KR20200112915A

KR20200112915A - 종양 침윤 림프구 요법의 바이오 마커 예측 및 그 용도

Info

Publication number: KR20200112915A
Application number: KR1020207024069A
Authority: KR
Inventors: 니콜라 케이 프라이스; 존 스티븐 브릿지먼
Original assignee: 인스틸 바이오 유케이 리미티드
Priority date: 2018-01-23
Filing date: 2019-01-23
Publication date: 2020-10-05
Also published as: CO2020010266A2; CR20200361A; EP4233883A3; GB201801067D0; EP3743511B1; PH12020551110A1; SG11202006875VA; JP2021511079A; CA3089294A1; AU2019213201A1; EA202091753A1; IL276167A; EP3743511C0; US20210000872A1; EP4233883A2; CL2020001943A1; MX2020007728A; MA51705A; ECSP20050981A; WO2019145711A1

Abstract

본 발명은 적응 세포 요법에 유용한 바이오마커에 관한 것이다. 논의되는 바이오마커는 CD150 이며, 달리 SLAM 또는 SLAMF1으로 지칭된다. 여기서 종양 침윤 림프구 주입 생성물에서의 CD150의 발현이 그러한 환자들에서 보이는 반응 률과 상관관계가 있음을 입증한다. 높은 CD150의 발현은 완전한 반응을 계속 보이는 환자에게서 발견되며, 치료에 반응하지 않는 환자에게서 낮은 발현을 보인다. 본 발명은 치료를 위해 반응률을 예측하거나 환자를 계층화하기 위한 바이오마커의 용도에 관한 것이다. 또한 T-세포 집단에서 수용체의 과발현 또는 효능을 증가시키기 위한 노력으로 CD150을 발현하는 세포의 분리를 포함하나 이에 제한되지 않는, 일반적으로 적응 세포 요법 레지멘에서 이 수용체의 이용을 다룬다.

Description

종양 침윤 림프구 요법의 바이오 마커 예측 및 그 용도

본 발명은 종양 침윤 림프구 (Tumor Infiltrating Lymphocyte; TIL)를 포함하는 T-세포로 치료 후 암의 예후 분야에 관한 것이다. 예후는 종양 침윤 림프구를 포함하는 T-세포에 의해 발현되는 생물학적 마커의 정량화를 기반으로 한다. 본 발명은 또한 TIL 요법을 포함하는 T-세포 요법의 치료 효능을 향상시키기 위한 생물학적 마커의 이용 및/또는 조작에 관한 것이다.

암 퇴행을 중재하기 위해 자가 T 세포를 사용하는 적응 세포 요법 (ACT)은 초기 임상 시험에서 많은 가능성을 보여주었다. 자연적으로 발생하는 종양 반응성 또는 종양 침윤 림프구/종양 관련 림프구 (TIL)의 생체 외 확장된 사용과 같은 몇 가지 일반적인 접근법이 취해졌다. 또한, T-세포는 정의된 종양 항원을 향해 그들을 재표적화하기 위해 유전적으로 변형될 수 있다. 이는 하기 유전자 전달을 통해 달성될 수 있다: 펩타이드 (p)-주조직 적합성 복합체 (MHC) 특이적 T-세포 수용체 (TCR); 또는 종양 특이적 단일 사슬 항체 단편 (scFv)과 T-세포 신호 전달 도메인 (예를 들어, CD3ζ) 사이의 합성 융합, 후자는 키메릭 항원 수용체 (CAR)로 지칭됨. TIL 및 TCR 전달은 흑색종을 표적으로 할 때 특히 효과적인 것으로 입증된 반면 (Rosenberg et al., 2011; Morgan et al., 2006), CAR 요법은 특정 B-세포 악성 종양의 치료에서 많은 가능성을 보여주고 있다 (Grupp et al., 2013).

종양 침윤 림프구 요법은 위 (Xu et al., 1995), 신장 (Figlin et al., 1997; Goedegebuure et al., 1995), 자궁경부 (Stevanovic et al., 2015) 및 결장 직장암 (Gardini et al., 2004)을 포함한 다수의 다른 악성 종양에 적용되었으나, 흑색종 요법에서 가장 널리 적용되었으며 대부분의 발전과 가능성을 보여주었다. 진행성 전이성 흑색종에 대한 시험은 15-20% 완전한 반응 (치료)으로 약 50%의 반응률을 지속적으로 보여주었다 (Rosenberg et al., 2011; Dudley et al., 2010). 또한, 종양 관련 림프구는 복수(ascites)로부터 수득될 수 있고 TIL과 동일한 방식으로 성장할 수 있다.

TIL 생산 방법은 유전자 변형된 T-세포에 비해 낮은 비용과 향상된 기술 혁신을 제공한다; 그러나, 방법은 더 고된 노동력과 성장을 최적화하기 위해 더 높은 수준의 사용자 기술을 필요로 한다. 현재의 방법론에서, 종양 생검은 환자로부터 채취되어 실험실 환경으로 이전된다. TIL 생산에는 두 가지 옵션이 있다: i) 종양이 약 1-2mm³의 작은 조각으로 잘려지고 24-웰 조직 배양 플레이트의 개별 웰에 시딩됨; 또는 ii) 종양이 효소적으로 소화되고 생성된 단일 세포 현탁액이 24-웰 조직 배양 플레이트에서 배양됨. 이후, 두 경우 모두 TIL을 > 3000 lU/ml IL-2로 2-3주 동안 배양한 후, 조사된 피더 세포로 2주 확장하여 일반적으로 주입을 위한 > 1x10¹⁰ 세포를 수득한다. 확장 단계 동안, 환자는 전처리 화학 요법 (전형적으로 사이클로인산화물 및 플루다라빈)을 받고, 세포 주입시 TIL 생착을 향상시키기 위해 지지 IL-2 치료를 받는다.

임의의 치료적 개입에 의해, 혼합된 환자 반응이 있으며 치료 개선의 일환으로 어떤 환자가 주어진 치료로부터 분명한 이점을 보일 것인지 결정하는 것이 목표이다. 면역 요법도 예외는 아니며 고전적인 예로서 전처리 평균 적혈구 헤모글로빈 농도는 TroVax 예방 접종의 결과를 예측하는 것으로 나타났으며 (Harrop et al., 2012), PDL1 발현은 항-PD1 요법으로의 치료로부터 더 많은 이점을 보이는 환자를 정의하는 데 사용되었다 (Topalian et al. 2012). 흑색종에서의 TIL 요법은 약 50%의 반응률을 가지고 있기 때문에, 특히 TIL과 함께 사용되는 약제가 잠재적으로 매우 독성이 강할 수 있으므로 치료로부터 가장 많은 이점을 받을 환자를 예측할 수 있는 마커를 찾는 것이 유익할 것이다 (IL-2 및 전처리 화학 요법). 이를 위해 이펙터 메모리 T-세포가 농축된 TIL 생성물이 더 나은 환자 반응을 보인다는 것이 제안되었다 (Radvanyi et al., 2015). 또한, TIL에서의 BTLA 발현은 TIL 주입 후 좋은 예후와 상관관계가 있다 (Radvanyi et al., 2012; Haymaker et al., 2015).

본원에서 제공된 본 발명은 주입 후 성공적인 치료와 상관관계가 있고, 따라서 진단 마커로서 사용될 수 있고, 이러한 마커를 발현하는 TIL 집단이 이들이 개선된 임상 반응률과 관련되어 증가된 종양 반응성을 보이는 것으로 나타남에 따르는 세포 표면 마커에 관한 것이다.

본 발명은 또한 TIL 및 유전자 변형된 T-세포를 이용하는 요법을 포함하는 다른 T-세포 요법을 개선하기 위해 이 수용체가 이용될 수 있는 방법을 기재한다.

도 1 - TIL 제조 방법. 현재 TIL 요법은 두 개의 다른 부위에 크게 의존한다. 임상 위치에서 종양을 절제하여 두 번째 위치 (제조 위치)로 보내고, 여기서 종양은 분리되고 T-세포가 플레이트에서 IL-2를 사용하여 성장한다. 약 2 주 후, 세포를 급속 확장 프로토콜 (REP)에 넣어 세포를 > 1x10¹⁰ 수로 성장시킨다. REP 동안 환자는 전처리 화학 요법을 받는다. Post-REP TIL 최종 생성물은 재주입된 T-세포를 지원하기 위해 정맥 내 IL-2와 함께 환자에게 반환된다.
도 2 - SLAM 측정을 위한 예시적인 유세포 분석 염색 게이팅 전략. Pre 또는 Post-REP TIL은 하기 항체로 염색되었다:
고정가능한 생존성 염료 eFIuor 450, αCD45RO FITC, αCD8 PE Vio770, αCD4 APC Cy7, αCD62L APC; 이후 mlgG1 PE 및 αSLAM PE 쌍으로 대조 염색됨. 세포는 MACSQuant 분석기에서 획득되었다. 분석은 표시된 게이팅 전략을 사용하여 MACSQuantify 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.
도 3a - TIL pre- 및 post- 급속 확장 프로토콜 (REP)에서 SLAM/CD150의 발현. Post-REP TIL은 하기로 염색되었다:
고정가능한 생존성 염료 eFIuor 450, αCD45RO FITC, αCD8 PE Vio770, αCD4 APC Cy7, αCD62L APC; 이후 mlgG1 PE 또는 αSLAM PE 로 대조 염색됨. 세포는 MACSQuant 분석기에서 획득되었다. 분석은 MACSQuantify 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. SLAM⁺ 세포의 비율은 각 CD4+ 또는 CD8+ 집단에서 결정되고 Graphpad 소프트웨어를 사용하여 플롯되었다. 세 그래프 모두에 대해, 환자는 임상 반응에 따라 계층화되며 (진행성 질환, 안정성 질환 및 반응자), 표시된 반응률은 고형 종양 (RECISTv 1.1) 측정에서 반응 평가 기준에 의해 결정된 환자가 달성한 최상의 반응이다 (Schwartz et al. Eur J Cancer 2016 참조) * P < 0.05. 표시된 세 그래프 모두에 대해 평균 +/- 표준편차가 각 세포 및 환자 하위 유형에 대해 플롯된다. 유의성은 2-원 ANOVA 이후 Sidak의 다중 비교 테스트를 사용하여 결정되었다. 상단 그래프 (최종 생성물 (CD4+))의 경우, 메모리: PD 대 R, **p = 0.009. 하단 그래프 (최종 생성물)의 경우, CD4: PD 대 SD, *p = 0.037; PD 대 R, **p = 0.004; CD8: PD 대 R, **p = 0.008.
도 3b - TIL pre- 및 post- 급속 확장 프로토콜 (REP)에서 SLAM/CD150의 발현. Post-REP TIL은 하기로 염색되었다:
고정가능한 생존성 염료 eFIuor 450, αCD45RO FITC, αCD8 PE Vio770, αCD4 APC Cy7, αCD62L APC; 이후 mlgG1 PE 및 mlgG1 eFIuor 710 이소타입 대조군 또는 αSLAM PE 및 αGITR eFIuor 710의 쌍으로 대조 염색됨. 세포는 MACSQuant 분석기에서 획득되었다. 분석은 MACSQuantify 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. SLAM+ 세포의 비율은 각 CD4+ 또는 CD8+ 집단에서 결정되고 Graphpad 소프트웨어를 사용하여 플롯되었다. (A - C) 모든 흑색종 아형으로부터 Pre-REP 및 Post-REP TIL에서의 SLAM 발현; A) 모든 CD4+ 및 CD8+ T-세포에서 SLAM 발현; B) 나이브 [N], 메모리 [M] 및 이펙터 [E] CD4+ TIL에서의 SLAM 발현; C) 나이브 [N], 메모리 [M] 및 이펙터 [E] CD8+ TIL에서의 SLAM 발현; (D - F) 임상 반응에 의해 계층화된 피부 흑색종 환자로부터의 CD4+ 및 CD8+ TIL에서의 SLAM 발현; D) CD4+ 및 CD8+ TIL 상의 SLAM 발현; E) CD4+ T-세포 서브세트에서의 SLAM 발현 및 F) CD8+ 서브세트에서의 SLAM 발현. 닫힌 원 = 진행성 질환, 열린 삼각형 = 안정성 질환, 열린 사각형 = 반응자. 표시된 반응률은 고형 종양 (RECISTv 1.1) 측정에서 반응 평가 기준에 의해 결정된 환자가 달성한 최상의 반응이다 (Schwartz et al. Eur J Cancer 2016 참조) * P < 0.05.
도 4 - SLAM 발현과 상관관계가 있는 환자의 Kaplan-Meier 생존 곡선 - 환자의 전체 생존 시간은 두 그룹으로 플롯된다: 제 1 그래프 (A)에서, SLAM 고 치료 (25% 초과의 SLAM 양성 CD4 T-세포를 가진 환자) 및 SLAM 저 치료 (25% 미만의 SLAM 양성 T-세포를 가진 환자); 및 제 2 그래프 (B)에서, SLAM 고 치료 (40% 초과의 SLAM 양성 CD4 T-세포를 가진 환자) 및 SLAM 저 치료 (40% 미만의 SLAM 양성 T-세포를 가진 환자).
도 5 - SLAM 분류된 세포에서 생존력 및 사이토카인 반응 - 두 기증자 최종 생성물인 TIL032 및 TIL054로부터의 TIL은 SLAM 고 및 SLAM 저 집단에 따라 유동 분류되었다. 배양 24 시간 후 생존력을 평가하고 (A), 세포를 각각의 일치된 자가 종양 세포주와 혼합하고 유세포 분석을 사용하여 사이토카인 반응을 측정하였다(B).
도 6 - SLAM siRNA - SLAMF1은 SLAMF1 siRNA (siRNA) 또는 처리되지 않은 세포 (대조군)로 76 시간 처리한 후 Raji, 결장 직장 TIL (MRIBB011) 및 흑색종 TIL (TIL032)에서 qPCR (A) 또는 유세포 분석 (B)에 의해 측정되었다.
도 7 - SLAM 과발현 - SLAM 발현 카세트는 EF1α 프로모터의 인간 SLAMF1 서열, 2A 절단 서열 및 인간 세포질 도메인 절단된 CD19 서열 다운스트림을 클로닝함으로써 생성되었다 (A). Jurkat JRT3-T3.5 세포는 SLAMF1 및 절단된 CD19 유전자를 함유하는 적정 농도의 렌티바이러스 입자로 형질도입되었고 유세포 분석에 의해 발현을 분석하였다 (B).
발명의 측면의 요약
본 발명자들은 세포 표면 마커를 확인하였다: 신호 림프구 활성화 분자 (SLAM/SLAM F1/SLAM 패밀리 구성원 1/CD150/CDw150/IPO-3; 인간 아미노산 서열, 참조: NCBI 참조 서열: NP_003028.1), 이는 T-세포 주입 후 성공적인 치료와 상관관계가 있고 (TIL 주입), 따라서 마커는 T-세포 (TIL)가 종양 반응성일 가능성이 있음을 나타냄. 현재 이러한 증가된 종양 반응성이 어떤 메커니즘으로 발생하는지는 알려져 있지 않으며, 예를 들어, SLAM 발현 집단에서 강화된 종양 세포 사멸을 통한 것일 수 있고/있거나, 예를 들어, SLAM 발현이 종양 미세 환경에서 세포 생존 및 지속성을 향상시킬 수 있었다. 본 발명은 TIL 요법 및 유전자 변형된 T-세포를 이용하는 요법을 포함하여 T-세포를 사용하는 다른 암 요법을 개선하기 위해 이 수용체가 이용될 수 있는 방법에 관한 것이다.
제 1 측면에서, 종양 반응성 T-세포가 농축된 T 세포 집단과 같은 세포 집단을 수득하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 CD150/SLAM/SLAMF1을 발현하는 T-세포가 선택되고 임의로 확장된다. 따라서 CD150/SLAM/SLAMF1을 발현하는 세포는 대량 세포 집단, 예컨대 T-세포 집단 (예를 들어, 유전자 변형된 T-세포) 또는 적은 비율의 다른 세포 유형을 포함하는 T 세포 집단 (예를 들어, TIL 집단)으로부터 선택될 수 있다.
CD150/SLAM/SLAMF1을 발현하는 T-세포는 환자로부터 유래한 세포 (예를 들어, 종양 생검, 림프절, 복수로부터의 TIL 세포)로부터 선택될 수 있다. 구현예에서, CD150/SLAM/SLAMF1을 발현하는 T-세포의 선택은 (i) 유세포 분석, (ii) 항체 패닝, (iii) 자기 선택, (iv) 바이오마커 표적 세포 농축 중 하나 이상을 포함한다. 선택은 세포 집단을 항-CD150/SLAM/SLAMF1 항체와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 이후 선택된 세포는 분리되고 확장되어 집단에 존재하는 CD15Q/SLAM/SLAMF1 양성 (+ve) 세포의 수를 농축시킬 수 있다.
구현예에서, 본원에서 제공되는 생물학적 마커 CD150/SLAM/SLAMF1을 발현하는 TIL은 하기 옵션 중 하나 또는 둘 모두에 의해 확장된다:
a. 항체 또는 공동 자극 수용체에 의해 구동되는 T-세포 활성화 신호 및 공동 자극을 제공하기 위해 조사된 피더 세포로 확장; 및/또는
b. 상기 하나 이상의 생물학적 마커를 통해 구동되는 T-세포 활성화 신호 및 공동 자극 신호를 제공하는 고정화 또는 가용성 시약으로 확장.
본원에 제공된 구현예에서 세포 집단은 하기로부터 선택된다: i) 종양 생검, 림프절 또는 복수로부터의 종양 침윤 림프구 (TIL) 집단; 및/또는 ii) 유전자 변형된 T-세포 집단, 예를 들어 CAR 및/또는 TCR 및/또는 다른 외인성 핵산을 발현하도록 조작된 T-세포 집단.
본 발명의 또 다른 측면에서 본원에 제공된 것은 본원에 제공된 임의의 방법에 따라 수득된 종양 반응성 T-세포가 농축된 세포 집단이다. 이러한 집단은 TIL 집단 또는 유전자 변형된 T-세포 집단으로 시작하여 수득될 수 있고, 선택될 수 있고, 예를 들어 본원에 제공된 임의의 방법을 사용하여, 그 집단에서 CD150/SLAM/SLAMF1 양성 (+ve) 세포를 농축할 수 있다.
또한 종양 반응성 T-세포 (예컨대 TIL 또는 유전자 변형된 T-세포)가 농축된 세포 집단이 본원에 제공되며, 여기서 T-세포 또는 TIL의 >25% 는 생물학적 마커 CD150/SLAM/SLAMF1을 발현하거나, 또는 여기서 T-세포 또는 TIL의 >30%, >35% 또는 >40% 는 생물학적 마커 CD150/SLAM/SLAMF1을 발현한다.
구현예에서, 생물학적 마커 CD150/SLAM/SLAMF1이 농축된 TIL 집단이 본원에 제공된다. 일 구현예에서, 생물학적 마커 CD150/SLAM/SLAMF1이 농축된 TIL 집단은 본원에 기재된 방법에 따라 수득된다. 일부 구현예에서, TIL은 흑색종으로부터 유래할 수 있다.
T 세포 (TIL 집단으로부터 수득된 T-세포 포함)는 외인성 핵산으로부터 CD150/SLAM/SLAMF1을 발현하거나 과발현하도록 조작될 수 있다. 이러한 방식으로 CD150/SLAM/SLAMF1을 발현하거나 과발현하는 것은 조작된 T 세포의 종양 반응성을 증가시킬 수 있다. 일 구현예에서, CD150/SLAM/SLAMF1을 코딩하는 제 1 외인성 핵산을 포함하는 T-세포가 본원에 제공된다. T-세포는 키메릭 항원 수용체 (CAR) 및/또는 T-세포 수용체 (TCR) 및/또는 다른 단백질을 코딩하는 제 2 외인성 핵산을 추가로 포함할 수 있다.
적절하게는, T-세포는 CD4+ 또는 CD8+ 세포이다. 일부 구현예에서, T-세포는 메모리 세포이다.
본 발명의 또 다른 측면에서, CD150/SLAM/SLAMF1을 발현하는 T-세포, 예컨대 TIL 또는 유전자 변형된 T-세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. TIL은 대상체로부터 유래한 세포의 선택 및 확장에 의해 CD150/SLAM/SLAMF1이 농축된 TIL 집단일 수 있거나, TIL은 CD150/SLAM/SLAMF1을 발현하도록 조작된 TIL 또는 다른 T-세포일 수 있다. 대상체는 전형적으로 인간이다. 치료 방법은 적절하게 적응 세포 요법이다; T-세포는 자가 또는 동종 이형일 수 있다. 질환은 적절하게는 암, 예를 들어 흑색종, 또는 난소암 또는 자궁경부암이다.
또한 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제 및 임의로 하나 이상의 추가의 약제학적 활성 폴리펩티드 및/또는 화합물과 함께 CD150/SLAM/SLAMF1을 발현하도록 조작된 T-세포를 포함하는 CD150/SLAM/SLAMF1을 발현하는 종양 반응성 T-세포가 농축된 세포 집단을 포함하는 정맥 내 주입에 적절한 약제학적 조성물이 본원에 제공된다.
또한 SLAM/SLAMF1/CD150을 발현하는 세포 집단에서 T-세포를 정량화하는 단계를 포함하는 세포 집단의 종양 반응성을 평가하는 방법이 본원에 제공된다. 적절하게는 세포 집단은 i) 환자로부터의 TIL 일 수 있고 SLAM/SLAMF1/CD150을 발현하는 T-세포는 pre-REP 및/또는 post-REP로 정량화되거나; 또는 ii) 외인성 CAR 및/또는 TCR을 발현하도록 조작된 T-세포 집단일 수 있다. SLAM/SLAMF1/CD150 발현 수준을 평가할 때, T-세포/TIL 집단에서 SLAM/SLAMF1/CD150을 발현하는 T-세포의 적어도 25%는 세포 집단이 종양 반응성임을 나타낸다.
본 발명의 측면 및 구현예는 또한 하기에 기재된다.
본원에 기재된 본 발명은 암에 대한 종양 침윤 림프구 (TIL) 요법을 받을 수 있는 환자의 예후를 위한 시험관 내 방법 및 보다 최적의 TIL 생성물을 생성하기 위한 신규한 방법을 개발하기 위해 이러한 예후 마커의 이용에 관한 것이다; 방법은 하기를 포함한다:
i) 상기 환자로부터, 제조하는 동안 종양 분해물 또는 TIL 생성물의 샘플에서 TIL상의 적어도 하나의 생물학적 마커 (SLAM/CD150)를 정량화하는 단계, 여기서 정량화는 상기 생물학적 마커 (SLAM/CD150)를 발현하는 세포의 비율임.
ii) 상기 적어도 하나의 생물학적 마커에 대해 단계 i)에서 수득된 값을 동일한 생물학적 마커에 대한 사전 결정된 참조 값과 비교하는 단계; 사전 결정된 참조 값은 상기 암 진행의 특정 예후와 상관관계가 있음.
iii) 상기 바이오마커(들)를 발현하는 세포의 농축에 기초하여 제조 전, 제조 동안 또는 후에 벌크 TIL 집단으로부터 세포를 분리하는 단계.
iv) 생성물의 치료 효능을 개선하기 위한 노력으로 T-세포에서 상기 생물학적 마커를 과발현시키는 단계.
v) TIL 생성물에 대한 방출 테스트로서 TIL에 대한 상기 적어도 하나의 생물학적 마커의 사용.
vi) 화학 물질, 항체, 다른 세포, 단백질, 지질 또는 다른 정의되지 않은 메커니즘 또는 방법을 사용하여 상기 생물학적 마커의 발현을 증가, 향상 또는 유도하기 위한 노력으로 T-세포 집단을 조작하는 방법.
방법의 일부 구현예에서, 단계 i)은 유세포 분석법에 의해 하나 이상의 생물학적 마커를 정량화하는 것으로 구성된다.
방법의 일부 다른 구현예에서, 단계 i)은 전체 종양 조직 샘플에서 유전자 발현 분석에 의해 상기 생물학적 마커를 정량화하는 것으로 구성된다.
방법의 일부 다른 구현예에서, 단계 i)은 전체 종양 조직 샘플의 면역 조직 화학에 의한 상기 생물학적 마커의 정량화하는 것으로 구성된다.
방법의 일부 구현예에서, 단계 iii)은 유세포 분석 분리를 사용하여 바이오마커(들)를 발현하는 세포를 분리하는 것으로 구성된다.
방법의 일부 다른 구현예에서, 단계 iii)은 하기를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는 일부 다른 형태의 물리적 분리 기술을 사용하여 바이오마커(들)를 발현하는 세포를 분리하는 것으로 구성된다: Miltenyi MACS 분리, StemCell Technologies 자기 분리 기술 또는 유세포 분석 분리.
방법의 일부 다른 구현예에서, 단계 iii)은 바이오마커를 통한 공동 자극을 유도하는 것과 같은 T-세포 활성의 자극과 조합하여 이러한 바이오 마커와 결합하는 항체 또는 가용성 수용체 단백질을 사용하는 것과 같은 일부 형태의 유사 분열 자극 방법을 통해 바이오마커(들)를 발현하는 세포를 농축시키는 것으로 구성된다.

세포

본 발명은 T-세포, 예를 들어 종양 침윤 림프구 (TIL)의 샘플에 존재하는 T-세포에 관한 것이다. 특히, T-세포를 포함하는 세포 집단, 예컨대 종양 반응성 T-세포가 농축된 TIL 집단에 관한 것이다.

종양 침윤 림프구는 혈류를 떠나 종양으로 이동한 백혈구이다. 그들은 단핵 면역 세포로, 다양한 유형의 세포 (즉, T-세포, B-세포, NK 세포, 대식세포)가 다양한 비율로 혼합되어 있으며, T-세포가 단연코 가장 풍부한 세포이다. 그들은 종종 스트로마와 종양 자체내에서 발견될 수 있다.

TIL은 종양 세포를 특이적으로 인식, 용해 및/또는 살해할 수 있다. 종양에 림프구의 존재는 종종 더 나은 임상 결과와 관련이 있다.

T-세포 또는 T-림프구는 세포 매개 면역에서 중심 역할을 하는 림프구의 유형이다. 그들은 세포 표면에 T-세포 수용체 (TCR)가 존재함으로써, B-세포 및 자연 살해 세포 (NK 세포)와 같은 다른 림프구와 구별될 수 있다. 하기에 요약된 바와 같이, 다양한 유형의 T-세포가 있다.

세포 용해성 T-세포 (TC 세포, 또는 CTL)는 바이러스에 감염된 세포 및 종양 세포를 파괴하며, 또한 이식 거부에도 관여한다. CTL은 이의 표면에서 CD8 분자를 발현한다. 이 세포는 모든 유핵 세포의 표면에 존재하는 MHC 클래스 I과 관련된 항원에 결합하여 그의 표적을 인식한다. IL-10, 아데노신 및 조절 T-세포에 의해 분비되는 다른 분자를 통해 CD8+ 세포는 무력 상태로 비활성화될 수 있고, 실험적 자가 면역 뇌척수염과 같은 자가 면역 질환을 예방한다.

메모리 T-세포는 감염이 해결된 후에도 장기간 지속되는 항원 특이적 T-세포의 서브세트이다. 그들은 동족 항원에 재 노출될 때 많은 수의 이펙터 T-세포로 빠르게 확장되어, 과거 감염에 대한 "기억"을 면역계에 제공한다. 메모리 T 세포는 하기 3가지 서브타입을 포함한다: 중앙 메모리 T-세포 (TCM 세포)와 두 가지 유형의 효과기 메모리 T-세포 (TEM 세포 및 TEMRA 세포). 메모리 세포는 CD4+ 또는 CD8+ 일 수 있다. 메모리 T-세포는 전형적으로 세포 표면 단백질 CD45RO를 발현한다.

이전에 억제 T-세포로 알려진 조절 T-세포 (Treg 세포)는, 면역학적 내성 유지에 중요하다. 그들의 주요 역할은 면역 반응이 끝날 때까지 T-세포 매개 면역을 차단하고 흉선에서 음성 선택 방법을 피한 자가 반응 T 세포를 억제하는 것이다.

CD4+ Treg 세포의 두 가지 주요 클래스가 기재되었다 - 자연 발생 Treg 세포 및 적응 Treg 세포.

자연적으로 발생하는 Treg 세포 (CD4+CD25+FoxP3+ Treg 세포라고도 함)는 흉선에서 발생하며, TSLP로 활성화된 골수성 (CD11c+) 및 형질 세포성 (CD123+) 수지상 세포와 함께 발달 중인 T-세포 간의 상호 작용에 연결되어 왔다. 자연적으로 발생하는 Treg 세포는 FoxP3라고 불리는 세포 내 분자의 존재에 의해 다른 T-세포와 구별될 수 있다.

적응 Treg 세포 (Tr1 세포 또는 Th3 세포라고도 함)는 정상적인 면역 반응 중에 발생할 수 있다.

자연 살해 세포 (또는 NK 세포)는 선천성 면역 체계의 일부를 형성하는 세포 용해 세포의 한 유형이다. NK 세포는 MHC 독립적인 방식으로 바이러스에 감염된 세포로부터 오는 선천성 신호에 대한 빠른 반응을 제공한다.

NK 세포 (선천성 림프구 그룹에 속함)는 대형 과립 림프구 (LGL)로 정의되며 B- 및 T-림프구를 생성하는 일반적인 림프구 전구 세포로부터 분화된 세 번째 종류의 세포를 구성한다.

선택 및 농축

일 측면에서, 본원에 제공된 본 발명은 종양 침윤 림프구 (TIL) 집단에 존재하는 T-세포를 포함하는, T-세포 집단을 수득하고 사용하는 것에 관한 것으로, 대량 세포 집단으로부터 CD150/SLAM/SLAMF1을 발현하는 T-세포를 선택함으로써 종양 반응성 T-세포가 농축된다. 선택될 때, CD150/SLAM/SLAMF1 양성 세포는 대량 집단으로부터 분리되어 CD150/SLAM/SLAMF1을 발현하는 T-세포가 농축된 집단을 제공하고, 임의로 선택된 세포는 이후 CD150/SLAM/SLAMF1 +ve (양성) 세포의 수를 증가시키기 위해 확장된다. 일단 CD150/SLAM/SLAMF1 +ve 세포가 선택되면, 당업계에 공지된 임의의 적합한 T-세포 확장 방법이 사용될 수 있으며, CD150/SLAM/SLAMF1 발현이 확장 후 유지된다.

예를 들어, 본원에 기재된 것은 하기 선택 기술 중 하나 이상을 사용하여 상기 생물학적 마커 (CD150/SLAM/SLAMF1)의 예후적으로 유리한 수준을 발현하는 세포를 선택하는 시험관 내 방법이다: (i) 유세포 분석, (ii) 항체 패닝, (iii) 자기 선택, (iv) 바이오마커 표적 세포 농축.

다른 많은 인간 유전자와 마찬가지로 SLAMF1의 여러 이소형이 있으며, 그 중 일부는 코딩되지 않거나 기능성 표면 단백질을 생성하지 않는다. 그러나, 이들 스플라이스 변이체는 세포질 도메인에서 상이하고, 본원에 기재된 것과 같은 SLAMF1에 대한 항체는 세포 외 도메인에 결합하여 SLAMF1의 상이한 이소형에 결합한다.

이후 상기 생물학적 마커 (CD150/SLAM/SLAMF1)를 발현하는 선택된 세포는 예를 들어, 하기 옵션 중 하나 또는 둘 모두를 통해 확장될 수 있다:

a) 항체 또는 공동 자극 수용체에 의해 구동되는 T-세포 활성화 신호 및 공동 자극을 제공하는 방식으로 조사된 피더 세포; 및/또는

b) 상기 하나 이상의 생물학적 마커를 통해 구동되는 T-세포 활성화 신호 및 공동 자극 신호를 제공하는 고정화 또는 가용성 시약.

예를 들어, 일부 구현예에서 항체를 사용하는 SLAM/CD150을 통한 공동 자극은 문헌에서 공동 자극을 유도하는 것으로 나타났기 때문에 실현 가능할 수 있으며, 하기를 참조한다: Aversa G, Chang CC, Carballido JM, Cocks BG, de Vries JE. J Immunol. 1997 May 1 ;158(9):4036-44.

외인성 핵산 분자

일 측면에서, 본 발명은 SLAM (Signaling lymphocyte activation molecule)/SLAMF1/CD150을 코딩하는 외인성 핵산 분자를 포함하는 세포를 제공한다. 단어 "외인성"은 핵산 분자가 재조합 수단에 의해 만들어지고 예를 들어 렌티 바이러스 벡터와 같은 벡터를 통해 세포 내로 도입되는 것을 의미한다. 세포는 핵산 분자를 함유하고 SLAM/SLAMF1/CD150을 발현 (또는 과발현)하도록 조작된다.

임의로 세포는 예를 들어 키메릭 항원 수용체 (CAR) 또는 T-세포 수용체 (TCR)를 코딩하는 제 2 외인성 핵산을 추가로 포함할 수 있으며, 따라서 CAR 또는 TCR 도 발현할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드" 및 "핵산"은 서로 동의어로 의도된다.

다수의 상이한 폴리뉴클레오티드 및 핵산이 유전 코드의 축퇴의 결과로 동일한 폴리펩티드를 코딩할 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 또한, 당업자는 일상적인 기술을 사용하여, 폴리펩티드가 발현되어야 하는 임의의 특정 숙주 유기체의 코돈 사용, 예를 들어 코돈 최적화를 반영하기 위해 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열에 영향을 미치지 않는 뉴클레오티드 치환을 만들 수 있음을 이해해야 한다.

본 발명에 따른 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있다. 그들은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 그들은 또한 합성 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 올리고뉴클레오티드에 대한 다수의 상이한 유형의 변형이 당업계에 공지되어 있다. 여기에는 메틸포스포네이트 및 포스포로티오에이트 백본, 분자의 3' 및/또는 5' 말단에 아크리딘 또는 폴리라이신 사슬 추가가 포함된다. 본 발명의 목적을 위해, 폴리뉴클레오티드는 당업계에서 이용 가능한 임의의 방법에 의해 변형될 수 있음을 이해해야 한다. 이러한 변형은 관심있는 폴리뉴클레오티드의 생체 내 활성 또는 수명을 향상시키기 위해 수행될 수 있다.

벡터

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열 또는 핵산 구조체를 포함하는 벡터를 제공한다.

이러한 벡터는 SLAM/SLAMF1/CD150을 발현하도록 핵산 서열(들) 또는 핵산 구조체(들)를 숙주 세포 내로 도입하는데 사용될 수 있다.

벡터는 예를 들어 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터, 또는 트랜스포존 기반 벡터 또는 합성 mRNA 일 수 있다. 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스로부터 유래된 벡터는, 이식 유전자 또는 이식 유전자의 장기적이고 안정적인 통합과 딸 세포에서의 증식을 허용하므로 장기 유전자 전달을 달성하는 데 적절한 도구이다.

벡터는 T-림프구를 형질감염 또는 형질도입할 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산이 삽입된 벡터를 제공한다.

SLAM/SLAMF1/CD150을 코딩하는 천연 또는 합성 핵산, 및 임의로 TCR 또는 CAR의 발현은 전형적으로 SLAM/SLAMF1/CD150 및 TCR/CAR 폴리펩티드 또는 이의 일부를 하나 이상의 프로모터에 작동적으로 연결하고, 그 구조체를 발현 벡터에 도입함으로써 달성된다. 벡터는 진핵세포에서 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 원하는 핵산 서열의 발현 조절에 유용한 전사 및 번역 종결자, 개시 서열 및 프로모터를 함유한다.

바이러스 벡터 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Sambrook et al. (2001 , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) 및 기타 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에서 기재되어 있고, 또한 WO 01/96584; WO 01/29058; 및 U.S. Pat. No.6,326,193를 참조한다.

SLAM/SLAMF1/CD150 폴리펩티드 또는 이의 일부의 발현을 평가하기 위해, 세포 내로 도입될 발현 벡터는 또한 선택 가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 둘 모두를 함유할 수 있어 바이러스 벡터를 통해 형질감염 또는 형질도입하고자 하는 세포 집단으로부터 발현 세포의 식별 및 선택을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 마커 유전자는 도 7A에 나타낸 바와 같이 CD19일 수 있다.

일부 구현예에서, 핵산 구조체는 도 7A에 나타낸 바와 같다. 도 7A는 SLAMF1 및 CD19 마커 유전자가 EF1α 프로모터에 의해 구동되는 렌티바이러스 발현 구조체를 나타낸다.

약제학적 조성물

본 발명은 또한 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제, 및 임의로 하나 이상의 추가의 약제학적 활성 폴리펩티드 및/또는 화합물과 함께 본 발명의 세포, T-세포 또는 TIL(들)의 집단을 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 이러한 제형은, 예를 들어 정맥 내 주입에 적절한 형태일 수 있다. 적어도 25%, 30%, 40% 또는 50%의 T-세포가 SLAM/SLAMF1/CD150을 발현하는 T-세포 집단을 포함하는 정맥 내 주입을 위한 약제학적 조성물이 본원에 제공된다.

치료 방법

SLAM/SLAMF1/CD150을 발현하는 TIL을 포함하는 치료에 사용하기 위한 TIL 생성물은 대상체로부터 유래한 세포로부터 SLAM/SLAM F1/CD150을 발현하는 세포를 농축시키거나 SLAM/SLAMF1/CD150을 발현하도록 세포를 조작함으로써 수득될 수 있다.

본 발명의 SLAM/SLAMF1/CD150을 발현하는 종양 침윤 림프구 (TIL)를 포함하는 T-세포는 환자 자신의 말초 혈액 (자가)으로부터 생체 외에서, 또는 기증자 말초 혈액 (동종 이형)에서 조혈모세포 이식을 설정하거나, 또는 연결되지 않은 기증자의 말초 혈액 (동종 이형)으로 설정될 수 있다. 이러한 경우, SLAM/SLAMF1/CD150 및 임의로, CAR 및/또는 TCR을 발현하는 T-세포는 S SLAM/SLAMF1/CD150 및 임의로 CAR 및/또는 TCR을 코딩하는 DNA 또는 RNA를 도입하여, 바이러스 벡터를 사용한 형질도입, DNA 또는 RNA를 사용한 형질감염을 포함한 여러 수단 중 하나에 의해 생성된다.

세포가 환자에게 투여되는 본 발명의 방법의 목적을 위해, 세포는 환자에게 동종 이형 또는 자가인 T 세포일 수 있다.

질환을 치료하는 방법은 본 발명의 벡터 또는 세포의 치료적 용도에 관한 것이다. 이와 관련하여, 벡터 또는 T-세포는 질환과 관련된 적어도 하나의 증상을 완화, 감소 또는 개선하기 위해 및/또는 질환의 진행을 늦추거나, 감소시키거나, 차단하기 위해 기존 질환 또는 상태를 갖는 대상체에게 투여될 수 있다. 본 발명의 방법은 TIL 세포 집단의 대부분에 존재하고 이를 구성하는 T 세포와 같은, T 세포의 종양 반응성을 증가시키는 것에 관한 것이다. 증가된 항-종양 활성은 증가된 SLAM/SLAMF1/CD150을 갖는 T-세포가 이들 세포로 치료된 암 환자에서 개선된 임상 반응과 상관관계가 있음을 보여주는 본원 데이터에 의해 입증되었다. 이러한 세포는 종양 반응성 T-세포로 간주될 수 있다. 증가된 SLAM 발현이 개선된 임상 반응 (본원에서 증가된 종양 반응성으로 지칭됨)과 상관관계가 있는 이유는 알려져 있지 않으며, 예를 들어, 이는 SLAM이 종양 사멸 증가에 관여하거나 SLAM이 T-세포 지속성을 촉진하는 데 관여할 수 있다는 것일 수 있다.

본 발명의 측면 및 구현예의 추가 세부 사항은 하기에 있다.

면역 체계가 많은 암 유형에 효과적인 반응을 일으킬 수 있다는 반박할 수 없는 증거가 있다. 이것은 수많은 암 면역 요법의 개발로 이어졌다. 이들은 크게 세포 기반 면역 요법과 비 세포 기반으로 분류할 수 있다. 비 세포 기반 면역 요법은 몇 가지 흥미로운 결과를 보여주었다. 특히 항-PD1 (니볼루맙; 펩브롤리주맙), 및 PDL1 (아테졸리주맙) 또는 항-CTLA4 (이필루무맙)와 같은 체크포인트 차단 항체의 사용은 진행성 전이성 흑색종에 대한 임상 환경에서 놀라운 결과를 가져왔다. 암에 대한 세포 기반 면역 요법은 특히 고무적인 결과를 보여주는 B-세포 악성 종양을 표적으로 하는 CD19-CAR T-세포를 사용한 초기 시험에서도 마찬가지로 흥미로운 결과를 가져왔다.

TIL 요법은 일반적으로 유전자 변형이 필요하지 않아 매력적이라는 점에서 더 단순한 접근 방식이다. 흑색종에서 약 50%의 반응률이 일반적으로 관찰된다. 자궁경부암 시험에서도 또한 33%의 반응률이 나타났다. 또한 난소암을 포함한 다른 암 적응증에 대한 수많은 시험이 진행 중이다.

암 반응은 RECIST 가이드라인 (2000년에 발행된 버전 1)을 사용하여 측정되며 최근에는 RESIST 가이드라인 1.1에서 업데이트되었다 (Eisenhauer et al 2009). 암 치료제의 임상 평가의 중요한 특징인, 종양 부담 변화에 대한 균일한 평가를 가능하게 함: 종양 수축 또는 검출 가능한 질환 없음 즉, 치료 효능 및 환자 예후를 결정하기 위한 임상 시험에서 유용한 종점인 객관적 반응 (CR + PR), 변화 없음 (안정성 질환 (SD)) 및 진행성 질환 (PD). RESIST 1.1의 중요한 변화는 수축 이전에 염증으로 인해 종양의 크기가 증가할 수 있다는 것이었는데, 이는 TIL과 같은 치료제가 작동하도록 하는데 중요하며, 그렇지 않으면 이러한 요법이 실패라고 할 수 있다.

본 발명은 환자에서 종양 침윤 림프구 요법을 사용한 치료 결과의 예후를 위한 방법을 제공하며, 신규한 방법은 TIL 제조 방법 중 생성물에서 또는 주입 전 TIL 생성물에서, 예를 들어 종양 내 CD4+ 및/또는 CD8+ 종양 침윤 림프구에 대한 하나 이상의 생물학적 마커의 검출 및/또는 정량화에 기초한다.

TIL 생성물의 유세포 분석을 통해 출원인은 주입시 환자에서 보이는 반응과 상관관계가 있는 TIL 생성물 내 CD4+ 및/또는 CD8+ T-세포에서 발현되는 세포 분자 마커를 발견했다.

본 발명자들에 의해 환자 반응과 상관관계가 있음을 보이는 본원에 기재된 마커는 SLAM (CD150)이다.

세포 표면 마커의 발현과 TIL 처리 결과 사이에 상관관계가 있음이 본 발명에 따라 밝혀졌다.

확인된 수용체는 SLAM (신호 림프구 활성화 분자/SLAMFI/CD150)이다. SLAM은 SLAM 패밀리 수용체 1 (SLAMF1)을 특별히 지칭하는, SLAM 패밀리 수용체의 특정 구성원에 부여된 이름이다. SLAM 패밀리에는 SLAMF3 (CD229), SLAMF4 (CD244) 및 SLAMF7 (CRACC/CD319)을 포함한 다수의 다른 구성원을 함유한다. 이러한 수용체의 대부분은 자기 리간드이고, 즉 조혈 세포를 통해 서로 결합한다. SLAM 패밀리 수용체의 세포질 도메인은 SAP (T 세포) 또는 EAT-2 (NK 세포) 단백질 어댑터와 관련된 면역수용체 티로신 기반 스위치 모티프를 함유한다. SLAM 패밀리 수용체의 역할은 다소 미해결된 것으로 남아 있다. 그들은 논의되는 SLAM 패밀리 수용체와 그것이 발현되는 세포에 따라, 활성화 역할 또는 억제 역할에서 면역 반응을 도울 수 있다. CD150 자체는 공동 자극 기능이 입증되었다. SLAM 관여는 IFNγ에 의해 지배되는 사이토카인의 TH1 표현형을 유도하며, 따라서 SLAM의 조작이 TH2 극성화된 질병에 유익할 수 있다고 제안되었다 (Quiroga et al 2004). 또한, SLAM은 TH2 세포 (Hamalainen et al 2000)와 비교하여 TH1 세포에서 더 높은 수준으로 발현된다는 것이 주목되었으며, 이는 사이토카인처럼 TH1을 유도하는 이유에 대한 관찰을 부분적으로 설명할 수 있다. CD150과 관련하여 마지막으로 흥미로운 점은 이것이 홍역 바이러스의 1 차 바이러스 수용체라는 것이다 (Erlenhoefer et al 2001). 이는 보다 특이적으로 렌티바이러스를 T 세포에 표적화하기 위해 홍역 바이러스 외피로 가형화된 렌티바이러스를 사용하여 세포 치료 목적으로 이용되었다 (Frecha et al. 2011).

따라서, 본 발명의 제 1 목적은 암에 대한 종양 침윤 림프구 (TIL) 요법을 받을 수 있는 환자의 예후를 위한 시험관 내 방법으로 이루어진다; 방법은 하기를 포함한다:

i) 종양 분해 샘플, 제조 방법 중 TIL 물질 또는 상기 환자로부터의 TIL 생성물에서 TIL상의 적어도 하나의 생물학적 마커를 정량화하는 단계; 및

ii) 상기 적어도 하나의 생물학적 마커에 대해 단계 i)에서 수득된 값을 동일한 생물학적 마커에 대한 사전 결정된 참조 값과 비교하는 단계; 사전 결정된 기준 값은 상기 암 진행의 특정 예후와 상관관계가 있음.

임상 효능과 상관관계가 있는 것으로 보이는 TIL에 대한 분자 마커 (예를 들어, BTLA)의 이전 예가 있지만, SLAM을 기재한 예는 없다. Radvanyi et al. 2015 는 TIL 내에서 CD8+ T-세포의 비율이 좋은 임상 결과와 관련이 있다고 기재했다. 이는 BTLA가 T-세포 활동의 음성 조절자로 작용할 수 있다는 관찰에 의해 혼동된다 (Watanabe et al. 2003).

CD8+ 세포가 농축된 TIL 생성물은 혼합된 CD4+ 및 CD8+ 세포에 비해 생존 이점을 제공하지 않는다 (Dudley et al., 2010). 이는 주로 CD4+ 헬퍼 T-세포의 존재가 CD8+ T-세포 생존 및 생착을 돕기 때문인 것으로 추정된다. 또한, CD4+ 세포가 종양 세포를 직접 인식하고 죽이는 데 도움을 줄 수 있다는 증거가 있다 (Tran et al., 2014).

Radvanyi et al. (2015) 는 또한 BTLA의 발현이 임상적 이점과 유리한 연관성을 갖는 것으로 기재했다. BTLA의 발현은 생존 특성이 강화된 덜 분화된 T-세포와 관련이 있다 (Haymaker et al., 2015). 그러나, 역설적이게도 TIL 주입 생성물 내에서 보다 분화된 이펙터 메모리 T-세포의 존재가 유리한 결과와 관련이 있는 것으로 또한 나타났다. 이펙터 메모리 T-세포는 일반적으로 CD45RO 또는 CD45RA와 결합된 CD62L 또는 CCR7의 공동 발현으로 표시되어 이펙터 메모리 세포는 하기 표현형을 가질 수 있다: CD62L-/CD45RO+, CD62L-/CD45RA-, CCR7-/CD45RO+ 또는 CCR7-/CD45RA-.

또한 임상 결과와 함께 생체 내 TIL상의 다양한 세포 표면 마커와의 관련성을 기재하는 많은 출판물 및 선행 기술 연구가 있지만, 이는 TIL 제조와 관련이 없으며, 오히려 종양 생검 분석과 관련이 있다. 예로는 특허 US20090215053A1를 포함한다 - 암 진행의 예후 및 환자의 결과에 대한 시험관 방법 및 상기 방법을 수행하기 위한 수단.

본원에서 의도된 바와 같이, 종양 침윤 림프구는 a) 물리적 또는 효소적 분해를 통해 암 환자의 종양 샘플로부터 직접 분리된 CD45+ 세포, b) 상기 환자의 림프절에서 분리된 CD45+ 세포 c) 복수로부터 분리된 CD45+ 세포 (다른 경우 종양 관련 림프구로 지칭됨)이다. TIL은 TIL 제조 방법 전반에 걸쳐 그대로 남아 있고 이때 CD45+로 남아있는 약간 다른 표현형을 수득하려는 경향이 있지만, CD3+ 세포의 비율은 세포가 IL-2에서 배양되고 조사된 피더 세포 또는 대체 TIL 확장 시스템으로 활성화됨에 따라 증가한다. 이러한 CD45+/CD3+ 세포는 T-세포 또는 T-림프구라고 지칭된다. 따라서 'TIL'이라는 용어는 수술 시점부터 동일한 환자에게 다시 주입되는 시점까지 임의의 CD45+ 세포를 포함한다.

상기 마커 (SLAM/SLAMF1/CD150)의 분석은 여러 메커니즘 중 하나에 의해 수행될 수 있다. 제 1 예에서 유세포 분석이 수행될 수 있다. 이 경우 세포는 SLAM에 대한 항체로 염색되어 그 존재 여부를 결정할 수 있다. 또한 다른 항체는 염색 패널에 도입되어 TIL 내에서 정의된 세포 집단을 볼 수 있다. 예를 들어, 세포는 CD62L, CD45RO, CD4 및/또는 CD8로 항체로 대조 염색될 수 있다.

상기 마커 (SLAM/SLAMF1/CD150)는 최종 생성물의 효능을 개선하기 위한 노력으로 상기 마커를 발현하는 세포를 농축시키는 방식으로 달리 이용될 수 있다. 예를 들어, 유세포 분석은 형광단 또는 다른 직접 또는 간접 선택 가능한 마커에 접합된 특이적 항체 (항-SLAM) 또는 재조합 (r) 단백질 (예를 들어, r-SLAM)을 사용하여 상기 마커를 발현하는 세포를 분리하기 위해 이용될 수 있다.

대안적으로, 세포를 분리하기 위한 다른 기술이 수행될 수 있다. 예를 들어, Miltenyi MACS 자기 기술, Invitrogen Dynal 기술 또는 StemCell Technologies EasySep 기술은 상기 마커를 발현하는 세포를 분리하기 위해 사용될 수 있다.

또는　대안적으로, 플레이트, 비드 또는 다른 고체 매트릭스에 고정되거나 인공 항원 제시 세포 플랫폼에서 발현된 항체 (또는 이의 항체 단편) 또는 재조합 단백질은 상기 마커를 발현하는 세포를 농축시키는데 사용될 수 있다. 이러한 예에서 항체 또는 재조합 단백질은 단독으로 또는 T-세포에 1 차 활성화 신호를 유도하는 항체 또는 다른 활성화 플랫폼과 조합하여 발견될 수 있다 (예는 하기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: 피토헤마글루티닌, 항-CD3 항체, 펩타이드-주조직 적합성 항원 복합체, 포볼 미리스테이트 아세테이트).

상기 모든 것의 목표는 이후 상기 마커의 발현에 기초하여 환자를 계층화하고, 가능한 경우 상기 기재된 하나 이상의 방법을 통해 치료 세포를 분리 및/또는 농축하는 것이다.

본원에서 의도된 바와 같이, 하기를 사용하여 바이오마커의 존재를 평가하기 위해 당업계에서 다양한 방법이 이용 가능하다: (a) 바이오마커 결합 모이어티가 단일 또는 다중 단계 방법에서 2 차 리포터 모이어티에 결합되는 직접적인 방법, 예컨대 유세포 분석에서 일반적으로 사용되는 것과 같이 검출될 수 있는 리포터 시스템에 접합된 바이오마커 결합 항체. 현미경 또는 단백질 겔 크로마토그래피; 또는 (b) 정량적 PCR과 같이 핵산을 코딩하는 바이오마커가 정량화되는 간접 방법. 선택 방법이 단일 세포 및 집단 기반 방법에서 세포를 분석하는 경우 세포는 형광단에 직접 또는 간접적으로 결합될 수 있는 정의된 표면 마커에 대한 항체와 함께 적재되고, 이는 유세포 분석 기기의 구성 요소에 의해 감지될 수 있는 정의된 파장에서 빛을 방출한다. 본원에서 용어 유세포 분석은 Becton Dickinson 유세포 분석 기기의 상표인 보다 일반적으로 사용되지만 잘못된 용어 FACS보다 선호된다. 따라서 이 방법의 목적을 위해 임의의 유세포 분석기 (Becton Dickinson [BD], Miltenyi, Acea etc)가 분석에 사용될 수 있지만 다른 방법이 사용될 수 있다.

바람직하게는, 단계 a)가 하나 이상의 유전자, 즉 하나 이상의 적절한 생물학적 마커의 발현 분석으로 이루어질 때, 상기 하나 이상의 유전자 발현의 정량화는 전체 종양 조직 샘플로부터 수행된다.

본 발명의 다양한 추가 측면 및 구현예는 본 개시 내용을 고려하여 당업자에게 명백할 것이다.

본 명세서에서 언급된 모든 문헌들은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

본원에서 사용되는 "및/또는"은 서로를 포함하거나 포함하지 않는 2개의 특정된 특징 또는 구성 요소 각각의 특정 개시로 간주된다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 각각이 본원에서 개별적으로 제시된 것처럼, (i) A, (ii) B 및 (iii) A 및 B 각각의 특정 개시로 간주된다.

문맥이 달리 지시하지 않는 한, 상기 설명된 특징의 기재 및 정의는 본 발명의 임의의 특정 측면 또는 구현예로 제한되지 않으며, 기재된 모든 측면 및 구현예는 동일하게 적용된다.

본 발명의 특정 측면 및 구현예는 기재된 도면 및 하기 기재된 표를 참조하여 예로서 설명될 것이다.

실시예 1 - 종양 침윤 림프구에서의 SLAM/CD150 발현 분석

전이성 흑색종 종양 생검을 환자로부터 채취하여 실험실로 가져와 처음에는 메스를 사용하여 미세 조각으로 절단한 다음, 콜라게나아제 및 DNase의 혼합물을 사용하여 단일 세포 현탁액으로 소화하였다.

세포 현탁액은 3000 lU/ml IL-2의 첨가와 함께 완전한 배지에서 24웰 플레이트의 웰 당 대략 1x10⁶ 개의 생존가능한 CD3+ 세포로 접종되었다. 배양물은 세포 성장에 대해 모니터링되었고 건강한 배양물을 유지하기 위해 필요에 따라 분할되었다.

TIL은 최대 21일 동안 또는 CD3+ 세포 수가 30x10⁶ 개를 초과할 때까지 성장한 후 세포는 세척되고 동결되었다. 동결하기 전에 샘플은 유세포 분석을 위해 채취되었다. 이 시점에서 샘플은 Pre-REP이라고 지칭된다. 세포가 주입 준비가 되기 전에 1x10¹⁰을 초과하는 숫자로 확장될 필요가 있다. 이를 달성하기 위해 TIL은 급속한 확장 프로토콜을 거친다 (Dudley et al., 2003). 간단히 말해서, TIL 세포는 확장되기 1 내지 3일 전에 해동되었다. 이후 TIL은 10 - 50 ng/ml OKT3를 첨가하여 조사된 자가/동종 이형 PBMC 피더 세포와 1:50 내지 1:1000 비율로 혼합된다. 이후 TIL은 2주 동안 확장된 후 Post-REP TIL이라고 지칭된다. 치료용 TIL 생성물 (즉, Post-REP TIL)을 주입하기 전에 환자는 플루다라빈 및 사이클로인산화물로 이루어진 전처리 화학 요법을 받았다. Post-REP TIL은 환자에게 발행되고 IL-2의 다수의 투여 전에 단일 주입으로 제공된다.

Pre-REP 및 Post-REP의 시점에서 TIL 세포는 유세포 분석에 의해 분석되었다. 간단히 말해서, 1-2x10⁵ 개의 세포의 3개의 샘플을 PBS로 세척한 다음 어둠 속 실온에서 5분 동안 고정 가능한 생존성 염료 eFIuor 450을 1:400 희석한 50μl로 배양하였다. 세포를 150μl의 PBS로 2회 세척한 후 2mM EDTA 및 0.5% 우 태아 혈청 (PEF)이 보충된 50μl의 차가운 PBS에 재현탁시켰다. 각 샘플에 4℃에서 30분 동안 하기 표에 표시된 대로 항체를 첨가하였다.

배양 후 세포를 150μl 차가운 PEF로 2회 세척하고 최종적으로 200 μl PBS에 재현탁시켰다. 세포는 MACSQuant 분석기에서 획득되었고 데이터는 MACSQuantify 소프트웨어를 사용하여 분석되었다 (도 1).　 Pre-REP 및 Post-REP에서 TIL을 비교할 때, Post-REP 단계와 비교하여 Pre-REP 단계에서 CD4+ 및 CD8+ TIL에서 SLAM의 향상된 발현을 발견하였다. 특히 CD4+ Post-REP TIL에서 SLAM 발현의 2가지 뚜렷한 집단을 관찰하였고 SLAM-고 및 SLAM-저 환자 그룹을 암시한다. 특히 SLAM 발현은 CD4+ 및 CD8+ 집단의 메모리 세포 집단으로 크게 제한되는 경향이 있으며, 나이브 및 이펙터 집단에서는 발현이 더 낮다. 나이브 및 이펙터 집단은 전체 TIL 생성물의 작은 부분을 형성한다.

피부 흑색종에서 환자 반응과 관련하여 SLAM+ 세포의 비율을 분석하였을 때, 진행성 질환이 있는 사람('진행자')과 비교하여 안정성 질환을 앓고 있는 환자 (p = 0.0252) 또는 반응자 (p = 0.0113)에서 SLAM+인 CD4+ T-세포의 비율이 유의하게 증가되는 것을 발견하였다. CD8+ 집단에서 관찰된 유의한 차이는 치료에 대한 반응이 있는 환자와 진행성 질환이 있는 환자 (p = 0.0248) 사이에 있었다. 유의한 차이는 주로 메모리 세포 집단에서 보이는 차이로 제한되었다. CD4+ T-세포에서 메모리 세포 집단은 안정성 질환을 가진 환자와 진행자 (p = 0.0384) 사이 및 진행성 질환과 반응자 (p = 0.0221) 사이에 유의한 차이를 가졌다. CD8+ 메모리 T-세포에서 우리는 진행성 질환과 안정성 질환이 있는 환자 (p = 0.0348) 사이 및 진행성 질환 및 반응자 (p = 0.0169) 사이에 유의한 차이를 보았다.

치료 후 환자를 평가하여 고형 종양 (RECISTvl .1) 측정에서 반응 평가 기준에 따라 종양 크기를 측정하였다. 최신 RECIST 1.1 가이드라인에 따라 각 환자의 최상의 반응이 결정되었다 (Schwartz et al. 2016). 반응 기간에 대한 환자의 전체 생존을 플롯팅하였다 (도 4). SLAM-고 및 SLAM-저에 대한 2 가지 컷-오프를 사용하였다: 최종 생성물에서 각각 전체 CD4+ TIL의 25% 및 40%. >25 % SLAM+ 세포를 가진 환자가 <25 % SLAM+ 세포를 가진 환자에 비해 생존율이 향상되었음을 발견하였다 (각각 중앙값 21.3 개월 v 2.4 개월, Wilcoxon 테스트에 의해 p = 0.009의 유의한 차이, 44%의 안정기) (도 4A). 마찬가지로 >40 % SLAM+ 세포를 가진 환자가 <40 % SLAM+ 세포를 가진 환자에 비해 생존율이 향상되었음을 발견하였다 (각각 중앙값에 도달하지 않음 v 4 개월, Wilcoxon 테스트에 의해 p = 0.027의 유의한 차이, 55%의 안정기) (도 4A).

실시예 2 - T-세포 및 TIL에서 SLAM 발현의 조절

먼저 일치된 종양 (TIL032 및 TIL054)에 대한 TIL의 생존성 및 기능적 반응에 대한 TIL에서의 SLAM 발현의 영향을 평가하였다. 이를 위해 2 개의 TIL 주입 생성물을 가져와 항-SLAM 항체 및 흐름 분류기를 사용하여 SLAM-고 및 -저 집단을 분류하였다. 밤새 휴식 기간 후, 세포는 자가 종양 주와 함께 공동 배양되거나 16시간 동안 자극되지 않은 웰에 방치한 다음 생존성은 DRAQ7을 사용하여 결정되었고 (도 5A), IL-2, IFNγ 및 TNFα을 생산하는 세포의 비율은 유세포 분석을 사용하여 결정되었다 (도 5B). TIL032 및 TIL054 SLAM-고 세포가 SLAM-저 세포 또는 미분류 세포에 비해 증가된 생존력을 가짐을 발견하였다 (도 5A). 종양과 혼합되었을 때 효과는 덜 분명하였지만, TIL054에서는 분명하였다. 사이토카인 생산을 평가하였을 때, TIL이 이들의 일치된 종양과 함께 배양되었을 때 증가된 사이토카인 반응을 발견하였다. 이는 TNFα의 생산을 볼 때 가장 분명하였다. 그러나, TIL054에서 종양에 대한 CD8+ 반응을 제외하고, SLAM-고 분류 집단으로부터 TNFα 반응이 전체적으로 SLAM-저 분류 세포보다 더 크다는 것을 발견하였다.

다음으로 SLAM 발현을 조절하기 위한 접근법으로 세포주 및 T-세포에서 SLAM 발현에 대한 SLAMF1 siRNA의 영향을 평가하였다. SLAM+ 세포주 Raji 와 2 개의 TIL 샘플 (결장 직장 종양 TIL 샘플인 MRIBB011 및 TIL032로부터 TIL032 주입 생성물)을 가져왔다. 세포를 최소 배지 (RPMI + 1 % FCS + ITS, 및 1000 lU/ml의 IL-2로 보충된 TIL)에서 10 μM의 자가 전달 siRNA (Accell Human SLAMF1 siRNA SMARTpool, 5 nmol - [Dharmacon, Colorado, USA])와 함께 96웰 (웰 당 1x10⁵)에 플레이팅하였다. 대조군은 siRNA 없이 동일한 조건에서 성장하였다. 76시간 후 각 조건의 2x10⁵ 개의 세포 (2x 웰)을 풀링하였고 Cells-to-CT™ 1-Step TaqMan® 키트 (Invitrogen)를 사용하였다.

간단히 세포를 회전시켰고, PBS (R/T)로 세척하였고 다시 펠렛화하였다. 상청액을 제거하였고 49 μl Lysis 용액 + 1 μl DNAse를 첨가하였다. 그들은 R/T에서 5분 동안 배양되었고 5μl의 STOP 용액이 첨가되었다. 샘플은 RT에서 2분 동안 방치한 후 사용될 때까지 얼음 위에 놓아두었다. 상기 모든 시약은 키트와 함께 제공된다. 용해물은 -80에서 최대 5개월 동안 안정적이다.

SLAMF1 (분석 ID: Hs00234149_m1, Invitrogen) 및 GAPDH (분석 ID: Hs03929097_g1, Invitrogen)에 대한 TaqMan 반응을 3중으로 설정하고, 반응 부피를 키트에 의해 제안된 20 μl에서 10 μl으로 축소하였다. 1 μl의 용해물을 각 반응에 첨가하였다. 미처리된 Raji 세포로부터 이미 추출된 RNA와 양성 대조군 반응은 또한 세포 용해물에 존재하는 가능한 PCR 억제제를 설명하기 위해 설정되었다.

Raji 세포 (>99%)에서 SLAM 전사체의 거의 완전한 녹다운을 관찰하였다 (도 6A). MRIBB011에서 SLAM 전사체의 31% 감소를 보았고; TIL032에서 SLAM 전사체의 57% 증가를 보았다. 단백질 발현은 상이한 정도로 변경되었다 (도 6B). Raji 세포에서 동일한 기간에 걸쳐 단백질의 표면 발현은 5.3%, MRIBB011 TIL에서 30.8%, TIL032에서 9.6% 감소하였다. 따라서 최적화는 발현에서 최적의 녹다운을 관찰하기 위해 테스트된 각 세포주에 대해 필요하지만, SLAM siRNA는 SLAM 발현을 조절하는 적절한 수단이다.

다음으로 T-세포에서 SLAM 발현의 향상이 siRNA를 통해 달성된 녹다운에 의한 것보다는, SLAM 발현의 영향을 정량화하는 대체 접근법을 제공할 수 있는지 여부를 결정하였다. 이를 위해 SLAMF1 및 CD19 마커 유전자가 EF1α 프로모터에 의해 구동되는 렌티바이러스 발현 구조체가 생성되었다 (도 7A). 렌티바이러스 입자는 일시적인 형질감염에 의해 HEK293T 세포에서 생성된 후 생성된 입자는 SLAM-음성 Jurkat JRT3-T3.5 세포에서 적정되었다 (도 7B). SLAM 및 CD19의 공동 발현은 Jurkat 세포에서 입증되었다.

본 발명의 측면 및 구현예는 또한 하기 항목에서 설명된다:

1. 하기 단계를 포함하는 종양 침윤 림프구 (TIL) 요법을 받는 환자의 예후를 위한 시험관 내 방법:

a. 상기 환자로부터의 TIL 샘플에서 적응 면역 반응 상태를 나타내는 생물학적 마커 (CD150/SLAM/SLAMF1)를 정량화하는 단계; 및

b. 상기 생물학적 마커 (CD150/SLAM/SLAMF1)는 암 반응을 나타냄; 및

c. 상기 적어도 하나의 생물학적 마커 (CD150/SLAM/SLAMF1)에 대해 단계 a)에서 수득된 값을 동일한 생물학적 마커에 대한 미리 결정된 참조 값과 비교하는 단계; 상기 암의 특정 예후 또는 진행과 상관관계가 있는 미리 결정된 참조 값이 있음.

2. 항목 1에 있어서, 상기 종양 조직 샘플은 (i) 원발성 종양, (ii) 전이성 종양 병변, (iii) 상기 환자로부터 종양 병변 중 하나에 가장 가까운 곳에 위치한 림프절로 이루어진 군으로부터 유래한 시험관 내 방법.

3. 항목 1에 있어서, 단계 a)는 유세포 분석을 사용하여 수행되는 시험관 내 방법.

4. 항목 1에 있어서, 단계 a)는 상기 생물학적 마커 (CD150/SLAM/SLAMF1)의 값을 평가하는 대체 직접 또는 간접 방법을 사용하여 수행되고，상기 적어도 하나의 생물학적 마커 (CD150/SLAM/SLAMF1)에 대해 단계 ａ）에서 수득된 값을 비교하는 상기 방법은 동일한 생물학적 마커에 대한 미리 결정된 참조 값을 결정할 수 있고; 암의 특정 예후 또는 진행과 관련된 미리 결정된 참조 값이 있는 시험관 내 방법.

5. 항목 1에 있어서, 상기 생물학적 마커 (CD150/SLAM/SLAMF1)가 림프구에 의해 발현되는 시험관 내 방법.

6. 항목 1에 있어서, 상기 환자 암에 대한 상기 환자의 적응 면역 반응의 상태를 나타내는 상기 생물학적 마커 (CD150/SLAM/SLAMF1)는 T 림프구, NK 세포, NKT 세포, γδ T-세포, CD4+ 세포 및/또는 CD8+ 세포로 구성된 군으로부터 선택된 면역계로부터의 세포에 의해 발현되는 적어도 하나의 생물학적 마커로 이루어진 시험관　내　방법.

7. 항목 1에 있어서, 상기 생물학적 마커는 SLAM (CD150)인 시험관 내 방법.

8. 항목 1에 있어서, 상기 생물학적 마커 (CD150/SLAM/SLAMF1)는 하기 샘플 중 하나에서 정량화되는 시험관 내 방법: (i) 종양의 단일 세포 현탁액, (ii) 종양 침윤 림프구의 배양 중 임의의 시점에서 종양의 단일 세포 현탁액으로부터 수득된 물질 샘플, (iii) 상기 환자에게 주입하기 위해 발행되는 최종 생성물.

9. 하기 선택 기술 중 하나 이상을 사용하여 상기 생물학적 마커 (CD150/SLAM/SLAMF1)의 예후적으로 유리한 수준을 발현하는 세포를 선택하는 시험관 내 방법: (i) 유세포 분석, (ii) 항체 패닝, (iii) 자기 선택, (iv) 바이오마커 표적 세포 농축.

10. 항목 9에 있어서, 상기 생물학적 마커 (CD150 / SLAM / SLAMF1)를 발현하는 세포는 하기 옵션 중 하나 또는 둘 모두에 의해 확장되는 시험관 내 방법:

a) 항체 또는 공동 자극 수용체에 의해 구동되는 T-세포 활성화 신호 및 공동 자극을 제공하는 방식으로 조사된 피더 세포; 및

11. 하나 이상의 림프구에서 상기 생물학적 마커 (CD150/SLAM/SLAMF1)를 발현하는 시험관 내 방법.

12. 항목 11에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터.

13. 항목 11에 따른 폴리펩티드를 발현하는 세포.

14. 항목 12 중 어느 하나에 따른 벡터로 세포를 형질도입 또는 형질감염시키는 단계를 포함하는, 항목 11에 따른 세포 제조 방법.

15. 항목 12에 있어서, 관심 이식 유전자가 또한 적응 세포 요법을 위한 키메릭 항원 수용체, T-세포 수용체 또는 다른 면역 요법용 수용체를 코딩하여, 벡터가 표적 세포를 형질도입하기 위해 사용될 때, 표적 세포가 항목 13에 따른 폴리펩티드 및 키메릭 항원 수용체, T-세포 수용체 또는 다른 면역 요법 관심 수용체를 공동-발현하는 벡터 (명확성을 위해 이 추가 폴리펩티드 코딩 단백질은 관심 단백질 (POI)이라 지칭됨.

16. 하기 단계를 포함하는, POI 를 발현하는 세포를 선택하는 방법:

I. 항목 15에 따른 벡터로 형질감염되거나 형질도입된 세포 표면에서 POI 에피토프의 발현을 검출하는 단계; 및

II. POI 에피토프를 발현하는 것으로 확인된 세포를 농축하는 단계.

17. 항목 16에 따른 방법을 사용하여 세포 집단으로부터 POI를 발현하는 세포를 선택하는 단계를 포함하는, POI를 발현하는 세포가 농축된 정제된 세포 집단을 제조하는 방법.

18. 항목 1에 따른 폴리펩티드를 발현하는 세포가 농축되어, POI를 발현하는 세포가 농축된 세포 집단.

19. 세포 표면에서 항목 1에 따른 폴리펩티드의 발현을 검출하는 단계를 포함하는 생체 내 형질도입된 세포를 추적하는 방법.

20. 항목 12 - 14 중 어느 하나에 따른 세포 또는 항목 18에 따른 세포 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환을 치료하는 방법.

참조 문헌

Claims

CD150/SLAM/SLAMF1을 발현하는 T-세포가 선택되고 임의로 확장되는 종양 반응성 T-세포가 농축된 세포 집단을 수득하는 방법.
제 1 항에 있어서, CD150/SLAM/SLAMF1을 발현하는 T-세포가 대상체로부터 유래한 세포로부터 선택된 T-세포인 수득 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, CD150/SLAM/SLAMF1을 발현하는 T-세포를 선택하는 단계는 (i) 유세포 분석, (ii) 항체 패닝, (iii) 자기 선택, (iv) 바이오마커 표적 세포 농축 중 하나 이상을 포함하는 수득 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, T-세포를 선택하는 단계가 세포 집단을 항-CD150/SLAM/SLAMF1 항체와 접촉시키는 것을 포함하는 수득 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, CD150/SLAM/SLAMF1을 발현하는 T-세포가 하기 옵션 중 하나 또는 둘 모두에 의해 확장되는 수득 방법:
항체 또는 공동 자극 수용체에 의해 구동되는 T-세포 활성화 신호 및 공동 자극을 제공하기 위해 조사된 피더 세포로 확장; 또는
CD150/SLAM/SLAMF1을 통해 구동되는 T-세포 활성화 신호 및 공동 자극 신호를 제공하는 고정화 또는 가용성 시약으로 확장.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단이 하기로부터 선택되는 수득 방법:
i) 종양 생검, 림프절 또는 복수로부터의 종양 침윤 림프구 (TIL) 집단; 및/또는
ii) CAR 및/또는 TCR 을 발현하도록 조작된 T-세포 집단.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득된 세포 집단.
T-세포를 포함하고 T-세포의 >25%, >30% 또는 >40% 가 CD150/SLAM/SLAMF1을 발현하는 세포 집단.
제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 세포가 TIL, 바람직하게는 흑색종에서 유래하는 TIL 인 세포 집단.
CD150/SLAM/SLAMF1을 코딩하는 제 1 외인성 핵산을 포함하는 T-세포.
제 10 항에 있어서, 키메릭 항원 수용체 (CAR) 또는 T-세포 수용체 (TCR)를 코딩하는 제 2 외인성 핵산을 추가로 포함하는 T-세포.
제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, T-세포가 TIL 인 T-세포.
제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 세포 집단, 또는 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 T 세포로서, 암, 바람직하게는 흑색종의 치료에 사용하기 위한, 세포 집단 또는 T 세포.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 수득 방법, 제 7 항 내지 제 9 항 또는 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 세포 집단으로서, CD150/SLAM/SLAMF1을 발현하는 T-세포가 CD4+ 또는 CD8+ 세포를 포함하고, 임의로 CD150/SLAM/SLAMF1을 발현하는 T-세포가 메모리 세포를 포함하는 수득 방법 또는 세포 집단.
제 7 항 내지 제 9 항 또는 제 13 항 및 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 세포 집단 또는 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 T-세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 적응 세포 요법의 방법으로서, T-세포가 자가 또는 동종 이형인 적응 세포 요법의 방법.
제 7 항 내지 제 9 항 또는 제 13 항 및 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 세포 집단, 또는 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 T-세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환을 치료하는 방법.
제 16 항에 있어서, 질환이 암, 바람직하게는 흑색종인 치료 방법.
하기를 포함하는 약제학적 조성물:
제 7 항 내지 제 9 항 또는 제 13 항 및 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 세포 집단, 또는 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 T-세포를 포함하는 세포 집단.
제 18 항에 있어서, 암, 바람직하게는 흑색종의 치료에서 사용하기 위한 약제학적 조성물.
세포 집단에서 SLAM/SLAMF1/CD150을 발현하는 T-세포의 비율을 정량화하는 것을 포함하는 세포 집단의 종양 반응성을 평가하는 방법.
제 20 항에 있어서, 세포 집단이 i) 환자로부터의 TIL 이고, SLAM/SLAMF1/CD150을 발현하는 T-세포가 pre-REP 및/또는 post-REP로 정량화되거나; 또는 ii) 외인성 CAR 및/또는 TCR을 발현하도록 조작된 T-세포 집단인 평가 방법.
제 20 항 또는 제 21 항에 있어서, SLAM/SLAMF1/CD150을 발현하는 T-세포의 비율이 세포 집단의 적어도 25%인 것은 세포 집단이 종양 반응성임을 나타내는 평가 방법.