CN111886335A - 肿瘤浸润淋巴细胞治疗的生物标记物预测及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可用于过继细胞疗法的生物标记物。考虑的生物标记物是CD150，又名SLAM或SLAMF1。本文中我们验证了CD150在肿瘤浸润淋巴细胞输注产品上的表达与在那些患者中看到的应答率相关。高CD150表达可见于继续具有完全应答的患者，低表达可见于对治疗无应答的患者。本发明涉及生物标记物用于预测治疗的患者的应答率或将治疗的患者分级的用途。其还涵盖了该受体通常在过继细胞疗法方案中的应用，包括但不限于在T细胞群体中过表达该受体或分离表达CD150的细胞以提高功效。

Description

肿瘤浸润淋巴细胞治疗的生物标记物预测及其用途
技术领域
本发明涉及在使用T细胞(包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL))治疗之后的癌症预后的领域。该预后是基于由T细胞(包括肿瘤浸润淋巴细胞)表达的生物标记物的定量。本发明还涉及利用和/或操纵生物标记物来增强T细胞治疗(包括TIL治疗)的治疗效果。
背景技术
使用同体T细胞以介导癌症逆转的过继细胞疗法(ACT)已在早期临床试验中显示了很大的希望。已经采取了几种通用方法，例如使用天然存在的肿瘤反应性或肿瘤浸润淋巴细胞/离体扩增的肿瘤相关淋巴细胞(TIL)。此外，可以对T细胞进行基因修饰以使其重新靶向确定的肿瘤抗原。这可以通过以下方式的基因转移实现：肽(p)-主要组织相容性复合体(MHC)特异性T细胞受体(TCR)；或肿瘤特异性单链抗体片段(scFv)和T细胞信号传导结构域(例如，CD3ξ)之间的合成融合，后者被称为嵌合抗原受体(CAR)。当靶向黑素瘤时，TIL和TCR转移已被证明特别有效(Rosenberg等，2011；Morgan等，2006)，而CAR治疗在某些B细胞恶性肿瘤的治疗中已显示出很大的希望(Grupp等，2013)。
肿瘤浸润淋巴细胞治疗已应用于多种不同的恶性肿瘤，包括胃癌(Xu等，1995)，肾癌(Figlin等，1997；Goedegebuure等，1995)，宫颈癌(Stevanovic等，2015)和结直肠癌(Gardini等，2004)，但在黑素瘤治疗中得到了最广泛的应用并显示了最大的发展和希望。在晚期转移黑素瘤中的试验始终显示应答率为约50％，且完全应答(治愈)为15-20％(Rosenberg等，2011；Dudley等，2010)。此外，肿瘤相关的淋巴细胞可从腹水获得并且以与TIL相同的方式生长。
TIL生产过程与基因修饰的T细胞相比提供了较低的成本和改善的技术创新；然而，该过程更耗人力并且需要更高程度的用户技能以优化生长。在当前的方法中，肿瘤活检从患者获取并送往实验室设施。对于TIL生产有两种选择：i)将肿瘤切割成约1-2mm3的小块并接种到24孔组织培养板上的各个孔中；或ii)将肿瘤酶促消化并将所得的单细胞悬浮液在24孔组织培养板中培养。在两种情况中，TIL均在之后以>3000lU/ml IL-2培养2-3周，在此之后它们与辐照的饲养细胞一起经历两周的扩增，得到约>1×1010细胞用于输注。在扩增阶段期间，患者接受预处理化疗(通常为环磷酰胺和氟达拉滨)，并且在输注细胞时接受支持性IL-2治疗以增强TIL移植成活率。
在进行任何治疗性干预的情况下，患者的应答是混合的，并且作为治疗改善的一部分，目标是随后确定哪个患者将从所给予的治疗中获得明显的收益。免疫疗法也不例外，并且作为经典示例，治疗前的平均小体血红蛋白浓度已显示出可预测TroVax疫苗接种的结果(Harrop等，2012)，并且PDL1表达已被用于定义从抗PD1疗法治疗受益更多的患者(Topalian等，2012)。由于黑素瘤中的TIL治疗具有约50％的应答率，这将有利于寻找可预测那些将从治疗中受益最大的患者的标记物，特别是因为与TIL一起使用的药物可能具有很高的毒性(IL-2和预处理化疗)。因此，已显示富含效应记忆T细胞的TIL产品表现出更好的患者应答(Radvanyi等，2015)。此外，TIL中的BTLA表达与TIL输注后的良好预后相关(Radvanyi等，2012；Haymaker等，2015)。
本文提供的发明涉及一种与输注后的成功治疗相关的细胞表面标记物，因此能够用作预后标记物，表达该标记物的TIL群体似乎显示肿瘤反应性的增加，因为它们与改善的临床应答率相关。
本发明还描述了可如何利用该受体来改善TIL和其他T细胞治疗，包括利用基因修饰T细胞的治疗。
附图说明
图1—TIL制造过程。现有的TIL治疗很大程度上取决于两个不同的部位。在临床部位肿瘤被切除，并送至第二部位(制造部位)，在第二部位处，肿瘤被解离，并使用IL-2在平板中生长出T细胞。大约两周后，将细胞投入快速扩增方案(REP)中，使细胞数量增长到>1×1010。在REP期间，患者通常进行预处理化疗。在REP后，将TIL的最终产品连同静脉内IL-2一起返回患者体内，以支持重新输注的T细胞。
图2—用于SLAM测量的示例性流式细胞术染色门控策略。将REP之前或之后的TIL用以下抗体染色：
可固定的活性染料eFIuor 450、αCD45RO FITC、αCD8 PE Vio770、αCD4 APC Cy7、αCD62L APC，然后分别用mlgG1 PE和αSLAM PE中任一对来复染。在MACSQuant分析仪上获取细胞。使用MACSQuantify软件使用所显示的门控策略进行分析。
图3a—在快速扩增方案(REP)之前和之后SLAM/CD150在TIL中的表达。REP之后的TIL使用以下染色：
可固定的活性染料eFIuor 450、αCD45RO FITC、αCD8 PE Vio770、αCD4 APC Cy7、αCD62L APC；并随后用mlgG1 PE或αSLAM PE复染。在MACSQuant分析仪上获取细胞。使用MACSQuantify软件进行分析。在每个CD4+或CD8+群体中测定SLAM+细胞的比例并使用Graphpad软件绘图。对于所有三个图表，通过临床应答对患者进行分类(疾病进展、疾病稳定和有应答者)，所示的应答率是根据实体肿瘤应答评价标准(RECISTv1.1)测量中测得的患者实现的最佳应答(请参阅Schwartz等，Eur J Cancers 2016)，*p<0.05。对于显示的所有三个图表，对每个细胞亚型和患者亚型的平均值+/-SEM绘图。使用双向ANOVA确定显著性，然后进行Sidak多重比较检验。对于上图(最终产品(CD4+))，记忆：PD vs R，**p＝0.009。对于下图(最终产品)，CD4：PD vs SD，*p＝0.037；PD vs R，**p＝0.004；CD8：PD vsR，**p＝0.008。
图3b—在快速扩增方案(REP)之前和之后SLAM/CD150在TIL中的表达。Post-REP的TIL使用以下染色：
可固定的活性染料eFIuor 450、αCD45RO FITC、αCD8 PE Vio770、αCD4 APC Cy7、αCD62L APC；并随后用mlgG1 PE和mlgG1 eFIuor 710同种型对照物中任一对或αSLAMPE和αGITR eFIuor 710复染。在MACSQuant分析仪上获取细胞。使用MACSQuantify软件进行分析。每个CD4+或CD8+群体中测定SLAM+细胞的比例在并使用Graphpad软件绘图。(A-C)在来自所有黑素瘤亚型的Pre-REP和Post-REP TIL中的SLAM表达；A)在所有CD4+和CD8+T-细胞中的SLAM表达；B)在初始[N]、记忆[M]和效应[E]CD4+TIL中的SLAM表达；C)在初始[N]、记忆[M]和效应[E]CD8+TIL中的SLAM表达；(D-F)在来自通过临床应答分类的皮肤黑素瘤患者的CD4+和CD8+TIL中的SLAM表达；D)在CD4+和CD8+TIL上的SLAM表达；E)在CD4+T细胞亚组中的SLAM表达；和F)在CD8+亚组中的SLAM表达。封闭圆圈＝疾病发展，开放三角＝疾病稳定，开放正方形＝有应答者。所示的应答率为通过实体肿瘤应答评价标准(RECISTv1.1)测量测得的患者实现的最佳应答(参考Schwartz等，Eur J Cancers 2016)，*p<0.05。
图4—与SLAM表达相关的患者的Kaplan-Meier生存曲线——患者的总生存时间分两组绘图：在第一幅图(A)中，高SLAM治疗组(SLAM阳性CD4 T细胞高于25％的患者)和低SLAM治疗组(SLAM阳性T细胞低于25％的患者)；在第二幅图(B)中，高SLAM治疗组(SLAM阳性CD4T细胞高于40％的患者)和低SLAM治疗组(SLAM阳性T细胞低于40％的患者)。
图5—SLAM分选细胞中的活力和细胞因子应答——将来自两个供体终产品的TIL，TIL032和TIL054，流动分选为高SLAM群体和低SLAM群体。培养24h之后评估活力(A)，将细胞与其各自匹配的同体肿瘤细胞系混合并使用流式细胞术测量细胞因子应答(B)。
图6—SLAM siRNA——通过qPCR(A)或流式细胞术(B)在用SLAMF1 siRNA(siRNA)治疗后76h的Raji，结直肠TIL(MRIBB011)和黑素瘤TIL(TIL032)中或在未治疗细胞(对照物)中测量SLAMF1。
图7—SLAM过表达——通过克隆EF1α启动子下游的人SLAMF1序列、2A切割序列和人胞浆区截短CD19序列来创建SLAM表达盒(A)。用滴定浓度的含有SLAMF1和截短CD19基因的慢病毒颗粒转导Jurkat JRT3-T3.5细胞，并用流式细胞术对表达进行分析(B)。
发明内容
本发明人已识别出一种细胞表面标记物：信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM/SLAMF1/SLAM家族成员1/CD150/CDw150/IPO-3；人氨基酸序列，参见：NCBI参考序列：NP_003028.1)，其与T细胞输注(TIL输注)后的成功治疗相关，因此该标记物显示T细胞(TIL)很可能是肿瘤反应性的。现在尚未知晓这种肿瘤反应性增加时通过何种机制发生，例如，其可能是通过增强表达SLAM的群体中的肿瘤细胞杀伤，和/或，例如，SLAM表达能改善肿瘤微环境中的细胞存活和存留。本发明涉及如何利用该受体改善TIL治疗和其他使用T细胞的癌症治疗，包括利用基因修饰的T细胞的治疗。
在第一方面，本文提供了一种用于获得细胞群体(如T细胞群体)的方法，该T细胞群体富含肿瘤反应性的T细胞，其中选择和任选地扩增表达CD150/SLAM/SLAMF1的T细胞。因此表达CD150/SLAM/SLAMF1的细胞可从大量细胞群体中选择，如T细胞群体(例如基因修饰的T-细胞)或包含少部分其他细胞类型的T细胞群体(例如TIL群体)。
表达CD150/SLAM/SLAMF1的T细胞可选自来源于患者的细胞(例如来自肿瘤活检、淋巴结、腹水的TIL细胞)。在实施方式中，表达CD150/SLAM/SLAMF1的T细胞的选择包括以下中的一种或多种：(i)流式细胞术，(ii)抗体淘选，(iii)磁性选择，(iv)生物标记物靶向的细胞富集。选择可包括将细胞群体与抗-CD150/SLAM/SLAMF1抗体接触。所选择的细胞随后可被分离并扩增以富集群体中存在的CD15Q/SLAM/SLAMF1阳性(+ve)细胞的数目。
在本文提供的实施方式中，表达生物标记物CD150/SLAM/SLAMF1的TIL通过以下选择中的一种或两种来扩增：
a.用辐照的饲养细胞扩增以提供由抗体或共刺激受体驱动的T细胞激活信号和共刺激，和/或
b.用固定或可溶试剂进行扩增，该固定或可溶试剂提供通过所述一种或多种生物标记物驱动的T细胞激活信号和共刺激信号。
在本文提供的实施方式中，细胞群体选自：i)来自肿瘤活检、淋巴结或腹水的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群体；和/或ii)基因修饰的T细胞(如经工程化以表达CAR和/或TCR和/或其他外源核酸的T细胞)群体。
本文提供的发明的另一方面是富含通过本文提供的任何方法获得的肿瘤反应性T细胞的细胞群体。这样的群体可通过如下方式获得：从TIL群体或基因修饰的T细胞群体开始，并且经选择和任选地富集该群体中的CD150/SLAM/SLAMF1阳性(+ve)细胞，例如使用本文提供的任何方法。
本文还提供了富含肿瘤反应性T细胞(如TIL或基因修饰的T-细胞)的细胞群体，其中>25％的T细胞或TIL表达生物标记物CD150/SLAM/SLAMF1，或其中>30％、>35％或>40％的T细胞或TIL表达生物标记物CD150/SLAM/SLAMF1。
在实施方式中，本文提供了富含生物标记物CD150/SLAM/SLAMF1的TIL群体。在一个实施方式中，富含生物标记物CD150/SLAM/SLAMF1的TIL群体根据本文所述的方法获得。在一些实施方式中，TIL可来源于黑素瘤。
T细胞(包括从TIL群体获得的T细胞)可被工程化以表达或过表达来自外源核酸的CD150/SLAM/SLAMF1。以这种方式表达或过表达CD150/SLAM/SLAMF1可增加工程化T细胞的肿瘤反应性。在一个实施方式中，本文提供了包含编码CD150/SLAM/SLAMF1的第一外源核酸的T细胞。T细胞可进一步包含编码嵌合抗原受体(CAR)和/或T细胞受体(TCR)和/或其他蛋白质的第二外源核酸。
合适地，T细胞是CD4+或CD8+细胞。在一些实施方式中，T细胞是记忆细胞。
在本发明的另一方面，本文提供了治疗受试者疾病的方法，该方法包括对受试者施用表达CD150/SLAM/SLAMF1的T-细胞，如TIL或基因修饰的T-细胞。TIL可为通过选择和扩增来源于受试者的细胞而富集CD150/SLAM/SLAMF1的TIL群体，或者TIL可为已被工程化以表达CD150/SLAM/SLAMF1的TIL或其他T细胞。受试者通常是人。治疗方法适合为过继细胞疗法；T细胞可为同体的或同种异体的。疾病适合为癌症，例如黑素瘤，或者卵巢或宫颈癌。
本文中还提供了适合用于静脉内输注的药物组合物，其包括富含表达
CD150/SLAM/SLAMF1的肿瘤反应性T细胞(包括经工程化以表达CD150/SLAM/SLAMF1的T细胞)的细胞群体以及可药用载体、稀释剂或赋形剂，以及任选地一种或多种其他药物活性多肽和/或化合物。
本文还提供了评估细胞群体的肿瘤反应性的方法，该方法包括定量细胞群体中表达SLAM/SLAMF1/CD150的T细胞。合适地，细胞群体可为：i)来自患者的TIL，并且表达SLAM/SLAMF1/CD150的T细胞在REP之前和/或之后进行定量；或ii)经工程化以表达外源CAR和/或TCR的T细胞群体。当评估SLAM/SLAMF1/CD150表达水平时，T细胞/TIL群体中有至少25％的表达SLAM/SLAMF1/CD150的T细胞表明该细胞群体是肿瘤反应性的。
以下还描述了本发明的多个方面和实施方式。
本文所述的发明涉及用于可接受用于癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)疗法的患者的预后的体外方法和利用这些预后标记物开发产生更优化的TIL产品的新方法；该方法包括以下：
i)在来自所述患者的肿瘤消化物或制造过程中的TIL产品的样品中，对TIL上的至少一种生物标记物(SLAM/CD150)进行定量，其中定量是表达所述生物标记物(SLAM/CD150)的细胞的比例。
ii)将在步骤i)中获得的所述至少一种生物标记物的值与同一生物标记物的预定参考值进行比较；该预定参考值与所述癌症的进展的特定预后相关。
iii)在制造之前、过程中或之后，基于表达所述生物标记物的细胞的富集从主体TIL群体中分离细胞。
iv)在T细胞中过表达所述生物标记物以试图改善产品的治疗功效。
v)使用TIL上的所述至少一种生物标记物作为用于TIL产品的释放测试。
vi)使用化学品、抗体、其他细胞、蛋白质、脂质或其他未定义的机制或方法来操纵T细胞群体以增加、增强或诱导所述生物标记物的表达的方法。
在该方法的一些实施方式中，步骤i)由通过流式细胞术对一种或多种生物标记物进行定量组成。
在该方法的一些其他实施方式中，步骤i)由通过在全肿瘤组织样品中的基因表达分析对所述生物标记物进行定量组成。
在该方法的一些其他实施方式中，步骤i)由通过全肿瘤组织样品的免疫组织化学对所述生物标记物进行定量组成。
在该方法的一些实施方式中，步骤iii)由使用流式细胞仪分选分离表达生物标记物的细胞组成。
在该方法的一些其他实施方式中，步骤iii)由使用一些其他形式的物理分离技术分离表达生物标记物的细胞组成，该一些其他形式的物理分离技术可包括但不限于：Miltenyi MACS分离、干细胞技术磁性分离技术或流式细胞仪分选。
在该方法的一些其他实施方式中，步骤iii)由经由一些形式的促有丝分裂刺激过程富集表达生物标记物的细胞组成，如通过使用与该生物标记物结合的抗体或可溶性受体蛋白质，结合T细胞激活刺激，从而通过该生物标记物诱导共刺激。
具体实施方式
细胞
本发明涉及T-细胞，例如存在于肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)样品中的T细胞。特别是，其涉及包含T细胞的细胞群体，如富含肿瘤-反应性的T-细胞的TIL群体。
肿瘤浸润淋巴细胞是离开血液并迁移到肿瘤中的白细胞。它们是单核免疫细胞，不同比例的不同类型细胞(即，T-细胞、B-细胞、NK细胞、巨噬细胞)的混合物，T细胞是迄今最丰富的细胞。它们经常可见于基质中和肿瘤本身中。
TIL可特异性识别、溶解和/或杀伤肿瘤细胞。肿瘤中淋巴细胞的存在通常与更好的临床表现有关。
T-细胞或T-淋巴细胞是一种类型的淋巴细胞，其在细胞介导的免疫中具有核心作用。它们可通过细胞表面上的T细胞受体(TCR)区别于其他淋巴细胞，如B-细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)。有很多类型的T细胞，如以下所总结的。
溶细胞性T细胞(TC细胞，或CTL)破坏病毒感染细胞和肿瘤细胞，并且还涉及移植排异。CTL在其表面上表达CD8分子。这些细胞通过结合到与存在于所有有核细胞表面上的MHC I型相关抗原来识别其目标。通过IL-10，调控性T-细胞CD8+细胞分泌的腺苷和其他分子可被灭活为无变应性状态，这预防了自身免疫疾病，如实验性自身免疫性脑脊髓炎。
记忆T细胞是抗原特异性T细胞的一个亚型，其在感染已被治愈之后长期存在。当再暴露于其同源抗原后，它们快速扩增至大量效应T细胞，由此提供了具有对过去感染的记忆的免疫系统。记忆T细胞包括3个亚型：中央记忆T细胞(TCM细胞)和两种类型的效应记忆T细胞(TEM细胞和TEMRA细胞)。记忆细胞可为CD4+或CD8+。记忆T细胞通常表达细胞表面蛋白质CD45RO。
调控性T细胞(Treg细胞)早先被称为抑制T-细胞，其对免疫耐受性保持非常重要。其主要作用是停止朝向免疫反应终端的T细胞介导的免疫和抑制逃离胸腺中的负性选择过程的自身反应性T细胞。
已对两种主要类别的CD4+Treg细胞——天然Treg细胞和适应性Treg细胞进行描述。
天然Treg细胞(也称为CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞)出现于胸腺中，并且与发育中的T细胞与用TSLP激活的髓样(CD11c+)和浆细胞样(CD123+)树突状细胞之间的相互作用有关。天然Treg细胞可以通过被称为FoxP3的细胞内分子的存在而区别于其他T细胞。
适应性Treg细胞(也称为Tr1细胞或Th3细胞)可来源于正常免疫应答过程。
自然杀伤细胞(或NK细胞)是一种类型的溶细胞性细胞，其形成固有免疫系统的一部分。NK细胞以MHC无关的方式对来自病毒感染细胞的固有信号提供迅速应答。
NK细胞(属于固有淋巴样细胞的组别)被定义为大颗粒淋巴细胞(LGL)，并且构成由产生B-和T-淋巴细胞的共同淋巴样祖细胞分化的第三个细胞种类。
选择和富集
在一个方面，本文提供的发明涉及获得和使用T细胞群体，包括存在于肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群体中的T细胞，其通过从主体细胞群体选择表达CD150/SLAM/SLAMF1的T细胞来富集肿瘤反应性T细胞。在选择时，将CD150/SLAM/SLAMF1阳性细胞从主体群体分离以提供富含表达CD150/SLAM/SLAMF1的T细胞的群体，并且任选地随后扩增所选择的细胞以增加CD150/SLAM/SLAMF1+ve(阳性)细胞的数量。一旦选择了CD150/SLAM/SLAMF1+ve细胞，可使用本领域已知的任何合适的在扩增后保持提供CD150/SLAM/SLAMF1表达的T细胞扩增方法。
例如，本文描述了一种使用以下选择技术中的一种或多种来选择表达预后良好水平的所述生物标记物(CD150/SLAM/SLAMF1)的细胞的体外方法：(i)流式细胞术，(ii)抗体淘选，(iii)磁性选择，(iv)生物标记物靶向的细胞富集。
与许多其他人类基因一样，有多个SLAMF1同种型，其中的一些是非编码的并且不会产生功能性表面蛋白质。然而，这些剪接变体在其胞浆区，和SLAMF1的抗体(如本文所述那些)，结合胞外区存在区别，因此结合SLAMF1的不同同种型。
所选择的表达所述生物标记物(CD150/SLAM/SLAMF1)的细胞随后可例如通过以下选择中的一种或两种扩增：
a)辐照饲养细胞，以这种方式提供受抗体或共刺激受体驱动的T细胞激活信号和共刺激；和/或
b)固定或可溶性试剂，其提供通过所述一种或多种生物标记物驱动的T细胞激活信号和共刺激信号。
例如，在一些实施方式中，通过使用抗体的SLAM/CD150的共刺激是可行的，因为在文献中已显示它们诱导共刺激，参见：Aversa G,Chang CC,Carballido JM,Cocks BG,deVries JE.J Immunol.1997,May 1,158(9):4036-44。
外源核酸分子
在一个方面，本发明提供了一种细胞，其包含编码SLAM(信号传导淋巴细胞激活分子)/SLAMF1/CD150的外源核酸分子。词语“外源”表示核酸分子通过重组手段产生并例如通过载体(如慢病毒载体)引入细胞。细胞经工程化以包含核酸分子和表达(或过表达)SLAM/SLAMF1/CD150。任选地，细胞可进一步包括例如编码嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)第二外源核酸，因此表达CAR或TCR。
如本文所用，术语“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”旨在彼此同义。
本领域技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸和核酸可编码相同的多肽。另外，应理解，本领域技术人员可以使用常规技术，进行不影响本文中所述的多核苷酸编码的多肽序列的核苷酸取代，以反映要在其中表达该多肽的任何特定宿主生物体的密码子使用，例如密码子优化。
根据本发明的核酸可包括DNA或RNA。它们可为单链或双链的。它们还可为在其中包含合成或修饰核苷酸的多核苷酸。对寡核苷酸的许多不同类型的修饰在本领域中是已知的。这些包括膦酸甲酯和硫代磷酸酯骨架，在分子的3'和/或5'末端添加吖啶或聚赖氨酸链。对于本申请，应理解多核苷酸可通过本领域任何可行的方法修饰。可进行这样的修饰以增强所关注的多核苷酸的体内活性或寿命。
载体
在一个方面，本发明提供了一种载体，其包括本发明的核酸序列或核酸构建物。
这样的载体可用于将核酸序列或核酸构建物引入到表达SLAM/SLAMF1/CD150的宿主细胞中。
例如，载体可为质粒或病毒载体，如逆转录病毒载体或慢病毒载体，或基于转座子的载体或合成mRNA。来源于逆转录病毒(如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许长期、稳定整合的转基因或多种转基因以及其在子代细胞中的繁殖。
载体可能能够转染或转导T-淋巴细胞。本发明还提供了其中插入了本发明的核酸的载体。
编码SLAM/SLAMF1/CD150以及任选的TCR或CAR的天然或合成核酸的表达通常是通过如下方式实现的：将编码SLAM/SLAMF1/CD150和TCR/CAR多肽或其部分的核酸可操作地连接至一个或多个启动子，并将构建物加入表达载体中。载体可适合在真核细胞中复制和整合。典型的克隆载体包含可用于调控所需的核酸序列的表达的转录和翻译终止子、启动序列和启动子。
病毒载体技术是本领域中公知的，并且在例如Sambrook等，(2001，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)和其他病毒学和分子生物学手册中描述，还参见，WO 01/96584；WO 01/29058；以及美国专利6,326,193。
为了评估SLAM/SLAMF1/CD150多肽或其部分的表达，要被引入到细胞中的表达载体还可包含可选择的标记基因或报告基因或二者以利于从要通过病毒载体转染或转导的细胞群体中识别和选择表达细胞。例如，标记基因可为如图7A中所示的CD19。
在一些实施方式中，核酸构建物示于图7A中。图7A示出了创建的慢病毒表达构建物，其中SLAMF1和CD19标记基因受EF1α启动子驱动。
药物组合物
本发明还涉及一种药物组合物，其包含本发明的T细胞或TIL的细胞群体以及可药用载体、稀释剂或赋形剂，以及任选地一种或多种其他药物活性多肽和/或化合物。该制剂可例如为适合用于静脉内输注的形式。本文提供了用于静脉内输注的药物组合物，其包含其中至少25％、30％、40％或50％的T细胞表达SLAM/SLAMF1/CD150的T细胞群体。
治疗方法
一种用于治疗的包含表达SLAM/SLAMF1/CD150的TIL的TIL产品可通过从来源于受试者的细胞富集表达SLAM/SLAMF1/CD150的细胞或通过对细胞工程化以表达SLAM/SLAMF1/CD150获得。
本发明的包括表达SLAM/SLAMF1/CD150的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的T细胞可为来自患者自身的外周血(同体的)体外的，或者在来自供体外周血(同种异体的)或来自不相关供体(同种异体)的外周血的造血干细胞移植物的设置中。在这些情况中，通过用包括用病毒载体转导、用DNA或RNA转染在内的许多手段中的一种来引入编码SLAM/SLAMF1/CD150以及任选地CAR和/或TCR的DNA或RNA来产生表达SLAM/SLAMF1/CD150以及任选的CAR和/或TCR的T细胞。
对于其中细胞被施用给患者的本发明的方法，细胞可为对患者而言同种异体或同体的T细胞。
一种用于治疗疾病的方法涉及本发明的载体或细胞的治疗用途。在此方面，载体，或T细胞可被施用给患有已存在的疾病或状况的受试者以减轻、减少或改善与该疾病相关的至少一种症状和/或减缓、减少或阻断该疾病的发展。本发明的方法涉及增加T细胞的肿瘤反应性，如存在于TIL细胞群体中并构成TIL细胞群体的T细胞。本文的数据验证了增加的抗肿瘤活性，这显示具有增加的SLAM/SLAMF1/CD150的T细胞与用这些细胞治疗的癌症患者中改善的临床应答相关。这些细胞可被认为是肿瘤反应性T-细胞。不知道增加的SLAM表达为何与改善的临床应答(在本文中称为增加的肿瘤反应性)相关，例如，可能是SLAM参与了增加的肿瘤杀伤或者SLAM参与了促进T细胞存留。
下文是本发明的多个方面和实施方式的进一步的细节。
现在有无可辩驳的证据表明免疫系统可以对许多癌症类型作出有效应答。这导致了许多癌症免疫疗法的发展。这些可以大致分为基于细胞的免疫疗法和非基于细胞的免疫疗法。免疫疗法已显示出一些令人振奋的结果。特别是使用检查点阻断抗体如抗PD1(纳武单抗；派姆单抗)和PDL1(阿特珠单抗)或抗CTLA4(Ipilumumab)在晚期转移性黑色素的临床研究中取得了显著成果。基于细胞的癌症免疫疗法在早期针对CD19-CAR T细胞靶向B细胞恶性肿瘤的试验中也获得了同样令人振奋的结果，特别是显示了令人鼓舞的结果。
TIL治疗通常是更简单的方法，因为它不需要基因修饰，因此是吸引人的。在黑素瘤中，通常观察到约50％的应答率。宫颈癌的一项临床试验也显示了33％的应答率。还有许多针对其他癌症适应症(包括卵巢癌)的正在进行的试验。
癌症应答使用RECIST指南(2000年公布的第1版)来测量，并且最近在RESIST指南1.1(Eisenhauer等，2009)中进行了更新。使得能够对肿瘤负荷变化进行一致的评估，这是癌症治疗临床评价的重要特征：作为客观应答的肿瘤萎缩或无法检测到疾病(CR+PR)，无变化(疾病稳定(SD))和疾病进展(PD)，都是在临床试验中确定治疗功效和患者预后的有用终点。RESIST1.1的一个关键变化是其允许肿瘤在萎缩之前因炎症而增大尺寸，这对于允许如TIL之类的治疗发挥作用是至关重要的，否则这些疗法可能被视为失败。
本发明提供了一种用于在患者中使用肿瘤浸润淋巴细胞治疗的治疗效果的预后的方法，这种新方法是基于一种或多种生物标记物的检测和/或定量，例如在肿瘤中、在TIL制造过程中或在输注之前的TIL产品中的CD4+和/或CD8+肿瘤浸润淋巴细胞上。
通过TIL产品的流式细胞仪分析，申请人发现了在TIL产品内的CD4+和/或CD8+T细胞上表达的细胞分子标记物，其与输注时在患者中看到的应答相关。
本发明人已证实与患者应答相关的本文所述的标记物是SLAM(CD150)。
根据本发明已发现在细胞表面标记物的表达和用TIL治疗的成果之间存在关联。
所识别的受体是SLAM(信号传导淋巴细胞激活分子/SLAMFI/CD150)。SLAM是给予SLAM家族受体的特定成员的名称，具体指代SLAM家族受体1(SLAMF1)。SLAM家族包含许多其他成员，包括SLAMF3(CD229)、SLAMF4(CD244)和SLAMF7(CRACC/CD319)。这些受体大部分是自体配体，它们通过造血细胞彼此结合。SLAM家族受体的胞浆区包含免疫受体酪氨酸基开关基序，其与SAP(在T-细胞中)或EAT-2(在NK-细胞中)蛋白质适配体相关。SLAM家族受体的作用仍有一些尚未解决。它们能以激活作用或抑制作用辅助免疫应答，这取决于所关注的SLAM家族受体和其所表达的细胞。CD150本身已证实了共刺激功能。SLAM结合诱导了IFNy占主导的细胞因子的TH1表型，因此暗示操纵SLAM可对TH2极化的疾病有益(Quiroga等，2004)。此外，已表明与TH2细胞相比，SLAM在TH1细胞中的表达程度更高(Hamalainen等，2000)，这可部分解释关于其为何像细胞因子一样诱导TH1的观察结果。关于CD150所做的最终兴趣点是，其是麻疹病毒的主要病毒受体(Erlenhoefer等，2001)。已通过使用慢病毒将这种病毒用于细胞治疗目的，这些慢病毒与麻疹病毒包膜一起假型化，以特异性更高地将慢病毒靶向T细胞(Frecha等，2011)
因此，本发明的第一目的由用于可接受用于癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)疗法的患者的体外方法组成；该方法包括以下：
i)对来自肿瘤消化物、制造过程期间的TIL材料或来自所述患者的TIL产品样品中的TIL上的至少一种生物标记物进行定量；和
ii)将步骤i)中获得的所述至少一种生物标记物的值与同一生物标记物的预定参考值进行比较；该预定参考值与所述癌症的进展的特定预后相关。
尽管存在看起来与临床功效相关的先前的TIL上分子标记物的示例(例如BTLA)，但无人对SLAM进行过描述。Radvanyi等，2015将TIL中CD8+T细胞的比例描述为与良好的临床表现有关。这是由于观察到BTLA可以作为T细胞活性的负调节剂而混淆的(Watanabe等，2003)。
富含CD8+细胞的TIL产品相对于混合的CD4+和CD8+细胞没有赋予存活优势(Dudley等，2010)。这在很大程度上被认为是因为CD4+辅助T细胞的存在有助于CD8+T细胞的存活和移植。此外，有证据表明，CD4+细胞可以帮助直接识别和杀死肿瘤细胞(Tran等，2014)。
Radvanyi等(2015)还将BTLA的表达描述为与临床益处具有良好的关联。BTLA的表达与具有增强的存活特性的分化程度较低的T细胞相关(Haymaker等，2015)。然而，自相矛盾地，还显示TIL输注产品中分化程度更高的效应记忆T细胞的存在与良好的预后相关。效应记忆T细胞通常通过CD62L或CCR7结合CD45RO或CD45RA的共表达为标记，从而使效应记忆细胞能够拥有具有以下表型：CD62L-/CD45RO+、CD62L-/CD45RA-、CCR7-/CD45RO+或CCR7-/CD45RA-。
还有许多出版物和现有技术描述了体内TIL上各种细胞表面标记物与临床表现的相关性，但这与TIL的生产无关，而不是与肿瘤活检的分析无关。示例包括专利US20090215053A1——Vitro Method for the Prognosis of Progression of a Cancerand of the Outcome in a Patient and Means for Performing Said Method.
如本文所预期的，肿瘤浸润淋巴细胞是：a)经由物理或酶解聚作用从癌症患者的肿瘤样品直接分离的CD45+细胞，b)从来自所述患者的淋巴结分离的CD45+细胞，c)从腹水分离的CD45+细胞(又名肿瘤相关的淋巴细胞)。在整个TIL制造过程中，TIL仍保持原样，倾向于获得稍微不同的表型，其中它们保留CD45+，但当细胞在IL-2中培养和用辐照饲养细胞或可替代地的TIL扩增系统激活时CD3+细胞的比例增加。这些CD45+/CD3+细胞被称为T-细胞或T-淋巴细胞。因此，术语“TIL”涵盖了从手术点到返回给同一患者的输注点的任何CD45+细胞。
所述标记物(SLAM/SLAMF1/CD150)的分析可通过以下几种机制之一进行。在第一种情况中，可执行流式细胞术。在这种情况下，细胞可用SLAM抗体染色以确定其存在与否。另外，可向染色面板中加入其它抗体以观察TIL中的确定的细胞群体。例如，细胞可用CD62L、CD45RO、CD4和/或CD8抗体复染。
另外，所述标记物(SLAM/SLAMF1/CD150)可以富集表达所述标记物的细胞的方式被利用，以试图改善最终产品的功效。例如可利用流式细胞术以通过使用轭合至荧光团或其他直接或间接可选择标记物的特定抗体(抗-SLAM)或重组(r)蛋白(例如r-SLAM)来分离表达所述标记物的细胞。可替代地，可实施用于分离细胞的其他技术。例如，Miltenyi MACS磁性技术，Invitrogen Dynal技术或干细胞技术EasySep技术可用于分离表达所述标记物的细胞。
仍然可替代地，固定于板、珠或其他固体基质的、或者在呈递人工抗原的细胞平台上表达的抗体(或其抗体片段)或重组蛋白可用于富集表达所述标记物的细胞。在这样的示例中，抗体或重组蛋白可被单独发现或与诱导对T细胞的主要激活信号的抗体或其他激活平台组合发现(示例包括但不限于：植物血凝素、抗CD3抗体、主要组织相容性肽抗原复合物、豆蔻酸佛波酯)。
然后，上述所有目的都是基于所述标记物的表达对患者进行分级，并在可能的情况下通过上述一种或多种方法分离和/或富集治疗细胞。
如本文所预期的，本领域中可使用多种方法来评估生物标记物的存在，或者使用：
(a)直接方法，其中生物标记物结合部分以单一或多个步骤结合至第二报告部分，如轭合至可检测的报告系统(如流式细胞术、显微镜或蛋白质组凝胶色谱法中常用的那些)的生物标记物结合抗体；或(b)间接方法，其中通过如定量PCR来定量生物标记物编码核酸。当选择的方法是在基于单一细胞和群体的方法上分析细胞时，其中细胞加载有对确定的表面标记物的抗体，该表面标记物可直接或间接偶联至荧光团，该荧光团以确定的波长发光，该光可通过流式细胞仪机器的组件检测。在本文中术语流式细胞术优选为更经常使用的但并不正确的术语FACS，后者是Becton Dickinson流式细胞仪机器的商标。同时，任何流式细胞仪可用于该方法的分析(Becton Dickinson[BD]，Miltenyi，Acea等)适用于此方法，但可使用其他方法。
优选地，当步骤a)由一种或多种基因，即一种或多种相关的生物标记物的表达分析组成时，则所述一种或多种基因的表达的定量在全肿瘤组织样品上进行。
鉴于本公开，本发明的多个其他方面和方式对本领域技术人员将是显而易见的。本说明书中提到的所有文件均通过引用以其整体并入本文。
“和/或”在本文中被用作对两个指定特征或组件中的每一个带有或不带有另一个的特定公开。例如“A和/或B”被视为对以下中每个的特定公开：(i)A，(ii)B，和(iii)A和B，就好像每个在此单独列出一样。
除非上下文另外指示，否则以上阐述的特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方式，并且同样适用于所描述的所有方面和实施方式。本发明的某些方面和实施方式现在将通过示例和参考上述附图和以下描述的表格来说明本发明。
实施例1-SLAM/CD150在肿瘤浸润淋巴细胞中表达的分析
从患者获取转移性黑素瘤肿瘤活检，并将其带入实验室，在这里首先用手术刀将它们切割成小块，随后使用胶原酶和DNA酶消化为单细胞悬浮液。
将细胞悬浮液以约1×106活CD3+细胞/孔接种在24孔板中的完全培养基中，并添加3000lU/ml IL-2。监测培养物的细胞生长并根据需要进行分裂以维持健康的培养。
TIL生长最多21天或直到CD3+细胞计数大于30×106，然后洗涤并冷冻细胞。在冷冻之前，取样进行流式细胞仪分析。此时，样本被称为Pre-REP的。在准备好将细胞用于输注之前，必须将其扩展到超过1×1010的数量。为实现这点，TIL经历快速扩增方案。简言之，将TIL细胞在扩增前1至3天解冻。然后将TIL细胞以1:50至1:1000的比例与辐照的同体/异体PBMC饲养细胞混合，添加10-50ng/ml OKT3。然后将TIL扩增2周，之后将其称为Post-REP的TIL。在输注治疗性TIL产品之前(即Post-REP的TIL)，患者经历由氟达拉滨和环磷酰胺组成的预处理化学疗法。Post-REP的TIL被发放给患者并在多个IL-2剂量之前以单次输注的形式给予患者。
在Pre-REP和Post-REP的时间点上，通过流式细胞术分析TIL细胞。简言之，1-2×105细胞的3个样品在PBS中洗涤，随后用50ml 1:400稀释的可固定的活性染料eFIuor 450于室温避光温育5分钟。细胞用150ml PBS洗涤两次，随后再悬浮在50ml用2mM EDTA和0.5％胎牛血清(PEF)。于4℃在30分钟内向每个样品中添加如下表中所示的抗体。
Figure BDA0002693105580000111
在温育之后，细胞用150ml冷PEF洗涤两次，并最终再悬浮在200μl PBS中。在MACSQuant分析仪上获取细胞并使MACSQuantify软件分析数据(图1)。当比较Pre-REP和Post-REP的TIL时，我们发现与Post-REP阶段相比，Pre-REP阶段的CD4+和CD8+TIL中SLAM的表达增强。特别是，我们观察到在CD4+Post-REP TIL中SALM表达的两个不同群体，显示了高SLAM和低SLAM的患者组。特别是，SLAM表达往往很大程度上限制在CD4+和CD8+群体中的记忆细胞群体在，在初始和效应群体中的表达较低。初始和效应群体形成了总TIL产品的一小部分。
当我们分析皮肤黑素瘤中SLAM+细胞的比例与患者应答时，我们发现，与疾病进展的那些患者(“进展者”)相比，CD4+T细胞的比例显著增加，其在疾病稳定的患者(p＝0.0252)或有应答者(p＝0.0113)中是SLAM+的。在CD8+群体中，在那些对治疗由应答的患者和那些疾病进展的患者(p＝0.0248)之间观察到显著区别。显著区别主要限制于在记忆细胞群体中看到的区别。在CD4+T细胞中，记忆细胞群体在疾病稳定的患者和进展者之间(p＝0.0384)以及在疾病进展的患者和有应答者之间(p＝0.0221)有显著区别。在CD8+记忆T细胞中，我们看到在疾病进展和疾病稳定的患者之间(p＝0.0348)和在疾病进展的那些患者和有应答者(p＝0.0169)之间有显著区别。
在治疗后，对患者进行评估，以根据实体肿瘤中的应答评估标准(RECISTvl.1)测量肿瘤尺寸。根据最新的RECIST1.1指南(Schwartz等，2016)测定最佳应答。绘制了患者的总体存活期与应答持续时间的关系(图4)。我们使用了高SLAM和低SLAM的两个截止值：最终产品中所有CD4+TIL分别为25％和40％。我们发现，具有>25％SLAM+细胞的患者相比于具有<25％SLAM+细胞的那些患者具有更高的存活率(分别为中位数21.3个月相对于2.4个月，经Wilcoxon检验，显著性差异p＝0.009，且稳定期为44％(图4A)。我们同样发现，具有>40％SLAM+细胞的患者与那些具有<40％SLAM+细胞的患者相比，其存活率提高了(分别为未达到中位数相对于4个月，经Wilcoxon检验，显著性差异p＝0.027)，并且稳定期为55％(图4A)。
实施例2-T细胞和TIL中SLAM表达的调节
我们首先评估了TIL中SLAM表达对活力的影响以及TIL对匹配肿瘤的功能性应答(TIL032和TIL054)。为此，我们采用了两种TIL输注产品，并使用抗-SLAM抗体和流式细胞术分选仪分选出了高SLAM和低SLAM群体。在整夜测试期之后，将细胞与其同体的肿瘤系共同培养或留在未刺激的孔中16h，随后使用DRAQ7测定活力(图5A)和使用流式细胞术测定产生IL-2、IFNy和TNFa的细胞(图5B)。我们发现TIL032和TIL054的高SLAM细胞与低SLAM或未分选细胞相比具有增加的活力(图5A)。当与其肿瘤混合时，作用作用较不明显，但在TIL054中很明显。当我们评估细胞因子产生时，我们发现当TIL与其匹配肿瘤一起培养时细胞因子应答提高。当看到产生TNFα时，这点最明显。然而，我们发现来自高SLAM的分选群体的TNFα应答在总体上高于来自低SLAM的分选细胞，例外情况是TIL054中对肿瘤的CD8+应答。
接下来，我们评估了SLAMF1 siRNA对SLAMin细胞系和T细胞的表达的影响，以此作为调节SLAM表达的方法。我们选择了SLAM+细胞系Raji和两种TIL样品(MRIBB011，一种结直肠肿瘤TIL样品，以及来自TIL032的TIL032输注产品)。细胞在96孔中铺板(1×105/孔)，使用在最小培养基(RPMI+1％FCS+ITS，并且对TILs补充以1000lU/ml IL-2)中的10mM自递送siRNA(Accell Human SLAMF1 siRNA SMARTpool,5nmol-[Dharmacon,Colorado,USA])。对照物在相同条件下生长但没有siRNA。76小时后，从每种条件汇集2×105细胞(2x孔)，并且使用Cells-to-CTTM 1-Step
Figure BDA0002693105580000121
试剂盒(Invitrogen)。
将细胞简短离心，用PBS(R/T)洗涤并再次造粒。除去上清液，加入49μl Lysis溶液+1μl DNA酶。将它们在R/T温育5分钟，然后添加5ml STOP溶液。样品于室温放置2分钟，然后放在冰上直至使用。所有上述试剂随试剂盒提供。裂解液在-80℃可稳定5个月。
将针对SLAMF1(Assay ID：Hs00234149_m1，Invitrogen)和GAPDH(Assay ID：Hs03929097_g1，Invitrogen)的TaqMan反应重复三次，并将反应体积从试剂盒建议的20ml缩减至10ml。在每个反应中都添加1ml裂解液。也设置具有已从未反应的Raji细胞提取的RNA的阳性对照试验以负责细胞裂解物中可能存在的PCR抑制剂。
我们在Raji细胞中观察到SLAM转录物几乎完全被敲低(>99％)(图6A)。在MRIBB011中，我们看到SLAM转录物减少了31％；而在TIL032中，我们看到了SLAM转录物增加了57％。不同程度地该表了蛋白质表达(图6B)。同一时间段内蛋白质表达在Raji细胞表面减少了5.3％，在MRIBB011 TIL中减少了30.8％，在TIL032中减少了9.6％。因此SLAM siRNA是调节SLAM表达的合适方法，尽管需要对每个测试的细胞系进行优化以观察表达的最佳敲低。
接下来我们测定T细胞中的SLAM表达的增强是否能提供一种定量SLAM表达的影响的替代方法，而不是通过经由siRNA实现的敲低来实现。为此，产生其中SLAMF1和CD19标记基因受和EF1α启动子驱动的慢病毒表达构建物(图7A)。通过瞬时转染在HEK293T细胞中产生慢病毒颗粒，然后在SLAM阴性Jurkat JRT3-T3.5细胞上滴定所得的颗粒(图7B)。在Jurkat细胞中证明了SLAM和CD19的共表达。
本发明的多个方面和实施方式还在以下条款中列出：
1.一种经历肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)疗法的患者的预后的体外方法，该方法包括以下步骤：
a.定量来自所述患者的TIL样品中的生物标记物(CD150/SLAM/SLAMF1)，其是适应性免疫应答状况的指征；和
b.所述生物标记物(CD150/SLAM/SLAMF1)是癌症应答的指征；和
c.将步骤a)获得的所述至少一种生物标记物(CD150/SLAM/SLAMF1)的值与同一生物标记物的预定参考值进行比较；用于此步骤的预定参考值与所述癌症的特定预后或进展相关。
2.根据条款1所述的体外方法，其中所述肿瘤组织样品来源于由以下组成的组：(i)原发性肿瘤，(ii)转移性肿瘤病变，(iii)位于最接近所述患者的肿瘤病变之一处的淋巴结。
3.根据条款1所述的体外方法，其中步骤a)使用流式细胞术进行。
4.根据条款1所述的体外方法，其中步骤a)使用如下的可替代直接或间接方法进行：评估所述生物标记物(CD150/SLAM/SLAMF1)的值和所述比较步骤a)中获得的所述至少一种生物标记物(CD150/SLAM/SLAMF1)的值的方法能够确定同一生物标记物预定参考值；其中预定参考值与所述癌症的特定预后或进展相关。
5.根据条款1所述的体外方法，其中所述生物标记物(CD150/SLAM/SLAMF1)由淋巴细胞表达。
6.根据条款1所述的体外方法，其中作为所述患者对所述患者的癌症的适应性免疫应答状况的指征的所述生物标记物(CD150/SLAM/SLAMF1)由选自下组的来自免疫系统的细胞所表达的至少一种生物标记物组成：T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞、gd T-细胞、CD4+细胞和/或CD8+细胞。
7.根据条款1所述的体外方法，其中所述生物标记物是SLAM(CD150).
8.根据条款1所述的体外方法，其中所述生物标记物(CD150/SLAM/SLAMF1)在以下样品之一中定量：(i)肿瘤的单细胞悬浮液，(ii)在肿瘤浸润淋巴细胞培养期间的任何时间点从该肿瘤的单细胞悬浮液获得的材料样品，(iii)分发用于输注给所述患者的最终产品。
9.一种使用以下选择技术中的一种或多种来选择表达预后良好水平的所述生物标记物(CD150/SLAM/SLAMF1)的体外方法：(i)流式细胞术，(ii)抗体淘选，(iii)磁性选择，(iv)生物标记物靶向的细胞富集。
10.根据条款9所述的体外方法，其中表达所述生物标记物(CD150/SLAM/SLAMF1)的细胞通过以下选项中的一种或两种的方式扩增：
a)辐照饲养细胞，以提供受抗体或共刺激受体驱动的T细胞激活信号和共刺激的方式；和
b)固定或可溶性试剂，其提供通过所述一种或多种生物标记物驱动的T细胞激活信号和共刺激信号。
11.一种在一种或多种淋巴细胞中表达所述生物标记物(CD150/SLAM/SLAMF1)的体外方法。
12.一种载体，其包含根据条款11所述的核酸序列。
13.一种细胞，其表达根据条款11所述的多肽。
14.一种制备根据条款11所述的细胞的方法，其包括以下步骤：用根据条款12中任一项所述的载体来转导或转染细胞。
15.根据条款12所述的载体，其中所关注的转基因还编码嵌合抗原受体、T细胞受体或用于过继细胞疗法的其他免疫治疗受体，因此当载体用于转导靶细胞时，该靶细胞共表达根据条款13中任一项所述的多肽和嵌合抗原受体、T细胞受体或免疫治疗关注的其他受体。为清楚起见，这种额外的多肽编码的蛋白质名为关注蛋白质(POI)
16.一种用于对表达POI的细胞进行选择的方法，其包括以下步骤：
I.检测用根据条款15所述的载体转染或转导的细胞表面上的POI表位的表达；和
II.富集被鉴定为表达POI表位的细胞。
17.一种制备富集了表达POI的细胞的纯化细胞群体的方法，其包括以下步骤：使用根据条款16所述的方法从细胞群体中选择表达POI的细胞。
18.一种细胞群体，其富含表达根据条款1所述的多肽的细胞，并由此富含表POI的细胞。
19.一种在体内追踪传导细胞的方法，其包括在细胞表面测定根据条件1所述多肽的表达的步骤。
20.一种对受试者疾病进行治疗的方法，其包括将根据条款12-14中任一项所述的细胞或条款18所述的细胞群体施用于受试者的步骤。
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Claims (22)

1.一种获得富含肿瘤反应性T细胞的细胞群体的方法，其中选择和任选扩增表达CD150/SLAM/SLAMF1的T细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中表达CD150/SLAM/SLAMF1的T细胞是选自来源于受试者的细胞的T细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中选择表达CD150/SLAM/SLAMF1的T细胞包括以下中的一种或多种：(i)流式细胞术，(ii)抗体淘选，(iii)磁性选择，(iv)生物标记物靶向的细胞富集。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中选择T细胞包括将所述细胞群体与抗-CD150/SLAM/SLAMF1抗体接触。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中表达CD150/SLAM/SLAMF1的T细胞通过以下选择中的一种或两种方式进行扩增：
用辐照的饲养细胞扩增以提供通过抗体或共刺激受体驱动的T细胞激活信号和共刺激；或
用固定或可溶试剂的扩增，这提供了通过CD150/SLAM/SLAMF1驱动的T细胞激活信号和共刺激信号。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞群体选自：i)来自肿瘤活检、淋巴结或腹水的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群体；和/或
ii)经工程化以表达CAR和/或TCR的T细胞群体。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法获得的细胞群体。
8.细胞群体，其中所述群体包括T细胞，并且其中>25％、>30％或>40％的T细胞表达CD150/SLAM/SLAMF1。
9.根据权利要求7或权利要求8所述的细胞群体，其中所述细胞是TIL，优选来源于黑素瘤的TIL。
10.一种T细胞，包括编码CD150/SLAM/SLAMF1的第一外源核酸。
11.根据权利要求10所述的T细胞，还包括编码嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的第二外源核酸。
12.根据权利要求10或权利要求11所述的T细胞，其中所述T细胞是TIL。
13.根据权利要求6-9中任一项所述的细胞群体或根据权利要求10-12中任一项所述的T细胞，其用于治疗癌症，优选黑素瘤。
14.根据权利要求1-6中任一项所述的方法、根据权利要求7-9或权利要求13中任一项所述的细胞群体，其中表达CD150/SLAM/SLAMF1的T细胞包括CD4+或CD8+细胞，任选地其中表达CD150/SLAM/SLAMF1的T细胞包括记忆细胞。
15.一种过继细胞疗法的方法，包括将根据权利要求7-9或权利要求13和14中任一项所述的细胞群体或根据权利要求10-12中任一项所述的T细胞施用给受试者，其中T细胞是同体的或同种异体的。
16.一种用于治疗受试者的疾病的方法，所述方法包括将根据权利要求7-9或权利要求13和14中任一项所述的细胞群体或根据权利要求10-12中任一项所述的T细胞施用给受试者的步骤。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述疾病是癌症，优选黑素瘤。
18.一种药物组合物，包括：
根据权利要求7-9或权利要求13和14中任一项所述的细胞群体或根据权利要求10-12中任一项所述的T细胞。
19.根据权利要求18所述的药物组合物，其用于治疗癌症，优选黑素瘤。
20.一种用于评估细胞群体的肿瘤反应性的方法，所述方法包括对表达SLAM/SLAMF1/CD150的T细胞在所述细胞群体中的比例进行定量。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述细胞群体是：i)来自患者的TIL，并且定量Pre-REP和/或Post-REP的表达SLAM/SLAMF1/CD150的T细胞；或ii)经工程化以表达外源CAR和/或TCR的T细胞群体。
22.根据权利要求20或权利要求21所述的方法，其中所述表达SLAM/SLAMF1/CD150的T细胞的比例为所述细胞群体的至少25％表示所述细胞群体是肿瘤反应性的。
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