KR20220150222A

KR20220150222A - 신규 단백질

Info

Publication number: KR20220150222A
Application number: KR1020220054782A
Authority: KR
Inventors: 이지원; 이보람
Original assignee: (주)셀레메디
Priority date: 2021-05-03
Filing date: 2022-05-03
Publication date: 2022-11-10
Also published as: CN117242086A; EP4335867A1

Abstract

본 발명은 외부 표면에 외래 펩타이드가 융합되고, 인간 트랜스페린 수용체에 대한 결합력이 떨어지도록 돌연변이된 페리틴 단백질에 관한 것으로, 다양한 외래 펩타이드 유래의 활성을 나타낼 수 있는 단백질에 관한 것이다.

Description

신규 단백질 {NEW PROTEIN}

본 발명은 신규 단백질에 관한 것이다.

약물전달 시스템은 기존 의약품의 부작용을 최소화하고 효능 및 효과를 극대화시켜 필요한 양의 약물, 예를 들어, 단백질, 핵산, 또는 기타 저분자 등을 효율적으로 전달할 수 있도록 하는 의약 기술을 의미한다. 신약 개발에 필요한 비용과 시간을 절감해 주는 상기 기술은 최근 나노기술과 결합하면서 의약계에서 새로운 부가가치를 창출하는 첨단기술의 한 분야로 자리 잡고 있으며, 미국과 일본 등 기술선진국들은 지난 80년대 후반부터 제약회사 등 기업을 중심으로 신약 개발과 함께 약물전달시스템의 개발에 전력을 쏟아 왔다.

지금까지는, 바이러스 유전자, 재조합 단백질, 리포좀(liposome), 양이온성 고분자, 그리고 다양한 형태의 나노입자와 나노물질들이 동물 세포 내로의 약물전달을 위해 이용되었다. 그러나 많은 양이온성 리포좀들과 양이온성 고분자들은 임상에 적용하기에는 세포에 독성이 강하여 부적합한 것으로 밝혀졌다. 또한, 안정적인 핵산의 세포막 투과를 위하여 핵산의 주 사슬을 화학적으로 변형시키는 방법도 시도되었다. 그러나, 이러한 방법은 비용이 비싸고 오랜 시간이 걸리며 노동 집약적인 공정이 요구되므로 임상 적용에는 적합하지 않다. 의미 있는 시도로서, 양자점, 자성 입자, 또는 금 나노입자를 포함한 다양한 형태의 나노입자를 이용한 약물전달 시스템(drug delivery system, DDS)이 개발된 바 있다. 그러나, 이러한 입자들은 세포에 독성을 가지며 핵산 등의 생체 고분자의 도입에 용이하지 않은 구조를 가지며, 세포 내로의 도입 효율도 낮다는 단점이 있었다.

세포 내에서의 단백질/펩타이드의 기능의 연구 또는 세포내 전달을 위해서는 효율적인 전달 시스템이 필요하다. 그러나, 광범위한 단백질/펩타이드을 전달할 수 있는 범용적인 전달 시스템, 다량의 단백질/펩타이드를 수용 및 전달할 수 있는 시스템에 대한 개발은 아직 미진한 상황이다.

본 발명은 외부 표면에 외래 펩타이드가 융합되고, 인간 트랜스페린 수용체에 대한 결합력이 떨어지도록 돌연변이된 신규한 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 상기 단백질을 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 외부 표면에 외래 펩타이드가 융합되고, 인간 트랜스페린 수용체에 대한 결합력이 떨어지도록 돌연변이된 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자가 융합된 페리틴 단백질.을 제공한다.

상기 외래 펩타이드는 약리 활성 펩타이드일 수 있다.

상기 외래 펩타이드는 면역 관문 분자와 결합 가능한 리간드 또는 리간드의 단편, 수용체 또는 수용체의 단편, 항체 또는 항원 결합부위(CDR)를 포함하는 항체의 단편; 또는 질환 항원 에피토프일 수 있다.

상기 면역 관문 분자는 Her-2/neu, VISTA, 4-1BBL, Galectin-9, Adenosine A2a receptor, CD80, CD86, ICOS, ICOSL, BTLA, OX-40L, CD155, BCL2, MYC, PP2A, BRD1, BRD2, BRD3, BRD4, BRDT, CBP, E2F1, MDM2, MDMX, PPP2CA, PPM1D, STAT3, IDH1, PD1, CTLA4, PD-L1, PD-L2, LAG3, TIM3, TIGIT, BTLA, SLAMF7, 4-1BB, OX-40, ICOS, GITR, ICAM-1, BAFFR, HVEM, LFA-1, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, LAIR1, 2B4, CD2, CD3, CD16, CD20, CD27, CD28, CD40L, CD48, CD52, EGFR family, AXL, CSF1R, DDR1, DDR2, EPH receptor family, FGFR family, VEGFR family, IGF1R, LTK, PDGFR family, RET, KIT, KRAS, NTRK1 및 NTRK2으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

상기 항원결합부위는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

상기 질환 항원 에피토프는 gp100, MART-1, Melna-A, MAGE-A3, MAGE-C2, Mammaglobin-A, proteinsase-3, mucin-1, HPV E6, LMP2, PSMA, GD2, hTERT, PAP, ERG, NA17, ALK, GM3, EPhA2, NA17-A, TRP-1, TRP-2, NY-ESO-1, CEA, CA 125, AFP, Survivin, AH1, ras, G17DT, MUC1, Her-2/neu, E75, p53, PSA, HCG, PRAME, WT1, URLC10, VEGFR1, VEGFR2, E7, Tyrosinase 펩타이드, B16F10, EL4, 신생항원(neoantigen) 및 GV1001로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 단백질은 상기 외래 펩타이드가 융합된 페리틴 단량체 24개가 자기 조립되어 이루어진 구형의 단백질일 수 있다.

본 발명에서 상기 외래 펩타이드는 페리틴 단량체의 인접한 α-헬릭스들 사이 중 적어도 하나에 융합될 수 있다.

본 발명에서 상기 외래 펩타이드는 페리틴 단량체의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다.

본 발명에서 상기 외래 펩타이드는 페리틴 단량체의 A-B루프, B-C루프, C-D루프 또는 D-E루프에 융합될 수 있다.

본 발명에서 상기 외래 펩타이드는 페리틴 단량체의 N-말단과 A 헬릭스 사이 또는 E 헬릭스와 C-말단 사이에 융합될 수 있다.

본 발명의 단백질은 서열번호 1의 서열에서 15번, 16번, 23번, 82번, 84번, 117번, 120번 또는 124번 아미노산이 알라닌, 글라이신, 발린 또는 류신으로 치환된 것일 수 있다.

본 발명의 페리틴 단백질은 트랜스페린 수용체에 대한 결합력(K)이 다음 수학식 1을 만족할 수 있다:

[수학식 1]

K ≥ 10 nM

(식 중, K = [P][T]/[PT]이고, 여기서 [P]는 페리틴 단백질과 트랜스페린 수용체와의 결합 반응의 평형 상태에서의 페리틴 단백질의 농도를 나타내고, [T]는 상기 평형 상태에서의 트랜스페린 수용체의 농도를 나타내며, [PT]는 상기 평형 상태에서의 페리틴 단백질과 트랜스페린 수용체의 복합체의 농도를 나타냄).

본 발명에서 상기 트랜스페린 수용체에 대한 결합력은 인간 트랜스페린 수용체에 대한 결합력일 수 있다.

본 발명에서 페리틴은 인간 페리틴 중쇄일 수 있다.

본 발명의 페리틴 단백질은 대장균 생산 시스템에서 40% 이상이 수용성 분획으로 존재할 수 있다.

본 발명의 단백질은 인간 트랜스페린 수용체에 대한 결합력이 저하되어, 외래 펩타이드 유래의 활성을 충분히 나타낼 수 있다.

본 발명의 단백질은 외래 펩타이드가 다수 융합될 수 있어, 그 외래 펩타이드 자체 대비 보다 강화된 활성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 단백질은 생체 적합성과 안전성이 뛰어나며, 염증반응 혹은 면역원성 유발 가능성이 매우 낮다.

도 1은 wild type(native) 인간 페리틴 중쇄(huHF) 및 mutant 인간 페리틴 중쇄 단백질을 제조하는 기본 벡터의 모식도이다.
도 2는 huHF_Mutant1-dual을 제조하는 벡터의 모식도 및 그 페리틴 단백질의 제조를 확인할 수 있는 도면이다.
도 3은 huHF_Mutant1-h_smPD1을 제조하는 벡터의 모식도 및 그 페리틴 단백질의 제조를 확인할 수 있는 도면이다.
도 4 내지 6은 각각 huHF_native-h_smPD1, huHF_Mutant-h_smPD1, huHF_Mutant1-dual의 인간 transferrin receptor에 대한 결합력 평가 결과이다.
도 7은 huHF_Mutant1-dual, huHF_Mutant2-dual의 인간 transferrin receptor에 대한 결합력 평가 결과이다.
도 8은 huHF_mutant1-dual 처리에 따른 NK 세포와 암 세포 간의 결합능 평가 결과이다.
도 9 및 10은 huHF_mutant1-dual 처리에 따른 NK 세포와 암 세포 간의 결합능력 평가 결과이다.
도 11은 huHF_mutant1-dual 처리에 따른 NK 세포의 암세포 사멸능 평가 결과이다.
도 12는 LLC1 폐암 동물 모델 제조 및 종양 억제 실험 개요도이다.
도 13 및 14는 huHF_mutant1-dual 처리에 따른 종양 성장 억제 평가 결과이다.
도 15 내지 17은 huHF_mutant1-dual의 폐암 세포주 A549에 대한 avidity 평가 결과이다.
도 18은 huHF_mutant1-dual 또는 이와 항암제의 병용시의 LLC1 폐암 동물 모델에서의 종양 성장 억제 평가 결과이다.

본 발명은 외부 표면에 외래 펩타이드가 융합되고, 인간 트랜스페린 수용체에 대한 결합력이 떨어지도록 돌연변이된 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자가 융합된 페리틴 단백질에 관한 것이다.

페리틴(Ferritin)은 인간, 동물 및 미생물 유래의 페리틴일 수 있다.

인간 페리틴은 중쇄(heavy chain, 21 kDa)와 경쇄(light chain, 19 kDa)로 구성되며, 상기 페리틴을 이루고 있는 단량체의 자가조립 능력을 통해 구형의 나노입자를 형성하는 특성을 나타낸다. 페리틴은 24개의 단량체가 모여 구 형상의 입체 구조를 갖는 자기조립체를 형성할 수 있다.

인간 페리틴의 경우 외경은 약 12 nm이고 내경은 약 8 nm이다. 페리틴 단량체의 구조는 5개의 α-헬릭스 구조, 즉 A 헬릭스, B 헬릭스, C 헬릭스, D 헬릭스 및 E 헬릭스가 순차적으로 연결된 형태이며, 루프(loop)라 불리는 각각의 α-헬릭스 구조의 폴리펩타이드를 연결하는 비정형 폴리펩타이드 부분을 포함한다.

루프는 페리틴에 펩타이드 또는 작은 단백질 항원 등이 삽입되더라도 구조적으로 망가지지 않는 지역(region)이다. 여기에 펩타이드를 클로닝을 이용하여 융합시킴으로써 페리틴의 단량체에 에피토프 등의 펩타이드가 위치한 펩타이드-페리틴 융합 단백질 단량체를 제조할 수 있다. A 헬릭스와 B 헬릭스를 연결하는 루프를 A-B루프, B 헬릭스와 C 헬릭스를 연결하는 루프를 B-C루프, C 헬릭스와 D 헬릭스를 연결하는 루프를 C-D루프, D 헬릭스와 E 헬릭스를 연결하는 루프를 D-E루프라 한다.

페리틴의 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank Accession No. NM_000146, NM_002032 등).

페리틴은 페리틴 중쇄일 수 있으며, 구체적으로, 인간 페리틴 중쇄일 수 있다. 인간 페리틴 중쇄는 'huHF'와 혼용되어 사용될 수 있다.

페리틴 단백질은 페리틴 단량체일 수 있다. 이에, 페리틴 중쇄 단량체일 수 있고, 인간 페리틴 중쇄 단량체일 수 있다.

페리틴은 그 단량체 수 개가 자기 조립되어 조직적인 구조 또는 패턴을 형성한다. 본 발명의 페리틴 단백질은 나노 스케일의 입자이다. 예컨대 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자가 융합된 페리틴 단량체 24개가 자기 조립되어 페리틴 단백질을 형성할 수 있다.

본 발명의 페리틴 단백질은 구형일 수 있다. 구형인 경우 예컨대 그 입경이 8 내지 50nm일 수 있다. 보다 구체적으로, 8nm 내지 50nm, 8nm 내지 45nm, 8nm 내지 40nm, 8 nm 내지 35nm, 8nm 내지 30nm, 8nm 내지 25nm, 8nm 내지 20nm, 8nm 내지 15nm일 수 있다.

본 발명의 페리틴 단백질은 외부 표면에 외래 펩타이드가 융합된 것이다. 외래 펩타이드는 페리틴에 대한 외래 펩타이드일 수 있다. 페리틴 단백질의 외부 표면에 외래 펩타이드가 융합되어 있기만 하면 되는 것으로, 페리틴 단백질을 이루는 모든 페리틴 단량체에 외래 펩타이드가 융합되어 있을 필요는 없다.

예컨대 외래 펩타이드가 융합된 페리틴 단량체 24개가 자기 조립되어 페리틴 단백질을 형성할 때, 24개의 페리틴 단량체 중 적어도 1개의 페리틴 단량체에 외래 펩타이드가 융합되어 있으면 된다. 페리틴 단백질 외부 표면의 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자의 밀도를 높이기 위해 24개의 페리틴 단량체 모두에 외래 펩타이드를 융합시킬 수 있다.

페리틴 단백질을 이루는 각 페리틴 단량체에는 면역 관문 분자와 외래 펩타이드가 1종 또는 2종 이상 융합될 수 있다. 페리틴 단백질을 이루는 각 페리틴 단량체는 서로 다른 외래 펩타이드가 융합되어 있을 수 있다.

외래 펩타이드는 약리 활성 펩타이드일 수 있다. 이는 약리 활성을 갖는 것이라면 어떠한 펩타이드라도 제한되지 않고 사용될 수 있으며, 예를 들면 면역 관문 분자와 결합 가능한 리간드 또는 리간드의 단편, 수용체 또는 수용체의 단편, 항체 또는 항원 결합부위(CDR)를 포함하는 항체의 단편; 또는 질환 항원 에피토프일 수 있다.

면역 관문 분자(Immune checkpoint molecule)는 T세포에 결합하여 T세포를 불활성화시키는 역할을 한다. 이러한 면역 관문 분자는 예를 들면 Her-2/neu, VISTA, 4-1BBL, Galectin-9, Adenosine A2a receptor, CD80, CD86, ICOS, ICOSL, BTLA, OX-40L, CD155, BCL2, MYC, PP2A, BRD1, BRD2, BRD3, BRD4, BRDT, CBP, E2F1, MDM2, MDMX, PPP2CA, PPM1D, STAT3, IDH1, PD1, CTLA4, PD-L1, PD-L2, LAG3, TIM3, TIGIT, BTLA, SLAMF7, 4-1BB, OX-40, ICOS, GITR, ICAM-1, BAFFR, HVEM, LFA-1, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, LAIR1, 2B4, CD2, CD3, CD16, CD20, CD27, CD28, CD40L, CD48, CD52, EGFR family, AXL, CSF1R, DDR1, DDR2, EPH receptor family, FGFR family, VEGFR family, IGF1R, LTK, PDGFR family, RET, KIT, KRAS, NTRK1, NTRK2 등일 수 있다.

면역 관문 분자와 결합 가능한 분자는 면역 관문 분자와 결합 가능한 리간드 또는 리간드의 단편, 수용체 또는 수용체의 단편, 항체 또는 항원 결합부위(CDR)를 포함하는 항체의 단편일 수 있다.

항체는 CDR(complementarity-determining regions)을 가지는 모든 항체일 수 있고, 이는 IgA, IGD, IgE, IgG, IgM, IgY, IgW 클래스 등에 속하는 모든 항체, 이의 항원 결합 단편, scFv 등을 포함할 수 있다.

예를 들자면, 항체는 질환 항원의 항체, 면역 관문 분자에 대한 항체, 진단, 예측, 평가 등의 목적으로 검출하고자 하는 항원에 대한 항체, 질환의 치료 타겟이 되는 항원의 항체 등일 수 있다.

질환 항원은 면역 반응에 의해 예방, 치료, 완화 또는 개선될 수 있는 모든 질환의 항원일 수 있다. 예를 들면 질환 항원은 암세포, 병원체 세포 또는 병원체에 감염된 세포의 세포 표면 항원일 수 있다. 질환 항원의 항원 특이성을 결정하는 특정 부위가 질환 항원 에피토프이다.

질환은 항체에 의해 치료될 수 있는 모든 질환을 포함하는 것으로서, 예를 들면 감염성 질환, 암, 염증성 질환 등일 수 있다.

감염성 질환은 예를 들면 바이러스, 세균, 진균, 기생충 또는 프리온 감염증일 수 있다.

염증성 질환은 예를 들면 죽상동맥경화증, 동맥경화증, 자가면역질환, 다발성 경화증, 전신 홍반성 루푸스, 류마티스성 다발근통, 통풍성 관절염, 퇴행성 관절염, 건염, 활액낭염, 건선, 낭성 섬유증, 관절뼈염, 류마티스성 관절염, 염증성 관절염, 쇼그렌 증후군, 거대 세포성 동맥염, 진행성 전신 경화증(피부경화증), 강직성 척추염, 다발근염, 피부근염, 유사천포창, 당뇨병(예를 들어, 유형 I), 중증근무력증, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 굿파스쳐 질환, 혼합 결합 조직병, 경화성 담관염, 염증성 장질환, 크론병, 궤양성 대장염, 악성 빈혈, 염증성 피부병, 통상성 간질성 폐렴, 석면증, 규폐증, 기관지 확장증, 베릴륨증, 활석증, 진폐증, 사르코이드증, 박리성 간질성 폐렴, 림프구성 간질성 폐렴, 거대 세포성 간질성 폐렴, 세포성 간질성 폐렴, 외인성 알러지 폐포염, 베게너 육아종증 및 관련 형태의 혈관염(측두동맥염 및 결절성 다발동맥염), 염증성 피부염, 간염, 지연형 과민 반응(예를 들어, 옻중독), 폐렴, 호흡계 감염, 성인 호흡 곤란 증후군, 뇌염, 즉시 과민 반응, 천식, 건초열, 알러지, 급성 아나필락시스, 류마티스 열, 사구체신염, 신우신염, 봉와직염, 방광염, 만성 담낭염, 허혈(허혈성 손상), 재관류 손상, 동종 이식 거부, 숙주 대 이식편 거부, 맹장염, 동맥염, 안검염, 모세기관지염, 기관지염, 자궁경부염, 담관염, 융모양막염, 결막염, 누선염, 피부근염, 심내막염, 자궁내막염, 장염, 소장결장염, 상과염, 부고환염, 근막염, 섬유염, 위염, 위장염, 치은염, 회장염, 홍채염, 후두염, 척수염, 심근염, 신장염, 제대염, 난소염, 고환염, 골염, 이염, 췌장염, 이하선염, 심낭염, 인두염, 늑막염, 정맥염, 폐렴, 직장염, 전립선염, 비염, 난관염, 부비강염, 구내염, 활액막염, 정소염, 편도선염, 요도염, 방광염, 포도막염, 질염, 혈관염, 외음염, 외음질염, 맥관염, 만성 기관지염, 골수염, 시신경염, 측두동맥염, 횡단척수염, 괴사성 근막염 및 괴사성 장염을 포함한다.

암은 예를 들면 뇌암, 두경부암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암, 식도암, 백혈병, 폐암, 간암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 직장암, 신장암, 위암, 고환암, 자궁암, 혈관 종양, 편평세포암종, 선암종, 소세포 암종, 흑색종, 신경교종, 신경아세포종, 육종, 후두암, 이하선암, 담도암, 갑상선암, 광선각화증, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수 백혈병, 샘낭암종, 선종, 선 평편상피암종, 항문관암, 항문암, 항문직장암, 성상세포종, 큰질어귀샘암, 기저세포 암종, 담즙암, 골암, 골수암, 기관지암, 기관지샘 암종, 카시노이드, 담관암종, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 투명세포 암종, 결합조직암, 낭선종, 소화계통암, 십이지장암, 내분비계암, 내배엽동종양, 자궁내막증식증, 자궁내막모양 선암종, 내피세포암, 뇌실막세포, 상피세포암, 안와암, 국소결절성 과증식, 담낭암, 날문방암, 위 기저부 암, 가스트린종, 교모세포종, 글루카곤종, 심장암, 혈관아세포종, 혈관내피종, 혈관종, 간샘종, 간 선종증, 간담도암, 간세포 암종, 호지킨병, 회장암, 인슐린종, 상피내 신생물, 상피내 편평세포 신생물, 간내 담도암, 침윤성 편평세포암종, 공장암, 관절암, 골반암, 거대 세포 암종, 대장암, 림프종, 악성 중피세포 종양, 수아세포종, 수질상피종, 뇌막암, 중피암, 전이성 암종, 구강암, 점막표피모양 암종, 다발성 골수종, 근육암, 비강관암, 신경계암, 비-상피 피부암, 비-호지킨 림프종, 연맥 세포 암종, 핍지교종암, 구강암, 골육종, 유두상 장액성 선암종, 음경암, 인두암, 뇌하수체 종양, 형질세포종, 가육종, 폐 아세포종, 직장암, 신세포 암종, 호흡계 암, 망막아세포종, 장액성 암종, 부비강암, 피부암, 소세포 암종, 소장암, 평활근육암, 연조직암, 소마토스타틴-분비 종양, 척추암, 편평세포암종, 선조 근육암, 중피세포하층암, T 세포 백혈병, 설암, 요관암, 요도암, 자궁경부암, 자궁몸통암, 질암, VIPoma, 외음부암, 고분화 암종 및 윌름 종양으로 이루진 군에서 선택된 암일 수 있다.

염증성 질환 항원은 예를 들면 염증성 사이토카인일 수 있고, 예를 들면 인간 성장 호르몬 (human growth hormone), N-메티오닐 인간 성장 호르몬 (N-methionyl human growth hormone) 및 소 성장 호르몬 (bovine growth hormone)과 같은 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬 (parathyroid hormone); 티록신 (thyroxine); 인슐린 (insulin); 프로인슐린 (proinsulin); 릴랙신 (relaxin); 프로릴랙신 (prorelaxin); 난포 자극 호르몬 (follicle stimulating hormone, FSH), 갑상선 자극 호르몬 (thyroid stimulating hormone, TSH) 및 황체 형성 호르몬 (luteinizing hormone, LH)과 같은 당단백 호르몬; 간 성장 인자 (hepatic growth factor); 섬유아세포 성장 인자 (fibroblast growth factor); 프로락틴 (prolactin); 태반 락토겐 (placental lactogen); 종양 괴사 인자-알파 (tumor necrosis factor such as tumor necrosis factor-alpha, TNF-α) 및 종양 괴사 인자-베타 (tumor necrosis factor-beta, TNF-β)와 같은 종양 괴사 인자; 뮐러관 (mullerian)-억제 물질; 마우스 성선 자극 호르몬 관련 펩타이드 (mouse gonadotropin-associated peptide); 인히빈 (inhibin); 액티빈 (activin); 혈관 내피 성장 인자 (vascular endothelial growth factor); 인테그린 (integrin); 인간혈소판 생성 촉진인자 (thrombopoietin, TPO); NGF-알파 (NGF-α)와 같은 신경 성장 인자 (nerve growth factors); 혈소판 성장 인자 (platelet-growth factor); 태반 성장 인자 (placental growth factor); TGF-α 및 TGF-β와 같은 형질 전환 성장 인자 (transforming growth factors, TGF); 인슐린 유사 성장 인자-1 및 -11 (insulin-like growth factor-1 and -11); 에리트로포이에틴 (erythropoietin, EPO); 골유도 인자(osteoinductive factors); 인터페론-알파 (IFN-α), 인터페론-베타 (IFN-β) 및 인터페론-감마 (IFN-γ)와 같은 인터페론; 대식세포-CSF (macrophage-CSF, M-CSF)와 같은 콜로니 자극 인자 (colony stimulating factors, CSF); 과립구 대식세포-CSF (granulocyte macrophage-CSF, GM-CSF); 과립구-CSF (granulocyte-CSF, G-CSF); IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-33 등의 인터루킨; 및 LIF 및 키트 리간드 (kit ligand, KL)를 비롯한 기타 폴리펩타이드 인자를 포함한다.

암 항원은 예를 들면 gp100, MART-1, Melna-A, MAGE-A3, MAGE-C2, Mammaglobin-A, proteinsase-3, mucin-1, HPV E6, LMP2, PSMA, GD2, hTERT, PAP, ERG, NA17, ALK, GM3, EPhA2, NA17-A, TRP-1, TRP-2, NY-ESO-1, CEA, CA 125, AFP, Survivin, AH1, ras, G17DT, MUC1, Her-2/neu, E75, p53, PSA, HCG, PRAME, WT1, URLC10, VEGFR1, VEGFR2, E7, Tyrosinase 펩타이드, B16F10, EL4 신생항원(neoantigen)일 수 있다. 상기 신생항원은 종양세포 내의 체성 돌연변이에 의해 유도되어 형성되는 면역원성 펩타이드를 의미한다. 상기 신생항원은 MHC I과 복합체를 형성하고 종양세포의 표면으로 이동하여 항원 에피토프로 표시될 수 있는데, T-세포의 수용기 (T-cell receptor, TCR)가 이 신생항원-MHC I 복합체를 인식함으로써 면역반응을 유도할 수 있다.

항체는 예를 들면 암세포 또는 T 세포 표면의 면역 관문 분자에 대한 항체일 수 있다. 예를 들면 PD-1, Her-2/neu, VISTA, 4-1BBL, CD48, Galectin-9, Adenosine A2a receptor, CD80, CD86, ICOS, ICOSL, BTLA, OX-40L, CD155, BCL2, MYC, PP2A, BRD1, BRD2, BRD3, BRD4, BRDT, CBP, E2F1, MDM2, MDMX, PPP2CA, PPM1D, STAT3, IDH1, PD-L1, PD-L2, CD40L, LAG3, TIM3, TIGIT, BTLA, CD52, SLAMF7, 4-1BB, OX-40, ICOS, GITR, CD27, CD28, CD16, CD3, CD20, EGFR family, AXL, CSF1R, DDR1, DDR2, EPH receptor family, FGFR family, VEGFR family, IGF1R, LTK, PDGFR family, RET, KIT, KRAS, NTRK1 또는 NTRK2일 수 있다.

검출하고자 하는 항원은 예를 들면 바이오마커일 수 있고, 예를 들자면 질병 진단용 바이오마커, 질병 발생 가능성 예측용 바이오마커, 특정 의약의 예후 진단용 바이오마커 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

CDR은 항체에 구성 성분인 CDR로서, 예를 들면 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있고, 예를 들면 HCDR3 일 수 있다.

1개 또는 2개 이상의 CDR이 페리틴 단량체에 융합될 수 있다.

2개 이상의 CDR이 융합된 경우, 동일 항체의 동일 CDR이 2개 이상 포함할 수도 있고, 동일 항체의 서로 다른 CDR을 포함할 수도 있고, 서로 다른 항체의 CDR을 포함할 수도 있다.

또한, 본 발명의 단백질은 서로 다른 CDR이 융합된 페리틴 단량체를 포함하여 자기조립된 것일 수도 있다.

서로 다른 CDR은 동일 항체의 서로 다른 CDR 또는 서로 다른 항체의 CDR일 수 있다.

질환 항원 에피토프는 gp100, MART-1, Melna-A, MAGE-A3, MAGE-C2, Mammaglobin-A, proteinsase-3, mucin-1, HPV E6, LMP2, PSMA, GD2, hTERT, PAP, ERG, NA17, ALK, GM3, EPhA2, NA17-A, TRP-1, TRP-2, NY-ESO-1, CEA, CA 125, AFP, Survivin, AH1, ras, G17DT, MUC1, Her-2/neu, E75, p53, PSA, HCG, PRAME, WT1, URLC10, VEGFR1, VEGFR2, E7, Tyrosinase 펩타이드, B16F10, EL4, 신생항원(neoantigen) 및 GV1001로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

외래 펩타이드는 페리틴 단백질의 외부 표면에 노출될 수 있다면 페리틴 단량체 어느 곳에 융합되어도 괜찮다. 외래 펩타이드는 페리틴 단량체가 자기 조립되는데 방해가 되지 않는 위치에 융합된다.

외래 펩타이드가 페리틴 단량체 내부에 융합되어 페리틴 단백질의 구조가 바뀔 수 있다. 페리틴 단량체의 각 구성 부분 중 내부로 함입되어 있는 부분이 외래 펩타이드의 융합에 의해 외부로 돌출될 수 있고, 반대로 페리틴 단량체의 각 구성 부분 중 외부로 돌출되어 있던 부분이 외래 펩타이드의 융합에 의해 내부로 함입되게 될 수 있다.

외래 펩타이드는 페리틴 단백질의 인간 트랜스페린 수용체에 대한 결합력을 떨어뜨리거나 인간 트랜스페린 수용체와의 결합력에 방해가 되는 위치에 융합되는 것이 바람직하다.

외래 펩타이드는 그 구조, 분자량 및 아미노산 길이가 특정한 범위의 것으로 한정되지 않는다.

외래 펩타이드는 예컨대 그 아미노산 길이가 25aa 이하인 리간드, 항체 또는 이들의 단편일 수 있다. 보다 구체적으로 아미노산의 길이가 25aa 이하, 24aa 이하, 23aa 이하, 22aa 이하, 21aa 이하, 20aa 이하, 19aa 이하, 18aa 이하, 17aa 이하, 16aa 이하, 15aa 이하, 14aa 이하, 13aa 이하, 12aa 이하, 11aa 이하, 10aa 이하, 9aa 이하, 8aa 이하, 7aa 이하, 6aa 이하, 5aa 이하일 수 있다. 또한 예컨대 그 아미노산의 길이가 3aa 이상, 4aa 이상, 5aa 이상, 6aa 이상, 7aa 이상, 8aa 이상, 9aa 이상, 10aa 이상일 수 있다.

외래 펩타이드의 융합 위치는 특정한 위치로 제한되지 않으며, 예컨대 페리틴 단량체의 α-헬릭스의 내부(A 헬릭스, B 헬릭스, C 헬릭스, D 헬릭스 또는 E 헬릭스), 인접한 α-헬릭스들 사이, N-말단, C-말단, A-B루프, B-C루프, C-D루프, D-E루프, N-말단과 A 헬릭스 사이, E 헬릭스와 C-말단 사이, 헬릭스 내부 등에 융합될 수 있다.

본 발명의 페리틴 단백질은 트랜스페린 수용체에 대해서는 잘 결합하지 않도록 돌연변이된 것이다. 예컨대 본 발명의 페리틴 단백질은 트랜스페린 수용체에 대하여 다음 수학식 1을 만족한다:

[수학식 1]

K ≥ 10 nM

상기 결합력은 예를 들면 인간 트랜스페린 수용체에 대한 결합력일 수 있다.

수학식 1의 K 값이 10nM 이상, 20nM 이상, 30nM 이상, 40nM 이상, 50nM 이상, 60nM 이상, 70nM 이상, 80nM 이상, 90nM 이상, 100nM 이상, 110nM 이상, 120nM 이상, 125nM 이상, 125nM 초과, 150nM 이상, 200nM 이상, 210nM 이상, 220nM 이상, 230nM 이상, 240nM 이상, 250nM 이상, 260nM 이상, 270nM 이상, 280nM 이상, 290nM 이상, 300nM 이상, 350nM 이상, 400nM 이상, 450nM 이상, 500nM 이상, 550nM 이상, 600nM 이상, 700nM 이상, 800nM 이상, 900nM 이상, 1000nM 이상이다. 수학식 1의 K값이 클수록 트랜스페린 수용체에 대한 결합력이 떨어지는 것이다.

트랜스페린 수용체에 대한 결합력(K)은 본 발명의 페리틴 단백질(A)과 트랜스페린 수용체와의 결합 반응의 평형 상태에서 측정된다. 평형 상태에서의 페리틴 단백질의 농도([P]), 트랜스페린 수용체의 농도([T]) 및 본 발명의 단백질과 트랜스페린 수용체의 복합체의 농도([PT])는 공지된 다양한 방법으로 측정될 수 있다.

본 발명의 페리틴 단백질은 트랜스페린 수용체에 대한 결합력을 낮추기 위해 트랜스페린 수용체와의 결합에 관여하는 부위에 외래 펩타이드를 융합시킬 수 있다. 예컨대 본 발명의 페리틴 단백질의 B-C루프 및 A 헬릭스 부분에 외래 펩타이드가 위치하도록 상기 외래 펩타이드를 융합시킬 수 있다.

본 발명의 페리틴 단백질은 해당 단백질을 코딩하는 서열을 발현하는 미생물 내에서 제조되는 것일 수 있다.

미생물은 당 분야에 공지된 미생물이 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들면 대장균일 수 있고, 구체적으로는 BL21(DE3)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

미생물 시스템으로 단백질을 제조하는 경우에 얻어지는 단백질이 세포질에 용해된 상태로 존재해야 분리/정제가 용이하다. 많은 경우 제조된 단백질이 봉입체(inclusion body) 등으로 응집된 상태로 존재한다. 본 발명의 페리틴 단백질은 미생물 생산 시스템에서 세포질에 용해된 비율이 높게 나타난다. 분리/정제 및 활용이 용이하다.

본 발명의 페리틴 단백질은 예를 들면 이를 제조하는 대장균 시스템에서 전체 단백질 중 수용성 분획비율이 40% 이상인 상태로 제조될 수 있다. 구체적으로, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상일 수 있다. 그 상한은 예를 들면 100%, 99%, 98%, 97%, 96% 등일 수 있다.

본 발명은 이상의 페리틴 단백질은 그 외래 펩타이드의 종류에 따라 다양한 용도로 활용될 수 있다.

예를 들어, 외래 펩타이드가 약리 활성 펩타이드인 경우, 그러한 약리 활성을 활용하는 약학 조성물로서 활용될 수 있다. 구체적으로, 외래 펩타이드가 면역 관문 분자와 결합 가능한 리간드 또는 리간드의 단편, 수용체 또는 수용체의 단편, 항체 또는 항원 결합부위(CDR)를 포함하는 항체의 단편; 또는 질환 항원 에피토프인 경우, 상기 약학 조성물은 암, 감염질환, 염증질환 등일 수 있다.

본 발명은 상기 페리틴 단백질을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 이상의 페리틴 단백질에 관하여 설명된 사항은 모두 본원의 약학 조성물의 유효성분으로서의 페리틴 단백질에 그대로 적용된다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, “약학적으로 허용 가능한 담체”란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 성분의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 본 발명에서의 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 또는 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여, 조직 또는 장기에 주입하기에 적합한 주사제의 형태로 제형화할 수 있다. 또한, 등장성 멸균 용액, 또는 경우에 따라 멸균수나 생리 식염수를 첨가하여 주사 가능한 용액이 될 수 있는 건조 제제(특히 동결 건조제제)로 제형화할 수도 있다. 또한, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 충진제, 부형제, 붕해제, 결합제 또는 활택제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.

한 구체예에서, 상기 약학 조성물은 주사 제형일 수 있으며, 정맥내 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, “유효량”은 목적하는 치료되어야 할 특정 질환의 발병 또는 진행을 지연하거나, 전적으로 증진시키는데 필요한 양을 의미한다.

본 발명에서 조성물은 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 상기 약학 조성물의 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다.

본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 약학적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적인 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 필요에 따라 약물의 제조, 사용 및 판매를 관장하는 정부 기관에 의해 지시된 형태로 포장과 연계된 지시서가 수반될 수 있으며, 상기 지시서는 조성물의 형태 또는 인간이나 동물 투여에 관하여 사익 기관의 승인을 나타내고 있고, 예를 들어, 약물의 처방에 대하여 미국 식품의약국에서 승인된 표지일 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.

실시예

1. 단백질 제조용 발현 벡터 구성

huHF는 24개의 단량체로 구성된 구형 단백질 나노입자(12 nm)로서 각 단량체는 총 5개의 α-helix로 구성되어 있다. 본 발명자는 유전자 클로닝을 통해 huHF 단량체의 transferrin receptor와 결합하는 아미노산 서열에 돌연변이를 유도하여 표 1의 huHF_Mutant1(Q15A, D16A, R23A, F82A, Q84A), huHF_Mutant2(Q15A, D16A, R23A, F82A, Q84A, E117A, K120A, D124A)를 확보하였다. huHF_Mutant1 및 2의 α-helix 사이 loop(PDB 3AJO sequence 기준 huHF 5T 내지 176G 중 BC loop; 92D/93W)와 C-말단 중 선택된 위치에 항체 CDR3 펩타이드 및 도메인을 유전자 클로닝을 통해 삽입하여 전달체를 확보하였다.

하기 표 2의 서열을 사용하였고, 하기 도 1 내지 3, 표 3의 벡터 모식도에 따라 PCR을 수행하여 huHF_Mutant1-dual (BC loops, C-말단), huHF_Mutant2-dual (BC loops, C-말단), huHF_Mutant1-h_smPD1 (C-말단)를 제조하였다. 제작된 모든 플라즈미드 발현 벡터는 아가로스 젤에서 정제한 다음, 완전한 DNA 시퀀싱을 통해 서열을 확인하였다.

명칭	서열번호
huHF_Native	1
huHF-Mutant1	2
huHF-Mutant2	3

명칭	서열번호
huHF-αPD-L1	4
huHF αTIGIT	5
huHF-h-smPD1	6
Linker1	7
Linker2	8
Linker3	9

단백질	발현 벡터
huHF_Native	NH2-NdeI-huHF-αPD-L1 HCDR3-HindIII-COOH
huHF_Mutant1-dual	BC(92D/93W): NH2-NdeI-huHF_Mutant1-[αPD-L1 HCDR3]- huHF_Mutant1- αTIGIT HCDR3-HindIII-COOH
huHF_Mutant2-dual	BC(92D/93W): NH2-NdeI-huHF_Mutant2-[αPD-L1 HCDR3]-huHF- αTIGIT HCDR3-HindIII-COOH
huHF_Mutant1-h_smPD1	NH2-NdeI-huHF_Mutant1-Linker2-h_smPD1-HindIII-COOH

2. 단백질의 생합성

대장균 균주 BL21[(fhuA2 [lon] ompT gal [dcm] △hsdS)]를 상기 제조된 발현벡터로 각각 형질 전환하고, 카나마이신-저항성 형질 전환체를 선택하였다. 형질 전환된 대장균을 50 mL의 Luria-Bertani (LB) 배지(100 mg L-1카나마이신 함유)를 함유하는 플라스크(250 mL Erlenmeyer flasks, 37 ℃, 150 rpm)에서 배양하였다. 배지 탁도(O.D 600)가 약 0.5-0.7에 도달할 때, IPTG (Isopropyl-β-Dthiogalactopyranosid) (1.0 mM)을 주입하여 재조합 유전자의 발현을 유도하였다.

20℃에서 16~18 시간 배양한 후, 배양한 대장균을 4,500 rpm으로 10분간 원심 분리하여 균체 침전물을 회수하고 5 ㎖의 파쇄 용액(10 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.5, 10 mM EDTA)에 현탁하여 초음파 파쇄기(Branson Ultrasonics Corp., Danbury, CT, USA)를 이용하여 파쇄하였다. 파쇄한 후 13,000 rpm으로 10분간 원심분리한 뒤 상등액과 불용성 응집체를 분리하였다. 분리된 상등액을 추후 실험에 이용하였다.

3. 단백질의 정제

상기 실시예 2에서 획득한 상등액을 3단계의 과정을 거쳐 정제하였다. 먼저 1) 재조합 단백질에 융합된 히스티딘과 니켈의 결합을 이용한 Ni²⁺-NTA affinity 크로마토그래피를 진행한 후, 2) 재조합 단백질을 농축하고 버퍼 교환을 통하여 형광물질을 부착하였으며, 3) 마지막으로 형광물질이 부착된 자가 조립된 단백질 나노입자만을 분리하기 위하여 수크로스 구배 초원심분리(ultracentifugation)를 진행하였다. 각 단계별 상세한 기재는 아래와 같다.

1) Ni²⁺-NTA affinity 크로마토그래피

재조합 단백질을 정제하기 위하여 상기 명시된 동일한 방법으로 배양된 대장균을 회수하여 그 세포 펠렛을 5 mL 라이시스 버퍼(pH 8.0, 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole)에 재부유하고 초음파 파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 세포액을 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 그 상등액만 분리한 후 각 재조합 단백질을 Ni²⁺-NTA 컬럼(Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하여 각각 분리하였다 (세척 버퍼: pH 8.0, 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 80 mM imidazole / 용출 버퍼: pH 8.0, 50 mM sodium phosphate, 300mM NaCl, 200 mM imidazole).

2) 수크로스 구배 초고속 원심 분리

PBS(2.7 mM KCl, 137 mM NaCl, 2 mM KH₂PO₄, 10mM Na₂HPO₄, pH7.4) 버퍼에 수크로스를 농도별로 각각 첨가하여 40%, 35%, 30%, 25%, 20%의 수크로스를 포함하는 용액을 각각 준비한 후 초고속 원심 분리용 튜브 (ultraclear 13.2ml tube, Beckman)에 각 농도별 (45~20%) 수크로스 용액을 농도가 높은 용액부터 2 ml씩 담은 다음, 준비된 자가조립용 버퍼에 존재하는 재조합 단백질 용액을 1ml 채운 후 35,000rpm으로 16시간 동안 4℃로 초고속 원심 분리를 시행하였다(Ultracentrifuge L-90k, Beckman). 원심 분리 후 조심스럽게 파이펫을 이용하여 위 층 (20-25% 수크로스 용액 부분)을 2)에 명시된 바와 같이 ultracentrifugal filter와 PBS 버퍼를 이용하여 재조합 단백질의 버퍼를 교체해 주었다.

4. 단백질의 수용성 분획 확인

pCM(Tac promoter) 기반 각종 발현 벡터를 BL21 competent cell을 형질전환 (transformation)시켰다. 단일 콜로니를 카나마이신 100 mg/L이 첨가된 LB 액체 배지(50 mL)에 접종하여 진탕 배양기 (shaking incubator)에서 37℃, 130 rpm의 조건에서 배양하였다. 탁도(turbidity/optical density at 600 nm)가 0.5에 도달하면, IPTG 1 mM 투여를 통해 타겟 단백질의 발현을 유도하였다. 이후 20℃에서 12~16 시간 배양 후, 배양액 속의 세포들은 원심분리(13000 rpm, 10 분)을 통하여 spun-down되고, 세포 펠릿을 수거하여 10 mM Tris-Hcl (pH 7.4) 버퍼에 재부유시켰다. 재부유된 세포들은 Branson Sonifier (Branson Ultrasonics Corp., Danbury, CT)를 이용하여 파열되었다. 음파처리 후, 용해성 단백질을 포함한 상층액과 불용성 단백질을 포함한 응집체들은 원심분리(13000 rpm, 10 분)로 분리되었다. 분리된 용해성, 불용성 단백질 분획의 SDS-PAGE 분석을 통해 확인하였다(도 2, 도 3).

5. 단백질의 조립 검증

실시예 3에서 제작한 각각의 단백질의 정제된 재조합 단백질 나노입자의 구조 분석을 위하여 투과전자현미경 (TEM) 재조합 단백질을 촬영하였다. 먼저 염색하지 않은 정제한 단백질 샘플을 탄소 코팅된 구리 전자 현미경 그리드(grids) 올린 후 자연 건조하였다. 단백질의 염색된 이미지를 얻기 위해, 자연 건조된 샘플을 포함하는 전자 현미경 그리드를 2% (w/v) 수성 우라닐 아세테이트 용액과 함께 10분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 증류수로 3-4회 세척하였다. 단백질 이미지를 Philips Technai 120 kV 전자 현미경을 이용하여 관찰한 결과, 각각의 입자들이 구형의 나노입자를 형성함을 확인하였다(도 2, 도 3).

6. 단백질의 항원에 대한 결합력 측정

상기 실시예에서 제조한 단백질들의 Native형태와 Mutant(huHF_mutant1-dual, huHF_mutant2-dual)의 human transferrin receptor에 대한 결합력을 비교하였다.

제조된 단백질의 항원에 대한 결합력 A를 하기 방법에 따라 측정하였다.

먼저, human transferrin receptor-Fc tag standard를 high-binding 96 well plate에 2μg/ml로 100㎕씩 4℃ overnight 부착하였다.

그리고, PBST(PBS+Tween0.05%) 200㎕로 3번 washing 해주었다. SuperBlcok^TM(PBS) Blocking Buffer (thermo cat#37515) 100㎕씩 1시간 상온에서 blocking 과정을 수행하였다.

그리고, PBST(PBS+Tween0.05%) 200㎕로 3번 washing 해주었다. 상기 실시예에서 제조한 단백질들을 농도 구간별로 100㎕씩 4℃ overnight 처리하였다.

그리고, PBST(PBS+Tween0.05%) 200㎕로 3번 washing 해주었다. hexa-His tag에 특이적으로 결합하는 항체(mouse anti His tag antibody, Hisprobe)를 1/1000로 PBST에 희석하여 이를 100㎕씩 1시간 상온에서 처리해주었다.

그리고, PBST(PBS+Tween0.05%) 200㎕로 3번 washing 해주었다. 쥐 항체에 특이적으로 결합하는 항체(goat anti mouse igG antibody-HRP)를 1/1000로 PBST에 희석하여 이를 100㎕씩 1시간 상온에서 처리해주었다.

그리고, PBST(PBS+Tween0.05%) 200㎕로 3번 washing 해주었다. HRP와 반응하여 발색반응을 나타내는 TMB solution을 100㎕씩 15분 상온에서 처리해주었다. 1M H₂SO₄ 용액을 50㎕씩 처리해준 뒤, TECAN으로 450nm 파장으로 optical density를 측정해주었다. 이를 Langmuir equation을 이용하여 계산하였다. (표 4, 도 4 내지 도 6)

구분		결합력
huHF-h_smPD1	Native	46.8
	Mutant	94.2
huHF_mutant1-dual		181.9

도 7은 huHF_mutant1-dual과 huHF_mutant2-dual의 hTfR에 대한 결합력을 평가/비교한 것으로서, 이를 참고하면 huHF_mutant2-dual의 경우 농도를 10000nM까지 증가시킨 경우에도 포화되지 않아, hTfR에 대한 결합력이 더욱 감소한 것을 확인할 수 있다. 예상 포화지점을 선정하여 그 결합력 Kd 값을 계산한다면 약 4400nM이 된다.

8. huHF_mutant-dual 처리에 따른 NK 세포와 암 세포 간의 결합능 평가

형광물질인 CFSE로 인간 폐암 세포주인 A549를 표지하였다. 10⁶개의 세포에 CFSE를 5μM 농도로 20분간 37℃ 인큐베이터에서 반응시키고, 이를 PBS로 워싱하여 10⁵ 세포를 2ml cell plate 에 2 ml culture media에 희석해서 하루 배양하였다.

이후 10⁵개의 NK 세포를 CFSE로 염색된 A549 세포주와 반응시켰다.

이때, 대조군으로 PBS 10 μl를 사용하고, 실험군으로 Cy5.5 형광염료가 표지된 huHF_mutant-dual(dICB, dual immune checkpoint blocker)을 3 μM 10 μl를 넣었다.

인큐베이터에서 10분간 반응시킨 뒤, NK 1.1 antibody-PE 항체를 이용하여 NK 세포를 표지하였다.

4% formaldehyde로 샘플을 고정하고, fluorescence microscopy로 형광 이미지를 확인하였다.

대조군(PBS)에 비해 실험군(huHF_mutant-dual)의 형광 이미지에서 NK 세포가 A549 세포에 더 많이 부착되어 있는 것을 확인하였다(도 8).

9. huHF_mutant-dual 처리에 따른 NK 세포와 암 세포 간의 결합능력 및 NK 세포의 암세포 사멸능 평가

형광물질인 CFSE로 인간 폐암 세포주인 A549를 표지하였다. 10⁶개의 세포에 CFSE를 5μM 농도로 20분간 37℃ 인큐베이터에서 반응시키고, 이를 PBS로 워싱하여 10⁴ 세포를 96 well plate 에 200 μl culture media에 희석해서 하루 배양하였다.

이후 DAPI로 표지된 10⁴~10⁵개의 NK 세포를 조건에 따라 CFSE로 염색된 A549 세포주와 반응시켰다.

이때, PBS 10 μl, Abs(Tecentriq+mAb-mTIGIT (Bio X Cell, #BE0274) 병용투여군) 3 μM 10 μl (각각 3 μM , 총 6 μM), 및 huHF_mutant-dual 3 μM 10 μl를 넣었다.

결합 측정은 상기 반응액을 인큐베이터에서 30분간 반응시킨 뒤 FACS 장비로 CFSE fluorescence와 DAPI fluorescence를 동시에 나타내는 세포 비율을 분석하였다 (도 9). 이를 참고하면 huHF_mutant-dual 처리시에 NK cell의 A549 cell에 대한 결합능이 증가함을 확인할 수 있다.

Fluorescence microscopy로 이에 대한 형광 이미지를 확인하였다(도 10). NK 1.1 antibody-PE 항체로 NK 세포를 표지하였다.

독성 측정은 상기 반응액을 인큐베이터에서 48시간 반응시킨 뒤 FACS 장비로 샘플에 따른 독성 능력을 검증하였다. 7-AAD로 세포가 사멸되는 정도를 분석하였다.

CFSE fluorescence와 7-AAD fluorescence를 동시에 나타내는 세포 비율을 분석하여 NK 세포와 암 세포 비율 및 샘플에 따른 NK 세포의 독성 능력을 분석하였다(도 11). 이를 참고하면 huHF_mutant-dual 처리시에 NK cell의 A549 cell의 사멸능이 증가함을 확인할 수 있다.

10. 암 세포 성장 억제능 평가

다음과 같은 샘플군 (PBS, Tecentriq, Tecentriq+mAb-mTIGIT, huHF_mutant-dual)에 대하여 각 5마리씩 마우스 폐암 세포주인 LLC1에 대하여 암 세포 정상 억제 효능을 검증하였다. Tecentriq은 폐암 등의 치료에 사용되는 PD-1 또는 PD-L1에 결합하는 단일클론항체이고, mAb-mTIGIT은 murine TIGIT에 결합하는 단일클론항체이다.

LLC1을 5*10⁵ 개씩 C57BL/6에 피하에 이식하여 종양모델을 형성하였다.

7일 후, 개체마다 종양 크기를 측정 및 분류하여 각 군마다 동일한 크기로 조절하였다.

7일부터 샘플을 3일 마다 미정맥을 통해 정맥주사하며, 각 개체마다 종양 크기를 측정하여 종양 성장 억제 효능을 비교하였다(도 12).

도 13에 각 실험군에서의 날짜별 종양 크기를 나타내었고, 도 14에 각 실험군에서의 22일차의 종양 크기를 나타내었다. 이를 참고하면, huHF_mutant-dual 의 경우 보다 적은 용량으로 처리함에도 불구하고 종양 크기가 가장 작아 그 효과가 우수함을 확인할 수 있다.

11. Cell avidity 평가

huHF_mutant-dual 및 mut-huHF의 인간 폐암 세포주 A549에 대한 avidity를 분석하였다.

먼저, Target cell (immune cell, cancer cell)을 배양하고 분주하였다

(1*10⁵ 개/10㎕, 1 FACS column (5ml polystyrene round-bottom tube, Falcon(352052))).

이후, 샘플(drug, antibody(anti-mouse PD-L1 antibody(BE0101), anti-mouse TIGIT antibody(BE0274), anti-human PD-L1(BE0285)))을 100㎕/FACS column 처리하고, control 군에는 FACS buffer (0.1%BSA + 0.01% sodium azide in PBS) 100㎕를 처리하였다(3hr, room temperature).

FACS buffer를 각 1ml 씩 상기 FACS column에 넣어준 뒤, 1700rpm으로 5분간 원심분리하고 상층액을 제거하는 공정을 3회 반복 수행하였다.

이후 Fluorescence antibody (anti his tag antibody-PE(SC-8036PE), anti-IgG antibody-PE(PE goat F(ab')2 anti-rat (IgG) secondary antibody(ab7010), PE F(ab')2-goat anti-mouse IgG(H+L) secondary antibody(12-4010-82)))를 처리하였다(2hr, room temperature).

이후 각 sample FACS column에 FACS buffer 100ul 넣어준 뒤, 7-AAD(BD Pharmigen (559925)) 2㎕를 5분간 처리하였다.

BD Biosciences, FACS 장비를 각 FACS columns 에서의 live cell 중 PE 형광을 나타내는 target cell의 비율을 이용하여 분석을 수행하였다(도 15-17).

이를 통해, huHF_mutant-dual이 세포 당 결합하는 샘플 수가 더 많고 결합한 세포 수도 더 뛰어남을 검증하였다.

12. 종양 성장 억제능 평가

다음과 같은 샘플군 (PBS, Ab-1, huHF_mutant-dual, huHF_mutant-dual+ Vac)에 대하여 각 5마리씩 마우스 폐암 세포주인 LLC1에 대하여 암 세포 정상 억제 효능을 검증하였다. Ab-1은 mouse마우스 항 PD-L1 항체를 사용하였고(Bio X Cell, #BE0101), 백신(Vac)으로는 LLC-1 neo-antigen vaccine(서열번호 10)을 사용하였다.

7일부터 샘플을 3일 마다 미정맥을 통해 정맥주사하며(G2 군의 경우 6일마다 주사), 각 개체마다 종양 크기를 측정하여 종양 성장 억제 효능을 비교하였다(도 18).

Ab-1은 30 nmol/kg, huHF_mutant-dual은 30 nmol/kg, Vac은 10 nmol/kg의 농도로 주사하였다.

이를 참고하면, huHF_mutant-dual 처리군의 종양 성장 억제능이 우수하고, 백신과 병용시에 보다 우수한 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.

<110> CELLEMEDY CO., LTD <120> NEW PROTEIN <130> 22P03023 <150> KR 10-2021-0057062 <151> 2021-05-03 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 183 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp 1 5 10 15 Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser 20 25 30 Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala 35 40 45 Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg 50 55 60 Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg 65 70 75 80 Ile Phe Leu Gln Asp Ile Gln Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser 85 90 95 Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn 100 105 110 Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro 115 120 125 His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys 130 135 140 Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly 145 150 155 160 Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu 165 170 175 Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser 180 <210> 2 <211> 183 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Ferritin Heavy Chain mutant <400> 2 Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Ala Ala 1 5 10 15 Ser Glu Ala Ala Ile Asn Ala Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser 20 25 30 Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala 35 40 45 Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg 50 55 60 Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg 65 70 75 80 Ile Ala Leu Ala Asp Ile Gln Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser 85 90 95 Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn 100 105 110 Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro 115 120 125 His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys 130 135 140 Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly 145 150 155 160 Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu 165 170 175 Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser 180 <210> 3 <211> 183 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Ferritin Heavy Chain mutant <400> 3 Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Ala Ala 1 5 10 15 Ser Glu Ala Ala Ile Asn Ala Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser 20 25 30 Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala 35 40 45 Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg 50 55 60 Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg 65 70 75 80 Ile Ala Leu Ala Asp Ile Gln Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser 85 90 95 Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn 100 105 110 Gln Ser Leu Leu Ala Leu His Ala Leu Ala Thr Ala Lys Asn Asp Pro 115 120 125 His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys 130 135 140 Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly 145 150 155 160 Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu 165 170 175 Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser 180 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 4 Gly Gly Ser Tyr Gly Ser Leu Tyr Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 5 Met Pro Ser Phe Ile Thr Leu Ala Ser Leu Ser Thr Trp Glu Gly Tyr 1 5 10 15 Phe Asp Phe <210> 6 <211> 52 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 6 Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu 1 5 10 15 Ala Ala Phe Pro Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln 35 40 45 Ile Lys Glu Ser 50 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 7 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Thr 1 5 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 8 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr 1 5 10 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 9 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 10 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LLC-1 neo-antigen vaccine <400> 10 Glu Leu Glu Leu Ala Leu Ser Pro Ile His Tyr Ser Ser Ala Ile Pro 1 5 10 15 Ala Ala Gly Ser Asn Gln Val Thr 20

Claims

외부 표면에 외래 펩타이드가 융합되고,
인간 트랜스페린 수용체에 대한 결합력이 떨어지도록 돌연변이된 페리틴 단백질.
청구항 1에 있어서, 상기 외래 펩타이드는 약리 활성 펩타이드인 페리틴 단백질.
청구항 1에 있어서, 상기 외래 펩타이드는 면역 관문 분자와 결합 가능한 리간드 또는 리간드의 단편, 수용체 또는 수용체의 단편, 항체 또는 항원 결합부위(CDR)를 포함하는 항체의 단편; 또는 질환 항원 에피토프인 단백질.
청구항 3에 있어서, 상기 면역 관문 분자는 Her-2/neu, VISTA, 4-1BBL, Galectin-9, Adenosine A2a receptor, CD80, CD86, ICOS, ICOSL, BTLA, OX-40L, CD155, BCL2, MYC, PP2A, BRD1, BRD2, BRD3, BRD4, BRDT, CBP, E2F1, MDM2, MDMX, PPP2CA, PPM1D, STAT3, IDH1, PD1, CTLA4, PD-L1, PD-L2, LAG3, TIM3, TIGIT, BTLA, SLAMF7, 4-1BB, OX-40, ICOS, GITR, ICAM-1, BAFFR, HVEM, LFA-1, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, LAIR1, 2B4, CD2, CD3, CD16, CD20, CD27, CD28, CD40L, CD48, CD52, EGFR family, AXL, CSF1R, DDR1, DDR2, EPH receptor family, FGFR family, VEGFR family, IGF1R, LTK, PDGFR family, RET, KIT, KRAS, NTRK1 및 NTRK2으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 단백질.
청구항 3에 있어서, 상기 항원결합부위는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 단백질.
청구항 3에 있어서, 상기 질환 항원 에피토프는 gp100, MART-1, Melna-A, MAGE-A3, MAGE-C2, Mammaglobin-A, proteinsase-3, mucin-1, HPV E6, LMP2, PSMA, GD2, hTERT, PAP, ERG, NA17, ALK, GM3, EPhA2, NA17-A, TRP-1, TRP-2, NY-ESO-1, CEA, CA 125, AFP, Survivin, AH1, ras, G17DT, MUC1, Her-2/neu, E75, p53, PSA, HCG, PRAME, WT1, URLC10, VEGFR1, VEGFR2, E7, Tyrosinase 펩타이드, B16F10, EL4, 신생항원(neoantigen) 및 GV1001로 이루어진 군에서 선택되는 것인 단백질.
청구항 1에 있어서, 상기 외래 펩타이드는 페리틴 단량체의 인접한 α-헬릭스들 사이 중 적어도 하나에 융합되는 단백질.
청구항 1에 있어서, 상기 외래 펩타이드는 페리틴 단량체의 N-말단 또는 C-말단에 융합되는 단백질.
청구항 1에 있어서, 상기 외래 펩타이드는 페리틴 단량체의 A-B루프, B-C루프, C-D루프 또는 D-E루프에 융합된 단백질.
청구항 1에 있어서, 상기 외래 펩타이드는 페리틴 단량체의 N-말단과 A 헬릭스 사이 또는 E 헬릭스와 C-말단 사이에 융합된 단백질.
청구항 1에 있어서, 돌연변이된 상기 페리틴 단백질은 서열번호 1의 서열에서 15번, 16번, 23번, 82번, 84번, 117번, 120번 또는 124번 아미노산이 알라닌, 글라이신, 발린 또는 류신으로 치환된 것인 단백질.
청구항 1에 있어서, 트랜스페린 수용체에 대한 결합력(K)이 다음 수학식 1을 만족하는 단백질:
[수학식 1]
K ≥ 10 nM
(식 중, K [P][T]/[PT]이고, 여기서 [P]는 상기 단백질과 상기 트랜스페린 수용체와의 결합 반응의 평형 상태에서의 상기 단백질의 농도를 나타내고, [T]는 상기 평형 상태에서의 상기 트랜스페린 수용체의 농도를 나타내며, [PT]는 상기 평형 상태에서의 상기 단백질과 상기 트랜스페린 수용체의 복합체의 농도를 나타냄).
청구항 12에 있어서, 상기 트랜스페린 수용체는 인간 트랜스페린 수용체인 단백질.
청구항 1에 있어서, 상기 페리틴은 인간 페리틴 중쇄인 단백질.