IFNa, ou, pelo menos, um dos marcadores CD80, CD83 e CD86, que refletem a maturação das células dendríticas (DC) imaturas. Para este fim, as células dendríticas plasmocitoides (PDCs) são purificadas a partir do sangue de um doador saudável, tal como descrito por Tel et al.30 e subsequentemente incubadas com a concentração apropriada do ligando TLR9. Após 24 h o IFNa é medido no sobrenadante utilizando protocolos padrão de ELISA. Para a determinação do estado de maturação das células, as pDCs são coradas para a expressão de CD80, CD83 ou CD86, utilizando procedimentos padrão FACS com anticorpos específicos, disponíveis comercialmente, antes e após a incubação com o ligando TLR9.

[067] A indução de IFNa pode ser determinada pelo nível de expressão de IFNa e o respectivo aumento em relação a um nível de referência. O aumento em relação a células não-estimuladas pode ser comparado com os níveis de indução induzidos por referências estabelecidas para cada tipo de CpG conforme definido pelo ligando TLR9 de grupo 1, 2 ou 3 e é tipicamente entre 30% e 300% da respectiva referência, de preferência pelo menos 100%, mais preferivelmente pelo menos 120%, pelo menos 150%, pelo menos, 200% ou pelo menos 250%.

[068] A maturação de células dendríticas imaturas pode ser determinada pelo nível de expressão de qualquer um dos marcadores CD80, CD83 e CD86. O respectivo aumento em relação a células não-estimuladas pode ser comparado com os níveis de indução induzidos por referências estabelecidas para cada tipo de CpG como definido pelo ligando TLR9 de grupo 1, 2 ou 3 e é tipicamente entre 30% e 300% da respectivo referência, de preferência pelo menos 100%, mais preferivelmente pelo menos 120%, pelo menos 150%, pelo menos 200% ou pelo menos 250%.

[069] Especificamente, o agonista TLR9 de grupo 1 e 3 iria resultar num aumento da expressão de IFNa e um agonista TRL9 de grupo 2 e 3 conduziria a um aumento da expressão de qualquer um dos fatores de maturação de células dendríticas CD80, CD83 e CD86. O antagonista TLR9 resultaria numa redução da expressão do IFNa e uma redução da expressão de qualquer um dos fatores de maturação de células dendríticas CD80, CD83 e CD86, mesmo na presença de um agonista TLR9 do grupo 1 ou 3.

[070] De acordo com uma realização específica da invenção, o imunógeno deriva tanto de - um antígeno associado a um tumor, para uso na imunoterapia do câncer, ou - um patógeno para uso na imunoterapia de doenças infecciosas, ou - um alergeno para uso na imunoterapia de doenças alérgicas

[071] Tal vacina é tipicamente uma vacina imunoestimulante, por exemplo, estimulando a resposta imune humoral e das células T (Th1).

[072] Esta forma de incorporação de uma vacina imunoestimulante emprega especificamente um ligando TLR9 que é um agonista TLR9. Neste caso, a vacina induz predominantemente respostas Th1 contra o imunógeno.

[073] Especificamente a referida fração anti-CD32 tem como alvo o CD32a, de preferência com uma elevada afinidade de Kd < 10-6 M,, mais preferivelmente inferior a 10-7 M ou inferior a 10-8 M.

[074] Mais especificamente a referida porção anti-CD32 é um aglutinante de CD32a específico ou seletivo, ou seja, não tem como alvo o CD32b ou visa ao CD32b com uma baixa afinidade de Kd> 10-6 M, de preferência superior a 10-5 M, mais preferivelmente superior a 10-4 M. O diferencial de afinidade de ligação ao CD32a e CD32b é de preferência pelo menos de 1 log, mais preferivelmente pelo menos 2 logs ou pelo menos 3 logs, ou uma maior diferença no valor de Kd.

[075] A alta afinidade especificamente preferida ou a elevada afinidade diferencial da porção anti-CD32 de ligar-se ao CD32a, ao invés de ao CD32b, é tipicamente utilizada numa vacina imunoestimulante, também empregando o agonista TLR9. Prefere-se ainda que tal vacina empregue um imunógeno selecionado a partir de uma série de alvos oncológicos ou alvos patogênicos, onde uma resposta Th1 e anticorpos IgG específicos são necessários para combater eficazmente as doenças.

[076] De acordo com uma forma de incorporação alternativa, a referida porção anti-CD32 é dirigido tanto ao CD32a quanto ao CD32b, com uma elevada afinidade de Kd < 10-6 M, de preferência uma afinidade maior do que 10-7 M, mais preferivelmente uma afinidade maior do que 10-8 M. A alta afinidade especificamente preferida da porção anti-CD32 de ligar-se tanto ao CD32a quanto ao CD32b é tipicamente utilizada numa vacina que emprega também o agonista TLR9. Prefere- se ainda que tal vacina empregue um imunógeno selecionado a partir de uma série de alvos de alergia, onde se obtém o redirecionamento da resposta Th2 para obter uma resposta Th1. Tipicamente, não se preferem anticorpos contra a própria vacina. Além disso, prefere-se uma vacina específica que se ligue ao CD32b com aproximadamente a mesma afinidade para com o CD32a.

[077] A afinidade de ligação da porção anti-CD32 especificamente dirigida ao CD32a ou CD32b, ou ambos, CD32a e CD32b, pode ser determinada num ensaio adequado, tal como um ELISA típico utilizando formas recombinantes marcadas com HIS e comercialmente disponíveis de CD32a e CD32b, revestidas com placas Ni- NTA de ELISA, por exemplo, placas Ni-NTA HisSorb (Qiagen, Áustria). As porções anti-CD32 podem ser biotiniladas e, como tal, podem ser detectadas utilizando estreptavidina-HRP ou estreptavidina AP e os substratos apropriados. Como alternativa, as porções podem ser testadas num ensaio FACS utilizando células U937 (por exemplo, ATCC: CRL 1593) que expressam CD32a, mas não CD32b e células B transformadas por EBV, por exemplo, CFB4:2 como descrito por van Reijsen et al31, que expressam CD32b e não CD32a.

[078] De acordo com outra incorporação da invenção, o imunógeno deriva tanto de - um alergeno para uso na imunoterapia de doenças alérgicas, ou - um autoantígeno humano para uso na imunoterapia de doenças autoimunes.

[079] Essa vacina para utilização na doença autoimune é tipicamente uma vacina de imunotolerância, por exemplo, induzindo a tolerância de células T contra o imunógeno pelas células T reguladoras e modulando negativamente a resposta imune humoral.

[080] Esta forma de incorporação de uma imunotolerância emprega especificamente um ligando TLR9 que é um agonista TLR9 de grupo 1 ou é um antagonista TLR9. Neste caso, a vacina predominantemente regularia de forma negativa as respostas Th1 /2/17 contra o imunógeno, mas ativaria as células Treg.

[081] Esta vacina para utilização na alergia pode ser: - uma vacina de imunotolerância, por exemplo, induzindo a tolerância da célula T contra o imunógeno pelas células T reguladoras e modulando negativamente a resposta imune humoral, empregando um ligando TLR9 que é um agonista TLR9 de grupo 1 ou um antagonista TLR9. Nesse caso, a vacina predominantemente regularia de forma negativa as respostas Th1/2/17contra o imunógeno, mas ativaria as células Treg; ou - uma vacina autoestimulante induzindo respostas Th1 contra o imunógeno enquanto que se previne a resposta imune humoral contra a vacina, empregando um ligando TLR9 que é um agonista TLR9 de grupo 3.

[082] De acordo com esta forma de incorporação de uma vacina para a imunotolerância, a referida porção anti-CD32 é especificamente dirigida para CD32b ou para o CD32A e CD32b, com uma elevada afinidade de Kd < 10-6 M, de preferência uma maior afinidade com um Kd <10-7 M, mais preferivelmente Kd <10-8 M. Prefere-se que a porção anti-CD32 seja especificamente dirigida tanto para o CD32a quanto para o CD32b.

[083] Também para a vacina imunoestimulante para utilização na alergia, a referida porção anti-CD32 é especificamente dirigida ao CD32a e CD32b, com uma elevada afinidade de Kd < 10-6 M, preferencialmente com uma afinidade mais elevada, por exemplo, um Kd < 10-7 M, mais preferivelmente Kd <10-8 M. Prefere--se que a porção anti-CD32 seja especificamente dirigida tanto para CD32a quanto CD32b.

[084] Especificamente, proporciona-se uma vacina de acordo com a invenção, em que o referido imunógeno é derivado de um alergeno para utilização na imunoterapia de doenças alérgicas em que a referida porção anti-CD32 é direcionada para CD32a e CD32b.

[085] As incorporações específicas da invenção podem ser descritas a partir da tabela a seguir, indicando a seleção da porção anti-CD32 de acordo com sua especificidade e afinidade de ligação com CD32a e/ou CD32b, o tipo de ligando TLR9 e o tipo de imunógeno. Tabela 1: Formas de incorporação específicas:

[086] As colunas 2 e 3 referem-se à seletividade e/ou afinidade da porção anti- CD32 ligando-se ao CD32a ou CD32b: CD32a >> CD32b significando uma ligação seletiva ao CD32a (diferença na afinidade de ligação/Kd de no mínimo 1 log); CD32b = CD32a significando ligação tanto ao CD32a quanto CD32b mais ou menos no mesmo grau (diferença na afinidade de ligação/Kd inferior a 1 log).

[087] Particularmente, ao se proporcionar uma vacina antialergia, ou seja, uma vacina de imunotolerância para o tratamento de doenças alérgicas, ou uma vacina contra a doença autoimune, ou seja, uma vacina de imunotolerância para o tratamento de doenças autoimunes, a porção anti-CD32 é especificamente dirigida tanto para o CD32A quanto CD32b com cerca da mesma afinidade elevada, por exemplo, uma afinidade diferencial de se ligar a cada um dos alvos CD32A e CD32b com menos do que 2 logs, de preferência uma diferença inferior a 1 log nos valores de Kd.

[088] De acordo com a invenção, é fornecida também uma composição imunogênica compreendendo a. um adjuvante direcionado compreendendo ao menos uma porção anti- CD32 ligada a um ligando TLR9 e uma primeira alfa-hélice peptídica; e b. um imunógeno peptídico gastrina-17 ligado a uma segunda alfa-hélice peptídica enrolada na primeira alfa-hélice, cujo imunógeno peptídico é (i) a gastrina-17 humana compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID 78, ou um fragmento da mesma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID 79, ou ao menos os 4 aminoácidos N-terminais de SEQ ID 79; (ii) um análogo de (i), preferivelmente do macaco rhesus ou de origem murina; e/ou (iii) uma variante funcionalmente ativa de (i) ou (ii), com um, dois, três ou quatro mutações de ponto na sequência de aminoácidos de SEQ ID 79.

[089] Especificamente, o referido imunógeno peptídico é um peptídeo linear compreendendo ou consistindo em (i) uma sequência de aminoácidos de SEQ ID 80, preferivelmente SEQ ID 81; (ii) uma sequência de aminoácidos de SEQ ID 82, preferivelmente SEQ ID 83; (iii) uma sequência de aminoácidos de SEQ ID 84, preferivelmente SEQ ID 85; ou (iv) uma sequência de aminoácidos de SEQ ID 79 ou 86.

[090] Prefere-se que a composição imunogênica da invenção compreenda ao menos dois dos imunógenos peptídicos ligados à segunda alfa-hélice peptídica, preferivelmente 2, 3 ou 4 dos imunógenos peptídicos.

[091] Quando mais do que um imunógeno peptídico é ligado à segunda alfa- hélice, os imunógenos peptídicos podem, por exemplo, ser conjugados com a alfa- hélice consecutivamente, ou seja, ligando os imunógenos peptídicos numa fila, por exemplo, ligando o C-terminal de um primeiro imunógeno peptídico ao N-terminal de um segundo imunógeno peptídico, cujos primeiro e segundo imunógenos peptídicos são idênticos ou diferentes uns dos outros.

[092] Alternativamente, ou adicionalmente, outros imunógenos peptídicos podem ser incorporados na composição imunogênica da invenção através de ligação cruzada, por exemplo, dois ou mais imunógenos peptídicos, que são idênticos ou diferentes um do outro, estão ligados à mesma alfa-hélice por reação química, tal como uma ligação cruzada química permitindo o estabelecimento de ligações cruzadas intermoleculares, por exemplo, com reagentes homobifuncionais tais como o dimetil adipimidato (DMA), dimetil suberimidato (DMS), ou glutaraldeído. Por exemplo, essa ligação cruzada pode ser realizada empregando a ligação cruzada com glutaraldeído por meio de grupos de lisina livres da alfa-hélice ou um espaçador/conector, respectivamente. Dessa forma, dois ou mais imunógenos peptídicos conforme utilizados de acordo com a invenção são acoplados à alfa- hélice paralelamente ou lado a lado.

[093] De acordo com um aspecto específico adicional da invenção, a composição imunogênica compreende uma ou mais sequências ligantes, preferencialmente compostas por glicina e /ou serina e /ou resíduos de lisina, de preferência uma sequência de aminoácidos de SEQ ID 89 ou 90. As sequências de ligação podem ser de cadeia linear ou ramificada, por exemplo, para proporcionar ligação ou reticulação entre duas ou mais entidades peptídicas ou polipeptídicas.

[094] De acordo com um aspecto específico adicional da invenção, a composição imunogênica compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID 87 ou SEQ ID 88.

[095] De acordo com a invenção, é ainda proporcionada uma vacina que compreende a composição imunogênica da invenção, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Essa vacina é geralmente uma vacina imunoestimulante, por exemplo, estimulando a resposta imune das células T (Th1) e humoral (Th1).

[096] De acordo com uma forma de incorporação preferida, a resposta imune humoral e de células T (Th1) é transitória, por exemplo, com um título máximo de IgG específico induzido por vacinação que é normalmente alcançado dentro de um período de 2 a 8 semanas, mediante vacinação, seguido por uma redução de título de pelo menos 30%, de preferência pelo menos 40%, ou, pelo menos, 50%, ou pelo menos 60%, ou, pelo menos, 70%, ou, pelo menos, 80%, ou, pelo menos, 90%, ou até 100%, dentro de 6 meses desde a vacinação, de preferência dentro de 5 meses, ou dentro de 4 meses, ou até 3 meses, ou dentro 2 meses. Esse título reduzido pode ser novamente aumentado a partir de uma injeção de reforço. Em uma série de vacinação, a resposta imunológica transitória é possivelmente determinada a partir da última injeção da composição imunogênica ou vacina. A resposta imune transiente tem a vantagem de um tratamento controlado com, por exemplo, a possibilidade de se interromper ou suspender o tratamento, caso necessário.

[097] A invenção particularmente fornece uma vacina compreendendo uma composição imunogênica que inclui - um adjuvante direcionado compreendendo pelo menos uma porção anti-CD32 ligada a um ligando TLR9, e - um imunógeno, que é ligado ao adjuvante direcionado, preferencialmente por ligação ou afinidade de ligação; por exemplo fusão pelas tecnologias de DNA recombinante ou quimicamente conjugado. para uso no tratamento de um sujeito para desencadear uma resposta imune IgG dirigida para o imunógeno que é transiente, de preferência com um título de IgG específico máximo induzido por vacinação que é normalmente alcançado dentro de um período de 2 a 8 semanas, após a vacinação, seguido por uma redução do título de, pelo menos, 30%, de preferência pelo menos 40%, ou, pelo menos, 50%, ou, pelo menos, 60%, ou, pelo menos, 70%, ou, pelo menos, 80%, ou, pelo menos, 90%, ou até 100%, dentro de 6 meses depois da vacinação, por exemplo, após a última vacinação, em uma série de vacinações.

[098] Essa vacina é de preferência usada com um imunógeno que é ou compreende um antígeno ou epítopo de um autoantígeno, por exemplo, selecionado a partir do grupo consistindo de um antígeno associado a um tumor (TAA), preferivelmente um receptor da superfície da célula tumoral ou um antígeno solúvel produzido pela célula tumoral, tais como o Her2 /neu, gastrina, interferon alfa (INFα), fator de crescimento epidérmico (EGF), receptor de EGF (EGF-R), molécula de adesão da célula epitelial (EpCAM), alfa-fetoproteína (AFP), antígeno carcinoembrionário (CEA), MUC-1 ou LewisY, pré-hormônios e hormônios, tais como qualquer dos hormônios digestivos, incluindo secretina ou insulina , hormônios da tireoide, ou hormônios sexuais.

[099] O autoantígeno é particularmente de origem humana ao tratar um sujeito humano.

[100] Pela resposta imune Th1 transitória induzida com este tipo de vacina, não há resposta autoimune irreversível, mas , sim, reversível, a qual é indicado pelo nível de IgG específico em circulação, por exemplo, que é inferior a 50%, de preferência menos do que 60%, de preferência menos do que 70%, de preferência menos do que 80%, ou menos do que 90%, mesmo se a redução de 100% de IgG circulante, após o IgG tenha sido induzida. A indução de IgG é, tipicamente, seguida pela redução de IgG dentro de um período de tempo específico, por exemplo dentro de 1 ano após a última imunização, ou dentro de 6 meses, ou até 3 meses.

[101] A este respeito, a invenção proporciona ainda um método de tratamento de um sujeito com necessidade de redução transiente de autoantígenos ou autoantígenos através da administração de uma quantidade eficaz da vacina para o sujeito, por exemplo, em uma ou mais doses, em que, pelo menos a última dose proporciona o efeito transitório.

[102] De acordo com a invenção, é fornecido um kit para preparação da composição imunogênica da invenção, compreendendo os seguintes componentes a. um adjuvante direcionado que compreende, pelo menos, uma porção anti-CD32 ligada a um ligando TLR9 e uma primeira alfa-hélice peptídica; e b. um imunógeno peptídico gastrina 17 ligado a uma segunda alfa-hélice peptídica combinada com a primeira alfa-hélice, cujo imunógeno peptídico é (i) a gastrina humana 17 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID 78 ou um fragmento da mesma compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID 79 ou ao menos os 4 aminoácidos N-terminais de SEQ ID 79; (ii) um análogo de (i), preferivelmente do macaco rhesus ou de origem murina; e/ou (iii) uma variante funcionalmente ativa de (i) ou (ii), com um, dois, três ou quatro mutações de ponto na sequência de aminoácidos de SEQ ID 79.

[103] O kit pode ser utilizado especificamente para facilitar a produção da vacina usando o componente adjuvante direcionado pré-formado para a combinação com um imunógeno que possa ser fornecido de acordo com a necessidade de um grupo de sujeitos ou do sujeito individual.

[104] De acordo com a invenção, é ainda proporcionada a composição imunogênica para uso no tratamento de um sujeito sofrendo de doenças dependentes da gastrina ou distúrbios. Tal doença ou distúrbio é causado principalmente ou associados com a produção endógena de gastrina ou excesso de produção no sujeito. As doenças dependentes de gastrina ou distúrbios incluem especificamente tumores dependentes da gastrina ou câncer dependente de gastrina, como o câncer pancreático, ou cânceres gastrointestinais, úlcera gástrica, doença do refluxo gastroesofágico (DRGE), insuficiência renal terminal (ESRF), ou obesidade.

[105] Assim, o invento proporciona especificamente um método para o tratamento de um sujeito sofrendo de doenças dependentes da gastrina, tais como tumores dependentes de gastrina ou câncer dependente de gastrina, tais como o câncer pancreático, ou cânceres gastrointestinais, úlcera gástrica, doença do refluxo gastroesofágico (DRGE), insuficiência renal terminal (ESRF), ou obesidade, por administração no sujeito de uma quantidade eficaz da composição imunogênica ou vacina da invenção, quer profilaticamente, por exemplo, para evitar o surto de uma doença ou distúrbio ou o progresso da doença, ou terapeuticamente, por exemplo, para aliviar um distúrbio ou doença.

[106] Especificamente, a composição é administrada no sujeito em uma quantidade efetiva empregando uma estratégia de prime boost.

[107] Especificamente, a quantidade eficaz está compreendida entre 0,0001 e 2 mg por administração, de preferência entre 0,001 e 2 mg por dose.

[108] De acordo com uma incorporação específica da invenção, o sujeito é ainda tratado por quimioterapia, por exemplo, no decurso de tratamento de um câncer dependente de gastrina.

[109] Especificamente, a composição imunogênica da invenção desencadeia uma resposta imunitária protetora no paciente, preferencialmente, com um título de IgG sérico contra a gastrina-17 humana de pelo menos 1/1000, preferivelmente, pelo menos, 1/104, de preferência, pelo menos, 1/105, de preferência pelo menos, 1/106, ou mais baixa, portanto, detectável em uma diluição maior.

[110] FIGURAS

[111] A Figura 1 mostra a interação de alta afinidade da espiral enrolada utilizada na invenção (Exemplo 4) O imunógeno com K-coil é revestido com um Chip BIACore e a ogiva com E-coil encontra-se no tampão de fluxo. Cada espiral é composta por uma alfa-hélice alfa com repetição heptavalente de 5 vezes • Os dados confirmam a afinidade extrema das duas espirais uma pela outra (visualizada por uma baixa constante de dissociação)32. • A ligação da espiral do imunógeno com a espiral da ogiva é específica e pode ser bloqueada pela pré-incubação com o imunógeno.

[112] A Figura 2 mostra a reatividade das células T induzida pelo imunógeno 3 (Exemplo 6) As PBMCs (células mononucleares do sangue periférico) de macacos rhesus (Macaca mulatta) sensibilizados com Der p1 foram cultivadas em triplicata com Der p1 ou imunógeno 3. A proliferação foi ensaiada por incorporação de [3H]- timidina. Os resultados são apresentados como contagens por minuto. Além disso, os sobrenadantes foram ensaiados quanto aos níveis de IL-10 e GM-CSF, cada um indicado como pg/ml • Não há nenhuma diferença significativa entre a resposta ao Der p1 ou imunógeno 3, nem na proliferação, nem na produção de citocinas, indicando que os epítopos de células T no imunógeno 3, que foram selecionados com base na expressão de HLA classe II humana, são igualmente apresentados pelas moléculas de classe II do macaco rhesus e induzem respostas igualmente fortes de células T.

[113] A Figura 3 mostra: apresentação de antígenos ampliada e mediada pela ogiva (Exemplo 7) Proliferação durante 24 h (ensaiada pela incorporação de [3H] -timidina) de células T do macaco Rhesus (Macaca mulatta) após a pré-incubação durante 30 minutos em gelo respectivamente com a ogiva e Der p1 ou com a ogiva e imunógeno 3. Depois de cada pré-incubação as células foram lavadas. (bdl = abaixo do limite de detecção) • Somente quando o imunógeno pôde interagir com a ogiva através de sua espiral é que a proliferação de células T (imunógeno 3) numa forma dependente da dose pôde ser observada. O Der p1 não apresentou uma resposta quando pré-incubado com a ogiva. Como controle positivo, Der p1 mostrou ser reativo após incubação durante a noite (sem lavagem). • A absorção do antígeno mediada pela ogiva é mais eficiente do que a absorção através de pinocitose.

[114] A figura 4 mostra a resposta autoimune induzida por um autoantígeno acoplado ao CpG (Exemplo 8) PBMCs de macacos rhesus (Macaca mulatta) e PBMCs humanos normais foram cultivadas durante 24 h com CpG ou CpG-biot ou aCD32-biot + CpG. Os sobrenadantes foram colhidos e ensaiados quanto a IL-4 e IFNg s (cada um indicado como pg/ml) • No caso em que CpG foi acoplado ao biot (CpG-biot) uma IL-4 forte (PBMC do macaco rhesus e humana) foi induzida em comparação com CpG sem biot. PBMC humano também mostrou uma forte resposta IFNg contrao CpG-biot. Quando o biot e CpG não foram acoplados (aCD32-Biot + CpG) nenhum aumento da resposta foi observado em comparação com o CpG nas PBMCs humanas e do macaco rhesus

[115] A figura 5 mostra a reatividade das células T induzidas por imunógeno 5 (Exemplo 10) PBMCs de doadores humanos saudáveis foram cultivadas durante 24 h em triplicata com Der p1 ou imunógeno 5. Os sobrenadantes foram colhidos e ensaiados quanto a níveis de GM-CSF e IL-10 (cada um indicado como pg/ml; bdl = abaixo do limite de detecção) • As células T humanas respondem igualmente bem ao imunógeno 5 e Der p1, conforme medido pela indução de IL-10 e IFNg

[116] A Figura 6 mostra a indução da resposta autoimune pela imunização com a ogiva SG100 com a ogiva induzindo uma resposta forte e IgG1 IgG2a ao ScFv-1- coil, bem como ao mAb IV.3 no dia 28. Uma resposta positiva foi observada independente da presença de Alum . A imunização com ScFv-1-coil apenas induziu uma resposta de IgG1 contra ScFv-1-coil e apenas na presença de Alum, nenhuma resposta de IgG2a foi induzida.

[117] Figura 7 (exemplo 12.8) Fortes respostas de IgG foram medidas contra a ogiva e o imunógeno de SG100, mas não foram detectados anticorpos contra Der p2, Der p5 ou Der p7, indicando que os animais eram naive em relação ao alergenos HDM testados e que o SG100 não contém epítopos de células B, que reagem de forma cruzada com os alergenos HDM testados.

[118] Figura 8 (exemplo 12.8) Os animais apresentaram forte proliferação quando estimulados in vitro com a ogiva, immo5, Der p1, Der p2, Der p7, mas não contra Der p5. Der p5 não faz parte do immo5.

[119] Figura 9 (exemplo 12.8) Os animais produziram IFNY, mas não IL-4 após a estimulação com ogivas, immo5, Der p1, Der p2, Der p7 mas não com Der p5. Der p5 não faz parte do immo5

[120] A Figura 10 mostra o anticorpo (indução de IgG) em macacos cynomolgus. Curva de tempo de indução de IgG anti-G17, depois de três injeções com a vacina (TYG100_2RM) em d0, d14 e d28. • Uma indução IgG significativa foi observada contra o ScFv- coil1 e G17RM e G17H. Nenhuma resposta foi observada contra um peptídeo de controle de peso molecular semelhante, ou quando os animais foram imunizados com G17RM_2 sem a presença da ogiva. Todos os títulos de IgG específicos caíram 4 semanas após a última imunização, indicando que as injeções de reforço são necessárias para manter os níveis de IgG. Além disso, a presença de G17RM natural não aumenta a resposta e uma vez que a diminuição no nível de IgG contra G17RM é significativamente maior do que aquele para o ScFv-coil1, pode-se concluir que a resposta imunitária induzida é reversível

[121] A figura 11 mostra a perda de peso após a imunização com antigastrina. • Quatro dos seis animais apresentaram uma perda de peso dependente do tempo significativa após a imunização com TYG100_2RM. Foi observado pelos cuidadores dos animais que estes perderam o apetite em relação aos seus lanches da tarde, sem perder o interesse pela alimentação diária normal. Tais observações nunca foram obtidas com outras vacinas, por conseguinte, a vacina antigastrina do presente invento pode ser usada para controlar a obesidade.

[122] A figura 12 mostra a informação de sequências de SEQ ID 78: gastrina pequena humana, G17; SEQ ID 79: peptídeo da gastrina humana, primeiro (N-terminal) 12 AA (aminoácidos) da gastrina pequena G12; SEQ ID 80: Epítopo do N-terminal da gastrina pequena, primeiro (N- terminal) 4 AA, incluindo variantes ativas funcionalmente específicas com mutações de ponto; SEQ ID 81: Epítopo do N-terminal da gastrina pequena, primeiro (N- terminal) 4 AA, incluindo variantes funcionalmente ativas mais específicas com mutações de ponto; SEQ ID 82: Epítopo do N-terminal da gastrina pequena, primeiro (N- terminal) 12 AA, incluindo variantes funcionalmente ativas específicas com mutações de ponto; SEQ ID 83: Epítopo do N-terminal da gastrina pequena, primeiro (N- terminal) 12 AA, incluindo variantes funcionalmente ativas mais específicas com mutações de ponto; SEQ ID 84: Epítopo do N-terminal da gastrina pequena, primeiro (N- terminal) 13 AA, incluindo variantes funcionalmente ativas específicas com mutações de ponto; SEQ ID 85: Epítopo do N-terminal da gastrina pequena, primeiro (N- terminal) 13 AA, incluindo variantes funcionalmente ativas mais específicas com mutações de ponto; SEQ ID 86: Peptídeo da gastrina humana, primeiro (N-terminal) 13 AA (aminoácidos) da gastrina pequena, G13; SEQ ID 87: Componente imunógeno de TYG100_1H: Parte de uma composição imunogênica da invenção, compreendendo um peptídeo de gastrina humana de SEQ ID 86, uma sequência ligante e uma alfa-hélice peptídica (TYG100_1H). Esta parte pode ser ligada ao adjuvante direcionado adequado por meio de uma ligação em espiral. • em negrito é o imunógeno peptídico, em itálico é o conector, sublinhado é a espiral SEQ ID 88: componente imunógeno de TYG100_2H: Parte de uma composição imunogênica da invenção, que compreende dois peptídeos de gastrina humana de SEQ ID 86, uma sequência ligante ramificada e uma alfa-hélice peptídica (TYG100_2H). Esta parte pode ser ligada ao adjuvante direcionado adequado por uma ligação em espiral. • em negrito é o imunógeno peptídico, em itálico é o conector, sublinhado é a espiral SEQ ID 89: sequência de conectores lineares; SEQ ID 90: sequência de conectores ramificados.

[123] DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[124] Os termos específicos utilizados ao longo da especificação possuem o seguinte significado.

[125] O termo "adjuvante" como aqui utilizado significa um componente integrado ou coadministrado de uma vacina, que: - aumenta a resposta imune a um imunógeno específico, por exemplo, um antígeno ou um hapteno. A resposta imune é tipicamente maior do que a resposta imunitária provocada por uma quantidade equivalente da composição imunogênica administrada sem o adjuvante, e /ou - o adjuvante é utilizado para direcionar um determinado tipo ou classe de resposta imunitária contra o imunógeno, por exemplo, um tipo de resposta imune do tipo Th1 ou Treg, aqui entendido como "adjuvante direcionado".

[126] Uma "quantidade eficaz" de um adjuvante do presente invento, especificamente, é uma quantidade que aumenta a resposta imunológica ao imunógeno de tal modo que, por exemplo, doses mais baixas ou em menor número da composição imunogênica são necessárias para gerar uma resposta imune eficiente da classe a que se destinam.

[127] O adjuvante direcionado de acordo com a invenção não só medeia a resposta imunitária eficiente, mas também a regulação da resposta imunitária na forma desejada. Ao dirigir o imunógeno para as células imunitárias adequadas para a sua internalização e processamento posterior, a resposta imune do tipo Th1 é induzida em vez da resposta imunitária Th2, em particular quando se emprega um ligante TLR9 que é um agonista TLR9 do grupo 3. Se um antagonista TLR9 é utilizado na composição da vacina, a respectiva resposta imune é modulada negativamente em qualquer caso. Se um agonista TLR9 do grupo 1 é combinado com uma porção anti-CD32 que se liga ao CD32b, a indução de células T reguladoras é geralmente esperada.

[128] Uma "quantidade eficaz" de um adjuvante do presente invento, especificamente, é uma quantidade que aumenta a resposta imunológica ao imunógeno de tal modo que, por exemplo, doses mais baixas ou em menor número da composição imunogênica é obrigado a gerar uma resposta imune eficiente da classe a que se destinam.

[129] O adjuvante direcionado de acordo com a invenção não só medeia a resposta imunitária eficiente, mas também a regulação da resposta imune da maneira desejada. Ao dirigir o imunógeno para as células imunitárias adequadas para a sua internalização e processamento posterior, a resposta imune do tipo Th1 é induzida em vez da resposta imunitária Th2, em particular quando se emprega um ligante TLR9 que é um agonista TLR9 de grupo 3. Se um agonista TLR9 de grupo 1 é combinado com uma porção anti-CD32 que se liga ao CD32b, a indução de células T reguladoras é geralmente esperada.

[130] Uma "quantidade eficaz" de uma composição imunogênica, por exemplo, tal como utilizado numa vacina da invenção, refere-se a uma quantidade suficiente para mostrar um benefício significativo no sujeito a ser tratado, quando administrado como parte de um regime de dosagem de vacinação. Os conhecedores da área irão apreciar que, em algumas concretizações, uma determinada composição pode ser considerada como contendo uma quantidade profilaticamente ou terapeuticamente eficaz caso contenha uma quantidade apropriada para uma forma de dosagem unitária administrada num regime de dosagem específico, embora tal quantidade possa ser insuficiente para conseguir o benefício significativo, se administrado como uma dose unitária única. Os versados na área irão considerar ainda que uma quantidade eficaz de uma composição imunogênica pode ser diferente para diferentes indivíduos que recebem a composição, dependendo, por exemplo, de fatores tais como o desfecho biológico desejado, a natureza da composição, a via de administração, a saúde, tamanho e /ou a idade do sujeito a ser tratado, etc. Em algumas incorporações, uma quantidade eficaz é aquela que é correlacionada com o efeito benéfico quando administrada como parte de um regime de dosagem particular, por exemplo, uma única administração ou uma série de administrações tais como num regime de boosting.

[131] O termo "alfa-hélice peptídica", tal como aqui utilizado, significa um motivo estrutural em espiral com base em uma sequência peptídica que compreende um certo número de repetições, também chamadas repetições espiraladas (coil). Tal alfa-hélice é capaz de se ligar a outro homólogo, também chamado de alfa-hélice correspondente do mesmo tipo para formar um dímero, trímero ou oligômero, também chamado de espiral enrolada (coiled-coil).

[132] Uma espiral enrolada é um motivo estrutural em polipeptídeos ou peptídeos, em que 2-7 alfa-hélices são enroladas em conjunto como os fios de uma corda. Em algumas formas de incorporação, a espiral enrolada da vacina tem duas hélices-alfa enroladas em conjunto. Essas alfa- regiões helicoidais são suscetíveis de formar estruturas em espiral enrolada e podem estar envolvidas na oligomerização das repetições de espiral tal como medido num ensaio adequado de ligação e interação da espiral enrolada.

[133] Especificamente, um dímero de alfa-hélices pode ser formado contatando os dois monômeros, de tal modo que o dímero é formado através de uma interação com os dois domínios alfa helicoidais em espiral enrolada. Em algumas formas de incorporação as espirais compreendem um peptídeo com a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1 ou 2 (coil e anti-coil), que incluem x repetições. EVSAL (SEQ ID 97) E5: EVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEK-NH2 (SEQ ID 1) KVSAL (SEQ ID 98) K5: KVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKE-NH2 (SEQ ID 2)

[134] Alternativamente, qualquer uma das sequências descritas por Chao et al33 ou Litowsky et al34 ou equivalentes funcionais que geram a ligação específica do tipo espiral enrolada pode ser utilizada:

[135] Para o propósito da invenção, o tipo preferido de espiral enrolada é um dímero, ou um heterodímero (heterocoil) de duas hélices diferentes, mas correspondentes, as quais diferem entre si em pelo menos um aminoácido na sequência de repetição da espiral, ou então de um homodímero de duas hélices correspondentes e idênticas, ou seja, aquelas que compreendem as sequências de repetição da espiral correspondente (as "espirais").

[136] O número preferido de repetições da espiral é 3-5, preferivelmente qualquer uma das combinações 3+3, 3+4, 3+5, 4+4, 4+5, 5+5, 4+3, 5+3 ou 5+4.

[137] Como alternativa às repetições heptavalentes (repetições de uma sequência de aminoácidos consistindo em 7 aminoácidos, heptâmeros), hexâmeros, octâmeros ou nonâmeros podem ser utilizados.

[138] No caso de uma espiral enrolada homodimérica, o número de repetições de espiral típico é, especificamente, não mais do que 5, de modo a evitar incompatibilidades indesejadas na estrutura. No caso de uma espiral enrolada heterodimérica, é normalmente desejável empregar um comprimento da sequência peptídica com, pelo menos, 3 espirais. Desse modo, a ligação dos componentes da vacina, isto é, o adjuvante direcionado e os componentes de imunógeno, um com o outro é tipicamente obtida com uma afinidade elevada preferencial com um Kd inferior a 10-7 M, mais preferivelmente inferior a 10-8 M ou 10-9 M. Contudo, embora mais repetições aumentem a afinidade, isso pode se dar à custa de um aumento da homodimerização.

[139] Os componentes da composição imunogênica da invenção podem também compreender um peptídeo espaçador, de modo a ligar a fração anti-CD32 e/ou o ligando TLR9, e opcionalmente também o epítopo (por exemplo, o imunógeno peptídico) com as repetições de espiral, respectivamente. Por exemplo, o peptídeo espaçador pode estar em uma ou ambas as extremidades de uma espiral enrolada. Cada um dos espaçadores peptídicos pode ser ligado a um domínio de alfa-hélice simples da espiral enrolada.

[140] O peptídeo espaçador pode ser, por exemplo, um peptídeo de, pelo menos, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 aminoácidos ou mais, seja linear ou ramificado, por exemplo, provendo dois, três, quatro ou mais ramos. O número de aminoácidos no peptídeo espaçador pode ser, em algumas formas de incorporação, de 20 aminoácidos ou até 10 aminoácidos mais ou menos, dependendo das sequências particulares e comprimento da espiral.

[141] O termo "porção anti-CD32" tal como é aqui utilizado, significa um ligando que se liga especificamente ao alvo celular CD32, seja o CD32a, CD32b, ou ambos, CD32a e CD32b. O radical pode ser qualquer estrutura de ligação, tais como derivados de proteínas, polipeptídeos ou peptídeos, incluindo anticorpos e fragmentos de anticorpos ou moléculas de compósitos com uma parte de ligação. A parte de ligação de moléculas ou complexos de moléculas da invenção pode ser constituída por proteínas tais como anticorpos ou fragmentos de anticorpos, tais como Fab, Fv, dímero VH/VL, scFv, dAb, F(ab)2, minicorpo, pequenos domínios de imunoglobulina mutada, Fcab, Mab2 ou outros ligantes biológicos, tais como o receptor de células T solúvel, Darpins, etc. Os anticorpos e fragmentos de anticorpos e derivados podem ser gerados e selecionadas para ligação ao CD32 de acordo com métodos conhecidos, tais como a tecnologia de hibridomas, clonagem de células B, exibição de fagos, exibição de levedura, exibição de ribossomos ou exibição de superfícies celulares de bibliotecas de anticorpos, e array screening (triagem) de anticorpos variantes. As porções anti-CD32 exemplificativas são o scFv derivado do anticorpo monoclonal anti-CD32 AT-1035, IV.336, 2E637 ou qualquer outro anticorpo monoclonal CD32.

[142] A ligação específica pode ser determinada em um ensaio de ligação adequado, como os imunoensaios convencionais.

[143] Existem vários métodos conhecidos na técnica para detectar a ligação num imunoensaio. Vários imunoensaios conhecidos na área podem ser utilizados, incluindo sistemas de ensaio competitivos e não-competitivos utilizando técnicas tais como radioimunoensaios, ELISA (ensaio de imunoabsorção enzimática), ensaios imunorradiométricos, reações de precipitação com difusão em gel, ensaios de imunodifusão, western blot, BIAcore etc.

[144] O termo "reativo de forma cruzada" relacionado a antígenos ou anticorpos tal como aqui utilizado refere-se a epítopos partilhados entre antígenos de origem diferente, por exemplo, de origem humana, do macaco rhesus ou camundongo. O epítopo N-terminal consistindo ou compreendendo a primeira 4 AA de G17 mostrou ser reativo de forma cruzada em peptídeos de várias origens, cujo epítopo provoca uma resposta imune, e anticorpos IgG que são reativos de forma cruzada com os epítopos.

[145] A composição imunogênica da invenção é especificamente útil para o tratamento de doenças dependentes de gastrina ou distúrbios que estão associadas com o excesso de gastrina, por exemplo, tumores dependentes de gastrina ou câncer dependente de gastrina, como o câncer pancreático, úlcera gástrica, doença do refluxo gastroesofágico (GEDR), insuficiência renal terminal (ESRF), ou obesidade.

[146] O termo "tumor dependente de gastrina" ou "câncer dependente de gastrina" como aqui utilizado refere-se a tumores ou doenças ou distúrbios a ela associada, por exemplo, o adenocarcinoma colorretal e outros cânceres dependentes de gastrina, tais como o do estômago, fígado, pâncreas e o carcinoma de pequenas células do pulmão dependente de gastrina. O termo é aqui utilizado especificamente em relação ao tratamento do tumor para prevenir a progressão da doença tumoral, para uma resposta tumoral positiva ou para a diminuição do tumor. O termo também é aplicado à doença residual mínima, o qual seria tratada com sucesso, por exemplo, visando às células tumorais em circulação para reduzir o seu número abaixo de um certo limiar, por exemplo, abaixo do limite de detecção.

[147] A úlcera gástrica pode ser causada pelo aumento do ácido do estômago e um colapso das defesas complexas do estômago que normalmente protegem a mucosa gástrica contra danos ácidos. Embora as duas doenças tenham diferentes etiologias, ambas beneficiam-se de uma redução na secreção de ácido gástrico. O ácido gástrico é produzido numa célula especializada do estômago, a célula parietal. As células parietais podem ser estimuladas para produzir ácido por acetilcolina, histamina e gastrina, mediante a ligação de cada um destes compostos com receptores específicos na superfície da célula. Destes, o estimulador mais potente da secreção de ácido é o hormônio peptídico gastrina. A imunoterapia antigastrina, tal como aqui descrita, melhoraria o quadro de úlcera gástrica.

[148] O termo "peptídeo gastrina-17" ou " peptídeo G17" ou "G17" como aqui utilizado refere-se à gastrina pequena G17, a qual consiste no N-terminal 17 AA da gastrina. O peptídeo G17 pode ser de origem humana, ou proveniente de mamíferos, incluindo o macaco rhesus, ou o camundongo, ou seja, tem uma sequência de outro mamífero ou humano, ou pode ser uma construção artificial, tal como para incorporar sequências artificiais, por exemplo, obtidos por alteração do tipo e /ou a sequência de resíduos de aminoácidos na sequência nativa de G17 (de ocorrência natural). O termo inclui especificamente variantes da G17 humana, com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID 78, ou seus fragmentos, mas difere da sequência peptídica, por ser derivado de uma sequência homóloga de uma espécie diferente. Estes são chamados de variantes ou análogos de ocorrência natural. O termo "análogos" deverá também referir-se a construções quiméricas provenientes de duas ou mais origens, em que pelo menos uma parte é de ocorrência natural, por exemplo, a que constitui a maior parte (pelo menos 50%) do imunógeno peptídico, e uma outra parte da mesma é diferente, sendo de ocorrência natural ou sintética (artificial).

[149] O termo deve incluir especificamente fragmentos ou variantes funcionalmente ativos do G17, por exemplo, os que compreendem uma ou mais mutações pontuais, ou mais peptídeos ou polipeptídeos que compreendem sequências adicionais de aminoácidos para além do G17, por exemplo, através da extensão do N-terminal e/ou C-terminal por resíduos ou sequências adicionais de um ou mais aminoácidos. Uma extensão do C-terminal é, por exemplo, preferido com repetições de sequências G17, quer idênticos ou não, ou com sequências adicionais de aminoácidos da gastrina.

[150] O termo deverá incluir especificamente os peptídeos com um ou mais resíduos de aminoácidos modificados. Modificações comuns incluem fosforilação, metilação, acetilação, amidação, formação de ácido carboxílico pirrolidona, isomerização, hidroxilação, sulfação, ligação com a flavina, oxidação da cisteína e nitrosilação. A modificação exemplar, tal como aqui descrita, é a modificação do ácido glutâmico do N-terminal da G17, ou seja, o piroGlu na posição 1, que é também conhecido como "ácido carboxílico pirrolidona (Glu)" ou pGlu ou pE.

[151] O termo "variantes funcionalmente ativas", tal como aqui utilizado em relação ao imunógeno peptídico da invenção, significa uma sequência resultante de uma modificação desta sequência (a sequência de origem), por exemplo, por inserção, deleção ou substituição de um ou mais aminoácidos, tais como por técnicas de recombinação ou de derivação química de um ou mais resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos ou nucleotídeos dentro da sequência de nucleotídeos de codificação, ou em uma ou ambas extremidades distais da sequência, e cuja modificação não afeta (ou prejudica particularmente) a atividade desta sequência. No caso de um imunógeno peptídico desencadear uma certa resposta imune para atingir a gastrina, a variante funcionalmente ativa do imunógeno peptídico ainda incorpora o determinante antigênico ou epítopo, embora este possa ser alterado, por exemplo, para aumentar a imunogenicidade. Especificamente, as variantes funcionalmente ativas do imunógeno peptídico G17, ou um seu fragmento, tais como o fragmento G12 ou G13, têm o potencial de induzir anticorpos IgG antigastrina num sujeito tratado, cujos anticorpos reagem de forma cruzada com a gastrina endógena do sujeito.

[152] Variantes funcionalmente ativas podem ser obtidas, por exemplo, alterando a sequência de um peptídeo original, por exemplo, o peptídeo G17 humano, do macaco rhesus ou murino, ou um fragmento do mesmo, por exemplo, o peptídeo G12 ou G13, através da introdução de uma ou mais modificações que não afetem substancialmente os epítopos de reação cruzada, para se obter uma molécula substancialmente com a mesma imunogenicidade. O termo "substancialmente a mesma imunogenicidade", tal como aqui utilizado refere-se à quantidade de uma resposta imunitária de anticorpos IgG antigastrina induzida num paciente tratado com a composição imunogênica, cuja quantidade é, de preferência, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40 %, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou até, pelo menos, 100% ou, pelo menos, 110%, ou pelo menos 120%, ou pelo menos 130%, ou pelo menos 140%, ou pelo menos 150%, ou pelo menos 160%, ou pelo menos 170%, ou pelo menos 180%, ou pelo menos 190%, por exemplo, até 200% do valor determinado para o peptídeo parental.

[153] Numa forma de incorporação preferida, a variante funcionalmente ativa de um peptídeo parental a) é derivado do peptídeo por substituição, inserção (adição) e /ou eliminação de pelo menos um aminoácido, por exemplo, que compreende uma ou mais mutações de ponto em que a variante funcionalmente ativa tenha uma identidade de sequência específica em relação à molécula parental, tal como pelo menos 50% de identidade de sequência, de preferência pelo menos 60%, mais preferencialmente pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente, pelo menos 90%; e /ou b) consiste no peptídeo e, adicionalmente, pelo menos um aminoácido heterólogo em relação ao peptídeo.

[154] Variantes funcionalmente ativas podem ser obtidas por alterações de sequência na sequência peptídica, por exemplo, por uma ou mais mutações de ponto, em que as alterações de sequência retêm substancialmente a função da sequência peptídica pura, quando utilizadas de acordo com a invenção. Tais alterações de sequências ou mutações de ponto podem incluir, mas não estão limitados a, substituições (conservadoras), adições, deleções, mutações e inserções, por exemplo, a alteração de 1, 2, 3 ou 4 aminoácidos, ou por adição ou inserção de um a vários aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3 ou 4 aminoácidos, ou por uma transformação química de um até vários aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, ou 4, ou combinação dos mesmos, de preferência por mutações de ponto que não sejam contíguas. As substituições em resíduos de aminoácidos podem ser substituições conservadoras, por exemplo, substituindo um aminoácido hidrófobo por um aminoácido hidrofóbico alternativo.

[155] As substituições conservadoras são aquelas que ocorrem dentro de uma família de aminoácidos que estão relacionados nas suas cadeias laterais e propriedades químicas. Exemplos de tais famílias são aminoácidos com cadeias laterais básicas, com cadeias laterais ácidas, com cadeias laterais alifáticas não polares, com cadeias laterais aromáticas não polares, com cadeias laterais polares não carregadas, com cadeias laterais pequenas, com cadeias laterais grandes, etc.

[156] As mutações de ponto preferidas referem-se à troca de aminoácidos com a mesma polaridade e /ou carga. A este respeito, os aminoácidos referem-se a vinte aminoácidos que ocorrem naturalmente, codificados por sessenta e quatro códons triplos. Estes 20 aminoácidos podem ser divididos entre os que têm cargas neutras, cargas positivas e cargas negativas: Os aminoácidos “neutros” são apresentados abaixo junto com seu respectivo código de 3 letras e de letra única e polaridade: Alanina: (Ala, A) não polar, neutro; Asparagina: (Asn, N) polar, neutro; Cisteína: (Cys, C) não polar, neutro; Glutamina: (Gln, Q) polar, neutro; Glicina: (Gly, G) não polar, neutro; Isoleucina: (Ile, I) não polar, neutro; Leucina: (Leu, L) não polar, neutro; Metionina: (Met, M) não polar, neutro; Fenilalanina: (Phe, F) não polar, neutro; Prolina: (Pro, P) não polar, neutro; Serina: (Ser, S) polar, neutro; Treonina: (Thr, T) polar, neutro; Triptofano: (Trp, W) não polar, neutro; Tirosina: (Tyr, Y) polar, neutro; Valina: (Val, V) não polar, neutro; e Histidina: (His, H) polar, positivo (10%) neutro (90%). Os aminoácidos de carga “positiva” são: Arginina: (Arg, R) polar, positivo; e Lisina: (Lys, K) polar, positivo. Os aminoácidos de carga “negativa” são: Ácido aspártico: (Asp, D) polar, negativo; e Ácido glutâmico: (Glu, E) polar, negativo.

[157] A "percentagem (%) de identidade da sequência de aminoácidos" em relação às sequências peptídicas aqui descritas é definida como a percentagem de resíduos de aminoácidos numa sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência peptídica específica, após alinhamento da sequência e introdução de hiatos, se necessário, para alcançar a percentagem máxima de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservadoras como parte da identidade de sequência. Os peritos da área podem determinar os parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para conseguir o alinhamento máximo ao longo do comprimento total das sequências a serem comparadas.

[158] Variantes funcionalmente ativas podem ser obtidas por qualquer um dos métodos conhecidos de mutagênese, incluindo as mutações de ponto nas posições desejadas, por exemplo, aquelas obtidas por meio de técnicas de aleatorização. Em alguns casos, as posições são escolhidas aleatoriamente, por exemplo, com qualquer um dos aminoácidos possíveis ou uma seleção de aminoácidos preferenciais para randomizar as sequências peptídicas. A este respeito, o termo "mutagênese" refere-se a qualquer técnica reconhecida por alterar uma sequência polinucleotídica ou polipeptídica.

[159] O termo " imunógeno", tal como aqui usado, significa um ou mais antígenos que desencadeiam uma resposta imune num sujeito. O termo "antígeno" como utilizado aqui deve, em particular, referir-se a qualquer determinante antigênico, o qual pode ser possivelmente reconhecido por um local de ligação de um anticorpo ou é capaz de se ligar ao sulco do peptídeo do HLA classe I ou moléculas de classe II e, como tal, pode servir como estimulante para células T específicas. O antígeno alvo ou é reconhecido como uma molécula alvo inteira ou como um fragmento de tal molécula, especialmente as subestruturas, por exemplo, uma estrutura polipeptídica ou de hidratos de carbono dos alvos, geralmente referida como "epítopos", (por exemplo, epítopos de células B, epítopos de células T), os quais são imunologicamente relevantes, isto é, também são reconhecidos por anticorpos naturais ou monoclonais. Aqui, prefere-se o uso de epítopos das células T, por exemplo, para proporcionar vacinas contra a alergia.

[160] O termo " imunógeno peptídico", tal como aqui utilizado, significa um antígeno ou imunógeno de estrutura peptídica, em particular um imunógeno que compreende, ou consiste em um peptídeo de uma sequência específica de aminoácidos, que é fornecido como um peptídeo linear ou ramificado, compreendendo resíduos de aminoácidos de ocorrência natural ou modificados, por exemplo, um derivado obtido por modificação química ou derivação, tais como por fosforilação, metilação, acetilação, amidação, formação de ácido carboxílico pirrolidona, isomerização, hidroxilação, sulfação, ligação de flavina, oxidação de cisteína e nitrosilação.

[161] O imunógeno peptídico é especificamente concebido para desencadear uma resposta imune num sujeito, e inclui em particular um ou mais determinantes antigênicos, que podem ser possivelmente reconhecidos por um local de ligação de um anticorpo ou são capazes de se ligar ao sulco do peptídeo das moléculas HLA classe I ou classe II, ou outras moléculas que apresentam antígenos, tais como CD1 e como tal podem servir como estimulante para as células T específicas. O antígeno alvo ou é reconhecido como uma molécula alvo inteira ou como um fragmento de tal molécula, especialmente subestruturas, por exemplo, uma estrutura polipeptídica ou de hidratos de carbono dos alvos, geralmente referida como "epítopos", por exemplo, epítopos de células B, epítopo de células T, os quais são imunologicamente relevantes, isto é, também são reconhecidos por anticorpos naturais ou monoclonais. Aqui, o uso de epítopos de células B é preferido para proporcionar por exemplo, vacinas oncológicas.

[162] O termo "epítopo" como aqui utilizado de acordo com a presente invenção em particular refere-se a uma estrutura molecular que pode consistir em um parceiro de ligação específico ou ser parte de um parceiro de ligação específico a um sítio de ligação do anticorpo modular do presente invento. O termo epítopo também pode se referir a haptenos. Quimicamente, um epítopo pode ser qualquer composto de um hidrato de carbono, um peptídeo, um ácido graxo, uma substância orgânica, bioquímica ou inorgânica ou seus derivados, e quaisquer combinações destes. Se um epítopo é um polipeptídeo, ele irá normalmente incluir, pelo menos, três aminoácidos, preferencialmente pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 aminoácidos. Não há um limite superior crítico para o comprimento do peptídeo, que pode compreender quase o comprimento total de uma sequência de polipeptídeos de uma proteína. Os epítopos podem ser lineares ou epítopos conformacionais. Um epítopo linear compreende um único segmento de uma sequência primária de uma cadeia de polipeptídeos ou hidratos de carbono. Epítopos lineares podem ser contíguos ou sobrepostos. Os epítopos conformacionais são compostos de aminoácidos ou de hidratos de carbono agrupados por dobragem do polipeptídeo para formar uma estrutura terciária e os aminoácidos não são necessariamente adjacentes um ao outro na sequência linear. Especificamente, os epítopos são, pelo menos, parte de moléculas diagnosticamente relevantes, isto é, a ausência ou a presença de um epítopo numa amostra é qualitativamente ou quantitativamente correlacionada com alguma doença ou o estado de saúde de um paciente ou a situação de um processo na fabricação ou a situação ambiental e alimentar. Os epítopos também podem ser, no mínimo, parte das moléculas terapeuticamente relevantes, isto é, moléculas que podem ser visadas pelo domínio de ligação específico que altera o curso da doença.

[163] Um ou mais epítopos do mesmo antígeno ou antigenos diferentes podem ser utilizados de acordo com a presente invenção, que pode incluir antigenos de todos os autoantígenos, agentes patogênicos, alergenos ou autoantígenos para os quais é desejada a regulação da resposta imunitária, por exemplo, contra a qual a indução de uma resposta de tipo Th1 substancial ou resposta Treg (dependendo do tipo de vacina) no hospedeiro é desejada.

[164] No câncer, é desejável uma resposta imunitária a um autoantígeno. O termo "autoantígeno", tal como aqui utilizado, significa qualquer antígeno, especificamente um polipeptídeo ou peptídeo produzido por um indivíduo normal e saudável que não provoque uma resposta imune. Estes autoantígenos podem ser produzidos em níveis aberrantes ou elevados em certas doenças, incluindo o câncer, os denominados antígenos associados a tumores (TAAs). Aqui, a gastrina humana ou G17 humana é entendida como um autoantígeno em seres humanos e, especificamente, como um TAA em indivíduos que sofrem de um tumor dependente de gastrina. Os autoantígenos que estão associados com a doença autoimune são aqui chamados de autoantígenos.

[165] Entende-se que os autoantígenos podem ser de ocorrência natural, produzidos de forma recombinante ou sinteticamente. Entende-se também que os autoantígenos não precisam ser idênticos ao antígeno produzido naturalmente, mas podem incluir variações dos mesmos e ter certas semelhanças, identidades de sequência, ou homologia.

[166] A escolha do autoantígeno para utilização em terapia do câncer depende do tipo e estádio da doença cancerígena, e, em particular, do padrão de expressão de uma célula cancerosa, tal como a derivada de um tumor ou metástases. Os exemplos específicos de antígenos associados a tumores selecionados e possivelmente usados numa vacina de acordo com a invenção são a molécula de adesão de células epiteliais (EpCAM), Lewis Y, alfa-fetoproteína (AFP) e antígeno carcinoembrionário (CEA), HER2 /neu, MUC-1, etc.

[167] A escolha de um autoantígeno para utilização na terapia de doenças autoimunes depende do tipo de doença autoimune. Os exemplos específicos de antígenos associados a doenças autoimunes selecionados e possivelmente usados numa vacina de acordo com a invenção são C1q, ADAMTS13, Desmogelin 3, queratina, gangliósidos (por exemplo, GM1, GD1a, GQ1b), colágeno tipo IV, IgM, cardiolipina, anexina A5, etc.

[168] Em algumas formas de incorporação, o imunógeno compreende um ou mais alergenos específicos. Um "alergeno" é um antígeno que pode dar início a um estado de hipersensibilidade, ou que pode provocar uma reação de hipersensibilidade imediata em um sujeito já sensibilizado com o alergeno. Os alergenos são normalmente proteínas ou substâncias químicas ligadas a proteínas que têm a propriedade de ser alergênicos. No entanto, os alergenos podem também incluir materiais orgânicos ou inorgânicos derivados de uma variedade de fontes sintéticas ou naturais, tais como materiais vegetais, metais, componentes de cosméticos ou detergentes, látex, ou assemelhados.

[169] A escolha de um alergeno para utilização na terapia antialergia depende do tipo e gravidade da alergia. Os exemplos específicos de antígenos associados a alergia selecionados e possivelmente usados numa vacina de acordo com a invenção são qualquer alergeno convencionalmente utilizado como imunógeno, especificamente alergenos de ácaros domésticos (por exemplo, Der p1, Der p2, Der p3/ Der p23, Der f1, Der f2, Derf3/---Der f23), pelo de gato, pólen da grama ou de árvores, alergenos de baratas, etc.

[170] A escolha de um antígeno que induza especificamente uma resposta imunitária contra um agente patogênico para uso na profilaxia ou terapia de doenças infecciosas depende do tipo de agente patogênico, por exemplo, um agente microbiano ou viral infeccioso. Exemplos específicos de antígenos derivados de patógenos selecionados e possivelmente utilizados numa vacina de acordo com a invenção são o da hepatite B, hepatite C, cólera, HIV, coqueluche, gripe, febre tifoide, etc.

[171] O imunógeno peptídico ou a composição imunogênica utilizada na vacina de acordo com o invento é geralmente incluído numa vacina numa quantidade eficaz, que é aqui especificamente entendida como uma "quantidade imunologicamente eficaz". Por "quantidade imunologicamente eficaz" pretende-se dizer que a administração dessa quantidade a um indivíduo, seja em dose única ou como parte de uma série de doses, é eficaz para os objetivos terapêuticos ou profiláticos. Esta quantidade varia dependendo da saúde e condição física do sujeito a ser tratado, da idade, da capacidade do sistema imunitário do sujeito de sintetizar anticorpos, do grau de resposta imunitária desejada, da formulação da vacina, e de outras condições.

[172] A invenção também provê um método para tratar um sujeito ou aumentar uma resposta imune num sujeito, compreendendo a etapa de administração de uma quantidade imunologicamente eficaz do imunógeno peptídico, da composição imunogênica ou da vacina da invenção.

[173] Uma quantidade ou dosagem eficaz pode variar de 0,0001 a 2 mg, por exemplo, entre 0,001 e 2 mg da composição imunogênica administrado ao sujeito que necessita da mesma, por exemplo, um sujeito humano adulto. A dosagem eficaz da composição imunogênica é capaz de induzir uma resposta imune em um paciente com níveis eficazes de título do anticorpo para ligar e neutralizar a G17 madura e precursora endógena, por exemplo, 1-3 meses após a imunização. A eficácia da terapia pode ser avaliada pelos títulos de anticorpos antigastrina em amostras de sangue colhidas do sujeito.

[174] O termo “ligando TLR9” conforme aqui utilizado é compreendido da forma a seguir.

[175] O receptor tipo Toll 9 (TLR9) reconhece o DNA do CpG não metilado bacteriano e inicia uma cascata de sinalização que conduz à produção de citocinas pró-inflamatórias. Existem numerosas estruturas ou sequências que mostram agir como um ligando TLR9, ou seja, ligam-se a este receptor e assim acionam (estimulam, regulam positivamente o agonista TLR9) ou desativam (regulam negativamente o antagonista TLR9) o TLR9. Por exemplo, o DNA microbiano ou DNA sintético, por exemplo, os ODN de CpG sintéticos, pode estimular o TLR9 com variações no número e localização dos dímeros de CpG, bem como as sequências de bases específicas que flanqueiam os dímeros de CpG. Os ODN de CpG sintéticos diferem do DNA microbiano na medida em que possuem uma espinha dorsal parcialmente ou completamente de fosforotioato, em vez de uma estrutura de fosfodiéster normal, e podem ou não ter uma cauda poli G na extremidade 3, na extremidade 5', ou em ambas.

[176] O termo "agonista", em conjunto com o ligando TLR9 como aqui utilizado, refere-se especificamente à ligação e ativação do TLR9 em um ensaio baseado em células.

[177] O ligando TLR9 que é composto de uma sequência de nucleotídeos é normalmente acoplado ao componente adjuvante direcionado da presente composição imunogênica por acoplamento químico, por exemplo, utilizando o kit comercialmente disponível da Solulink. Um ligando peptídico TLR9 pode ser acoplado utilizando a química padrão dos peptídeos ou pode ser integrado utilizando a tecnologia de DNA recombinante.

[178] Os ligandos TLR9 exemplares são os ODN 221638 (grupo 1), ODN 2006/ODN 200739 (grupo 2) e CpG-M36240 (grupo 3).

[179] Outros exemplos de ligandos TLR9 podem ser os peptídeos que mimetizam a ação de um agonista TLR9 CpG, por exemplo, identificados ou obtidos a partir de uma biblioteca de peptídeos, os quais são selecionadas pela afinidade de ligarem-se ao TLR9 e pela atividade agonista comprovada, ou ligandos proteicos, incluindo anticorpos específicos.

[180] Os ligandos TLR9 específicos consistem nos peptídeos imunoestimulantes, por exemplo, aqueles que imitam qualquer uma das classes de CpG, tais como os peptídeos selecionados a partir de uma biblioteca de peptídeos adequada. Exemplos de peptídeos imunoestimulantes são selecionados entre o grupo constituído por ESWDKFLSHYLP (SEQ ID 50), TDWSWFY (SEQ ID 51), YPVYWPW (SEQ ID 52), EWWFYWP (SEQ ID 53), WFPIEWW (SEQ ID 54), DQVDIGY (SEQ ID 55), THQVYIS (SEQ ID 56), WFPIEWWFYWP (SEQ ID 57), DSWQAFLTKFVL (SEQ ID 58), HDIQWFWQHWNS (SEQ ID 59), WSWWDHTFNYML (SEQ ID 60), TTQQTWNVRYPY (SEQ ID 61), DHTMPWTRNAKN (SEQ ID 62), SWDPYWPFPWFS (SEQ ID 63), AIYYVPSPMFTV (SEQ ID 64), ETTLLKMWLAQM (SEQ ID 65), YPWLDVAVVSLY (SEQ ID 66), VPGWHYLATLRA (SEQ ID 67) e FDPLGSRDIKGS (SEQ ID 68), e variantes funcionalmente ativas dos mesmos, as quais são fragmentos, mutantes ou híbridos dos mesmos.

[181] Mais especificamente, a variante funcionalmente ativa estimula as pDCs, induzindo dessa forma um nível elevado de IL-6 e TNF-alfa em comparação com o controle negativo.

[182] Especificamente, a variante funcionalmente ativa a) possui no mínimo 60% de homologia com qualquer um dos peptídeos de SEQ ID 50-68; b) é um mutante de qualquer um dos peptídeos de SEQ ID 50-68, que podem ser obtidos por modificação da sequência de aminoácidos original pela inserção, deleção ou substituição de um ou mais aminoácidos no interior da sequência em uma ou em ambas extremidades distais da sequência ; ou c) é um fragmento de qualquer um dos peptídeos de SEQ ID 50-68 compreendendo ao menos 5 aminoácidos.

[183] Os peptídeos imunoestimulantes específicos compreendem um motivo selecionado a partir do grupo que consiste em EWWFYWP (SEQ ID 53), EWW (SEQ ID 125), WFY (SEQ ID 126), YWP (SEQ ID 127), e QVxI, sendo X qualquer aminoácido (SEQ ID 128).

[184] A função de um ligando ou agonista ou antagonista TLR9 pode ser determinada num ensaio adequado, por exemplo, da seguinte maneira: pDCs são purificadas a partir do sangue de um doador saudável, tal como descrito por Tel et al41 e subsequentemente incubadas com a concentração apropriada do ligando TLR9. Após 24 h, o IFNa é medido no sobrenadante utilizando protocolos padrão de ELISA. Para a determinação do estado de maturação das células, as pDCs são coradas para a expressão de CD80, CD83 ou CD86, utilizando procedimentos padrão de FACS com anticorpos específicos, disponíveis comercialmente, antes e após a incubação com o ligando TLR9.

[185] O número de células T reativas que são ativadas após exposição à vacina de acordo com a invenção pode ser determinada por uma série de métodos, incluindo ELISPOT, análise de FACS, liberação de citocina, ou ensaios de proliferação de células T.

[186] Tal como aqui utilizado, o termo "especificidade" ou "ligação específica" refere-se a uma reação de ligação que é determinante do ligante cognato de interesse numa população heterogênea de moléculas. Assim, nas condições indicadas (por exemplo, condições de imunoensaio), um ou mais antígenos são especificamente ligados pelo respectivo local/locais de ligação de um ligante, o qual não se liga numa quantidade significativa a outras moléculas presentes numa amostra. A ligação específica significa que a ligação é seletiva em termos de identidade alvo, avidez ou afinidade de ligação alta, média ou baixa, conforme selecionado. A ligação seletiva é geralmente obtida se a dinâmica de ligação ou constante de ligação é pelo menos 10 vezes diferente, de preferência a diferença é de pelo menos 100 vezes, e, mais preferivelmente, de pelo menos 1000 vezes. Compreende-se bem que o termo deva ainda referir-se a ligantes de reação cruzada ou multiespecíficos que reconheçam especificamente um ou mais antígenos diferentes.

[187] O termo "tratamento", tal como aqui utilizado, deve sempre se referir ao tratamento de indivíduos para fins profiláticos (por exemplo, para prevenir a infecção e /ou um quadro de enfermidade) ou terapêuticos (ou seja, efeitos no tratamento de doenças, independentemente da sua patogênese). O tratamento de um sujeito será tipicamente terapêutico em casos de alergia, doença autoimune ou câncer, ou profilático no tratamento de doenças infecciosas. O tratamento de um sujeito será tipicamente terapêutico em casos de doença, incluindo o câncer, tumores dependentes de gastrina ou câncer dependente de gastrina. No entanto, no caso de pacientes que sofram de uma doença primária, que estão em risco de progressão da doença ou em risco de desenvolver uma doença secundária ou reação secundária, por exemplo, que seja dependente da produção endógena de efeitos da gastrina, o tratamento poderá ser profilático.

[188] Também no caso de pacientes com alergia em risco de desenvolver uma doença, por exemplo, por causa de uma história familiar de alergia, o tratamento poderá ser profilático.

[189] Tal tratamento pode ser efetuado com a vacina de acordo com o invento como o único agente terapêutico ou profilático, ou então em combinação com quaisquer meios adequados, por exemplo, incluindo quimioterapia, ou o uso de antiácidos.

[190] O termo "combinação", conforme utilizado neste contexto, por exemplo, no que diz respeito à combinação dos compostos ou tratamentos, refere-se especificamente ao tratamento concomitante, simultâneo, consecutivo ou em paralelo de um sujeito.

[191] As seguintes doenças alérgicas específicas são tratadas de acordo com a invenção: rinoconjuntivite alérgica (febre do feno), asma alérgica, eczema alérgico, tal como o eczema atópico ou dermatite atópica.

[192] Para a terapia de alergia, as medidas terapêuticas adicionais específicas incluem a aplicação de corticosteroides (inalados) combinados com bronco- dilatadores na asma alérgica, cremes contendo esteroides (eczema atópico) e, em formas mais leves de alergia (por exemplo, febre do feno), anti-histamínicos e imunoterapias específicas.

[193] A alergia, onde as respostas polarizadas do tipo Th2, a secreção abundante de IL-4/IL-13 e a resposta dos anticorpos IgE são inadequadas e prejudiciais, é apenas um exemplo do fracasso de uma resposta imune. Outros exemplos são caracterizados por condições mediadas por Th1 relacionadas com doenças autoimunes sistêmicas.

[194] O tratamento de doenças autoimunes com a vacina de acordo com a invenção pode especificamente, entre outros exemplos, referir-se ao diabetes, síndrome de Guillain-Barré, lúpus eritematoso sistêmico, esclerose múltipla ou trombocitopenia.

[195] A profilaxia ou terapia de doenças infecciosas que empregam a vacina de acordo com a presente invenção refere-se especificamente a situações patológicas, tais como infecções microbianas, ou seja, condições causadas por infecções bacterianas, virais, fúngicas, por protozoários ou helmintos patogênicos. Para os fins da presente invenção, o termo "agente patogênico" é usado num sentido lato para se referir a um agente causador específico de uma doença ou distúrbio, e inclui qualquer agente que provoque uma resposta imune. Os agentes patogênicos incluem vírus, bactérias, fungos, protozoários, parasitas e outros semelhantes. Tipicamente, o imunógeno é derivado de um ou mais antígenos peptídicos, polipeptídicos, proteicos ou de hidratos de carbono produzidos por um agente patogênico. Os métodos para a identificação de antígenos adequados, obtendo-se e a preparação de tais moléculas, são bem conhecidos na arte.

[196] O tratamento de doenças infecciosas causadas por agentes patogênicos refere-se especificamente a, por exemplo, hepatite B, hepatite C, cólera, HIV, coqueluche, gripe ou febre tifoide.

[197] Os métodos de imunoterapia para o tratamento de tumores, como descritos aqui, referem-se especificamente a métodos e vacinas de acordo com a invenção para o tratamento de câncer de colo do útero, de mama, colorrectal, de próstata, de pulmão e melanoma.

[198] Na terapia do câncer, tratamentos terapêuticos adicionais incluem, por exemplo, a ressecção cirúrgica, radioterapia, quimioterapia, terapia hormonal, vacinas antitumorais, terapias com anticorpos, irradiação do corpo inteiro, transplante de medula óssea, transplante de células tronco do sangue periférico, e a administração de agentes quimioterápicos.

[199] Para o tratamento, a composição imunogênica ou vacina de acordo com a invenção pode ser administrada de uma vez só, ou pode ser dividida em componentes individuais e/ou num número de doses menores a serem administradas em intervalos de tempo. A vacina é tipicamente administrada a uma concentração de 0,1 a 500 μg / ml, por exemplo, por via subcutânea, intradérmica, intramuscular, intravenosa, por via oral, por inalação ou por via intranasal, com ou sem adjuvante adicional, tal como ALUM. Entende-se que a dosagem precisa e a duração do tratamento dependem da doença a ser tratada e podem ser determinadas empiricamente usando protocolos de teste conhecidos ou por extrapolação a partir de dados de teste in vivo ou in vitro.

[200] A composição imunogênica ou vacina do presente invento pode ser administrada por quaisquer meios adequados e respectivas formulações a fim de incluir, mas não se limitando a, por exemplo, qualquer injeção parenteral (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa e intradérmica), ou injeção local na área afetada, tais como articulações, ou dentro ou em torno do tumor. Numa forma de incorporação preferida, a vacina é proporcionada numa formulação para injeção intramuscular, subcutânea ou intradérmica.

[201] A invenção também fornece um dispositivo de aplicação, por exemplo, uma seringa, pré-preenchido com a vacina de acordo com a invenção.

[202] Tipicamente, após preparar um sujeito por meio de uma primeira injeção da vacina de acordo com a invenção, uma ou mais injeções de reforço podem ser realizadas ao longo de um período de tempo, pelas mesmas vias ou por vias diferentes de administração. Quando forem utilizadas múltiplas injeções, as injeções subsequentes podem ser efetuadas, por exemplo, no prazo de 1 a 52 semanas após a injeção anterior, ou até mais.

[203] A vacina pode conter tipicamente diluentes, tais como água, solução salina, glicerol, etanol, etc. Adicionalmente, na condição de substâncias auxiliares, agentes molhantes ou emulsionantes, substâncias tamponantes de pH e assemelhados podem estar presentes entre os excipientes. Tipicamente, a vacina de acordo com a invenção é preparada como uma substância injetável, seja na forma de soluções ou suspensões liquidas, ou forma de sólidos adequados para uma solução ou suspensão em veículos líquidos antes da administração. Os preparos podem também ser emulsionados ou encapsulados em lipossomas.

[204] A administração da vacina de acordo com a invenção pode ser adequadamente e adicionalmente combinada com qualquer um dos agonistas ou antagonistas TLR9 e /ou outras medidas adjuvantes para aumentar o efeito imunorregulador ou resposta imune. Uma resposta imune ampliada pode incluir uma ou mais de uma resposta imune Th1, Th2, Th17 ou Treg reforçada.

[205] Uma resposta imune Th1 ampliada pode incluir um aumento em uma ou mais das citocinas associadas a uma resposta imune do tipo Th1 (tal como IFNY), e um aumento de macrófagos ativados.

[206] Uma resposta imune Th1 ampliada pode incluir um ou mais de um aumento de anticorpos IgG antígeno-específicos, em especial anticorpos IgG1.

[207] Por exemplo, a composição imunogênica ou vacina do invento pode ser em associação (por exemplo ligada quimicamente ou de forma recombinante, unida por ligação de afinidade ou uma mistura de componentes separados) com um ou mais adjuvantes e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. A vacina de acordo com a invenção pode incluir um ou mais excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis, tais como água, solução salina, glicerol, etanol, etc. Adicionalmente, substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsionantes, substâncias tamponantes de pH e assemelhados, podem estar presentes em tais veículos. Os adjuvantes podem especificamente ser utilizados para melhorar a eficácia da vacina. Os adjuvantes podem ser diretamente adicionados às composições de vacinas ou podem ser administrados separadamente, seja simultaneamente ou logo após a administração da vacina.

[208] Os adjuvantes adequados incluem citocinas e compostos semelhantes que ajudam a orquestrar uma resposta imunitária ao imunógeno. Tal como aqui utilizado, o termo "citocina" é utilizado como um nome genérico para um grupo diverso de proteínas e peptídeos solúveis que atuam como reguladores humorais em concentrações entre nano e picomolares e que, quer em condições normais ou patológicas, modulam as atividades funcionais de células e tecidos individuais. Estas proteínas também fazem a mediação de interações entre células diretamente e regulam os processos que ocorrem no ambiente extracelular.

[209] Exemplos de citocinas incluem IL-1, IL-4, TNFα, IFNα, INFY, GM-CSF e G-CSF.

[210] Oligonucleotídeos CpG também podem ser utilizados como um adjuvante em conjunto com a apresentação dos respectivos epítopos. Outros adjuvantes incluem Alum, adjuvante (in)completo de Freund, B. pertussis ou sua toxina, IC31, etc.

[211] Os componentes da composição imunogênica, ou seja, o componente adjuvante direcionado, por exemplo, o radical anti-CD32 ligado ao ligando TLR9 e à primeira alfa-hélice peptídica, e o componente imunogênico, por exemplo, compreendendo o imunógeno peptídico ligado à segunda alfa-hélice peptídica, que corresponde à primeira, bem como a composição imunogênica ou vacina, ou qualquer das suas porções de ligação ou ligandos e o imunógeno com ou sem as repetições em espiral podem ser obtidos por diversos métodos conhecidos na área, por exemplo, por purificação ou isolamento a partir de cultura de células, tecnologia recombinante ou síntese química.

[212] De acordo com uma forma de incorporação específica, a composição imunogênica e /ou o componente adjuvante direcionado e /ou o seu componente imunógeno é produzido como um polipeptídeo recombinante, tal como por tecnologia de DNA recombinante. Tal como aqui utilizado, o termo "recombinante" refere-se a uma molécula ou construto que não ocorre naturalmente numa célula hospedeira. Em algumas concretizações, as moléculas de ácido nucleico recombinantes contêm duas ou mais sequências que ocorrem naturalmente, que são ligadas entre si de uma maneira que não ocorre naturalmente. Uma proteína recombinante refere-se a uma proteína que é codificada e /ou expressa por um ácido nucleico recombinante. Em algumas formas de incorporação, as "células recombinantes" expressam genes que não são encontrados dentro de uma forma idêntica dentro da forma nativa (isto é, não recombinante) da célula e /ou expressam genes nativos que de outra forma seriam anormalmente superexpressos, subexpressos, e /ou não expressos devido à intervenção humana deliberada. As células recombinantes contêm pelo menos um polinucleotídeo ou polipeptídeo recombinante. "Recombinação", "recombinante" e a geração de um ácido nucleico "recombinante" geralmente abrangem o conjunto de pelo menos dois fragmentos de ácidos nucleicos. Em certas formas de incorporação, as proteínas recombinantes e ácidos nucleicos recombinantes permanecem funcionais, isto é, mantêm a sua atividade ou exibem uma atividade aumentada na célula hospedeira.

[213] Assim, a invenção refere-se também à produção da composição imunogênica ou seus componentes, e meios recombinantes para tal produção, incluindo um ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos, um cassete de expressão, um vetor ou plasmídeo que compreende o ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos a ser expressa, e uma célula hospedeira compreendendo qualquer dos referidos meios. Técnicas convencionais de DNA recombinante adequadas são conhecidas na área e são descritas, inter alia, em Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual’ (1989), 2a edição (Cold Spring Harbor Laboratory press).

[214] O termo "vacina sensibilizante" é aqui entendido da forma a seguir. Um sujeito pode ser submetido à sensibilização específica aos componentes da vacina, excetuando o imunógeno, de modo a induzir uma resposta imune humoral específica. De acordo com a presente invenção, por exemplo, um sujeito é sensibilizado pelo tratamento com a vacina sensibilizante da invenção que compreende o adjuvante direcionado e a alfa-hélice peptídica, de preferência, a espiral enrolada ou a hélice dupla para estabilizar a molécula. Assim, o imunógeno conforme utilizado na vacina imunorreguladora de acordo com a invenção, especificamente, não é empregado em tal vacina sensibilizante. Após a administração da vacina sensibilizante em um sujeito, o sujeito pode desenvolver a resposta imune contra os epítopos da vacina sensibilizante. O tratamento adicional do mesmo sujeito com a vacina imunorreguladora de acordo com a invenção induzirá, em seguida, a resposta imunitária específica ao imunógeno que é necessário para o tratamento ou prevenção da doença. Graças à sensibilização, a memória imunológica existente e potencialmente nociva para partes do imunógeno, por exemplo, no caso de pacientes alérgicos, não irá provocar reações imunológicas indesejadas contra as partes da vacina para as quais o paciente é naive antes da imunização.

[215] Aqui o termo “sujeito” é entendido como abrangendo sujeitos humanos ou mamíferos, inclusive gado, animais de estimação e animais de laboratório, em particular seres humanos que sejam pacientes sofrendo de uma doença específica ou sujeitos sadios.

[216] A invenção proporciona ainda um kit de componentes para preparar a composição imunogênica da invenção, por exemplo, um kit farmacêutico compreendendo um ou mais recipientes cheios com os componentes. Os kits podem ser utilizados nos métodos descritos acima. Em uma forma de incorporação particular, o kit compreende ainda instruções para utilizar os componentes da composição imunogênica ou a composição imunogênica ou a vacina preparada da invenção.

[217] Os componentes da vacina, isto é, o componente adjuvante direcionado e o componente imunogênico, bem como a vacina, ou qualquer das suas porções de ligação ou ligandos e o imunógeno com ou sem as repetições de espiral podem ser obtidos por vários métodos conhecidos na área, por exemplo, por purificação ou isolamento a partir de cultura de células, tecnologia recombinante ou síntese química.

[218] Portanto, a presente invenção prevê uma vacina exclusiva e as respectivas aplicações.

[219] De acordo com um exemplo específico, a vacina de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo recombinante de SEQ ID 19: EVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWLNTY TGESIYPDDFKGRFAFSSETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARGDYGYDDPLDYW GQGTSVTVSS GGGGSGGGGSGGGGS DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLL HTNGNTYLHWFLQRPGQSPQLLIYRMSVLASGVPDRFSGSGSGTAFTLSISRVEAE DVGVFYCMQHLEYPLTFGAGTKLELKGSISAWSHPQFEKGPEVSALEKEVSALEKE VSALEKEVSALEKEVSALEK N-terminal sublinhado: sequência de ScFV especificamente ligando-se ao CD32a; Itálico: Conector; qualquer conector alternativo comumente utilizado em preparos de scFv pode ser utilizado. Negrito: StrepTag II para purificação, qualquer tag alternativo poderá ser usado, por exemplo, flag tag ou HIS tag. C-terminal sublinhado duplamente: alfa-hélice com repetição do heptad (pepE) para formar a espiral enrolada com a alfa-hélice com repetição do heptad oposta no imunógeno (pepK). Neste exemplo (SEQ ID 19), 5 repetições são utilizadas; mais repetições podem provocar autoagregação e menos repetições podem reduzir a afinidade. O número funcional mínimo preferido de repetições das espirais utilizadas é 3 e o número funcional máximo preferido é 5 42-44 , mas mais repetições são viáveis, dependendo do tipo de alfa-hélice que é utilizado. O número de repetições que começam a induzir a homodimerização seria o limite. Assim, a homodimerização está especificamente excluída.

[220] Polipeptídeos similares podem compreender uma sequência de comando, a sequência de aminoácidos de uma porção anti-CD32 específica, que é, por exemplo um scFv recombinante, um conector, um marcador para fins de purificação e a sequência da alfa-hélice peptídica pepE. Este construto com ou sem o ligando TLR9 também é chamado de "ogiva", que pode depois ser utilizado para construir uma vacina por combinação com um imunógeno ligado à alfa-hélice oposta pepK.

[221] De acordo com um outro exemplo específico, a porção anti-CD32 é um peptídeo anti-CD32a com a sequência de SEQ ID 20: ADGAWAWVWLTETAVGAA45 usado como uma alternativa ao ScFv.

[222] De acordo com um outro exemplo, um imunógeno contendo uma espiral compreendendo um alergeno, tal como os epítopos de células T Der P1 e Der P2, é preparado. A alfa-hélice peptídica é adequadamente ligada ao imunógeno através de um ligante para permitir flexibilidade.

[223] De acordo com um outro exemplo, uma espiral enrolada estável é estabelecida entre a ogiva scFv e o imunógeno.

[224] De acordo com outro exemplo, um imunógeno contendo uma espiral é preparado, compreendendo cerca de 29 epítopos diferentes de célula T de um alergeno.

[225] Num outro exemplo, pôde-se demonstrar que a ogiva mediou a apresentação ampliada de antígenos. As células T foram estimuladas de forma eficaz quando o imunógeno com a espiral (pepK coil) interagiu com a ogiva contendo a espiral correspondente (pepE coil).

[226] Em outro exemplo, provou-se que o agonista TLR9 CpG mediou a ativação de células T reativas autoimunes.

[227] No entanto, em outro exemplo, o tratamento de alergia é descrito usando uma ogiva que emprega ou o peptídeo anti-CD32 scFv ou o CD32a ligado pela espiral enrolada ao imunógeno alergeno-específico.

[228] De acordo com um outro exemplo, uma espiral enrolada estável é estabelecida entre a ogiva scFv e o imunógeno.

[229] Foi comprovado que as PBMCs podiam ser eficazmente estimuladas com esse imunógeno ou com a vacina.

[230] Num outro exemplo, pôde-se demonstrar que a ogiva mediou a apresentação ampliada de antígenos. As células T foram estimuladas de forma eficaz quando o imunógeno com a espiral (pepK coil) interagiu com a ogiva contendo a espiral correspondente (pepE coil).

[231] Em outros exemplos, descreve-se o tratamento de câncer pancreático num modelo de camundongo e num modelo de macaco rhesus usando uma ogiva que emprega ou o peptídeo anti-CD32 scFv ou o peptídeo CD32a ligado pela espiral enrolada ao imunógeno peptídico G13. O controle do apetite e a redução do apetite são descritos no modelo de macaco rhesus.

[232] Portanto, a presente invenção prevê uma composição imunogênica exclusiva e uma vacina e as respectivas aplicações.

[233] A descrição anterior será compreendida mas plenamente com referência aos exemplos seguintes. Tais exemplos são, no entanto, meramente representativos dos métodos de concretização de uma ou mais formas da presente invenção e não devem ser interpretados como limitantes do escopo da invenção.

[234] EXEMPLOS

[235] Exemplo 1: Ogiva ScFV contendo espiral Sequência de aminoácidos 1. (SEQ ID 21)

AA 1-19: sequência líder (para secretar o produto) AA 20-271 sequência de ScFV (o domínio VH é sublinhado, VI é sublinhado duplamente) (a ordem do domínio VH e VL pode ser trocada) AA140-154 O conector pode ser mudado para qualquer conector usado no preparo de ScFV AA 272-279: O StrepTag II para purificação pode ser trocado por qualquer tipo de tag, por exemplo, flag tag ou HIS tag. AA280-281: conector curto (pode ser mais longo) AA282-316: alfa-hélice de repetição heptad (pepE) para formar a espiral enrolada com a alfa- hepta de repetição heptad correspondente no imunógeno (pepK). No exemplo, são utilizadas 5 repetições, mais repetições podem provocar a autoagregação e menos repetições reduzirão a afinidade, no entanto, 4 repetições ainda são funcionais. O número funcional mínimo de repetições para as espirais utilizadas é 3 e 546-48 Um agonista TRL9 tal como o CpG pode ser acoplado à ogiva, por exemplo, usando um acoplamento químico utilizando o kit de acoplamento oligo - anticorpo Solulink. Um agonista TRL9 peptídico pode ser acoplado utilizando a química padrão dos peptídeos.

[236] Exemplo 2: Ogiva peptídica contendo a espiral enrolada Sequência de aminoácidos 2 (SEQ ID 22):

AA1-19 sequência do peptídeo aCD32a publicada por Berntzen et al45 AA20-24 e AA32-33: Os conectores podem ser trocados por qualquer conector, incluindo conectores mais longos, para permitir flexibilidade entre as duas sequências conectadas. AA24-31: O StrepTag II para purificação pode ser trocado por qualquer tipo de tag, por exemplo, flag tag ou HIS tag AA34-68: alfa-hélice de repetição heptad (pepE) para formar a espiral enrolada com a alfa- hélice de repetição heptad correspondente no imunógeno (pepK). No exemplo, são utilizadas 5 repetições, mais repetições podem provocar a autoagregação e menos repetições reduzirão a afinidade, no entanto, 4 repetições ainda são funcionais. O número funcional mínimo de repetições para as espirais utilizadas é 3 e 549-51. Um agonista TRL9 tal como o CpG pode ser acoplado à ogiva usando acoplamento químico, por exemplo, utilizando o kit de acoplamento oligo - anticorpo Solulink. Um agonista TRL9 peptídico pode ser acoplado utilizando a química padrão dos peptídeos.

[237] Exemplo 3: Imunógeno 3 contendo espiral (epítopos de células T Der P1 e Der P2 baseados na expressão de Classe II humana) Sequência de aminoácidos 3 (SEQ ID 23):

AA1-6 O His tag para purificação pode ser trocado por qualquer tipo de tag, por exemplo, flag tag ou StrepTag II. O tag pode também ser posicionado entre o conector e a alfa- hélice ( ver exemplo 4). O terminal C não é preferido, uma vez que este pode interferir com a funcionalidade das espirais enroladas. AA208-219: O conector entre os peptídeos de alergeno e o conector (pode ser trocado por qualquer outro conector para permitir a flexibilidade entre as duas sequências conectadas). A cisteína sublinhada pode ser removida da sequência. AA220-254: Alfa-hélice de repetição heptad (pepK) para formar a espiral enrolada com a alfa- hélice de repetição heptad correspondente na ogiva (pepE). No exemplo, são utilizadas 5 repetições, mais repetições podem provocar a autoagregação e menos repetições reduzirão a afinidade, no entanto, 4 repetições ainda são funcionais. O número funcional mínimo de repetições para as espirais utilizadas é 3 e 552-54. AA6-54: epítopos de célula T do Der p1 (AA181-220 da proteína nativa): YYRYVAREQSCRRPNAQRFGISNYCQIYPPNANKIREALAQTHSAIAV (SEQ ID 24) Negrito e itálico são epítopos de células T previstos apresentados pela Classe HLA AA55-88: epítopos de célula T do Der p1 (95-128): DLRQMRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYL (SEQ ID 25) Negrito e itálico são epítopos de células T previstos apresentados pela Classe HLA AA89-108: epítopos de célula T do Der p2: (AA85-104 da proteína nativa): QQYDIKYTWNVPKIAPKSEN (SEQ ID 26) Negrito e itálico são epítopos de células T previstos apresentados pela Classe HLA AA109-134: epítopos de célula T do Der p2: (AA105-130 da proteína nativa): VVVTVKVMGDDGVLACAIATHAKIRD (SEQ ID 27) Negrito e itálico são epítopos de células T previstos apresentados pela Classe HLA AA135-183: epítopos de célula T do Der p1 (AA228-276 da proteína nativa): DAFRHYDGRTIIQRDNGYQPNYHAVNIVGYSNAQGVDYWIVRNSWDTNW (SEQ ID 28) Negrito e itálico são epítopos de células T previstos apresentados pela Classe HLA AA184-208: epítopos de célula T do DerP2: (AA11-45 da proteína nativa): HEIKKVLVPGCHGSEPCIIHRGKPF (SEQ ID 29) Negrito e itálico são epítopos de células T previstos apresentados pela Classe HLA

[238] Exemplo 4: Formação de uma espiral enrolada estável entre a ogiva ScFV e o imunógeno 3. O imunógeno 3 foi imobilizado no sensor de biochip CM5 BIACore na célula de fluxo 1, 2 e 3 utilizando procedimentos padrão e resultando em unidades de resposta de ~700, subsequentemente a ogiva (10μg/ml em PBS) foi injetada na célula de fluxo 1 e um aumento de massa dependente do tempo foi mensurado (constante de associação), após ~160 segundos o tampão foi alterado para PBS somente. A constante de dissociação indica a estabilidade da ligação entre a ogiva e o imunógeno, a célula foi injetada somente com PBS. Quando a ogiva foi pré-incubada com espiral pepK e subsequentemente injetada na célula de fluxo 2, não foi observada ligação da ogiva ao biochip. Da mesma forma, quando o biochip foi pré-incubado com pep E (célula de fluxo 3) antes da injeção com a ogiva, não se observou ligação da ogiva com o imunógeno (ver a Figura 1)

[239] Exemplo 5: Imunógeno 5-12 contendo espiral (~29 epítopos de célulaT de Der p1, Der p2, Der p3, Der p4, Der p7, Der p9, Der p10, Der p11, Der p14, Der p15, baseados na expressão de Classe II humana) Sequência de aminoácidos 3 (SEQ ID 30): Imunógeno 5-12:

AA1369-274 O His tag para purificação pode ser trocado por qualquer tipo de tag, por exemplo, flag tag ou StrepTag II. O tag pode também ser posicionado entre o conector e a alfa- hélice (ver exemplo 4). O terminal C não é preferido, uma vez que este pode interferir com a funcionalidade das espirais enroladas. AA365-368 e 375-381: Conectores entre os peptídeos de alergenos HIS tag e pepK. Os conectores (podem ser trocados por qualquer outro conector para permitir flexibilidade entre as duas sequências conectadas). A cisteína sublinhada (Cys379) é preferivelmente removida da sequência. AA382-416: Alfa-hélice de repetição heptad (pepK) para formar a espiral enrolada com a alfa- hélice de repetição heptad correspondente na ogiva (pepE). No exemplo, são utilizadas 5 repetições, mais repetições podem provocar a autoagregação e menos repetições reduzirão a afinidade, no entanto, 4 repetições ainda são funcionais. O número funcional mínimo de repetições para as espirais utilizadas é 3 e 555-57. A ogiva (baseada em ScFVcoil1 IV.3 + ODNM362) é misturada com o Imunógeno 5-12 numa proporção que indica que 10% a 100% da ogiva é ligada ao imunógeno através da estrutura em espiral enrolada, de preferência sem imunógeno livre ou com menos de 50% de imunógeno livre, e formulada em Alum. Como exemplo e posteriormente descrito abaixo, de acordo com uma forma de incorporação preferida, a invenção provê uma vacina onde a vacina imunorreguladora do invento compreende - um adjuvante direcionado que é composto da porção anti-CD32 ligada à primeira alfa-hélice compreendendo ou consistindo na sequência de SEQ ID 70, a qual está acoplada ao ligando TLR9 da SEQ ID 69, por exemplo, numa razão de 1: 1-18 (molécula por molécula); e - um imunógeno que compreende ou consiste no imunógeno de SEQ ID 30, ligado à segunda hélice-alfa, de preferência à SEQ ID 75, ou uma variante funcionalmente ativa, de preferência uma variante em que Cys379 é removido, ou em que a ordem dos peptídeos derivados de alergenos é alterada onde o adjuvante direcionado e o imunógeno são ligados um ao outro através da estrutura de espiral enrolada formada pela primeira e segunda alfa-hélices. Epítopos de células T (há 15 peptídeos derivados de alergenos no immo5-12: 1-2-34-5-6-7-8-9-10-11-12-13-14-15) A ordem dos peptídeos derivados dos alergenos HDM foi otimizada visando à solubilidade, mas qualquer outra ordem também é possível. 1) AA: 1-14 Der p2 (AA116-129 da proteína nativa) GVLACAIATHAKIR (SEQ ID 31) Negrito e itálico são os epítopos de células T previstos apresentados pela classe HLA 2) AA: 15-51 Der p11 (AA697-733 da proteína nativa) EQERLVKLETVKKSLEQEVRTLHVRIEEVEANALAGG (SEQ ID 32) Negrito e itálico são os epítopos de células T previstos apresentados pela classe HLA 3) AA: 52-72 Der p1 (AA95-115 da proteína nativa) DLRQMRTVTPIRMQGGCGSCW (SEQ ID 33) Negrito e itálico são os epítopos de células T previstos apresentados pela classe HLA 4) AA: 73-92 Der p10 (AA219-238 da proteína nativa) EAHEQQIRIMTTKLKEAEAR (SEQ ID 34) Negrito e itálico são os epítopos de células T previstos apresentados pela classe HLA 5) AA: 93-106 Der p2: (AA85-98 da proteína nativa) QQYDIKYTWNVPKI (SEQ ID 35) Negrito e itálico são os epítopos de células T previstos apresentados pela classe HLA 6) AA: 107-132 Der p1 (AA251-276 da proteína nativa) AVNIVGYSNAQGVDYWIVRNSWDTNW (SEQ ID 104) Negrito e itálico são os epítopos de células T previstos apresentados pela classe HLA 7) AA: 133-150 Der p4 (AA2-19 da proteína nativa): YHNPHFIGNRSVITHLME (SEQ ID 105) Negrito e itálico são os epítopos de células T previstos apresentados pela classe HLA 8) AA: 151.181 Der p7 (AA66-96 da proteína nativa): DLKGELDMRNIQVRGLKQMKRVGDANVKSED (SEQ ID 36) Negrito e itálico são os epítopos de células T previstos apresentados pela classe HLA 9) AA: 182-203 Der p1 (AA228-252 da proteína nativa) DAFRHYDGRTIIQRDNGYQPNY (SEQ ID 37) Negrito e itálico são os epítopos de células T previstos apresentados pela classe HLA 10) AA: 204-235 Der p9 (AA54-85 da proteína nativa): LDEYWILTAAHCVDGQT VSKLIRSKVL GEKIS (SEQ ID 38) Negrito e itálico são os epítopos de células T previstos apresentados pela classe HLA 11) AA: 236-260 Der p1 (AA181-205 da proteína nativa) YYRYVAREQSCRRPNAQRFGISNYC (SEQ ID 39) Negrito e itálico são os epítopos de células T previstos apresentados pela classe HLA 12) AA: 261-271 Der p2 (AA105-115 da proteína nativa) VVVTVKVMGDD (SEQ ID 40) Negrito e itálico são os epítopos de células T previstos apresentados pela classe HLA 13) AA: 272-294 Der p15 (AA251-273 da proteína nativa) ELHTYFNVNYTMHYYLNNGATRD (SEQ ID 41) Negrito e itálico são os epítopos de células T previstos apresentados pela classe HLA 14) AA: 295-327 Der p3 (AA58-90 da proteína nativa) ILDEYWILTAAHCVAGQTASKLSIRYNSLKHSL (SEQ ID 42) Negrito e itálico são os epítopos de células T previstos apresentados pela classe HLA 15) AA: 328-364 Der p14 (AA1061-1097 da proteína nativa) FKYRPFKVNELNLEGEFGRELQHKFRLMRNSQMEVEE (SEQ ID 43) Negrito e itálico são os epítopos de células T previstos apresentados pela classe HLA

[240] Exemplo 6: Estimulação das PBMCs do Macaco com Imunógeno 3 As PBMCs (100.000 /poço) de macacos rhesus (Macaca mulatta) sensibilizados com Der P1 foram cultivadas em triplicata com meio, 3 Der p1 ou 3 e 5 μg/ml de imunógeno 3 a 37°C /5% de CO2 na presença de 20 U/ml de IL-2. A proliferação foi avaliada por incorporação de [3H] -timidina (0,5 μCi /poço) durante as últimas 18 horas de uma cultura de 2 dias. As células foram recolhidas para contagem de cintilação beta (Topcount NXT, Packard, Ramsey, MN, EUA). Os resultados são apresentados como contagens por minuto. Além disso, a partir de culturas paralelas, os sobrenadantes foram analisados em duplicata quanto aos níveis de IL-10 e GM- CSF, utilizando um kit ELISA disponível no mercado (U-Cytech, Utrecht, Holanda) de acordo com as instruções do fabricante. Ver Figura 2. Não há diferença não-significativa entre a resposta ao Der p1 ou ao imunógeno 3 nem na proliferação ou na produção de citocinas, indicando que os epítopos das células T no imunógeno 3, que foram selecionados com base na expressão de HLA de classe II humana, são igualmente bem apresentados pelas moléculas de classe II do macaco rhesus.

[241] Exemplo 7: Apresentação ampliada de antígenos mediada pela ogiva As PBMCs (100.000/poço) de macacos rhesus sensibilizados por Der p1 (Macaca mulatta) foram pré-incubadas (30 min em gelo) com 1 μg/ml da ogiva scFv e lavadas 3 vezes com PBS, ou pré-incubadas com apenas PBS e lavadas três vezes. Subsequentemente, estas células foram incubadas (30 min em gelo) com diferentes concentrações de Imunógeno 3 ou Der p1 a 3 μg/ml e lavadas 3 vezes com PBS, após o que as células foram cultivadas a 37°C /5% de CO2, na presença de 20 U/ml de IL-2 durante 48 horas. Como um controle positivo, PBMCs (sem pré-incubação da ogiva) foram incubadas com 3 μg/ml de Der P1 sem lavagem e cultivadas a 37°C /5% de CO2, na presença de 20 U/ml de IL-2. A proliferação foi avaliada por incorporação de [3H] -timidina (0,5 μCi /poço) durante as últimas 18 horas de uma cultura de 2 dias. As células foram recolhidas para contagem de cintilação beta (Topcount NXT, Packard, Ramsey, MN, EUA). Os resultados são apresentados como contagens por minuto. Ver Figura 3. A fim de estimular as células T, o antígeno tem que ser internalizado e processado por células apresentadoras de antígenos. Isto pode ser obtido fazendo a cultura das células T e APC na presença do antígeno ou por direcionamento do antígeno a um receptor de superfície celular capaz de internalizar e relocar nos lisossomos58-62. De acordo com a literatura, a estimulação de PBMCs com imunógeno pré-incubado na ausência da ogiva não provocou proliferação (dados não apresentados). Também a pré-incubação com Der p1 na presença da ogiva não provocou proliferação. No entanto, quando as PBMCs foram pré-incubadas com 1 μg/ml de ogiva ScFv, sendo lavadas e subsequentemente incubadas com diferentes concentrações de imunógeno 3 e lavadas, uma estimulação dose-dependente foi observada, a qual foi ainda maior do que o controle positivo, onde as PBMCs foram cultivadas por 48 horas na presença de 3 μg/ml de Der p1 sem lavagem. Assim, somente quando o imunógeno (que contém o pepK coil) foi capaz de interagir com a ogiva (contendo o pepE coil), de modo que uma espiral enrolada estável fosse formada, é que a estimulação foi observada. A Ogiva em combinação com Der P1 não levou à estimulação visto que o Der P1 não possui a espiral e não se liga às PBMCs.

[242] Exemplo 8. Ativação mediada por CpG das células T reativas autoimunes As PBMCs (100.000 /poço) de macacos rhesus (Macaca mulatta) ou doadores humanos normais foram incubadas em triplicata com 50 μM de CpG ou CpG-biot. Paralelamente, as PBMCs foram pré-incubadas (30 min em gelo), 1 μg/ml de ogiva ScFv biotinilada e subsequentemente lavadas 3x e subsequentemente incubadas com 50 μM de CpG. Os sobrenadantes foram analisados em duplicata quanto aos níveis de IL-4 e IFN gama, utilizando um kit ELISA disponível no mercado de acordo com as instruções do fabricante. Ver a Figura 4. O CpG não induziu uma resposta específica de células T nas células do macaco ou nas células humanas (barras à esquerda) nem aumentaram ou induziram uma resposta das células T contra a proteína biotinilada que foi coadministrada (barras à direita). Somente quando CpG e biotina foram fisicamente ligados (barras verdes) é que uma resposta específica contra a biotina foi induzida. Uma vez que a biotina (também chamada de vitamina B7, vitamina H e vitamina B8) é uma automolécula, não deve ocorrer resposta imune. No entanto, quando a biotina é apresentada por células apresentadoras de antígenos ativadas por TLR9, a tolerância das células T é quebrada, indicando que a ligação física de um agonista TLR9 à autoproteína conduzirá a uma resposta imune que, no caso de a autoproteína ser um antígeno associado a um tumor (TAA), poderá ser utilizada para tratar o câncer. “Ligação física” significa diretamente acoplado ao TAA ou indiretamente utilizando a ogiva e um TAA acoplado com (ou contendo a) uma espiral que interage com a espiral da ogiva. O último é o preferido. Qualquer outra forma de complexo entre o agonista TRL9 e TAA pode ser utilizado também, desde que seja assegurado que o agonista TLR9 e o TAA sejam absorvidos pela mesma APC (célula apresentadora de antígenos).

[243] Exemplo 9: Tratamento do câncer Em contraste com o tratamento da alergia, a ogiva que é utilizada para o tratamento do câncer deve ligar-se predominantemente com o CD32a e não ao CD32b. A ogiva do exemplo 1 e 2 são preferidas para uso no tratamento do câncer.

[244] Exemplo 10: Estímulo das PBMCs humanas com Imunógeno 5-12 As PBMCs (100.000/poço) de doadores normais sensibilizadas com Der p1 foram cultivadas em triplicata com meio, 3 μg/ml de Der p1 ou 5, 1 ou 0,5 μg/ml de imunógeno 5-12 (Immo5-12) em 37°C/5% de CO2 durante 24 h. Os sobrenadantes foram analisados em duplicata quanto aos níveis de IL-10 e IFNg usando kits ELISA comercialmente disponíveis (eBioscience), de acordo com as instruções do fabricante. Ver Figura 5.

[245] Exemplo 11: Tratamento de enfermidades autoimunes Uma vacina compreendendo uma ogiva que reconhece o CD32a e CD32b, uma espiral enrolada e um antagonista ou agonista TLR9 que induz a sinalização inibidora TLR9 (referências) combinado com um autoantígeno. Uma vacina deste tipo não irá induzir novos anticorpos contra qualquer parte da vacina incluindo o autoantígeno e é, por conseguinte, segura para uso em tais pacientes. O uso de um CpG inibidor (ODN inibidor) nesta vacina irá induzir células T reguladoras contra a vacina, incluindo o autoantígeno. O mesmo acontecerá quando um agonista CpG do grupo 1 ou 2 é usado. Um agonista TLR9 de grupo 3 não é preferido, ainda que isso leve à indução de mais autoimunidade (ver a figura 4).

[246] Exemplo 12: Ligandos exemplares 12.1 . Região de ligação CD32, aqui também chamada de porção anti-CD32 ou ligante CD32 Ligandos CD32a: Anticorpo especificamente ligando-se ao CD32a: mAb IV.3 (Stuart et al. (1987) J. Exp. Med. 166: 1668) ScFV derivado de mAb IV.3 (VH-conector-VL): (SEQ ID 44) EVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWLNTY TGESIYPDDFKGRFAFSSETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARGDYGYDDPLDYW GQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSL LHTNGNTYLHWFLQRPGQSPQLLIYRMSVLASGVPDRFSGSGSGTAFTLSISRVE AEDVGVFYCMQHLEYPLTFGAGTKLELKGSI Sublinhado: domínio VH Negrito: domínio HL Conjunto de tipo normal. Conector flexível (talvez qualquer conector) Peptídeo anti-CD32a: Berntzen et al. (J. Biol. Chem. (2009) 284: 1126-1135): (SEQ ID 45) ADGAWAWVWLTETAVGAAK Grupo de ligantes CD32a+b: Anticorpo especificamente ligando-se ao CD32a e CD32b: mAb AT-10 (AbD Serotec) ScFV derivado de mAb AT-10 (VH-conector-VL): (SEQ ID 46) EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSYYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLK SNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKNNVYLQMNNLRAEDTGIYYCNRRDEYYAMDY WGQGTSVSVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPGSLAVSLGQRATISCRASES VDNFGISFMNWFQQKPGQPPRLLIYGASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVE EDDAAMYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEIKGSI Sublinhado: domínio VH Negrito: domínio HL Conjunto de tipo normal. Conector flexível (talvez qualquer conector) fragmento IgG1 (domínio CH2-CH3): (SEQ ID 47) (PKSCDKTHTCPPCP) PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTÇVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGK Entre () é a região de dobradiça que pode ser omitida Sublinhado: domínio ÇH2 Negrito: domínio ÇH3 12.2 Porção ou região de ligação TLR9, aqui também chamada de ligando TLR9 ÇpG classe A Grupo ÇpG-A: ODN2216: (SEQ ID 48) GGGGGAÇGATÇGTÇGGGGGG ÇpG classe B Grupo CpG-B: Ligandos naturais: ODN2006: (SEQ ID 49) TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT Ligandos peptídicos (peptídeos imunoestimulantes):

Tais peptídeos imunoestimulantes podem ser preferencialmente utilizados como um mímico de CpG. Do mesmo modo, as variantes funcionalmente ativas dos mesmos podem ser utilizadas, as quais são fragmentos, mutantes ou híbridos, incluindo suas combinações. As variantes funcionalmente ativas são especificamente caracterizadas pelo fato de estimular pDCs, induzindo assim um aumento do nível de IL-6 e /ou TNF alfa e /ou IFN alfa, em comparação com um controle negativo. As variantes funcionalmente ativas dos peptídeos imunoestimulantes que se ligam ao TLR9 especificamente a) têm pelo menos 60% de homologia ou identidade de sequência com qualquer dos peptídeos de SEQ ID 73-91, de preferência pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90%; b) são mutantes de qualquer dos peptídeos de SEQ ID 50-68, que podem ser obtidos por modificação da sequência de aminoácidos original pela inserção, deleção ou substituição de um ou mais aminoácidos no interior da sequência ou em uma ou ambas as extremidades distais da sequência, preferencialmente menos do que 5, 4, 3, 2 ou 1 mutações de ponto; ou c) são fragmentos de qualquer um dos peptídeos de SEQ ID 50-68, compreendendo pelo menos 50% da sequência original, ou pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, ou pelo menos 90%; ou pelo menos 5 aminoácidos, de preferência pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10 ou pelo menos 11 aminoácidos. CpG classe C Grupo CpG-C ODNM362: (SEQ ID 69) TCGTCGTCGTTCGAACGACGTTGAT 12.3 Exemplos de produtos de ligação ao CD32 com espirais ScFV-coil 1 (IV.3): (SEQ ID 70) EVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWLNTY TGESIYPDDFKGRFAFSSETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARGDYGYDDPLDYW GQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSL LHTNGNTYLHWFLQRPGQSPQLLIYRMSVLASGVPDRFSGSGSGTAFTLSISRVE AEDVGVFYCMQHLEYPLTFGAGTKLELKGSISAWSHPQFEKGPEVSALEKEVSAL EKEVSALEKEVSALEKEVSALEK Sublinhado: domínio VH Negrito: domínio HL Conjunto de tipo normal. Conector flexível (talvez qualquer conector) Em itálico: pepE coil mais sequência C’ StrepTag II e o conector “GP” pode ser qualquer conector flexível (StrepTag II pode ser removido ou substituído pelo HIS Tag ou qualquer outro tag) ScFV-coil 2 (AT10): (SEQ ID 71) EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSYYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLK SNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKNNVYLQMNNLRAEDTGIYYCNRRDEYYAMDY WGQGTSVSVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPGSLAVSLGQRATISCRASES VDNFGISFMNWFQQKPGQPPRLLIYGASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVE EDDAAMYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEIKGSISAWSHPQFEKGPEVSALEKEVSAL EKEVSALEKEVSALEKEVSALEK Sublinhado: domínio VH Negrito: domínio HL Conjunto de tipo normal. Conector flexível (talvez qualquer conector) Em itálico: pepE coil mais sequência C’ StrepTag II e o conector “GP” pode ser qualquer conector flexível (StrepTag II pode ser removido ou substituído pelo HIS Tag ou qualquer outro tag) Peptídeo-coil: (SEQ ID 72) ADGAWAWVWLTETAVGAAKGPEVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEK Em itálico: pepE coil mais o conector “GP” que pode ser qualquer conector flexível IgG1 Fc fragmento-coil: (SEQ ID 73) (PKSCDKTHTCPPCP) PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGKGPEVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEK Entre ()é a região de dobradiça que pode ser omitida Sublinhado: domínio CH2 Negrito: domínio CH3 Em itálico: pepE coil mais o conector “GP” que pode ser qualquer conector flexível 12.4. Exemplos de produtos de ligação ao TLR9 com grupo SH para ligação cruzada química ao ligando CD32 Grupo CpG-A: ODN2216_SH: (SEQ ID 48) GGGGGACGATCGTCGGGGGG-SH Em negrito, o conector flexível com o grupo SH para ligação cruzada química com ScFv-coil (Talvez qualquer conector e grupo quimicamente reativo, por exemplo, NH2 adequado para a ligação cruzada química) Grupo CpG-B: Ligandos naturais: ODN2006_SH: (SEQ ID 49) GGGGGACGATCGTCGGGGGG-SH Ligandos peptídicos_SH:

Em negrito, o conector flexível com o grupo SH para a ligação cruzada química com ScFV-coil (talvez qualquer conector e grupo quimicamente reativo, por exemplo, NH2, adequado para a ligação cruzada química) Grupo CpG-C ODNM362_SH: (SEQ ID 69) TCGTCGTCGTTCGAACGACGTTGAT-SH Em negrito, o conector flexível com o grupo SH para ligação cruzada química com ScFV-coil (talvez qualquer conector e grupo quimicamente reativo, por exemplo, NH2, adequado para a ligação cruzada química) 12.5 Ogiva exemplar, ou seja, uma estrutura compreendendo um ligando CD32 e um ligando TLR9 Qualquer representante do grupo de ligantes CD32 ligado quimicamente por qualquer método com qualquer representante do grupo de ligantes TLR9, onde, de preferência, os ligantes TLR9 são acoplados às lisinas disponíveis (K) nos ligantes CD32, por exemplo. Além disso, as misturas de diferentes ligantes TLR9 podem ser acopladas, por exemplo, ligantes CpG-B naturais ou peptídicos. ScFV-coil1 (IV.3) (SEQ ID 70) EVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWLNT YTGESIYPDDFKGRFAFSSETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARGDYGYDDPLDY WGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKS LLHTNGNTYLHWFLQRPGQSPQLLIYRMSVLASGVPDRFSGSGSGTAFTLSISRVE AEDVGVFYCMQHLEYPLTFGAGTKLELKGSISAWSHPQFEKGPEVSAL EKEVSALE KEVSALEKEVSALEKEVSALEK São preferidas lisinas na estrutura espiralada (itálico) ou Peptídeo-coil: (SEQ ID 72) ADGAWAWVWLTETAVGAAKGPEVSALE K EVSALE K EVSALE K EVSALE K EVSALE K São preferidas lisinas na estrutura espiralada (itálico). 12.6. Imunógeno exemplar, aqui também denominado de antígeno Imunógeno 3 contendo espiral (epítopos de célula T Der P1 e Der P2 T baseados na expressão de Classe II humana) (SEQ ID 74) HHHHHHYYRYVAREQSCRRPNAQRFGISNYCQIYPPNVNKIREALAQTHSAIAVDL RQMRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLQQYDIKYTWNVPKIAPKSENVVV TVKVMGDDGVLACAIATHAKIRDDAFRHYDGRTIIQRDNGYQPNYHAVNIVGYSNAQ GVDYWIVRNSWDTNWHEIKKVLVPGCHGSEPCIIHRGKPFGGGSGGGSGGKVSAL KEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKE Sublinhado: HIS tag (pode ser removido) Em negrito: um conector (pode ser qualquer conector) Em itálico: a espiral pepK para interação com a ogiva Imunógeno 5-12 contendo espiral (~29 epítopos de célula T de Der p1, Der p2, Der p3, Der p4, Der p7, Der p9, Der p10, Der p11, Der p14, Der p15, baseados na expressão da Classe II humana) (SEQ ID 75) GVLACAIATHAKIREQERLVKLETVKKSLEQEVRTLHVRIEEVEANALAGGDLRQMR TVTPIRMQGGCGSCWEAHEQQIRIMTTKLKEAEARQQYDIKYTWNVPKIAVNIVGYS NAQGVDYWIVRNSWDTNWYHNPHFIGNRSVITHLMEDLKGELDMRNIQVRGLKQM KRVGDANVKSEDDAFRHYDGRTIIQRDNGYQPNYLDEYWILTAAHCVDGQTVSKLI RSKVLGEKISYYRYVAREQSCRRPNAQRFGISNYCVVVTVKVMGDDELHTYFNVNY TMHYYLNNGATRDILDEYWILTAAHCVAGQTASKLSIRYNSLKHSLFKYRPFKVNEL NLEGEFGRELQHKFRLMRNSQMEVEEGGGSHHHHHHGGGSCGG KVSALKEKVS ALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKE Sublinhado: HIS tag (pode ser removido) Em negrito: um conector (pode ser qualquer conector) Em itálico: a espiral pepK para interação com a ogiva 12.7 Vacina exemplar para alergia SG100 contra ácaros domésticos (HDM) O complexo molecular-modelo é formado por ligação química, fusão e /ou afinidade de ligação, em particular, por uma estrutura em espiral. A ogiva (baseada em ScFVcoil1 IV.3 + ODNM362) é misturada com imunógeno 512 numa proporção que indica que 90% da ogiva é complexada com imunógeno, sem imunógeno livre (razão molar de aproximadamente 1: 1,5) e formulada em Alum. 12.8 Eficácia de SG100 no macaco rhesus: Métodos: 5 macacos rhesus sadios naive em relação aos ácaros domésticos (HDM) foram imunizados com SG100 (100 μg/injeção) absorvido em Alum no dia 0, 14 e 28. Amostras de sangue foram coletadas no dia 0 e 49 para ativação das células T e produção de anticorpos. Resposta imune ao anticorpo: As amostras de soro foram testadas em ELISA padrão para detecção de anticorpos IgG contra a ogiva, immo 5-12 (Immo5), Der p1, Der p2, Der p5 e Der p7. Os antígenos foram revestidos em placas maxisorb (1μg/ml I PBS) durante a noite a 4 °C, lavados duas vezes, bloqueados com BSA a 1% em PBS, lavados duas vezes e incubados com os soros numa diluição de 1: 1000 durante 1 hora a 4°C, lavados duas vezes e subsequentemente detectados com IgG-PO-anti-humano (reação cruzada com IgG de macaco rhesus). Resposta imune celular: Proliferação: PBMCs (105/poço) foram cultivadas durante 4 dias (37°C /5% de CO2 /99% de umidade) em 8 plex com meio, ogiva (2 2 μg/ml), imunógeno (2 2 μg/ml), Der p1 (2 μg/ml), Der p2 (2 μg/ml), Der p5 (2 μg/ml) e Der p7 (2 μg/ml). Como controle positivo, Con A (Concanavaline A, Sigma) foi utilizada. A proliferação foi medida por [3H] -timidina (0,5 μCi /poço) durante as últimas 18 horas de uma cultura de 4 dias. As células foram recolhidas para contagem de cintilação beta (Topcount NXT, Packerd, Ramsey, MN, EUA). Contagens líquidas por minuto foram calculadas subtraindo as contagens do controle do meio das contagens induzidas pelos diferentes antígenos. Produção de citocinas: De cada poço das estimulações 8plex do experimento de proliferação, 50 μl de sobrenadante foram colhidos após 24 horas e reunidos. Os sobrenadantes reunidos foram testados quanto à presença de IFNY e IL-4 utilizando kits de ELISA comercialmente disponíveis da U-Cytech, Utrecht, Holanda). Resultados: Respostas dos anticorpos: As fortes respostas de IgG foram medidas contra a ogiva e o imunógeno de SG100, mas não foram detectados anticorpos contra Der p1, Der p2, Der p5 ou Der p7 (Figura 7), indicando que os animais eram naive em relação aos alergenos HDM testados e que SG100 não contém epítopos de célula B, que reagem de forma cruzada com os alergenos HDM testados. Resposta das células T: Na Figura 8, pode-se observar que os animais apresentaram proliferação forte quando estimulados in vitro com a ogiva, immo5, Der p1, Der p2 e Der p7, mas não contra Der p5. Também IFNY, mas nenhuma IL-4 foi medida nos sobrenadantes de culturas in vitro com ogiva, immo5, Der p1, Der p2, Der p7, mas não contra Der p5. (Figura 9). A IL-4 foi observada após a estimulação com Con A (dados não mostrados). Conclusão: A imunização com SG100 induz uma resposta de memória do tipo Th1 contra a vacina, tal como indicado pela presença de anticorpos IgG bem como a indução de células T que produzem IFNY, mas não de IL-4 quando estimuladas pela ogiva ou Immo5. Como esperado, nenhum IgG (=memória das células B) contra Der p1, Der p2, Der p5 or Der p7 foi induzido porque a vacina não contém epítopos de células B provenientes destes alergenos. No entanto, a memória do tipo Th1 foi induzida contra os epítopos de células T dos alergenos de ácaros domésticos, que estão presentes no Der p1, Der p2 e Der p7 da vacina. Nenhum tipo de memória Th1 é induzida contra Der p5, que não está incluída na vacina. Isso confirma o conceito de SG100. 12.9 Vacina exemplar, ogiva para uso na oncologia ScFV-coil 1 (IV.3): (SEQ ID 70) EVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWLNTY TGESIYPDDFKGRFAFSSETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARGDYGYDDPLDYW GQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSL LHTNGNTYLHWFLQRPGQSPQLLIYRMSVLASGVPDRFSGSGSGTAFTLSISRVE AEDVGVFYCMQHLEYPLTFGAGTKLELKGSISAWSHPQFEKGPEVSALEKEVSAL EKEVSALEKEVSALEKEVSALEK Sublinhado: domínio VH Negrito: domínio HL Conjunto de tipo normal. Conector flexível (talvez qualquer conector) Em itálico: pepE coil mais a sequência C’ StrepTag II e o conector “GP” pode ser qualquer conector flexível (StrepTag II pode ser removido ou substituído pelo HIS Tag ou qualquer outro tag) Ogiva com ODNM362: EVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWLNT YTGESIYPDDFKGRFAFSSETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARGDYGYDDPLDY WGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKS LLHTNGNTYLHWFLQRPGQSPQLLIYRMSVLASGVPDRFSGSGSGTAFTLSISRVE AEDVGVFYCMQHLEYPLTFGAGTKLELKGSISAWSHPQFEKGPEVSAL EKEVSALE KEVSALEKEVSALEKEVSALEK ODNM362_SH (SEQ ID 69) TCGTCGTCGTTCGAACGACGTTGAT-SH ODN-M362 pode ser acoplado a qualquer uma das lisinas disponíveis no ScFV-1- coil Ogiva (SG100): ScFV-1-coil ligado quimicamente com ODN-M362-SH.O preparo é uma mistura de ScFV-1-coil ligado com 1 a 18 moléculas ODN-M362, prefere-se uma mistura com 16 moléculas ODN-M362 acopladas ao ScFV-1-coil.Todas essas misturas podem ser denominadas de ogiva ou ScFv-1-coil-M362. Fundamento: Os alvos oncológicos da imunoterapia ativa são quase por definição autoantígenos, que são superexpressos em células tumorais. Estes antígenos são chamados de antígenos associados a tumores (TAA) e o sistema imune não é capaz de reagir contra estes antígenos, porque eles são reconhecidos como próprios do organismo. Uma formulação de vacina que permite que o sistema imunitário gere um anticorpo específico e /ou resposta imune celular contra um autoantígeno é potencialmente adequado para utilização como vacina antitumoral. A ogiva de SG100 possibilita uma resposta autoimune: 24 camundongos (6 /grupo) foram imunizados s.c. 2x com 35μg em 150 μl de ScFv- 1-coil ou com a ogiva (ScFv-1-coil-M362), um ou outro formulado em Alum ou diluído em PBS. As imunizações foram realizadas nos dias 0 e 14, os soros foram coletados no dia 0 (antes da imunização) e 28 e analisados quanto ao IgG1 e IgG2a contra ScFv-1- coil (indicado como ScFv) e mAb IV.3 por ELISA padrão. Ver figura 6. Como se pode ver na figura 6, a imunização com a ogiva induziu uma forte resposta de IgG1 e IgGa ao ScFV-1-coil bem como ao mAb IV.3 no dia 28. Uma resposta positiva foi observada independente da presença de Alum. A imunização com ScFV- 1-coil induziu somente uma resposta IgG1 contra ScFV-1-coil e apenas na presença de Alum, nenhuma resposta de IgG2a foi induzida. Estes dados se encaixam com o conceito de que CpG (M362) induz uma resposta de tipo Th1 (IgG2a) e Alum induz uma resposta do tipo Th2 (IgG1). A resposta contra scFv-1-coil indica que esta proteína é imunogênica no camundongo, de fato, tanto o StrepTagII (sequência de aminoácidos “SAWSHPQFEK” (SEQ ID 76)) e o pepE (sequência de aminoácidos "EVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEK " SEQ ID 77) eram alvo das respostas de IgG (dados não apresentados). No entanto, o ScFV-1-coil também contém " autossequências de camundongo" porque o ScFv contém os domínios VH e VL de mAb IV.3 de camundongo. Portanto, uma resposta imune contra IV.3 indica a presença de anticorpos autoimunes. Com efeito, só a ogiva com ou sem Alum foi capaz de induzir este tipo de resposta imunitária. Assim, a presença de M362 no ScFV-1-coil é capaz de quebrar a tolerância contra os autoantígenos do domínio VH e VL do anticorpo progenitor. Através da combinação de um autoantígeno, por exemplo, um TAA, através de uma interação de alta afinidade com o pepE da ogiva, a ogiva será capaz de induzir a resposta autoimune necessária contra o TAA. O complexo da ogiva (ScFV-1-coil-M362) com o TAA forma uma vacina potente para o tratamento de câncer com superexpressão do TAA na vacina. Tal vacina pode ser formulada com quaisquer adjuvantes, por exemplo, em Alum.

[247] Exemplo 13: Utilização da plataforma tecnológica na oncologia, imunógeno G17 Ogiva baseada em ScFV-coil1 (IV.3) + ODNM362 e imunógeno G17 do macaco rhesus e cynomolgus (G17RM). Abaixo, pE significa pyroGlu. Sequência do imunógeno humano gastrina pequena (G17H, primeira 13 AA, SEQ ID 86): pEGPWLEEEE EAYG Sequência do imunógeno gastrina pequena do macado rhesus e cynomolgus (G17RM, primeira 13 AA, SEQ ID 99: pEGPWMEEEE AAYG Sequência do imunógeno gastrina pequena do camundongo gastrina pequena (G17M, primeira 13 AA, SEQ ID 100): pERPRMEEEE diferenças em relação ao G17RM em negrito Produto final imunógeno G17RM 1 - coil e G17H 1 - coil : G17RM_1-coil, SEQ ID 101: pEGPWM EEE EAAYGGGSGG KVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKE G17H_1-coil, SEQ ID 102 pEGPWLEE E E EAYGGGSGG KVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKE em negrito: um conector (pode ser qualquer conector) em itálico: a espiral pepK para interação com a ogiva Pronto para uso (produto final) TYG100 1 RM e TYG100 1H A ogiva, conforme descrito acima (com base no ScFv-coil1 IV.3), é misturada com G17RM_1-coil ou G17H_1-coil numa proporção que indica que 100% da ogiva é complexado com G17RM_1-coil ou G17H_1-coil, sem imunógeno livre de G17 presente (razão molar de ~ 1: 1) e formulado em Alum. Deste modo, YG100_1RM e TYG100_1H são produzidos.

[248] Exemplo 14: TYG100 1RM para tratamento do câncer dependente de gastrina por exemplo, câncer pancreático: 6 camundongos Balb/c foram imunizados 3 vezes no dia 0, dia 14 e dia 35 com TYG100_1RM ou G17_1RM (sem ogiva) contendo G17 de macaco rhesus (58,4 g/ injeção em 0,5 ml). Duas semanas após a última imunização, o soro foi colhido e analisado quanto à presença de anticorpos IgG contra G17RM, G17H e G17M (= G17 do camundongo).Tabela 2

A Tabela 2 mostra que todos os camundongos responderam com IgG contra os dois componentes da vacina (ogiva e G17RM). É importante ressaltar que todos os camundongos produziram IgG que reagiu de forma cruzada com o G17 humano e em menor grau com o G17 de camundongo (G17M). O último é notável porque os primeiros 13 ácidos imunes de G17 do camundongo (pERPRMEEEE EAYG, SEQ ID 86) são diferentes na 3 AA de G17RM (diferenças indicadas em negrito e sublinhadas) e G17M é um autoantígeno para o camundongo. Os anticorpos que reconhecem G17M são, portanto, autoanticorpos, indicando que TYG100_1RM tem sido capaz de quebrar a tolerância natural contra o autoantígeno G17M. Não houve resposta contra G17 quando o G17-peptídeo foi imunizado sem a ogiva. A capacidade de uma vacina para induzir uma resposta autoimune é um pré- requisito para uma vacina anticâncer, onde todos os antígenos associados a tumores (TAA) são autoantígenos, que são superexpressos, por exemplo, em células tumorais. Assim, uma vacina composta pela ogiva de TYG100_1RM combinada com G17 humano como imunógeno pode ser utilizada como vacina para o tratamento de tumores dependentes de gastrina, tais como o câncer pancreático.

[249] Exemplo 15: Produtos exemplares incluindo um dímero do imunógeno peptídico Produto final imunógeno G17RM 2-coil e G17H 2-coil: Um dímero de G17RM (primeira sequência 13AA da gastrina pequena) foi sintetizado quimicamente com um conector flexível especial conectando os 2 peptídeos a uma espiral pepK. G17RM 2-coil: (SEQ ID 103: Parte de uma composição imunogênica da invenção, que compreende dois peptídeos de gastrina de macaco rhesus de SEQ ID 99, uma sequência de ligação ramificada e uma alfa-hélice peptídica (TYG100_2RM). Esta parte pode ser ligada ao adjuvante direcionado adequado por meio de uma ligação em espiral).

em negrito, um conector flexível especial (pode ser qualquer conector que conecte 3 peptídeos) em itálico, a espiral pepK para interação com a ogiva G17H 2-coil: (SEQ ID 88: Parte de uma composição imunogênica da invenção, que compreende dois peptídeos de gastrina humana de SEQ ID 86, uma sequência de ligação ramificada e uma alfa-hélice peptídica (TYG100_2H). Esta parte pode ser ligada ao adjuvante direcionado adequado por meio de uma ligação em espiral)

em negrito, um conector flexível especial (pode ser qualquer conector que conecte 3 peptídeos) em itálico, a espiral pepK para interação com a ogiva Produto final TYG100 2RM e TYG100 2H A ogiva, conforme descrito acima (com base no ScFv-coil1; IV.3) é misturada com G17RM_2-coil ou G17H_2-coil numa proporção indica que 100% da ogiva é complexado com G17RM_2-coil ou o imunógeno G17H_2-coil, sem presença do imunógeno livre de G17 (razão molar de ~ 1: 1) e formulado em Alum. Deste modo, TYG100_2RM e TYG100_2H são produzidos.

[250] Exemplo 16: TYG100 2RM para tratamento do câncer dependente de gastrina por exemplo, câncer pancreático: 6 camundongos Balb/c foram imunizados 3 vezes nos dias 0, 14 e 35, com TYG100_2RM contendo os primeiros 13 ácidos imuno G17 de macaco rhesus (66,8 μg/injeção em 0,5 ml). Duas semanas após a última imunização, o soro foi colhido e analisado quanto à presença de anticorpos IgG contra G17RM, G17H e G17M (= G17 do camundongo). Tabela 3

A Tabela 3 mostra que todos os camundongos responderam com IgG contra os dois componentes da vacina (ogiva e G17RM). É importante ressaltar que todos os camundongos produziram IgG que reagiu de forma cruzada com a G17 humana e em menor grau com G17 de camundongo (G17M). O último é notável porque os primeiros 13 ácidos imunes de G17 de camundongo pERPRMEEEE EAYG, SEQ ID 86) são diferentes na 3 AA de G17RM (diferenças indicadas em negrito e sublinhado) e G17M é um autoantígeno para o camundongo. Os anticorpos que reconhecem o G17M são, portanto, autoanticorpos, indicando que TYG100_2RM tem sido capaz de quebrar a tolerância natural contra o autoantígeno G17M. Não houve resposta contra G17 quando o peptídeo G17 foi imunizado sem a ogiva. A capacidade de uma vacina de induzir uma resposta autoimune é um pré-requisito para uma vacina anticâncer, em que todos os antígenos associados a tumores (TAA) são autoantígenos que são superexpressos em células tumorais. Assim, uma vacina composta pela ogiva de TYG100_2RM combinada com G17 humana como imunógeno pode ser utilizada como vacina para o tratamento de tumores dependentes de gastrina, tais como o câncer pancreático. As respostas contra todos os três tipos de G17 induzida por TYG100_2RM eram mais fortes do que as induzidos por TYG100_1RM (tabela 2), indicando que o dímero é preferido na vacina.

[251] Exemplo 17: TYG100 2RM para tratamento do câncer dependente da gastrina, por exemplo, câncer pancreático: 6 macacos Cynomolgus foram imunizados com TYG100_2RM e 6 foram imunizados com G17RM_2-coil em d0, d14 e d28. Em d0, d14, d28, 42 e d56 o soro foi analisado quanto à presença de anticorpos IgG contra a gastrina pequena autóloga (G17RM), a gastrina pequena oriunda dos seres humanos (G17H), um peptídeo de controle irrelevante de MW semelhante à gastrina (peptídeo de controle) ou contra a ogiva (scFv-coil1), utilizando o sistema ELISA multiplex do Meso Scale Discovery (MSD) de acordo com o manual do MSD. Na figura 10, pode-se ver que todos os 6 animais apresentaram uma forte resposta de IgG tempo-dependente à ogiva (ScFv- coil1), bem como ao G17RM e G17H, não foi obtida resposta contra o peptídeo de controle. A resposta contra G17RM depois de três imunizações foi 75% da resposta contra ScFv-coil1. Isto é notável uma vez que G17RM é uma proteína 100% autóloga de apenas ~ 1,2 kDa, enquanto que ScFv-coil1 é uma proteína 100% alogênica > 30 kDa. Os anti anticorpos G17RM reagiram fortemente de forma cruzada com G17H. Não houve resposta contra G17RM quando o peptídeo G17RM_2-coil foi utilizado sem a ogiva. A diminuição no título de IgG entre d42 e 56 foi mais forte para G17RM do que para ScFV, indicando que parte dos anticorpos IgG foram neutralizadas pelo G17 endógeno. É importante notar que a presença de G17 endógeno não estimula a resposta ao G17RM. Os dados na Figura 10 mostram que a vacina foi capaz de induzir uma resposta genuína dos autoanticorpos que é reversível. Este é um pré-requisito para vacinas anticâncer, uma vez que os antígenos associados a tumores (TAA) são autoantígenos que são superexpressos, por exemplo, superexpressos em células tumorais, mas também presentes em níveis mais baixos de expressão em células normais e saudáveis. Assim, uma vacina tal como a TYG100_2RM ou TYG100_2H pode ser utilizada para o tratamento de tumores dependentes de gastrina, tais como o câncer pancreático. Uma vez que o câncer foi completamente curado, o tratamento pode ser interrompido e os anticorpos anti-G17 induzidos serão eliminados da circulação. A fim de manter um estado estável (durante o tratamento), a resposta autoimune tem de ser impulsionada por injeções repetidas com a vacina. Nenhuma doença autoimune irreversível é induzida com este tipo de vacina.

[252] Exemplo 18: TYG100 2RM para tratamento da obesidade: Os animais do Exemplo 14 foram monitorados quanto ao seu apetite e o peso corporal foi medido em d0, d14, d28, d42 e d56. Depois de duas injeções com TYG100_2RM, 4 dos 6 animais perderam o interesse em seus lanches diários (biscoitos), enquanto que a ingestão de alimentos básicos permaneceu normal. Este foi acompanhado de perda de peso significativa (figura 11), mas nenhum efeito secundário indesejado foi documentado. Até agora essas observações nunca foram feitas com outras vacinas baseadas em interações entre a ogiva e a espiral tendo como alvo imunógenos diferentes dos imunógenos de gastrina (dados não apresentados). Estes dados indicam que a TYG100_2RM reduz o desejo por lanches (entre as refeições), sem influenciar a ingestão de alimentos básicos necessários para uma vida saudável. Os animais encontravam-se normalmente ativos e alegres. Portanto, a TYG100_2RM pode ser utilizada para o tratamento da obesidade. 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Claims

1. VACINA IMUNORREGULADORA caracterizada por compreender - um adjuvante direcionado compreendendo pelo menos uma porção anti- CD32 ligada a um ligante TLR9 e uma primeira alfa-hélice peptídica, em que o ligando TLR9 é um oligodesoxinucleotídeo CpG classe A, B ou C e - um imunógeno com ao menos um epítopo e uma segunda alfa-hélice peptídica enrolada na primeira alfa-hélice em que a primeira e a segunda alfa-hélices provêm uma estrutura em espiral enrolada onde o adjuvante direcionado e o imunógeno sao ligados entre si, cuja estrutura em espiral é um heterodímero de duas hélices diferentes, em que cada uma das referidas primeira e segunda alfa-hélices compreender 3-5 repetições de motivos de aminoácidos, repetições de aminoácidos de um motivo de aminoácidos, ligando-se especificamente um ao outro com um Kd inferior a 10-6 M; onde a espiral enrolada é uma heterocoil de duas diferentes hélices correspondentes, cada uma das hélices correspondentes compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistido pela SEQ ID NOs:91-98, e - m que a referida porção anti-CD32 é selecionada a partir do grupo que consiste num anticorpo anti-CD32, ou um fragmento de anticorpo.

2. VACINA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo referido imunógeno ser derivado de - um antígeno associado a um tumor para uso na imunoterapia do câncer, ou - um patógeno para uso na imunoterapia de doenças infecciosas, ou - um alergeno para uso na imunoterapia de doenças alérgicas.

3. VACINA de acordo com a reivindicação 1 ou 2 , caracterizada pela referida porção anti-CD32 ter como alvo a CD32a.

4. VACINA de acordo com qualquer uma das reivindições 1 a 3, caracterizada pelo referido imunógeno ser derivado de um alergeno, para utilização na imunoterapia de doenças e alérgicas em que a referida porção anti-CD32 tem como alvo a CD32A e CD32b.

5. VACINA de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, compreendendo - um adjuvante direcionado que é composto pela porção anti-CD32 ligada à primeira alfa-hélice que compreende ou consiste na sequência de SEQ ID 70, a qual está acoplada ao ligando TLR9 da SEQ ID 69, de preferência numa razão de 1: 1-18 (molécula por molécula), e - um imunógeno que compreende ou consiste no imunógeno da SEQ ID 30, que é ligada à segunda alfa-hélice, de preferência a SEQ ID 75, caracterizada pelo adjuvante direcionado e o imunógeno estarem ligados um ao outro pela estrutura em espiral das primeira e segunda alfa-hélices.

6. KIT para a preparação de uma vacina de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado por compreender os seguintes componentes - um adjuvante direcionado compreendendo pelo menos uma porção anti- CD32 ligada a um ligando TLR9 e uma primeira alfa-hélice peptídica, em que o ligando TLR9 é um oligodesoxinucleotídeo CpG classe A, B ou C, e - um imunógeno com pelo menos um epítopo de célula T e uma segunda alfa-hélice peptídica correspondente à primeira alfa-hélice.

7. VACINA sensibilizante caracterizada por compreender, pelo menos, uma porção anti-CD32 ligada a um ligando TLR9 e uma alfa-hélice peptídica numa formulação farmacêutica, em que o ligando TLR9 é um oligodesoxinucleotídeo CpG classe A, B ou C, e onde a porção anti-CD32 é umanticorpo anti-CD32, ou um fragmento de anticorpo .

8. VACINA de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pela referida alfa- hélice ser uma espiral enrolada de dupla hélice.

9. VACINA de acordo com qualquer das reivindicações 7 ou 8, caracterizada para utilização na pré-imunização de um paciente antes da imunoterapia dos referidos pacientes com a vacina imunorreguladora de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6.