KR20230058167A - 조작된 자연 살해 세포의 향상된 증폭 및 세포 독성 및 그의 용도 - Google Patents

조작된 자연 살해 세포의 향상된 증폭 및 세포 독성 및 그의 용도 Download PDF

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제임스 바나비 트레이거
알렉산드라 레이다 리아나 라제틱
캐서린 잠보레츠
무하매드 나피설 라만
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엔카르타, 인크.
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Abstract

본원에 개시된 몇몇 구현예는 배양 중 NK 세포의 향상된 증폭을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 몇몇 구현예에서, 방법은 NK 세포 또는 다른 면역 세포의 증폭 중의 하나 이상의 시점에 배양 배지 보충제로 하나 이상의 가용성 인터류킨을 이용하며, 상기 증폭은 피더 세포 집단을 이용한다.

Description

조작된 자연 살해 세포의 향상된 증폭 및 세포 독성 및 그의 용도
관련 사건
본원은 2020년 9월 2일에 출원된 미국 가출원 제63/073,671호의 우선권을 주장하고, 이의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
분야
본원에 개시된 방법 및 조성물의 일부 구현예는 조작된 면역 세포, 예를 들어 자연 살해(Natural Killer, NK) 세포 및/또는 T 세포의 향상된 증폭 및/또는 향상된 세포 독성에 관한 것이다.
세포의 면역 요법을 위한 조작된 세포의 사용은, 질병 또는 손상된 세포를 표적화하고 파괴하는 면역 시스템의 다양한 측면을 활용함으로써 암 또는 기타 질병의 치료를 가능하게 한다. 상기 요법은 치료 관련 용량에 충분한 수의 조작된 세포를 필요로 한다.
ASCII 텍스트 파일로 참조에 의한 자료의 포함
본원은 이와 함께 동시에 제출되는 ASCII 텍스트 파일: 2021년 8월 31일, 126186 바이트의 크기로 만들어진 파일명: NKT064WO_ST25.txt에 함유된 서열 목록을 참조로 포함한다.
몇몇 구현예에서, 세포의 면역 요법에 사용하기 위한 면역 세포의 증폭을 향상시키는 다양한 방법이 제공된다. 예를 들어 몇몇 구현예에서, 면역 세포가 자극성 사이토카인으로 보충된 배지에서 피더 세포주(feeder cell line)와 반복적으로 공-배양되는 방법이 제공된다. 몇몇 구현예에서, 신선한 (예를 들어 사용되지 않은) 배지 및 피더 세포(feeder cell, '배양 보조 세포'라고도 함)는 공-배양의 각각의 반복의 초기에 도입된다. 몇몇 구현예에서, 각각의 공-배양은 피더 세포에 대해 증폭되는 세포의 특정 비율로 시작한다. 몇몇 구현예에서, 반복된 공-배양은 NK 세포의 유의하게 향상된 증폭(예를 들어 몇몇 구현예에 따르면 100만배 초과)을 유도한다. 몇몇 구현예에서, 면역 세포는 NK 세포이다. 몇몇 구현예에서, 증폭된 NK 세포는 (예를 들어 암 면역 요법에 사용하기 위해) 세포 조작, 예를 들어 키메라 수용체를 발현하도록 세포를 조작하는 것이 예상외로 가능하다. 몇몇 구현예에서, 피더 세포로 반복적으로 공-배양된 NK 세포 (또는 다른 면역 세포)는 다중-펄스 공-배양(multi-pulse co-culturing)을 겪지 않는 NK 세포보다 더 강력하게 그러한 키메라 수용체를 발현한다. 또한, 몇몇 구현예에서, 조작된 NK 세포는 예상외로 향상된 세포 독성을 나타낸다.
몇몇 구현예에서, 면역 요법에 사용하기 위한 자연 살해 세포의 증폭을 향상시키는 방법이 본원에 제공되되, 상기 방법은, 배양 배지에서 제 1 기간 동안 자연 살해(NK) 세포의 집단을 피더 세포의 제 1 집단과 공-배양하는 단계, 여기서 상기 제 1 피더 세포의 집단은 4-1BBL 및 막-결합 인터류킨-15(mbIL15)를 발현하도록 조작된 세포를 포함하고, 상기 NK 세포의 집단은 피더 세포의 집단보다 작으며, 상기 배양 배지는 인터류킨 2(IL2), 인터류킨 12(IL12), 및 인터류킨 18(IL18)을 포함하고, 상기 제 1 기간 동안 상기 공-배양은 NK 세포의 증폭된 집단을 초래함; 이어서 상기 제 1 기간 후에, 상기 피더 세포로부터 상기 NK 세포의 증폭된 집단의 적어도 일부를 분리하는 단계; 및 신선한 배양 배지에서, 제 2 기간 동안 상기 NK 세포의 증폭된 집단의 적어도 일부를 상기 피더 세포의 제 2 집단과 공-배양하는 단계, 여기서 상기 NK 세포의 집단은 상기 피더 세포의 집단보다 작고, 상기 배양 배지는 인터류킨 2(IL2), 인터류킨 12(IL12), 및 인터류킨 18(IL18)을 포함하며, 상기 제 2 기간 동안 상기 공-배양은 NK 세포의 추가 증폭된 집단을 초래함;을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 방법은 선택적으로, IL2, IL12, 및 IL18을 포함하는 신선한 배양 배지를 사용하여 상기 분리 및 공-배양 단계를 적어도 1 회 추가 반복함으로써, 상기 NK 세포의 추가 증폭된 집단의 추가 증폭을 초래하는 단계를 더 포함한다.
몇몇 구현예에서, 피더 세포의 추가 집단 및 신선한 배지와 증폭된 NK 세포의 반복된 공-배양은 반복된 공-배양의 부재 하에 NK 세포를 피더 세포와 함께 증폭시키는 것과 비교하여 향상된 NK 세포 증폭을 초래한다.
몇몇 구현예에서, IL2는 약 10 단위/mL 내지 약 100 단위/mL의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, IL2는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100 단위/mL의 농도 또는 상기 농도 중의 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내의 임의의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, IL12는 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, IL12는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100 ng/mL의 농도 또는 상기 농도 중의 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내의 임의의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, IL18은 약 0.01 ng/mL 내지 약 30 ng/mL의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, IL18은 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 ng/mL의 농도 또는 상기 농도 중의 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내의 임의의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, 제 1 기간 및 제 2 기간은 약 7일이다. 일부 구현예에서, 공-배양은 적어도 3회 반복된다. 일부 구현예에서, IL2는 약 10 단위/mL 내지 약 100 단위/mL의 농도로 배지에 존재하고, IL12는 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 농도로 배지에 존재하고, IL18은 약 0.01 ng/mL 내지 약 30 ng/mL의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, IL2는 약 10 단위/mL 내지 약 100 단위/mL의 농도로 배지에 존재하고, IL12는 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 농도로 배지에 존재하고, IL18은 약 0.01 ng/mL 내지 약 30 ng/mL의 농도로 배지에 존재하고, 여기서 제 1 기간 및 제 2 기간은 약 7일이고, 공-배양은 적어도 3회 반복된다. 단위/mL의 측면에서 IL2의 이들 농도는 IL2에 대한 WHO 국제 표준(National Institute for Biological Standards and Control [NIBSC] 86/500)에 따라 결정될 수 있다.
몇몇 구현예에서, IL2는 약 0.575 ng/mL 내지 약 5.75 ng/mL의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, IL2는 약 0.5 ng/mL 내지 약 6 ng/mL의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, IL2는 0.5, 0.575, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 5.75, 또는 6 ng/mL의 농도, 또는 상기 농도 중의 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내의 임의의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, IL12는 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, IL12는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100 ng/mL의 농도, 또는 상기 농도 중의 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내의 임의의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, IL18은 약 0.01 ng/mL 내지 약 30 ng/mL의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, IL18은 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 ng/mL의 농도, 또는 상기 농도 중의 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내의 임의의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, 제 1 기간 및 제 2 기간은 약 7일이다. 일부 구현예에서, 공-배양은 적어도 3회 반복된다. 일부 구현예에서, IL2는 약 0.575 ng/mL 내지 약 5.75 ng/mL(또는 약 0.5 ng/mL 내지 약 6 ng/mL)의 농도로 배지에 존재하고, IL12는 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 농도로 배지에 존재하고, IL18은 약 0.01 ng/mL 내지 약 30 ng/mL의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, IL2는 약 0.575 ng/mL 내지 약 5.75 ng/mL(또는 약 0.5 ng/mL 내지 약 6 ng/mL)의 농도로 배지에 존재하고, IL12는 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 농도로 배지에 존재하고, IL18은 약 0.01 ng/mL 내지 약 30 ng/mL의 농도로 배지에 존재하고, 여기서 제 1 기간 및 제 2 기간은 약 7일이고, 공-배양은 적어도 3회 반복된다.
몇몇 구현예에서, NK 세포의 집단은 각각의 공-배양의 초기에 피더 세포의 집단보다 약 5 내지 약 25 배 적은 양으로 존재한다. 몇몇 구현예에서, 증폭된 NK 세포는 형광-활성화 세포 분류(Fluorescence-Activated Cell Sorting; FACS)에 의해 피더 세포로부터 분리된다.
몇몇 구현예에서, 피더 세포 집단은 4-1BBL 및 mbIL15 둘 다를 발현하는 K562 세포를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 반복된 공-배양은 NK 세포 활성화의 마커의 발현을 증가시킨다. 추가로, 몇몇 구현예에서, 반복된 공-배양은 증폭된 NK 세포의 세포독성 및/또는 지속성을 증가시킨다.
몇몇 구현예에서, 상기 방법은 NK 세포를 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 벡터와 접촉시키는 것을 더 포함한다. 몇몇 구현예에서, CAR은 CD19, CD123, CD70, BCMA, 또는 자연 살해 수용체 그룹 D(NKG2D)의 리간드 중의 하나 이상을 표적화하도록 구성된다.
일부 구현예에서, IL2는 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 단위/mL 미만의 농도, 또는 상기 농도 중의 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내의 임의의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, IL2는 약 50 단위/mL 미만의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, IL12는 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 ng/mL 미만의 농도, 또는 상기 농도 중의 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내의 임의의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, IL12는 약 30 ng/mL 미만의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, IL18은 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 ng/mL 미만의 농도, 또는 상기 농도 중의 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내의 임의의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, IL18은 약 10 ng/mL 미만의 농도로 배지에 존재한다. 몇몇 구현예에서, IL2는 약 50 단위/mL 미만의 농도로 배지에 존재하고, IL12는 약 30 ng/mL 미만의 농도로 배지에 존재하고, IL18은 약 10 ng/mL 미만의 농도로 배지에 존재한다.
일부 구현예에서, IL2는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 mL 미만의 농도, 또는 상기 농도 중의 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내의 임의의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, IL2는 약 6 ng/mL 미만의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, IL12는 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 ng/mL 미만의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, IL12는 약 30 ng/mL 미만의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, IL18은 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 ng/mL 미만의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, IL18은 약 10 ng/mL 미만의 농도로 배지에 존재한다. 몇몇 구현예에서, IL2는 약 6 ng/mL 미만의 농도로 배지에 존재하고, IL12는 약 30 ng/mL 미만의 농도로 배지에 존재하고, IL18은 약 10 ng/mL 미만의 농도로 배지에 존재한다.
몇몇 구현예에서, IL2는 약 20 단위/mL 내지 약 50 단위/mL의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, IL2는 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 단위/mL의 농도, 또는 상기 농도 중의 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내의 임의의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, IL12는 약 15 ng/mL 내지 약 30 ng/mL의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, IL12는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 ng/mL의 농도, 또는 상기 농도 중의 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내의 임의의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, IL18은 약 5 ng/mL 미만의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, IL18은 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 1, 2, 3, 4, 또는 5 ng/mL 미만의 농도, 또는 상기 농도 중의 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내의 임의의 농도로 배지에 존재한다. 몇몇 구현예에서, IL2는 약 20 단위/mL 내지 약 50 단위/mL의 농도로 배지에 존재하고, 여기서 IL12는 약 15 ng/mL 내지 약 30 ng/mL의 농도로 배지에 존재하고, IL18은 약 5 ng/mL 미만의 농도로 배지에 존재한다.
몇몇 구현예에서, IL2는 약 1.15 ng/mL 내지 약 2.875 단위/mL의 농도로 배지에 존재한다. 몇몇 구현예에서, IL2는 약 1 ng/mL 내지 약 3 단위/mL의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, IL2는 약 1, 1.15, 1.5, 2, 2.5, 2.875, 또는 3 ng/mL의 농도로, 또는 상기 농도 중의 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내의 임의의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, IL12는 약 15 ng/mL 내지 약 30 ng/mL의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, IL12는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 ng/mL의 농도로, 또는 상기 농도 중의 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내의 임의의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, IL18은 약 5 ng/mL 미만의 농도로 배지에 존재한다. 일부 구현예에서, IL18은 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 1, 2, 3, 4, 또는 5 ng/mL 미만의 농도로, 또는 상기 농도 중의 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내의 임의의 농도로 배지에 존재한다. 몇몇 구현예에서, IL2는 약 1.15 ng/mL 내지 약 2.875 ng/mL의 농도로 배지에 존재하고, 여기서 IL12는 약 15 ng/mL 내지 약 30 ng/mL의 농도로 배지에 존재하고, 여기서 IL18은 약 5 ng/mL 미만의 농도로 배지에 존재한다. 몇몇 구현예에서, IL2는 약 1 ng/mL 내지 약 3 ng/mL의 농도로 배지에 존재하고, 여기서 IL12는 약 15 ng/mL 내지 약 30 ng/mL의 농도로 배지에 존재하고, 여기서 IL18은 약 5 ng/mL 미만의 농도로 배지에 존재한다.
또한, 암 치료용 약제의 제조를 위한 본원에 개시된 방법에 의해 증폭된 NK 세포의 용도가 본원에 제공된다. 또한, 암의 치료를 위한 본원에 개시된 방법에 의해 증폭된 NK 세포의 용도가 본원에 제공된다.
몇몇 구현예에서, 조작된 자연 살해(NK) 세포의 집단이 본원에 제공되되, 표적 암 세포(target cancer cell) 상의 마커에 결합하고, 결합시, NK 세포가 상기 표적 암 세포에 대해 세포독성 효과를 발휘하는 것을 유도하도록 구성된 조작된 키메라 수용체, 여기서 상기 NK 세포는 배양 배지 인터류킨 2(IL2), 인터류킨 12(IL12), 및 인터류킨 18(IL18)에서, 피더 세포의 제 1 집단과 함께 자연 살해(NK) 세포의 출발 집단을 제 1 시간 동안 공-배양함으로써 증폭되고, 상기 제 1 피더 세포 집단은 4-1BBL 및 막-결합 인터류킨-15(mbIL15)를 발현하도록 조작된 세포를 포함하며, 상기 NK 세포의 출발 집단은 상기 피더 세포의 집단보다 작고; 상기 제 1 공-배양은 NK 세포의 중간 증폭된 집단(intermediate expanded population)을 초래함;을 포함하되, 상기 제 1 공-배양 후에, 상기 NK 세포의 중간 증폭된 집단의 적어도 일부를 상기 피더 세포로부터 분리하고, 신선한 배양 배지에서, 상기 NK 세포의 중간 증폭된 집단의 적어도 일부를 상기 피더 세포의 제 2 집단과 함께 적어도 제 2 시간 동안 공-배양하되, 상기 피더 세포의 제 2 집단과 공-배양된 상기 NK 세포의 집단의 일부는 피더 세포의 제 2 집단보다 작고, 적어도 제 2 공-배양은 NK 세포의 추가 증폭된 집단을 초래한다.
몇몇 구현예에서, 조작된 키메라 수용체는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 또는 27에 대해 서열에서 95% 이상 동일한 서열에 의해 암호화된다. 몇몇 구현예에서, 조작된 키메라 수용체는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28에 대해 서열에서 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
또한, 암 치료용 약제의 제조를 위한 및/또는 암의 치료를 위한 본원에 개시된 바와 같은 조작된 NK 세포의 용도가 본원에 제공된다.
또한, 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 본원에 개시된 바와 같은 조작된 NK의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
하기 도면의 설명은 여기 개시된 발명의 비제한적인 구현예를 나타내는 실험 및 결과에 관한 것이다.
도 1a 및 1b는, 여기 개시된 구현예에 따라 NK 세포의 증폭을 향상시키는 데 사용된 증폭 프로토콜의 비제한적인 예를 도시한다.
도 2는, 여기 개시된 것의 비제한적인 구현예를 포함한 다양한 증폭 방법을 사용하는 NK 세포의 배수 증폭을 비교하는 데이터를 도시한다.
도 3a-3b는, 상이한 조건 하에서 4명의 상이한 도너 유래 NK 세포의 증폭과 관련된 데이터를 도시한다. 도 3a는, 피더 세포 단독으로(상단 열) 또는 사이토카인 보충(하단 열)을 이용하여 증폭했을 경우 NK 세포의 표면 상에서 NKG2D의 발현을 측정한 유세포 분석 데이터를 도시한다. 도 3b는, 다양한 조건 하에서 키메라 수용체 구조체를 함유한 NKG2D로의 형질 도입(NKX101)을 나타내는 평균 형광 강도를 측정한다.
도 4는, 피더 세포 단독 또는 사이토카인 보충을 이용한 조건 하에서 증폭 후 다양한 시점에 NK 세포의 세포 독성과 관련된 데이터를 도시한다.
도 5a-5b는, NK 세포에 의한 기억 표현형을 나타내는 특정 마커의 발현과 관련된 데이터를 도시한다.
도 6a-6b은, 증폭 중 나타낸 사이토카인 자극을 하거나 하지 않은 채 증폭된 NK 세포의 항-종양 활성과 관련된 생체 내 데이터를 도시한다.
도 7a-7b는 다양한 조건 하에서 NK 세포 증폭에 관한 것이다. 도 7a는, IL12/18에 대해 과포화, 포화 또는 하위 포화인 것으로 결정된 다양한 조건을 도시한다. 도 7b는 다양한 배양 조건 하에서 NK 세포 증식 데이터를 도시한다.
도 8은, 배양 배지 내 IL12 및/또는 IL18의 농도를 달리하여 배양된 NK 세포에 의한 인터페론 감마의 방출과 관련된 데이터를 도시한다.
도 9a-9h는, 나타낸 조건에서 배양 7 일 후 NK 세포 증폭의 평가에 관한 것이다. 도 9a는 각 배양 그룹에 대한 요약 데이터를 도시한다. 도 9b는 그룹의 통계적인 비교를 제공한다. 도 9c는, 4ng/ml의 IL18과 함께 다양한 농도의 IL12를 수반하는 특정 적정 데이터 세트에 대한 배수 증폭 데이터(7 일)를 도시한다. 도 9d는 20ng/ml의 IL18로 유사한 데이터를 도시한다. 도 9e는 20ng/ml의 IL18, 40IU/ml의 IL2 및 지시된 농도의 IL12를 사용한 배양 7 일째의 조작된 NK 세포의 생존 능력을 나타낸다. 도 9f는 20ng/ml의 IL18, 400IU/ml의 IL2 및 지시된 농도의 IL12를 사용한 배양 8 일째의 조작된 NK 세포의 생존 능력을 나타낸다. 도 9g는 4ng/ml의 IL18, 40IU/ml의 IL2 및 지시된 농도의 IL12를 사용한 배양 7 일째의 조작된 NK 세포의 생존 능력을 나타낸다. 도 9h는 4ng/ml의 IL18, 400IU/ml의 IL2 및 지시된 농도의 IL12를 사용한 배양 8 일째의 조작된 NK 세포의 생존 능력을 나타낸다.
도 10a-10b는 NK 세포의 세포 독성 평가에 관한 것이다. 도 10a는 배양 8 일 후 각 배양 그룹에서 NK 세포의 세포 독성에 대한 요약 데이터를 도시한다. 도 10b는 세포 독성의 통계적인 비교를 제공한다.
도 11a-11b는 NK 세포의 세포 독성 평가에 관한 것이다. 도 11a는 배양 15 일 후 각 배양 그룹에서 NK 세포의 세포 독성에 대한 요약 데이터를 도시한다. 도 11b는 세포 독성의 통계적인 비교를 제공한다.
도 12a-12b는, 2명의 도너 유래 키메라 수용체 구조체로 형질 도입되고, 다양한 조건에서 배양된 NK 세포에 대한 발현 데이터를 도시한다.
도 13a-13b는, 2명의 추가 도너 유래 키메라 수용체 구조체로 형질 도입되고, 다양한 조건에서 배양된 NK 세포에 대한 발현 데이터를 도시한다.
도 14a-14b는 세포 독성 데이터를 도시한다. 도 14a는, NKG2D 리간드를 표적화하는 키메라 수용체로 형질 도입되고, 지시된 조건에서 배양된 NK 세포의 세포 독성과 관련된 요약 데이터를 도시한다. 도 14b는 그룹의 통계적인 비교를 도시한다.
도 15a-15d는, 지시된 조건 하에서 배양된 후 NKG2D 표적화 키메라 수용체로 형질 도입된 NK 세포의 세포 독성 효과에 관한 것이다. 도 15a 및 15b는, GFP 암호화 벡터 또는 NKG2D 리간드를 표적화하는 키메라 수용체를 암호화하는 벡터 중 어느 하나로 형질 도입 후 13 일에 2 명의 상이한 도너 유래 NK 세포의 세포 독성에 관한 데이터를 도시한다. 도 15c 및 15d는 형질 도입 후 21 일에 동일한 2 명의 도너 유래 대응하는 세포 독성 데이터를 도시한다.
도 16a-16b는 NK 세포의 표현형과 관련된 데이터를 도시한다. 도 16a는, 지시된 배양 조건에서 시간의 흐름에 따라 NK 세포에 의한 기억 유사 표현형과 연관된 마커의 발현과 관련된 데이터를 도시한다. 도 16b는, 배양 중 시간의 흐름에 따른 마커 발현의 진행을 나타내는 유세포 분석 데이터를 도시한다.
도 17a-17d는, 다양한 배양 조건에서 NK 세포에 의한 선택된 마커와 관련된 요약 발현 데이터를 도시한다. 도 17a는 CD62 리간드와 관련된 발현 데이터를 도시하고, 도 17b는 NKG2C의 발현을 도시하고, 도 17c는 CD57의 발현을 도시하며, 도 17d는 CD62L 및 NKG2C 둘 다의 발현을 도시한다.
도 18은, 형질 도입 후 21 일에 GFP 및 또는 NKG2D 리간드 유도된 키메라 수용체 중 어느 하나를 발현하는 NK 세포에 대한 세포 독성 데이터를 도시한다.
도 19는 달라진 배양 조건 하에서 성장된 NK 세포에 대한 세포의 생존 능력 및 증폭 데이터를 도시한다.
도 20은, 항-CD19 CAR로 형질 도입되고 지시된 조건을 이용하여 배양된 NK 세포에 대한 (Flag 태그에 기반한) 발현 데이터를 도시한다. 상기 데이터는 증폭 15 일에 수집되었다.
도 21은, 항-CD19 CAR로 형질 도입되고 지시된 조건을 이용하여 배양된 NK 세포에 대한 (Flag 태그에 기반한) 발현 데이터를 도시한다. 상기 데이터는 증폭 22 일에 수집되었다.
도 22a-22c는, 항-CD19 CAR을 발현하는 NK 세포의 세포 독성과 관련된 데이터를 도시한다. NK 세포는 지시된 조건을 이용하여 증폭되었고, 도 22a의 지시된 E:T 비율을 이용하여 Nalm6 세포로 도전되었다(3 명의 도너 평균). 도 22b는 세포 독성 데이터의 요약을 도시한다. 도 22c는 이펙터 대 표적 비율의 함수로 세포 독성 데이터를 도시한다.
도 23은, 간세포 암종 이종 이식 모델에서 NKG2D 리간드를 표적화하는 키메라 수용체를 발현하는 NK 세포의 세포 독성을 평가하는 실험 설정의 개략도를 도시한다.
도 24는 지시된 처리 하에서 시간의 흐름에 따른 마우스의 종양 부담의 요약을 도시한다.
도 25는, 생체 내에서 NK 세포의 세포 독성에 대한 증폭 배양 조건의 영향을 평가하는 개략적인 실험 설정을 도시한다.
도 26a-26f는, 세포 독성, 생존 데이터, NK 세포의 지속성과 관련된 데이터 및 신선한 또는 동결 보존된 NK 세포에서 CAR 발현과 관련된 데이터를 도시한다. 도 26a는, 이종 이식 모델에서 Nalm6 세포에 대해 지시된 조건 하에서 증폭된 NK 세포의 세포 독성과 관련된 데이터를 도시한다. 도 26b는 지시된 치료를 받은 마우스에 대한 생존 곡선을 도시한다. 도 26c는, 증폭 배양 조건에 근거하여 분리된, 주입 후 18 일에 뮤린 혈액 내 인간 NK 세포의 검출과 관련된 데이터를 도시한다. 도 26d는, 증폭 배양 조건에 근거하여 분리된, 주입 후 18 일에 뮤린 혈액 내 CAR 양성 NK 세포의 검출과 관련된 데이터를 도시한다. 도 26e는, 증폭 15 일 및 추가 자극 분자의 존재 또는 부재 하에 항-CD19 CAR의 비제한적인 구현예를 발현하는 (신선한 또는 동결 보존된) NK 세포의 백분율과 관련된 발현 데이터를 도시한다. 도 26f는, 증폭 22 일 및 추가 자극 분자의 존재 또는 부재 하에 항-CD19 CAR의 비제한적인 구현예를 발현하는 (신선한 또는 동결 보존된) NK 세포의 백분율과 관련된 발현 데이터를 도시한다.
도 27a-27c는 여기 개시된 구현예에 따라 다양한 CD19 유도된 CAR의 생체 내 효능에 관한 것이다. 도 27a는, 생체 내에서 다양한 CD19 유도된 CAR 구조체를 발현하는 인간화된 NK 세포의 유효성을 평가하기 위한 실험 프로토콜의 개략적인 묘사를 도시한다. 테스트된 다양한 실험 그룹은 지시된 바와 같다. "IL12/IL18" 표시된 세포의 경우, 세포가 여기 개시된 구현예에 따라 가용성 IL12 및/또는 IL18의 존재 하에 증폭되었다. 도 27b 및 27c는 Nalm6 종양 세포로 투약되고 지시된 구조체로 치료된 동물의 생물 발광 데이터를 도시한다.
도 28a-28j는 도 27b-27c의 생물 발광 데이터의 그래프 묘사를 도시한다. 도 28a는 형질 도입되지 않은 NK 세포를 받은 동물의 (광자/초 플럭스로서) 생물 발광을 도시한다. 도 28b는 비히클로서 PBS를 받은 동물에서 측정된 플럭스를 도시한다. 도 28c는, (CAR의 비제한적인 예로) NK19 NF2 CAR을 발현하는 사전 동결된 NK 세포를 받은 동물에서 측정된 플럭스를 도시한다. 도 28d는, IL12 및/또는 IL18을 이용하여 증폭된 (CAR의 비제한적인 예로) NK19 NF2 CAR을 발현하는 사전 동결된 NK 세포를 받은 동물에서 측정된 플럭스를 도시한다. 도 28e 및 도 28f는, (CAR의 비제한적인 예로) NK19 NF2 CAR을 발현하는 신선한 NK 세포를 받은 동물에서 측정된 플럭스를 도시한다. 도 28g 및 도 28h는, IL12 및/또는 IL18을 이용하여 증폭된 (CAR의 비제한적인 예로) NK19 NF2 CAR을 발현하는 사전에 신선한 NK 세포를 받은 동물에서 측정된 플럭스를 도시한다. 도 28i는, 종양 접종 후 처음 30 일에 걸쳐 다양한 그룹에서 측정된 생물 발광을 묘사하는 선 그래프를 도시한다. 도 28j는, 종양 접종 후 처음 56 일에 걸쳐 다양한 그룹에서 측정된 생물 발광을 묘사하는 선 그래프를 도시한다.
도 29는 지시된 요법을 받은 경우 시간의 흐름에 따른 마우스의 몸무게와 관련된 데이터를 도시한다.
도 30a-30c는, (여기 개시된 바와 같이) CAR을 발현하도록 조작되고, 하나 이상의 자극성 사이토카인의 존재 또는 부재 하에 증폭된 NK 세포를 특성화하는 데이터와 관련된 데이터를 도시한다. 도 30a는 시간의 흐름에 따라 동물의 혈액에서 CAR을 발현하는 NK 세포의 백분율과 관련된 데이터를 도시한다. 도 30b는, 50 일의 기간에 걸쳐 동물의 혈액에서 CAR을 발현하는 NK 세포의 백분율과 관련된 데이터를 도시한다. 도 30c는, 테스트된 살아있는 세포의 수에 근거하고, 시간의 흐름에 따라 CAR을 발현하는 NK 세포의 백분율과 관련된 데이터를 도시한다.
도 31a-31c는, 항-CD19 CAR의 발현 및 어떤 세포가 CAR을 발현하는지의 특성화와 관련된 3 마리의 상이한 마우스(각각 도 31a, 31b, 및 31c) 유래 데이터를 도시한다.
도 32a-32c는, 항-CD19 CAR의 발현 및 어떤 세포가 CAR을 발현하는지의 특성화와 관련된 3 마리의 상이한 마우스(각각 도 32a, 32b, 및 32c) 유래 데이터를 도시한다.
도 33a-33c는 생체 내 투여(도 27a의 프로토콜) 후 4 일에 수집된 혈액 샘플의 요약 발현 데이터를 도시한다. 도 33a는 지시된 실험 그룹에 대한 전혈 샘플 유래 CD3-CD56+ NK 세포의 백분율을 도시한다. 도 33b는 각 실험 그룹에 대한 특정 항-CD19 CAR을 발현하는 NK 세포의 백분율을 도시한다. 도 33c는 각 실험 그룹에 대해 검출된 GFP 양성 종양 세포의 수와 관련된 데이터를 도시한다.
도 34a-34c는 생체 내 투여(도 27a의 프로토콜) 후 12 일에 수집된 혈액 샘플의 요약 발현 데이터를 도시한다. 도 34a는 지시된 실험 그룹에 대한 전혈 샘플 유래 CD3-CD56+ NK 세포의 백분율을 도시한다. 도 34b는 각 실험 그룹에 대한 특정 항-CD19 CAR을 발현하는 NK 세포의 백분율을 도시한다. 도 34c는 각 실험 그룹에 대해 검출된 GFP 양성 종양 세포의 수와 관련된 데이터를 도시한다.
도 35a-35e는 생체 내 투여(도 27a의 프로토콜) 후 18 일에 수집된 혈액 샘플의 요약 발현 데이터를 도시한다. 도 35a는 지시된 실험 그룹에 대한 전혈 샘플 유래 CD3-CD56+ NK 세포의 백분율을 도시한다. 도 35b는, PE(phycoerythrin)-접합된 항체를 이용하여 측정된 바와 같은 각 실험 그룹에 대한 CD19 양성 종양 세포의 백분율을 도시한다. 도 35c는 각 실험 그룹에 대해 검출된 GFP 양성 종양 세포의 수와 관련된 데이터를 도시한다. 도 35d는, 항 CD19 FC 항체를 이용하여 측정된 바와 같은 각 실험 그룹에 대한 특정 항-CD19 CAR을 발현하는 NK 세포의 백분율을 도시한다. 도 35e는 CD19 CAR을 발현하는 각 처리 그룹에서 NK 세포의 백분율을 도시한다.
도 36은, 10,000 개의 백혈구 당 NK 세포의 수로 측정된 바와 같은 두 개 용량의 NK 세포 각각에 대해 항-CD19 CAR을 발현하는 NK 세포의 반감기와 관련된 4 주에 걸쳐 수집된 데이터를 도시한다. 두 개 용량은, (i) 항-CD19 CAR을 발현하는 2백만 개의 NK 세포 및 (ii) 항-CD19 CAR을 발현하는 5백만 개의 NK 세포이었다. 상기 데이터는 제 3 용량의 NK 세포가 투여된 후에 수집되었다.
도 37은, NKG2D 리간드를 표적화하는 CAR을 발현하도록 조작되고, 추가의 자극성 사이토카인을 사용하지 않고 증폭된 동결 보존된 NK 세포의 반감기에 대해 수집된 데이터를 도시한다.
도 38a-38d는 종양 세포주에 대한 다양한 CD19-표적화 CAR(또는 비-형질도입된 NK 세포)의 비교 용량-반응 세포독성 데이터를 나타낸다. 도 38a는 24 시간 후에 높은 CD19-발현 Nalm6 종양 세포에 대한 세포독성을 나타낸다. 도 38b는 72 시간 후에 Nalm6에 대한 세포독성을 나타낸다. 도 38c는 24시간 후에, Nalm6 세포보다 더 낮은 수준의 CD19를 나타내는 Reh 종양 세포에 대한 세포독성을 나타낸다. 도 38d는 72 시간 후에 Reh 세포에 대한 세포독성을 나타낸다.
도 39a-39b는 CD19-CAR의 비제한적인 구현예를 발현하고 덱사메타손의 존재 및 부재 하에 NK 세포(도 39a) 또는 NK 세포(도 39a)의 세포독성에 관한 데이터를 나타낸다.
도 40a-40b는 시간 경과에 따른 동물의 혈류에서의 CAR-발현 NK(데이터는 CAR의 비제한적인 구현예인 것으로 나타내고, 여기서 CD19-표적화 CAR임)의 수명(예를 들어 반감기)과 관련된 데이터(도 40a-40b의 상이한 스케일)를 나타낸다.
도 41a-41b는 제대혈(CB) 또는 말초혈(PB)로부터 수득된 NK 세포가 IL2로 배지를 보충하면서 증폭 과정 동안 다수의 시점에서 1:10의 비로 피더 세포로 펄싱된 시간 경과에 따른 NK 세포 증폭 데이터에 관한 것이다. 도 41a는 시간 경과에 따른 NK 세포의 증폭의 선 그래프를 나타낸다. 도 41b는 요약 증폭 데이터를 나타낸다.
도 42a-42b는 제대혈(CB) 또는 말초혈(PB)로부터 수득된 NK 세포가 IL2 및 IL12 둘 다로 배지를 보충하면서 증폭 과정 동안 다수의 시점에서 1:10의 비로 피더 세포로 펄싱된 시간 경과에 따른 NK 세포 증폭 데이터에 관한 것이다. 도 42a는 시간 경과에 따른 NK 세포의 증폭의 선 그래프를 나타낸다. 도 42b는 요약 증폭 데이터(summary expansion data)를 보여준다.
도 43a-43b는 제대혈(CB) 또는 말초혈(PB)로부터 수득된 NK 세포가 IL2 및 IL18 둘 다로 배지를 보충하면서 증폭 과정 동안 다수의 시점에서 1:10의 비로 피더 세포로 펄싱된 시간 경과에 따른 NK 세포 증폭 데이터에 관한 것이다. 도 43a는 시간 경과에 따른 NK 세포의 증폭의 선 그래프를 보여준다. 도 43b는 요약 증폭 데이터를 보여준다.
도 44a-44b는 제대혈(CB) 또는 말초혈(PB)로부터 수득된 NK 세포가 IL2 및 IL12 및 IL18의 조합으로 배지를 보충하면서 증폭 과정 동안 다수의 시점에서 1:10의 비로 피더 세포로 펄싱된 시간 경과에 따른 NK 세포 증폭 데이터에 관한 것이다. 도 44a는 시간 경과에 따른 NK 세포의 증폭의 선 그래프를 보여준다. 도 44b는 요약 증폭 데이터를 보여준다.
도 45a-45e는 피더 세포의 다수의 펄스 및 배지를 보충하는데 사용된 지시된 사이토카인 조건의 결과로서의 CD3-양성 세포의 증폭에 관한 것이다. 도면에서 스타는 NK 세포가 신선한 배지(지시된 경우, 배지 성분을 보충하는 것을 포함함)로 신선한 피더 세포 상에 리플레이팅된 때를 나타낸다. 도 45a는 고농도의 IL2(400 단위/mL)가 배지를 보충하는데 사용되었을 때의 데이터를 보여준다. 도 45b는 배지를 IL12(뿐만 아니라 40 단위/mL의 IL2)로 보충하는 것에 관련된 데이터를 보여준다. 도 45c는 배지를 IL18(뿐만 아니라 40 단위/mL의 IL2)로 보충하는 것에 관련된 데이터를 보여준다. 도 45d는 배지를 IL12 및 IL18 둘 다(뿐만 아니라 40 단위/mL의 IL2)로 보충하는 것에 관련된 데이터를 보여준다. 도 45e는 대조군 증폭(신선한 피더 세포 및 40 단위/mL의 IL2로 펄싱, 그러나 추가의 사이토카인은 없음)에 관련된 데이터를 보여준다.
도 46a 내지 46j는 활성화 NKG2C 수용체의 발현에 관련된 것이다. 도면에서 스타는 NK 세포가 신선한 배지(지시된 경우, 배지 성분을 보충하는 것을 포함함)로 신선한 피더 세포 상에 리플레이팅된 때를 나타낸다. 도 46a는 고농도의 IL2(400 단위/mL)가 NKG2C 발현에 대해 양성인 NK 세포의 백분율로서 제시된 데이터로 배지를 보충하는데 사용되었을 때의 데이터를 보여준다. 도 46b는 고농도의 IL2(400 단위/mL)가 NKG2C 발현을 나타내는 전체 평균 형광 강도(MFI)로서 제시된 데이터로 배지를 보충하는데 사용되었을 때의 데이터를 보여준다. 도 46c는 NKG2C 발현에 대해 양성인 NK 세포의 백분율로서 제시된 데이터로 배지를 IL12(뿐만 아니라 40 단위/mL의 IL2)로 보충하는 것에 관련된 데이터를 보여준다. 도 46d는 NKG2C 발현을 나타내는 전체 MFI로서 제시된 데이터로 배지를 IL12(뿐만 아니라 40 단위/mL IL2)로 보충하는 것에 관련된 데이터를 보여준다. 도 46e는 NKG2C 발현에 대해 양성인 NK 세포의 백분율로서 제시된 데이터와 함께 IL18(뿐만 아니라 40 단위/mL의 IL2)로 배지를 보충하는 것과 관련된 데이터를 보여준다. 도 46f는 NKG2C 발현을 나타내기 위해 전체 MFI로서 제시된 데이터와 함께 IL18(뿐만 아니라 40 단위/mL의 IL2)로 배지를 보충하는 것과 관련된 데이터를 보여준다. 도 46g는 NKG2C 발현에 대해 양성인 NK 세포의 백분율로서 제시된 데이터와 함께 IL12 및 IL18(뿐만 아니라 40 단위/mL의 IL2) 둘 다로 배지를 보충하는 것과 관련된 데이터를 보여준다. 도 46h는 NKG2C 발현을 나타내기 위해 전체 MFI로서 제시된 데이터와 함께 IL12 및 IL18(뿐만 아니라 40 단위/mL의 IL2) 둘 다로 배지를 보충하는 것과 관련된 데이터를 보여준다. 도 45i는 NKG2C 발현에 대해 양성인 NK 세포의 백분율로서 제시된 데이터와 함께 대조군 증폭(새로운 피더 세포 및 40 단위/mL의 IL2로 펄싱, 그러나 추가의 사이토카인은 없음)과 관련된 데이터를 보여준다. 도 45j는 NKG2C 발현을 나타내기 위해 전체 MFI로서 제시된 데이터와 함께 대조군 증폭(새로운 피더 세포 및 40 단위/mL의 IL2로 펄싱, 그러나 추가의 사이토카인은 없음)과 관련된 데이터를 보여준다.
도 47a 내지 도 47b는 0 일 ("SOP")에서의 단일 피더 펄스(feeder pulses)을 이용한 증폭 방법과 비교하여, 0 일 및 7 일에 2개의 피더 펄스("2X") 또는 0 일, 7 일 및 14 일에 3개의 피더 펄스("3X")로 증폭된 NK 세포 상의 활성화(도 47a) 및 억제(도 47b) 마커의 증가를 보여준다. "순수한 NK"는 피더 세포와 함께 배양된 세포의 초기 집단이 정제된 군이다. "PBM"은 피더 세포와 함께 배양된 세포의 초기 집단이 말초 혈액 단핵 세포, 정제된 NK 세포가 아닌 군이다.
도 48a 내지 도 48b는 0 일(원) 또는 7 일(사각형)에서의 활성화(도 48a) 또는 억제(도 48b) 마커의 발현의 추가의 평가에 관한 것이다.
암 면역 요법 또는 기타 질병에 대한 세포 요법이 관심 구조체를 발현하는 세포를 조작하는 능력의 측면에서 상당한 진전이 있었으나, 환자 투여를 위해 상기 세포들의 임상적으로 적절한 수에 대한 필요성이 여전히 존재한다. 조작되고 나중에 투여될 근본적인 선천 면역 세포가 다른 면역 세포 유형보다 덜 우세한 경우 이는 특히 중요하다. 상기는, 실용적이지 않을 수 있는 보다 많은 양의 출발 물질로 시작하거나, 관심 면역 세포, 예를 들어 NK 세포를 (일부 경우에 바람직하게는) 증폭시키는 보다 효율적인 방법 및 조성물을 개발할 것을 요구한다. 따라서, 몇몇 구현예에서, NK 세포 (또는 다른 면역 세포)의 향상된 증폭을 유리하게 허용하고 또한 상기 세포들의 향상된 세포 독성을 허용하는 방법 및 조성물이 여기 제공된다.
몇몇 구현예에서, 여기 개시된 변형된 "피더(feeder)" 세포와 출발 면역 세포 집단을 공-배양하고, 증폭 중 특정 시점에 다양한 사이토카인으로 공-배양물을 보충하는 것에서 유래된 증폭 및 활성화된 NK 세포 집단이 제공된다.
면역 세포 증폭에 사용하기 위한 세포
몇몇 구현예에서, 세포주가 증폭될 예정인 면역 세포 집단과의 공-배양에 사용된다. 상기 세포주는, "피더 세포(혹은, '지지세포')(feeder cells)"로도 지칭될 수 있는 "자극성 세포(stimulatory cells)"로 여기서 지칭된다. 몇몇 구현예에서, 면역 세포의 전체 집단이 증폭될 수 있으나, 몇몇 구현예에서 선택된 면역 세포 하위 집단이 증폭될 수 있다. 예를 들어 몇몇 구현예에서, 기타 면역 세포 하위 집단(예를 들어 T 세포)에 비례하여 NK 세포가 증폭된다. 다른 구현예에서, NK 세포 및 T 세포 둘 다가 증폭된다. 몇몇 구현예에서, 피더 세포는 그 자체가 유전적으로 변형된다. 일부 구현예에서, 피더 세포는 NK 세포에 억제 효과를 갖는 MHC I 분자를 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 피더 세포는 MHC I 발현이 완전히 결여될 필요는 없으나, 야생형 세포보다 더 낮은 수준으로 MHC I 분자를 발현할 수 있다. 예를 들어 몇몇 구현예에서, 야생형 세포가 MHC를 X 수준으로 발현할 경우, 사용된 세포주는 X의 95% 미만, X의 90% 미만, X의 85% 미만, X의 80% 미만, X의 70% 미만, X의 50% 미만, X의 25% 미만 수준 및 나열된 수치 사이(및 포함하는) 임의의 발현 수준으로 MHC를 발현할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 자극성 세포는 불멸화된, 예를 들어 암 세포주이다. 그러나, 몇몇 구현예에서, 자극성 세포는 1차 세포이다.
다양한 세포 유형이 구현예에 따라 피더 세포로 사용될 수 있다. 상기는, 다른 것들 중 K562 세포, 특정 빌름스 종양 세포주(예를 들어 빌름스 종양 세포주 HFWT), 자궁 내막 종양 세포(예를 들어 HHUA), 흑색종 세포(예를 들어 HMV-II), 간모세포종 세포(예를 들어 HuH-6), 폐소세포 암종 세포(예를 들어 Lu-130 및 Lu-134-A), 신경아 세포종 세포(예를 들어 NB19 및 NB69), 배아 암종 고환 세포(예를 들어 NEC14), 자궁 경부 암종 세포(TCO-2), 신경아 세포종 세포(예를 들어 TNB1), 721.221 EBV 형질 전환된 B 세포주를 포함하나 이에 국한되지 않는다.
추가 구현예에서, 피더 세포는 MHC I 발현이 감소(또는 결여)되었을 뿐만 아니라 MHC II 발현이 또한 감소(또는 결여)되었다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 I 분자를 초기에 발현할 수 있는 다른 세포주가, MHC I 발현을 감소 또는 녹아웃시킨 상기 세포의 유전적 변형과 함께 사용될 수 있다. 유전자 변형은, 유전자 편집 기술(예를 들어 CRISPR/Cas 시스템; RNA 상에서 작용하는 아데노신 디아미나제(Adenosine deaminases acting on RNA, ADAR)를 갖는 RNA 편집, 아연 핑거, TALENS, 등), 억제성 RNA(예를 들어 siRNA) 또는 세포의 표면 상에서 MHC I 분자의 발현을 중단 및/또는 감소시키는 기타 분자적 방법의 사용을 통해 달성될 수 있다.
하기에서 보다 상세하게 논의된 바와 같이, 몇몇 구현예에서, 피더 세포가 조작되어 면역 세포 증폭 및 활성화를 촉진하는 특정 자극 분자(예를 들어 인터류킨, CD3, 4-1BBL, 등)를 발현한다. 조작된 피더 세포가, 예를 들어 여기 전문이 참조로 포함된 국제 특허 출원 PCT/SG2018/050138에 개시된다. 몇몇 구현예에서, 자극성 분자, 예를 들어 인터류킨 12, 18, 및/또는 21이, 예를 들어 정해진 시간 및 특정 양으로 공-배양 배지에 별도로 첨가되어 원하는 면역 세포의 하위 집단(들)의 향상된 증폭을 달성한다.
자극성 분자
상기 간략하게 논의된 바와 같이, 특정 분자가 조작된 NK 세포 또는 T 세포를 포함한 면역 세포, 예를 들어 NK 세포 또는 T 세포의 증폭을 촉진한다. 구현예에 따라, 자극성 분자 또는 분자들은 면역 집단을 증폭하기 위해 사용된 피더 세포의 표면 상에 발현될 수 있다. 예를 들어 몇몇 구현예에서, K562 피더 세포 집단이 조작되어 4-1BBL 및/또는 막 결합된 인터류킨 15(mbIL15)를 발현한다. 추가 구현예는 막 결합된 인터류킨 또는 자극제와 더 관련된다. 상기 추가 막 결합된 자극 분자의 예가, 여기 전문이 참조로 포함된 국제출원 제PCT/SG2018/050138호에서 발견될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 여기 개시된 방법은, 조작된 피더 세포 및 조작된 NK 세포가 공-배양되는 배양 배지에 하나 이상의 자극성 분자의 첨가에 관한 것이다. 몇몇 구현예에서, 하나 이상의 인터류킨이 첨가된다. 예를 들어 몇몇 구현예에서, IL2가 배지에 첨가된다. 몇몇 구현예에서, IL12가 배지에 첨가된다. 몇몇 구현예에서, IL18이 배지에 첨가된다. 몇몇 구현예에서, IL21이 배지에 첨가된다. 몇몇 구현예에서, IL2, IL12, IL18, 및/또는 IL21 중 2 개 이상의 조합물이 배지에 첨가된다. 일부 구현예에서, mbIL15와 함께 피더 세포를 이용하기 보다 가용성 IL15가 (단독 또는 IL2, IL12, IL18, 및 IL21 중 어느 하나와의 조합물로) 배지에 첨가된다.
몇몇 구현예에서, 배지는 하나 이상의 비타민, 무기염 및/또는 아미노산을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 배지는 글리신, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-시스테인(예를 들어 L-시스테인 2HCl), L-글루탐산, L-글루타민, L-히스티딘, L-히드록시프롤린, L-이소루신, L-루신, L-리신 염산염, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신(예를 들어 L-티로신 2나트륨염 무수물) 및 L-발린 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 전부를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 배지는, 비오틴, 염화 콜린, D-판토텐산 칼슘, 엽산, i-이노시톨, 니아신아미드, 파라-아미노벤조산, 피리독신 염산염, 리보플라빈, 티아민 염산염 및 비타민 B12 중 1, 2, 3, 4 개 이상을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 배지는, 질산 칼슘(Ca(NO3)2 4H2O), 황산 마그네슘(MgSO4)(예를 들어 황산 마그네슘(MgSO4)(무수물)), 염화 칼륨(KCl), 중탄산 나트륨(NaHCO3), 염화 나트륨(NaCl), 및 이염기성 인산 나트륨(Na2HPO4)(예를 들어 이염기성 인산 나트륨(Na2HPO4) 무수물) 중 1, 2, 3, 4 개 이상을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 배지는 D-글루코오스 및/또는 글루타티온(선택적으로 감소된 글루타티온)을 더 포함한다. 몇몇 구현예에서, 배지는 약 1% 내지 약 20% 범위의 양으로 혈청(예를 들어 소 태아 혈청)을 더 포함한다. 몇몇 구현예에서, 혈청은 열-비활성화된다. 몇몇 구현예에서, 배지는 무혈청이다. 몇몇 구현예에서, 배지는 무이종성이다.
구현예에 따라, IL2가 사용되어 배양 배지를 보충하고, NK 세포의 증폭 또는 다른 특성을 향상시킨다. 몇몇 구현예에서, 사용된 IL2의 농도는 약 1 IU/mL 내지 약 1000 IU/mL의 범위이고, 예를 들어 약 1 IU/mL 내지 약 5 IU/mL(예를 들어 1, 2, 3, 4, 및 5, 약 5 IU/mL 내지 약 10 IU/mL(예를 들어 5, 6, 7, 8, 9, 및 10), 약 10 IU/mL 내지 약 20 IU/mL(예를 들어 약 10, 12, 14, 16, 18, 및 20), 약 20 IU/mL 내지 약 30 IU/mL(예를 들어 약 20, 22, 24, 26, 28, 및 30), 약 30 IU/mL 내지 약 40 IU/mL(예를 들어 30, 32, 34, 36, 38, 및 40), 약 40 내지 약 50 IU/mL(예를 들어 40, 42, 44, 46, 48, 50), 약 50 IU/mL 내지 약 75 IU/mL(예를 들어 50, 55, 60, 65, 70, 및 75), 약 75 IU/mL 내지 약 100 IU/mL(예를 들어 75, 80, 85, 90, 95, 및 100), 약 100 IU/mL 내지 약 200 IU/mL(예를 들어 100, 125, 150, 275, 및 200), 약 200 IU/mL 내지 약 300 IU/mL(예를 들어 200, 225, 250, 275, 및 300), 약 300 IU/mL 내지 약 400 IU/mL(예를 들어 300, 325, 350, 375, 및 400), 약 400 IU/mL 내지 약 500 IU/mL(예를 들어 400, 425, 450, 475, 및 500), 약 500 IU/mL 내지 약 750 IU/mL(예를 들어 500, 550, 600, 650, 700, 및 750), 또는 약 750 IU/mL 내지 약 1000 IU/mL(예를 들어 750, 800, 850, 900, 950, 및 1000), 및 종점을 포함한 상기 사이 임의의 농도를 포함한다. 몇몇 구현예에서, IL2가 배양 중 복수의 시점에 첨가될 수 있다. 상기 일부 구현예에서, 사용된 IL2의 농도는 선택된 시점 간에 상이할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 그리고 관련 기술분야에서 통상적으로 이해되는 바와 같이, 용어 "단위(units)" 및 "국제 단위(international unit; IU)"는 생물학적 활성과 같은 활성의 측정에 의해 결정된 바와 같은 물질, 분자, 또는 화합물의 표준화된 양 또는 측정치를 지칭한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 용어 "단위" 및 "IU"는 호환가능하다. 일반적으로 이해되는 바와 같이, 단위 또는 IU에 의한 측정은, 예를 들어 상이한 제조 공정 또는 배치 사이의 동일한 물질의 상관관계를 가능하게 하기 때문에, 질량 또는 부피와 같은 다른 통상적인 정량 방식과 비교하여 유리할 수 있거나 유리하지 않을 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 IL2에 적용되는 바와 같이, IL2의 단위 또는 IU의 정의는 NIBSC 코드 86/500 하에 IL2에 대한 WHO 국제 표준에 따라 표준화된다. NIBSC 표준에 따라 제조되는 한, 사용되는 IL2의 공급원과 관계없이, 과도한 실험 없이, 단위/mL 또는 IU/mL의 측정에 의한 IL2 농도의 개시내용이 전달가능해야 한다는 것이 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다.
본원에서 개시 목적으로 사용된 IL2는 2.3 ng/mL에 상응하는 40 IU/mL의 농도(즉, 1 IU/mL는 57.5 pg/mL에 상응함)를 갖는다. 따라서, IU/mL 또는 단위/mL의 측면에서의 IL2의 임의의 농도는 이러한 등가성에 따라 그의 질량 농도의 측면에서 해석될 수 있다. 당업자는 대안이 사용되는 경우 IU/mL의 측면에서 측정된 IL2 생성물의 그의 상응하는 질량 농도 등가물을 결정할 수 있음을 이해할 것이다.
구현예에 따라, IL2는 배양 배지를 보충하고 NK 세포의 증폭 또는 다른 특성을 향상시키기 위해 사용된다. 몇몇 구현예에서, 사용된 IL2의 농도는 57.5 pg/mL 내지 약 57.5 ng/mL(또는 55 pg/mL 내지 약 60 ng/mL), 예를 들어 약 55 pg/mL 내지 약 500 pg/mL(예를 들어 55, 60, 100, 200, 300, 400, 500 pg/mL), 약 500 pg/mL 내지 약 1000 pg/mL(예를 들어 500, 600, 700, 800, 900, 1000 pg/mL), 약 1 ng/mL 내지 약 10 ng/mL(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ng/mL), 또는 약 10 ng/mL 내지 약 60 ng/mL(예를 들어 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ng/mL), 및 종점을 비롯한 그 사이의 임의의 농도의 범위이다. 몇몇 구현예에서, IL2는 배양 동안 다수의 시점에서 첨가될 수 있다. 일부 이러한 구현예에서, 사용된 IL2의 농도는 선택된 시점들 사이에서 상이할 수 있다.
구현예에 따라, IL12A 및/또는 IL12B가 사용되어 배양 배지를 보충하고, NK 세포의 증폭 또는 다른 특성을 향상시킨다. 몇몇 구현예에서, 사용된 IL12(IL12A 또는 IL12B 중 어느 하나)의 농도는 약 0.01 ng/ml 내지 약 100ng/mL의 범위이고, 예를 들어 약 0.01 ng/mL 내지 약 0.05 ng/mL(예를 들어 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 및 0.05), 약 0.05 ng/mL 내지 약 0.1 ng/mL(예를 들어 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09 및 0.1), 약 0.1 ng/mL 내지 약 0.5 ng/mL(예를 들어 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 및 0.5), 약 0.5 ng/mL 내지 약 1.0 ng/mL(예를 들어 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 및 1.0), 약 1.0 ng/mL 내지 약 2.0 ng/mL(예를 들어 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 및 2.0), 약 2.0 ng/mL 내지 약 5.0 ng/mL(예를 들어 2.0, 3.0, 4.0, 및 5.0), 약 5.0 ng/mL 내지 약 10.0 ng/mL(예를 들어 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0 및 10.0), 약 10.0 ng/mL 내지 약 15.0 ng/mL(예를 들어 10.0, 11.0, 12.0, 13.0, 14.0, 및 15.0), 약 15.0 ng/mL 내지 약 20.0 ng/mL(예를 들어 15.0, 16.0, 17.0, 18.0, 19.0, 및 20.0), 약 20.0 ng/mL 내지 약 25.0 ng/mL(예를 들어 20.0, 21.0, 22.0, 23.0, 24.0, 및 25.0), 약 25.0 ng/mL 내지 약 30.0 ng/mL(예를 들어 25.0, 26.0, 27.0, 28.0, 29.0, 및 30.0), 약 30.0 ng/mL 내지 약 50.0 ng/mL(예를 들어 30.0, 35.0, 40.0, 45.0, 및 50.0), 약 50.0 ng/mL 내지 약 75.0 ng/mL(예를 들어 50.0, 55.0, 60.0, 65.0, 70.0, 및 75.0), 약 75.0 ng/mL 내지 약 100.0 ng/mL(예를 들어 75.0, 80.0, 85.0, 90.0, 95.0, 및 100.0), 및 종점을 포함한 상기 사이 임의의 농도를 포함한다. 몇몇 구현예에서, IL12의 농도는 약 0.01 ng/mL 내지 약 8 ng/mL이고, 종점을 포함한 상기 사이 임의의 농도를 포함한다.
일부 구현예에서, IL12A 및 IL12B의 혼합물이 사용된다. 몇몇 구현예에서, IL12A:IL12B의 특정 비율, 예를 들어 1:10, 1:50, 1:100, 1:150, 1:200, 1:250, 1:500, 1:1000, 1:10,000, 10,000:1, 1000:1, 500:1, 250:1, 150:1, 100:1, 10:1 및 종점을 포함한 상기 사이 임의의 비율이 사용된다.
일부 구현예에서, 인터류킨 18(IL18)이 사용되어 NK 세포의 증폭 또는 다른 특성을 향상시킨다. 몇몇 구현예에서, 사용된 IL18의 농도는 약 0.01 ng/ml 내지 약 100ng/mL의 범위이고, 예를 들어 약 0.01 ng/mL 내지 약 0.05 ng/mL(예를 들어 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 및 0.05), 약 0.05 ng/mL 내지 약 0.1 ng/mL(예를 들어 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09 및 0.1), 약 0.1 ng/mL 내지 약 0.5 ng/mL(예를 들어 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 및 0.5), 약 0.5 ng/mL 내지 약 1.0 ng/mL(예를 들어 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 및 1.0), 약 1.0 ng/mL 내지 약 2.0 ng/mL(예를 들어 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 및 2.0), 약 2.0 ng/mL 내지 약 5.0 ng/mL(예를 들어 2.0, 3.0, 4.0, 및 5.0), 약 5.0 ng/mL 내지 약 10.0 ng/mL(예를 들어 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0 및 10.0), 약 10.0 ng/mL 내지 약 15.0 ng/mL(예를 들어 10.0, 11.0, 12.0, 13.0, 14.0, 및 15.0), 약 15.0 ng/mL 내지 약 20.0 ng/mL(예를 들어 15.0, 16.0, 17.0, 18.0, 19.0, 및 20.0), 약 20.0 ng/mL 내지 약 25.0 ng/mL(예를 들어 20.0, 21.0, 22.0, 23.0, 24.0, 및 25.0), 약 25.0 ng/mL 내지 약 30.0 ng/mL(예를 들어 25.0, 26.0, 27.0, 28.0, 29.0, 및 30.0), 약 30.0 ng/mL 내지 약 50.0 ng/mL(예를 들어 30.0, 35.0, 40.0, 45.0, 및 50.0), 약 50.0 ng/mL 내지 약 75.0 ng/mL(예를 들어 50.0, 55.0, 60.0, 65.0, 70.0, 및 75.0), 약 75.0 ng/mL 내지 약 100.0 ng/mL(예를 들어 75.0, 80.0, 85.0, 90.0, 95.0, 및 100.0), 및 종점을 포함한 상기 사이 임의의 농도를 포함한다.
일부 구현예에서, 인터류킨 21(IL21)이 사용되어 NK 세포의 증폭 또는 다른 특성을 향상시킨다. 몇몇 구현예에서, 사용된 IL21의 농도는 약 0.01 ng/ml 내지 약 100ng/mL의 범위이고, 예를 들어 약 0.01 ng/mL 내지 약 0.05 ng/mL(예를 들어 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 및 0.05), 약 0.05 ng/mL 내지 약 0.1 ng/mL(예를 들어 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09 및 0.1), 약 0.1 ng/mL 내지 약 0.5 ng/mL(예를 들어 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 및 0.5), 약 0.5 ng/mL 내지 약 1.0 ng/mL(예를 들어 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 및 1.0), 약 1.0 ng/mL 내지 약 2.0 ng/mL(예를 들어 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 및 2.0), 약 2.0 ng/mL 내지 약 5.0 ng/mL(예를 들어 2.0, 3.0, 4.0, 및 5.0), 약 5.0 ng/mL 내지 약 10.0 ng/mL(예를 들어 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0 및 10.0), 약 10.0 ng/mL 내지 약 15.0 ng/mL(예를 들어 10.0, 11.0, 12.0, 13.0, 14.0, 및 15.0), 약 15.0 ng/mL 내지 약 20.0 ng/mL(예를 들어 15.0, 16.0, 17.0, 18.0, 19.0, 및 20.0), 약 20.0 ng/mL 내지 약 25.0 ng/mL(예를 들어 20.0, 21.0, 22.0, 23.0, 24.0, 및 25.0), 약 25.0 ng/mL 내지 약 30.0 ng/mL(예를 들어 25.0, 26.0, 27.0, 28.0, 29.0, 및 30.0), 약 30.0 ng/mL 내지 약 50.0 ng/mL(예를 들어 30.0, 35.0, 40.0, 45.0, 및 50.0), 약 50.0 ng/mL 내지 약 75.0 ng/mL(예를 들어 50.0, 55.0, 60.0, 65.0, 70.0, 및 75.0), 약 75.0 ng/mL 내지 약 100.0 ng/mL(예를 들어 75.0, 80.0, 85.0, 90.0, 95.0, 및 100.0), 및 종점을 포함한 상기 사이 임의의 농도를 포함한다.
일부 구현예에서, 인터류킨 15(IL-15)가 (피더 세포에 mbIL15 대신 또는 이에 더하여) 가용성 형태로 사용되어 NK 세포의 증폭 또는 다른 특성을 향상시킨다. 몇몇 구현예에서, 사용된 IL15의 농도는 약 0.01 ng/ml 내지 약 100ng/mL의 범위이고, 예를 들어 약 0.01 ng/mL 내지 약 0.05 ng/mL(예를 들어 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 및 0.05), 약 0.05 ng/mL 내지 약 0.1 ng/mL(예를 들어 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09 및 0.1), 약 0.1 ng/mL 내지 약 0.5 ng/mL(예를 들어 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 및 0.5), 약 0.5 ng/mL 내지 약 1.0 ng/mL(예를 들어 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 및 1.0), 약 1.0 ng/mL 내지 약 2.0 ng/mL(예를 들어 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 및 2.0), 약 2.0 ng/mL 내지 약 5.0 ng/mL(예를 들어 2.0, 3.0, 4.0, 및 5.0), 약 5.0 ng/mL 내지 약 10.0 ng/mL(예를 들어 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0 및 10.0), 약 10.0 ng/mL 내지 약 15.0 ng/mL(예를 들어 10.0, 11.0, 12.0, 13.0, 14.0, 및 15.0), 약 15.0 ng/mL 내지 약 20.0 ng/mL(예를 들어 15.0, 16.0, 17.0, 18.0, 19.0, 및 20.0), 약 20.0 ng/mL 내지 약 25.0 ng/mL(예를 들어 20.0, 21.0, 22.0, 23.0, 24.0, 및 25.0), 약 25.0 ng/mL 내지 약 30.0 ng/mL(예를 들어 25.0, 26.0, 27.0, 28.0, 29.0, 및 30.0), 약 30.0 ng/mL 내지 약 50.0 ng/mL(예를 들어 30.0, 35.0, 40.0, 45.0, 및 50.0), 약 50.0 ng/mL 내지 약 75.0 ng/mL(예를 들어 50.0, 55.0, 60.0, 65.0, 70.0, 및 75.0), 약 75.0 ng/mL 내지 약 100.0 ng/mL(예를 들어 75.0, 80.0, 85.0, 90.0, 95.0, 및 100.0), 및 종점을 포함한 상기 사이 임의의 농도를 포함한다.
일부 구현예에서, 인터류킨 22(IL22)가 사용되어 NK 세포의 증폭을 촉진한다. 몇몇 구현예에서, 사용된 IL22의 농도는 약 0.01 ng/ml 내지 약 100ng/mL의 범위이고, 예를 들어 약 0.01 ng/mL 내지 약 0.05 ng/mL(예를 들어 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 및 0.05), 약 0.05 ng/mL 내지 약 0.1 ng/mL(예를 들어 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09 및 0.1), 약 0.1 ng/mL 내지 약 0.5 ng/mL(예를 들어 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 및 0.5), 약 0.5 ng/mL 내지 약 1.0 ng/mL(예를 들어 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 및 1.0), 약 1.0 ng/mL 내지 약 2.0 ng/mL(예를 들어 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 및 2.0), 약 2.0 ng/mL 내지 약 5.0 ng/mL(예를 들어 2.0, 3.0, 4.0, 및 5.0), 약 5.0 ng/mL 내지 약 10.0 ng/mL(예를 들어 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0 및 10.0), 약 10.0 ng/mL 내지 약 15.0 ng/mL(예를 들어 10.0, 11.0, 12.0, 13.0, 14.0, 및 15.0), 약 15.0 ng/mL 내지 약 20.0 ng/mL(예를 들어 15.0, 16.0, 17.0, 18.0, 19.0, 및 20.0), 약 20.0 ng/mL 내지 약 25.0 ng/mL(예를 들어 20.0, 21.0, 22.0, 23.0, 24.0, 및 25.0), 약 25.0 ng/mL 내지 약 30.0 ng/mL(예를 들어 25.0, 26.0, 27.0, 28.0, 29.0, 및 30.0), 약 30.0 ng/mL 내지 약 50.0 ng/mL(예를 들어 30.0, 35.0, 40.0, 45.0, 및 50.0), 약 50.0 ng/mL 내지 약 75.0 ng/mL(예를 들어 50.0, 55.0, 60.0, 65.0, 70.0, 및 75.0), 약 75.0 ng/mL 내지 약 100.0 ng/mL(예를 들어 75.0, 80.0, 85.0, 90.0, 95.0, 및 100.0), 및 종점을 포함한 상기 사이 임의의 농도를 포함한다.
2 개의 자극제가 사용되는 경우, 2 개 사이 상대적인 비율은, 1:10, 1:20, 1:50, 1:100, 1:150, 1:200, 1:250, 1:500, 1:750, 1:1,000, 1:10,000, 1:50,000, 1:100,000, 100,000:1, 50,000:1, 10,000:1, 1,000:1, 750:1, 500:1, 250:1, 200:1, 150:1, 100:1, 50:1, 20:1, 10:1의 비율 및 종점을 포함한 나열된 상기 사이 임의의 비율의 범위일 수 있다. 마찬가지로, 3 개 이상의 제제가 사용되는 경우, 상기 추가 제제와 다른 제제 간의 비율은 상기 언급된 비율 중 어느 하나를 활용할 수 있다.
하기에서 보다 상세하게 논의된 바와 같이, 구현예에 따라, 자극 분자가 증폭 프로세스 중 특정 시점(또는 시점들)에 첨가될 수 있거나, 이들이 공-배양 프로세스를 통해 배양 배지의 구성 요소로 존재하도록 첨가될 수 있다.
공-배양 및 면역 세포 증폭 방법
일부 구현예에서, 말초 혈액 도너 샘플에서 단리된 NK 세포가 4-1BBL 및 mbIL15를 발현하도록 변형된 K562 세포와 공-배양된다. 다른 접근법은 다른 막결합된 사이토카인의 발현을 수반하나, 복수의 자극성 분자를 갖는 피더 세포의 생성은 생성(예를 들어 다양한 자극성 분자의 바람직한 발현 수준, 증폭 중 적시의 바람직한 발현 수준의 달성 등)이 어려울 수 있다. 따라서, 여기 개시된 몇몇 구현예는 특정 시기에 다양한 자극제의 특정 농도로 배양 배지의 보충에 관한 것이다. 몇몇 구현예에서, 피더 세포가 배양 용기 내로 시딩되고, 합류 근처에 도달하도록 허용된다. 이어서 면역 세포가 원하는 농도로 배양물에 몇몇 구현예에서 약 0.5 x 106 세포/cm2 내지 약 5 x 106 세포/cm2의 범위(종점을 포함한 나열된 것 사이 임의의 농도를 포함)로 첨가될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 면역 세포가 말초 혈액 샘플에서 분리된다. 이후, 몇몇 구현예에서, 면역 세포가 같이 증폭될 수 있거나, NK 세포와 같은 세포의 단리된 하위 집단이 사용된다. 몇몇 구현예에서, 제대혈, 또는 혈액의 다른 공급원이 면역 세포의 공급원으로서 사용된다. 일부 구현예는 면역 세포의 특정 집단, 또는 하위집단을 사용한다. 몇몇 구현예에서, 집단 또는 하위집단은 배양물에서의 증폭 전에 정제된다. 예를 들어 몇몇 구현예에서, 정제된 NK 세포가 증폭에 사용된다. 다른 구현예에서, 단핵 세포(예를 들어 말초 혈액 단핵 세포 또는 제대혈 단핵 세포)는 증폭에 사용되는 세포이다.
이후, NK 세포가 피더 세포, 선택적으로 하나 이상의 사이토카인(배양 배지 내 또는 외인성 보충제로)으로 시딩되고, 제 1 기간 동안, 예를 들어 약 6 시간, 약 12 시간, 약 18 시간, 약 24 시간, 약 2 일, 약 3 일, 약 4 일, 약 5 일, 약 6 일, 약 7 일, 약 8 일, 약 9 일, 약 10 일, 약 11 일, 약 12 일, 약 13 일, 약 14 일, 또는 종점을 포함한 나열된 것 사이 임의의 시간 동안 배양된다.
실시예에서 추가로 상세하게 논의된 바와 같이 (예를 들어 실시예 4 참조), 증폭되는 세포는 신선한 배지 및 피더 세포, 및 임의로 배양 배지를 보충하는데 사용되는 자극 사이토카인 중의 하나 이상으로 "펄싱"된다. 예를 들어 몇몇 구현예에서, 증폭되는 세포는 그 안에 피더 세포의 새로운 "배치(batch)"를 갖는 배양 용기에서 수집되고 리플레이팅된다. 증폭되는 세포는 신선한 배지와 함께 새로운 배양 용기/피더 세포에 첨가된다. 몇몇 구현예에서, 공-배양물에 첨가된 배지는 또한 신선하고, 이는 선택적으로, (예를 들어 증폭의 0 일에) 증폭 배지에 초기에 존재하는 임의의 자극 사이토카인으로 배지를 보충하는 것을 포함한다. 본원에 논의된 바와 같이, 배지에 첨가된 자극 사이토카인(들)의 농도는 이전의 증폭 기간에서와 동일할 수 있거나, 또는 임의로 상이한 농도 (더 높거나 더 낮음)일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 증폭되는 세포는 증폭 동안 적어도 1 회 추가 펄싱된다. 몇몇 구현예에서, 증폭되는 세포는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 회 또는 그 초과의 시간 동안 펄싱된다.
몇몇 구현예에서, 제 1 펄스와 제 2 펄스 사이의 지속기간은 약 5 내지 7 일이다. 몇몇 구현예에서, 소정의 제 1 펄스와 소정의 제 2 펄스 사이의 기간은 약 2 일, 약 3 일, 약 4 일, 약 5 일, 약 6 일, 약 7 일, 약 8 일, 약 9 일, 약 10 일, 약 11 일, 약 12 일, 약 13 일, 또는 약 14 일(또는 종점을 비롯하여 열거된 것들 사이의 임의의 시간)이다. 구현예에 따라, 펄스 사이의 기간은 비교적 일정하고, 예를 들어 증폭 0 일째와 제 1 펄스 사이의 시간이 약 5 내지 약 7 일인 경우, 제 1 펄스 및 제 2 펄스로부터의 기간은 약 5 내지 약 7 일이다. 그러나, 몇몇 구현예에서, 시간은, 예를 들어 편의상 또는 증폭 세포의 건강에서 관찰된 변화에 대해 조정될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 펄스 증폭은 세포(예를 들어 NK 세포)가 초기 세포 계수로부터 적어도 20,000 배의 증폭을 달성하기 위해 계속 증폭되게 한다. 몇몇 구현예에서, 더 큰 증폭, 예를 들어 적어도 약 50,000 배의 증폭, 적어도 약 100,000 배의 증폭, 적어도 약 150,000 배의 증폭, 적어도 약 200,000 배의 증폭, 적어도 약 250,000 배의 증폭, 적어도 약 300,000 배의 증폭, 적어도 약 350,000 배의 증폭, 적어도 약 400,000 배의 증폭, 적어도 약 450,000 배의 증폭, 적어도 약 500,000 배의 증폭, 적어도 약 750,000 배의 증폭, 적어도 약 1,000,000 배의 증폭, 적어도 약 1,250,000 배의 증폭, 적어도 약 1,500,000 배의 증폭, 적어도 약 1,750,000 배의 증폭, 적어도 약 2,000,000 배의 증폭, 약 2,500,000 배의 증폭, 또는 약 3,000,000 배의 증폭, 또는 종점을 비롯하여 열거된 것들 사이의 임의의 증폭 정도가 달성된다. 몇몇 구현예에서, 약 4,000,000배 또는 약 5,000,000배 초과의 증폭이 달성된다.
몇몇 구현예에서, 증폭의 초기에 증폭될 면역 세포의 수 대 증폭의 종료시에 증폭된 세포의 수의 비는 약 1:25,000; 약 1:50,000, 약 1:100,000, 약 1:200,000, 약 1:500,000, 약 1:1,000,000, 약 1:1,500,000, 약 1:2,000,000, 약 1:2,500,000, 또는 약 1:3,000,000, 또는 종점을 비롯하여 열거된 것들 사이의 임의의 비이다.
증폭 정도는 몇몇 구현예에서, 피더 세포의 수 대 증폭될 세포의 출발 수의 비를 조정함으로써 조정될 수 있다. 예를 들어 몇몇 구현예에서, 1:1 비가 사용되는 한편, 추가의 실시예에서, 약 1:2, 1:5, 1:10, 1:20, 1:50, 1:100, 1:1,000, 1:10,000, 1:50,000, 1:100,000, 100,000:1, 50,000:1, 10,000:1, 1,000:1, 100:1, 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 및 종점을 비롯하여 열거된 것들 사이의 임의의 비의 범위일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 증폭 초기의 비는 각각의 후속 펄스에 대해 동일한 대략적인 비로 유지된다. 그러나, 몇몇 구현예에서, 더 빠르거나 더 느린 증폭 속도가 요망되는지에 관계없이, 예를 들어 세포의 증폭 속도를 조정하기 위해, 시간 경과에 따라 비가 변경된다.
몇몇 구현예에서, 제 1 증폭 기간 후, 증폭된 세포(예를 들어 NK 세포)가 조작된 구조체, 예를 들어 키메라 항원 수용체로 형질 도입된다. 임의의 다양한 키메라 항원 수용체가, 이의 각각의 전문이 여기 참조로 통합된 문헌[국제 PCT 출원 PCT/US2018/024650, PCT/IB2019/000141, PCT/IB2019/000181, 및/또는 PCT/US2020/020824, PCT/US2020, 035752, 미국 가출원 번호 62/924967, 62/960285, 및/또는 63/038645]에 기재된 것을 포함한 조작된 세포, 예를 들어 NK 세포에서 발현될 수 있다.
바이러스 형질 도입 후, 조작된 세포가 제 2 기간 동안, 예를 들어 약 6 시간, 약 12 시간, 약 18 시간, 약 24 시간, 약 2 일, 약 3 일, 약 4 일, 약 5 일, 약 6 일, 약 7 일, 약 8 일, 약 9 일, 약 10 일, 약 11 일, 약 12 일, 약 13 일, 약 14 일, 또는 종점을 포함한 나열된 것 사이 임의의 시간 동안 배양된다. 여기 제시된 특정 데이터는 NKG2D 리간드 결합 도메인(예를 들어 NKX101) 또는 CD19(예를 들어 NK19-1 또는 NKX101)를 발현하는 키메라 수용체 복합체의 바이러스 발현에 관한 것임을 유의해야 한다. 그러나, 임의의 적합한 키메라 수용체 또는 키메라 항원 수용체가 사용될 수 있다.
하나 이상의 자극제, 예를 들어 IL12 및/또는 IL18로 배지의 보충이 배양 프로세스 중 임의의 시기에 발생할 수 있다. 예를 들어 하나 이상의 자극제가 배양의 초기, 예를 들어 0 시점(예를 들어 배양의 초기)에 첨가될 수 있다. 제제 또는 제제들이 제 2, 제 3, 제 4, 제 5 이상의 시기에 첨가될 수 있다. 후속 첨가는 선행 첨가와 동일한 농도일 수 있거나 아닐 수 있다. 복수의 첨가 사이 간격은, 예를 들어 약 12 시간, 약 24 시간, 약 36 시간, 약 48 시간, 약 72 시간 이상 및 종점을 포함한 상기 사이 임의의 시간의 시간 간격으로 달라질 수 있다.
자극제의 복수의 첨가가 이용되는 경우, 제 1 보충 첨가의 농도는 제 2 (및/또는 임의의 보충 첨가)와 동일하거나 이와 상이한 농도일 수 있다. 예를 들어 몇몇 구현예에서, 복수의 시점에 걸친 자극제의 첨가가 증량, 감량, 일정하게 유지 또는 복수의, 비등량의 농도로 달라질 수 있다.
몇몇 구현예에서, 피더 세포 대 증폭될 세포의 특정 비율이 사용된다. 예를 들어 몇몇 구현예에서, 약 5:1의 피더 세포 : "표적(target)" 세포의 비율이 사용된다. 몇몇 구현예에서, 1:1의 비율이 사용되는 반면, 추가 구현예에서 약: 1:10, 1:20, 1:50, 1:100, 1:1,000, 1:10,000, 1:50,000, 1:100,000, 100,000:1, 50,000:1, 10,000:1, 1,000:1, 100:1, 50:1, 20:1, 10:1 및 종점을 포함한 나열된 것 사이 임의의 비율 범위일 수 있다.
실시예
실시예에 개시된 재료 및 방법은 본 출원에 제공된 댜양한 구현예에 적용 가능한 재료 및 방법(시약 및 조건을 포함)의 비제한적인 예이다.
실시예 1 - 증폭 조건의 초기 평가
도 1a는 증폭 프로세스의 비제한적인 예를 도시한다. 본 실시예에서, 자극성 사이토카인이 0 일에 첨가되고, 동일한 용량이 4 일에 다시 첨가되며, 이는 여기 논의된 특정 구현예에 사용되었다. 도 1b는 단일 용량 프로세스의 비제한적인 구현예를 나타내며, 이는 여기 논의된 특정 구현예에 사용되었다.
도 2는 다양한 방법을 사용한 NK 세포의 배수 증폭과 관련된 데이터를 도시한다. 가장 왼쪽 데이터 세트는 (mbIL15 및 4-1BBL을 발현하는) K562 피더 세포 단독을 이용한 NK 세포의 증폭을 도시하는 반면, 오른쪽 3 개의 데이터 세트 각각은 다양한 농도의 IL12 및 IL18로 배지를 보충했을 때 증가된 배수 증폭을 도시한다. 임의의 양으로 IL12 및 IL18 보충제의 존재는 NK 세포의 증폭에서 유의미한 증가를 초래했고, 이로써 추가의 자극제가 NK 세포 증폭을 향상시킬 수 있음을 입증한다.
도 3a는 K562 세포 단독(상단 열) 또는 IL12/18 보충 중 어느 하나로 증폭된 4 명의 상이한 도너 유래 NK 세포에서 NKG2D의 발현과 관련된 유세포 분석 데이터를 도시한다. (NKX101로 형질 도입된 세포와 관계가 있는) 오른쪽으로 옮겨간 곡선의 증가된 높이에서 알 수 있는 바와 같이, NKG2D의 더 많은 발현이 존재한다. NKX101의 표시는, NKG2D 수용체의 리간드에 결합할 수 있는 절단된 NKG2D 세포 외 도메인을 발현하는 조작된 NK 세포를 지칭한다. 몇몇 구현예에서, 절단된 NKG2D 도메인은 CD8알파 힌지 및 CD8알파 TM 도메인에 결합된다. 몇몇 구현예에서, 절단된 NKG2D 도메인은 OX40 공자극 도메인 및 CD3제타 신호 전달 도메인에 결합된다. 몇몇 구현예에서, 구조체는 막결합된 IL15를 더 포함한다. 몇몇 구현예에서, NKX101은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 도 3a는 NKG2D의 향상된 발현을 더 지지하며, 여기서 가용성 보충물 IL12/18을 사용할 경우 더 높은 평균 형광 강도(MFI)는 주어진 세포 상에서 NKG2D의 더 많은 존재를 입증한다. 따라서, 가용성 IL12/18로 피더 세포를 보충하는 용량이 NK 세포의 증폭을 향상시킬 뿐만 아니라, 상기 NK 세포에 의한 키메라 수용체의 발현을 또한 개선한다. 더 많은 NK 세포 수가 종양과 같은 바람직하지 않은 세포를 표적화할 더 많은 양의 수용체를 이제 발현하는 것은 예상외의 유익이다.
다른 수용체가 사용되어 종양에 대해 NK 세포를 표적화할 수 있다. 예를 들어 몇몇 구현예에서, 수용체는 종양 세포 상의 CD19를 표적화하는 키메라 항원 수용체이다. 몇몇 구현예에서, 항-CD19 CAR은, OX40 공자극 도메인 및 CD3제타 신호 전달 도메인에 결합된 CD19(예를 들어 FMC63 scFv 또는 이의 변이체)에 결합된 scFv를 포함한다. 몇몇 구현예에서, CAR을 암호화하는 핵산 서열이 IL15를 더 암호화한다. 몇몇 구현예에서, IL15는 막 결합 형태로 숙주 세포(예를 들어 NK 세포 또는 T 세포)에 의해 발현되도록 구성된다. 몇몇 구현예에서, CAR은, 서열번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 또는 27의 서열에 대해 적어도 95%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 몇몇 구현예에서, CAR은, 서열번호 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28의 서열에 대해 적어도 95%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 구현예에서, CAR은 인간화된 항-CD19 바인더를 이용한다.
도 4는, NK 세포를 증폭할 때 가용성 보충제 IL12/18의 사용이 증폭된 상기 NK 세포의 향상된 세포 독성을 실제적으로 초래하는 데이터를 도시한다. 도 4는 바이러스 형질 도입 후 2 번의 시점, 14 일 및 21 일에 2 명의 상이한 도너 유래 데이터를 도시한다. NK 세포를 증폭하는 데 사용된 배양 조건은 가용성 IL12/18(점선) 또는 (4-1BBL 및 mbIL15를 발현하는) K562 단독(실선) 중 어느 하나의 사용이었다. GFP 형질 도입된 세포가 대조군으로 사용되었다 - NKX101 곡선이 도 4에서 화살표로 표시된다. 데이터가 지시하는 바와 같이, K562 세포 단독에 대한 증폭에 비해 IL12/18의 사용이 형질 도입 후 21 일에 NK 세포의 세포 독성을 향상시킨다(하단 패널). 14 일의 효과가 상기 특정 실험으로 한정되었으나, 몇몇 구현예에서, 아마도 도너 및/또는 특정 IL 농도에 따라, 몇몇 구현예에서, 향상된 세포 독성이 좀 더 이른 시점, 예를 들어 바이러스 형질 도입 후 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 21, 22, 또는 23 일에 달성된다. 시간과는 관계없이, 증폭 프로세스 중 가용성 인터류킨의 사용이 증폭된 세포의 세포 독성을 유의미하게 향상시킬 수 있는 것은 예상외이다.
몇몇 구현예에서, 조작된 NK 세포의 증가된 세포 독성이 특정 표현형으로 이동하는 세포에 적어도 부분적으로 기인한다. 도 5a 및 5b는 시간의 흐름에 따른 NK 세포 기억과 관련된 특정 마커와 관련된 데이터를 도시한다. 도 5a는 피더 세포 단독에서 증폭된 NK 세포 내 CD57, NKG2C 및 CD62L의 발현을 도시하나, 도 5b는 피더 세포뿐만 아니라 가용성 IL12/18의 사용을 도시한다. NKG2C 발현이 IL12/18로 증폭된 상기 NK 세포에서 21 일에 증가되었다. NKG2C는 사이토카인 유도된 NK 세포 기억의 마커이다. CD67L의 증가는 가용성 IL12/18을 사용하여 증폭된 NK 세포가 있는 후기 시점에서 또한 관찰되었다. CD67L은 증가된 림프구 삼출(증가된 세포 활성의 증거)과 연관된다. 종합하면, 상기 데이터는, NK 세포 증폭 중 가용성 인터류킨의 사용이 항원에 대한 NK 세포 기억 및 상기 항원을 함유한 세포에 대한 향상된 세포 독성과 연관된 상이한 신호 전달 경로를 활성화시키는 능력을 갖는다는 것을 시사한다.
6a-6b은, 근본적인 NK 세포가 K562 세포 단독 대 가용성 IL12/18로 증폭 배지를 대체하여 증폭되었을 때 NKX101을 발현하는 NK 세포의 항-종양 효과와 관련된 생체 내 데이터를 도시한다. 동물 모델은 0 일에 (복강 내로) 4 x 106 개의 SNU499 간세포 암종 세포 후 증폭 배지를 IL12/18로 보충하거나 하지 않은 채 증폭된 (또는 대조군) NKX101을 발현하는 3 x 106 개의 NK 세포로 마우스에 투약하는 것을 포함한다. 왼쪽 패널에 도시된 바와 같이, 대조군 마우스는 7 일만큼이나 초기에 유의미한 종양 부담을 가지며, 14 일 및 21 일에 종양 신호가 존재하고 일부 마우스에서 적당히 증가했다. 생체 내 생물 발광 영상화(bioluminescent imaging, BLI)에서 이미지 이하로 나타난다. 오른쪽 패널은 NKX101을 발현하는 NK 세포로 수행된 실험을 도시한다. 이미지에 나타난 바와 같이, 종양 부담이 7 일에 존재했으나 14 일까지 대부분 검출 가능하지 않았고, 21 일까지 그와 같이 유지되었다. 중앙 패널에서, 실험 이미지가 NKX101을 발현하는 NK 세포에 대해 도시되며, NK 세포는 가용성 IL12/18을 사용하여 증폭되었다. 종양 부담에 대한 효과는 적어도 NKX101 세포만큼 효과적이었으나("표준(standard)" 증폭), NKX101 효능의 상당한 정도가 IL12/18을 이용한 개선된 효과를 검출하기 어렵게 만들 수 있다. 그럼에도 불구하고, 여기 개시된 몇몇 구현예에 따라, NK 세포 증폭 배지를 보충하는 가용성 IL12/18의 사용이 향상된 증폭뿐만 아니라 향상된 키메라 수용체 발현 및 향상된 세포 독성을 초래한다.
실시예 2 - 증폭 및 효능의 추가 평가
상기 논의된 바와 같이, 여기 개시된 몇몇 구현예에서, 하나 이상의 가용성 자극 인자가 사용되어 조작된 면역 세포, 예를 들어 NK 세포, T 세포 또는 이의 조합물의 증폭 및/또는 세포 독성을 향상시킨다. 본 실시예에 대해 시행된 실험은, 확립된 증폭 시스템과 비교하여 선택된 자극 분자의 다양한 농도의 효능을 평가하기 위해 수행되었다. 구현예에 따라 다른 자극제가 사용될 수 있으나, 본 실시예는 가용성 인터류킨 12 및 가용성 인터류킨 18을 이용했다. 상기 사이토카인이 (하기 기재된 다양한 농도로) 첨가되었고, 결과적으로 생성된 세포가 막결합 인터류킨 15 및 4-1BBL을 발현하도록 변형된 K562 세포를 사용하여 증폭된 세포와 비교되었다(각각의 전문이 여기 참조로 통합된 문헌[미국 특허 번호 7,435,596 및 8,026,097]에 보다 완전히 기재됨). 증폭된 세포가 증식, 사이토카인 분비, 세포 독성 및 표현형에 관하여 평가되었다.
다양한 조건을 이용하여 증폭된 복수의 도너 유래 NK 세포를 사용한 실험이 설정되었다. NK 세포 중 한 그룹이 mbIL15 발현 피더 세포(K562/4-1BBL/mbIL15) 상에서 증폭되었다. NK 세포 중 또 다른 그룹이 세포 표면 상에서 IL12 및 IL18을 발현하도록 더 변형된 mbIL15 발현 세포 상에서 증폭되었다. 다양한 배양 조건이 다른 그룹에 걸쳐 사용되었고, 증식 평가가 수행되어 자극성 사이토카인의 다양한 농도의 영향을 결정했다. 예를 들어 한 그룹의 세포가 IL12의 고정된 농도(5 ng/mL) 및 IL18의 가변적인 농도에 노출되었다. 추가 그룹이 또 다른 IL12의 고정된 농도(2.5 ng/mL) 및 IL18의 가변적인 농도에 노출되었다. 가용성 형태로 IL12 및 IL18에 노출된 상기 배양물이 배양 0 일에 (및 4 일에 다시) IL12/18의 용량에 노출되었음에 유의한다. 상기 논의된 바와 같이, 0 일 및 4 일에 가용성 사이토카인의 첨가는 도 2-18 및 도 23-24에 도시된 데이터를 생성하는 실험에 사용되었다. 다른 실험은 0 일에만 가용성 사이토카인에 대한 노출을 이용했다.
도 7a는 NK 세포의 증폭에 사용된 다양한 배양 조건의 개략적인 표이다. 도 7b는 다양한 조건에 대한 노출 후 72 시간에 세포 수와 관련된 데이터를 도시한다. 보다 아래의 미량에 나타난 바와 같이, 임의의 농도로 IL18 단독 추가는 NK 세포 증식에 대해 제한적인 영향을 미쳤다. 그에 반해, IL12 단독 첨가는 용량 의존적인 방식으로 NK 세포 증식을 증가시켰다. 다양한 농도(2.5 ng/mL 또는 5 ng/mL)로 IL12의 조합은 NK 세포 증식을 더 향상시켰고, 이는 상기 2 개의 인터류킨 간의 상승적인 상호 작용을 시사한다. 2.5 ng/mL 및 5 ng/mL 둘 다에서 IL12에 대한 데이터는 강력한 NK 세포 증폭을 입증하고, IL18이 약 0.1 내지 약 1 ng/mL의 농도로 존재했을 때 거의 최대 수준이 달성되었다. 보다 높은 농도로 IL18의 첨가는 여전히 NK 세포 증폭을 양으로 향상시킬 수 있었고, 5 ng/mL의 IL12와 조합으로 50 ng/mL의 IL18의 최대 농도가 2.5 ng/mL의 IL12와 비교하여 약간 향상된 증폭을 초래했다. IL12 또는 IL18의 과포화된 농도로의 증폭에 대한 데이터는 척도를 벗어났고 도시되지 않는다.
도 8은 IL12 또는 IL18의 다양한 농도로 배양 72 시간 후에 IFNg 농도와 관련된 데이터를 도시한다. 데이터 플롯은 선택된 인터류킨의 증가하는 농도와 관련하여 (ELISA 분석 중 흡광도에 의해 측정된 바와 같은) IFNg의 농도를 나타낸다. 증폭 데이터와 유사하게, IL12의 첨가는 IL18의 첨가와 비교하여 IFNg의 보다 많은 생성을 초래했다. 그렇긴 하지만, 증가하는 농도의 IL18의 첨가는 증가된 IFNg 생성을 초래했다. 반면에, IL12는 테스트된 거의 모든 농도에서 NK 세포에 의한 보다 많은 IFNg 생성을 초래했다. 증식에서와 같이, 약 1 ng/mL (또는 그 이상)의 IL18의 농도와 IL12의 농도의 조합물이 향상된 IFNg 생성을 산출했다. 약 0.5 ng/mL 미만의 농도로 IL18과 IL12(어떠한 농도에서든)의 조합물이 IL12 단독으로 달성된 것과 유사한 IFNg 생성을 초래했다. 반면에, 약 1 ng/mL 이상으로 IL18의 포함이 유의미하게 향상된 IFNg 생성으로 이어졌고, 이는 NK 세포의 상승적인 자극을 다시 나타낸다.
도 9a-9b는, 지시된 배양 조건에서 증폭 7 일 후에 (비형질 도입된) NK 세포의 증폭과 관련된 데이터를 도시한다. 제 1 그룹은 IL12(20 ng/mL) 및 IL18(25 ng/mL) 둘 다의 포화 농도를 이용하여 증폭되었다. 제 2 그룹은 IL12의 포화 농도(20 ng/mL) 및 IL18의 하위 포화 농도(0.05 ng/mL)를 이용하여 증폭되었다. 제 3 그룹은 IL15, IL12 및 IL18 각각의 막결합 형태를 발현하도록 조작된 피더 세포를 이용하여 증폭되었다(상기 피더 세포주에 대한 추가 세부 사항은 전문이 여기 참조로 통합된 문헌[국제출원 제PCT/SG2018/0501387호]에서 찾을 수 있다). 대조군으로 제 4 그룹은 확립된 피더 세포주(mbIL15 및 4-1BBL을 발현하는 K562 세포) 상에서 증폭되었다. 도 9a는 계산된 증폭 데이터를 도시하고, 도 9b는 통계적 분석을 도시한다. 도 9c 및 9d는 특정 적정 곡선 및 NK 세포 증폭에 대한 데이터를 나타낸다. 도 9c는 4 ng/mL로 일정하게 유지된 IL18과 함께 IL12의 다양한 농도에 대한 데이터를 도시한다. 도 9d는 20 ng/mL의 IL18 및 다양한 IL12를 이용한 유사한 데이터를 도시한다. 종합하면, 상기 데이터는, 가용성 형태이든 또는 피더 세포(예를 들어 mbIL15를 발현하는 K562 세포) 상에 막결합되었든 IL12 및 IL18의 첨가가 유의미하게 향상된 NK 세포의 증폭을 산출함을 나타낸다. 흥미롭게도, IL12는 증폭의 1차 구동체인 것으로 보이고, 이의 활성은 낮은 농도에서조차 IL18의 포함에 의해 향상된다(예를 들어 IL18의 포화 및 하위 포화 농도에 대한 유사한 증폭 수를 참조한다). 상기 데이터는 IL12 및 IL18의 조합물이 NK 세포 증폭을 강력하게 향상시킨다는 것을 나타냈다.
도 10a-10b는, 지시된 조건 (및 40 IU/mL로 보충된 IL-2 배지)에서 증폭 8 일 후에 비형질 도입된 NK 세포에 대한 세포 독성 데이터를 도시한다. 표적 세포는 1:1의 이펙터 대 표적 비율의 Reh 급성 림프구성 백혈병(비-T; 비-B) 세포이었다. 배양 조건과 관계없이, 모든 세포가 약 40% 내지 약 65%의 세포 독성을 나타냈다. 임의의 IL12 또는 IL18이 없이 mbIL15 발현 피더 세포 상에서 증폭된 세포는, 가용성 IL12/IL18에서 배양된 그룹 중 어느 하나보다 유의미하게 더 많은 가장 높은 정도의 세포 독성을 나타냈다. 막결합된 IL12 및 IL18를 갖는 피더 세포의 이용은 가용성 사이토카인을 갖는 것보다 더 높은 정도의 세포 독성을 나타냈다.
도 11a-11b는, 1:1의 이펙터 표적 비율로 Reh 세포에 대해 배양(400 IU/mL의 IL2 농도) 15 일에 비형질 도입된 NK 세포에 대한 세포 독성 데이터를 도시한다. 상기 데이터는 테스트된 그룹에 걸쳐 보다 높은 정도의 세포 독성뿐만 아니라 그룹 간 제한된 차이를 나타낸다. 다시 말해, 모든 그룹은 배양 조건 간 유의미한 차이가 존재하지 않는 정도로 증가된 세포 독성을 나타낸다. 일부 구현예에 따라, IL12 및 IL18의 사용은 배양 중 초기 부분에서 증폭에 영향을 주는 경로 또는 신호 전달 케스케이드를 유도한다. 몇몇 구현예에서, 상기 경로 또는 케스케이드(또는 경로들/케스케이드들)는 향상된 세포 독성에 대한 지연 효과를 갖는다. 몇몇 구현예에서, 특정 자극 인자의 사용은 NK 세포를 프라이밍하여 표적 세포에 대한 세포 독성 효과를 발휘하는 기억 유사 표현형과 같은 NK 세포의 표현형 변화를 유도한다. 몇몇 구현예에서, 상기 표현형 변화의 유도는, 평가될 NK 세포의 특성에 따라 인식되기까지 1-2, 3-4, 5-6, 7-8 일 이상 걸릴 수 있다.
상기 실험이 비형질 도입된 NK 세포로 수행되었으나, 이는 다양한 농도로 IL12 및 IL18의 포함이 NK 세포의 증폭 및 세포 독성을 향상시킬 수 있음을 입증한다. 추가 실험이 (GFP 형질 도입된 세포 또는 비형질 도입된(NT) NK 세포와 비교하여) 키메라 수용체로 형질 도입된 NK 세포로 수행되었다. 비제한적인 예로, 이용된 키메라 수용체는 CD8알파 힌지 및 CD8알파 TM 도메인, OX40 공자극 도메인, CD3제타 신호 전달 도메인에 결합된 절단된 NKG2D 도메인 및 막결합된 IL15를 포함한다. 도 12a-12b는 다양한 조건 하에 배양된 다양한 도너 유래 NK 세포 상에 키메라 수용체(45_4로 표시)의 발현을 평가하는 유세포 분석 데이터를 도시한다. 도 12a-12b의 왼쪽 열에서, 데이터가 2 명의 도너(상단에서 227, 하단에서 732)에 대해 피더 세포를 발현하는 mbIL15 상에 배양된 NK 세포에 대해 도시된다. "45_4"로 식별된 곡선은 (NKG2D 함유 키메라 수용체로 형질 도입될 상기 세포에 대해 예상되는 바와 같이) NKG2D의 보다 많은 발현을 나타낸다. 오른쪽 열은, 0 일에 각각 20 ng/mL 및 25 ng/mL로 배지에 첨가된 가용성 IL12 및 가용성 IL18을 갖는 mbIL15 발현 피더 세포 상에서 배양된 NK 세포에 대한 발현 결과를 도시한다. 도 13a-13b는 2 명의 추가 도너에 대한 대응하는 데이터를 도시한다. 도 12a-12b 및 도 13a-13b 둘 다의 MFI 데이터에서 알 수 있는 바와 같이, IL12 및 IL18의 사용이 향상된 NKG2D 발현을 초래했고, 이는 특정 자극 인자가 NK 세포 증폭을 강력하게 구동할 수 있다는 선행 데이터를 더 지지한다. 상기 데이터는, 자극성 분자, 예를 들어 IL12 및 IL18의 사용이 형질 도입된 NK 세포와 양립 가능함을 또한 확인해준다.
자극성 사이토카인이 형질 도입된 NK 세포의 증폭을 향상시키는 것을 확인하고, 세포독성을 평가하였다. 도 14a 및 14b는 지시된 구조체로 형질도입되고 지시된 배양 조건을 사용하여 증폭된 NK 세포의 세포 독성과 관련된 데이터를 도시한다. mbIL-15-발현 피더 세포 상에서 성장한 GFP 형질 도입된 NK 세포; mbIL-15-발현 피더 세포 상에서 성장하고 IL12 및 IL18에 노출된 GFP 형질 도입된 NK 세포; mbIL-15-발현 피더 세포 상에서 성장한 NKX101 형질 도입된 NK 세포; 및 mbIL-15-발현 피더 세포 상에서 성장하고 IL12 및 IL18에 노출된 NKX101 형질 도입된 NK 세포; 그룹이 존재했다. 표적 세포는 1:1 E:T 비율의 Reh 세포이었다. 세포 독성이 4 명의 상이한 도너 유래 세포를 사용하여 증폭 후 13 일에 평가되었다. 도시된 바와 같이, GFP 형질 도입된 NK 세포 및 NKX101 형질 도입된 NK 세포 둘 다 세포 독성을 나타내었고, NKX101 발현 세포는 표적 세포에 대해 더 큰 효과를 나타냈다. 사용된 증폭 배양 조건에 근거한 어떠한 유의미한 차이도 검출되지 않았다(14b 참조).
도 15a-15b는, 상이한 E:T 비율이 테스트된 2 명의 도너 유래 추가의 세포 독성 데이터를 도시한다. 상기 데이터는 도 14에 도시된 것과 일치하는 패턴을 나타낸다. 도 15a는 제 1 도너에 대한 4 개의 배양 조건에 대한 데이터를 도시하고, 15b는 제 2 도너에 대한 대응하는 데이터를 도시한다. 도너 543(도 15a)은 시토메갈로바이러스에 대해 음성이었고, 도너 224(도 15b)는 CMV에 대해 양성이었음에 유의한다. CMV 양성 개체는 기억 유사 표현형을 갖는 NK 세포의 하위 집단을 갖고, 이는 이들이 표적 세포에 대해 보다 빠른 반응으로 특징지어짐을 의미한다. 도 15a-15b의 데이터는 증폭 후 13 일에 수집되었다. 이들 곡선은 상기 데이터와 유사하고, 상대적으로 초기 시점에, IL12/IL18의 존재 또는 부재가 NK 세포에 의해 유도된 세포 독성에 제한적인 영향을 미친다. 도 15c 및 15d는 동일한 도너/조건 유래이나 증폭 후 21 일의 데이터를 도시한다. 특히, IL12/IL18의 사용이 테스트된 대부분의 E:T 비율에서 표적 세포에 대해 향상된 세포 독성을 초래한다. 상기 데이터는, 향상된 세포 독성의 유도에 지연이 있으나 후기 시점에 검출 가능하다는 점에서 형질 도입되지 않은 NK 세포에 대해 상기에서 논의된 것과 일치한다. 상기에서 논의된 바와 같이, 상기 효과는 NK 세포에서 표현형 변화를 유도하는 데 필요한 시간에 기인할 수 있다.
도 16a-16b는 시간의 흐름에 따라 상이한 조건에서 배양된 NK 세포의 표현형 평가에 관한 것이다. 도 16a는 지시된 조건 하에서 5 주의 배양에 걸친 NKG2C 및 CD62L(L-셀렉틴)의 발현 수준을 도시한다. mbIL15 발현 피더 세포를 사용했을 경우 CD62L 또는 NKG2C 중 어느 것의 발현 수준도 5 주의 배양에 걸쳐 유의하게 변하지 않았다. 그러나 그에 반해, 상기 피더 세포의 사용 및 0 일에 IL12 및 IL18로 배지를 보충하는 것은 NKG2C 및 CD62L 둘 다의 발현에 유의미한 영향을 미쳤다. CD62L은 배양 1 주 후 NK 세포의 약 50%에 처음에 존재했다. 상기는 1 주 후 증가했으나, 이어서 CD62L 발현의 유의미한 감소가 있었고, 배양 4 주에 제한된 검출이 가능했다. 그에 반해, NKG2C 발현이 배양 1 주 후 약간 증가했고, NKG2C의 발현이 5 주 후 NKG2C를 발현하는 세포 중 40% 이상으로 NK 세포 상에서 증가했다. 따라서, 5 주의 배양물은 자극성 사이토카인없이 성장한 NK 세포와 비교하여 NKG2C가 상승했고, 자극성 사이토카인없이 성장한 NK 세포와 비교하여 CD62L 발현이 감소 또는 동등한 것으로 특성화될 수 있다. 도 16b는 NK 세포에 의한 변경된, 기억 유사 표현형의 발달을 지지하는 추가 데이터를 도시한다. 도 16b는, 0 일에 mbIL15 발현 세포(왼쪽 세로줄) 또는 IL12 및 IL18 첨가뿐만 아니라 mbIL15 발현 세포(오른쪽 세로줄)와 함께 배양된 14 일(상단 가로줄) 및 21 일(하단 가로줄)에 도너 NK 세포의 FACS 분석에 의한 발현 데이터를 도시한다. CD57 발현이 또한 도시되고, 상대적으로 낮은 백분율의 세포가 발현에 양성이며, 이는 NK 세포가 배양될 경우 상기 마커의 발현 상실에 대한 경향을 확인해준다(신선한 NK 세포는 CD57을 보다 많이 발현할 것이다). mbIL15 세로 줄에서 알 수 있는 바와 같이, NKG2C 발현(X-축)이 유의미하게 변하지 않는다. 그에 반해 (화살표로 표시된 바와 같이) NKG2C를 발현하는 세포의 백뷴율이 가용성 IL12 및 가용성 IL18에 대한 초기 노출 후 배양에서 추가 주 후 40%까지 증가한다.
도 17a-17d는 지시된 조건 하에서 배양 14 일 후 NK 세포 상의 마커 발현과 관련된 요약 데이터를 도시한다. 도 17a에 도시된 바와 같이, 상기 시점에서, CD62L은, 가용성이든 또는 막결합 형태이든 IL12 및 IL18의 사용에 의해 향상된다. 상기 논의된 바와 같이, 상기 별현은 배양의 추가 시간에 걸쳐 하락한다. 도 17b는 IL12 및 IL18이 1 일에 배지 내로 도입될 경우 향상된 NKG2D 발현을 도시한다. 다른 데이터와 마찬가지로, NK 세포 표현형(증폭 및 세포 독성과 같은)에 대한 효과가 IL18 농도가 달라질 때 대략 동등함에 유의한다(예를 들어 효과가 IL18의 포화 또는 하위 포화 농도로 나타난다). CD57 발현 수준이 모든 조건 하에서 상대적을 낮았고, 이는 17d에 도시된 바와 같이 (신선하게 단리되기보다) 배양된 세포를 반영한다. 도 17d는 CD62L 및 NKG2C에 대한 이중 양성 마커 발현을 도시하고, 다시 한 번 발현 수준이 배양물에 IL12 및 IL18의 존재로 향상되었다. 상기 데이터는 (가용성이든 또는 막결합이든) IL12 및 IL18과 배양된 NK 세포의 표현형이 보다 강력한 기억 유사 표현형으로 이동함을 반영한다. 몇몇 구현예에서, 상기 표현형은 NK 세포, 특히 키메라 수용체를 발현하도록 조작된 것에 향상된 증폭 능력 및/또는 향상된 세포 독성을 부여하여 보다 강력한 암 면역 요법 생성물을 만든다.
도 18은, IL12 및 IL18의 사용이 (증폭 후 21 일의 세포 독성으로 도시된) 후기 시점에서조차 조작된 NK 세포의 세포 독성을 향상시킴을 도시한다. 특히 도면 상의 2 개의 중앙 지점은, 임의의 그룹 중 가장 큰 세포 독성 효과를 나타내는 NKX101 형질 도입된 NK 세포를 나타낸다. 중요하게, mbIL15 발현 피더 세포 상에서 가용성 IL12 및 18과 함께 배양된 NKX101 형질 도입된 NK 세포가 표적 세포에 대한 가장 높은 정도의 세포 독성을 나타낸다(비제한적인 예로, 여기서 표적은 Reh 백혈병 세포이었다). 따라서, 몇몇 구현예에 따라, NK 세포 배양 중 IL12, IL18, IL21 등과 같은 가용성 자극 인자의 사용이, 표적 세포에 대한 예상외로 향상된 세포 독성뿐만 아니라 (임상적으로 의미있는 세포 수의 생성과 매우 관련된) 예상외로 개선된 세포의 증폭을 제공한다.
실시예 3 - 증폭, 동결 보존 및 세포 독성의 평가
여기 개시된 바와 같이, 몇몇 구현예에서, 증폭된 조작된 NK 세포는 자가 조직 시나리오에 사용하기 위한 것이다. 몇몇 구현예에서, 동종이계 접근법이 사용된다. 몇몇 구현예에서, NK 세포가 "규격품(off the shelf)"인 것으로 설계되고, 이는 증폭되고 조작되었고, 이어서 나중에 환자에 투약을 위해 보존된 NK 세포의 기존 집단을 지칭한다. 몇몇 구현예에서, 보존은 동결 보존을 통한다. 임의의 냉동-해동 주기에서와 마찬가지로, 세포의 생존 능력 및 활성이 문제가 될 수 있다. 도 19는, 배양의 초기에 가용성 IL12/18로 보충된 mbIL15 발현 피더 세포 또는 mbIL15 발현 피더 세포와 배양된 3 명의 상이한 도너 유래 NK 세포의 특성과 관련된 데이터를 도시한다. 표의 하단 3 개의 가로줄은 배양 중 NK 세포에 대한 가용성 IL12 및 18의 플러스의 영향을 증명한다. 증폭 6 일 후에, IL12/18 배지에서 NK 세포의 생존 능력은 약간 더 높았으나, 총 세포 수 및 따라서 배수 증폭은 IL12/18을 사용했을 때 현저하게 더 높았다.
상기 데이터를 기반으로, 세포가 항-CD19 키메라 항원 수용체로 형질 도입되었고, (mbIL15 발현 피더 세포를 사용하여) 가용성 IL12 및 18과 함께 또는 IL12 및 18이 없이 배양되었다. 세포의 일부가 동결 보존되었고, 이어서 대응하는 신선한 세포와 비교되었다. FACS를 사용하여, NK 세포가 FLAG(NK19-1 구조체 내의 태그이나 이는 대응하는 비태그 구조체가 여기에 제공되는 것이 인식되어야 한다)의 발현에 대해 평가되었다. 도 20에 도시된 바와 같이, 신선 및 동결 보존된 세포 둘 다의 3 명의 도너 유래 NK 세포가 CD19 CAR의 발현을 유지한다. IL12/18의 존재는 CAR 발현에 대해 제한된 영향을 갖는 것으로 보인다. 도 21은 증폭 22 일에 동일한 도너 유래 세포를 도시한다. 흥미롭게도, 항-CD19 CAR을 발현하는 세포의 백분율이 21 일에 비해 14 일에 감소했다. 21 일에 구조체의 발현이 신선한 (예를 들어 냉동이 아닌) NK 세포에서 대략 동일했다(3-4 열과 7-8 열을 비교한다). 상기 데이터는, 여기 개시된 방법에 따라 배양된 NK 세포가 강력한 세포 집단이고, 동결 보존에서 생존할 수 있고, 생존 능력을 여전히 유지하며, 구조체를 유도하는 세포 독성의 유의미한 발현 수준을 유지함을 나타낸다.
NK 세포에 대한 동결 보존의 영향의 추가 분석이 수행되었다. Nalm6-핵 적색 세포주가 표적 세포로 사용되었고, 항-CD19 CAR을 발현하는 NK 세포주에 의해 표적화되었다. 비제한적인 예로, 상기 실험은 서열번호 1에 의해 암호화된 CAR을 이용했다. 평가 결과가 도 22a-22b에 제공된다. 도 22a는 평가 시간에 따른 (3 명의 도너 평균) 세포수 곡선을 도시한다. 도시된 바와 같이, 유사한 정도의 Nalm6 표적 세포를 나타내는 비형질 도입된 NK 세포 및 Nalm6 세포 단독이 증가한다. 가용성 IL12/18과 함께 성장한 비형질 도입된 NK 세포는 약간의 세포 독성 효과를 나타냈다(웰 당 세포 수 곡선의 하향 이동). 특히, 배양 14 일에 동결 보존된 세포는 Nalm6 세포에 대한 유의미한 세포 독성 효과를 나타내어 실험의 마지막 시간까지 성장을 제한했다. 유의미하게, 가용성 IL12/18이 있는 배양물에서 성장한 14 일 동결 보존된 세포는 Nalm6 세포 성장을 완전히 제한했다. 몇몇 구현예에서, (선선하든 또는 동결 보존이든) 더 오랜 기간 동안 증폭된 세포는 또한 유의미하게 종양 성장을 감소시킬 수 있다. 14 일의 요약 데이터가 도 22b에 도시된다. 비형질 도입된 NK 세포에 관하여, 배양 0 일에 첨가된 가용성 IL12/18을 이용한 NK 세포의 증폭이 표적 종양 세포에 대한 NK 세포의 세포 독성을 유의미하게 증가시켰다. 유사한 데이터가 CAR을 발현하는 NK 세포에 대해 도시된다. 표적 세포에 대한 거의 80% 세포 독성으로 이어지는 CAR의 존재에도 불구하고, 가용성 IL12/18과 함께 CAR 발현 NK 세포의 배양은 세포 독성을 유의미하게 향상시켰다. 도 22c는, 다양한 E:T 비율에서 증폭 중 배양 배지 내 IL12/18의 존재 또는 부재 하에 배양된 NK 세포에 대한 추가의 세포 독성 데이터를 도시한다. 도시된 바와 같이, 항-CD19 car의 비제한적인 구현예를 발현하도록 조작된 세포가 거의 모든 E:T 비율에서 향상된 세포 독성을 나타낸다. 표적 세포의 수가 증가함에 따라, 여기 개시된 바와 같이 IL12 및 IL18을 사용하여 증폭된 NK 세포의 세포 독성이 피더 세포 단독 상에서 증폭된 세포와 비교하여 향상된 세포 독성 효과를 나타낸다. 총괄하여, 상기 데이터는 배양 배지 내 IL12/18의 사용이 향상된 세포 독성뿐만 아니라 NK 세포의 향상된 증식을 초래한다는 증거를 제공한다. 게다가, 상기 데이터는 세포의 활성이 세포가 동결 보존된 후에도 보존된다는 중요한 추가 증거를 제공한다. 상기 데이터는 일부 구현예에 따라, 강력한 항-종양 효과를 갖는 "냉장고에서 꺼낸(out of the freezer)" 조작된 NK 세포 생성물이 생성되었음을 시사한다.
도 23은 생체 내 실험의 개략도를 도시하고, 여기서 간세포 암종 세포가 도너 마우스 내로 주사되고, 다양한 배양 조건을 이용하여 성장한 NK 세포가 투여된다. 이후 종양 부담이 생물 발광을 이용하여 모니터링된다. 투여된 세포는, 1 일에 가용성 IL12/IL18로 보충된 배지에서 성장한 비형질 도입된 NK 세포, IL2로 성장한 NKX101을 발현하는 NK 세포 또는 1 일에 가용성 IL12/IL18로 보충된 배지에서 성장한 NKX101을 발현하는 NK 세포 중 어느 하나이다. 모든 세포가 mbIL15 발현 피더 세포 상에서 성장했다. 도 24는 시간의 흐름에 따른 종양 부담 분석의 결과를 도시한다. 비형질 도입된 NK 세포를 받은 것뿐만 아니라 대조군 동물은 시간의 흐름에 따라 중간의 종양 성장을 나타냈다. 그에 반해, NKX101을 발현하고 IL12/18 또는 IL2로 성장한 NK 세포를 받은 상기 동물은 유의미하게 더 많은 항-종양 효과를 나타냈다. 종양 부담은 2 개의 그룹 모두에서 감소했고, IL2 그룹에서 14 일에서 21 일까지 단지 약간 증가했다. 상기 데이터는 배양된 NK 세포의 세포 독성을 향상시키기 위해 증폭 배양 배지에 IL12, IL18, 또는 IL21과 같은 자극성 사이토카인의 사용을 더 강화한다.
도 25는 유사한 실험 설정을 도시하고, 이번에는 Nalm6 세포의 이종 이식 및 항-CD19 CAR을 발현하는 NK 세포로 치료한다. 도 26a는 결과적인 생물 발광 데이터를 도시한다. 선행 실험과 마찬가지로, 대조군 동물 및 비형질 도입된 NK 세포를 받은 동물은 후기 시점에 하락하기는 하나 종양 부담에서 빠른 증가를 나타냈다. NK19-1(항 CD-19 CAR)을 발현하는 NK 세포를 받은 동물은 종양 성장의 효과적인 지연을 나타냈고, 후기 시점까지 유의미한 성장을 제한했다. NK19-1을 발현하고 IL12/18로 성장한 세포는 종양 성장의 놀라운 제어를 나타냈고, 다른 그룹과 비교하여 실험의 후기 단계까지 및 이어서 심지어 현저하게 더 낮은 전반적인 종양 부담으로 증가를 제한했다. 생존과 관련되 추가 데이터가 도 26b에 도시된다. PB(대조군) 또는 NT NK 세포를 받은 마우스는 30 일 경에 생존의 가파른 하락을 나타냈다. NK19-1을 받은 동물은 상기 그룹보다 더 오래 생존했고, NK19-1 IL12/18 동물은 다른 모든 그룹에 생존체가 없는 경우에서조차 여전히 80% 생존 가능했다. 도 26c 및 26d는, 이들이 IL12/18로 보충된 배지에서 배양되었을 때 생체 내에서 NK 세포의 지속성과 관련된 데이터를 도시한다. 도 26c는 뮤린 총 말초 혈액 중 인간 CD56+(NK 세포에 대한 마커) 세포의 백분율 측정치를 도시한다. 도시된 바와 같이, 가용성 IL12/18을 이용한 NK 세포의 증폭은, 투여 후 18 일에서조차 뮤린 혈액 내 인간 NK 세포의 유의미하게 보다 많은 백분율을 초래한다. 이는 증폭 중 자극성 사이토카인의 사용을 통해 NK 세포에 부여된 향상된 지속성을 증명한다. 마찬가지로, 생체 내에서 지속하는 것인 일반적으로 NK 세포일뿐만 아니라 CAR을 발현하는 것은 가용성 IL12/18 (또는 다른 자극성 분자)의 사용을 통해 향상된 지속성을 누린다. 도 26d는, 이종 이식 수용체 마우스에서 주사 후 18 일에 (총 뮤린 말초 혈액 세포수 중) 항-CD19 CAR 양성 NK 세포의 백분율을 도시한다. 선행 도면에서와 마찬가지로, 상기 데이터는, 조작된 면역 세포, 예를 들어 키메라 항원 수용체를 발현하는 NK 세포는 하나 이상의 자극성 사이토카인을 사용하여 증폭될 경우 생체 내에서 향상된 지속성을 나타낸다. 추가 실험을 수행하여 증폭 배양에 사용된 사이토카인의 영향 및 NK 세포에 의한 CAR의 발현에 대한 동결 보존 (또는 이의 결여)의 영향을 평가했다. 도 26e는, 배양 15 일에 항-CD19 CAR의 비제한적인 구현예의 발현이 사이토카인이 증폭 배양에 사용될 경우 변하지 않는다는 것을 도시한다. 즉, 하나 이상의 추가 자극성 분자를 사용하여 증폭 배양에 근거한 여기 입증된 향상된 효과는 감소된 CAR 발현에 의해 상쇄되지 않는다. 게다가, NK 세포의 동결 보존은 조작된 NK 세포에 의한 CAR의 발현에 악영향을 미치지 않는다. 도 26f는 CAR 발현이 배양 중 추가 시간 후에 약화되지 않는다는 것을 확인해 준다. 상기 데이터는, 다른 것들 중 IL12 및 IL18과 같은 자극성 사이토카인의 영향 하에 성장한 NK 세포의 향상된 세포 독성, 이의 지속성 및 이에 의한 안정적인 CAR 발현을 또 다시 지지한다. 마찬가지로, 조작된 NK 세포의 동결 보존이 상기 유리한 특성에 유의미하게 악영향을 미치지 않는다.
실시예 4 - NK 세포의 세포 독성, NK 세포 특성 및 NK 세포의 생존에 대한 동결 보존 및 증폭의 영향을 평가하는 추가 실험
추가 실험이 수행되어 동결 보존 후 해동에 의한 프로세스가 예를 들어 이의 생존 능력, 지속성 또는 세포 독성을 감소시킴으로써 조작된 NK 세포에 악영향을 미치는지 여부를 결정했다. 도 27a는 사용된 실험 그룹 및 다른 조건뿐만 아니라 이용된 개략적인 실험 프로토콜을 도시한다. 상기 기재된 바와 같이, "IL12/IL18" 표시된 처리 그룹의 경우, 세포가 여기 기재된 구현예와 부합되게 가용성 IL12 및/또는 IL18의 존재 하에 증폭되었다. 처리 그룹은 대조군으로 신선한, 비형질 도입된 NK 세포(G1) 및 PBS(G2)를 포함한다. 실험 그룹은, 항-CD19 CAR의 비제한적인 구현예를 발현하도록 조작되고 추가의 자극성 사이토카인이 없이(G5, G6) 및 이와 함께(G7, G8) 증폭된 신선한 NK 세포뿐만 아니라 항-CD19 CAR의 비제한적인 구현예를 발현하도록 조작되고 추가의 자극성 사이토카인이 없이(G3) 및 이와 함께(G4) 증폭된 동결 보존되고 해동된 NK 세포를 포함했다. 혈액 수집 및 영상화가 도 27a의 지시된 시점에 수행되었다.
도 27b 및 27c는 지시된 실험 그룹의 생체 내 생물 발광 영상화를 도시한다. 도 28a-28h는 시간의 흐름에 따른 생물 발광 강도를 반영하는 선 그래프를 도시한다. 상기 데이터가 처리 후 처음 30 일을 도시하는 도 28i 및 56 일 전체의 데이터를 도시하는 도 28j에 요약된다. 도 28i는 CD19 CAR을 발현하는 NK 세포와 2 개의 대조군 사이에 명확한 차이를 도시하나, 각 실험군은 실험의 처음 30 일에 걸쳐 측정된 BLI(증가된 BLI는 증가된 종양 성장을 나타낸다)의 비-검출 가능한 증가로 제한됨을 보여주고 이는 종양 성장의 제어를 나타낸다. 도 28j는 56일 전체의 데이터를 도시하며, 다양한 CAR 구조체를 발현하고 종양 세포 성장을 억제하는 지시된 조건 하에서 프로세싱된 실험군의 보다 큰 분리가 존재한다. 대조군 그룹(G1 및 G2)은 상당히 증가된 종양 성장을 나타내어 상기 그룹에 대해 30 일에 실험의 중단이 초래되었다. 항-CD19 CAR을 발현하고 가용성 인터류킨을사용하지 않고 증폭된 신선한 NK 세포를 받은 그룹(G5)은 30 일 내지 56 일에 BLI의 선명한 증가를 나타냈다. 상기 그룹의 또 다른 실험 복제(G6)는 종양 성장을 억제하는 보다 현저한 능력을 나타냈다. 항-CD19 CAR을 발현하고 가용성 인터류킨을사용하지 않고 증폭된 냉동된 NK 세포를 받은 그룹(G3)은 신선한 세포로 검출된 것과 동일한 정도는 아니나 30 일 내지 56 일에 BLI의 증가를 또한 나타냈다. (여기 개시된 구현예에 따라) 증폭 중 추가 자극 인자를 사용하여 증폭되었던 신선하든지 냉동이든지 NK 세포를 발현하는 항-CD19 CAR을 받은 실험 그룹은 종양 성장의 가장 강력한 저지를 나타냈다. 특히, 둘 다 동결 보존된 NK 세포이었던 그룹 4 및 8은 가장 많은 종양 성장의 억제를 나타냈다. 조작된 신선한 NK 세포가 투여되었을 경우에 수집된 데이터와 조합하여 상기 데이터는 몇몇 구현예에 따라, 항-CD19 CAR을 발현하는 조작된 NK 세포가 신선하게 제조 및 투여되었을 경우뿐만 아니라 (예를 들어 특정 동종 이계 구현예에서와 같이) 제조, 냉동, 이어서 해동 및 투여되을 경우에도 효과적임을 나타낸다.
도 29는 56 일의 실험에 걸쳐 지시된 구조체로 처리된 마우스 몸무게의 선 그래프를 도시한다. 체중의 감소는 증가된 종양 성장과 상관 관계가 있는데, 예를 들어 종양의 진행은 마우스의 건강 저하 및 상응하는 체중의 손실(예를 들어 소모성)을 초래한다. 도시된 바와 같이, 대조군 그룹은 30 일까지 몸무게의 실질적인 손실을 나타내나, 실험 그룹 중 하나를 제외하고 모두가 대부분의 설험에서 몸무게가 증가하고 있다. 상기 논의된 생물 발광 데이터에서와 마찬가지로, 신선한 대 냉동 제조 중 많은 것이 체중에 대해 실질적으로 유사한 효과를 나타낸다는 것은 주목할 만한 경향이다. 몇몇 구현예에 따라, 항-CD19 CAR을 발현하는 조작된 NK 세포는 신선하게 제조 및 투여될 경우에도 효과적이다. 게다가, 몇몇 구현예에 따라, 항-CD19 CAR을 발현하는 조작된 NK 세포는 (예를 들어 동종 이계 상황에서와 같이) 제조, 냉동, 이어서 해동 및 투여되을 경우에도 효과적이다.
추가 데이터가 수집되어 하나 이상의 추가 자극 인자를 사용 또는 사용하지 않은 채 증폭된 NK 세포의 특징을 특성화했다. 도 30a는 배양 중 NK 세포의 수명(예를 들어 지속성)과 관련된 데이터를 도시한다. 상기 데이터는 (활성화 키메라 수용체(Activating Chimeric Receptor, ACR) 양성에 근거한) 조작된 NK 세포의 백분율(CD56 양성에 근거)을 도시한다. 상기 데이터는 증폭 중 추가 자극 인자, 예를 들어 IL12 및/또는 IL18과 함께 또는 없이 증폭된 NK 세포가 생체 내에서 유사한 지속성 프로필을 나타내고, 상기 조작된 NK 세포는 약 7 일에 걸쳐 혈액에서 상대적으로 일정한 수준(약 5-10%)으로 존재한다는 것을 나타낸다. 또 다시 조작된 CAR 발현의 검출 및 CD56 양성에 근거하여 측정하여 동물의 혈액에 존재하는 NK 세포의 백분율이 ~50 일에 걸쳐 측정되었고, 이의 데이터가 도 30B에 도시된다. 7 일의 기간에 걸친 유사한 프로필과 대조적으로, 하나 이상의 추가 자극 인자를 사용하지 않고 증폭된 NK 세포는 약 25-30 일 후에 수가 감소하기 시작했다. 상기 세포는 약 48 일까지 수에서 느린 감소가 계속되었고, 이때 세포 수가 0에 가까웠다. 약 25-30 일의 동일한 시점으로부터, 추가 자극 인자(예를 들어 몇몇 구현예에 따라 IL12 및/또는 IL18)로 증폭된 조작된 NK 세포가 45 일 동안 약 10%로 혈액 내에 계속 존재했다. 마지막 3 일이 지나서 단지 약간의 감소(약 5-7%로)가 있었다. 상기 데이터는, 하나 이상의 추가 자극 분자, 예를 들어 IL12, IL18, 및/또는 IL21의 사용이 상기 자극 분자를 사용하지 않고 배양/증폭된 NK 세포와 비교하여 조작된 NK 세포에 생체 내에서 향상된 지속성을 부여한다는 강력한 지표이다. 도 30c는 계수된 10,000 개의 살아있는 세포 당 조작된 CAR-발현 NK 세포 수의 카운트에 근거한 상이한 방식으로 지속성 데이터를 제시한다. 상기 데이터는 도 30b에 도시된 일반적인 경향을 반영한다, 즉, 하나 이상의 자극 분자(예를 들어 가용성 IL12 및/또는 가용성 IL18)의 사용으로 증폭된 세포는, 상기 자극 분자를 사용하지 않고 증폭된 조작된 NK 세포와 비교하여 연장된 기간에 걸쳐 보다 많은 수로 혈액 내에 남아있다. 몇몇 구현예에서, 여기 개시된 방법은 특정 사이토카인 기반 증폭 방법 중 흔한 사이토카인 중독을 회피한다는 점에서 특히 유리하다. 일부 방법에서, 높은 농도의 가용성 사이토카인의 사용이 세포의 성장을 촉진하나, 세포는 상기 농도에 익숙해져 자라고, 예를 들어 환자에 투여 시 상기 인공적인 조건없이 환경에 노출될 경우 철회의 징후(예를 들어 세포 자멸사, 감소된 생존 능력 또는 다른 기능적 감소)를 나타낸다. 여기 개시된 방법에 따라 증폭된 조작된 NK 세포에 의해 나타난 지속적인 높은 사이토카인 농도를 요구할 필요가 없는 것은 적어도 부분적으로 생체 내에서 세포의 보다 긴 수명 (및 활성 수명)에 기여한다.
도 31a-31c는 여기 개시된 구현예에 따라 생성된 조작된 NK 세포를 특성화하는 추가 데이터를 도시한다. 상기 데이터는, 항-CD19 CAR을 발현하고 여기 개시된 몇몇 구현예에 따라 가용성 IL12 및 가용성 IL18을 사용하여 증폭된 신선한 (동결 보존되지 않은) 조작된 NK 세포가 투여된 (투여 후 51 일에) 3 마리의 마우스의 혈액에서 수집된다. 데이터는 (조작된 항-CD19 CAR을 발현하는 세포를 나타내는) CD19-Fc 양성 및 (NK 세포를 나타내는) CD56 양성인 전혈 샘플 유래 세포의 비율을 도시한다. 각각의 도 31a, 31b 및 31c에 도시된 바와 같이, 이중 양성 세포의 비율(상단 오른쪽의 박스 영역)은 약 4.75% 내지 약 6.7%의 범위이다. 도 32a-32c는 도 31과 동일한 마우스 유래 전혈의 분석을 도시하나, (조작된 항-CD19 CAR을 발현하는 세포를 나타내는) CD19-Fc 양성 및 (T 세포를 나타내는) CD3 양성인 세포를 식별한다. 상기 데이터는 항-CD19 CAR을 발현하는 대부분의 세포가 이들이 T 세포가 아님을 의미하는 CD3에 대해 음성임을 입증한다. 몇몇 구현예에 따라, 특정 NK 세포 생성 방법은 초기 도너 전혈 샘플에서 T 세포를 제거하는 단계를 포함하나, 명목상의 T 세포 수는 남아있을 수 있다. 그러나, 몇몇 구현예에서, 도 31a-32c에 도시된 데이터와 부합되게, 항-CD19 CAR을 발현하는 대부분의 조작된 세포가 NK 세포의 특징을 나타내고(CD56-양성), T 세포의 특징을 나타내지 않는다(CD3-음성).
도 33, 34, 및 35는 종양 접종 후 다양한 시점에 동물의 전혈 유래 세포를 더 특성화하는 데이터에 관한 것이다. 도 33은 투여 후 4 일의 데이터에 관한 것이고, 도 34는 종양 접종 후 12 일의 데이터에 관한 것이며, 도 35는 종양 접종 후 18 일의 데이터에 관한 것이다. 상기 데이터는 대조군으로 처리되고 비형질 도입된 NK 세포(NT NK) 또는 PBS를 받은 동물의 전혈 유래 또는 각 조건에 대해 신선 및 냉동된 처리 그룹으로 배양 중 IL2 또는 배양 중 IL12/18로 증폭된 조작된 NK 세포를 받은 다른 그룹 중 하나 유래 세포에 관한 것이다. 도 33a는 4 일에 동물의 전혈에서 NK 세포(CD56-양성/CD3-음성)의 백분율을 도시한다. 각 처리 그룹이 상기 점에서 상대적으로 유사했고, 전혈의 약 3-5%의 세포가 조작된 NK 세포이었다. 도 33b는 항-CD19 CAR의 비제한적인 구현예를 특이적으로 발현하는 세포의 백분율과 관련된 데이터를 도시한다. 도 33a와 매우 유사하게, 각 처리 그룹 내 항-CD19 CAR 발현 세포의 백분율이 약 3-5% 범위이다. 도 33c는 투여 후 4 일에 혈액에 존재하는 GFP 양성 종양 세포의 백분율과 관련된 데이터를 도시한다. 앞의 도면에 도시된 BLI 영상화와 일관되게, 임의의 처리 그룹에 검출 가능한 종양 세포가 거의 존재하지 않는다. 검출된 낮은 신호는 (혈액 샘플 그 자체에서는 아니나 이들을 BLI 영상화에 의해 잠재적으로 검출 가능하게 만드는) 순환으로부터 다양한 조직 내로 GFP+ 종양 세포의 이동을 반영하는 것일 수 있다. 도 34a-34c는 종양 접종 후 12 일에 대응하는 데이터를 도시한다. 보다 이른 시점의 경우에서와 같이, 샘플 내 약 3%-5%의 혈액 세포를 초래한 각 처리 그룹은 NK 세포이었다(도 34a). 도 34b는 항-CD19 CAR 구조체에 양성인 세포의 백분율을 도시한다. 발현 수준이 상기 시점에서 처리 그룹 간에 유사했으나, 각 실험 그룹은 대조군 그룹 이상의 현저한 수준으로 존재했다. 또한, 12 일에, 항-CD19 발현 CAR 세포(예를 들어 NK 세포)의 백분율이 약간 더 높았고(혈액 세포의 약 7-9%), 이는 순환 중 조작된 세포의 증가된 지속성을 시사한다. 도 34c는 전혈 내 종양 세포의 수를 도시한다. 흥미롭게도, BLI 영상화는 특히 대조군에서 증가된 발광을 나타냈으나, 모든 그룹이 GFP 발현을 거의 나타내지 않았다. 또 다시, 상기 데이터는 특정 종양 세포 현탁액이 나타내는 생리학적 "거주(residency)"를 반영할 수 있다.
도 35a는 종양 접종 후 18 일에 (CD56 양성에 근거한) NK 세포의 백분율을 도시한다. 모든 실험 그룹은 대조군 그룹과 비교하여 현저하게 더 높은 백분율을 나타내고, 그룹들은 전혈 세포의 약 15% 내지 약 25% 범위이다. 상기 증가된 백분율은 도 30b 및 30c에 도시된 바와 같은 증가된 NK 세포의 시간 창과 일치한다. 상기 특정 실험에서 통계적으로 상이하지 않으나, 상기 데이터는 IL12/IL18 배지에서 증폭되고 동결 보존된 NK 세포가 실험 그룹 중 가장 풍부했음을 나타낸다. 몇몇 구현예에 따라, 동결 보존과 결합된 피더 세포 플러스 사이토카인 기반 증폭이, 보다 전형적인 사이토카인 조건(예를 들어 사이토카인 중독없이) 하에서 생존할 수 있고, 건강한 상태로 보다 오랜 기간 동안 지속할 수 있는 보다 강력한 NK 세포를 산출한다. 도 35b 및 35c는 18 일에 종양 부담의 2 개의 측정치를 도시한다. 도 35b는, 항-CD19 PE 결합된 항체를 사용하여 측정된 바와 같이 CD19(상기 비제한적인 구현예로 조작된 CAR의 표적) 양성인 혈액 내 세포의 백분율을 도시한다. 상기 데이터는, 대조군 그룹 내 종양 부담 및 그에 반해 종양 성장을 제한하는 처리 그룹의 조작된 NK 세포의 능력에 대한 경향을 도시한다. 도 35c는 GFP 신호의 검출(예를 들어 ~BLI)을 통하나 유사한 데이터를 도시한다. PE- 대 GFP-기반 검출의 민감도로 인해 35b의 것과 상이하나 상기 데이터는 유사한 경향을 나타낸다. 실험의 NK 세포는 대조군과 비교하여 종양 세포의 증폭을 방지하는 향상된 능력을 나타낸다. 도 35d는 조작된 항-CD19(예를 들어 CD56 및 CD19 Fc 둘 다 양성)를 발현하는 NK 세포의 수와 관련된 데이터에 관한 것이다. 도 35a의 데이터와 유사하게, 상기 데이터는, 핼액 샘플 내 NK 세포의 증가된 백분율이 조작된 항-CD19 CAR을 발현하는 NK 세포이고 이는 이의 향상된 지속성을 반영함을 나타낸다. 도 35e는, CAR 양성인 각 실험 그룹의 거의 모든 NK 세포 집단이 여기 개시된 항-CD19 CAR을 발현하도록 조작된 NK 세포임을 확인해주는 데이터를 도시한다.
여기 개시된 구현예에 따라 증폭된 조작된 NK 세포의 지속성을 더 조사하기 위해, 여기 개시된 바와 같은 가용성 사이토카인을 이용하여 증폭된 두 개 용량의 조작된 NK 세포가 마우스에 투여되었고, 세포 수가 추가 4 주에 걸쳐 추적되었다(도 27a에 따른 투여 프로토콜). 도 36은 상기 데이터의 박스 플롯을 도시한다. 간략하게, 박스 플롯의 X 축은 2 가지 형태: i) 제 3 투여 후 시간 또는 ii) 종양 접종이래 총 시간(괄호 안에 표시)로 시간을 나타낸다. Y 축은 (10,000 개의 백혈구 당) 항-CD19 CAR 발현 NK 세포의 수를 나타낸다. 2백만 개의 NK 세포 용량에 대한 박스 플롯이 하단의 추적 박스(점선 화살표로 표시)인 반면, 5백만 개의 세포 용량은 상단 추적(실선 화살표로 표시)이다. 상기 데이터는, (여기 몇몇 구현예에 기재된 바와 같은 피더 세포와 함께) 하나 이상의 자극 분자(예를 들어 IL12 및/또는 IL18)가 사용된 조건에서 증폭된 조작된 NK 세포의 반감기가 피더 세포 단독 조건에서 증폭된 조작된 NK 세포와 비교하여 연장된 것을 나타낸다. 2백만 개의 조작된 NK 세포 용량의 반감기는 ~15 일이다. 하나 이상의 제거 및/또는 분포량의 분산에 근거하여, 5백만 개의 조작된 NK 세포 용량의 반감기는 ~18 일이다. 이는 도 37에 도시된 하나 이상의 추가 자극 분자를 사용하지 않고 증폭된 또 다른 조작된 NK 세포의 용량과 대조적이고, 5백만 개의 세포 용량에 대한 ~5 일의 반감기를 나타낸다. 따라서, 여기 개시된 몇몇 구현예에 따라, 피더 세포 시스템과 함께 하나 이상의 추가 사이토카인을 사용한 조작된 NK 세포의 증폭이 NK 세포의 증가된 증폭을 가능하게 하고, 향상된 지속성 및/또는 세포 독성을 상기 세포에 부여한다.
실시예 5 - 다중-펄스 피더 세포 및 향상된 NK 세포 증폭
본원에 개시된 구현예는 NK 세포의 강력한 증폭을 초래하지만, 증폭된 NK 세포에 부여된 유리한 특성을 유지하고/하거나 세포의 해로운 효과 또는 특성을 최소화하면서, 더 큰 정도의 증폭이 달성될 수 있는지를 결정하기 위해 추가 구현예가 평가되었다. NK 세포를 40 단위/mL의 IL2가 보충된 배지에서 피더 세포(여기서, 막-결합된 IL15 및 4-1BB 리간드를 발현하는 K562 세포가 피더 세포의 비제한적인 예로서 사용됨)와 1:10 비로 플레이팅하였다. NK 세포를 제대혈 또는 말초 혈액으로부터 수득하였다. NK 세포를 ~3주 동안 배양하고, 0일째에 시작하여 7일째 및 14일째에 새로운 피더 세포 및 배지로 다시 펄싱하였다. 증폭된 세포를 7일째, 14일째, 22일째 및 29일째에 계수하였다. 증폭 결과를 도 41a에 그래프로 나타내고, 도 41b에 수치로 요약하였다. 증폭된 각각의 샘플은 22일째에 세포 수의 피크에 도달하였고, 29일째까지 대략 동일한 수로 유지되었다. 이들 데이터는 세포 증폭이 약 100,000배 내지 백만배 초과(말초 혈액으로부터의 NK 세포의 경우)의 범위임을 보여준다.
본원에서 논의된 바와 같이, 몇몇 구현예에서, 배양 배지는 IL12 또는 IL18 중 하나 이상으로 보충된다. 이러한 구현예에 대한 추가 정보는 2020년 7월 29일자로 출원된 국제출원 제PCT/US2020/044033호에 개시되어 있으며, 상기 국제출원은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 다중-펄스 증폭 포맷으로 사용될 때 그 효과를 조사하기 위해, 배지를 40 IU/mL의 IL2 및 20 μg/mL의 IL12로 보충하고, 제대혈 또는 말초 혈액으로부터의 NK 세포를 0일째, 7일째 및 14일째에 펄싱하고, 7일째, 14일째, 22일째 및 29일째 계수할 때 사용하였다. 증폭 결과를 도 42a에 그래프로 나타내었고, 도 42b에 수치로 요약하였다. 흥미롭게도, 세포 증폭은 여러 샘플에서 22일째에 그의 피크에 도달하였지만, 하나의 도너로부터의 말초 혈액에서는 29일째 피크에 도달하였다. 이들 데이터는 IL12가 특히 말초 혈액으로부터의 NK 세포의 증진된 증폭을 촉진할 수 있음을 보여준다.
유사하게, 배양 배지를 0.05 ng/mL의 IL18(및 40 IU/mL의 IL2)로 보충함으로써 IL18의 효과를 조사하였다. 증폭 결과를 도 43a에 그래프로 나타내었고, 도 43b에 수치로 요약하였다. 이들 데이터는 IL18이 제대혈 및 말초 혈액-유래 NK 세포 둘 다에 대해 실질적인 세포 증폭을 유도할 수 있음을 보여준다. 하나의 도너는 7일째 및 14일째 (뿐만 아니라 배양의 초기에) 초기 NK 세포를 펄싱한 결과로서 NK 세포의 백만배 초과의 증가를 보여주었다.
도 44a 및 44b는 제대혈-유래 또는 말초 혈액-유래 NK 세포를 IL12(20 ng/mL) 및 IL18(0.05 ng/mL) 둘 다 (뿐만 아니라 40 IU/mL의 IL2)로 보충된 새로운 피더 세포 및 배지로 펄싱한 결과를 보여준다. NK 세포를 7일째 및 14일째에 (뿐만 아니라 배양의 초기에) 펄싱하고, 세포를 7일째, 14일째, 22일째 및 29일째 계수하였다. 흥미롭게도, 이들 데이터는 3 펄스 접근법으로, IL12 및 IL18 보충된 배지의 조합이 감소된 세포 증폭을 초래하였음을 나타내며, 이는 아마도 세포가 IL12, IL18 및 IL2의 반복된 제시에 의해 과자극되거나 증폭 고갈로 유도되었음을 시사한다. 이는, 그 안에 개시된 일부 구현예에 따르면, 가용성 IL12 및 IL18의 첨가(그러나, 이 특정 실험에서와 같이, 3-펄스 방식으로는 아님)가 강건한 NK 세포 증폭을 유도함을 나타내는 2020년 7월 29일자로 출원된 국제출원 제PCT/US2020/044033호에 제시된 데이터와 대조적이다.
증폭하는 면역세포, 여기서는 NK세포에 관한 피더 세포 및 자극성 사이토카인의 다수의 펄스의 효과를 추가로 특성화하기 위해, 추가 데이터를 수집하여 세포의 CD3-양성 하위집단의 증폭을 평가하였다. 일부 구현예에 따르면, NK 세포는 정제되지만(예를 들어 T 세포 및 다른 비-NK 세포를 제거하기 위해), 일부 작은 잔류 T 세포 하위집단이 남아있다. 대안적으로, 일부 구현예에 따르면, NK 세포는 증폭 전에 정제되지 않는다. 따라서, 특정 조건 하에서, T-세포 하위집단은 도너로부터 수집된 세포의 증폭으로부터 생성될 수 있다. 이는 도 45a-45e에서 평가된다. 도 45a는 혈액 세포의 출발 집단(NK 세포(도 45b-e의 출발 물질은 CBMC 또는 PBMC였던 것과 대조적임))이 고농도의 IL2로 증폭되었을 때 CD3-양성 집단의 제한된 증폭을 보여준다(데이터는 CD3-양성인 세포의 백분율로서 제시됨). 대조적으로, 도 45b는 3-펄스 증폭 설정에서 IL12의 사용이 시간 경과에 따라 CD3-양성 세포의 더 큰 정도의 증폭을 초래함을 보여준다. 3-펄스 증폭 동안 IL18의 사용은 도 45c에 제시된 바와 같이 CD3-양성 세포의 성장을 증가시키지 않았다. 조합으로 IL12 및 IL18의 사용은 CD3-양성 하위집단에서 유사한 증가를 초래하였고(도 45d 참조), 따라서 IL12의 존재는 심지어 IL18과 조합으로 적어도 특정 조건 하에서 세포의 CD3-양성 하위집단의 증폭을 초래할 수 있음을 나타낸다(이러한 세포가 증폭될 세포의 출발 집단에 존재하는 경우). 도 45e는 제어 조건 하에서 제한된 CD3-양성 증폭을 보여준다. 따라서, 몇몇 구현예에서, IL12는 CD3-양성 하위집단의 증폭을 초래하지 않는 농도로 사용되거나, 또는 IL12는 IL2를 사용한 이전 펄스와 동일한 농도로 주어진 펄스에서 사용된 배지 내로 도입되지 않는다. 몇몇 구현예에서, IL12는 증폭 동안 사용된 펄스의 총 수보다 적은 수, 예를 들어 모든 다른 펄스, 모든 제 3 펄스 등으로 배지 내에 포함된다. 몇몇 구현예에서, IL12는 약 20 ng/mL 미만, 예를 들어 약 15 ng/mL, 약 12 ng/mL, 약 15 ng/mL, 약 15 ng/mL, 약 15 ng/mL, 또는 열거된 것들 사이의 임의의 농도로 존재한다. 몇몇 구현예에서, IL12가 사용되는 경우에도, CD3-양성 세포 증폭을 상쇄시키는 IL18의 농도, 예를 들어 약 0.07 ng/mL, 약 0.10 ng/mL, 약 0.12 ng/mL, 약 0.15 ng/mL, 약 0.2 ng/mL, 또는 그 초과가 사용된다. 일부 구현예에서, CD3-양성 세포 증폭에도 불구하고, CD3-양성 하위세트의 전체 성장은 NK 세포 성장(예를 들어 CD56+/CD3- 세포)에 의해 상쇄되어, CD3-양성 세포의 백분율은 전체 생성된 증폭된 집단에서 무시할만하다. 몇몇 구현예에서, CD3-양성 세포가 증폭 후 검출되는 경우에, 이들은 예를 들어 고체 상 친화도(예를 들어 세파로스 비드(Sepharose beads) 또는 항-CD3 항체를 보유하는 또 다른 고체 지지체)에 의해 제거된다.
다양한 조건 하에 증폭된 NK 세포 상의 활성화 NKG2C 수용체의 발현 정도에 관한 추가의 데이터를 수집하였다. 도 46a는 높은 IL2로 성장시켰을 때 시간 경과에 따른 NKG2C를 발현하는 NK 세포의 백분율을 나타내는 반면, 도 46b는 동일한 세포를 나타내지만, 전체 MFI(이는 반드시 %-양성 데이터에 의해 입증되지는 않는 더 큰 정도의 NKG2C를 발현하는 세포를 설명함)에 관하여 데이터가 발현되었다. 3개의 펄스를 갖는 배양 배지에서의 IL12의 사용은 약 22일(도 46c)에 걸쳐 NKG2C 발현의 시간-의존성 증가를 발생시켰고, 그 후 주어진 세포에 의해 전체 발현이 떨어졌다(도 46d). 배지에서의 IL18은 시간 경과에 따른 발현의 약간 증진된 안정성에도 불구하고 NKG2C 발현의 유사한 프로파일을 발생시켰다(도 46e 및 46f). 3-펄스 증폭과 조합된 IL12 및 IL18의 사용은 시간 경과에 따른 NKG2C 발현의 꾸준한 증가를 발생시켰고, NKG2C를 발현하는 세포의 백분율은 개별적으로 사이토카인과 유사한 수준에 도달하였다. 그러나, 조합은 개별적으로 유발된 사이토카인으로서 14일과 22일 사이에 일반적 감소를 발생시키지 않았다. 더욱이, MFI에 의해 측정된 바와 같이, IL12 및 IL18의 사용은 NKG2C 발현의 "밀도"를 함께 증진시켰다(도 46h). 대조군 NKG2C 데이터는 도 46i 및 46j에 제시되어 있다.
다양한 조건 하에 증폭된 NK 세포에 의한 다양한 마커(예를 들어 활성화 또는 억제 마커)의 발현에 관한 추가의 특성화 데이터를 수집하였다. 도 47a는 다중-펄스 증폭 프로토콜이 활성화의 마커, 예를 들어 천연 세포독성 수용체 NKp46 및 NKp44, NKG2C 수용체 및 글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체(GITR)의 증가된 발현을 발현하는 NK 세포의 백분율의 증가를 발생시킨다는 것을 나타내는 데이터를 제시한다. 흥미롭게도, 도 47b에 제시된 바와 같이, 2종의 억제 마커인 체크포인트 수용체 TIGIT 및 TIM3(T 세포 관용성에 관여하는 단백질 도메인)이 또한 증가되었다.
도 48a 내지 48b는 0 일(원) 또는 7 일(사각형)에서의 활성화(도 48a) 또는 억제(도 48b) 마커의 발현의 추가의 평가에 관한 것이다. 도 48a는 상기 논의된 바와 같이, 천연 세포독성 수용체 NKp44 및 NKp46이 0 일(펄스 1)에 비해 펄스 배양의 7 일에 더 많은 NK 세포에 의해 발현된다는 것을 보여준다. 활성화의 다른 마커, 예를 들어 2B4 발현, CD25 발현은 배양 동안 일관되게 상승된 채로 유지되는 DNAM-1 발현이며, 이들 마커를 발현하는 NK 세포의 대략 75% 이상을 갖는다. 도 48b는 펄스 배양 접근법을 사용할 때 TIGIT 및 TIM3이 시간에 따라 적당히 증가된다는 추가 데이터를 보여준다. 그러나, 몇몇 구현예에서, 증폭 동안 사용된 다수의 펄스는 활성화된 NK 세포의 특성을 발현하는 임상적으로 관련된 NK 세포의 생성을 가능하게 함으로써, 암 면역 요법에서 이들의 사용을 가능하게 한다.
상기 개시된 구현예의 특정 특징 및 측면의 다양한 조합 및 하위 조합이 이루어질 수 있고, 본 발명의 하나 이상 내에 여전히 속할 수 있음이 고려된다. 또한, 구현예와 관련된 임의의 특정 특징, 측면, 방법, 특질, 특성, 자질, 속성, 요소 등의 여기 개시는 여기에 제시된 다른 모든 구현예에 사용될 수 있다. 그러므로, 개시된 구현예의 다양한 특징 및 측면이 개시된 발명의 다양한 방식을 형성하기 위해 서로 조합되거나 치환될 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 여기 개시된 본 발명의 범위가 상기 기재된 특정 개시 구현예에 의해 제한되어서는 안되는 것으로 의도된다. 또한, 본 발명은 다양하게 변형되기 쉽고, 이의 대안적인 형태, 특정 실시예가 도면에 도시되었으며 여기서 상세하게 설명된다. 그러나, 본 발명은 개시된 특정 형태 또는 방법으로 제한되어서는 안되고, 반대로 본 발명은 기재된 다양한 구현예 및 첨부된 청구 범위의 사상 및 범위 내에 속하는 모든 변형, 등가물 및 대안을 포함해야 한다는 것이 이해되어야 한다. 여기 개시된 임의의 방법은 재인용된 순서로 수행될 필요는 없다. 여기에 개시된 방법은 실무자에 의해 취해지는 특정 행동을 포함하나; 이는 명시적으로 또는 함축적으로 상기 행동의 임의의 제 3자 지침을 또한 포함할 수 있다. 예를 들어 "증폭된 NK 세포 집단의 투여(administering a population of expanded NK cells)"와 같은 행동은 "증폭된 NK 세포 집단의 투여 지시(instructing the administration of a population of expanded NK cells)"를 포함한다. 또한, 본 개시의 특징 또는 측면이 마쿠시(Markush) 그룹의 관점에서 기재된 경우, 당업자는 이로써 본 개시가 마쿠시 그룹의 임의의 개별 멤버 또는 하위 그룹의 멤버의 관점에서 또한 기재된다는 것을 인식할 것이다.
여기 개시된 범위는 임의의 및 모든 중복, 하위 범위 및 이의 조합을 또한 포함한다. "최대(up to)", "이상(at least)", "초과(greater than)", "미만(less than)", "사이(between)" 등과 같은 언어는 재인용된 수를 포함한다. "약(about)" 또는 "대략(approximately)"과 같은 용어가 앞에 오는 수는 재인용된 수를 포함한다. 예를 들어 "90%"는 "90%"를 포함한다. 일부 구현예에서, 기준 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열은 기준 서열에 대해 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 또한, 서열이 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 "포함하는(comprising)" 것으로 개시된 경우, 상기 참조는 달리 지시되지 않는 한, 상기 서열이 재인용된 서열을 "포함한다(comprises)", "구성한다(consists of)" 또는 "본질적으로 구성한다(consists essentially of)"를 또한 포함해야 한다.
"a", "an", "the" 등과 같은 관사는 반대로 지시되거나 문맥에서 달리 명백하지 않는 한 하나 이상을 의미할 수 있다. 명세서 및 청구 범위에서 여기 사용된 바와 같은 문구 "및/또는(and/or)"은 그렇게 결합된 요소의 "어느 하나 또는 둘 다(either or both)"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는(and/or)"으로 나열된 복수의 요소는 동일한 방식, 즉, 그렇게 결합된 요소 중 "하나 이상(one or more)"으로 이해되어야 한다. 다른 요소가 "및/또는" 절에 의해 구체적으로 확인된 요소 이외에 선택적으로 존재할 수 있다. 명세서 및 청구 범위에서 여기 사용된 바와 같은 "또는(or)"은 상기 정의된 "및/또는(and/or)"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어 요소 목록에서 사용되는 경우, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것으로, 즉, 요소 목록 중 적어도 하나이나 선택적으로 하나 이상 및 선택적으로 추가적인 열거되지 않은 요소를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. "~ 중 오직 하나(only one of)" 또는 "~ 중 정확히 하나(exactly one of)"와 같이 반대를 명확하게 지시하는 용어만이 여러 요소 또는 요소 목록 중 정확히 하나의 요소의 포함을 지칭할 것이다. 따라서, 그룹의 하나 이상의 멤버 사이에 "또는"을 포함하는 청구항은, 그룹 멤버 중 하나, 하나 이상 또는 모두가 반대로 지시되지 않는 한, 주어진 생성물 또는 프로세스에 존재, 이용 또는 그렇지 않으면 관련된 경우 만족하는 것으로 간주된다. 그룹 중 정확히 하나의 멤버가 주어진 생성물 또는 프로세스에 존재, 이용 또는 그렇지 않으면 관련된 구현예가 제공된다. 그룹 멤버 중의 하나 이상 또는 전부가 주어진 생성물 또는 프로세스에 존재, 이용 또는 그렇지 않으면 관련된 구현예가 제공된다. 임의의 하나 이상의 청구항이 보정되어 임의의 구현예, 측면, 특징, 요소 또는 특성 또는 이의 임의의 조합물을 명백하게 배제할 수 있다. 임의의 하나 이상의 청구항이 보정되어 임의의 제제, 조성물, 양, 용량, 투여 경로, 세포 유형, 표적, 세포 마커, 항원, 표적화 모이어티 또는 이의 조합물을 배제할 수 있다.
몇몇 구현예에서, 핵산 코드의 퇴화를 설명하면서 여기 개시된 임의의 핵산에 대응하는 아미노산 서열이 제공된다. 또한, 여기에 명백하게 개시된 것과 다르나 기능적 유사성 또는 동등함을 갖는 그런 서열(핵산이든지 아미노산이든지)도 본 발명의 범위 내인 것으로 고려된다. 상기는 돌연 변이체, 절단물, 치환체 또는 다른 유형의 변형물을 포함한다.
여기 사용된 모든 제목 또는 부제목은 조직화 목적을 위한 것이며, 여기에 개시된 구현예의 범위를 제한하는 데 사용되어서는 안된다.
SEQUENCE LISTING <110> Nkarta, Inc. <120> ENHANCED EXPANSION AND CYTOTOXICITY OF ENGINEERED NATURAL KILLER CELLS AND USES THEREOF <130> NKT.064WO <150> 63/073,671 <151> 2020-09-02 <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1797 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> NK45-1 DNA <400> 1 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccgttattca accaagaagt tcaaattccc ttgaccgaaa gttactgtgg cccatgtcct 120 aaaaactgga tatgttacaa aaataactgc taccaatttt ttgatgagag taaaaactgg 180 tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa 240 gaggaccagg atttacttaa actggtgaag tcatatcatt ggatgggact agtacacatt 300 ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat ggctccattc tctcacccaa cctactaaca 360 ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca ctctatgcct cgagctttaa aggctatata 420 gaaaactgtt caactccaaa tacgtacatc tgcatgcaaa ggactgtgac cacgacgcca 480 gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca 540 gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga 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gtgggcgatc gcgtgaccat tacctgccgc gcgagccagg atattagcaa atatctgaac 180 tggtatcagc agaaaccgga tggcaccgtg aaactgctga tttatcatac cagccgcctg 240 catagcggcg tgccgagccg ctttagcggc agcggcagcg gcaccgatta taccctgacc 300 attagcagcc tgcagccgga agatattgcg acctattttt gccagcaggg caacaccctg 360 ccgtatacct ttggcggcgg caccaaactg gaaattaccg gtggcggtgg ctcgggcggt 420 ggtgggtcgg gtggcggcgg atctcaggtg cagctgcagg aaagcggccc gggcctggtg 480 aaaccgagcc agaccctgag cgtgacctgc accgtgagcg gcgtgagcct gccggattat 540 ggcgtgagct ggattcgcca gccgccgcgc aaaggcctgg aatggctggg cgtgatttgg 600 ggcagcgaaa ccacctatta taacagcgcg ctgaaaagcc gcctgaccat tagcaaagat 660 aacagcaaaa gccaggtgag cctgaaaatg agcagcgtga ccgcggcgga taccgcgatt 720 tattattgcg cgaaacatta ttattatggc ggcagctatg cgatggatta ttggggccag 780 ggcaccagcg tgaccgtgag cagcaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 840 cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 900 ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 960 gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg ccggagggac 1020 cagaggctgc cccccgatgc ccacaagccc cctgggggag gcagtttccg gacccccatc 1080 caagaggagc aggccgacgc ccactccacc ctggccaaga tcagagtgaa gttcagcagg 1140 agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1200 ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1260 ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1320 atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1380 gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1440 caggccctgc cccctcgcgg ctctggcgag ggaaggggtt ccctgcttac ttgcggcgac 1500 gtcgaagaga atcccggtcc gatggccctc ccagtaactg ccctcctttt gcccctcgca 1560 ctccttcttc atgccgctcg ccccaactgg gtcaacgtga ttagcgattt gaagaaaatc 1620 gaggacctta tacagtctat gcatattgac gctacactgt atactgagag tgatgtacac 1680 ccgtcctgta aggtaacggc catgaaatgc tttcttctgg agctccaggt catcagcttg 1740 gagtctgggg acgcaagcat ccacgatacg gttgaaaacc tcatcatcct tgcgaacaac 1800 tctctctcat ctaatggaaa cgttacagag agtgggtgta aggagtgcga agagttggaa 1860 gaaaaaaaca tcaaagaatt tcttcaatcc ttcgttcaca tagtgcaaat gttcattaac 1920 acgtccacta ccacacccgc cccgaggcca cctacgccgg caccgactat cgccagtcaa 1980 cccctctctc tgcgccccga ggcttgccgg cctgcggctg gtggggcggt ccacacccgg 2040 ggcctggatt ttgcgtgcga tatatacatc tgggcacctc ttgccggcac ctgcggagtg 2100 ctgcttctct cactcgttat tacgctgtac tgctaagcgg ccgcgtcgac 2150 <210> 26 <211> 706 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> AA NK19H-No Flag-12 <400> 26 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 20 25 30 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln 35 40 45 Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr 50 55 60 Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly 100 105 110 Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln 130 135 140 Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr 145 150 155 160 Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly 165 170 175 Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly 180 185 190 Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser 195 200 205 Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu Lys 210 215 220 Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys 225 230 235 240 His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Arg Asp Gln 325 330 335 Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg 340 345 350 Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys 355 360 365 Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln 370 375 380 Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu 385 390 395 400 Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly 405 410 415 Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 420 425 430 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 435 440 445 Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 450 455 460 Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro 465 470 475 480 Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val 485 490 495 Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu 500 505 510 Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asn Trp Val Asn Val 515 520 525 Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile 530 535 540 Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val 545 550 555 560 Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu 565 570 575 Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu 580 585 590 Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys 595 600 605 Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln 610 615 620 Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Thr Thr Thr 625 630 635 640 Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro 645 650 655 Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val 660 665 670 His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro 675 680 685 Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu 690 695 700 Tyr Cys 705 <210> 27 <211> 2210 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> DNA NK19-1 <400> 27 ggatccgaat tcgccgccac catggcctta ccagtgaccg ccttgctcct gccgctggcc 60 ttgctgctcc acgccgccag gccggactac aaagacgatg acgataaagg cggtggtggc 120 tctggtggtg gcggcagcga catccagatg acacagacta catcctccct gtctgcctct 180 ctgggagaca gagtcaccat cagttgcagg gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat 240 tggtatcagc agaaaccaga tggaactgtt aaactcctga tctaccatac atcaagatta 300 cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc agtgggtctg gaacagatta ttctctcacc 360 attagcaacc tggagcaaga agatattgcc acttactttt gccaacaggg taatacgctt 420 ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg gagatcacag gtggcggtgg ctcgggcggt 480 ggtgggtcgg gtggcggcgg atctgaggtg aaactgcagg agtcaggacc tggcctggtg 540 gcgccctcac agagcctgtc cgtcacatgc actgtctcag gggtctcatt acccgactat 600 ggtgtaagct ggattcgcca gcctccacga aagggtctgg agtggctggg agtaatatgg 660 ggtagtgaaa ccacatacta taattcagct ctcaaatcca gactgaccat catcaaggac 720 aactccaaga gccaagtttt cttaaaaatg aacagtctgc aaactgatga cacagccatt 780 tactactgtg ccaaacatta ttactacggt ggtagctatg ctatggacta ctggggccaa 840 ggaacctcag tcaccgtctc ctcaaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 900 cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 960 ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 1020 gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg ccggagggac 1080 cagaggctgc cccccgatgc ccacaagccc cctgggggag gcagtttccg gacccccatc 1140 caagaggagc aggccgacgc ccactccacc ctggccaaga tcagagtgaa gttcagcagg 1200 agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1260 ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1320 ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1380 atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1440 gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1500 caggccctgc cccctcgcgg ctctggcgag ggaaggggtt ccctgcttac ttgcggcgac 1560 gtcgaagaga atcccggtcc gatggccctc ccagtaactg ccctcctttt gcccctcgca 1620 ctccttcttc atgccgctcg ccccaactgg gtcaacgtga ttagcgattt gaagaaaatc 1680 gaggacctta tacagtctat gcatattgac gctacactgt atactgagag tgatgtacac 1740 ccgtcctgta aggtaacggc catgaaatgc tttcttctgg agctccaggt catcagcttg 1800 gagtctgggg acgcaagcat ccacgatacg gttgaaaacc tcatcatcct tgcgaacaac 1860 tctctctcat ctaatggaaa cgttacagag agtgggtgta aggagtgcga agagttggaa 1920 gaaaaaaaca tcaaagaatt tcttcaatcc ttcgttcaca tagtgcaaat gttcattaac 1980 acgtccacta ccacacccgc cccgaggcca cctacgccgg caccgactat cgccagtcaa 2040 cccctctctc tgcgccccga ggcttgccgg cctgcggctg gtggggcggt ccacacccgg 2100 ggcctggatt ttgcgtgcga tatatacatc tgggcacctc ttgccggcac ctgcggagtg 2160 ctgcttctct cactcgttat tacgctgtac tgctaagcgg ccgcgtcgac 2210 <210> 28 <211> 724 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> AA NK19-1 <400> 28 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser 35 40 45 Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala 50 55 60 Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp 65 70 75 80 Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly 85 90 95 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu 100 105 110 Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln 115 120 125 Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 130 135 140 Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser 165 170 175 Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp 180 185 190 Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp 195 200 205 Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu 210 215 220 Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe 225 230 235 240 Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 245 250 255 Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 260 265 270 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg 275 280 285 Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg 290 295 300 Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly 305 310 315 320 Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr 325 330 335 Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Arg 340 345 350 Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser 355 360 365 Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu 370 375 380 Ala Lys Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr 385 390 395 400 Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg 405 410 415 Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met 420 425 430 Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu 435 440 445 Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys 450 455 460 Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu 465 470 475 480 Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu 485 490 495 Pro Pro Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly 500 505 510 Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu 515 520 525 Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asn Trp Val 530 535 540 Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met 545 550 555 560 His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys 565 570 575 Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser 580 585 590 Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile 595 600 605 Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser 610 615 620 Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe 625 630 635 640 Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Thr 645 650 655 Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser 660 665 670 Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly 675 680 685 Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp 690 695 700 Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile 705 710 715 720 Thr Leu Tyr Cys

Claims (22)

  1. 면역 요법에 사용하기 위한 자연 살해 세포(natural killer cells)의 증폭을 향상시키는 방법으로서,
    배양 배지에서 제 1 기간 동안 자연 살해(NK) 세포의 집단을 피더 세포(feeder cells)의 제 1 집단과 공-배양(co-culturing)하는 단계,
    여기서
    상기 제 1 피더 세포의 집단은 4-1BBL 및 막-결합 인터류킨-15(membrane-bound interleukin-15, mbIL15)를 발현하도록 조작된 세포를 포함하고,
    상기 NK 세포의 집단은 상기 피더 세포의 집단보다 적은 세포를 포함하며,
    상기 배양 배지는 인터류킨 2(IL2), 인터류킨 12(IL12), 및 인터류킨 18(IL18)을 포함하고,
    상기 제 1 기간 동안 상기 공-배양은 NK 세포의 증폭된 집단을 초래함;
    상기 제 1 기간 후에, 상기 피더 세포로부터 상기 NK 세포의 증폭된 집단의 적어도 일부를 분리하는 단계;
    신선한 배양 배지에서, 제 2 기간 동안 상기 NK 세포의 증폭된 집단의 적어도 일부를 상기 피더 세포의 제 2 집단과 공-배양하는 단계,
    여기서
    상기 NK 세포의 집단은 상기 피더 세포의 집단보다 적은 세포를 포함하고,
    상기 배양 배지는 인터류킨 2(IL2), 인터류킨 12(IL12), 및 인터류킨 18(IL18)을 포함하며,
    상기 제 2 기간 동안 상기 공-배양은 NK 세포의 추가 증폭된 집단을 초래함; 및
    선택적으로, IL2, IL12, 및 IL18을 포함하는 신선한 배양 배지를 사용하여 상기 분리 및 공-배양 단계를 적어도 1 회 추가 반복함으로써, 상기 NK 세포의 추가 증폭된 집단의 추가 증폭을 초래하는 단계;
    를 포함하는, 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 피더 세포의 추가 집단 및 신선한 배지와 상기 증폭된 NK 세포의 반복된 공-배양은 상기 반복된 공-배양의 부재 하에 NK 세포를 피더 세포와 함께 증폭시키는 것과 비교하여 향상된 NK 세포 증폭을 초래하는 것인, 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 IL2는 약 10 단위(units)/mL 내지 약 100 단위(units)/mL의 농도로 상기 배지에 존재하고, 상기 IL12는 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 농도로 상기 배지에 존재하고, 상기 IL18은 약 0.01 ng/mL 내지 약 30 ng/mL의 농도로 상기 배지에 존재하고, 상기 제 1 및 제 2 기간은 약 7 일이고, 상기 공-배양은 적어도 3회 반복되는, 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 NK 세포의 집단은 각각의 공-배양의 초기에 상기 피더 세포의 집단보다 약 5 내지 약 25 배 더 적은 양으로 존재하는, 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 증폭된 NK 세포는 형광-활성화 세포 분류(Fluorescence-Activated Cell Sorting; FACS)에 의해 상기 피더 세포로부터 분리되는, 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 피더 세포 집단은 4-1BBL 및 mbIL15 둘 다를 발현하는 K562 세포를 포함하는, 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 반복된 공-배양은 NK 세포 활성화의 마커의 발현을 증가시키는 것인, 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 반복된 공-배양은 상기 증폭된 NK 세포의 세포독성 및/또는 지속성(persistence)을 증가시키는 것인, 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 NK 세포를 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 암호화하는 벡터와 접촉시키는 것을 더 포함하는, 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 CAR은 CD19, CD123, CD70, BCMA 또는 자연 살해 수용체 그룹 D(natural killer receptor group D, NKG2D)의 리간드 중의 하나 이상을 표적화하도록 구성되는, 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL2는 약 50 단위/mL 미만의 농도로 배지에 존재하고, 상기 IL12는 약 30 ng/mL 미만의 농도로 배지에 존재하며, 상기 IL18은 약 10 ng/mL 미만의 농도로 배지에 존재하는, 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 10 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL2는 약 20 단위/mL 내지 약 50 단위/mL의 농도로 배지에 존재하고, 상기 IL12는 약 15 ng/mL 내지 약 30 ng/mL의 농도로 배지에 존재하며, 상기 IL18은 약 5 ng/mL 미만의 농도로 배지에 존재하는, 방법.
  13. 암 치료용 약제의 제조를 위한 제 1 항 내지 제 12 항 중의 어느 한 항의 방법에 의해 증폭된 NK 세포의 용도.
  14. 암의 치료를 위한 제 1 항 내지 제 12 항 중의 어느 한 항의 방법에 의해 증폭된 NK 세포의 용도.
  15. 조작된 자연 살해(NK) 세포의 집단으로서,
    표적 암 세포(target cancer cell) 상의 마커에 결합하고, 결합시, NK 세포가 상기 표적 암 세포에 대해 세포독성 효과를 발휘하는 것을 유도하도록 구성된 조작된 키메라 수용체,
    여기서
    상기 NK 세포는 인터류킨 2(IL2), 인터류킨 12(IL12), 및 인터류킨 18(IL18)을 포함하는 배양 배지에서, 피더 세포의 제 1 집단과 함께 자연 살해(NK) 세포의 출발 집단을 제 1 시간 동안 공-배양함으로써 증폭되고,
    상기 피더 세포의 제 1 집단은 4-1BBL 및 막-결합 인터류킨-15(mbIL15)를 발현하도록 조작된 세포를 포함하며,
    상기 NK 세포의 출발 집단은 상기 피더 세포의 제 1 집단보다 적은 세포를 포함하고,
    상기 제 1 공-배양은 NK 세포의 중간 증폭된 집단(intermediate expanded population)을 초래함;
    을 포함하되,
    상기 제 1 공-배양 후에, 상기 NK 세포의 중간 증폭된 집단의 적어도 일부를 상기 피더 세포로부터 분리하고,
    신선한 배양 배지에서, 상기 NK 세포의 중간 증폭된 집단의 적어도 일부를 상기 피더 세포의 제 2 집단과 함께 적어도 제 2 시간 동안 공-배양하되,
    상기 피더 세포의 제 2 집단과 공-배양된 상기 NK 세포의 집단의 일부는 피더 세포의 제 2 집단보다 적은 세포를 포함하고,
    적어도 제 2 공-배양은 NK 세포의 추가 증폭된 집단을 초래하는 것인, 집단.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 조작된 키메라 수용체는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 또는 27 중의 하나 이상에 대해 서열에서 95% 이상 동일한 서열에 의해 암호화되는 것인, 조작된 NK 세포의 집단.
  17. 제 15 항에 있어서,
    상기 조작된 키메라 수용체는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 또는 28 중의 하나 이상에 대해 서열에서 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 것인, 조작된 NK 세포의 집단.
  18. 암 치료용 약제의 제조를 위한 제 15 항 내지 제 17 항 중의 어느 한 항의 NK 세포의 용도.
  19. 암 치료를 위한 제 15 항 내지 제 17 항 중의 어느 한 항의 증폭된 NK 세포의 용도.
  20. 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
    제 15 항 내지 제 17 항 중의 어느 한 항의 조작된 NK 세포의 치료적 유효량을 상기 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  21. 면역 요법에 사용하기 위한 자연 살해 세포의 증폭을 향상시키는 방법으로서,
    배양 배지에서 제 1 기간 동안 자연 살해(NK) 세포의 집단을 피더 세포의 제 1 집단과 공-배양하는 단계,
    여기서
    상기 제 1 피더 세포의 집단은 4-1BBL 및 막-결합 인터류킨-15(mbIL15)를 발현하도록 조작된 세포를 포함하고,
    상기 NK 세포의 집단은 상기 피더 세포의 집단보다 적은 세포를 포함하며,
    상기 배양 배지는 인터류킨 2(IL2), 인터류킨 12(IL12), 및 인터류킨 18(IL18)을 포함하고,
    상기 IL2는 약 0.5 ng/mL 내지 약 6.0 ng/mL의 농도로 상기 배지에 존재하고, 상기 IL12는 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 농도로 상기 배지에 존재하며, 상기 IL18은 약 0.01 ng/mL 내지 약 30 ng/mL의 농도로 상기 배지에 존재하고,
    상기 제 1 기간 동안 상기 공-배양은 NK 세포의 증폭된 집단을 초래함;
    상기 제 1 기간 후에, 상기 피더 세포로부터 상기 NK 세포의 증폭된 집단의 적어도 일부를 분리하는 단계;
    신선한 배양 배지에서, 제 2 기간 동안 상기 NK 세포의 증폭된 집단의 적어도 일부를 상기 피더 세포의 제 2 집단과 공-배양하는 단계,
    여기서
    상기 NK 세포의 집단은 상기 피더 세포의 집단보다 적은 세포를 포함하고,
    상기 배양 배지는 인터류킨 2(IL2), 인터류킨 12(IL12), 및 인터류킨 18(IL18)을 포함하며,
    상기 제 2 기간 동안 상기 공-배양은 NK 세포의 추가 증폭된 집단을 초래함; 및
    선택적으로, IL2, IL12, 및 IL18을 포함하는 신선한 배양 배지를 사용하여 상기 분리 및 공-배양 단계를 적어도 1 회 추가 반복함으로써, 상기 NK 세포의 추가 증폭된 집단의 추가 증폭을 초래하는 단계;
    를 포함하는, 방법.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 제 1 기간 및 제 2 기간은 약 7 일이고, 상기 공-배양은 적어도 3 회 반복되는, 방법.
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