CN117460742A - 用于增强的干细胞样记忆t细胞工程化的材料和方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供了用于产生干细胞样记忆T(TSCM)细胞的方法。本公开还提供了细胞、药物组合物以及它们在用于治疗疾病诸如癌症的过继免疫疗法中的用途。

Description

用于增强的干细胞样记忆T细胞工程化的材料和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年4月8日提交的美国临时申请号63/172,595、2021年4月8日提交的美国临时申请号63/172,601、2021年4月8日提交的美国临时申请号63/172,605以及2021年4月8日提交的美国临时申请号63/172,610的优先权，这些临时申请中的每个临时申请的公开内容全文以引用方式并入本文。

技术领域

本发明涉及产生用于在过继免疫疗法中使用的干细胞样记忆T(T_SCM)细胞的方法。本发明还涉及细胞、药物组合物以及它们在用于治疗疾病的过继免疫疗法中的用途。

序列表

本申请包含已经以ASCII格式电子递交的序列表，并且据此全文以引用方式并入。所述ASCII副本创建于2022年4月6日，命名为253505_000131_SL.txt，并且大小为21,082字节。

背景技术

免疫疗法提供了治疗实体瘤和其他癌症的新途径^1,2。包括单克隆抗体、T细胞重定向双特异性抗体、检查点阻断和最近的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)在内的生物制剂已经极大地改善了肿瘤的治疗。有力的证据表明，使用遗传修饰的T细胞(诸如T细胞受体(TCR)转导的和CAR工程化的T细胞)的过继转移的免疫疗法可导致一些患有转移性癌症的患者的完全缓解。目前，食品和药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)已经批准了四种CAR-T疗法，更多疗法处于临床研发管线中³。然而，基于CAR-T细胞的疗法的最近成功并非没有它们的缺点^4-7。

发明内容

CAR-T细胞通过以下方式来产生：收集患者血液，提取T细胞并表达通常具有靶向肿瘤相关抗原(TAA)的单链可变片段(scFv)的CAR。该过程将患者的T细胞重新编程为特异性地靶向肿瘤细胞并破坏它们，从而导致细胞死亡⁸。目前的临床试验已经利用外周血单核细胞(PBMC)衍生的T细胞亚群或未选择的大量T细胞群作为TCR工程化和CAR-T细胞扩增的起始群体。然而，目前的制造方法已经导致施用于患者的最终细胞产品的不一致、可变的细胞组成的产生。

干细胞样记忆T(T_SCM)细胞是由初始T细胞直接产生的早期记忆T细胞亚群的稀有群体，它们与其他表征的记忆和效应T细胞亚群相比具有不同的表型、转录和表观遗传状态。单个T_SCM细胞拥有自我更新，从而重建整个T细胞亚群(包括中央记忆(T_CM)T细胞亚群、效应记忆T细胞亚群和效应T细胞亚群)的能力。T_SCM细胞在健康供体和癌症患者中均被检测到，尽管在后者中频率较低，并且与其他已知的记忆T细胞亚群相比，显示出具有更少衰竭标记(exhaustion marker)的基因标签。特别是应用目前的常规制造方法，从大量未分选的PBMC群产生优化的T_SCM或T_SCM样细胞的努力，已经证明在很大程度上是无效的。

在此背景下，本申请提供了一种产生具有增强的效应子功能和减少的衰竭标记以增强抗肿瘤免疫的T_SCM CAR-T细胞的方法。

在一个方面，本文提供了一种在T细胞群中富集干细胞样记忆T(T_SCM)细胞的方法，该方法包括以下步骤：

a)使所述T细胞群与有效量的包括白介素7(IL-7)的一种或多种细胞因子接触足以富集T_SCM细胞的时间段；以及

b)任选地扩增所述T_SCM细胞。

在一些实施方案中，该一种或多种细胞因子还包括IL-15。在一些实施方案中，该一种或多种细胞因子还包括IL-21。在一些实施方案中，该一种或多种细胞因子还包括IL-15和IL-21。

在一些实施方案中，将该一种或多种细胞因子中的每一种细胞因子与T细胞群以约1ng/ml至15ng/ml、约2ng/ml至14ng/ml、约3ng/ml至13ng/ml、约4ng/ml至12ng/ml、约5ng/ml至12ng/ml、约6ng/ml至12ng/ml、约7ng/ml至11ng/ml、约8ng/ml至12ng/ml、约8ng/ml至10ng/ml或约10ng/ml的浓度接触。在一个实施方案中，将该一种或多种细胞因子中的每一种细胞因子以约10ng/ml的浓度与T细胞群接触。

在一些实施方案中，该一种或多种细胞因子不包括IL-2。

在一些实施方案中，T细胞群包含Pan T细胞、初始CD4⁺T细胞、初始CD8⁺T细胞、或初始CD4⁺和初始CD8⁺T细胞、或它们的任意组合。在一些实施方案中，该方法还包括在步骤(a)之前从外周血单核细胞(PBMC)中分离Pan T细胞、初始CD4⁺细胞、初始CD8⁺T细胞、或初始CD4⁺和初始CD8⁺细胞、或它们的任意组合。在一些实施方案中，T细胞群不包含抑制性调节T细胞。

在一些实施方案中，该一种或多种细胞因子在扩增步骤(b)期间存在。

在一些实施方案中，该方法还包括：遗传修饰T细胞以表达嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，通过向细胞中引入编码所述CAR或工程化TCR的多核苷酸来进行遗传修饰。在一些实施方案中，通过病毒转导、电穿孔、直接注射、磁转染、超声、弹道或流体动力学方法或它们的组合来引入编码所述CAR或工程化TCR的多核苷酸。

在一些实施方案中，CAR或工程化TCR特异性地结合肿瘤抗原、感染性抗原或自身免疫性抗原。在一些实施方案中，肿瘤抗原选自BCMA、GPRC5D、CD79、KLK2、CD19、CD30、CD33、CD123、hK2、FLT3、CD20、CD22、KRASG12D、p53、BRAC1和PSMA。

在一些实施方案中，在扩增步骤(b)之前进行遗传修饰。在一些实施方案中，该一种或多种细胞因子在遗传修饰步骤期间存在。

在各种实施方案中，将接触步骤(a)进行约5天-20天、约10天-20天、约5天-18天、约8天-15天、约10天-18天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天或约18天。在一个实施方案中，将接触步骤(a)进行约14天。

在各种实施方案中，将接触步骤(a)和扩增步骤(b)进行总共5天-20天、约10天-20天、约5天-18天、约8天-15天、约10天-18天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天或约18天。在一些实施方案中，将接触步骤(a)和扩增步骤(b)进行总共约14天。

在各种实施方案中，将接触步骤(a)在约37℃的温度下进行。

在各种实施方案中，该方法还包括：在接触步骤(a)开始时活化T细胞群。在一个实施方案中，该活化步骤用抗CD3剂和/或抗CD28剂进行约24小时。

在各种实施方案中，该方法还包括：在活化步骤(a)之前引发T细胞群。

在各种实施方案中，该方法还包括：确定扩增步骤(b)之后T细胞群中T_SCM细胞的百分比。在一些实施方案中，在扩增步骤(b)之后，T细胞群中T_SCM细胞的百分比为至少约40％、50％、60％或70％。在一个实施方案中，在扩增步骤(b)之后，T细胞群中T_SCM细胞的百分比为约60％-70％。

在一些实施方案中，在T细胞群中富集T_SCM细胞的方法在体外或离体进行。

在一些实施方案中，本文提供了产生遗传修饰的干细胞样记忆T(T_SCM)细胞的方法，该方法包括以下步骤：

a)获得分离的Pan T细胞、初始CD4⁺T细胞、初始CD8⁺T细胞、或初始CD4⁺和初始CD8⁺T细胞、或它们的任意组合的群体；

b)活化所述T细胞群；

c)遗传修饰在步骤(b)之后存在的细胞以表达嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)；

d)扩增所述遗传修饰的细胞；

其中步骤b)、c)和d)在包含括白介素-7(IL-7)的一种或多种细胞因子的存在下进行。

在一些实施方案中，该一种或多种细胞因子还包括IL-15。在一些实施方案中，该一种或多种细胞因子还包括IL-21。在一些实施方案中，该一种或多种细胞因子还包括IL-15和IL-21。

在一些实施方案中，将该一种或多种细胞因子中的每一种细胞因子与T细胞群以约1ng/ml至15ng/ml、约2ng/ml至14ng/ml、约3ng/ml至13ng/ml、约4ng/ml至12ng/ml、约5ng/ml至12ng/ml、约6ng/ml至12ng/ml、约7ng/ml至11ng/ml、约8ng/ml至12ng/ml、约8ng/ml至10ng/ml或约10ng/ml的浓度接触。在一个实施方案中，将该一种或多种细胞因子中的每一种细胞因子以约10ng/ml的浓度与T细胞群接触。

在各种实施方案中，该一种或多种细胞因子不包括IL-2。

在各种实施方案中，从外周血单核细胞(PBMC)中分离Pan T细胞、初始CD4⁺T细胞、初始CD8⁺T细胞、或初始CD4⁺和初始CD8⁺T细胞、或它们的任意组合。在一些实施方案中，T细胞不包含抑制性调节T细胞。

在各种实施方案中，通过向细胞中引入编码所述CAR或工程化TCR的多核苷酸来进行遗传修饰。在一些实施方案中，通过病毒转导、电穿孔、直接注射、磁转染、超声、弹道或流体动力学方法或它们的组合来引入编码所述CAR或工程化TCR的多核苷酸。在一些实施方案中，CAR或工程化TCR特异性地结合肿瘤抗原、感染性抗原或自身免疫性抗原。在一些实施方案中，肿瘤抗原选自BCMA、GPRC5D、CD79、KLK2、CD19、CD30、CD33、CD123、hK2、FLT3、CD20、CD22、KRASG12D、p53、BRAC1和PSMA。

在一些实施方案中，将扩增步骤(d)进行5天-20天、约10天-20天、约5天-18天、约8天-15天、约10天-18天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天或约18天。在一些实施方案中，将扩增步骤(d)进行约14天。

在一些实施方案中，将步骤(b)、(c)和(d)进行总共5天-20天、约10天-20天、约5天-18天、约8天-15天、约10天-18天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天或约18天。在一些实施方案中，将步骤(b)、(c)和(d)进行总共14天。

在各种实施方案中，将步骤(b)、(c)和(d)在约37℃的温度下进行。

在各种实施方案中，该活化步骤用抗CD3剂和/或抗CD28剂进行。在各种实施方案中，将该活化步骤进行约12小时-48小时(例如，24小时)。

在各种实施方案中，该方法还包括：在活化步骤(b)之前引发T细胞群。

在各种实施方案中，该方法还包括：确定扩增步骤(d)之后T细胞群中T_SCM细胞的百分比。在一些实施方案中，在扩增步骤(d)之后，T细胞群中T_SCM细胞的百分比为至少约40％、50％、60％或70％。在一个实施方案中，在扩增步骤(d)之后，T细胞群中T_SCM细胞的百分比为约60％-70％。

在一些实施方案中，用于产生遗传修饰的T_SCM细胞的方法在体外或离体进行。

在另一个方面，本文提供了包含富集的干细胞样记忆T(T_SCM)细胞的T细胞群，其通过包括以下步骤的方法制备：

a)使Pan T细胞、初始CD4⁺T细胞、初始CD8⁺T细胞、或初始CD4⁺和初始CD8⁺T细胞、或它们的任意组合与有效量的一种或多种细胞因子(包括白介素7(IL-7))接触足以富集T_SCM细胞的时间段；以及

b)任选地扩增所述T_SCM细胞。

在另一个方面，本文提供了包含富集的干细胞样记忆T(T_SCM)细胞的T细胞群，其可通过包括以下步骤的方法获得：

a)使Pan T细胞、初始CD4⁺T细胞、初始CD8⁺T细胞、或初始CD4⁺和初始CD8⁺T细胞、或它们的任意组合与有效量的一种或多种细胞因子(包括白介素7(IL-7))接触足以富集T_SCM细胞的时间段；以及

b)任选地扩增所述T_SCM细胞。

在本文所述的T细胞群的一些实施方案中，该一种或多种细胞因子还包括IL-15。在一些实施方案中，该一种或多种细胞因子还包括IL-21。在一些实施方案中，该一种或多种细胞因子还包括IL-15和IL-21。

在本文所述的T细胞群的一些实施方案中，该一种或多种细胞因子各自以约1ng/ml至15ng/ml、约2ng/ml至14ng/ml、约3ng/ml至13ng/ml、约4ng/ml至12ng/ml、约5ng/ml至12ng/ml、约6ng/ml至12ng/ml、约7ng/ml至11ng/ml、约8ng/ml至12ng/ml、约8ng/ml至10ng/ml或约10ng/ml的浓度添加。在一个实施方案中，该一种或多种细胞因子各自以约10ng/ml的浓度添加。

在本文所述的T细胞群的一些实施方案中，该一种或多种细胞因子不包括IL-2。

在本文所述的T细胞群的一些实施方案中，从外周血单核细胞(PBMC)中分离Pan T细胞、初始CD4⁺细胞、初始CD8+T细胞、或初始CD4⁺和初始CD8⁺细胞、或它们的任意组合。在一些实施方案中，Pan T细胞、初始CD4+细胞、初始CD8+T细胞、或初始CD4⁺和初始CD8⁺细胞、或它们的任意组合不包含抑制性调节T细胞。

在本文所述的T细胞群的一些实施方案中，该一种或多种细胞因子在扩增步骤(b)期间存在。

在本文所述的T细胞群的一些实施方案中，该制备方法还包括：遗传修饰T细胞以表达嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，通过向细胞中引入编码所述CAR或工程化TCR的多核苷酸来进行遗传修饰。在一些实施方案中，通过病毒转导、电穿孔、直接注射、磁转染、超声、弹道或流体动力学方法或它们的组合来引入编码所述CAR或工程化TCR的多核苷酸。

在本文所述的T细胞群的一些实施方案中，CAR或工程化TCR特异性地结合肿瘤抗原、感染性抗原或自身免疫性抗原。

在本文所述的T细胞群的一些实施方案中，肿瘤抗原选自BCMA、GPRC5D、CD79、KLK2、CD19、CD30、CD33、CD123、hK2、FLT3、CD20、CD22、KRASG12D、p53、BRAC1和PSMA。

在本文所述的T细胞群的一些实施方案中，遗传修饰在扩增步骤(b)之前进行。在一些实施方案中，该一种或多种细胞因子在遗传修饰步骤期间存在。在一些实施方案中，该一种或多种细胞因子在扩增步骤(b)期间存在。

在本文所述的T细胞群的一些实施方案中，将接触步骤(a)进行约5天-20天、约10天-20天、约5天-18天、约8天-15天、约10天-18天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天或约18天。在一个实施方案中，将接触步骤(a)进行约14天。

在本文所述的T细胞群的一些实施方案中，将接触步骤(a)和扩增步骤(b)进行总共约5天-20天、约10天-20天、约5天-18天、约8天-15天、约10天-18天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天或约18天。在一个实施方案中，将接触步骤(a)和扩增步骤(b)进行总共14天。

在本文所述的T细胞群的一些实施方案中，将接触步骤(a)在约37℃的温度下进行。

在本文所述的T细胞群的一些实施方案中，该制备方法还包括：在接触步骤(a)开始时活化T细胞群。在一个实施方案中，该活化步骤用抗CD3剂和/或抗CD28剂进行约24小时。

在本文所述的T细胞群的一些实施方案中，该方法还包括：在活化步骤(a)之前引发T细胞群。

在本文所述的T细胞群的一些实施方案中，该方法还包括：确定扩增步骤(b)之后T细胞群中T_SCM细胞的百分比。在一些实施方案中，在扩增步骤(b)之后，T细胞群中T_SCM细胞的百分比为至少约40％、50％、60％或70％。在一个实施方案中，在扩增步骤(b)之后，T细胞群中T_SCM细胞的百分比为约60％-70％。

在另一个方面，本文提供了包含富集的干细胞样记忆T(T_SCM)细胞的T细胞群，其可通过包括以下步骤的方法制备(或可获得)：

a)获得分离的Pan T细胞、初始CD4⁺T细胞、初始CD8⁺T细胞、或初始CD4⁺和初始CD8⁺T细胞、或它们的任意组合的群体；

b)活化所述T细胞群；

c)遗传修饰在步骤(b)之后存在的细胞以表达嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)；

d)扩增所述遗传修饰的细胞；

其中步骤b)、c)和d)在包含括白介素-7(IL-7)的一种或多种细胞因子的存在下进行。

在本文所述的T细胞群的一些实施方案中，获得分离的Pan T细胞、初始CD4⁺T细胞、初始CD8⁺T细胞、或初始CD4⁺和初始CD8⁺T细胞、或它们的任意组合的群体的步骤在从受试者获得的样品上进行。

在本文所述的T细胞群的一些实施方案中，该一种或多种细胞因子还包括IL-15。在一些实施方案中，该一种或多种细胞因子还包括IL-21。在一些实施方案中，该一种或多种细胞因子还包括IL-15和IL-21。

在本文所述的T细胞群的一些实施方案中，该一种或多种细胞因子各自以约1ng/ml至15ng/ml、约2ng/ml至14ng/ml、约3ng/ml至13ng/ml、约4ng/ml至12ng/ml、约5ng/ml至12ng/ml、约6ng/ml至12ng/ml、约7ng/ml至11ng/ml、约8ng/ml至12ng/ml、约8ng/ml至10ng/ml或约10ng/ml的浓度添加。在一个实施方案中，该一种或多种细胞因子各自以约10ng/ml的浓度添加。

在本文所述的T细胞群的各种实施方案中，该一种或多种细胞因子不包括IL-2。

在本文所述的T细胞群的各种实施方案中，从外周血单核细胞(PBMC)中分离Pan T细胞、初始CD4⁺T细胞、初始CD8⁺T细胞、或初始CD4⁺和初始CD8⁺T细胞、或它们的任意组合。在一些实施方案中，T细胞不包含抑制性调节T细胞。

在本文所述的T细胞群的各种实施方案中，通过向细胞中引入编码所述CAR或工程化TCR的多核苷酸来进行遗传修饰。在一些实施方案中，通过病毒转导、电穿孔、直接注射、磁转染、超声、弹道或流体动力学方法或它们的组合来引入编码所述CAR或工程化TCR的多核苷酸。在一些实施方案中，CAR或工程化TCR特异性地结合肿瘤抗原、感染性抗原或自身免疫性抗原。在一些实施方案中，肿瘤抗原选自BCMA、GPRC5D、CD79、KLK2、CD19、CD30、CD33、CD123、hK2、FLT3、CD20、CD22、KRASG12D、p53、BRAC1和PSMA。

在本文所述的T细胞群的各种实施方案中，将扩增步骤(d)进行约5天-20天、约10天-20天、约5天-18天、约8天-15天、约10天-18天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天或约18天。在一些实施方案中，将扩增步骤(d)进行约14天。

在本文所述的T细胞群的各种实施方案中，将步骤(b)、(c)和(d)进行总共约5天-20天、约10天-20天、约5天-18天、约8天-15天、约10天-18天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天或约18天。在一些实施方案中，将步骤(b)、(c)和(d)进行总共14天。

在本文所述的T细胞群的各种实施方案中，将步骤(b)、(c)和(d)在约37℃的温度下进行。

在本文所述的T细胞群的各种实施方案中，该活化步骤用抗CD3剂和/或抗CD28剂进行。在各种实施方案中，将该活化步骤进行约24小时。

在本文所述的T细胞群的各种实施方案中，该方法还包括：在活化步骤(b)之前引发T细胞群。

在本文所述的T细胞群的各种实施方案中，该方法还包括：确定扩增步骤(d)之后T细胞群中T_SCM细胞的百分比。在一些实施方案中，在扩增步骤(d)之后，T细胞群中T_SCM细胞的百分比为至少约40％、50％、60％或70％。在一些实施方案中，在扩增步骤(d)之后，T细胞群中T_SCM细胞的百分比为约60％-70％。

在另一个方面，本文提供了药物组合物，其包含本文所述的T细胞群和药学上可接受的载剂或赋形剂。

在另一个方面，本文提供了一种治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的包含富集的干细胞样记忆T(T_SCM)细胞的T细胞群、或者包含所述含有富集的T_SCM细胞的T细胞群和药学上可接受的载剂或赋形剂的药物组合物，其中所述含有富集的T_SCM细胞的T细胞群通过包括以下步骤的方法制备(或可获得)：

a)获得分离的Pan T细胞、初始CD4⁺T细胞、初始CD8⁺T细胞、或初始CD4⁺和初始CD8⁺T细胞、或它们的任意组合的群体；

b)活化所述T细胞群；

c)遗传修饰在步骤(b)之后存在的细胞以表达嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)；

d)扩增所述遗传修饰的细胞；

其中步骤b)、c)和d)在包含括白介素-7(IL-7)的一种或多种细胞因子的存在下进行。

在本文所述的治疗方法的一些实施方案中，获得分离的Pan T细胞、初始CD4⁺T细胞、初始CD8⁺T细胞、或初始CD4⁺和初始CD8⁺T细胞、或它们的任意组合的群体的步骤在从受试者获得的样品上进行。

在本文所述的治疗方法的一些实施方案中，该一种或多种细胞因子还包括IL-15。在一些实施方案中，该一种或多种细胞因子还包括IL-21。在一些实施方案中，该一种或多种细胞因子还包括IL-15和IL-21。

在本文所述的治疗方法的一些实施方案中，该一种或多种细胞因子各自以约1ng/ml至15ng/ml、约2ng/ml至14ng/ml、约3ng/ml至13ng/ml、约4ng/ml至12ng/ml、约5ng/ml至12ng/ml、约6ng/ml至12ng/ml、约7ng/ml至11ng/ml、约8ng/ml至12ng/ml、约8ng/ml至10ng/ml或约10ng/ml的浓度添加。在一个实施方案中，该一种或多种细胞因子各自以约10ng/ml的浓度添加。

在本文所述的治疗方法的一些实施方案中，该一种或多种细胞因子不包括IL-2。

在本文所述的治疗方法的一些实施方案中，从外周血单核细胞(PBMC)中分离PanT细胞、初始CD4⁺T细胞、初始CD8⁺T细胞、或初始CD4⁺和初始CD8⁺T细胞、或它们的任意组合。在一些实施方案中，T细胞不包含抑制性调节T细胞。

在本文所述的治疗方法的一些实施方案中，通过向细胞中引入编码所述CAR或工程化TCR的多核苷酸来进行遗传修饰。在一些实施方案中，通过病毒转导、电穿孔、直接注射、磁转染、超声、弹道或流体动力学方法或它们的组合来引入编码所述CAR或工程化TCR的多核苷酸。在一些实施方案中，CAR或工程化TCR特异性地结合肿瘤抗原、感染性抗原或自身免疫性抗原。在一些实施方案中，肿瘤抗原选自BCMA、GPRC5D、CD79、KLK2、CD19、CD30、CD33、CD123、hK2、FLT3、CD20、CD22、KRASG12D、p53、BRAC1和PSMA。

在本文所述的治疗方法的一些实施方案中，将扩增步骤(d)进行约5天-20天、约10天-20天、约5天-18天、约8天-15天、约10天-18天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天或约18天。在一些实施方案中，将扩增步骤(d)进行约14天。

在本文所述的治疗方法的一些实施方案中，将步骤(b)、(c)和(d)进行总共约5天-20天、约10天-20天、约5天-18天、约8天-15天、约10天-18天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天或约18天。在一些实施方案中，将步骤(b)、(c)和(d)进行总共14天。

在本文所述的治疗方法的一些实施方案中，将步骤(b)、(c)和(d)在约37℃的温度下进行。

在本文所述的治疗方法的一些实施方案中，该活化步骤用抗CD3剂和/或抗CD28剂进行约24小时。

在本文所述的治疗方法的一些实施方案中，该方法还包括：在活化步骤(b)之前引发T细胞群。

在本文所述的治疗方法的一些实施方案中，该方法还包括：确定扩增步骤(d)之后T细胞群中T_SCM细胞的百分比。在一些实施方案中，在扩增步骤(d)之后，T细胞群中T_SCM细胞的百分比为至少约40％、50％、60％或70％。在一些实施方案中，在扩增步骤(d)之后，T细胞群中T_SCM细胞的百分比为约60％-70％。

在本文所述的治疗方法的一些实施方案中，T细胞群对受试者而言是同种异体的。在一些实施方案中，T细胞群对受试者而言是自体的。

在本文所述的治疗方法的一些实施方案中，该疾病或病症是癌症、感染性疾病或自身免疫性疾病。在一些实施方案中，癌症是血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症是实体瘤。在一些实施方案中，该癌症是鳞状细胞癌、腺鳞状细胞癌、肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃部癌(gastric cancer)或胃癌(stomach cancer)、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、尿道癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾脏癌(kidney cancer)或肾癌(renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝肿瘤(hepaticcarcinoma)、肛门癌、阴茎癌、皮肤癌、多发性骨髓瘤和急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞白血病(AML)、慢性髓细胞白血病(CML)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)、淋巴瘤诸如霍奇金淋巴瘤(HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区B细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、毛细胞白血病(HCL)、前体B淋巴母细胞性淋巴瘤和原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、T细胞NHL诸如前体T淋巴母细胞性淋巴瘤/白血病、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、结节外自然杀伤T细胞淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、如上文所述的一种或多种白血病/淋巴瘤的混合物、脑癌以及头颈癌、胆管癌、支气管癌、脊索瘤、绒毛膜癌、上皮癌、内皮肉瘤、食管癌、尤因肉瘤、重链病、造血系统癌、免疫细胞淀粉样变性、意义未明的单克隆丙种球蛋白病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生性疾病、原因不明骨髓化生(AMM)或骨髓纤维化(MF)、慢性特发性骨髓纤维化、骨髓增生性肿瘤、真性红细胞增多症、直肠腺癌、原发性血小板增多症、慢性嗜中性粒细胞白血病、高嗜酸性粒细胞综合征或软组织肉瘤，或它们的组合或转移。

在一些实施方案中，该癌症是表达BCMA的癌症。在一些实施方案中，表达BCMA的癌症是急性髓样白血病(AML)或多发性骨髓瘤(MM)或冒烟型多发性骨髓瘤(SMM)。

在另一个方面，本文提供了一种用于在T细胞群中富集干细胞样记忆T(T_SCM)细胞的系统，该系统包括以下元件：

a)用于使所述T细胞群与有效量的包括白介素7(IL-7)的一种或多种细胞因子接触足以富集T_SCM细胞的时间段的工具；以及

b)任选地，用于扩增所述T_SCM细胞的工具。

在本文所述的系统的一些实施方案中，T细胞群包含Pan T细胞、初始CD4⁺T细胞、初始CD8+T细胞、或初始CD4⁺和初始CD8⁺T细胞、或它们的任意组合。

在本文所述的系统的一些实施方案中，该系统还包括用于从外周血单核细胞(PBMC)中分离Pan T细胞、初始CD4⁺细胞、初始CD8⁺T细胞、或初始CD4⁺和初始CD8⁺细胞、或它们的任意组合的工具。在一些实施方案中，该系统还包括用于遗传修饰T细胞以表达嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)的工具。在一些实施方案中，该系统还包括用于在开始使所述T细胞群与包括白介素7(IL-7)的一种或多种细胞因子接触时活化T细胞群的工具。在一些实施方案中，该系统还包括用于在活化之前引发T细胞群的工具。在一些实施方案中，该系统还包括用于确定扩增之后T细胞群中T_SCM细胞的百分比的工具。

在另一个方面，本文提供了一种用于产生遗传修饰的干细胞样记忆T(T_SCM)细胞的系统，该系统包括以下元件：

a)用于获得分离的Pan T细胞、初始CD4⁺T细胞、初始CD8+T细胞或初始CD4⁺和初始CD8⁺T细胞、或它们的任意组合的群体的工具；

b)用于活化所述T细胞群的工具；

c)用于在活化后遗传修饰细胞以表达嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)的工具；

d)用于扩增所述遗传修饰的细胞的工具；

其中获得分离的Pan T细胞、初始CD4⁺T细胞、初始CD8⁺T细胞、或初始CD4⁺和初始CD8⁺T细胞、或它们的任意组合的群体，活化所述T细胞群以及遗传修饰所述T细胞群在包括白介素-7(IL-7)的一种或多种细胞因子的存在下进行。

在本文所述的系统的各种实施方案中，该一种或多种细胞因子还包括IL-15和/或IL-21。

在另一个方面，本文提供了一种用于在T细胞群中富集干细胞样记忆T(T_SCM)细胞的组合物，该组合物包含：

a.T细胞群，

b.包括白介素7(IL-7)的一种或多种细胞因子，其是用于富集T_SCM细胞的工具，和

c.任选地，用于扩增所述T_SCM细胞的工具。

在另一个方面，本文提供了一种用于在T细胞群中富集干细胞样记忆T(T_SCM)细胞的组合物，该组合物包含：

a.T细胞群，和

b.有效量的包括白介素7(IL-7)的一种或多种细胞因子，和

用于进行以下操作的工具：

(i)使所述T细胞群与有效量的包括IL-7的一种或多种细胞因子接触，从而富集T_SCM细胞，

(ii)活化所述富集的T_SCM细胞，和

(iii)任选地，用于扩增所述T_SCM细胞的工具。

在另一个方面，本文提供了一种用于产生遗传修饰的干细胞样记忆T(T_SCM)细胞的组合物，该组合物包含：

a.T细胞群，和

b.有效量的包括白介素7(IL-7)的一种或多种细胞因子，和

用于进行以下操作的工具：

(i)使所述T细胞群与有效量的包括IL-7的一种或多种细胞因子接触，从而富集T_SCM细胞，

(ii)活化所述富集的T_SCM细胞，

(iii)遗传修饰所述富集的T_SCM细胞以表达嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)，和

(iv)任选地，用于扩增所述T_SCM细胞的工具。

在各种实施方案中，通过将T细胞群与有效量的包括IL-7的一种或多种细胞因子接触足以富集T_SCM细胞的时间段来富集T_SCM细胞。

附图说明

图1A-图1B显示了示例性第二代CAR-T细胞设计。图1A是第二代CAR-T的图，该第二代CAR-T包含与源自人CD8A的铰链和跨膜序列以及4-1BB(CD137)和CD3ζ细胞内结构域融合的靶向感兴趣的TAA(例如，B细胞成熟抗原(BCMA))的scFv。图1B显示了本文所述的示例性抗BCMACAR构建体的氨基酸序列。

图2A-图2C显示了细胞因子调理增强CD4⁺T细胞亚群中的T_SCM细胞表型。Pan-T细胞在存在或不存在所示细胞因子的情况下被活化。对于荧光激活细胞分选(FACS)分析，将细胞对CD4⁺CAR⁺T细胞进行门控。确定CD4⁺BCMA-HL CAR转导的细胞内CD62L(图2A)、CCR7(图2B)和CD27(图2C)表达水平的频率。此处显示的是在CAR-T细胞转导后第14天的表型表征。

图3A-图3B显示了细胞因子调理增强CD8⁺T细胞亚群中的T_SCM细胞表型。Pan-T细胞在存在或不存在所示细胞因子的情况下被活化。对于FACS分析，将细胞对CD8⁺CAR⁺T细胞进行门控。确定CD8⁺BCMA-HL CAR转导的细胞内CD62L(图3A)、CCR7(图3B)和CD27(图3C)表达水平的频率。此处显示的是在CAR-T细胞转导后第14天的表型表征。

图4A-图4B显示了细胞因子调理增强在CD4⁺和CD8⁺T细胞亚群中的CD45RO^-/CD45RA⁺T_SCM细胞表型。Pan-T细胞在存在或不存在所示细胞因子的情况下被活化。对于FACS分析，将细胞对CAR⁺T细胞进行门控。在CD4⁺CAR⁺T细胞亚群中CD45RO^-/CD45RA⁺的表达水平的频率(图4A)。在CD8⁺CAR⁺T细胞亚群中CD45RO^-/CD45RA⁺的表达水平的频率(图4B)。此处显示的是在CAR-T细胞转导后第14天的表型表征。

具体实施方式

定义

术语“T细胞”和“T淋巴细胞”是可互换的，并且在本文中同义使用。如本文所用，T细胞包括胸腺细胞、初始T淋巴细胞、未成熟T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静息T淋巴细胞或活化T淋巴细胞。T细胞可以是T辅助性(Th)细胞，例如T辅助性1(Th1)、T辅助性2(Th2)、T辅助性17(Th17)或调节性T(Treg)细胞。T细胞可以是T辅助细胞(Th；CD4⁺T细胞)、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、细胞毒性T细胞(CTL；CD8+T细胞)、肿瘤浸润性细胞毒性T细胞(TIL；CD8⁺T细胞)、CD4⁺CD8⁺T细胞、干细胞样记忆T(T_SCM)细胞、中央记忆T细胞(T_CM)、效应记忆T细胞(T_EM)、末端效应T细胞(T_eff)或T细胞的任何其他亚群。适用于具体实施方案的说明性T细胞群包括干中央记忆T细胞(T_SCM)。

初始T细胞可具有以下细胞表面标记表达模式：CCR7⁺、CD62L⁺、CD45RA⁺、CD45RO^-、CD95^-。干细胞样记忆T细胞(T_SCM)可具有以下细胞表面标记表达模式：CCR7⁺、CD62L⁺、CD45RA⁺、CD45RO^-、CD95⁺。中央记忆T细胞(T_CM)可具有以下细胞表面标记表达模式：CCR7⁺、CD62L⁺、CD45RA^-、CD45RO⁺、CD95⁺。效应记忆T细胞(T_EM)可具有以下细胞表面标记表达模式：CCR7^-、CD62L^-、CD45RA^-,CD45RO⁺、CD95⁺。终末效应T细胞(T_eff)可具有以下细胞表面标记表达模式：CCR7^-、CD62L^-、CD45RO^-、CD95⁺。参见例如Gattinoni等人Nat.Med.17(2011):1290-7；以及Flynn等人Clin.Translat.Immunol.3(2014):e20，这些文献出于所有目的全文以引用的方式并入本文。

术语“表达(express和expression)”意指允许或引起基因或DNA序列中的信息产生，例如通过活化相应基因或DNA序列的转录和/或翻译中所涉及的细胞功能来产生RNA或蛋白质。DNA序列在细胞中或通过细胞表达以形成“表达产物”，诸如RNA或蛋白质。据称表达产物本身例如所得蛋白质也可以被细胞“表达”。表达产物可以表征为细胞内、细胞外或跨膜。

术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”意指通过其可将DNA或RNA序列(例如，外源基因)引入宿主细胞，以便遗传修饰细胞并促进所引入的序列的表达(例如，转录和翻译)的媒介物。载体包括质粒、合成的RNA和DNA分子、噬菌体、病毒等。在某些实施方案中，载体是病毒载体，诸如但不限于，病毒载体是腺病毒、腺相关病毒、甲病毒、疱疹病毒、慢病毒、逆转录病毒或痘苗病毒载体。

如本文所用，术语“特异性结合”、“特异性识别”或“对……具有特异性”是指可测量和可重现的相互作用，诸如靶标与抗原结合蛋白(诸如CAR或工程化TCR)之间的结合，其决定了在包含生物分子的异质分子群体的存在下靶标的存在。

术语“多肽”、“肽”或“蛋白质”可互换使用，并且是指氨基酸残基的聚合物。这些术语涵盖所有种类的天然存在的和合成的蛋白质，包括所有长度的蛋白质片段、融合蛋白和修饰的蛋白质，包括但不限于糖蛋白类以及所有其他类型的修饰蛋白质(例如，由磷酸化、乙酰化、肉豆蔻酰化、棕榈酰化、糖基化、氧化、甲酰化、酰胺化、聚谷氨酰化、ADP核糖基化、聚乙二醇化、生物素酰化等产生的蛋白质)。

除非另有说明，否则术语“核酸”、“核苷酸”和“多核苷酸”涵盖DNA和RNA两者。“核酸序列”或“核苷酸序列”意指编码氨基酸的核酸序列，这些术语还可以指包括编码作为克隆制品而添加的任何氨基酸(包括由接头编码的任何氨基酸)的部分的核酸序列。

术语状态、病症或病状的“治疗(treat或treatment)”包括：(1)预防、延迟或降低在受试者中发展的状态、病症或病状的至少一种临床或亚临床症状的发生率和/或出现的可能性，该受试者可能患有或易患上该状态、病症或病状，但还没有经历或显示该状态、病症或病状的临床或亚临床症状；(2)抑制该状态、病症或病状，即阻止、减少或延缓该疾病的发展或其复发或其至少一种临床或亚临床症状；或(3)缓解疾病，即引起该状态、病症或病状或其至少一种临床或亚临床症状的消退。对待治疗的受试者的益处是统计学上显著的或至少对患者或医师是可感知的。

应用于剂量或量的术语“有效”是指足以在向有需要的受试者施用时产生期望活性的化合物或药物组合物的量。注意，当施用活性成分的组合时，所述组合的有效量可以包括或可以不包括如果单独施用将有效的每种成分的量。所需的确切量将随受试者而变化，取决于受试者的物种、年龄和一般病状、所治疗的病状的严重程度、所采用的一种或多种特定药物、施用模式等。

与本文所述的组合物结合使用的短语“药学上可接受的”是指此类组合物的分子实体和其他成分，它们是生理学上耐受的并且当施用于哺乳动物(例如人)时通常不会产生不良反应。优选地，术语“药学上可接受的”意味着由联邦或州政府的监管机构批准的或者在美国药典或其他公认的药典中列出的用于在哺乳动物并且更具体地人类中使用的物质。

术语“患者”、“个体”、“受试者”和“动物”在本文中可互换使用，并且是指哺乳动物，包括但不限于人、非人灵长类动物和兽医动物(例如，猫、狗、牛、马、绵羊、猪等)和实验动物模型。哺乳动物的示例包括啮齿目哺乳动物，诸如小鼠和仓鼠；兔形目哺乳动物，诸如兔；食肉目哺乳动物，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)；偶蹄目哺乳动物，包括牛科动物(牛)和猪科动物(猪)；奇蹄目哺乳动物，包括马科动物(马)；或灵长目哺乳动物、猿目(Ceboids)或猴目(Simoids)(猴)哺乳动物；或类人猿亚目哺乳动物(人和猿)。在一个优选的实施方案中，受试者是人。

术语“载剂”是指与化合物一起施用的稀释剂、辅助剂、赋形剂或介质。此类药物载剂可以是无菌液体，诸如水和油，包括来源于石油、动物、植物的油或合成的那些油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。水或水溶液盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液优选用作载剂，特别是用于可注射溶液。另选地，载剂可以是固体剂型载剂，包括但不限于粘结剂(用于压缩丸剂)、助流剂、包封剂、调味剂和着色剂中的一种或多种。合适的药物载剂描述于E.W.Martin的“Pharmaceutical Sciences”中。

除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指代。因此，例如，对“一种方法”的提及包括一种或多种方法、和/或本文所述类型的步骤、和/或本领域技术人员在阅读本公开后将变得显而易见的步骤。

术语“约”或“大约”包括在统计学上有意义的值范围内。此类范围可以在给定值或范围的数量级内，优选地在50％以内，更优选地在20％以内，仍更优选地在10％以内，并且甚至更优选地在5％以内。术语“约”或“大约”涵盖的可允许的变化取决于所研究的具体系统，并且可以由本领域普通技术人员容易地理解。

在整个本公开中，本公开的各种方面可以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被理解为是对本公开范围的固定限制。因此，范围的描述应被视为具有明确公开的所有可能子范围以及该范围内的各个数值。例如，范围诸如1至6的描述应被视为具有明确公开的子范围诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的各个数值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。作为另一示例，诸如95％-99％同一性的范围包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的某物，并且包括诸如96-99％、96-98％、96-97％、97-99％、97-98％和98％-99％同一性的子范围。无论范围的宽度如何，这均适用。

除非上下文另有明确说明，否则本发明任何方面的所有实施方案可组合使用。

本发明的方法

适合用于本公开的方法的细胞可来自所有细胞和组织，特别是哺乳动物细胞和组织。合适的细胞可以是人、猿、猴、猪或啮齿动物来源的，并且可以是原代细胞或培养的细胞。在一些实施方案中，使用本公开的方法修饰的细胞是人细胞。

供体细胞的分离/富集

在一些实施方案中，在本公开的方法中使用的细胞源自供体。在一些实施方案中，相对于施用细胞的接受者，细胞可以是同种异体的或非自体的(“非自身的”)。在替代性实施方案中，细胞相对于施用细胞的接受者而言可以是自体的。在一些实施方案中，细胞从哺乳动物受试者获得。在其他实施方案中，细胞从灵长类动物受试者获得。在一些实施方案中，细胞从人类受试者获得。

在一些实施方案中，在本公开的方法中使用的细胞是淋巴细胞(例如，T细胞)。淋巴细胞可从以下来源获得：诸如但不限于外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。淋巴细胞也可通过干细胞的分化产生。在一些实施方案中，淋巴细胞可使用本领域技术人员通常已知的技术(诸如沉降，例如FICOLL^TM分离)从收集自受试者的血液中获得。

来自受试者的循环血液的细胞可通过单采术获得。单采术设备通常含有淋巴细胞(包括T细胞)、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。可对通过单采术收集的细胞进行洗涤，以除去血浆部分并且将这些细胞置于适当的缓冲液或培养基中用于后续处理。可用PBS或用另一种缺乏钙、镁和大多数(如果不是全部的话)二价阳离子的合适溶液洗涤细胞。洗涤步骤可通过本领域技术人员已知的方法完成，这些方法诸如但不限于使用半自动化流通离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器或Baxter CytoMate)。洗涤后，可将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液、细胞培养基或其他含或不含缓冲液的盐水溶液中。

T细胞可通过裂解红细胞并清除单核细胞而从外周血单核细胞(PBMC)中分离。作为示例，T细胞可通过离心通过PERCOLL^TM梯度进行分选。在一些实施方案中，在分离PBMC之后，可在活化、扩增和/或遗传修饰之前或之后将细胞毒性T淋巴细胞和辅助T淋巴细胞两者分选到初始T细胞亚群、记忆T细胞亚群和效应T细胞亚群中。

在一些实施方案中，在本文所述的方法中使用的T细胞群包含Pan T细胞、初始CD4⁺T细胞、初始CD8⁺T细胞、或初始CD4⁺和CD8⁺T细胞、或它们的任意组合。在一些实施方案中，从获自受试者的样品中分离T细胞群。

在一些实施方案中，在本文所述的方法中使用的T细胞群不包含抑制性调节T细胞。

在一些实施方案中，可富集T淋巴细胞。例如，可使用阳性或阴性选择技术富集T淋巴细胞的特定亚群，诸如干中央记忆T细胞(T_SCM)，其表达一种或多种标记，诸如但不限于CD3、CD4、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、CD27、CD28、CD34、CD36、CD45RA、CD45RO、CD56、CD62、CD62L、CD122、CD123、CD127、CD235a、CCR7、HLA-DR或它们的组合。在一些实施方案中，使用本文详述的方法富集干细胞样记忆性T细胞(T_SCM)。

在一些实施方案中，T淋巴细胞还可从干细胞分化，该干细胞诸如脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、造血干细胞(HSC)和诱导的多能干细胞(iPSC)。

遗传修饰

可将T细胞遗传修饰以表达高亲和力T细胞受体(工程化TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，本文所述的方法包括将包含编码CAR或工程化TCR的核苷酸序列的外源核酸分子引入细胞中的步骤。在一些实施方案中，将T细胞遗传修饰以表达一种或多种工程化TCR或CAR。

在一些实施方案中，遗传修饰可在包括IL-7、IL-15和/或IL-21的一种或多种细胞因子的存在下进行。在一些实施方案中，遗传修饰可在IL-7的存在下进行。在一些实施方案中，遗传修饰可在IL-7和IL-15的存在下进行。在一些实施方案中，遗传修饰可在IL-7和IL-21的存在下进行。在一些实施方案中，遗传修饰可在IL-7、IL-15和IL-21的存在下进行。

在一些实施方案中，遗传修饰可在不存在IL-2的情况下进行。

在一些实施方案中，遗传修饰可在扩增T细胞之前进行。例如，可遗传修饰从PBMC分离的Pan T细胞、初始CD4⁺T细胞、初始CD8⁺T细胞、或初始CD4⁺和CD8⁺T细胞、或它们的任意组合。

在一些实施方案中，遗传修饰可在扩增T细胞之后进行。在一些实施方案中，遗传修饰包含富集的干细胞样记忆T细胞(T_SCM)的T细胞。

如本文所用，“嵌合抗原受体”或“CAR”是指细胞表面受体，其包含细胞外靶标结合结构域、跨膜结构域和细胞质结构域，该细胞质结构域包含淋巴细胞活化结构域和任选地至少一个共刺激信号传导结构域，所有这些结构域不会组合起来一同存在于单一蛋白质上。特别地，这包括其中细胞外结构域和细胞质结构域在单个受体蛋白质上非天然地一起存在的受体。

天然存在的T细胞受体包含两个亚基，即α-亚基和β-亚基，它们中的每一个是由每个T细胞基因组中的重组事件产生的独特蛋白质。可针对对特定靶抗原的选择性筛选TCR文库。以这种方式，可以选择、克隆对靶抗原具有高亲合力和反应性的天然TCR，随后将其引入用于过继免疫疗法的T细胞群中。

在一个实施方案中，通过引入编码TCR亚基的多核苷酸来修饰T细胞，该TCR亚基具有形成向T细胞赋予对表达靶抗原的肿瘤细胞的特异性的TCR的能力。在特定的实施方案中，与天然存在的亚基相比，该亚基具有一个或多个氨基酸取代、缺失、插入或修饰，只要该亚基保留形成TCR的能力并且参与免疫学相关的细胞因子信号传导即可，该TCR赋予转染的T细胞归巢至靶细胞的能力。工程化TCR优选地还以高亲合力结合展示与相关肿瘤相关的肽的靶细胞，并且任选地在体内介导对呈递相关肽的靶细胞的有效杀伤。

包含编码CAR或工程化TCR的核苷酸序列的外源核酸分子可以游离地表达。另选地，包含编码CAR或工程化TCR的核苷酸序列的外源核酸分子可通过同源性定向修复(HDR)(例如，通过使用基因组编辑核酸酶诸如CRISPR/Cas)敲入基因座中。例如但非限制性地，可将包含编码CAR或工程化TCR的核苷酸序列的外源核酸分子敲入TCRα、TCRβ或B2M基因座中以替代内源基因。在敲入的情况下，包含编码CAR或工程化TCR的核苷酸序列的核酸分子可作为双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)或在病毒载体(例如，AAV)中提供。在任一个实施方案中，基因与在细胞中有活性的启动子可操作地连接(即，在转录控制下)。

CAR或工程化TCR可针对在恶性细胞或受感染细胞的表面上表达的抗原，诸如肿瘤抗原或感染性抗原。

可被本文所述的修饰的细胞靶向的肿瘤抗原的非限制性示例包括B细胞成熟抗原(BCMA)、人表皮生长因子受体2(HER2)、激肽释放酶相关肽酶2(KLK2)、己糖激酶2(hK2)、白介素13受体亚基α2(IL-13Ra2)、肝配蛋白A型受体2(EphA2)、A激酶锚蛋白4(AKAP-4)、肾上腺素受体β3(ADRB3)、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)、雄激素受体、血管生成素结合的细胞表面受体2(Tie2)、B7H3(CD276)、骨髓基质细胞抗原2(BST2)、碳酸酐酶IX(CAIX)、CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS)、CD171、CD179a、CD24、CD300分子样家族成员f(CD300LF)、CD38、CD44v6、CD72、CD79a、CD79b、CD97、染色体X开放阅读框61(CXORF61)、封闭蛋白6(CLDN6)、CS-1(CD2子集1、CRACC、SLAMF7、CD319或19A24)、C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)、C型凝集素样分子1(CLL-1)、细胞周期蛋白B1、细胞色素P450 1B 1(CYP1B 1)、含EGF样模块粘蛋白样激素受体样2(EMR2)、表皮生长因子受体(EGFR)、ERG(跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)-ETS融合基因)、位于染色体12p上的ETS易位变体基因6(ETV6-AML)、IgA受体的Fc片段(FCAR)、Fc受体样5(FCRL5)、Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)、叶酸受体β、Fos相关抗原1、岩藻糖基GM1、G蛋白偶联受体20(GPR20)、G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)、神经节苷脂GD3、神经节苷脂GM3、糖神经酰胺(glycoceramide)(GloboH)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)、globoH的多聚己糖部分、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、白介素11受体α(IL-11Ra)、KIT(CD117)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)、Lewis(Y)抗原、淋巴细胞抗原6复合物基因座K 9(LY6K)、淋巴细胞抗原75(LY75)、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)、乳腺分化抗原(NY-BR-1)、黑色素瘤癌症-睾丸抗原1(MAD-CT-1)、黑色素瘤癌症-睾丸抗原2(MAD-CT-2)、黑色素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)、细胞表面相关黏蛋白1(MUC1)、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V(NA17)、神经细胞粘附分子(NCAM)、o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)、嗅觉受体51E2(OR51E2)、p53突变体、配对盒蛋白Pax-3(PAX3)、配对盒蛋白Pax-5(PAX5)、泛连接蛋白3(PANX3)、胎盘特异性蛋白1(PLAC1)、血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)、聚唾液酸、顶体素原(proacrosin)结合蛋白sp32(OY-TES1)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、丝氨酸蛋白酶21(PRSS21)、蛋白酶体(Prosome、Macropain)亚基β型9(LMP2)、Ras同源基因家族成员C(RhoC)、肉瘤易位断裂点、唾液酸Lewis粘附分子(sLe)、精子蛋白17(SPA17)、由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)、阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)、滑膜肉瘤、X断裂点2(SSX2)、TCRγ可变阅读框架蛋白(TARP)、TGS5、促甲状腺激素受体(TSHR)、Tn抗原(Tn Ag)、肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)、肿瘤内皮标志物7相关蛋白(TEM7R)、尿空斑蛋白2(UPK2)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、v-myc禽髓细胞瘤病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同源物(MYCN)、维尔姆斯瘤(Wilms tumor)蛋白(WT1)和X抗原家族成员1A(XAGE1)、或它们的片段或变体。

可被本文所述的修饰的细胞靶向的附加抗原包括但不限于碳酸酐酶EX、甲胎蛋白、A3、对A33抗体特异的抗原、Ba 733、BrE3抗原、CA125、CD1、CD1a、CD3、CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD38、CD45、CD74、CD80、CD123、CD138、Fms相关受体酪氨酸激酶3(FLT3)或CD135、结肠特异性抗原p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、CSAp、EGFR、EGP-I、EGP-2、Ep-CAM、EphA1、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、EphB6、FIt-I、Flt-3、叶酸受体、HLA-DR、人绒毛膜促性腺激素(HCG)及其亚基、低氧诱导因子(HIF-I)、Ia、IL-2、IL-6、IL-8、胰岛素生长因子1(IGF-I)、KC4抗原、KS-1抗原、KS1-4、Le-Y、巨噬细胞抑制因子(MIF)、MAGE、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、NCA66、NCA95、NCA90、对PAM-4抗体特异的抗原、胎盘生长因子、p53、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PSMA、RS5、S100、TAC、TAG-72、腱生蛋白、TRAIL受体、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、VEGF、ED-B纤连蛋白、17-lA抗原、血管生成标记、癌基因标记或癌基因产物。

在特定的实施方案中，被本文所述的修饰的细胞靶向的肿瘤抗原是BCMA、GPRC5D、CD79、KLK2、CD19、CD30、CD33、CD123、hK2、FLT3、CD20、CD22、KRASG12D、p53、BRAC1或PSMA。

在一个实施方案中，特异性地结合BCMA的CAR包含细胞外靶标结合结构域，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:2具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

在一个实施方案中，特异性地结合BCMA的CAR包含细胞外靶标结合结构域，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

在一个实施方案中，特异性地结合BCMA的CAR包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:11具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

在一个实施方案中，特异性地结合BCMA的CAR包含细胞外靶标结合结构域，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:12具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

感染性抗原可以是病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原或朊病毒抗原等。感染性抗原包括完整的微生物(例如，病毒、细菌、真菌)以及天然分离物以及它们的片段或衍生物，以及与天然微生物抗原相同或相似并诱导对该微生物(例如，病毒、细菌、真菌)具有特异性的免疫应答的合成或重组化合物。如果化合物诱导对天然微生物抗原的免疫应答(体液的和/或细胞的)，则其类似于天然微生物抗原。此类抗原在本领域中是常规使用的并且对本领域技术人员而言是熟知的。

感染性抗原可以是感染性病毒或源自感染性病毒。已经在人类中发现的感染性病毒的非限制性示例包括但不限于：腺病毒科(Adenoviridae)(大多数腺病毒)；沙粒病毒科(Arena viridae)(出血热病毒)；双RNA病毒科(Birnaviridae)；布尼亚病毒科(Bungaviridae)(例如，汉坦病毒、布尼亚病毒(bunga virus)、白蛉病毒(phlebovirus)和Nairo病毒)；钙化病毒科(Calciviridae)(例如，引起胃肠炎的毒株)；冠状病毒科(Coronoviridae)(例如，冠状病毒)；丝状病毒科(Filoviridae)(例如，埃博拉病毒)；黄病毒科(Flaviridae)(例如，登革热病毒、脑炎病毒、黄热病病毒)；嗜肝病毒科(Hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒)；疱疹病毒科(Herpesviridae)(单纯疱疹病毒(HSV)1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒)；虹彩病毒科(Iridoviridae)(例如，非洲猪瘟病毒)；诺沃克(Norwalk)病毒和相关病毒，以及星状病毒；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，流感病毒)；乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳头瘤病毒、多瘤病毒)；副粘病毒科(Paramyxoviridae)(例如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；细小病毒科(Parvovirida)(细小病毒)；小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(例如，脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒；肠道病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、艾柯病毒(echovirus))；痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)；呼肠孤病毒科(Reoviridae)(例如，呼肠孤病毒、环状病毒和轮状病毒)；逆转录病毒科(Retroviridae)(例如，人免疫缺陷病毒，诸如HIV-1(也称为HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV或HIV-III)；和其他分离物，诸如HIV-LP)；弹状病毒科(Rhabdoviradae)(例如，水泡性口炎病毒、狂犬病病毒)；披膜病毒科(Togaviridae)(例如，马脑炎病毒、风疹病毒)；以及未分类的病毒(例如，海绵状脑病的病原体，丁型肝炎的病原体，非甲型、非乙型肝炎(即丙型肝炎)的病原体)。

感染性抗原可以是感染性细菌或源自感染性细菌。革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌两者均可在脊椎动物中充当抗原。此类革兰氏阳性细菌包括但不限于巴斯德菌属(Pasteurella)物种、葡萄球菌属(Staphylococci)物种和链球菌属(Streptococcus)物种。革兰氏阴性细菌包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)物种和沙门氏菌属(Salmonella)物种。感染性细菌的非限制性示例包括但不限于：伊色列氏放线菌(Actinomyces israelli)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus antracis)、拟杆菌属(Bacteroides)物种、伯氏疏螺旋体(Borelia burgdorferi)、衣原体属(Chlamydia.)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringers)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、棒状杆菌属(Corynebacterium)物种、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、肠球菌属(Enterococcus)物种、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、幽门螺杆菌(Helicobacter pyloris)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、钩端螺旋体属(Leptospira)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、分枝杆菌属(Mycobacteria)物种(例如，结核分枝杆菌(M tuberculosis)、鸟分支杆菌(M avium)、戈登分枝杆菌(M gordonae)、胞内分枝杆菌(M intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(Mkansaii))、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)、多杀巴斯德氏菌(Pasturella multocida)、致病性弯曲杆菌属(Campylobacter)物种、立克次体属(Rickettsia)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、念珠状链杆菌(Streptobacillus monihformis)、链球菌属(Streptococcus)(厌氧物种)、链球菌属(Streptococcus)(草绿色组group)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)(B组链球菌)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、粪链球菌(Streptococcusfaecalis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)(A组链球菌)、梅毒螺旋体(Treponema pallidium)和雅司螺旋体(Treponemapertenue)。

感染性抗原可以是或来源于其他感染性微生物。感染性真菌的非限制性示例包括：新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatuin)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomycesdernatitidis)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)和白色念珠菌(Candidaalbicans)。其他感染性生物体(即原生生物)包括：疟原虫属(Plasmodium)(诸如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)、间日疟原虫(Plasmodium vivax))、刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)和血吸虫属(Shistosoma)。其他医学上相关的微生物已在文献中广泛描述，例如参见C.G.A.Thomas,“Medical Microbiology”,Bailliere Tindall,Great Britain 1983，其据此全文以引用方式并入。

感染性抗原的其他非限制性示例包括病毒抗原，诸如HIV抗原(例如，gp120、gp160、p18、Tat、Gag、Pol、Env、Nef)、来自疱疹病毒的糖蛋白和来自乙型肝炎病毒的表面抗原和核心抗原；细菌抗原，诸如来自疏螺旋体属物种的OspA、OspB和OspC抗原；真菌和寄生虫抗原，诸如来自白色念珠菌的MP65和来自疟原虫属物种的CS蛋白。

在一些实施方案中，CAR或工程化TCR可针对自身抗原。此类抗原的示例包括与自身免疫性疾病(诸如类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化症(MS)、干燥综合征(syndrome)、结节病、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、自身免疫性甲状腺炎、反应性关节炎、强直性脊柱炎、硬皮病、多肌炎、皮肌炎、银屑病、脉管炎、韦格纳肉芽肿(Wegener'sgranulomatosis)、克罗恩病和溃疡性结肠炎)相关的那些。

在附加实施方案中，本公开的方法还可涉及降低或抑制一种或多种内源性T细胞受体(TCR)的表达。

上文所述的方法的各种实施方案涉及向细胞中引入一种或多种多核苷酸/多肽剂(例如，CAR或工程化TCR)。可通过病毒、非病毒基因递送方法或物理方法将本发明中所述的多核苷酸和/或多肽引入细胞中。递送多核苷酸和/或多肽用于本发明方法使用的合适方法包括本领域技术人员已知的任何方法，通过该方法可将多核苷酸和/或多肽引入细胞器、细胞、组织或生物体中。多核苷酸和/或多肽转移可在体外、离体或在体内进行。

在各种实施方案中，使用物理方法将多肽或多核苷酸引入细胞中。合适的物理方法包括但不限于电穿孔、直接注射(例如，显微注射)、磁转染、超声、弹道或流体动力学方法、或它们的组合。

电穿孔是用于递送多核苷酸和/或多肽的方法。参见例如Potter等人，(1984)Proc.Nat'l Acad.Sci.USA,81,7161-7165；以及Tur-Kaspa等人，(1986)Mol.Cell Biol.,6,716-718，这两篇文献出于所有目的全文以引用方式并入本文。电穿孔涉及将细胞和DNA的悬浮液暴露于高压放电。在一些实施方案中，可以使用细胞壁降解酶(诸如果胶降解酶)使细胞比未处理的细胞对通过电穿孔进行的遗传修饰更敏感。参见例如美国专利号5,384,253，其出于所有目的全文以引用方式并入本文。

当使用CRISPR/Cas核酸酶时，可组装一种或多种CRISPR/Cas核酸酶和一种或多种gRNA以形成一种或多种核糖核蛋白(RNP)复合物，然后将其通过电穿孔引入细胞中。

用于本发明使用的电穿孔方法包括例如，Sardesai,N.Y.和Weiner,D.B.,CurrentOpinion in Immunotherapy 23:421-9(2011)以及Ferraro,B.等人，Human Vaccines 7:120-127(2011)，这两篇文献出于所有目的据此全文以引用方式并入。

用于转移多核苷酸和/或多肽的另一种物理方法包括注射。在一些实施方案中，可通过一种或多种注射(例如，针注射)将多肽、多核苷酸或载体递送至细胞、组织或生物体。注射的非限制性方法包括注射组合物(例如，基于盐水的组合物)。也可通过直接显微注射引入多核苷酸和/或多核苷酸。注射的非限制性位点包括皮下、皮内、肌内、结节内(允许直接递送抗原至淋巴组织)、静脉内、前列腺内、肿瘤内、淋巴内(允许直接施用树突状细胞)和腹膜内。应当理解，适当的注射部位准备是必要的(例如，刮削注射部位以观察适当的针放置)。

在一些实施方案中，通过由高渗性或低渗性诱导的胞饮作用将本发明所述的多核苷酸和/或多肽引入细胞中。例如，可将细胞置于具有比生理盐水更高或更低盐浓度的缓冲液中。这可活化细胞中的主动摄取机制，其中细胞吞噬细胞外环境。可使用各种化学品来增强和改进该过程。其可能不需要任何特殊的机器。胞饮作用可用于转导的示例性途径在本领域中有描述。参见例如WO2017093326A1，其出于所有目的全文以引用方式并入本文。

在各种实施方案中，将本发明中所述的多核苷酸和/或多肽通过载体引入细胞中。载体可以是病毒载体或非病毒载体。

在一些实施方案中，载体是病毒载体。可用于本发明中的合适的病毒载体包括但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、甲病毒载体、痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体或杆状病毒载体。在一个具体的实施方案中，病毒载体是慢病毒载体。在一个具体的实施方案中，病毒载体是逆转录病毒载体。在一些实施方案中，通过逆转录病毒转导来转导细胞。描述基因的逆转录病毒转导的参考文献是Anderson等人，美国专利号5,399,346；Mann等人，Cell 33:153(1983)；Temin等人，美国专利号4,650,764；Temin等人，美国专利号4,980,289；Markowitz等人，J.Virol.62:1120(1988)；Temin等人，美国专利号5,124,263；国际专利公开号WO 95/07358，于1995年3月16日公开，授予Dougherty等人；以及Kuo等人，Blood 82:845(1993)；这些文献中的每一篇文献全文以引用方式并入本文。

在一些实施方案中，载体是非病毒载体。可用于本发明方法的非病毒载体的非限制性示例包括质粒或转座子。

核酸疫苗也可用于将多核苷酸转移到细胞中。此类疫苗包括但不限于非病毒多核苷酸载体、“裸”DNA和RNA以及病毒载体。用这些疫苗遗传修饰细胞的方法以及优化这些疫苗中所包含的基因的表达的方法是本领域技术人员已知的。

在一些实施方案中，可使用纳米颗粒、聚合物、树状聚合物、脂质体和聚乙烯亚胺(PEI)颗粒将多核苷酸和/或多肽引入细胞中。在一些实施方案中，将多肽(例如，CRISPR/Cas核酸酶)作为可溶性蛋白质或核糖核蛋白引入细胞中。

转移多核苷酸和/或多肽的附加方法包括脂质体介导的转染(例如，多核苷酸包埋在悬浮于过量水溶液中的脂质复合物中。参见例如Ghosh和Bachhawat,(1991)于：LiverDiseases,Targeted Diagnosis and Therapy Using Specific Receptors and Ligands.第87-104页)。还考虑了与Lipofectamine或Superfect复合的多核苷酸和/或多肽；DEAE-葡聚糖(例如，使用DEAE-葡聚糖随后使用聚乙二醇将多核苷酸递送到细胞中。参见例如Gopal,T.V.,Mol Cell Biol.1985年5月；5(5):1188-90)；磷酸钙(例如，使用磷酸钙沉淀将多核苷酸引入细胞中。参见例如Graham和van der Eb,(1973)Virology,52,456-467；Chen和Okayama,Mol.Cell Biol.,7(8):2745-2752,1987)，以及Rippe等人，Mol.Cell Biol.,10:689-695,1990)；超声加载(通过直接声波加载引入多核苷酸。参见例如Fechheimer等人，(1987)Proc.Nat'l Acad.Sci.USA,84,8463-8467)；微粒轰击(例如，一个或多个颗粒可以用至少一种多核苷酸和/或多肽包被并且通过推进力递送到细胞中。参见例如美国专利号5,550,318；美国专利号5,538,880；美国专利号5,610,042；和PCT申请WO 94/09699；Klein等人，(1987)Nature,327,70-73；Yang等人，(1990)Proc.Nat'l Acad.Sci.USA,87,9568-9572)；以及受体介导的转染(例如，使用各种受体的细胞类型特异性分布通过将在靶细胞中发生的受体介导的胞吞作用对大分子进行选择性摄取。参见例如Wu和Wu,(1987)J.Biol.Chem.,262,4429-4432；Wagner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87(9):3410-3414,1990；Perales等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:4086-4090,1994；Myers,EPO 0273085；Wu和Wu,Adv.Drug Delivery Rev.,12:159-167,1993；Nicolau等人，(1987)MethodsEnzymol.,149,157-176)，这里引用的每篇参考文献出于所有目的全文以引用方式并入。

应当认识到，在CRISPR/Cas核酸酶的情况下，Cas蛋白质(例如，Cas9、Cas12a)和gRNA不需要使用相同的方法递送。在一些实施方案中，使用相同的方法递送Cas蛋白质(例如，Cas9、Cas12a)和gRNA。例如，将Cas蛋白质(例如，Cas9、Cas12a)和gRNA两者通过电穿孔或在同一载体中引入细胞中。在一些实施方案中，使用不同的方法递送Cas蛋白质(例如，Cas9、Cas12a)和gRNA。例如，通过电穿孔将Cas蛋白质(例如，Cas9、Cas12a)引入细胞中并且在病毒载体中递送gRNA。作为另一个示例，将Cas蛋白质(例如，Cas9、Cas12a)和gRNA在单独的载体中递送。

T细胞的刺激/活化

为了达到细胞组合物的足够治疗剂量，T细胞可以经受一轮或多轮的刺激/活化。细胞可在遗传修饰步骤之前、之后和/或期间被离体活化和/或扩增。

在一些实施方案中，T细胞的刺激/活化可在包括IL-7、IL-15和/或IL-21的一种或多种细胞因子的存在下进行。在一些实施方案中，T细胞的刺激/活化可在IL-7的存在下进行。在一些实施方案中，T细胞的刺激/活化可在IL-7和IL-15的存在下进行。在一些实施方案中，T细胞的刺激/活化可在IL-7和IL-21的存在下进行。在一些实施方案中，T细胞的刺激/活化可在IL-7、IL-15和IL-21的存在下进行。

在一些实施方案中，T细胞的刺激/活化可在不存在IL-2的情况下进行。

在一些实施方案中，本文所述的方法包括在一种或多种刺激信号或药剂(例如，化合物、小分子(例如，有机小分子)、核酸、多肽、或它们的片段、同种型、变体、类似物或衍生物)的存在下刺激T细胞变得活化。在一些实施方案中，本文所述的方法包括在一种或多种刺激信号或药剂的存在下刺激T细胞变得活化和增殖。

T细胞可通过诱导其生物状态的变化而被活化，通过该变化，细胞表达活化标记，产生细胞因子，增殖和/或变得对靶细胞具有细胞毒性。所有这些变化都可由初级刺激信号产生。共刺激信号放大初级信号的幅度并阻抑初始刺激后的细胞死亡，从而产生更持久的活化状态并因此产生更高的细胞毒性能力。

T细胞通常可使用例如在美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；和6,867,041中所述的方法来活化，这些专利中的每一篇专利出于所有目的全文以引用方式并入本文。

在一些实施方案中，可使用CD3/CD28刺激活化α-βT细胞。作为示例，可使用抗CD3抗体和抗CD28抗体刺激α-βT细胞。

在一些实施方案中，γ-δT细胞可被唑来膦酸盐和/或结合γ-δTCR的药剂(例如，抗体)活化。IL-2和IL-15也可用于扩增γ-δT细胞。

在一些实施方案中，T细胞可通过与活化CD3ζ的药剂结合而被激活。

在其他实施方案中，CD2结合剂可用于向T细胞提供初级刺激信号。例如但非限制性地，CD2剂包括但不限于CD2配体和抗CD2抗体，例如Tl 1.3抗体与Tl 1.1或Tl 1.2抗体的组合(Meuer,S.C.等人(1984)Cell36:897-906，其全文以引用方式并入本文)和9.6抗体(其识别与TI 1.1相同的表位)与9-1抗体的组合(Yang,S.Y.等人(1986)J.Immunol.137:1097-1100，其全文以引用方式并入本文)。也可使用与任何上述抗体的相同表位结合的其他抗体。

在一些实施方案中，通过施用佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)和离子霉素来活化T细胞。在一些实施方案中，通过施用诱导活化然后扩增的适当抗原来活化T细胞。在一些实施方案中，将PMA、离子霉素和/或适当的抗原与CD3一起施用来诱导活化和/或扩增。

通常，用于本发明的活化剂包括但不限于抗体、其片段和具有抗体样功能的蛋白质结合分子。(重组)抗体片段的示例是Fab片段、Fv片段、单链Fv片段(scFv)、二价抗体片段诸如(Fab)2'-片段、双抗体、三抗体(Iliades,P.等人，FEBS Lett(1997)409,437-441，其全文以引用方式并入本文)、十抗体(decabodies)(Stone,E.等人，Journal ofImmunological Methods(2007)318,88-94，其全文以引用方式并入本文)和其他结构域抗体(Holt,L.J.等人，Trends Biotechnol.(2003),21,11,484-490，其全文以引用方式并入本文)。二价抗体片段可以是(Fab)2'片段或二价单链Fv片段，而单价抗体片段可以选自由以下项组成的组：Fab片段、Fv片段和单链Fv片段(scFv)。

在一些实施方案中，CD3ζ剂的一个或多个结合位点可以是二价蛋白质人工结合分子，诸如二聚体脂质运载蛋白突变蛋白(即，duocalin)。在一些实施方案中，受体结合试剂可具有单个第二结合位点(即，单价的)。单价药剂的示例包括但不限于单价抗体片段、具有抗体样结合特性的蛋白质结合分子或MHC分子。单价抗体片段的示例包括但不限于Fab片段、Fv片段和单链Fv片段(scFv)，包括二价单链Fv片段。

特异性地结合CD3的药剂包括但不限于抗CD3抗体、抗CD3抗体的二价抗体片段、抗CD3抗体的单价抗体片段和具有抗体样结合特性的蛋白质CD3结合分子。具有抗体样结合特性的蛋白性CD3结合分子可以是适体、基于脂质运载蛋白家族的多肽的突变蛋白、glubody、基于锚蛋白支架的蛋白质、基于结晶支架的蛋白质、adnectin和高亲和性多聚体(avimer)。其还可以偶联到珠上。

在一些实施方案中，活化剂(例如，CD3结合剂)可以约0.1μg/ml至约10μg/ml的浓度存在。在一些实施方案中，活化剂(例如，CD3结合剂)可以约0.2μg/ml至约9μg/ml、约0.3μg/ml至约8μg/ml、约0.4μg/ml至约7μg/ml、约0.5μg/ml至约6μg/ml、约0.6μg/ml至约5μg/ml、约0.7μg/ml至约4μg/ml、约0.8μg/ml至约3μg/ml或约0.9μg/ml至约2μg/ml的浓度存在。在一些实施方案中，活化剂(例如，CD3结合剂)以约0.1μg/ml、约0.2μg/ml、约0.3μg/ml、约0.4μg/ml、约0.5μg/ml、约0.6μg/ml、约0.7μg/ml、约0.8μg/ml、约0.9μg/ml、约1μg/ml、约2μg/ml、约3μg/ml、约4μg/ml、约5μg/ml、约6μg/ml、约7μg/ml、约8μg/ml、约9μg/ml或约10μg/ml的浓度施用。在一些实施方案中，CD3结合剂可以1μg/ml的浓度存在。

在一些实施方案中，活化剂附着于固体支持物，诸如但不限于珠、在培养板或孔中存在的吸附性聚合物或其他基质(诸如但不限于琼脂糖或玻璃)上；可通过本领域技术人员已知的手段在天然或重组细胞系的细胞表面上表达(诸如以天然或重组的形式)。

T细胞的扩增/增殖

在T细胞被活化和转导之后，可培养细胞以增殖。可将T细胞培养至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天或20天，至少1周或2周，至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月或更长时间，扩增1轮、2轮、3轮、4轮、5轮、6轮、7轮、8轮、9轮或10轮或更多轮。在一些实施方案中，将T细胞培养1天-20天、1天-18天、1天-14天、3天-20天、3天-18天、3天-14天、5天-20天、5天-18天、5天-14天、7天-20天、7天-18天、7天-16天、7天-15天、7天-14天、8天-20天、8天-18天、8天-16天、8天-15天、8天-14天、8天-13天、8天-12天、9天-20天、9天-18天、9天-16天、9天-15天、9天-14天、9天-13天、9天-12天、10天-20天、10天-18天、10天-16天、10天-15天或10天-14天。在一些实施方案中，将T细胞培养8天-14天。在一个实施方案中，将T细胞培养14天。

根据本公开，可通过将T细胞与白介素诸如IL-7、IL-15和/或IL-21一起培养来富集干细胞样记忆T(T_SCM)细胞。

在一些实施方案中，可通过在IL-7的存在下培养T细胞来富集干细胞样记忆T(T_SCM)细胞。在一些实施方案中，可通过在IL-7和IL-15的存在下培养T细胞来富集干细胞样记忆T(T_SCM)细胞。在一些实施方案中，可通过在IL-7和IL-21的存在下培养T细胞来富集干细胞样记忆T(T_SCM)细胞。在一些实施方案中，可通过在IL-7、IL-15和IL-21的存在下培养T细胞来富集干细胞样记忆T(T_SCM)细胞。在一些实施方案中，可通过在IL-7、IL-15和IL-21的存在下培养T细胞来富集干细胞样记忆T(T_SCM)细胞。

在一些实施方案中，用于富集干细胞样记忆T(T_SCM)细胞的白介素不包括IL-2。

在一些实施方案中，用于扩增的药剂(例如，IL-7、IL-15、IL-21)以约1ng/ml至约20ng/ml施用。在一些实施方案中，用于扩增的药剂(例如，IL-7、IL-15、IL-21)以约2ng/ml至约20ng/ml、5ng/ml至约20ng/ml、5ng/ml至约18ng/ml、5ng/ml至约15ng/ml、5ng/ml至约12ng/ml、7ng/ml至约20ng/ml、7ng/ml至约18ng/ml、7ng/ml至约15ng/ml、5.5ng/ml至约9.5ng/ml、约6ng/ml至约9ng/ml、约6.5ng/ml至约12ng/ml、或约9ng/ml至约12ng/ml施用。在一些实施方案中，用于扩增的药剂(例如，IL-7、IL-15、IL-21)以约5ng/ml、约6ng/ml、约7ng/ml、约8ng/ml、约9ng/ml、约10ng/ml、约11ng/ml、约12ng/ml、约13ng/ml、约14ng/ml或约15ng/ml施用。

可用于T细胞扩增的试剂的其他说明性示例是结合CD8、CD45或CD90的药剂，诸如αCD8、αCD45或αCD90抗体。T细胞群的说明性示例包括抗原特异性T细胞、T辅助细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞(记忆T细胞的说明性示例是CD62L⁺CD8⁺特异性中央记忆T细胞)或调节性T细胞(Treg的说明性示例是CD4⁺CD25⁺CD45RA⁺Treg细胞)。

可用于扩增T淋巴细胞的附加药剂包括例如在美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；和6,867,041中所述的方法，这些专利中的每一篇专利出于所有目的全文以引用方式并入本文。

适于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最低必需培养基(MEM)、RPMI培养基1640、Lonza RPMI 1640、高级RPMI、Clicks、AIM-V、DMEM、a-MEM、F-12、TexMACS、X-Vivo15和X-Vivo 20、Optimizer，它们具有添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充有适当量的血清(或血浆)或一组确定的激素和/或足以生长和扩增的量的细胞因子)。

用于T细胞扩增的其他添加剂的示例包括但不限于表面活性剂、代用血浆(piasmanate)、pH缓冲液(诸如HEPES)和还原剂(诸如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇)、抗生素(例如，青霉素和链霉素)，它们仅包括在实验培养物中，不包括在待输注到受试者中的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如，适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％CO₂)。

在一些实施方案中，其中细胞是iPSC衍生的细胞，针对单个克隆选择修饰的细胞以制备主细胞库。

在一些实施方案中，在细胞扩增之后在T细胞群中确定T_SCM细胞的百分比。在一些实施方案中，在细胞扩增之后，T细胞群中T_SCM细胞的百分比为至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一个实施方案中，在细胞扩增之后，T细胞群中T_SCM细胞的百分比为约30％-90％、40％-80％、50％-60％、50％-70％、50％-80％、60％-70％或60％-80％。

本发明的组合物

在一个方面，本公开提供了根据本文所述的方法制备的包含干细胞样记忆T(T_SCM)细胞的T细胞群。可将细胞遗传修饰以表达一种或多种CAR或工程化TCR。

在另一个方面，本公开还提供了一种药物组合物，其包含含有干细胞样记忆T(T_SCM)细胞的T细胞群和任选地药学上可接受的载剂和/或赋形剂。药物载剂的示例包括但不限于无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。水或水溶液盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液优选用作载剂，特别是用于可注射溶液。

包含本文所述的修饰细胞的组合物可包含缓冲液，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，诸如EDTA或谷胱甘肽；辅助剂(例如氢氧化铝)；以及防腐剂。

包含本文所述的修饰的细胞的组合物可包含以下中的一种或多种：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水溶液(优选生理盐水)、林格氏溶液、等渗氯化钠、固定油(诸如可用作溶剂或悬浮介质的合成甘油单酯或甘油二酯)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶剂；抗细菌剂，诸如苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，诸如氯化钠或葡萄糖。可将肠胃外制剂封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。可注射的药物组合物优选地是无菌的。

在一些实施方案中，将组合物配制用于肠胃外施用，例如血管内(静脉内或动脉内)、腹膜内、瘤内、心室内、胸膜内或肌内施用。在一些实施方案中，组合物在施用之前由冻干制剂重构。

在一些实施方案中，可将修饰的细胞与在其施用之前粘附或渗透的物质(例如但不限于纳米颗粒)混合。

治疗方法

在另一个方面，本公开提供了在有需要的受试者中移植的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的如本文所述的包含干细胞样记忆T(T_SCM)细胞的T细胞群或本文所述的药物组合物。

在另一个方面，本公开提供了治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的如本文所述的包含干细胞样记忆T(T_SCM)细胞的细胞群或如本文所述的药物组合物。

在另一个方面，本公开提供了如本文所述的T细胞群或药物组合物，用于在医学中使用。在一些实施方案中，本公开提供如本文所述的T细胞群或药物组合物，用于在治疗疾病或病症(例如但不限于癌症、自身免疫性疾病或感染)中使用。

在一些实施方案中，用于制造T细胞群或药物组合物的方法在体外或离体进行。

在一些实施方案中，该细胞群或该药物组合物中的细胞相对于待施用该细胞群或该药物组合物的受试者是同种异体的。在一些实施方案中，该细胞群或该药物组合物中的细胞相对于待施用该细胞群或该药物组合物的受试者是自体的。

可使用本公开的方法和/或组合物治疗的疾病或病症包括但不限于癌症、自身免疫性疾病或感染。

在一些实施方案中，可用本文所述的方法治疗的疾病或病症是癌症。术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中通常特征在于不受调节的细胞生长的生理状况。术语“癌症”包括例如软组织肿瘤(例如，淋巴瘤)、以及血液和血液形成器官的肿瘤(例如，白血病)、以及实体瘤(其是在血流外的解剖部位中生长的肿瘤(例如，癌))。癌症的示例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤(例如，骨肉瘤或横纹肌肉瘤)以及白血病或淋巴恶性肿瘤。此类癌症的更具体示例包括鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)、腺鳞状细胞癌、肺癌(例如，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、支气管源性癌、路易斯(Lewis)肺癌、肺神经内分泌肿瘤、典型类癌、非典型类癌和大细胞神经内分泌癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃部癌或胃癌(例如，包括胃肠癌、胃肠道基质肿瘤、胰腺癌、胰腺腺癌、导管内乳头状黏液性肿瘤(IPMN)、胰岛细胞肿瘤)、宫颈癌(包括但不限于宫颈腺癌)、卵巢癌(包括但不限于，囊腺癌、卵巢胚胎癌、卵巢腺癌、卵巢透明细胞癌、卵巢浆液囊腺瘤)、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、肝细胞瘤、乳腺癌(包括但不限于乳腺腺癌、乳腺癌的乳头状癌、乳腺癌、乳腺髓样癌)、结肠癌(包括但不限于结肠腺癌)、结肠直肠癌(包括但不限于直肠癌、结肠直肠腺癌)、子宫内膜癌(包括但不限于子宫癌、子宫肉瘤)、唾液腺癌、肾脏癌或肾癌(包括但不限于肾母细胞瘤或维尔姆斯瘤、肾细胞癌)、前列腺癌(包括但不限于前列腺腺癌)、外阴癌、甲状腺癌、肝肿瘤、肛门癌、阴茎癌、皮肤癌(包括但不限于原发性或转移性黑色素瘤、鳞状细胞癌、角化棘皮瘤、基底细胞癌)、多发性骨髓瘤(包括但不限于，冒烟型多发性骨髓瘤)和急性淋巴细胞白血病(ALL)(包括但不限于B细胞ALL、T细胞ALL)、急性髓细胞白血病(AML)(例如，B细胞AML、T细胞AML)、慢性髓细胞白血病(CML)(例如，B细胞CML、T细胞CML)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)(例如，B细胞CLL、T细胞CLL)、淋巴瘤诸如霍奇金淋巴瘤(HL)(包括但不限于，B细胞HL、T细胞HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)(例如，B细胞NHL，诸如弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)(例如，弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL))、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区B细胞淋巴瘤(包括但不限于粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤、结节性边缘区B细胞淋巴瘤、脾脏边缘区B细胞淋巴瘤)、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤(包括但不限于华氏巨球蛋白血症)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、毛细胞白血病(HCL)、前体B淋巴母细胞性淋巴瘤和原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、T细胞NHL(诸如前体T淋巴母细胞性淋巴瘤/白血病)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)(例如，皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)，包括但不限于蕈样肉芽肿、塞扎里综合征)、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、结节外天然杀伤T细胞淋巴瘤、肠道病型T细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、一种或多种上文所述的白血病/淋巴瘤的混合物、脑癌(例如，高级胶质瘤、弥漫性脑桥胶质瘤、室管膜瘤、神经母细胞瘤、脑膜瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤；髓母细胞瘤或胶质母细胞瘤)、以及头颈癌(包括但不限于头颈鳞状细胞癌)、胆管癌(包括但不限于胆管上皮癌)、支气管癌、脊索瘤、绒毛膜癌、上皮癌、内皮肉瘤(包括但不限于卡波西肉瘤、多发性特发性出血性肉瘤)、食管癌(包括但不限于食管的腺癌、巴雷特氏腺癌)、尤因肉瘤、重链病(包括但不限于α链病、γ链病、μ链病)、造血系统癌、免疫细胞淀粉样变性、意义未明的单克隆丙种球蛋白病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生性疾病、原因不明骨髓化生(AMM)或骨髓纤维化(MF)、慢性特发性骨髓纤维化、骨髓增生性肿瘤、真性红细胞增多症、直肠腺癌、原发性血小板增多症、慢性嗜中性粒细胞白血病、高嗜酸性粒细胞综合征、软组织肉瘤(例如恶性纤维组织细胞瘤(MFH)、脂肪肉瘤、恶性外周神经鞘瘤(MPNST)、软骨肉瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤)及相关转移灶。癌症的附加示例可见于TheMerck Manual of Diagnosis and Therapy，第19版，§on Hematology and Oncology，由Merck Sharp&Dohme公司出版，2011(ISBN 978-0-911910-19-3)；The Merck Manual ofDiagnosis and Therapy，第20版，§on Hematology and Oncology，由Merck Sharp&Dohme公司出版，2018(ISBN 978-0-911-91042-1)(在Merck Manuals的因特网网站上的2018数字在线版)；以及SEER Program Coding and Staging Manual 2016，这些文献出于所有目的全文以引用方式并入本文。

在一些实施方案中，该癌症是表达BCMA的癌症或病症。在一些实施方案中，表达BCMA的癌症或病症包括血液学癌症，诸如急性骨髓性白血病(AML)或淋巴瘤(例如，多发性骨髓瘤(MM)、冒烟型多发性骨髓瘤(SMM))。

本公开中所述的组合物和方法可用于治疗感染性疾病。感染性疾病是本领域技术人员熟知的，并且非限制性示例包括但不限于病毒病原感染，诸如人免疫缺陷病毒(HIV)、流感、疱疹、病毒性肝炎、爱泼斯坦-巴尔病毒、脊髓灰质炎、病毒性脑炎、麻疹、水痘、乳头状瘤病毒、巨细胞病毒、狂犬病、水痘、黄热病、西尼罗病毒、埃博拉病毒；细菌病原感染，诸如肺炎、肺结核、梅毒、莱姆病、巴贝虫病；或寄生虫病原感染，诸如疟疾、锥虫病、利什曼病、滴虫病、阿米巴病。

本公开中所述的组合物和方法可用于治疗自身免疫性疾病。这些自身免疫性疾病的示例包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化症(MS)、干燥综合征、结节病、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、自身免疫性甲状腺炎、反应性关节炎、强直性脊柱炎、硬皮病、多肌炎、皮肌炎、银屑病、脉管炎、韦格纳肉芽肿、克罗恩病和溃疡性结肠炎。

在一些实施方案中，组合物以治疗有效量施用。在本发明的方法中施用的组合物的剂量将根据受试者的身体参数、施用频率、施用方式、清除速率等广泛地变化。初始剂量可以较大，并且随后可以是较小的维持剂量。剂量可每周或每两周不频繁地施用，或分成较小剂量并每天、每半周等施用，以维持有效剂量水平。预期多种剂量将可有效实现修饰的细胞的体内持久性。还预期多种剂量将可有效改善修饰的细胞的体内效应子功能。

在一些实施方案中，包含通过本文所述的方法产生的细胞的组合物可以10²至10¹⁰个细胞/kg体重、10⁵至10⁹个细胞/kg体重、10⁵至10⁸个细胞/kg体重、10⁵至10⁷个细胞/kg体重、10⁷至10⁹个细胞/kg体重、或10⁷至10⁸个细胞/kg体重(包括那些范围内的所有整数值)的剂量施用。细胞的数量将取决于组合物预期用于的治疗用途。治疗性细胞可以上文所列的剂量多次施用。

本公开中所述的组合物和方法可与其他类型的癌症疗法(诸如化学疗法、手术、放射、基因疗法等)联合使用。还预期当用于治疗各种疾病/病症时，本公开的组合物和方法可与适用于相同或相似疾病/病症的其他治疗方法/药剂一起使用。此类其他治疗方法/药剂可共同施用(同时或顺序地)以产生加合效应或协同效应。由于加合作用或协同效应，可降低每种药剂的合适的治疗有效剂量。

在任何上述治疗方法的一些实施方案中，该方法还包括向受试者施用一种或多种附加化合物，其选自由以下项组成的组：免疫抑制剂、生物制剂、益生菌、益生元和细胞因子(例如，IFN或IL-2)。

作为非限制性示例，本发明可与阻断炎症(例如，通过阻断IL1、INFα/β、IL6、TNF、IL23等)的其他疗法组合。

本公开的方法和组合物可与其他免疫调节治疗组合，该免疫调节治疗例如治疗性疫苗(包括但不限于GVAX、基于DC的疫苗等)、检查点抑制剂(包括但不限于阻断CTLA4、PD1、LAG3、TIM3等的药剂)或活化剂(包括但不限于增强4-1BB、OX40等的药剂)。本公开的方法还可与具有调节NKT功能或稳定性的能力的其他治疗组合，该其他治疗包括但不限于CD1d、CD1d-融合蛋白、CD1d二聚体或未负载或负载有抗原的CD1d的较大聚合物、CD1d-嵌合抗原受体(CD1d-CAR)、或存在于人类中的五种已知CD1异构体中的任何另外一种(CD1a、CD1b、CD1c、CD1e)。本发明的方法还可与其他治疗(诸如米哚妥林、恩西地平(enasidenib)或它们的组合)组合。

本公开的治疗方法可与另外的细胞疗法、免疫疗法和疗法组合。例如，当用于治疗癌症时，本发明的组合物可与常规癌症疗法组合使用，例如手术、放射疗法、化学疗法或它们的组合，这取决于肿瘤的类型、患者状况、其他健康问题和多种因素。在某些方面，可用于与本发明抑制剂的组合癌症疗法的其他治疗剂包括抗血管生成剂。许多抗血管生成剂已被鉴定并且是本领域已知的，包括例如TNP-470、血小板因子4、凝血酶致敏蛋白1、金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP1和TIMP2)、催乳素(16-Kd片段)、血管抑制素(纤溶酶原的38-Kd片段)、内皮抑制素、bFGF可溶性受体、转化生长因子β、干扰素α、可溶性KDR和FLT-1受体、胎盘增殖蛋白相关蛋白、以及由Carmeliet和Jain(2000)所列出的那些。在一个实施方案中，本发明的T细胞可与以下项组合使用：VEGF拮抗剂或VEGF受体拮抗剂，诸如抗VEGF抗体、VEGF变体、可溶性VEGF受体片段、能够阻断VEGF或VEGFR的适体、中和抗VEGFR抗体、VEGFR酪氨酸激酶抑制剂及它们的任意组合(例如，抗hVEGF抗体A4.6.1、贝伐单抗或兰尼单抗(ranibizumab))。

可用于本发明的组合疗法的化学治疗化合物的非限制性示例包括例如氨鲁米特、安吖啶、阿那曲唑、天冬酰胺酶、阿扎胞苷、卡介苗、比卡鲁胺、博来霉素、布舍瑞林、白消安、喜树碱、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯屈膦酸盐、秋水仙碱、环磷酰胺、环丙孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、地西他滨、己二烯雌酚、己烯雌酚、多西他赛、多柔比星、表柔比星、雌二醇、雌莫司汀(estramnustine)、依托泊苷、依西美坦、非格司亭、氟达拉滨、氟氢可的松、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、氟他胺、吉西他滨、染料木黄酮、戈舍瑞林、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、干扰素、伊立替康、ironotecan、来曲唑、甲酰四氢叶酸、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、氮芥、甲羟孕酮、甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼鲁米特、诺考达唑、奥曲肽、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸盐、喷司他丁、普卡霉素、卟吩姆钠、甲基苄肼、雷替曲塞、利妥昔单抗、链脲佐菌素、舒拉明、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、睾酮、硫鸟嘌呤、噻替派、二氯二茂钛(titanocene dichloride)、托泊替康、曲妥珠单抗、维甲酸、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。

这些化学治疗化合物可以根据它们的作用机制分类为例如以下组：抗代谢药/抗癌剂，诸如嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶、氟尿苷、卡培他滨、吉西他滨和阿糖胞苷)和嘌呤类似物、叶酸拮抗剂和相关抑制剂(巯嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨))；抗增殖/抗有丝分裂剂，包括天然产物(诸如长春花生物碱(长春碱、长春新碱和长春瑞滨))，微管干扰剂(诸如紫衫烷(紫杉醇、多西他赛)、长春花新碱(vincristin)、长春碱、诺考达唑、埃博霉素和诺维本、表鬼臼毒素(依托泊苷、替尼泊苷))，DNA损伤剂(放线菌素、安吖啶、蒽环霉素、博来霉素、白消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、癌得星(cytoxan)、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、六甲三聚氰胺、奥沙利铂、异环磷酰胺、美法仑、甲氯乙胺、丝裂霉素、米托蒽醌、亚硝基脲、普卡霉素、丙卡巴肼、紫杉醇、泰索帝、替尼泊苷、三亚乙基硫代磷酰胺和依托泊苷(VP16))；抗生素，诸如更生霉素(放线菌素D)、柔红霉素、多柔比星(阿霉素)、伊达比星、蒽环霉素、米托蒽醌、博来霉素、普卡霉素(光辉霉素)和丝裂霉素；酶(系统性代谢L-天冬酰胺并剥夺不具有合成其自身天冬酰胺能力的细胞的L-天冬酰胺酶)；抗血小板剂；抗增殖/抗有丝分裂烷化剂，诸如芥类(氮芥、环磷酰胺及类似物、美法仑、苯丁酸氮芥)、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(六甲基三聚氰胺和噻替派)、烷基磺酸酯-白消安、亚硝基脲(卡莫司汀(BCNU)及类似物、链脲佐菌素)、三氮烯-达卡巴嗪(trazenes dacarbazinine，DTIC)；抗增殖/抗有丝分裂抗代谢药，诸如叶酸类似物(甲氨蝶呤)；铂配位络合物(顺铂、卡铂)、丙卡巴肼、羟基脲、米托坦、氨鲁米特；激素、激素类似物(雌激素、他莫昔芬、戈舍瑞林、比卡鲁胺、尼鲁米特)和芳香酶抑制剂(来曲唑、阿那曲唑)；抗凝血剂(肝素、合成肝素盐和其他凝血酶抑制剂)；纤维蛋白溶解剂(诸如组织纤溶酶原活化剂、链激酶和尿激酶)、阿司匹林、双嘧达莫、噻氯匹定、氯吡格雷、阿昔单抗；抗迁移剂；抗分泌剂(布雷非德菌素(breveldin))；免疫抑制剂(环孢菌素、他克莫司(FK-506)、西罗莫司(雷帕霉素)、硫唑嘌呤、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil))；抗血管生成化合物(例如，TNP-470、染料木黄酮、贝伐单抗)和生长因子抑制剂(例如，成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂)；血管紧张素受体阻断剂；一氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体(曲妥珠单抗)；细胞周期抑制剂和分化诱导剂(维甲酸)；mTOR抑制剂、拓扑异构酶抑制剂(多柔比星(阿霉素)、安吖啶、喜树碱、柔红霉素、更生霉素、eniposide、表柔比星、依托泊苷、伊达比星和米托蒽醌、托泊替康、伊立替康)、皮质类固醇(可的松、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松和泼尼松龙)；生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体功能障碍诱导剂和胱天蛋白酶活化剂；以及染色质干扰剂。

在本文所述的治疗方法的各种实施方案中，该受试者是人类。受试者可以是任何年龄或性别的青少年或成人。

实施例

提供以下实施例以进一步描述本文所公开的实施方案中的一些。这些实施例旨在说明而非限制本发明所公开的实施方案。

实施例1.CAR-T设计和工程化

本实施例的第二代CAR-T包含靶向感兴趣的肿瘤相关抗原(TAA)(例如，B细胞成熟抗原(BCMA))的单链可变片段(scFv)，其与源自人CD8A的铰链和跨膜序列以及细胞内结构域(例如4-1BB和CD3ζ)融合，如图1A所示。CAR-T构建体的scFv被特别设计成包括5'和3'重叠，对应于病毒载体(例如，慢病毒载体)中的EcoRI和SpeI限制性位点。将所设计的DNA插入序列针对智人(Homo sapiens)进行密码子优化并随后合成。使用克隆方法进行构建体的克隆。在转染之前对所有构建体进行序列确认。图1B中示出了在本文所呈现的实验中所使用的BCMA CAR-T构建体的序列。

以下是可用于本文所公开的任何CAR-T细胞测定方法的试剂的列表。

试剂：

-TransAct^TM

-初始pan T细胞

-24孔透明TC处理的多孔板

-小鼠抗人CD4抗体

-小鼠抗人CD8抗体

-小鼠抗人CD62L抗体

-小鼠抗人CCR7抗体

-小鼠抗人CD27抗体

-抗人CD45RO抗体

-抗人CD45RA抗体

-抗人CD279(PD-1)

-抗人CD233(LAG-3)

-抗人CD366(Tim-3)

-抗人TIGIT

实施例2.人T细胞培养和电穿孔

从健康供体的外周血单核细胞(PBMC)中分离人Pan-T细胞，并将其在补充有10％胎牛血清(FCS)、2mM GlutaMax、1mM丙酮酸钠、55μMβ-巯基乙醇和100U青霉素/链霉素的完全T细胞培养基/RPMI培养基中进行培养。

按照制造商的方案使用抗CD3/CD28的磁性Dynabead将Pan-T细胞离体扩增约12天-14天。将细胞以1×10⁶个细胞/小瓶的密度冷冻并储存在液氮中。

实施例3.T细胞活化和嵌合抗原受体(CAR)转导

在第0天，将来自三个供体的初始Pan-T细胞解冻并在完全T细胞培养基/RPMI培养基(例如，参见实施例2)中稀释至1×10⁶个T细胞/ml的密度。在T细胞活化之前，将解冻的初始T细胞进行免疫表型分析。免疫表型组包括例如CD4⁺和CD8⁺T细胞亚群。对于T细胞活化，将10μl的TransAct^TM/ml添加到24孔板的每个孔中，密度为1×10⁶个T细胞/孔。将细胞在37℃/5％CO₂下孵育过夜。在第1天，用B细胞成熟抗原(BCMA)-HL CAR慢病毒颗粒以等于5的感染复数(MOI)转导细胞。

实施例4.BCMA-HL CAR转导的T细胞的表型表征

使用细胞因子调理将CAR转导的T细胞扩增14天，以增强CD4⁺和CD8⁺T细胞亚群中的干细胞样记忆T细胞(T_SCM)表型。具体地，使用细胞因子(例如，在单独的IL-7的存在下，或在IL-7与IL-15的组合(IL-7+IL-15)或与IL-15和IL-21的组合(IL7+IL-15和IL-21)的存在下)产生下一代T_SCM样细胞。

对于表型表征，在转导后第14天使用荧光激活细胞分选(FACS)流式细胞术分析来评估CAR T细胞的记忆和效应T细胞标记。对于FACS染色，将来自BCMA-HL CAR转导的细胞的100μl细胞/孔用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次，然后使用用荧光缀合物标记的细胞标记特异性抗体。用于本实验的抗体各自以1:200稀释，并且包括例如CD4、CD8、FVD(活死)、CD27、CD62L、CD45RA、CD45RO、CCR7、CD69和CAR+(1μg/ml)以及Alexa Fluor^TM647(AF647)二抗。使用Fortessa细胞分选系统评估所有样品。

在转导后第14天在CD4⁺CAR-T细胞亚群中和在CD8⁺CAR-T细胞亚群中T_SCM细胞表型的代表性细胞因子增强分别显示在图2A-图2C和图3A-图3C中。对于CD4⁺CAR-T细胞的表型表征(图2A-图2C)，根据上文所述的细胞因子调理范例在存在或不存在细胞因子的情况下活化pan-T细胞。对于FACS分析，将细胞对CD4⁺CAR⁺T细胞进行门控，并确定在CD4⁺BCMA-HLCAR转导的细胞内CD62L(图2A)、CCR7(图2B)和CD27(图2C)的表达水平的频率(亲本频率，％)。对于CD8⁺CAR-T细胞的表型表征(图3A-图3C)，根据上文所述的细胞因子调理范例在存在或不存在细胞因子的情况下相似地活化pan-T细胞。对于FACS分析，将细胞对CD8⁺CAR⁺T细胞进行门控，并确定在CD8+BCMA-HL CAR转导的细胞内CD62L(图3A)、CCR7(图3B)和CD27(图3C)的表达水平的频率(亲本频率，％)。如图4A-图4B中所示，还根据与上文所述的用于定量在CD4⁺CAR-T细胞(图4A)和CD8⁺CAR-T细胞(图4B)两个亚群中CD45RO^-/CD45RA⁺的表达水平的频率(亲本频率，％)的那些方法相同的方法进行表型表征。细胞因子调理增强了CD4⁺和CD8⁺CAR-T细胞两个亚群中的CD45RO^-/CD45RA⁺T_SCM细胞表型。

基于上述结果，单一细胞因子(IL-7)在CD4⁺和CD8⁺两个亚群中有效地富集了T_SCM样细胞。进一步观察到，当将IL-15和IL-21添加到IL-7细胞因子调理中时，在CD4⁺和CD8⁺T细胞中的T_SCM表型均增强。当将IL-7+IL-15+IL-21细胞因子调理的CAR T细胞与肿瘤靶标一起共培养时，IL-7+IL-15+IL-21CAR T细胞具有增强的细胞因子产生。不希望受理论的束缚，据信添加IL-15和IL-21分别活化STAT5和STAT3信号传导，这与单一细胞因子调理相比可能是有利的。

上文所述的用于产生具有增强的效应子功能和减少的衰竭标记的细胞因子调理的CAR-T细胞的方法展示了产生增强抗肿瘤免疫的CD4⁺和CD8⁺CAR-T_SCM细胞的概念证明。

参考文献

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***

本发明不限于本文所述具体实施方案的范围。实际上，除了本文所述的那些之外，根据前面的描述，本发明的各种修改形式对于本领域的技术人员将变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求书的范围内。

本文所引用的所有专利、申请、公布、测试方法、文献和其他材料据此全文以引用方式并入，好像物理地存在于本说明书中那样。

序列表

SEQ ID NO:1前导序列

MAWVWTLLFLMAAAQSIQA

SEQ ID NO:2BCMA scFv-HL

QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGSYFWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGITYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHDGAVAGLFDYWGQGTLVTVSSGTEGKSSGSGSESKSTSYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQPPGQAPVVVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEAVYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVL

SEQ ID NO:3BCMAscFv-LH

SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQPPGQAPVVVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEAVYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVLGTEGKSSGSGSESKSTQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGSYFWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGITYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHDGAVAGLFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:4接头

GTEGKSSGSGSESKST

SEQ ID NO:5CD8a-铰链

TSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD

SEQ ID NO:6CD8a-TM

IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC

SEQ ID NO: 7CD137共刺激

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

SEQID NO:8ζ

RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID NO:9细胞外结构域

MAWVWTLLFLMAAAQSIQAQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGSYFWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGITYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHDGAVAGLFDYWGQGTLVTVSSGTEGKSSGSGSESKSTSYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQPPGQAPVVVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEAVYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVLTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD

SEQ ID NO:10细胞质结构域

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID NO:11 BCMA CAR-HL

MAWVWTLLFLMAAAQSIQAQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGSYFWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGITYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHDGAVAGLFDYWGQGTLVTVSSGTEGKSSGSGSESKSTSYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQPPGQAPVVVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEAVYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVLTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID NO: 12 BCMA CAR-LH

MAWVWTLLFLMAAAQSIQASYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQPPGQAPVVVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEAVYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVLGTEGKSSGSGSESKSTQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGSYFWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGITYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHDGAVAGLFDYWGQGTLVTVSSTSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

序列表

<110> 杨森生物技术公司（JANSSEN BIOTECH, INC.）

<120> 用于增强的干细胞样记忆T细胞工程化的材料和方法

<130> 253505.000131

<140>

<141>

<150> 63/172,595

<151> 2021-04-08

<150> 63/172,601

<151> 2021-04-08

<150> 63/172,605

<151> 2021-04-08

<150> 63/172,610

<151> 2021-04-08

<160> 12

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 1

Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser

1 5 10 15

Ile Gln Ala

<210> 2

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 2

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly

20 25 30

Ser Tyr Phe Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ile Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg His Asp Gly Ala Val Ala Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Thr Glu Gly Lys Ser Ser

115 120 125

Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro

130 135 140

Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly

145 150 155 160

Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Pro Pro

165 170 175

Gly Gln Ala Pro Val Val Val Val Tyr Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser

180 185 190

Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr

195 200 205

Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Val Tyr Tyr Cys

210 215 220

Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr

225 230 235 240

Lys Leu Thr Val Leu

245

<210> 3

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 3

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Pro Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Thr Glu Gly

100 105 110

Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gln Leu Gln Leu

115 120 125

Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu

130 135 140

Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Ser Tyr Phe Trp

145 150 155 160

Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser

165 170 175

Ile Tyr Tyr Ser Gly Ile Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg

180 185 190

Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu

195 200 205

Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His

210 215 220

Asp Gly Ala Val Ala Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 4

Gly Thr Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr

1 5 10 15

<210> 5

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 5

Thr Ser Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 6

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 6

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 7

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 7

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 8

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 8

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 9

<211> 309

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 9

Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser

1 5 10 15

Ile Gln Ala Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys

20 25 30

Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile

35 40 45

Ser Ser Gly Ser Tyr Phe Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ile Thr Tyr Tyr

65 70 75 80

Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys

85 90 95

Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala

100 105 110

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Asp Gly Ala Val Ala Gly Leu Phe Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Thr Glu Gly

130 135 140

Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Ser Tyr Val Leu

145 150 155 160

Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile

165 170 175

Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His Trp Tyr Gln

180 185 190

Gln Pro Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Val Tyr Asp Asp Ser Asp

195 200 205

Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn

210 215 220

Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Val Val Phe Gly

245 250 255

Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Thr Ser Thr Pro Ala Pro Arg Pro

260 265 270

Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro

275 280 285

Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu

290 295 300

Asp Phe Ala Cys Asp

305

<210> 10

<211> 154

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 10

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

35 40 45

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

50 55 60

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

65 70 75 80

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

85 90 95

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

100 105 110

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

115 120 125

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

130 135 140

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

145 150

<210> 11

<211> 487

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 11

Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser

1 5 10 15

Ile Gln Ala Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys

20 25 30

Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile

35 40 45

Ser Ser Gly Ser Tyr Phe Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ile Thr Tyr Tyr

65 70 75 80

Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys

85 90 95

Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala

100 105 110

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Asp Gly Ala Val Ala Gly Leu Phe Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Thr Glu Gly

130 135 140

Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Ser Tyr Val Leu

145 150 155 160

Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile

165 170 175

Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His Trp Tyr Gln

180 185 190

Gln Pro Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Val Tyr Asp Asp Ser Asp

195 200 205

Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn

210 215 220

Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Val Val Phe Gly

245 250 255

Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Thr Ser Thr Pro Ala Pro Arg Pro

260 265 270

Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro

275 280 285

Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu

290 295 300

Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys

305 310 315 320

Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly

325 330 335

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

340 345 350

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu

355 360 365

Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

370 375 380

Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

385 390 395 400

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

405 410 415

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

420 425 430

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

435 440 445

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

450 455 460

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

465 470 475 480

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 12

<211> 487

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 12

Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser

1 5 10 15

Ile Gln Ala Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala

20 25 30

Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser

35 40 45

Lys Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Pro Pro Gly Gln Ala Pro Val Val

50 55 60

Val Val Tyr Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe

65 70 75 80

Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val

85 90 95

Glu Ala Gly Asp Glu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser

100 105 110

Ser Asp His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

115 120 125

Thr Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gln

130 135 140

Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr

145 150 155 160

Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Ser

165 170 175

Tyr Phe Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ile Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu

195 200 205

Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

210 215 220

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

225 230 235 240

Ala Arg His Asp Gly Ala Val Ala Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

245 250 255

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Pro Ala Pro Arg Pro

260 265 270

Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro

275 280 285

Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu

290 295 300

Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys

305 310 315 320

Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly

325 330 335

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

340 345 350

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu

355 360 365

Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

370 375 380

Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

385 390 395 400

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

405 410 415

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

420 425 430

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

435 440 445

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

450 455 460

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

465 470 475 480

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

Claims (78)

1.一种在T细胞群中富集干细胞样记忆T(T_SCM)细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

a)使所述T细胞群与有效量的包括白介素7(IL-7)的一种或多种细胞因子接触足以富集T_SCM细胞的时间段；以及

b)任选地扩增所述T_SCM细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子还包括IL-15。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子还包括IL-21。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子还包括IL-15和IL-21。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中将所述一种或多种细胞因子中的每一种细胞因子以约1ng/ml至约15ng/ml的浓度与所述T细胞群接触。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中将所述一种或多种细胞因子中的每一种细胞因子以约5ng/ml至12ng/ml的浓度与所述T细胞群接触。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中将所述一种或多种细胞因子中的每一种细胞因子以约10ng/ml的浓度与所述T细胞群接触。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子不包括IL-2。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述T细胞群包含Pan T细胞、初始CD4⁺T细胞、初始CD8⁺T细胞、或初始CD4⁺和初始CD8⁺T细胞、或它们的任意组合。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述方法还包括在步骤(a)之前从外周血单核细胞(PBMC)中分离Pan T细胞、初始CD4⁺细胞、初始CD8⁺T细胞、或初始CD4⁺和初始CD8⁺细胞。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述细胞群不包含抑制性调节T细胞。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子在所述扩增步骤(b)期间存在。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述方法还包括：

遗传修饰所述T细胞以表达嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述遗传修饰通过向所述细胞中引入编码所述CAR或工程化TCR的多核苷酸来进行。

15.根据权利要求14所述的方法，其中通过病毒转导、电穿孔、直接注射、磁转染、超声、弹道或流体动力学方法或它们的组合来引入编码所述CAR或工程化TCR的所述多核苷酸。

16.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述CAR或工程化TCR特异性地结合肿瘤抗原、感染性抗原或自身免疫性抗原。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述肿瘤抗原选自BCMA、GPRC5D、CD79、KLK2、CD19、CD30、CD33、CD123、hK2、FLT3、CD20、CD22、KRASG12D、p53、BRAC1和PSMA。

18.根据权利要求13-17中任一项所述的方法，其中所述遗传修饰在所述扩增步骤(b)之前进行。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子在所述遗传修饰步骤期间存在。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中将所述接触步骤(a)进行10天-20天。

21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中将所述接触步骤(a)进行约14天。

22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中将所述接触步骤(a)和所述扩增步骤(b)进行总共10天-20天。

23.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中将所述接触步骤(a)和所述扩增步骤(b)进行总共14天。

24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中将所述接触步骤(a)在约37℃的温度下进行。

25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述方法还包括：

在所述接触步骤(a)开始时活化所述T细胞群。

26.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述活化步骤用抗CD3剂和/或抗CD28剂进行约24小时。

27.根据权利要求25或26所述的方法，其中所述方法还包括：

在所述活化步骤(a)之前引发所述T细胞群。

28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述方法还包括：

确定在所述扩增步骤(b)之后在所述T细胞群中T_SCM细胞的百分比。

29.根据权利要求28所述的方法，其中在所述扩增步骤(b)之后，在所述T细胞群中T_SCM细胞的百分比为至少约40％、50％、60％或70％。

30.根据权利要求29所述的方法，其中在所述扩增步骤(b)之后，在所述T细胞群中T_SCM细胞的百分比为约60％-70％。

31.一种产生遗传修饰的干细胞样记忆T(T_SCM)细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

a)获得分离的Pan T细胞、初始CD4⁺T细胞、初始CD8⁺T细胞、或初始CD4⁺和初始CD8⁺T细胞、或它们的任意组合的群体；

b)活化所述T细胞群；

c)遗传修饰在步骤(b)之后存在的细胞以表达嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)；

d)扩增所述遗传修饰的细胞；

其中步骤b)、c)和d)在包含括白介素-7(IL-7)的一种或多种细胞因子的存在下进行。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子还包括IL-15。

33.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子还包括IL-21。

34.根据权利要求31所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子还包括IL-15和IL-21。

35.根据权利要求31-34中任一项所述的方法，其中将所述一种或多种细胞因子中的每一种细胞因子以约1ng/ml至约15ng/ml的浓度与所述T细胞群接触。

36.根据权利要求31-35中任一项所述的方法，其中将所述一种或多种细胞因子中的每一种细胞因子以约5ng/ml至12ng/ml的浓度与所述T细胞群接触。

37.根据权利要求31-36中任一项所述的方法，其中将所述一种或多种细胞因子中的每一种细胞因子以约10ng/ml的浓度与所述T细胞群接触。

38.根据权利要求31-37中任一项所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子不包括IL-2。

39.根据权利要求31-38中任一项所述的方法，其中从外周血单核细胞(PBMC)中分离所述Pan T细胞、初始CD4⁺T细胞、初始CD8⁺T细胞、或初始CD4⁺和初始CD8⁺T细胞、或它们的任意组合。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述T细胞不包含抑制性调节T细胞。

41.根据权利要求31-40中任一项所述的方法，其中所述遗传修饰通过向所述细胞中引入编码所述CAR或工程化TCR的多核苷酸来进行。

42.根据权利要求41所述的方法，其中通过病毒转导、电穿孔、直接注射、磁转染、超声、弹道或流体动力学方法或它们的组合来引入编码所述CAR或工程化TCR的所述多核苷酸。

43.根据权利要求31-42中任一项所述的方法，其中所述CAR或工程化TCR特异性地结合肿瘤抗原、感染性抗原或自身免疫性抗原。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述肿瘤抗原选自BCMA、GPRC5D、CD79、KLK2、CD19、CD30、CD33、CD123、hK2、FLT3、CD20、CD22、KRASG12D、p53、BRAC1和PSMA。

45.根据权利要求31-44中任一项所述的方法，其中将所述扩增步骤(d)进行10天-20天。

46.根据权利要求31-45中任一项所述的方法，其中将所述扩增步骤(d)进行约14天。

47.根据权利要求31-46中任一项所述的方法，其中将所述步骤(b)、(c)和(d)进行总共10天-20天。

48.根据权利要求31-47中任一项所述的方法，其中将所述步骤(b)、(c)和(d)进行总共14天。

49.根据权利要求31-48中任一项所述的方法，其中将所述步骤(b)、(c)和(d)在约37℃的温度下进行。

50.根据权利要求31-49中任一项所述的方法，其中所述活化步骤用抗CD3剂和/或抗CD28剂进行约24小时。

51.根据权利要求31-50中任一项所述的方法，其中所述方法还包括：

在所述活化步骤(b)之前引发所述T细胞群。

52.根据权利要求31-51中任一项所述的方法，其中所述方法还包括：

确定在所述扩增步骤(d)之后在所述T细胞群中T_SCM细胞的百分比。

53.根据权利要求52所述的方法，其中在所述扩增步骤(d)之后，在所述T细胞群中T_SCM细胞的百分比为至少约40％、50％、60％或70％。

54.根据权利要求53所述的方法，其中在所述扩增步骤(d)之后，在所述T细胞群中T_SCM细胞的百分比为约60％-70％。

55.一种包含富集的干细胞样记忆T(T_SCM)细胞的T细胞群，所述T细胞群通过根据权利要求1-54中任一项所述的方法制备。

56.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求55所述的T细胞和药学上可接受的载剂或赋形剂。

57.一种治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求55所述的T细胞或根据权利要求56所述的药物组合物。

58.根据权利要求57所述的方法，其中所述T细胞群对所述受试者而言是同种异体的。

59.根据权利要求57所述的方法，其中所述T细胞群对所述受试者而言是自体的。

60.根据权利要求57-59中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症、感染性疾病或自身免疫性疾病。

61.根据权利要求60所述的方法，其中所述癌症是血液恶性肿瘤。

62.根据权利要求60所述的方法，其中所述癌症是实体瘤。

63.根据权利要求60所述的方法，其中所述癌症是鳞状细胞癌、腺鳞状细胞癌、肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃部癌或胃癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾脏癌或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝肿瘤、肛门癌、阴茎癌、皮肤癌、多发性骨髓瘤和急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞白血病(AML)、慢性髓细胞白血病(CML)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)、淋巴瘤诸如霍奇金淋巴瘤(HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区B细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、毛细胞白血病(HCL)、前体B淋巴母细胞性淋巴瘤和原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、T细胞NHL诸如前体T淋巴母细胞性淋巴瘤/白血病、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、结节外自然杀伤T细胞淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、脑癌以及头颈癌、胆管癌、支气管癌、脊索瘤、绒毛膜癌、上皮癌、内皮肉瘤、食管癌、尤因肉瘤、重链病、造血系统癌、免疫细胞淀粉样变性、意义未明的单克隆丙种球蛋白病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生性疾病、原因不明骨髓化生(AMM)或骨髓纤维化(MF)、慢性特发性骨髓纤维化、骨髓增生性肿瘤、真性红细胞增多症、直肠腺癌、原发性血小板增多症、慢性嗜中性粒细胞白血病、高嗜酸性粒细胞综合征或软组织肉瘤，或它们的组合或转移。

64.根据权利要求60所述的方法，其中所述癌症是表达BCMA的癌症。

65.根据权利要求64所述的方法，其中所述表达BCMA的癌症是急性髓样白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)或冒烟型多发性骨髓瘤(SMM)。

66.一种用于在T细胞群中富集干细胞样记忆T(T_SCM)细胞的系统，所述系统包括以下元件：

a)用于使所述T细胞群与有效量的包括白介素7(IL-7)的一种或多种细胞因子接触足以富集T_SCM细胞的时间段的工具；以及

b)任选地，用于扩增所述T_SCM细胞的工具。

67.根据权利要求66所述的系统，其中所述T细胞群包含Pan T细胞、初始CD4⁺T细胞、初始CD8⁺T细胞、或初始CD4⁺和初始CD8⁺T细胞、或它们的任意组合。

68.根据权利要求67所述的系统，其中所述系统还包括用于从外周血单核细胞(PBMC)中分离Pan T细胞、初始CD4⁺细胞、初始CD8⁺T细胞、或初始CD4⁺和初始CD8⁺细胞、或它们的任意组合的工具。

69.根据权利要求66-68中任一项所述的系统，其中所述系统还包括用于遗传修饰所述T细胞以表达嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)的工具。

70.根据权利要求66-69中任一项所述的系统，其中所述系统还包括用于在开始使所述T细胞群与包括白介素7(IL-7)的一种或多种细胞因子接触时活化所述T细胞群的工具。

71.根据权利要求70所述的系统，其中所述系统还包括用于在所述活化之前引发所述T细胞群的工具。

72.根据权利要求66-71中任一项所述的系统，其中所述系统还包括用于确定在所述扩增之后在所述T细胞群中T_SCM细胞的百分比的工具。

73.一种用于产生遗传修饰的干细胞样记忆T(T_SCM)细胞的系统，所述系统包括以下元件：

a)用于获得分离的Pan T细胞、初始CD4⁺T细胞、初始CD8⁺T细胞或初始CD4⁺和初始CD8⁺T细胞、或它们的任意组合的群体的工具；

b)用于活化所述T细胞群的工具；

c)用于在活化后遗传修饰所述细胞以表达嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)的工具；

d)用于扩增所述遗传修饰的细胞的工具；

其中获得分离的Pan T细胞、初始CD4⁺T细胞、初始CD8⁺T细胞、或初始CD4⁺和初始CD8⁺T细胞、或它们的任意组合的群体，活化所述T细胞群以及遗传修饰所述T细胞群在包括白介素-7(IL-7)的一种或多种细胞因子的存在下进行。

74.根据权利要求66-73中任一项所述的系统，其中所述一种或多种细胞因子还包括IL-15和/或IL-21。

75.一种用于在T细胞群中富集干细胞样记忆T(T_SCM)细胞的组合物，所述组合物包含：

a.用于富集T_SCM细胞的包括白介素7(IL-7)的一种或多种细胞因子，

b.T细胞群，其是用于富集TSCM细胞的工具，和

c.任选地，用于扩增所述T_SCM细胞的工具。

76.一种用于在T细胞群中富集干细胞样记忆T(T_SCM)细胞的组合物，所述组合物包含：

a.T细胞群，和

b.有效量的包括白介素7(IL-7)的一种或多种细胞因子，和

用于进行以下操作的工具：

(i)使所述T细胞群与有效量的包括IL-7的一种或多种细胞因子接触，从而富集T_SCM细胞，

(ii)活化所述富集的T_SCM细胞，和

(iii)任选地，用于扩增所述T_SCM细胞的工具。

77.一种用于产生遗传修饰的干细胞样记忆T(T_SCM)细胞的组合物，所述组合物包含：

a.T细胞群，和

b.有效量的包括白介素7(IL-7)的一种或多种细胞因子，和

用于进行以下操作的工具：

(i)使所述T细胞群与有效量的包括IL-7的一种或多种细胞因子接触，从而富集T_SCM细胞，

(ii)活化所述富集的T_SCM细胞，

(iii)遗传修饰所述富集的T_SCM细胞以表达嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)，和

(iv)任选地，用于扩增所述T_SCM细胞的工具。

78.根据权利要求75-77中任一项所述的组合物，其中所述T_SCM细胞通过将所述T细胞群与有效量的包括IL-7的所述一种或多种细胞因子接触足以富集T_SCM细胞的时间段来富集。