CN116568805A - 工程化自然杀伤细胞的增强扩增和细胞毒性及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文公开的若干实施方案涉及用于培养物中NK细胞的增强扩增的方法和组合物。在若干实施方案中，该方法在NK细胞或其他免疫细胞扩增期间的一个或多个时间点利用一种或多种可溶性白细胞介素作为培养基补充物，该扩增采用饲养细胞群。

Description

工程化自然杀伤细胞的增强扩增和细胞毒性及其用途
相关案件
本申请要求于2020年9月2日提交的美国临时专利申请号：63/073,671的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
领域
本文公开的方法和组合物的一些实施方案涉及工程化免疫细胞(如自然杀伤(NK)细胞和/或T细胞)的增强扩增和/或增强细胞毒性。
背景
使用工程化细胞进行细胞免疫疗法容许通过利用免疫系统的各个方面以靶向和破坏患病或受损细胞来治疗癌症或其他疾病。此类疗法需要数量足以达到治疗相关剂量的工程化细胞。
通过引用ASCII文本文件中的材料并入
本申请通过引用并入包含在以下同时提交的ASCII文本文件中的序列表：文件名：NKT064WO_ST25.txt；创建于2021年8月31日，大小为126186字节。
概述
在若干实施方案中，提供了增强用于细胞免疫疗法的免疫细胞的扩增的多种方法。例如，在若干实施方案中，提供了方法，其中将免疫细胞与饲养细胞系在补充有刺激性细胞因子的培养基中重复共培养。在若干实施方案中，在共培养的每次重复开始时引入新鲜的(例如，未使用的)培养基和饲养细胞。在若干实施方案中，每次共培养以特定的待扩增细胞与饲养细胞比率起始。在若干实施方案中，重复共培养导致NK细胞的扩增显著增强(例如，根据若干实施方案，大于1百万倍)。在若干实施方案中，免疫细胞是NK细胞。在若干实施方案中，扩增的NK细胞意料不到地易于进行细胞工程化，如对工程化改造细胞以表达嵌合受体(例如，用于癌症免疫疗法)。在若干实施方案中，与饲养细胞重复共培养的NK细胞(或其他免疫细胞)比未经受多脉冲共培养的NK细胞更稳健地表达此类嵌合受体。此外，在若干实施方案中，工程化NK细胞表现意料不到的增强的细胞毒性。
在若干实施方案中，提供了增强用于免疫疗法的自然杀伤细胞的扩增的方法，其包括在培养基中将自然杀伤(NK)细胞群和第一饲养细胞群共培养第一时间段，其中第一饲养细胞群包含经工程化改造以表达4-1BBL和膜结合白细胞介素-15(mbIL15)的细胞，其中NK细胞群小于饲养细胞群，其中培养基包含白细胞介素2(IL2)、白细胞介素12(IL12)和白细胞介素18(IL18)，其中第一时间段的共培养导致扩增的NK细胞群，随后在第一时间段后从饲养细胞分离至少部分的扩增的NK细胞群，并且在新鲜培养基中将至少部分的扩增的NK细胞群与第二饲养细胞群共培养第二时间段，其中NK细胞群小于饲养细胞群，其中培养基包含白细胞介素2(IL2)、白细胞介素12(IL12)和白细胞介素18(IL18)，并且其中第二时间段的共培养导致进一步扩增的NK细胞群。在若干实施方案中，该方法进一步包括任选地使用包含IL2、IL12和IL18的新鲜培养基重复分离和共培养步骤至少额外一次，从而导致进一步扩增的NK细胞群的额外扩增。
在若干实施方案中，与在不存在重复共培养的情况下用饲养细胞扩增NK细胞相比，扩增的NK细胞与额外的饲养细胞群和新鲜培养基的重复共培养导致增强的NK细胞扩增。
在若干实施方案中，IL2以约10单位/mL至约100单位/mL的浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，IL2以10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100单位/mL的浓度或由上述浓度中任意两个所定义的范围内的任何浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，IL12以约10ng/mL至约100ng/mL的浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，IL12以10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100ng/mL的浓度或由上述浓度中任意两个所定义的范围内的任何浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，IL18以约0.01ng/mL至约30ng/mL的浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，IL18以0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30ng/mL的浓度或由上述浓度中任意两个所定义的范围内的任何浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，第一时间段和第二时间段为约7天。在一些实施方案中，共培养重复至少三次。在一些实施方案中，IL2以约10单位/mL至约100单位/mL的浓度存在于培养基中，IL12以约10ng/mL至约100ng/mL的浓度存在于培养基中，并且IL18以约0.01ng/mL至约30ng/mL的浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，IL2以约10单位/mL至约100单位/mL的浓度存在于培养基中，IL12以约10ng/mL至约100ng/mL的浓度存在于培养基中，并且IL18以约0.01ng/mL至约30ng/mL的浓度存在于培养基中，其中第一时间段和第二时间段为约7天，并且其中共培养重复至少三次。这些以单位/mL表示的IL2的浓度可以根据IL2的WHO国际标准(国家生物标准与控制研究所[NIBSC]86/500)确定。
在若干实施方案中，IL2以约0.575ng/mL至约5.75ng/mL的浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，IL2以约0.5ng/mL至约6ng/mL的浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，IL2以0.5、0.575、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、5.75或6ng/mL或由上述浓度中任意两个所定义的范围内的任何浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，IL12以约10ng/mL至约100ng/mL的浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，IL12以10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100ng/mL的浓度或由上述浓度中任意两个所定义的范围内的任何浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，IL18以约0.01ng/mL至约30ng/mL的浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，IL18以0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30ng/mL的浓度或由上述浓度中任意两个所定义的范围内的任何浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，第一时间段和第二时间段为约7天。在一些实施方案中，共培养重复至少三次。在一些实施方案中，IL2以约0.575ng/mL至约5.75ng/mL(或约0.5ng/mL至约6ng/mL)的浓度存在于培养基中，IL12以约10ng/mL至约100ng/mL的浓度存在于培养基中，并且IL18以约0.01ng/mL至约30ng/mL的浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，IL2以约0.575ng/mL至约5.75ng/mL(或约0.5ng/mL至约6ng/mL)的浓度存在于培养基中，IL12以约10ng/mL至约100ng/mL的浓度存在于培养基中，并且IL18以约0.01ng/mL至约30ng/mL的浓度存在于培养基中，其中第一时间段和第二时间段为约7天，并且其中共培养至少重复3次。
在若干实施方案中，在每次共培养开始时NK细胞群以少于饲养细胞群约5倍至约25倍的量存在。在若干实施方案中，通过荧光激活细胞分选(FACS)从饲养细胞分离扩增的NK细胞。
在若干实施方案中，饲养细胞群包含表达4-1BBL和mbIL15两者的K562细胞。在若干实施方案中，重复共培养增加NK细胞活化标志物的表达。此外，在若干实施方案中，重复共培养增加扩增的NK细胞的细胞毒性和/或持久性。
在若干实施方案中，方法进一步包括使NK细胞与编码嵌合抗原受体(CAR)的载体接触。在若干实施方案中，CAR配置成靶向CD19、CD123、CD70、BCMA或自然杀伤受体D组(NKG2D)的配体中的一种或多种。
在一些实施方案中，IL2以小于约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100单位/mL的浓度或由上述浓度中任意两个所定义的范围内的任何浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，IL2以小于约50单位/mL的浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，IL12以小于约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100ng/mL的浓度或由上述浓度中任意两个所定义的范围内的任何浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，IL12以小于约30ng/mL的浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，IL18以小于约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50ng/mL的浓度或由上述浓度中任意两个所定义的范围内的任何浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，IL18以小于约10ng/mL的浓度存在于培养基中。在若干实施方案中，IL2以小于约50单位/mL的浓度存在于培养基中，IL12以小于约30ng/mL的浓度存在于培养基中，并且IL18以小于约10ng/mL的浓度存在于培养基中。
在一些实施方案中，IL2以小于约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mL的浓度或由上述浓度中任意两个所定义的范围内的任何浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，IL2以小于约6ng/mL的浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，IL12以小于约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100ng/mL的浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，IL12以小于约30ng/mL的浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，IL18以小于约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50ng/mL的浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，IL18以小于约10ng/mL的浓度存在于培养基中。在若干实施方案中，IL2以小于约6ng/mL的浓度存在于培养基中，IL12以小于约30ng/mL的浓度存在于培养基中，并且IL18以小于约10ng/mL的浓度存在于培养基中。
在若干实施方案中，IL2以约20单位/mL至约50单位/mL的浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，IL2以约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50单位/mL的浓度或由上述浓度中任意两个所定义的范围内的任何浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，IL12以介于约15ng/mL至约30ng/mL的浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，IL12以15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30ng/mL的浓度或由上述浓度中任意两个所定义的范围内的任何浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，IL18以小于约5ng/mL的浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，IL18以小于0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、1、2、3、4或5ng/mL的浓度或由上述浓度中任意两个所定义的范围内的任何浓度存在于培养基中。在若干实施方案中，IL2以约20单位/mL至约50单位/mL的浓度存在于培养基中，其中IL12以约15ng/mL至约30ng/mL的浓度存在于培养基中，并且其中IL18以小于约5ng/mL的浓度存在于培养基中。
在若干实施方案中，IL2以约1.15ng/mL至约2.875单位/mL的浓度存在于培养基中。在若干实施方案中，IL2以约1ng/mL至约3单位/mL的浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，IL2以约1、1.15、1.5、2、2.5、2.875或3ng/mL的浓度或由上述浓度中任意两个所定义的范围内的任何浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，IL12以约15ng/mL至约30ng/mL的浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，IL12以15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30ng/mL的浓度或由上述浓度中任意两个所定义的范围内的任何浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，IL18以小于约5ng/mL的浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，IL18以小于0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、1、2、3、4或5ng/mL的浓度或由上述浓度中任意两个所定义的范围内的任何浓度存在于培养基中。在若干实施方案中，IL2以约1.15ng/mL至约2.875ng/mL的浓度存在于培养基中，其中IL12以约15ng/mL至约30ng/mL的浓度存在于培养基中，并且其中IL18以小于约5ng/mL的浓度存在于培养基中。在若干实施方案中，IL2以约1ng/mL至约3ng/mL的浓度存在于培养基中，其中IL12以约15ng/mL至约30ng/mL的浓度存在于培养基中，并且其中IL18以小于约5ng/mL的浓度存在于培养基中。
本文还提供了通过本文公开的方法扩增的NK细胞在制备用于治疗癌症的药物中的用途。本文还提供了通过本文公开的方法扩增的NK细胞用于治疗癌症的用途。
在若干实施方案中，本文提供了工程化自然杀伤细胞群，其包含工程化嵌合受体，该工程化嵌合受体配置成结合靶癌细胞上的标志物，并且在结合后诱导NK细胞发挥针对靶癌细胞的细胞毒性作用，其中NK细胞通过在含有白细胞介素2(IL2)、白细胞介素12(IL12)和白细胞介素18(IL18)的培养基中将起始自然杀伤(NK)细胞群与第一饲养细胞群共培养第一次而扩增，其中第一饲养细胞群包含经工程化改造以表达4-1BBL和膜结合白细胞介素-15(mbIL15)的细胞，其中起始NK细胞群小于饲养细胞群，其中第一共培养导致中间扩增的NK细胞群，在第一次共培养后，从饲养细胞分离至少部分的中间扩增的NK细胞群，在新鲜培养基中将至少部分的中间扩增的NK细胞群与第二饲养细胞群共培养至少第二次，其中与第二饲养细胞群共培养的部分的NK细胞群小于第二饲养细胞群，并且其中至少第二共培养导致进一步扩增的NK细胞群。
在若干实施方案中，工程化嵌合受体由与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27在序列上至少95％相同的序列编码。在若干实施方案中，工程化嵌合受体具有与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26或28在序列上至少95％相同的氨基酸序列。
本文还提供了本文公开的工程化NK细胞在制备用于治疗癌症的药物的用途和/或用于治疗癌症的用途。
还提供了治疗有此需要的受试者的癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文公开的工程化NK。
附图简述
以下附图描述涉及代表本文公开的本发明的非限制性实施方案的实验和结果。
图1A和1B描绘了根据本文公开的实施方案用于增强NK细胞扩增的扩增方案的非限制性示例。
图2描绘了比较NK细胞的倍数扩增的数据，其使用各种扩增方法，包括本文公开的那些的非限制性实施方案。
图3A-3B描绘了涉及来自四个不同供体NK细胞在各种条件下扩增的数据。图3A显示了测量在用单独的饲养细胞(顶行)或使用细胞因子补充(底行)扩增时NKG2D在NK细胞表面的表达的流式细胞术数据。图3B测量了在各种条件下的平均荧光强度(代表使用携带NKG2D的嵌合受体构建体(NKX101)的转导)。
图4显示了涉及在使用单独的饲养细胞或具有细胞因子补充的条件下扩增后各个时间点处NK细胞细胞毒性的数据。
图5A-5B描绘了涉及指示NK细胞的记忆表型的某些标志物的表达的数据。
图6显示了涉及在扩增期间在有或没有指示的细胞因子刺激的情况下扩增的NK细胞的抗肿瘤活性的体内数据。
图7A-7B涉及各种条件下的NK细胞扩增。图7A显示了确定为过饱和、饱和或亚饱和的IL12/18的各种浓度。图7B显示了各种培养条件下的NK细胞增殖数据。
图8显示了涉及在培养基中用不同浓度的IL12和/或IL18培养的NK细胞的干扰素γ释放的数据。
图9A-9H涉及在指示条件下培养7天后NK细胞扩增的评估。图9A显示了每个培养组的汇总数据。图9B提供了各组的统计学比较。图9C显示了特定滴定数据集的倍数扩增数据(第7天)，该数据集涉及各种浓度的IL12与4ng/mL的IL18。图9D显示了20ng/mL的IL18的类似数据。图9E显示了用20ng/mL IL18、40IU/mL IL2和指示浓度的IL12培养的第7天工程化NK细胞的存活力。图9F显示了用20ng/mL IL18、400IU/mL IL2和指示浓度的IL12培养的第8天工程化NK细胞的存活力。图9G显示了用4ng/mL IL18、40IU/mL IL2和指示浓度的IL12培养的第7天工程化NK细胞的存活力。图9H显示了用4ng/mL IL18、400IU/mL IL2和指示浓度的IL12培养的第8天工程化NK细胞的存活力。
图10A-10B涉及NK细胞细胞毒性的评估。图10A显示了培养8天后每个培养组中NK细胞的细胞毒性的汇总数据。图10B提供了细胞毒性的统计学比较。
图11A-11B涉及NK细胞细胞毒性的评估。图11A显示了培养15天后每个培养组中NK细胞的细胞毒性的汇总数据。图11B提供了细胞毒性的统计学比较。
图12显示了来自两个供体的用嵌合受体构建体转导并在各种条件下培养的NK细胞的表达数据。
图13显示了来自另外两个供体的用嵌合受体构建体转导并在各种条件下培养的NK细胞的表达数据。
图14A-14B显示了细胞毒性数据。图14A显示了涉及用靶向NKG2D配体的嵌合受体转导并在指示条件下培养的NK细胞的细胞毒性的汇总数据。图14B显示了这些组的统计学比较。
图15A-15D涉及在指示条件下培养后用靶向NKG2D的嵌合受体转导的NK细胞的细胞毒性作用。图15A和15B显示关于来自两个不同供体的NK细胞在用编码GFP的载体或编码靶向NKG2D配体的嵌合受体的载体转导后13天的细胞毒性数据。图15C和15D显示了在转导后第21天来自相同两个供体的相应细胞毒性数据。
图16A-16B显示了涉及NK细胞表型的数据。图16A显示了涉及在指示培养条件下由NK细胞的与记忆样表型相关联的标志物的表达随时间变化的数据。图16B显示了流式细胞术数据，其显示了培养物中标志物表达随时间的进展。
图17A-17D显示了涉及在多种培养条件下NK细胞选择标志物的汇总表达数据。图17A显示了涉及CD62配体的表达数据，图17B显示了NKG2C的表达，图17C显示了CD57的表达，以及图17D显示了CD62L和NKG2C的表达。
图18显示了在转导后第21天表达GFP和或NKG2D-配体定向嵌合受体的NK细胞的细胞毒性数据。
图19显示了在不同培养条件下生长的NK细胞的细胞存活力和扩增数据。
图20显示了用抗CD19 CAR转导并使用指示条件培养的NK细胞的表达数据(基于Flag标签)。该数据是在扩增的第15天收集的。
图21显示了用抗CD19 CAR转导并使用指示条件培养的NK细胞的表达数据(基于Flag标签)。该数据是在扩增的第22天收集的。
图22A-22C显示了涉及表达抗CD19 CAR的NK细胞的细胞毒性的数据。使用指示条件扩增NK细胞，并使用图22A中的指示E:T比用Nalm6细胞进行攻击(3个供体的平均值)。图22B显示了汇总细胞毒性数据。图22C显示了作为效应物与靶标比率的函数的细胞毒性数据。
图23显示了评估在肝细胞癌异种移植模型中表达靶向NKG2D配体的嵌合受体的NK细胞的细胞毒性的实验设置的示意图。
图24显示了在指示处理下小鼠中肿瘤负荷随时间变化的汇总。
图25显示了评估扩增培养条件对体内NK细胞细胞毒性的影响的示意性实验设置。
图26A-26F显示了细胞毒性、生存数据、涉及NK细胞持久性的数据以及涉及新鲜或冷冻保存NK细胞中的CAR表达的数据。图26A显示了涉及在指示条件下扩增的NK细胞针对异种移植模型中Nalm6细胞的细胞毒性的数据。图26B显示了接受指示处理的小鼠的生存曲线。图26C显示了涉及基于扩增培养条件分离的注射后18天鼠血液中的人NK细胞的检测的数据。图26D显示了涉及基于扩增培养条件分离的注射后18天鼠血液中的CAR阳性NK细胞的检测的数据。图26E显示了涉及在扩增第15天以及存在或不存在额外的刺激分子的情况下表达抗CD19 CAR的非限制性实施方案的NK细胞(新鲜的或冷冻保存的)的百分比的表达数据。图26F显示了涉及在扩增第22天以及存在或不存在额外的刺激分子的情况下表达抗CD19CAR的非限制性实施方案的NK细胞(新鲜的或冷冻保存的)的百分比的表达数据。
图27A-27C涉及根据本文公开的实施方案的各种CD19定向CAR的体内功效。图27A显示了用于体内评估人源化的表达各种CD19定向CAR构建体的NK细胞的有效性的实验方案的示意性描绘。所测试的各个实验组如所指示。根据本文公开的实施方案，对于具有“IL12/IL18”名称的细胞，该细胞在可溶性IL12和/或IL18存在下扩增。图27B和27C显示了来自用Nalm6肿瘤细胞给药并用指示构建体处理的动物的生物发光数据。
图28A-28J显示了来自图27B-27C的生物发光数据的图形描绘。图28A显示了来自接受未转导NK细胞的动物的生物发光(作为光子/秒通量)。图28B显示了在接受作为媒介物的PBS的动物中测量的通量。图28C显示了在接受先前冰冻的表达NK19 NF2 CAR(作为CAR的非限制性示例)的NK细胞的动物中测量的通量。图28D显示了在接受使用IL12和/或IL18扩增的先前冰冻的表达NK19 NF2 CAR(作为CAR的非限制性示例)的NK细胞的动物中测量的通量，该NK细胞。图28E和图28F显示了在接受新鲜的表达NK19 NF2 CAR(作为CAR的非限制性示例)的NK细胞的动物中测量的通量。图28G和图28H显示了在接受使用IL12和/或IL18扩增的先前新鲜的表达NK19 NF2 CAR(作为CAR的非限制性示例)的NK细胞的动物中测量的通量。图28I显示了描绘在肿瘤接种后的前30天内在各个组中测量的生物发光的线状图。图28J显示了描绘在肿瘤接种后的前56天内在各个组中测量的生物发光的线状图。
图29显示了涉及在接受指示疗法时小鼠体重随时间变化的数据。
图30A-30C显示了涉及表征经工程化改造以表达CAR(如本文所公开的)并且在存在或不存在一种或多种刺激性细胞因子的情况下扩增的NK细胞的数据的数据。图30A显示了涉及动物血液中表达CAR的NK细胞的百分比随时间变化的数据。图30B显示了涉及50天的时段内动物血液中表达CAR的NK细胞的百分比的数据。图30C显示了涉及表达CAR的NK细胞的百分比随时间变化并且基于所测试的活细胞数量的数据。
图31A-31C显示了来自三只不同小鼠(分别为31A、31B和31C)的数据，这些数据涉及抗CD19 CAR的表达以及哪些细胞表达CAR的表征。
图32A-32C显示了来自三只不同小鼠(分别为32A、32B和32C)的数据，这些数据涉及抗CD19 CAR的表达以及哪些细胞表达CAR的表征。
图33A-33C显示了来自体内施用(图27A的方案)后4天收集的血液样品的汇总表达数据。图33A显示了指示实验组的全血样品中CD3-CD56+NK细胞的百分比。图33B显示了每个实验组的表达特定抗CD19 CAR的NK细胞的百分比。图33C显示了涉及每个实验组检测到的GFP阳性肿瘤细胞的数量的数据。
图34A-34C显示了来自体内施用(图27A的方案)后12天收集的血液样品的汇总表达数据。图34A显示了指示实验组的全血样品中CD3-CD56+NK细胞的百分比。图34B显示了每个实验组的表达特定抗CD19 CAR的NK细胞的百分比。图34C显示了涉及每个实验组检测到的GFP阳性肿瘤细胞的数量的数据。
图35A-35E显示了来自体内施用(图27A的方案)后18天收集的血液样品的汇总表达数据。图35A显示了指示实验组的全血样品中CD3-CD56+NK细胞的百分比。图35B显示了如使用藻红蛋白(PE)缀合抗体测量的每个实验组的CD19阳性肿瘤细胞的百分比。图35C显示了涉及每个实验组检测到的GFP阳性肿瘤细胞的数量的数据。图35D显示了如使用抗CD19FC抗体测量的每个实验组的表达特定抗CD19 CAR的NK细胞的百分比。图35E显示了每个处理组中表达CD19 CAR的NK细胞的百分比。
图36显示了对于两种剂量的NK细胞中的每一种，在4周内收集的涉及表达抗CD19CAR的NK细胞的半衰期的数据，如通过每10,000个白细胞的NK细胞计数所测量的。这两种剂量是(i)2百万个表达抗CD19 CAR的NK细胞和(ii)5百万个表达抗CD19 CAR的NK细胞。这些数据是在施用第三剂NK细胞后收集的。
图37显示了为冷冻保存的经工程化改造以表达靶向NKG2D配体的CAR并在不使用额外的刺激性细胞因子的情况下扩增的NK细胞的半衰期收集的数据。
图38A-38D显示了各种靶向CD19的CAR(或未转导的NK细胞)针对肿瘤细胞系的比较性剂量响应细胞毒性数据。图38A显示了24小时后针对表达高CD19的Nalm6肿瘤细胞的细胞毒性。图38B显示72小时后针对Nalm6的细胞毒性。图38C显示了24小时后针对Reh肿瘤细胞的细胞毒性，该肿瘤细胞表现出比Nalm6细胞更低的CD19水平。图38D显示了72小时后针对Reh细胞的细胞毒性。
图39A-39B显示了涉及存在和不存在地塞米松的情况下，NK细胞(39A)或表达CD19-CAR的非限制性实施方案的NK细胞(39A)的细胞毒性的数据。
图40A-40B显示了涉及在动物血流中表达CAR的NK(显示的数据是CAR的非限制性实施方案，此处是靶向CD19的CAR)细胞的寿命(例如，半衰期)随时间变化的数据(40A和40B之间的标尺不同)。
图41A-41B涉及随时间变化的NK细胞扩增数据，其中从脐带血(CB)或外周血(PB)获得的NK细胞在扩增过程期间的多个时间点以1:10的比率用饲养细胞进行脉冲，同时用IL2补充培养基。图41A显示了NK细胞的扩增随时间变化的线状图。图41B显示了汇总扩增数据。
图42A-42B涉及随时间变化的NK细胞扩增数据，其中从脐带血(CB)或外周血(PB)获得的NK细胞在扩增过程期间的多个时间点以1:10的比率用饲养细胞进行脉冲，同时用IL2和IL12两者补充培养基。图42A显示了NK细胞的扩增随时间变化的线状图。图42B显示了汇总扩增数据。
图43A-43B涉及随时间变化的NK细胞扩增数据，其中从脐带血(CB)或外周血(PB)获得的NK细胞在扩增过程期间的多个时间点以1:10的比率用饲养细胞进行脉冲，同时用IL2和IL18两者补充培养基。图43A显示了NK细胞的扩增随时间变化的线状图。图43B显示了汇总扩增数据。
图44A-44B涉及随时间变化的NK细胞扩增数据，其中从脐带血(CB)或外周血(PB)获得的NK细胞在扩增过程期间的多个时间点以1:10的比率用饲养细胞进行脉冲，同时用IL2以及IL12和IL18的组合两者补充培养基。图44A显示了NK细胞的扩增随时间变化的线状图。图44B显示了汇总扩增数据。
图45A-45E涉及作为饲养细胞多次脉冲以及用于补充培养基的指示细胞因子条件的结果的CD3阳性细胞的扩增。图中的星号指示何时用新鲜培养基(包括补充培养基组分，如果指示的话)将NK细胞重新铺板到新鲜饲养细胞上。图45A显示了使用高浓度IL2(400单位/mL)补充培养基时的数据。图45B显示了涉及用IL12(以及40单位/mL IL2)补充培养基的数据。图45C显示了涉及用IL18(以及40单位/mL IL2)补充培养基的数据。图45D显示了涉及用IL12和IL18两者(以及40单位/mL IL2)补充培养基的数据。图45E显示了涉及对照扩增(用新的饲养细胞和40单位/mL IL2脉冲，但没有额外的细胞因子)的数据。
图46A-46J涉及活化NKG2C受体的表达。图中的星号指示何时用新鲜培养基(包括补充培养基组分，如果指示的话)将NK细胞重新铺板到新鲜饲养细胞上。图46A显示了当使用高浓度IL2(400单位/mL)补充培养基时的数据，数据呈现为对NKG2C表达呈阳性的NK细胞的百分比。图46B显示了当使用高浓度IL2(400单位/mL)补充培养基时的数据，数据呈现为总体平均荧光强度(MFI)以代表NKG2C表达。图46C显示了涉及用IL12(以及40单位/mL IL2)补充培养基的数据，数据呈现为对NKG2C表达呈阳性的NK细胞的百分比。图46D显示了涉及用IL12(以及40单位/mL IL2)补充培养基的数据，数据呈现为总体MFI以代表NKG2C表达。图46E显示了涉及用IL18(以及40单位/mL IL2)补充培养基的数据，数据呈现为对NKG2C表达呈阳性的NK细胞的百分比。图46F显示了涉及用IL18(以及40单位/mL IL2)补充培养基的数据，数据呈现为总体MFI以代表NKG2C表达。图46G显示了涉及用IL12和IL18两者(以及40单位/mL IL2)补充培养基的数据，数据呈现为对NKG2C表达呈阳性的NK细胞的百分比。图46H显示了涉及用IL12和IL18两者(以及40单位/mL IL2)补充培养基的数据，数据呈现为总体MFI以代表NKG2C表达。图45I显示了涉及对照扩增(用新的饲养细胞和40单位/mL IL2脉冲，但没有额外的细胞因子)的数据，数据呈现为对NKG2C表达呈阳性的NK细胞的百分比。图45J显示了涉及对照扩增(用新的饲养细胞和40单位/mL IL2脉冲，但没有额外的细胞因子)的数据，数据呈现为总体MFI以代表NKG2C表达。
图47A-47B显示了与在第0天用单个饲养物刺激(“SOP”)的扩增方法相比，在第0天和第7天用两个饲养物脉冲(“2X”)或在第0天、第7天和第14天用三个饲养物脉冲(“3X”)扩增的NK细胞上活化(47A)和抑制(47B)标志物的增加。“纯NK”是其中与饲养细胞一起培养的初始细胞群经过纯化的组。“PBM”是其中与饲养细胞一起培养的初始细胞群是外周血单核细胞而不是纯化的NK细胞的组。
图48A-48B涉及在第0天(圆圈)或第7天(正方形)时活化(48A)或抑制(48B)标志物的表达的额外评估。
发明详述
虽然癌症免疫疗法或其他疾病的细胞疗法在工程化改造细胞以表达感兴趣的构建体的能力方面取得了很大进步，但仍然需要临床相关数量的这些细胞用于患者施用。当待工程化改造和随后待施用的潜在天然免疫细胞没有其他免疫细胞类型普遍时，这一点尤为重要。这需要从大量的起始材料开始(这可能不切实际)，或者开发更有效的方法和组合物来扩增(在某些情况下优选)感兴趣的免疫细胞，如NK细胞。因此，在若干实施方案中，本文提供了有利地容许增强NK细胞(或其他免疫细胞)的扩增但还容许增强那些细胞的细胞毒性的方法和组合物。
在若干实施方案中，提供了扩增和活化的NK细胞群，这些NK细胞衍生自将本文公开的经修饰的“饲养”细胞与起始免疫细胞群共培养，并在扩增期间的某些时间点用各种细胞因子补充共培养物。
用于免疫细胞扩增的细胞
在若干实施方案中，细胞系用于与待扩增的免疫细胞群的共培养。此类细胞系在本文中称为“刺激细胞”，也可以称为“饲养细胞”。在若干实施方案中，整个免疫细胞群将被扩增，而在若干实施方案中，选定的免疫细胞亚群将被扩增。例如，在若干实施方案中，NK细胞相对于其他免疫细胞亚群(如T细胞)扩增。在其他实施方案中，NK细胞和T细胞均被扩增。在若干实施方案中，饲养细胞本身是遗传修饰的。在一些实施方案中，饲养细胞不表达对NK细胞具有抑制作用的MHC I分子。在一些实施方案中，饲养细胞不需要完全缺乏MHC I表达，然而它们可以以低于野生型细胞的水平表达MHC I分子。例如，在若干实施方案中，如果野生型细胞以X水平表达MHC，则所使用的细胞系可以以低于X的95％、低于X的90％、低于X的85％、低于X的80％、低于X的70％、低于X的50％、低于X的25％的水平以及介于(和包括)列出的那些之间的任何表达水平表达MHC。在若干实施方案中，刺激细胞是永生化的，例如癌细胞系。然而，在若干实施方案中，刺激细胞是原代细胞。
取决于实施方案，各种细胞类型可以用作饲养细胞。这些包括但不限于K562细胞、某些Wilms肿瘤细胞系(例如Wilms肿瘤细胞系HFWT)、子宫内膜肿瘤细胞(例如HHUA)、黑色素瘤细胞(例如HMV-II)、肝母细胞瘤细胞(例如HuH-6)，肺小细胞癌细胞(例如Lu-130和Lu-134-A)、神经母细胞瘤细胞(例如NB19和NB69)、胚胎癌睾丸细胞(例如NEC14)、宫颈癌细胞(TCO-2)、神经母细胞瘤细胞(例如TNB1)、721.221EBV转化的B细胞系等。
在另外的实施方案中，饲养细胞也具有降低的(或缺乏)MHC II表达，以及具有降低的(或缺乏)MHC I表达。在一些实施方案中，可以使用最初可以表达MHC I类分子的其他细胞系，连同那些细胞的遗传修饰以减少或敲除MHC I表达。遗传修饰可以通过使用基因编辑技术(例如CRISPR/Cas系统；使用作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)进行的RNA编辑、锌指、TALENS等)、抑制性RNA(例如siRNA)或其他分子方法来破坏和/或减少MHC I分子在细胞表面的表达来完成。
如下文更详细地讨论，在若干实施方案中，饲养细胞经工程化改造以表达某些刺激分子(例如白细胞介素、CD3、4-1BBL等)以促进免疫细胞扩增和激活。工程化饲养细胞公开于例如国际专利申请PCT/SG2018/050138中，其通过引用整体并入本文。在若干实施方案中，例如在规定的时间和以特定的量将刺激分子(如白细胞介素12、18和/或21)分别添加到共培养培养基中，以实现期望的免疫细胞亚群的增强扩增。
刺激分子
如上文简要讨论的，某些分子促进免疫细胞的扩增，如NK细胞或T细胞，包括工程化的NK或T细胞。取决于实施方案，可以在用于扩增免疫群的饲养细胞的表面上表达一种或多种刺激分子。例如，在若干实施方案中，K562饲养细胞群经工程化改造以表达4-1BBL和/或膜结合白细胞介素15(mbIL15)。另外的实施方案涉及另外的膜结合白细胞介素或刺激剂。此类另外的膜结合刺激分子的示例可以在国际专利申请PCT/SG2018/050138中找到，其通过引用整体并入本文。
在若干实施方案中，本文公开的方法涉及向培养基中添加一种或多种刺激分子，在该培养基中共培养工程化饲养细胞和工程化NK细胞。在若干实施方案中，添加了一种或多种白细胞介素。例如，在若干实施方案中，将IL2添加到培养基中。在若干实施方案中，将IL12添加到培养基中。在若干实施方案中，将IL18添加到培养基中。在若干实施方案中，将IL21添加到培养基中。在若干实施方案中，将IL2、IL12、IL18和/或IL21中的两种或更多种的组合添加到培养基中。在一些实施方案中，不是使用具有mbIL15的饲养细胞，而是将可溶性IL15添加到培养基中(单独或与IL2、IL12、IL18和IL21中的任一种组合)。
在若干实施方案中，培养基包含一种或多种维生素、无机盐和/或氨基酸。在若干实施方案中，培养基包含甘氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-胱氨酸(例如L-胱氨酸2HCl)、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸、L-羟脯氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸(例如L-酪氨酸二钠盐脱水物)和L-缬氨酸中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或全部。在若干实施方案中，培养基包含生物素、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、i-肌醇、烟酰胺、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺素和维生素B12中的1、2、3、4或更多种。在若干实施方案中，培养基包含硝酸钙(Ca(NO3)2·4H2O)、硫酸镁(MgSO4)(例如，硫酸镁(MgSO4)(无水))、氯化钾(KCl)、碳酸氢钠(NaHCO3)、氯化钠(NaCl)和磷酸氢二钠(Na2HPO4)(例如无水磷酸氢二钠(Na2HPO4))中的1、2、3、4或更多种。
在若干实施方案中，培养基进一步包含D-葡萄糖和/或谷胱甘肽(任选还原型谷胱甘肽)。在若干实施方案中，培养基进一步包含量在约1％至约20％范围内的血清(例如，胎牛血清)。在若干实施方案中，血清是热灭活的。在若干实施方案中，培养基是无血清的。在若干实施方案中，培养基是无异种的(xenofree)。
取决于实施方案，IL2用于补充培养基并增强NK细胞的扩增或其他特性。在若干实施方案中，使用的IL2的浓度范围为约1IU/mL至约1000IU/mL，包括例如约1IU/mL至约5IU/mL(例如，1、2、3、4和5)、约5IU/mL至约10IU/mL(例如，5、6、7、8、9和10)，约10IU/mL至约20IU/mL(例如，约10、12、14、16、18和20)、约20IU/mL至约30IU/mL(例如，约20、22、24、26、28和30)、约30IU/mL至约40IU/mL(例如，30、32、34、36、38和40)、约40至约50IU/mL(例如，40、42、44、46、48、50)、约50IU/mL至约75IU/mL(例如，50、55、60、65、70和75)、约75IU/mL至约100IU/mL(例如，75、80、85、90、95和100)、约100IU/mL至约200IU/mL(例如，100、125、150、275和200)、约200IU/mL至约300IU/mL(例如，200、225、250、275和300)、约300IU/mL至约400IU/mL(例如，300、325、350、375和400)、约400IU/mL至约500IU/mL(例如，400、425、450、475和500)、约500IU/mL至约750IU/mL(例如，500、550、600、650、700和750)、或约750IU/mL至约1000IU/mL(例如，750、800、850、900、950和1000)以及其间的任何浓度，包括端点。在若干实施方案中，可以在培养期间的多个时间点添加IL2。在一些此类实施方案中，所使用的IL2的浓度可以在所选时间点之间不同。
如本文所用和本领域通常理解的，术语“单位”和“国际单位(IU)”是指通过测量活性，如生物活性确定的物质、分子或化合物的标准化量或量度。出于本公开的目的，术语“单位”和“IU”可以互换。正如普遍理解的那样，与其他传统的量化模式(如质量或体积)相比，单位或IU的测量可能有利也可能不利，因为它能够实现相同物质的相关性，例如不同的制造过程或批次。如本文所用应用于IL2，IL2的单位或IU的定义根据NIBSC代码86/500下的IL2的WHO国际标准进行标准化。技术人员将会理解，通过测量单位/mL或IU/mL所公开的IL2浓度应该是可转移的，无需过度实验，无论使用的IL2来源如何，只要它是根据NIBSC标准制造的。
出于本文公开的目的，使用的IL2具有对应于2.3ng/mL的40IU/mL的浓度(即1IU/mL对应于57.5pg/mL)。相应地，任何以IU/mL或单位/mL表示的IL2浓度都可以根据该等价性根据它们的质量浓度来解释。应当理解，如果使用替代物，本领域技术人员将能够确定它们相应的以IU/mL测量的IL2产品的质量浓度当量。
取决于实施方案，IL2用于补充培养基并增强NK细胞的扩增或其他特性。在若干实施方案中，使用的IL2的浓度范围为57.5pg/mL至约57.5ng/mL(或55pg/mL至约60ng/mL)，包括例如约55pg/mL至约500pg/mL(例如，55、60、100、200、300、400、500pg/mL)、约500pg/mL至约1000pg/mL(例如，500、600、700、800、900、1000pg/mL)、约1ng/mL至约10ng/mL(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10ng/mL)、或约10ng/mL至约60ng/mL(例如，10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60ng/mL)以及其间的任何浓度，包括端点。在若干实施方案中，可以在培养期间的多个时间点添加IL2。在一些此类实施方案中，所使用的IL2的浓度可以在所选时间点之间不同。
取决于实施方案，IL12A和/或IL12B用于补充培养基并增强NK细胞的扩增或其他特性。在若干实施方案中，使用的IL12(IL12A或IL12B)的浓度范围为约0.01ng/mL至约100ng/mL，包括例如约0.01ng/mL至约0.05ng/mL(例如，0.01、0.02、0.03、0.04和0.05)、约0.05ng/mL至约0.1ng/mL(例如，0.05、0.06、0.07、0.08、0.09和0.1)、约0.1ng/mL至约0.5ng/mL(例如，0.1、0.2、0.3、0.4和0.5)、约0.5ng/mL至约1.0ng/mL(例如，0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0)、约1.0ng/mL至约2.0ng/mL(例如，1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9和2.0)、约2.0ng/mL至约5.0ng/mL(例如，2.0、3.0、4.0和5.0)、约5.0ng/mL至约10.0ng/mL(例如，5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0)、约10.0ng/mL至约15.0ng/mL(例如，10.0、11.0、12.0、13.0、14.0和15.0)、约15.0ng/mL至约20.0ng/mL(例如，15.0、16.0、17.0、18.0、19.0和20.0)、约20.0ng/mL至约25.0ng/mL(例如，20.0、21.0、22.0、23.0、24.0和25.0)、约25.0ng/mL至约30.0ng/mL(例如，25.0、26.0、27.0、28.0、29.0和30.0)、约30.0ng/mL至约50.0ng/mL(例如，30.0、35.0、40.0、45.0和50.0)、约50.0ng/mL至约75.0ng/mL(例如，50.0、55.0、60.0、65.0、70.0和75.0)、约75.0ng/mL至约100.0ng/mL(例如，75.0、80.0、85.0、90.0、95.0和100.0)以及其间的任何浓度，包括端点。在若干实施方案中，IL12的浓度为约0.01ng/mL至约8ng/mL，包括其间的任何浓度，包括端点。
在一些实施方案中，使用IL12A和IL12B的混合物。在若干实施方案中，使用特定比率的IL12A:IL12B，例如1:10、1:50、1:100、1:150、1:200、1:250、1:500、1:1000、1:10,000、10,000:1、1000:1、500:1、250:1、150:1、100:1、10:1及其间的任何比率，包括端点。
在一些实施方案中，白细胞介素18(IL18)用于增强NK细胞的扩增或其他特性。在若干实施方案中，使用的IL18浓度范围为约0.01ng/mL至约100ng/mL，包括例如约0.01ng/mL至约0.05ng/mL(例如，0.01、0.02、0.03、0.04和0.05)、约0.05ng/mL至约0.1ng/mL(例如，0.05、0.06、0.07、0.08、0.09和0.1)、约0.1ng/mL至约0.5ng/mL(例如，0.1、0.2、0.3、0.4和0.5)、约0.5ng/mL至约1.0ng/mL(例如，0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0)、约1.0ng/mL至约2.0ng/mL(例如，1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9和2.0)、约2.0ng/mL至约5.0ng/mL(例如，2.0、3.0、4.0和5.0)、约5.0ng/mL至约10.0ng/mL(例如，5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0)、约10.0ng/mL至约15.0ng/mL(例如，10.0、11.0、12.0、13.0、14.0和15.0)、约15.0ng/mL至约20.0ng/mL(例如，15.0、16.0、17.0、18.0、19.0和20.0)、约20.0ng/mL至约25.0ng/mL(例如，20.0、21.0、22.0、23.0、24.0和25.0)、约25.0ng/mL至约30.0ng/mL(例如，25.0、26.0、27.0、28.0、29.0和30.0)、约30.0ng/mL至约50.0ng/mL(例如，30.0、35.0、40.0、45.0和50.0)、约50.0ng/mL至约75.0ng/mL(例如，50.0、55.0、60.0、65.0、70.0和75.0)、约75.0ng/mL至约100.0ng/mL(例如，75.0、80.0、85.0、90.0、95.0和100.0)以及其间的任何浓度，包括端点。
在一些实施方案中，白细胞介素21(IL21)用于增强NK细胞的扩增或其他特征。在若干实施方案中，使用的IL21浓度范围为约0.01ng/mL至约100ng/mL，包括例如约0.01ng/mL至约0.05ng/mL(例如，0.01、0.02、0.03、0.04和0.05)、约0.05ng/mL至约0.1ng/mL(例如，0.05、0.06、0.07、0.08、0.09和0.1)、约0.1ng/mL至约0.5ng/mL(例如，0.1、0.2、0.3、0.4和0.5)、约0.5ng/mL至约1.0ng/mL(例如，0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0)、约1.0ng/mL至约2.0ng/mL(例如，1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9和2.0)、约2.0ng/mL至约5.0ng/mL(例如，2.0、3.0、4.0和5.0)、约5.0ng/mL至约10.0ng/mL(例如，5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0)、约10.0ng/mL至约15.0ng/mL(例如，10.0、11.0、12.0、13.0、14.0和15.0)、约15.0ng/mL至约20.0ng/mL(例如，15.0、16.0、17.0、18.0、19.0和20.0)、约20.0ng/mL至约25.0ng/mL(例如，20.0、21.0、22.0、23.0、24.0和25.0)、约25.0ng/mL至约30.0ng/mL(例如，25.0、26.0、27.0、28.0、29.0和30.0)、约30.0ng/mL至约50.0ng/mL(例如，30.0、35.0、40.0、45.0和50.0)、约50.0ng/mL至约75.0ng/mL(例如，50.0、55.0、60.0、65.0、70.0和75.0)、约75.0ng/mL至约100.0ng/mL(例如，75.0、80.0、85.0、90.0、95.0和100.0)以及其间的任何浓度，包括端点。
在一些实施方案中，白细胞介素15(IL15)以可溶形式使用(代替或补充饲养细胞上的mbIL15)以增强NK细胞的扩增或其他特征。在若干实施方案中，使用的IL15浓度范围为约0.01ng/mL至约100ng/mL，包括例如约0.01ng/mL至约0.05ng/mL(例如，0.01、0.02、0.03、0.04和0.05)、约0.05ng/mL至约0.1ng/mL(例如，0.05、0.06、0.07、0.08、0.09和0.1)、约0.1ng/mL至约0.5ng/mL(例如，0.1、0.2、0.3、0.4和0.5)、约0.5ng/mL至约1.0ng/mL(例如，0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0)、约1.0ng/mL至约2.0ng/mL(例如，1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9和2.0)、约2.0ng/mL至约5.0ng/mL(例如，2.0、3.0、4.0和5.0)、约5.0ng/mL至约10.0ng/mL(例如，5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0)、约10.0ng/mL至约15.0ng/mL(例如，10.0、11.0、12.0、13.0、14.0和15.0)、约15.0ng/mL至约20.0ng/mL(例如，15.0、16.0、17.0、18.0、19.0和20.0)、约20.0ng/mL至约25.0ng/mL(例如，20.0、21.0、22.0、23.0、24.0和25.0)、约25.0ng/mL至约30.0ng/mL(例如，25.0、26.0、27.0、28.0、29.0和30.0)、约30.0ng/mL至约50.0ng/mL(例如，30.0、35.0、40.0、45.0和50.0)、约50.0ng/mL至约75.0ng/mL(例如，50.0、55.0、60.0、65.0、70.0和75.0)、约75.0ng/mL至约100.0ng/mL(例如，75.0、80.0、85.0、90.0、95.0和100.0)以及其间的任何浓度，包括端点
在一些实施方案中，白细胞介素22(IL22)用于促进NK细胞的扩增。在若干实施方案中，使用的IL22浓度范围为约0.01ng/mL至约100ng/mL，包括例如约0.01ng/mL至约0.05ng/mL(例如，0.01、0.02、0.03、0.04和0.05)、约0.05ng/mL至约0.1ng/mL(例如，0.05、0.06、0.07、0.08、0.09和0.1)、约0.1ng/mL至约0.5ng/mL(例如，0.1、0.2、0.3、0.4和0.5)、约0.5ng/mL至约1.0ng/mL(例如，0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0)、约1.0ng/mL至约2.0ng/mL(例如，1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9和2.0)、约2.0ng/mL至约5.0ng/mL(例如，2.0、3.0、4.0和5.0)、约5.0ng/mL至约10.0ng/mL(例如，5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0)、约10.0ng/mL至约15.0ng/mL(例如，10.0、11.0、12.0、13.0、14.0和15.0)、约15.0ng/mL至约20.0ng/mL(例如，15.0、16.0、17.0、18.0、19.0和20.0)、约20.0ng/mL至约25.0ng/mL(例如，20.0、21.0、22.0、23.0、24.0和25.0)、约25.0ng/mL至约30.0ng/mL(例如，25.0、26.0、27.0、28.0、29.0和30.0)、约30.0ng/mL至约50.0ng/mL(例如，30.0、35.0、40.0、45.0和50.0)、约50.0ng/mL至约75.0ng/mL(例如，50.0、55.0、60.0、65.0、70.0和75.0)、约75.0ng/mL至约100.0ng/mL(例如，75.0、80.0、85.0、90.0、95.0和100.0)以及其间的任何浓度，包括端点。
如果使用两种刺激剂，则两者之间的相对比率范围可以为1:10、1:20、1:50、1:100、1:150、1:200、1:250、1:500、1:750、1:1,000、1:10,000、1:50,000、1:100,000、100,000:1、50,000:1、10,000:1、1,000:1、750:1、500:1、250:1、200:1、150:1、100:1、50:1、20:1、10:1的比率以及那些所列比率之间的任何比率，包括端点。同样，如果使用三种或更多种试剂，则这些额外的试剂与其他试剂之间的比率可以采用上述比率中的任何一种。
如下文更详细讨论的，取决于实施方案，可以在扩增过程期间的特定点(或多个点)添加刺激分子，或者可以添加刺激分子使得它们在整个共培养过程中作为培养基的组分存在。
共培养和免疫细胞扩增的方法
在一些实施方案中，将从外周血供体样品中分离的NK细胞与经修饰以表达4-1BBL和mbIL15的K562细胞共培养。虽然其他方法涉及其他膜结合细胞因子的表达，但难以生成具有各种刺激分子的饲养细胞(例如，要实现多种刺激分子的期望表达水平、在扩增期间的正确时间表达等)。因此，本文公开的若干实施方案涉及在特定时间用特定浓度的各种刺激剂补充培养基。在若干实施方案中，将饲养细胞接种到培养容器中并容许达到接近汇合。然后可以将免疫细胞以期望的浓度添加到培养物中，在若干实施方案中范围为约0.5×106个细胞/cm2至约5×106个细胞/cm2，包括所列那些之间的任何密度，包括端点。
在若干实施方案中，免疫细胞是从外周血样品中分离的。此后，在若干实施方案中，可以一起扩增免疫细胞，或者使用分离的细胞亚群，如NK细胞。在若干实施方案中，将脐带血或其他血液来源用作免疫细胞的来源。一些实施方案采用特定群体或免疫细胞亚群。在若干实施方案中，群体或亚群体在培养物中扩增之前经纯化。例如，在若干实施方案中，纯化的NK细胞用于扩增。在其他实施方案中，单核细胞(例如外周血单核细胞或脐带血单核细胞)是用于扩增的细胞。
此后，用饲养细胞、任选地一种或多种细胞因子(在培养基中或作为外源补充物)接种NK细胞并培养第一时间段，例如约6小时、约12小时、约18小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天或所列那些之间的任何时间，包括端点。
如在实施例中更详细地讨论的(参见例如实施例4)，正在扩增的细胞用新鲜培养基和饲养细胞以及任选地一种或多种用于补充培养基的刺激性细胞因子“脉冲”。例如，在若干实施方案中，将正在扩增的细胞收集并重新铺板在其中具有新“批次”的饲养细胞的培养容器中。将正在扩增的细胞添加到具有新鲜培养基的新培养容器/饲养细胞中。在若干实施方案中，添加到共培养物中的培养基也是新鲜的，包括任选地向培养基补充最初存在于扩增培养基中(例如，在扩增的第0天)的任何刺激性细胞因子。如本文所讨论的，添加到培养基的刺激性细胞因子的浓度可以与先前的扩增期相同，或任选地浓度不同(更高或更低)。在若干实施方案中，正在扩增的细胞在扩增期间至少额外脉冲一次。在若干实施方案中，将正在扩增的细胞脉冲2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次。
在若干实施方案中，第一和第二脉冲之间的持续时间为约5至7天。在若干实施方案中，给定的第一脉冲和给定的第二脉冲之间的持续时间为约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天或约14天(或所列那些之间的任何时间，包括终点)。取决于实施方案，脉冲之间的持续时间相对恒定，例如，如果扩增的第0天和第一脉冲之间的时间为约5至约7天，则从第一脉冲到第二脉冲的时长为约5至约7天。然而，在一些实施方案中，可以调整时间，例如为了方便或由于观察到扩增细胞的健康改变。在若干实施方案中，脉冲式扩增容许待扩增的细胞(如NK细胞)继续保持扩增以实现初始细胞计数的至少20,000倍扩增。在若干实施方案中，实现了更大的扩增，如至少约50,000倍扩增、至少约100,000倍扩增、至少约150,000倍扩增、至少约200,000倍扩增、至少约250,000倍扩增、至少约300,000倍扩增、至少约350,000倍扩增、至少约400,000倍扩增、至少约450,000倍扩增、至少约500,000倍扩增、至少约750,000倍扩增、至少约1,000,000倍扩增、至少约1,250,000倍扩增、至少约1,500,000倍扩增、至少约1,750,000倍扩增、至少约2,000,000倍扩增、约2,500,000倍扩增、或约3,000,000倍扩增或所列那些之间任何程度的扩增，包括端点。在若干实施方案中，实现了大于约4,000,000或约5,000,000倍的扩增。
在若干实施方案中，在扩增开始时待扩增的免疫细胞数量与在扩增结束时扩增的细胞数量的比率为约1:25,000；约1:50,000、约1:100,000、约1:200,000、约1:500,000、约1:1,000,000、约1:1,500,000、约1:2,000,000、约1:2,500,000或约1:3,000,000或所列那些之间的任何比率，包括端点。
在若干实施方案中，可以通过调节饲养细胞数量与待扩增细胞的起始数量的比率来调节扩增程度。例如，在若干实施方案中，使用1:1的比率，而在另外的实施方案中，其范围可以是约：1:2、1:5、1:10、1:20、1:50、1:100、1:1,000、1:10,000、1:50,000、1:100,000、100,000:1、50,000:1、10,000:1、1,000:1、100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1以及所列那些之间的任何比率，包括端点。在若干实施方案中，对于每个后续脉冲，扩增开始时的比率维持在相同的近似比率。然而，在若干实施方案中，比率随时间改变，例如为了调节细胞的扩增速率，无论期望更快或更慢的扩增速率。
在若干实施方案中，在第一扩增期后，用工程化构建体(如嵌合抗原受体)转导扩增的细胞(例如NK细胞)。可以在工程化细胞(如NK细胞)中表达任何种类的嵌合抗原受体，包括那些描述于国际PCT申请PCT/US2018/024650、PCT/IB2019/000141、PCT/IB2019/000181和/或PCT/US2020/020824、PCT/US2020/035752、美国临时申请号62/924967、62/960285和/或63/038645，其中每一个都通过引用整体并入本文。
病毒转导后，将工程化细胞培养第二时间段，例如约6小时、约12小时、约18小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天，约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天或所列那些之间的任何时间，包括端点。应当注意，本文提供的某些数据涉及表达NKG2D配体结合域(例如NKX101)或CD19(例如NK19-1或NKX101)的嵌合受体复合物的病毒表达。然而，可以使用任何合适的嵌合受体或嵌合抗原受体。
用一种或多种刺激剂(如IL12和/或IL18)补充培养基可以在培养过程中的任何时间发生。例如，可以在培养开始时添加一种或多种刺激剂，例如在时间点零(例如培养开始)。一种或多种试剂可以添加第二次、第三次、第四次、第五次或更多次。随后的添加可以与先前添加的浓度相同也可以不同。多次添加之间的间隔可以变化，例如约12小时、约24小时、约36小时、约48小时、约72小时或更长的时间间隔，以及其间的任何时间，包括端点。
如果使用多次添加刺激剂，第一次补充添加的浓度可以与第二次(和/或任何补充添加)的浓度相同或不同。例如，在若干实施方案中，在多个时间点添加刺激剂可以斜升、斜降、保持恒定或在多个非等效浓度之间变化。
在若干实施方案中，使用饲养细胞与待扩增细胞的特定比率。例如，在若干实施方案中，使用约5:1的饲养细胞:“靶”细胞比率。在若干实施方案中，使用1:1的比率，而在另外的实施方案中，其范围可以为约：1:10、1:20、1:50、1:100、1:1,000、1:10,000、1:50,000、1:100,000、100,000:1、50,000:1、10,000:1、1,000:1、100:1、50:1、20:1、10:1以及所列那些之间的任何比率，包括端点。
实施例
实施例中公开的材料和方法是适用于本申请提供的各种实施方案的材料和方法(包括试剂和条件)的非限制性示例。
实施例1——扩增条件的初始评估
图1A显示了扩增过程的非限制性示例。在该示例中，在第0天添加刺激性细胞因子，并在第4天再次添加相同剂量，其用于本文讨论的某些实施方案。图1B表示单一剂量过程的非限制性示例，其用于本文讨论的某些实施方案。
图2显示了涉及使用各种方法的NK细胞倍数扩增的数据。最左侧的数据集显示使用单独的K562(表达mbIL15和4-1BBL)饲养细胞扩增NK细胞，而右侧的三个数据集中的每一个显示在用各种浓度的IL12和IL18补充培养基时增加的倍数扩增。任何量的补充IL12和IL18的存在导致NK细胞扩增的显著增加，从而证明额外的刺激剂可以增强NK细胞扩增。
图3A显示了涉及来自四个不同供体的NK细胞中NKG2D的表达的流式细胞术数据，该NK细胞用单独的K562细胞(顶行)或补充IL12/18进行扩增。从右移曲线(其涉及用NKX101转导的细胞)的高度增加可以看出，NKG2D的表达较高。NKX101的命名是指表达能够结合NKG2D受体配体的截短NKG2D细胞外域的工程化NK细胞。在若干实施方案中，截短的NKG2D域与CD8α铰链和CD8αTM域偶联。在若干实施方案中，截短的NKG2D域与OX40共刺激域和CD3ζ信号传导域偶联。在若干实施方案中，构建体进一步包含膜结合的IL15。在若干实施方案中，NKX101具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列或SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列。进一步支持NKG2D表达增强的是图3A，其中当使用补充性可溶性IL12/18时更高的平均荧光强度(MFI)证明了在给定细胞上更多的NKG2D的存在。因此，用可溶性IL12/18补充饲养细胞不仅增强NK细胞的扩增，而且还提高这些NK细胞的嵌合受体的表达。这是意想不到的益处，因为更多的NK细胞数目现在表达更大量的受体，这些受体将靶向不期望的细胞，如肿瘤。
可以使用其他受体将NK细胞靶向肿瘤。例如，在若干实施方案中，受体是靶向肿瘤细胞上的CD19的嵌合抗原受体。在若干实施方案中，抗CD19CAR包含偶联至OX40共刺激域和CD3ζ信号传导域的与CD19结合的scFv(例如FMC63 scFv或其变体)。在若干实施方案中，编码CAR的核酸序列进一步编码IL15。在若干实施方案中，IL15配置成以膜结合形式由宿主细胞(例如，NK细胞或T细胞)表达。在若干实施方案中，CAR由与SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27的序列具有至少95％、97％、98％、99％或更多序列同一性的核苷酸序列编码。在若干实施方案中，CAR具有与SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26或28的序列具有至少95％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列。在若干实施方案中，CAR采用人源化抗CD19结合物。
图4描绘了在扩增NK细胞时使用补充性可溶性IL12/18实际上导致这些扩增的NK细胞的细胞毒性增强的数据。图4显示了在两个时间点(病毒转导后14天和21天)处的来自两个不同供体的数据。用于扩增NK细胞的培养条件为使用可溶性IL12/18(虚线)或单独的K562(表达4-1BBL和mbIL15)(实线)。GFP转导的细胞用作对照——NKX101曲线由图4中的箭头指示。如数据指示，相对于在单独的K562细胞上的扩增，IL12/18的使用在转导后21天增强了NK细胞的细胞毒性(下小图)。虽然在这个特定实验中第14天的效果有限，但在若干实施方案中，可能取决于供体和/或特定IL浓度，在若干实施方案中，在较早的时间点(如病毒转导后14、15、16、17、18、19、20、21、22或23天)实现了增强的细胞毒性。无论时间，出乎意料的是，在扩增过程期间使用可溶性白细胞介素可以显著增强扩增细胞的细胞毒性。
在若干实施方案中，工程化NK细胞的细胞毒性增加至少部分是由于细胞朝向特定表型移动。图5A和5B描绘了涉及与NK细胞记忆相关的某些标志物随时间变化的数据。图5A显示了在单独的饲养细胞上扩增的NK细胞中CD57、NKG2C和CD62L的表达，而图5B显示了饲养细胞加可溶性IL12/18的使用。在第21天，在用IL12/18扩增的那些NK细胞中，NKG2C表达升高。NKG2C是细胞因子诱导的NK细胞记忆的标志物。在使用可溶性IL12/18扩增NK细胞的后期时间点也观察到CD67L增加。CD67L与淋巴细胞外渗增加相关联(细胞活性增加的证据)。总之，这些数据表明，在NK细胞扩增期间使用可溶性白细胞介素具有调动不同的信号传导途径的能力，这些信号传导途径与对抗原的NK细胞记忆和针对携带这些抗原的细胞的细胞毒性增强相关联。
图6描绘了当使用单独的K562细胞与用可溶性IL12/18补充扩增培养基来扩增下层(underlying)NK细胞时，涉及表达NKX101的NK细胞的抗肿瘤作用的体内数据。动物模型涉及在第0天用4x 106个SNU499肝细胞癌细胞(腹膜内)，继而是已经在有或没有IL12/18补充扩增培养基的情况下扩增的3x 106个表达NKX101的NK细胞(或对照)给药小鼠。如左小图所示，对照小鼠早在第7天就具有显著的肿瘤负荷，出现肿瘤信号，并且在第14天和第21天在一些小鼠中适度增加。体内生物发光成像(BLI)显示在图像下方。右小图显示了用表达NKX101的NK细胞完成的实验。如图像中所示，肿瘤负荷在第7天出现，但到第14天基本检测不到，并且到第21天维持如此。在中央小图中，显示了表达NKX101的NK细胞的实验图像，NK细胞已经使用可溶性IL12/18进行扩增。对肿瘤负荷的影响至少与NKX101细胞(“标准”扩增)一样有效，尽管NKX101功效的显著程度可能使得IL12/18的改善效果难以检测。然而，根据本文公开的若干实施方案，使用可溶性IL12/18来补充NK细胞扩增培养基不仅导致扩增增强，而且导致嵌合受体表达增强和细胞毒性增强。
实施例2——扩增和功效的进一步评估
如上文所述，在本文公开的若干实施方案中，使用一种或多种可溶性刺激因子来增强工程化免疫细胞(如NK细胞、T细胞或其组合)的扩增和/或细胞毒性。为本实施例进行的实验是为了评估与已建立的扩增系统相比各种浓度的选定刺激分子的功效。虽然可以使用其他刺激剂，但取决于实施方案，本实施例采用可溶性白细胞介素12和可溶性白细胞介素18。添加这些细胞因子(以下文所述的各种浓度)并将所得的扩增细胞与使用经修饰以表达膜结合白细胞介素15和4-1BBL的K562细胞扩增的细胞进行比较(在美国专利号7,435,596和8,026,097中有更全面的描述，其中每一个的全部内容均通过引用整体并入本文)。在增殖、细胞因子分泌、细胞毒性和表型方面评估扩增的细胞。
使用来自多个供体的NK细胞建立实验，使用各种条件扩增这些细胞。一组NK细胞在表达mbIL15的饲养细胞(K562/4-1BBL/mbIL15)上扩增。另一组NK细胞在表达mbIL15的细胞上扩增，这些细胞经进一步修饰以在细胞表面上表达IL12和IL18。在其他组间使用各种培养条件，并且进行增殖测定以确定各种浓度的刺激性细胞因子的作用。例如，将一组细胞暴露于固定浓度的IL12(5ng/mL)和不同浓度的IL18。将另一组暴露于另一种固定浓度的IL12(2.5ng/mL)和不同浓度的IL18。注意，将暴露于可溶形式的IL12和IL18的那些培养物在培养的第0天(并且在第4天再次)暴露于IL12/18的剂量。如上文所述，在第0天和第4天添加可溶性细胞因子用于生成图2-18和图23-24中所示数据的实验。其他实验仅在第0天使用暴露于可溶性细胞因子。
图7A是用于NK细胞扩增的各种培养条件的示意性表格。图7B显示了暴露于各种条件72小时后涉及细胞计数的数据。从下图可以看出，单独添加任何浓度的IL18对NK细胞增殖的影响有限。相比之下，单独添加IL12以剂量依赖性方式增加NK细胞增殖。IL12(2.5ng/mL或5ng/mL)与不同浓度的组合进一步增强了NK细胞增殖，表明这两种白细胞介素之间的协同相互作用。2.5ng/mL和5ng/mL的IL12的数据均证明了稳健的NK细胞扩增，当IL18以约0.1至约1ng/mL的浓度存在时达到接近最大水平。添加更高浓度的IL18仍然能够积极增强NK细胞扩增，与2.5ng/mL的IL12相比，50ng/mL的最高浓度的IL18与5ng/mL的IL12的组合导致略微增强的扩增。用过饱和浓度的IL12或IL18进行扩增的数据超出刻度并且未显示。
图8显示了涉及用不同浓度的IL12或IL18培养72小时后IFNg浓度的数据。数据图表示IFNg的浓度(如通过ELISA测定期间的吸光度所测量)与选定白细胞介素的渐增浓度有关。与增殖数据相似，与添加IL18相比，添加IL12导致更高的IFNg产量。也就是说，添加渐增浓度的IL18确实导致增加的IFNg产量增加。另一方面，几乎在每个测试浓度下，IL12均导致NK细胞的IFNg产量更高。对于增殖，任一浓度的IL12与约1ng/mL(或更高)浓度的IL18的组合产生提高的IFNg产量。IL12(任一浓度)与浓度低于约0.5ng/mL的IL18的组合导致IFNg产量类似于用单独的IL12所实现的产量。另一方面，包含约1ng/mL或更高的IL18导致显著提高的IFNg产量，再次表明对NK细胞的协同刺激。
图9A-9B显示了涉及在指示培养条件下扩增7天后NK细胞(未转导的)的扩增的数据。第一组使用饱和浓度的IL12(20ng/mL)和IL18(25ng/mL)两者进行扩增。第二组使用饱和浓度的IL12(20ng/mL)和亚饱和浓度的IL18(0.05ng/mL)进行扩增。第三组使用经工程化改造以表达IL15、IL12和IL18中每一种的膜结合形式的饲养细胞进行扩增(关于该饲养细胞系的更多详细信息可以在国际专利申请号PCT/SG2018/0501387中找到，其通过引用整体并入本文)。第四组作为对照，在已建立的饲养细胞系(表达mbIL15和4-1BBL的K562细胞)上进行扩增。图9A显示了计算的扩增数据，并且图9B显示了统计学分析。图9C和9D展示了特定滴定曲线和NK细胞扩增的数据。图9C显示了各种浓度的IL12与在4ng/mL保持恒定的IL18的数据。图9D显示了相似的数据，其中IL12变化并且IL18为20ng/mL。总之，这些数据表明无论是以可溶形式还是膜结合在饲养细胞(如表达mbIL15的K562细胞)上，IL12和IL18的添加均产生显著增强的NK细胞扩增。有趣的是，IL12似乎是扩增的主要驱动物，其活性通过包含IL18得到增强，即使在低浓度下也是如此(参见，例如，IL18的饱和和亚饱和浓度的相似扩增数量)。这些数据表明IL12和IL18稳健地增强了NK细胞扩增。
图10A-10B显示了在指示条件下(以及40IU/mL的IL2培养基补充)扩增8天后的未转导NK细胞的细胞毒性数据。靶细胞是Reh急性淋巴细胞白血病(非T；非B)细胞，效应物靶标比率为1:1。无论培养条件如何，所有细胞展现出约40％至约65％的细胞毒性。在没有任何IL12或IL18的情况下在表达mbIL15的饲养细胞上扩增的细胞展现出最高程度的细胞毒性，显著高于在可溶性IL12/IL18中培养的任一组。使用饲养细胞与膜结合IL12和IL18展现出比与可溶性细胞因子的那些更大程度的细胞毒性。
图11A-11B显示了未转导的NK细胞在培养第15天(IL2浓度为400IU/mL)以1:1的效应物靶标比率针对Reh细胞的细胞毒性数据。这些数据不仅展现出测试组间更大程度的细胞毒性，而且限制了组间差异。换句话说，所有组都显示细胞毒性增加到培养条件之间没有显著差异的程度。根据一些实施方案，IL12和IL18的使用诱导影响培养的早期部分扩增的途径或信号传导级联。在若干实施方案中，该途径或级联(或多个途径/级联)对增强的细胞毒性具有延迟作用。在若干实施方案中，某些刺激因子的使用诱导NK细胞的表型变化，如记忆样表型，其引发NK细胞发挥针对靶细胞的细胞毒性作用。在若干实施方案中，该表型变化的诱导可能需要1-2、3-4、5-6、7-8或更多天才能被识别，这取决于正在评估的NK细胞的特性。
虽然上述实验是用未转导的NK细胞进行的，但它们证明了包含各种浓度的IL12和IL18可以增强NK细胞的扩增和细胞毒性。用嵌合受体转导的NK细胞进行了进一步的实验(与GFP转导的细胞或未转导的(NT)NK细胞相比)。作为非限制性示例，所采用的嵌合受体包含与CD8α铰链和CD8αTM域、OX40共刺激域、CD3ζ信号传导域偶联的截短NKG2D域以及膜结合IL15。图12显示了流式细胞术数据，其评估了嵌合受体(指示为45_4)在各种条件下培养的来自各种供体的NK细胞上的表达。在图12的左栏中，显示了在表达mbIL15的饲养细胞上培养的两个供体(顶部227，底部732)的NK细胞的数据。鉴定为“45_4”的曲线显示了更高的NKG2D的表达(正如预期的那些用含有NKG2D的嵌合受体转导的细胞)。右栏显示了在第0天分别以20ng/mL和25ng/mL向培养基中添加可溶性IL12和可溶性IL18的表达mbIL15的饲养细胞上培养的NK细胞的表达结果。图13显示了另外两个供体的相应数据。从图12和图13中的MFI数据可以看出，IL12和IL18的使用导致NKG2D表达增强，进一步支持了某些刺激因子可以稳健地驱动NK细胞扩增的先前数据。这些数据还证实，使用刺激性分子(如IL12和IL18)与转导的NK细胞相容。
已经确认刺激性细胞因子增强了转导的NK细胞的扩增，评估了细胞毒性。图14A和14B显示了涉及用指示构建体转导并使用指示培养条件扩增的NK细胞的细胞毒性的数据。这些组是：在表达mbIL-15的饲养细胞上生长的GFP转导的NK细胞；在表达mbIL-15的饲养细胞上生长并暴露于IL12和IL18的GFP转导的NK细胞、在表达mbIL-15的饲养细胞上生长的NKX101转导的NK细胞、以及在表达mbIL-15的饲养细胞上生长并暴露于IL12和IL18的NKX101转导的NK细胞。靶细胞是E:T比为1:1的Reh细胞。使用来自四个不同供体的细胞在扩增后第13天评估细胞毒性。如图所示，GFP转导和NKX101转导的NK细胞均展现出细胞毒性，其中表达NKX101的细胞针对靶细胞显示出更大的作用。基于所使用的扩增培养条件未检测到显著差异(参见14B)。
图15A-15B显示了来自两个供体的额外的细胞毒性数据，其中测试了不同的E:T比。这些数据显示了与图14中所示一致的模式。图15A显示了第一个供体的四种培养条件的数据，并且15B显示了第二个供体的相应数据。注意，供体543(图15A)对巨细胞病毒呈阴性，而供体224(15B)对CMV呈阳性。CMV阳性个体的NK细胞亚群具有记忆样表型，这意味着它们的特征在于对靶细胞更快的反应。15A-15B中的数据是在扩增后第13天收集的。这些曲线与上述数据相似，并且在这个相对较早的时间点，IL12/IL18的存在或不存在对NK细胞诱导的细胞毒性的影响有限。图15C和15D显示了来自相同供体/条件的数据，但是是在扩增后第21天。值得注意的是，在所测试的大多数E:T比下，IL12/IL18的使用导致针对靶细胞的细胞毒性增强。这些数据与那些上文讨论的未转导的NK细胞的数据一致，因为增强细胞毒性的诱导存在延迟，但在稍后的时间点可检测到。如上文所述，这种效应可能是由于诱导NK细胞表型变化所需的时间。
图16A-16B涉及随时间变化在不同条件下培养的NK细胞表型的评估。图16A显示了在指示条件下培养5周内的NKG2C和CD62L(L-选择素)的表达水平。当使用表达mbIL15的饲养细胞时，CD62L或NKG2C表达水平在培养5周内没有显著变化。然而，比较而言，使用那些饲养细胞并在第0天向培养基补充IL12和IL18对NKG2C和CD62L的表达有显著影响。培养第1周后，CD62L最初出现在约50％的NK细胞上。虽然这在一周后增加，但随后CD62L表达显著下降，在培养4周时可能检测有限。比较而言，培养一周后NKG2C表达略有增加，NKG2C在NK细胞上的表达增加，超过40％的细胞在5周后表达NKG2C。因此，在5周时，培养物可以表征为与在没有刺激性细胞因子的情况下生长的NK细胞相比具有升高的NKG2C，并且与在没有刺激性细胞因子的情况下生长的NK细胞相比具有降低或等同的CD62L表达。图16B显示了支持NK细胞发展改变的记忆样表型的进一步数据。图16B显示了第14天(顶行)和第21天(底行)用表达mbIL15的细胞(左栏)或表达mbIL15的细胞加在第0天添加IL12和IL18(右栏)培养的供体NK细胞的通过FACS分析的表达数据。还显示了CD57表达，对表达呈阳性的细胞的相对低的百分比证实了在培养NK细胞时该标志物的表达缺失的趋势(新鲜NK细胞将具有较高的CD57表达)。从mbIL15列中可以看出，NKG2C表达(X轴)没有显著变化。比较而言(如箭头所指示)，在初始暴露于可溶性IL12和可溶性IL18后再培养额外一周后，表达NKG2C的细胞百分比增加了40％。
图17A-17D显示了涉及在指示条件下培养14天后NK细胞上标志物表达的汇总数据。如图17A所示，在这个时间点，CD62L通过使用IL12和IL18(无论是以可溶形式还是膜结合形式)得到增强。如上文所讨论的，这种表达随着额外的培养时间而下降。图17B显示了在第1天将IL12和IL18引入培养基时的增强NKG2D表达。与其他数据一样，注意到当IL18浓度变化(例如，用饱和或亚饱和浓度的IL18观察到的效果)时，对NK细胞表型的影响(如扩增和细胞毒性)大致等同。CD57表达水平在所有条件下都相对较低，反映了培养(而不是新鲜分离)的细胞，如17D所示。图17D显示了CD62L和NKG2C的双阳性标志物表达，表达水平再次由培养物中IL12和IL18的存在而增强。这些数据反映了用IL12和IL18(无论是可溶性还是膜结合的)培养的NK细胞的表型朝向更有力的记忆样表型转变。在若干实施方案中，这种表型赋予NK细胞特别是经工程化改造以表达嵌合受体的那些细胞以增强的扩增能力和/或增强的细胞毒性，从而产生更有力的癌症免疫疗法产品。
图18显示了IL12和IL18的使用增强工程化NK细胞的细胞毒性，即使在较晚的时间点(显示的是扩增后21天的细胞毒性)。值得注意的是，图中的两个中心点代表NKX101转导的NK细胞，其展现出任何组中的最强的细胞毒性作用。重要的是，在表达mbIL15的饲养细胞上与可溶性IL12和18一起培养的NKX101转导的NK细胞显示出对靶细胞的最高程度的细胞毒性(作为非限制性示例，此处的靶标是Reh白血病细胞)。因此，根据若干实施方案，在NK细胞培养中使用可溶性刺激因子，如IL12、IL18、IL21等，提供了意料不到的改善的细胞扩增(这与产生有临床意义的细胞数量高度相关)以及针对靶细胞的意料不到的增强的细胞毒性。
实施例3——扩增、冷冻保存和细胞毒性的评估
如本文所公开的，在若干实施方案中，扩增的工程化NK细胞用于自体情况。在若干实施方案中，使用同种异体方法。在若干实施方案中，NK细胞被设计为“现成的”，指的是预先存在的NK细胞群，这些细胞群已经被扩增和工程化改造，然后被保存以供以后向患者给药。在若干实施方案中，保存是通过冷冻保存。与任何冻融循环一样，细胞的存活力和活性可能是问题。图19显示了涉及来自三个不同供体的NK细胞的特征的数据，该NK细胞用表达mbIL15的饲养细胞或在培养开始时补充有可溶性IL12/18的表达mbIL15的饲养细胞培养。该表的底部三行证明了可溶性IL12和18对培养的NK细胞的积极影响。扩增第6天后，NK细胞在IL12/18培养基中的存活力略高，而使用IL12/18时，总细胞数和因此的倍数扩增显著较高。
在此数据的基础上，用抗CD19嵌合抗原受体转导细胞，并且在有或没有可溶性IL12和18的情况下进行培养(使用表达mbIL15的饲养细胞)。将部分细胞冷冻保存，然后与相应的新鲜细胞进行比较。使用FACS，评估NK细胞的FLAG(NK19-1构建体中的标签，但应当理解，本文提供了相应的非标签化构建体)表达。如图20所示，来自3个供体的NK细胞(新鲜和冷冻保存的细胞)均维持CD19 CAR的表达。IL12/18的存在似乎对CAR表达的影响有限。图21显示了在扩增第22天来自相同供体的细胞。有趣的是，与第21天相比，第14天表达抗CD19CAR的细胞百分比降低。第21天构建体的表达与新鲜NK细胞(例如，未冰冻)中大致相同(比较第3-4行与第7-8行)。这些数据表明，根据本文公开的方法培养的NK细胞是稳健的细胞群并且能够在冷冻保存中生存，并且仍然维持存活力并维持细胞毒性诱导构建体的显著表达水平。
进行了冷冻保存对NK细胞的影响的进一步分析。将Nalm6核红细胞系用作靶细胞，并且由表达抗CD19 CAR的NK细胞系靶向。作为非限制性示例，该实验采用由SEQ ID NO:1编码的CAR。图22A-22B中提供了测定的结果。图22A显示了随测定时间变化的细胞计数曲线(三个供体的平均值)。如所示，非转导的NK细胞和单独的Nalm6细胞显示出相似程度的Nalm6靶细胞增加。用可溶性IL12/18生长的非转导的NK细胞显示出轻微的细胞毒性作用(每孔细胞计数曲线向下移动)。值得注意的是，在培养的第14天冷冻保存的细胞对Nalm6细胞显示出显著的细胞毒性作用，限制生长到实验的最后小时。值得注意的是，在具有可溶性IL12/18的培养物中生长的第14天冷冻保存的细胞完全限制了Nalm6细胞生长。在若干实施方案中，扩增较长时间段的细胞(新鲜或冷冻保存的)也能够显著减少肿瘤生长。第14天的汇总数据显示在图22B中。关于未转导的NK细胞，在培养的第0天添加可溶性IL12/18的NK细胞的扩增显著增加了NK细胞针对靶肿瘤细胞的细胞毒性。表达CAR的NK细胞显示出类似的数据。即使CAR的存在导致对靶细胞的近80％的细胞毒性，用可溶性IL12/18培养表达CAR的NK细胞也显著增强了细胞毒性。图22C显示了在扩增期间在培养基中存在或不存在IL12/18的情况下以各种E:T比培养的NK细胞的额外细胞毒性数据。如所示，经工程化改造以表达抗CD19 car的非限制性实施方案的细胞在几乎所有E:T比下展现出增强的细胞毒性。随着靶细胞数量的增加，如本文所公开的，与在单独的饲养细胞上扩增的细胞相比，使用IL12和IL18扩增的NK细胞的细胞毒性展现出增强的细胞毒性作用。总的来说，这些数据提供证据表明，在培养基中使用IL12/18导致NK细胞增殖增强以及细胞毒性增强。此外，这些数据提供了重要的额外证据，证明细胞的活性得以保留，即使在细胞被冷冻保存之后也是如此。该数据表明，根据一些实施方案，已经生成了具有稳健的抗肿瘤作用的“冷藏外(out of thefreezer)”工程化NK细胞产品。
图23显示了体内实验的示意图，其中将肝细胞癌细胞注射到供体小鼠中，并施用使用各种培养条件生长的NK细胞。此后使用生物发光监测肿瘤负荷。施用的细胞是在第1天补充有可溶性IL12/IL18的培养基中生长的非转导的NK细胞、有IL2的情况下生长的表达NKX101的NK细胞或在第1天补充有可溶性IL12/IL18的培养基中生长的表达NKX101的NK细胞。所有细胞在表达mbIL15的饲养细胞上生长。图24显示了随时间变化的肿瘤负荷分析的结果。对照动物以及那些接受非转导的NK细胞的动物随着时间的推移显示出适度的肿瘤生长。比较而言，那些接受表达NKX101并在有IL12/18或IL2的情况下生长的NK细胞的动物显示出显著更强的抗肿瘤作用。两组的肿瘤负荷均降低，其中IL2组从第14天到第21天仅略有增加。这些数据进一步加强了在扩增培养基中使用刺激性细胞因子如IL12、IL18或IL21以增强培养的NK细胞的细胞毒性。
图25显示了类似的实验设置，这次是Nalm6细胞的异种移植并用表达抗CD19 CAR的NK细胞处理。图26A显示了生成的生物发光数据。与先前的实验一样，对照动物和那些接受非转导的NK细胞的动物显示出肿瘤负荷迅速增加，尽管它在后来的时间点下降。接受了表达NK19-1(抗CD-19CAR)的NK细胞的动物显示出肿瘤生长的有效延迟，限制显著增加直到稍后的时间点。与其他组相比，表达NK19-1并在有IL12/18的情况下生长的细胞显示出对肿瘤生长的显著控制，限制增加直到实验后期，甚至随后总体肿瘤负荷显著更低。与生存相关的进一步数据如图26B所示。接受PB(对照)或NT NK细胞的小鼠在30天左右的生存迅速下降。接受NK19-1的动物比那些组生存更长，并且即使当所有其他组都没有存活者时，NK19-1IL12/18动物仍有80％存活。图26C和26D显示了涉及NK细胞在补充有IL12/18的培养基中培养时的体内持久性的数据。图26C显示了总鼠外周血中的人CD56+细胞(NK细胞的标志物)的百分比的测量。如所示，即使在施用后18天，使用可溶性IL12/18扩增NK细胞也导致鼠血液中人NK细胞的百分比显著更高。这证明了通过在扩增期间使用刺激性细胞因子给予了NK细胞增强的持久性。同样，不仅NK细胞通常在体内持久存在，而且那些表达CAR的细胞也通过使用可溶性IL12/18(或其他刺激性分子)享有增强的持久性。图26D显示了在异种移植物接受者小鼠中注射后18天抗CD19 CAR阳性NK细胞(在总鼠外周血细胞计数中)的百分比。与先前的图一样，这些数据显示，当使用至少一种刺激性细胞因子进行扩增时，工程化免疫细胞(如表达嵌合抗原受体的NK细胞)展现出增强的体内持久性。进行了额外的实验以评估扩增培养和冷冻保存(或缺乏冷冻保存)中使用的细胞因子对NK细胞表达CAR的影响。图26E显示，在培养的第15天，当在扩增培养中使用细胞因子时，抗CD19 CAR的非限制性实施方案的表达没有改变。即，本文基于使用一种或多种额外的刺激性分子的扩增培养所证明的增强效果未被降低的CAR表达所抵消。此外，NK细胞的冷冻保存没有对工程化NK细胞的CAR表达产生不利影响。图26F证实了CAR表达在培养进一步时间后未被削弱。这些数据再次支持了在刺激性细胞因子(如IL12和IL18等)的影响下生长的NK细胞的增强的细胞毒性、持久性和稳定的CAR表达。同样，工程化NK细胞的冷冻保存没有对这些有益的特性产生显著不利的影响。
实施例4——评估冷冻保存和扩增对细胞毒性、NK细胞特性和NK细胞生成的影响 的额外的实验
进行了额外的实验以确定冷冻保存后解冻的过程是否会对工程化NK细胞产生不利的影响，如降低它们的存活力、持久性或细胞毒性。图27A显示了所采用的示意性实验方案，以及所用的实验组和其他条件。如上文所述，根根据本文所述的实施方案，对于命名为“IL12/IL18”的处理组，细胞在可溶性IL12和/或IL18存在下扩增。处理组包括新鲜的、未转导的NK细胞(G1)和PBS(G2)作为对照。实验组包括冷冻保存并解冻的经工程化改造以表达抗CD19 CAR的非限制性实施方案并且在没有(G3)和有额外的刺激性细胞因子(G4)的情况下扩增的NK细胞，以及新鲜的经工程化改造以表达抗CD19CAR的非限制性实施方案并且在没有(G5、G6)和有额外的刺激性细胞因子(G7、G8)的情况下扩增的NK细胞。在图27A的指示时间点进行血液收集和成像。
图27B和27C显示了来自指示实验组的体内生物发光成像。图28A-28H显示了反映生物发光强度随时间变化的线状图。这些数据汇总在图28I和图28J中，图28I显示了处理后前30天的数据，图28J显示了整个56天的数据。虽然图28I显示了表达CD19 CAR的NK细胞与两个对照组的明显区别，但实验组中的每一个都显示在实验的前30天测量到的BLI限于不可检测的增加(增加的BLI指示增加的肿瘤生长)，指示肿瘤生长得到控制。图28J显示了整个56天的数据，并且在抑制肿瘤细胞生长的指示条件下表达各种CAR构建体并经处理的实验组存在较大的分离。对照组(G1和G2)显示肿瘤生长显著增加，导致这些组的实验在30天时终止。接受新鲜的表达抗CD19CAR并在不使用可溶性白细胞介素的情况下扩增的NK细胞的组(G5)在第30天和第56天之间显示出BLI急剧增加。该组的另一个实验重复(G6)显示出更显著的抑制肿瘤生长的能力。接受冰冻的表达抗CD19 CAR并在不使用可溶性白细胞介素的情况下扩增的NK细胞的组(G3)在第30天和第56天之间也显示出BLI增加，但与用新鲜细胞检测到的程度不同。接受在扩增期间使用额外的刺激因子扩增(如根据本文公开的实施方案)的表达抗CD19 CAR的NK细胞(无论是新鲜的还是冰冻的)的实验组展现出最稳健的肿瘤生长阻止。值得注意的是，均是冷冻保存的NK细胞的第4组和第8组显示最强的肿瘤生长抑制。结合施用新鲜的工程化NK细胞时收集的数据，这些数据表明，根据若干实施方案，表达抗CD19 CAR的工程化NK细胞不仅在新鲜制备并施用时有效，而且在制备、冰冻然后解冻并施用时也有效(例如，如在某些同种异体实施方案中)。
图29显示了在56天的实验中用指示构建体处理的小鼠体重的线状图。体重的降低与肿瘤生长的增加相关，例如，肿瘤的进展导致小鼠健康状况下降，以及相应的体重减轻(例如消瘦)。如图所示，到30天时，对照组的体重明显下降，而在大部分实验中，除了一个实验组外的所有实验组的体重都在增加。与上文讨论的生物发光数据一样，存在值得注意的趋势，即许多新鲜与冰冻制剂对体重展现出基本相似的影响。根据若干实施方案，表达抗CD19CAR的工程化NK细胞不仅在新鲜制备和施用时有效。此外，根据若干实施方案，表达抗CD19 CAR的工程化NK细胞不仅在制备、冰冻、然后解冻并施用时有效(例如，如在同种异体环境中)。
收集了额外的数据来表征在使用或不使用一种或多种额外刺激性因子的情况下扩增的NK细胞的特性。图30A显示了涉及培养中的NK细胞的寿命(例如，持久性)的数据。这些数据显示了经工程化改造(基于激活嵌合受体(ACR)阳性)的NK细胞百分比(基于CD56阳性)。这些数据表明，在扩增期间使用或不使用额外的刺激性因子(如IL12和/或IL18)扩增的NK细胞在体内展现出相似的持久性概况，此类工程化的NK细胞在约7天内在血液中以相对一致的水平存在(介于约5-10％)。同样，基于工程化CAR的表达和CD56阳性的检测进行测量，在约50天内测量了动物血液中存在的NK细胞百分比，其数据如图30B所示。与7天期间的类似概况相反，在约25-30天后，在不使用一种或多种额外的刺激性因子的情况下扩增的NK细胞数量开始下降。这些细胞的数量继续缓慢下降到约48天，此时细胞数量接近于零。从大约25-30天的同一时间点，用额外的刺激性因子(例如，IL12和/或IL18，根据若干实施方案)扩增的工程化NK细胞在整个45天内以约10％继续存在于血液中。仅在最后三天存在轻微下降(至约5-7％)。这些数据是强有力的指标，表明与不使用此类刺激性分子培养/扩增的NK细胞相比，使用一种或多种额外的刺激性分子(如IL12、IL18和/或IL21)赋予工程化NK细胞以增强的体内持久性。图30C以不同的方式呈现了持久性数据，基于所计数的每10,000个活细胞中工程化的表达CAR的NK细胞数量的计数。这些数据反映了图30B中所示的一般趋势，即，与不使用此类刺激性分子扩增的工程化NK细胞相比，使用一种或多种刺激性分子(例如，可溶性IL12和/或可溶性IL18)扩增的细胞在较长时间内以较高的数量保留在血液中。在若干实施方案中，本文公开的方法特别有利，因为它们避免了某些基于细胞因子的扩增方法中常见的细胞因子成瘾。在一些方法中，使用高浓度的可溶性细胞因子促进细胞生长，但细胞生长习惯于那些浓度，并且当暴露于没有那些人工条件的环境(如向患者施用时)时展现出退缩的迹象(例如，凋亡、存活力降低或其他功能降低)。根据本文公开的方法扩增的工程化NK细胞所展现的不需要持续的高细胞因子浓度至少部分有助于延长体内细胞的寿命(和活性寿命)。
图31A-31C显示了表征根据本文公开的实施方案产生的工程化NK细胞的额外数据。这些数据是从三只小鼠(施用后第51天)的血液中收集的，向这些小鼠施用新鲜(未冷冻保存)的表达抗CD19 CAR并根据本文公开的若干实施方案使用可溶性IL12和可溶性IL18扩增的工程化NK细胞。数据描绘了全血样品中CD56阳性(指示NK细胞)和CD19-Fc阳性(指示表达工程化抗CD19 CAR的细胞)的细胞比例。如图31A、31B和31C中的每一个所示，双阳性细胞的比例(右上方的方框区域)的范围为约4.75％至约6.7％。图32A-32C显示了对来自与图31中相同的小鼠的全血的分析，但鉴定CD19-Fc阳性(指示表达工程化抗CD19 CAR的细胞)和CD3阳性(指示T细胞)的细胞。这些数据证明，绝大多数表达抗CD19 CAR的细胞对CD3呈阴性，这意味着它们不是T细胞。根据若干实施方案，某些NK细胞生产方法确实涉及从初始供体全血样品中去除T细胞的步骤，但是，可能会保留微不足道的数量的T细胞。然而，在若干实施方案中，根据图31A-32C中所示的数据，大多数表达抗CD19 CAR的工程化细胞展现出NK细胞的特征(CD56-阳性)并且没有T细胞的特征(CD3-阴性)。
图33、34和35涉及进一步表征在肿瘤接种后各个时间点来自动物全血的细胞的数据。图33涉及施用后第4天的数据，图34涉及肿瘤接种后第12天的数据，图35涉及肿瘤接种后第18天的数据。这些数据涉及来自作为对照并接受非转导的NK细胞(NT NK)或PBS处理的动物的全血细胞，或来自接受在培养物中用IL2或在培养物中用IL12/18扩增的工程化NK细胞的其他组的动物的全血细胞，每个条件都有新鲜和冰冻处理组。图33A显示了第4天来自动物全血的NK细胞(CD56-pos/CD3-neg)的百分比。每个处理组在这方面相对相似，全血中约有3-5％的细胞为工程化NK细胞。图33B显示涉及特异性表达抗CD19-CAR的非限制性实施方案的细胞百分比的数据。与图33A非常相似，每个处理组中表达抗CD19-CAR的细胞的百分比范围为约3-5％。图33C显示了涉及施用后第4天血液中存在的GFP阳性肿瘤细胞百分比的数据。与先前图中所示的BLI成像一致，在任何处理组中存在少量可检测到的肿瘤细胞。检测到的低信号可能反映了GFP+肿瘤细胞从循环迁移到多个组织(使它们可能由BLI成像检测到，但不能在血液样品中检测到)。图34A-34C显示了肿瘤接种后12天的相应数据。与较早时间点的情况一样，每个处理组导致样品中约3％-5％的血细胞是NK细胞(图34A)。图34B显示了对抗CD19 CAR构建体呈阳性的细胞的百分比。虽然在该时间点处理组间的表达水平相似，但每个实验组的表达水平均显著高于对照组。此外，在第12天时，表达抗CD19 CAR的细胞(例如NK细胞)的百分比略高(大约为血细胞的7-9％)，表明循环中工程化细胞的持久性增加。图34C显示了全血中肿瘤细胞的数量。有趣的是，所有组都显示少量的GFP表达，尽管BLI成像显示发光增加，特别是在对照组中。同样，这些数据可以反映了某些悬浮肿瘤细胞展现出的生理性“驻留”。
图35A显示了肿瘤接种后18天时NK细胞的百分比(基于CD56阳性)。与对照组相比，实验组都显示出显著更高的百分比，各组占全血中细胞的范围为约15％至约25％。如图30B和30C所示，这种增加的百分比与增加的NK细胞的时间窗一致。虽然在这个特定实验中没有统计学差异，但这些数据显示，在IL12/IL18培养基中扩增并冷冻保存的NK细胞是实验组中最多产的。根据若干实施方案，饲养细胞加上基于细胞因子的扩增再与冷冻保存偶联产生了更稳健的NK细胞，其可以在更正常的细胞因子条件下(例如，没有细胞因子成瘾)存活并且可以在健康状态下持续较长的时间段。图35B和35C显示了第18天时肿瘤负荷的两种测量。图35B显示了使用抗CD19 PE偶联抗体测量的血液中对CD19(在该非限制性实施方案中工程化CAR的靶标)呈阳性的细胞的百分比。这些数据显示了对照组的肿瘤负荷呈上升趋势，并且比较而言，处理组的工程化NK细胞限制肿瘤生长的能力。图35C显示了类似的数据，但通过检测GFP信号(例如，～BLI)。这些数据虽然由于基于PE的检测与基于GFP的检测的灵敏度而不同于35B的数据，但这些数据显示出类似的趋势。与对照相比，实验NK细胞显示出增强的防止肿瘤细胞扩增的能力。图35D涉及关于表达工程化抗CD19(例如，CD56和CD19 Fc均呈阳性)的NK细胞数量的数据。与图35A的数据类似，这些数据显示，血液样品中增加的NK细胞百分比是表达工程化抗CD19 CAR的NK细胞，反映了它们增强的持久性。图35E显示了证实性数据，即每个实验组中几乎全部对CAR呈阳性的NK细胞群都是经工程化改造以表达本文公开的抗-CD19CAR的NK细胞。
为了进一步研究根据本文公开的实施方案扩增的工程化NK细胞的持久性，向小鼠施用两种剂量的使用如本文公开的可溶性细胞因子扩增的工程化NK细胞，并在另外的四个星期内追踪细胞数量(根据图27A的施用方案)。图36显示了这些数据的箱形图。简言之，箱形图的X轴以两种形式表示时间，二者为：i)第三次施用后的时间或ii)自肿瘤接种以来的总时间(显示在括号中)。Y轴表示表达抗CD19 CAR的NK细胞的计数(每10,000个白细胞)。2百万个NK细胞剂量的箱形图是箱的下部轨迹(由虚线箭头指示)，而5百万个细胞剂量是上部轨迹(由实线箭头指示)。这些数据表明，相比于在仅饲养细胞的条件下扩增的工程化NK细胞，在使用一种或多种刺激性分子(如IL12和/或IL18)(与饲养细胞结合，如本文若干实施方案中所述)的条件下扩增的工程化NK细胞的半衰期延长。2百万个NK细胞剂量的半衰期约为15天。基于一个或多个清除率和/或分布容积的差异，5百万个工程化NK细胞剂量的半衰期约为18天。这些与不使用一种或多种额外的刺激性分子扩增的另一种工程化NK细胞的剂量形成对比，如图37所示，其表明500万个细胞剂量的半衰期约为5天。因此，根据本文公开的若干实施方案，使用一种或多种额外的细胞因子结合饲养细胞系统扩增工程化NK细胞容许增加NK细胞的扩增并赋予那些细胞增强的持久性和/或细胞毒性。
实施例5——多次脉冲饲养细胞和增强NK细胞扩增
虽然本文公开的实施方案导致NK细胞的稳健扩增，但评估了额外的实施方案以确定是否可以实现更大程度的扩增，同时维持赋予扩增的NK细胞的有利特征和/或最小化细胞的有害影响或特征。将NK细胞以1:10的比率与饲养细胞(此处，表达膜结合IL15和4-1BB配体的K562细胞用作饲养细胞的非限制性示例)在补充有40单位/mL的培养基中IL2铺板。NK细胞获得自脐带血或外周血。NK细胞培养约3周，从第0天开始，并在第7天和第14天再次用新的饲养细胞和培养基脉冲。在第7、14、22和29天对扩增的细胞进行计数。扩增结果以图形方式显示在图41A中并以数字方式汇总在图41B中。每个扩增的样品在第22天达到细胞数量的峰值，并维持大致相同的数量直到第29天。这些数据显示细胞扩增范围为约100,000倍至超过100万倍(对于来自外周血的NK细胞)。
如本文所讨论的，在若干实施方案中，培养基补充有IL12或IL18中的一种或多种。2020年7月29日提交的国际PCT专利申请号:PCT/US2020/044033中公开了关于此类实施方案的进一步的信息，该申请通过引用整体并入本文。为了研究这些在多次脉冲扩增形式中使用时的效果，培养基补充了40IU/mL的IL2和20ug/mL IL12，并且在第0、7和14天脉冲来自脐带血或外周血的NK细胞时使用，并且在第7、14、22和29天计数。扩增结果以图形方式显示在图42A中并以数字方式汇总在图42B中。有趣的是，若干样品的细胞扩增在第22天达到顶峰，但在来自一位供体的外周血中则在第29天达到顶峰。这些数据表明，IL12可以促进NK细胞增强的扩增，特别是来自外周血的NK细胞。
同样，通过向培养基补充0.05ng/mL IL18(和40IU/mL IL2)研究了IL18的作用。扩增的结果以图形方式显示在图43A中并以数字方式汇总在图43B中。这些数据表明，IL18可以驱动大量细胞扩增，对于脐带血和外周血衍生的NK细胞均如此。一名供体显示NK细胞增加超过2000万倍是由于在第7天和第14天(以及培养开始时)对初始NK细胞进行脉冲。
图44A和44B显示了用新的饲养细胞和补充有IL12(20ng/mL)和IL18(0.05ng/mL)(以及40IU/mL的IL2)的培养基脉冲脐带血衍生或外周血衍生的NK细胞的结果。在第7天和第14天(以及培养开始时)对NK细胞进行脉冲，并且在第7、14、22和29天对细胞进行计数。有趣的是，这些数据表明，采用3次脉冲方法，IL12和IL18补充培养基的组合导致细胞扩增减少，这可能表明细胞因IL12、IL18和IL2的重复呈现而受过度刺激或导致扩增耗竭。这与2020年7月29日提交的国际PCT专利申请号:PCT/US2020/044033中显示的数据形成对比，该专利申请表明，根据其中公开的一些实施方案，添加可溶性IL12和IL18(但是不以与此特定实验相同的3-脉冲方式)驱动稳健的NK细胞扩增。
为了进一步表征饲养细胞和刺激性细胞因子的多次脉冲对扩增免疫细胞(此处为NK细胞)的影响，收集了额外的数据以评估CD3阳性细胞亚群的扩增。虽然根据一些实施方案，NK细胞经纯化(例如，以去除T细胞和其他非NK细胞)，但确实保留了一些小的残留T细胞亚群。可选地，根据一些实施方案，NK细胞在扩增前未经纯化。因此，在某些条件下，T细胞亚群可以来自从供体收集的细胞的扩增。这在图45A-45E中进行了评估。图45A显示了当起始血细胞群(NK细胞(与图45B-E的起始材料为CBMC或PBMC形成对比))在高浓度的IL2中扩增时CD3阳性群的有限扩增(数据呈现为CD3阳性细胞的百分比)。比较而言，图45B显示在3脉冲扩增设置中使用IL12导致CD3阳性细胞随时间变化的更大程度的扩增。在3脉冲扩增期间使用IL18不会增加CD3阳性细胞的生长，如图45C所示。组合使用IL12和IL18导致CD3阳性亚群的类似增加(参见图45D)，因此表明IL12的存在，即使与IL18组合，至少在某些条件下可以导致CD3阳性细胞亚群的扩增(如果此类细胞存在于待扩增的起始细胞群中)。图45E显示了在对照条件下有限的CD3阳性扩增。因此，在若干实施方案中，IL12以不导致CD3阳性亚群扩增的浓度使用，和或IL12不以与先前脉冲采用的IL2相同的浓度引入给定脉冲所使用的培养基中。在若干实施方案中，IL12以少于扩增期间使用的脉冲总数的方式包含在培养基中，例如每隔一个脉冲、每三个脉冲等。在若干实施方案中，IL12以小于约20ng/mL的浓度存在，例如约15ng/mL、约12ng/mL、约15ng/mL、约15ng/mL、约15ng/mL、约15ng/mL或所列那些之间的任何浓度。在若干实施方案中，使用弥补CD3阳性细胞扩增的IL18浓度，即使使用IL12，例如约0.07ng/mL、约0.10ng/mL、约0.12ng/mL、约0.15ng/mL、约0.2ng/mL或更多。在一些实施方案中，尽管CD3阳性细胞扩增，但CD3阳性亚组的总体生长被NK细胞生长(例如CD56+/CD3-细胞)抵消，使得CD3阳性细胞的百分比在总体所得扩增群体中可忽略不计。在若干实施方案中，如果在扩增后检测到CD3阳性细胞，则将它们移除，例如通过固相亲和(例如琼脂糖珠或带有抗CD3抗体的另一种固体支持物)。
收集了涉及在各种条件下扩增的NK细胞上活化NKG2C受体的表达程度的额外数据。图46A显示了在高IL2条件下生长时随时间变化表达NKG2C的NK细胞的百分比，而图46B显示了相同的细胞，但数据以总体MFI表示(这解释了表达较高程度的NKG2C的细胞不一定由％-阳性数据证明)。在三个脉冲的培养基中使用IL12导致在整个约22天期间NKG2C表达的时间依赖性增加(46C)，此后给定细胞的总体表达下降(46D)。培养基中的IL18导致NKG2C表达的相似概况，尽管随时间变化表达的稳定性略有增强(图46E和46F)。将IL12和IL18与三脉冲扩增组合使用导致NKG2C表达随时间平稳增加，表达NKG2C的细胞百分比达到与单独使用任一细胞因子相似的水平。然而，组合没有导致如单独的细胞因子所造成的第14天和第22天的普遍减少。此外，如通过MFI测量的，一起使用IL12和IL18提高了NKG2C表达的“密度”(图46H)。对照NKG2C数据如图46I和46J所示。
收集了与在各种条件下扩增的NK细胞表达的各种标志物(例如活化或抑制标志物)相关的进一步表征数据。图47A显示的数据表明，多脉冲扩增方案产生表达活化标志物的NK细胞的百分比的增加，如天然细胞毒性受体NKp46和NKp44、NKG2C受体和糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)的表达增加。有趣的是，两个抑制标志物也增加了，检查点受体TIGIT和TIM3(参与T细胞耐受的蛋白质域)，如图47B所示。
图48A-48B涉及在第0天(圆圈)或第7天(正方形)时活化(48A)或抑制(48B)标志物表达的额外评估。图48A显示，如上文所讨论的，与第0天(脉冲1)相比，天然细胞毒性受体NKp44和NKp46在脉冲培养的第7天由更多NK细胞表达。其他活化标志物，如2B4表达、CD25表达和DNAM-1表达在培养期间一致地升高，大约75％或更多的NK细胞表达这些标志物。图48B显示了TIGIT和TIM3在使用脉冲培养方法中随时间适度增加的额外数据。然而，在若干实施方案中，在扩增期间使用的多次脉冲容许产生临床相关的NK细胞，这些NK细胞表达活化的NK细胞的特征，从而容许它们用于癌症免疫疗法。
设想了可以进行上文公开的实施方案的具体特征和方面的多种组合或亚组合并且仍然落入本发明的一个或多个之内。此外，本文公开的与实施方案有关的任何特定特征、方面、方法、特性、特征、质量、属性、元素等可以用于本文列出的所有其他实施方案。相应地，应当理解，所公开的实施方案的多个特征和方面可以相互组合或取代以形成所公开的发明的不同模式。因此，预想了本文公开的本发明的范围不应受到上文描述的具体公开的实施方案的限制。此外，虽然本发明易受多种修饰和替代形式的影响，但其具体示例已在附图中显示并在本文中详细描述。然而，应当理解，本发明不限于所公开的特定形式或方法，相反，本发明涵盖落入所描述的多个实施方案和所附权利要求的精神和范围内的所有修饰、等同方案和替代方案。本文公开的任何方法不需要以所述顺序进行。本文公开的方法包括从业者采取的某些行为；然而，它们也可以包括任何第三方对这些行为的指示，无论是明示的还是暗示的。例如，诸如“施用扩增的NK细胞群”等行为包括“指示施用扩增的NK细胞群”。此外，在根据马库什组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到本公开也由此根据马库什组的任何个体成员或成员的亚组而描述。
本文公开的范围还涵盖任何和所有重叠、子范围及它们的组合。诸如“多达”、“至少”、“大于”、“小于”、“之间”等的语言包括所列举的数字。前面带有如“约”或“大约”等术语的数字包括所列举的数字。例如，“90％”包括“90％”。在一些实施方案中，与参考序列具有至少95％序列同一性的序列包括与参考序列具有96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。此外，当将序列公开为“包含”核苷酸或氨基酸序列时，除非另有说明，否则此类引用还应该包括该序列“包含所列举的序列”、“由所列举的序列组成”或“基本上由所列举的序列组成”。
诸如“一(a)”、“一(an)”、“该(the)”等冠词可以表示一个或多于一个，除非有相反指示或上下文中有其他明显的指示。本文在说明书和权利要求中使用的短语“和/或”应当理解为这样结合的元素的“其中之一或两者”。以“和/或”列出的多个元素应当以相同的方式解释，即如此连接的元素的“一个或多个”。除了由“和/或”条款具体认定的元素之外，可以任选地存在其他元素。如本文在说明书和权利要求中所使用的，“或”应当理解为具有与如上文所定义的“和/或”相同的含义。例如，当在元素列表中使用时，“或”或“和/或”应解释为包含性的，即包含元素列表的至少一个但任选地多于一个，并且任选地，额外的未列出的元素。只有明确指示相反的术语，如“仅一个”或“恰好一个”将指包含许多元素或元素列表中的恰好一个元素。因此，如果一个、多于一个或所有的组成员存在、用于给定的产品或过程或以其他方式与给定的产品或过程相关，则在组的一个或多个成员之间包含“或”的权利要求被认为是满足的，除非有相反指示。提供了恰好一个组成员存在、用于给定产品或过程或以其他方式与给定产品或过程相关的实施方案。提供了多于一个或所有的组成员存在、用于给定产品或过程或以其他方式与给定产品或过程相关的实施方案。可以修改任何一项或多项权利要求以明确排除任何实施方案、方面、特征、元素或特性或它们的任何组合。可以修改任何一项或多项权利要求以排除任何试剂、组合物、量、剂量、施用路径、细胞类型、靶标、细胞标志物、抗原、靶向部分或它们的组合。
在若干实施方案中，提供了对应于本文公开的任何核酸的氨基酸序列，同时考虑了核酸密码的简并性。此外，与本文明确公开的序列不同但具有功能相似性或等同性的那些序列(无论是核酸还是氨基酸)也涵盖在本公开的范围内。前述内容包括突变体、截短物、取代物或其他类型的修饰。
本文使用的任何标题或副标题用于组织目的而不应该用于限制本文公开的实施方案的范围。
序列表
<110> 恩卡尔塔公司
<120> 工程化自然杀伤细胞的增强扩增和细胞毒性及其用途
<130> NKT.064WO
<150> 63/073,671
<151> 2020-09-02
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1797
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> NK45-1 DNA
<400> 1
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgttattca accaagaagt tcaaattccc ttgaccgaaa gttactgtgg cccatgtcct 120
aaaaactgga tatgttacaa aaataactgc taccaatttt ttgatgagag taaaaactgg 180
tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa 240
gaggaccagg atttacttaa actggtgaag tcatatcatt ggatgggact agtacacatt 300
ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat ggctccattc tctcacccaa cctactaaca 360
ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca ctctatgcct cgagctttaa aggctatata 420
gaaaactgtt caactccaaa tacgtacatc tgcatgcaaa ggactgtgac cacgacgcca 480
gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca 540
gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt 600
gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt 660
atcacccttt actgccggag ggaccagagg ctgccccccg atgcccacaa gccccctggg 720
ggaggcagtt tccggacccc catccaagag gagcaggccg acgcccactc caccctggcc 780
aagatcagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 840
cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 900
cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg 960
tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 1020
gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag 1080
gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gcggctctgg cgagggaagg 1140
ggttccctgc ttacttgcgg cgacgtcgaa gagaatcccg gtccgatggc cctcccagta 1200
actgccctcc ttttgcccct cgcactcctt cttcatgccg ctcgccccaa ctgggtcaac 1260
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ctggagctcc aggtcatcag cttggagtct ggggacgcaa gcatccacga tacggttgaa 1440
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tgtaaggagt gcgaagagtt ggaagaaaaa aacatcaaag aatttcttca atccttcgtt 1560
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gctggtgggg cggtccacac ccggggcctg gattttgcgt gcgatatata catctgggca 1740
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<210> 2
<211> 599
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> NK45-5 AA
<400> 2
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro
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Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
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Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
195 200 205
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
210 215 220
Cys Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His
245 250 255
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260 265 270
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
275 280 285
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
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Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
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Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
340 345 350
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
355 360 365
Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu
370 375 380
Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val
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Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
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Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
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Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
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Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
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Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
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Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
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Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
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Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
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Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
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<210> 3
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<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> DNA NK19H-无Flag-1
<400> 3
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ccgtatacct ttggcggcgg caccaaactg gaaattaccg gtggcggtgg ctcgggcggt 420
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<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
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caggccctgc cccctcgcgg ctctggcgag ggaaggggtt ccctgcttac ttgcggcgac 1500
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Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val
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<213> 智人
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<221> MISC_FEATURE
<223> AA NK19H-无Flag-12
<400> 26
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Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu
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<212> DNA
<213> 智人
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<221> misc_feature
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<223> AA NK19-1
<400> 28
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Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe
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Thr Leu Tyr Cys

Claims (22)

1.增强用于免疫疗法的自然杀伤细胞的扩增的方法，其包括：
在培养基中将自然杀伤(NK)细胞群与第一饲养细胞群共培养第一时间段，
其中所述第一饲养细胞群包含经工程化改造以表达4-1BBL和膜结合白细胞介素-15(mbIL15)的细胞，
其中所述NK细胞群包含比所述饲养细胞群更少的细胞，
其中所述培养基包含白细胞介素2(IL2)、白细胞介素12(IL12)和白细胞介素18(IL18)，
其中所述第一时间段的共培养导致扩增的NK细胞群；
在所述第一时间段后，从所述饲养细胞中分离至少部分的所述扩增的NK细胞群，
在新鲜培养基中，将所述至少部分的所述扩增的NK细胞群与第二饲养细胞群共培养第二时间段，
其中所述NK细胞群包含比所述饲养细胞群更少的细胞，
其中所述培养基包含白细胞介素2(IL2)、白细胞介素12(IL12)和白细胞介素18(IL18)，
其中所述第二时间段的共培养导致进一步扩增的NK细胞群；和，任选地使用包含IL2、IL12和IL18的新鲜培养基重复所述分离和共培养步骤至少额外一次，从而导致所述进一步扩增的NK细胞群的额外扩增。
2.权利要求1的方法，其中与在不存在所述重复共培养的情况下用所述饲养细胞扩增NK细胞相比，所述扩增的NK细胞与额外的饲养细胞群和新鲜培养基的重复共培养导致增强的NK细胞扩增。
3.权利要求1的方法，其中所述IL2以约10单位/mL至约100单位/mL的浓度存在于所述培养基中，其中所述IL12以约10ng/mL至约100ng/mL的浓度存在于所述培养基中，并且其中所述IL18以约0.01ng/mL至约30ng/mL的浓度存在于所述培养基中，其中所述第一时间段和所述第二时间段为约7天，并且其中所述共培养重复至少三次。
4.权利要求3的方法，其中在每次共培养开始时所述NK细胞群以少于所述饲养细胞群约5倍至约25倍的量存在。
5.权利要求1的方法，其中通过荧光激活细胞分选(FACS)从所述饲养细胞分离所述扩增的NK细胞。
6.权利要求1的方法，其中所述饲养细胞群包含表达4-1BBL和mbIL15两者的K562细胞。
7.权利要求1的方法，其中所述重复共培养增加NK细胞活化标志物的表达。
8.权利要求1的方法，其中所述重复共培养增加所述扩增的NK细胞的细胞毒性和/或持久性。
9.权利要求1的方法，其进一步包括使所述NK细胞与编码嵌合抗原受体(CAR)的载体接触。
10.权利要求9的方法，其中所述CAR配置成靶向CD19、CD123、CD70、BCMA或自然杀伤受体D组(NKG2D)的配体中的一种或多种。
11.根据权利要求1至10中任一项的方法，其中所述IL2以小于约50单位/mL的浓度存在于所述培养基中，其中所述IL12以小于约30ng/mL的浓度存在于所述培养基中，并且其中所述IL18以小于约10ng/mL的浓度存在于所述培养基中。
12.根据权利要求1至10中任一项的方法，其中所述IL2以约20单位/mL至约50单位/mL的浓度存在于所述培养基中，其中所述IL12以约15ng/mL至约30ng/mL的浓度存在于所述培养基中，并且其中所述IL18以小于约5ng/mL的浓度存在于所述培养基中。
13.由权利要求1至12任一项所述的方法扩增的NK细胞在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
14.由权利要求1至12中任一项所述的方法扩增的NK细胞用于治疗癌症的用途。
15.工程化自然杀伤细胞群，其包含，
工程化嵌合受体，所述工程化嵌合受体配置成结合靶癌细胞上的标志物，并且在结合后诱导所述NK细胞发挥针对所述靶癌细胞的细胞毒性作用，
其中所述NK细胞通过在包含白细胞介素2(IL2)、白细胞介素12(IL12)和白细胞介素18(IL18)的培养基中将起始自然杀伤(NK)细胞群与第一饲养细胞群共培养第一次而扩增，
其中所述第一饲养细胞群包含经工程化改造以表达4-1BBL和膜结合白细胞介素-15(mbIL15)的细胞，
其中所述起始NK细胞群包含比所述第一饲养细胞群更少的细胞，
其中所述第一共培养导致中间扩增的NK细胞群；
在所述第一共培养后，从所述饲养细胞分离至少部分的所述中间扩增的NK细胞群，
在新鲜培养基中将所述至少部分的所述中间扩增的NK细胞群与第二饲养细胞群共培养至少第二次，
其中与所述第二饲养细胞群共培养的所述部分的NK细胞群包含比所述第二饲养细胞群更少的细胞，
其中所述至少第二共培养导致进一步扩增的NK细胞群。
16.权利要求15的NK细胞群，其中所述工程化嵌合受体由与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中的一个或多个在序列上至少95％相同的序列编码。
17.权利要求15的NK细胞群，其中所述工程化嵌合受体具有与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26或28中的一个或多个在序列上至少95％相同的氨基酸序列。
18.权利要求15至17中任一项所述的NK细胞在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
19.权利要求15至17中任一项所述的NK细胞用于治疗癌症的用途。
20.治疗有此需要的受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求15至17中任一项所述的工程化NK细胞。
21.增强用于免疫疗法的自然杀伤细胞的扩增的方法，其包括：
在培养基中将自然杀伤(NK)细胞群与第一饲养细胞群共培养第一时间段，
其中所述第一饲养细胞群包含经工程化改造以表达4-1BBL和膜结合白细胞介素-15(mbIL15)的细胞，
其中所述NK细胞群包含比所述饲养细胞群更少的细胞，
其中所述培养基包含白细胞介素2(IL2)、白细胞介素12(IL12)和白细胞介素18(IL18)，
其中所述IL2以约0.5ng/mL至约6.0ng/mL的浓度存在于所述培养基中，其中所述IL12以约10ng/mL至约100ng/mL的浓度存在于所述培养基中，并且其中所述IL18以约0.01ng/mL至约30ng/mL的浓度存在于所述培养基中，
其中所述第一时间段的共培养导致扩增的NK细胞群；
在所述第一时间段后，从所述饲养细胞中分离至少部分的所述扩增的NK细胞群，
在新鲜培养基中，将所述至少部分的所述扩增的NK细胞群与第二饲养细胞群共培养第二时间段，
其中所述NK细胞群包含比所述饲养细胞群更少的细胞，
其中所述培养基包含白细胞介素2(IL2)、白细胞介素12(IL12)和白细胞介素18(IL18)，
其中所述第二时间段的共培养导致进一步扩增的NK细胞群；和，任选地使用包含IL2、IL12和IL18的新鲜培养基重复所述分离和共培养步骤至少额外一次，从而导致所述进一步扩增的NK细胞群的额外扩增。
22.权利要求21的方法，其中所述第一时间段和所述第二时间段为约7天，并且其中所述共培养重复至少三次。
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