MX2008002435A - Aptameros que se unen a trombina con elevada afinidad - Google Patents
Aptameros que se unen a trombina con elevada afinidadInfo
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Abstract
La invención proporciona aptámeros capaces de aglutinarse a trombina y que sonútiles como agentes terapéuticos y para el diagnóstico de trastornos relacionados con la coagulación y/u otras enfermedades o trastornos en donde la trombina estáimplicada. La invención además proporciona materiales y métodos para la administración de aptámeros capaces de unirse a trombina.
Description
APTAMEROS QUE SE UNEN A TROMBINA CON ELEVADA AFINIDAD
CAMPO DE LA INVENCIÓN En términos generales, la invención se relaciona con el campo de ácidos nucleicos y más particularmente con aptámeros capaces de unirse a trombina y que son útiles como agentes terapéuticos y de diagnóstico para trastornos relacionados con la coagulación y/u otras enfermedades o trastornos en donde está implicada la trombina. Además, la invención se relaciona con materiales y métodos para la administración de aptámeros capaces de unirse a trombina.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los aptámeros son moléculas de ácidos nucleicos que tienen una elevada afinidad de unión específica a moléculas mediante interacciones distintas al apareamiento de bases tipo
Watson-Crick. Los aptámeros, al igual que péptidos generados mediante despliegue de fagos o anticuerpos monoclonales ("mAbs" por sus siglas en inglés), son capaces de unirse específicamente a objetivos seleccionados y modular la actividad del objetivo, por ejemplo, mediante la unión de aptámeros que pueden bloquear la habilidad del objetivo para funcionar. Habiendo sido creados mediante un proceso de selección in vi tro a partir de grupos de secuencias aleatorias Ref.189532 de oligonucleótidos, los aptámeros han sido generados para más de 100 proteínas incluyendo factores de crecimiento, factores de la transcripción, cenzimas, inmunoglobulinas y receptores. Un típico aptámero tiene un tamaño de 10-15 kDa (30-45 nucleótidos), se une a su objetivo con afinidad subnanomolar y discrimina contra objetivos muy relacionados (por ejemplo, normalmente los aptámeros no se unen a otras proteínas de la misma familia de genes). Una serie de estudios estructurales ha demostrado que los aptámeros son capaces de utilizar los mismos tipos de interacciones de unión (por ejemplo, unión a hidrógeno, complementariedades electrostáticas, contactos hidrofóbicos, exclusión esférica) que impulsan la afinidad y una unión muy selectiva en complejos de anticuerpo-antígeno (inmunocomplejos) . Los aptámeros tienen una variedad de características deseables para utilizarse como agentes terapéuticos y de diagnóstico que incluyen una elevada selectividad y afinidad, eficacia biológica y excelentes propiedades farmacocinéticas . Además, ofrecen ventajas competitivas con respecto a los anticuerpos y otros productos biológicos proteínicos, por ejemplo: 1) Velocidad y control. Los aptámeros se producen mediante un proceso completamente in vi tro, lo que permite una rápida generación de guías iniciales, incluyendo guías terapéuticas. La selección in vi tro permite que la selectividad y afinidad del aptámero esté muy regulada y permite la generación de guías, incluyendo guías contra objetivos tanto tóxicos como no inmunogénicos . 2) Toxicidad e inmunogenicidad. Los aptámeros como una clase, han demostrado una toxicidad terapéuticamente aceptable y falta de inmunogenicidad. En dosis crónicas en ratas o marmotas, con elevados niveles de aptámero (lOmg/kg diario durante 90 días), no se observa toxicidad mediante ninguna cuantificación clínica, celular o bioquímica. Mientras que la eficacia de varios anticuerpos monoclonales puede limitarse severamente por la respuesta inmunitaria a los anticuerpos en sí mismos, es extremadamente difícil provocar como respuesta a los anticuerpos contra aptámeros muy probablemente debido a que los aptámeros no pueden ser presentados por células T mediante el MHC (Complejo Principal de Histocompatibilidad "MHC" por sus siglas en inglés) y la respuesta inmunitaria generalmente está entrenada para no reconocer los fragmentos de ácidos nucleicos. 3) Administración . Mientras que los productos terapéuticos de anticuerpos comúnmente aprobados se administran mediante infusión intravenosa (normalmente durante un período 2-4 horas) , los aptámeros pueden administrarse mediante inyección subcutánea (biodisponibilidad de aptámero por vía administración subcutánea es de > 80% en estudios con primates (Tucker et al, J. Chromatography B. 732: 203-212, 1999)). Esta diferencia se debe principalmente a la solubilidad comparativamente lenta y por lo tanto los grandes volúmenes necesarios para la mayoría de los mAbs terapéuticos. Con una buena solubilidad (>150 mg/ml.) y un peso molecular comparativamente bajo (aptámero: 10-50 kDa; anticuerpo: 150 kDa) , se puede administrar mediante inyección una dosis semanal de aptámero en un volumen menor 0.5 ml . Además, el pequeño tamaño de los aptámeros les permite penetrar en áreas de restricciones conformacionales que no permiten penetrar a los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, lo que presente incluso otra ventaja de la profilaxis o terapia basada en aptámeros . 4) Escalabilidad y costo. Los aptámeros terapéuticos se sintetizan químicamente y en consecuencia pueden escalarse fácilmente según sea necesario para cumplir con la demanda de producción. Mientras que las dificultades en la producción a escalabilidad de incremento a escala actualmente limitan la disponibilidad de algunos productos biológicos y el costo capital de una instalación de producción proteínica a gran escala es enorme, solo sintetizador de oligonucleótidos a gran escala puede producir hasta 100 kg/año y requiere una inversión inicial relativamente modesta. 5) Estabilidad. Los aptámeros terapéuticos son químicamente resistentes. Están intrínsecamente adaptados para recobrar su actividad luego de exponerse a factores tales como calor y agentes desnaturalizantes y pueden almacenarse durante períodos prolongados (> 1 año) a temperatura ambiente en forma de polvos liofilizados.
Trombina La trombina es una serina proteasa multifuncional que tiene actividad procoagulante y anticoagulante. Como enzima procoagulante, la trombina coagula el fibrinógeno, activa los factores de coagulación V, VII y XIII y activa las plaquetas. La escisión específica de fibrinógeno por la trombina inicia la polimerización de monómeros de fibrina, un evento primario en la formación de coágulos sanguíneos. El evento principal en la formación de trombos plaquetarios es la activación de plaquetas de un modo "no aglutinantes" a un modo "aglutinante o de unión". La trombina es un activador fisiológico de la agregación plaquetaria. Por lo tanto, como un coagulante, la trombina tiene una función principal en la detención del sangrado (hemostasis fisiológico) y la formación de trombos vasooclusivos (trombosis patológica) . Como anticoagulante, la trombina se une a trombomodulina (TM) , una glicoproteína expresada sobre la superficie de células endoteliales vasculares. La TM altera la especificidad del sustrato de fibrinógeno y plaquetas a proteína C mediante una combinación de un cambio alostérico de la conformación del sitio activo y una superposición de TM y sitios de unión a fibrinógeno en trombina. La proteína C activada, en presencia de una superficie fosfolipídica, Ca2+ y un segundo cofactor proteínico dependiente de vitamina K, proteína S, inhibe la coagulación al degradar proteolíticamente los factores Va Villa. Por lo tanto, la formación del complejo trombina-TM convierte a trombina de una enzima procoagulante a una anticoagulante y el balance normal entre estas actividades opuestas es crítica para la regulación de la hemostasis.
Trastornos de Coagulación El daño vascular y la formación de trombos representan eventos clave en la patogénesis de diversos trastornos y enfermedades vasculares, incluyendo aterosclerosis. Los procesos patogénicos de activación de plaquetas y/o el sistema de coagulación, conllevan a trombosis en diversos estados de enfermedad y en diversos sitios, como pueden ser las arterias' coronarias, cámaras cardiacas y válvulas cardiacas prostéticas en donde parece ser diferente. Por lo tanto, se puede necesitar el uso de un inhibidor plaquetario, un anticoagulante o una combinación de ambos junto con trombolíticos para abrir los vasos cerrados y evitar la reoclusión. La proteólisis controlada mediante compuestos de la cascada de coagulación es crítica para la hemostasis. Como resultado, existe una variedad de sistemas reguladores complejos y están basados, parcialmente, en una serie de inhibidores de proteasa altamente específicos. En una situación patológica, la actividad inhibitoria funcional puede ser interrumpida por una producción excesiva de proteasa activa o la inactivación de la actividad inhibitoria. La perpetuación de la inflamación en respuesta a un trauma múltiple (daño tisular) o infección (sepsis) de pende de enzimas proteolíticas, tanto de los sistemas de cascada plasmática, incluyendo trombina y de origen lisosomal. En estos casos, la falla orgánica múltiple (MOF por sus siglas en inglés) se intensifica por el desbalance cada vez mayor entre proteasas y sus reguladores inhibitorios. Más aún, un desbalance de la actividad de trombina en el cerebro conlleva a enfermedades neurodegenerativas.
Cirugía de Derivación o Desvío de Arterias Coronarias (CABG por sus siglas en inglés) En 2001, la Asociación Cardiaca Americana mencionó que solo en los Estados Unidos de Norteamérica, un estimado de 12.4 millones de pacientes fueron diagnosticados con alguna forma de enfermedad de arterias coronarias. Dada la importancia de la trombina en los procesos de coagulación, un agente antitrombina o un agente que disminuya o inhiba la actividad de trombina a anticoagulante que se utiliza, por ejemplo, durante la cirugía de derivación o desvío de arterias coronarias (de aquí en adelante, "CABG") , intervención coronaria percutánea (de aquí en adelante, "PCI" por sus siglas en inglés) y el síndrome coronario agudo. A partir del 2001, se llevaron a cabo mas de 570 000 procedimientos CABG anualmente en los EE . UU . y se estima que mas de 700 000 procedimientos se llevan a cabo mundialmente. En la actualidad, el anticoagulante más comúnmente utilizado es heparina y debe utilizarse con el antídoto protamina. Sin embargo, el tratamiento heparina-protamina está asociado con una variedad de efectos secundarios serios que incluyen sangrado y trombocitopenia (reducción del conteo de plaquetas) que comúnmente es asintomático pero que puede estar asociado con trombosis venosa o arterial letal. Además, el tratamiento de heparina-protamina tiene una variedad de otras desventajas que incluyen: unión no específica a proteínas plasmáticas que da como resultado resistencia en algunos pacientes; la heparina no puede inhibir la trombina unida al coágulo; la heparina tiene una cinética no lineal lo que hace difícil controlar la dosificación; y la heparina es fabricada a partir de tejido vacunos o porcinos los cuales tienen un riesgo inherente de seguridad debido a la posibilidad de transmisión de virus y/o priones. En consecuencia, una variedad de novedosos anticoagulantes de alto costo, tales como Angiomax® y heparinas de bajo peso molecular están obteniendo una significativa penetración en este mercado. Sin embargo, estos compuestos tienen efectos secundarios similares y su actividad anticoagulante no puede revertirse rápidamente. Por lo tanto, existe una necesidad médica significativa que aun no ha sido cumplida para un anticoagulante de costo moderado que no requiera un agente de reversión separado y que no esté asociado con los efectos secundarios y desventajas enumeradas anteriormente. En consecuencia, sería beneficioso tener agentes que disminuyan o inhiban la actividad de trombina para ser utilizados como agentes terapéuticos en el tratamiento contra trastornos relacionados con la coagulación.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona materiales y métodos para el tratamiento contra trastornos relacionados con trombina, por ejemplo, trastornos crónicos y agudos relacionados con la coagulación. Además, la presente invención proporciona composiciones terapéuticas y métodos para la modulación de trombina, particularmente para disminuir o inhibir la coagulación mediada por trombina, para la anti coagulación en una persona o paciente. En una modalidad particular, se proporciona un aptámero que se une a un objetivo trombina, en donde el aptámero -disminuye o inhibe la coagulación mediada por trombina y el aptámero es ARC2172 (SEQ ID NO 294) o un aptámero que tiene sustancialmente la misma habilidad que ARC2172 .(SEQ ID NO 2914) para disminuir o inhibir la coagulación mediada por trombina, en donde el aptámero se une a trombina de humano con un KD menor a 1 nM, preferiblemente menor a 300 pM, con mayor preferencia menor a 250 pM y aún más preferiblemente menor a 200 pM y en donde el aptámero tiene una longitud menor a 56 nucleótidos o menos, 55 nucleótidos o menos, 50 nucleótidos o menos, 45 nucleótidos o menos, 40 nucleótidos o menos, 35 nucleótidos o menos, 30 nucleótidos o menos, 28 nucleótidos o menos, 26 nucleótidos o menos. En algunas modalidades, el aptámero tiene al menos 22 nucleótidos de longitud. En otra modalidad, se proporciona un aptámero que se une a un objetivo trombina, en donde el aptámero disminuye o inhibe la coagulación mediada por trombina y el aptámero es ARC2172 (SEQ ID NO 2194) o un aptámero que tiene sustancialmente la misma habilidad que ARC2172 (SEQ ID NO 294) para disminuir o inhibir la coagulación mediada por trombina y en donde el aptámero no comprende una modificación 5- bromodesoxiuridina en la mayoría de sus residuos timidina o uridina. En algunas modalidades, el aptámero se une a trombina humana con un KD menor a 1 nM preferiblemente menor 300 pM, con mayor preferencia menos de 250 pM, aún con mayor
' preferencia menos de 200 pM. En algunas modalidades, el aptámero tiene una longitud de 56 nucleótidos o menos, 55 nucleótidos o menos, 50 nucleótidos o menos, 45 nucleótidos o menos, 40 nucleótidos o menos, 35 nucleótidos o menos, 30 nucleótidos o menos, 28 nucleótidos o menos, 26 nucleótidos o menos. En algunas modalidades, el aptámero tiene al menos 22 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, la constante de disociación puede determinarse mediante una titulación "dot biot" (transferencia en mancha) como se describe en el siguiente Ejemplo 1. En algunas modalidades, se evalúa la habilidad del aptámero de la invención para disminuir o inhibir la coagulación mediada por trombina mediante la cuantificación de la habilidad del aptámero para disminuir o inhibir el tiempo de coagulación activada (ACT por sus siglas en inglés), tiempo de protrombina (PT por sus siglas en inglés) y/o el tiempo de tromboplastina parcial (aPTT por sus siglas en inglés) .Preferiblemente, la coagulación mediada por trombina es evaluada al cuantificar la habilidad del aptámero para disminuir ACT. En una modalidad preferida, se evalúa la habilidad del aptámero de la invención para disminuir o inhibir la coagulación mediante la cuantificación de ACT utilizando el instrumento Hemochron Jr (TIC Med, Edison NJ) como se describe en el siguiente Ejemplo 3B. En algunas modalidades, el aptámero de la invención disminuye o inhibe la coagulación in vivo mediada por trombina, particularmente en un paciente humano. En algunas modalidades, el aptámero de la invención disminuye o inhibe la coagulación in vi tro mediada por trombina. En una modalidad particular, se proporciona un aptámero que se une a trombina en donde el aptámero se selecciona a partir del grupo que comprende: SEQ ID NOs 9-41, 43-191, 193-204, 208-304, 307- 329, 331-332, 334, 336-337, 340-392, 396-397, 400 y 402-440. En una modalidad, se proporciona una aptámero que se une a trombina y comprende la siguiente secuencia de ácidos nucleicos: CCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGG. En modalidades particulares, se proporciona un aptámero que comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo que comprende: ACTGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCAGT (ARC2169 (SEQ ID NO 28)), GCTGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCAGC (ARC2170 (SEQ ID NO 292)), CTGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCAG (ARC2171 (SEQ ID NO 293)) y CGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCG (ARC2172 (SEQ TD NO 294)). En otra modalidad, se proporciona un aptámero que comprende la siguiente secuencia de ácidos nucleicos: N?N2N3TAGGTTGGGTAGGGTGGTN'3N'2N'? en donde Ni, N2 o N3 en cualquier nucleótido que forma pares de bases con N'i,N'2 o N'3 , respectivamente, en donde, Ni, N2 o N3 pueden ser cada uno el mismo nucleótido o diferentes nucleótidos y el aptámero disminuye o inhibe la coagulación mediada por trombina. En algunas modalidades, Ni, N2 o N3 son desoxinucleótidos. En otras modalidades, al menos dos de Ni, N2 o N3, comprenden una modificación 2 OMe. En otra modalidad, se proporciona un aptámero que comprende la siguiente secuencia ácidos nucleicos: N?N2N3N4TAGGTTGGGTAGGGTGGTN'4N,3N'2N'? donde Ni, N2, N3 o N4 es' cualquier nucleótido que forme un par de bases con respectivamente, en donde Ni, N2, N3 y N4 pueden ser cada uno el mismo nucleótido o diferentes nucleótidos y el aptámero disminuye o inhibe la coagulación mediada por trombina. En algunas modalidades, Ni, N2, N3 o N4 son desoxinucleótidos. En otras modalidades, al menos dos de Ni, N2, N3 o N4, comprenden una modificación 2 ' OMe . En otra modalidad, se proporciona un aptámero que comprende la siguiente secuencia de ácidos nucleicos NiN2N3N4N5TAGGTTGGGTAGGGTGGTN'5N,4N,3N,2N,/ en donde, N±, N2 , N3 , N4 o N5, es cualquier nucleótido que forme pares de bases con N'i, N'2 ,N'3, N' o N'5, respectivamente. En donde Ni, N2, N3, N4 y N5 pueden ser cada una el mismo nucleótido o diferentes nucleótidos y el aptámero disminuye o inhibe la coagulación mediada por trombina. En otras modalidades, Ni, N2, N3, N4 o N5 son desoxinucleótidos. En otras modalidades, al menos dos de Ni, N2, N3, N4 o N5 comprenden una modificación 2 OMe . En otra modalidad, se proporciona un aptámero que comprende la siguiente secuencia
N,N2N3N4N5N6TAGGTTGGGTAGGGTGGTN'6N,5N,4 N ' 3N ' 2N ' x en donde Ni, N2, N3, N4, N5 o N6 es cualquier nucleótido que forme pares de bases con N 'i, N ' 2, N ' 3iN ' 4, N ' s, o N'6, respectivamente, en donde i , N2, N3, N4, N5 o N6 pueden ser cada una el mismo nucleótido o diferentes nucleótidos y el aptámero disminuye o inhibe la coagulación mediada por trombina. En algunas modalidades, N en los aptámeros anteriormente descritos es un residuo nucleotídico de guanosina o citidina. En otra modalidad de este aspecto de la invención, el aptámero se une a trombina con un KD menor a 1 nM. En otra modalidad de este aspecto de la invención, el aptámero tiene al menos sustancialmente la misma habilidad que ARC2172 (SEQ ID NO 294) para disminuir o inhibir la coagulación mediada por trombina. En algunas modalidades, la trombina objetivo es trombina de humano. En algunas modalidades de los aptámeros de la invención, la mayoría de los nucleótidos son ácido desoxirribonucleico . En algunas modalidades, el aptámero de la invención es ácido desoxirribonucleico, particularmente ácido desoxirribonucleico monocatenario. En algunas modalidades de la invención, al menos 14, preferiblemente al menos 16, con mayor preferencia al menos 18 nucleótidos son desoxinucleótidos. En una modalidad particular, el aptámero comprende la secuencia de ácido desoxinucleico y TAGGTTGGGT AGGGTGGT . En algunas modalidades, los aptámeros de la invención comprenden al menos una modificación química, particularmente una modificación química seleccionada a partir del grupo que comprende: una sustitución química en una posición azúcar; una sustitución química en una posición fosfato y una posición química en una posición base de un ácido nucleico. En algunas modalidades, la modificación química no da como resultado una modificación 5-bromodesoxiuridina en la mayoría de los residuos uridina o timidina del aptámero. En algunas modalidades, la modificación se selecciona a partir de una grupo que comprende: incorporación de un nucleótido modificado, remate o finalización en el extremo 3' y conjugación con un compuesto no inmunogénico de elevado peso molecular, conjugación con un compuesto lipofílico, particularmente en donde el compuesto no inmunogénico de elevado peso molecular es un polialquilenglicol, particularmente un polietilenglicol. En algunas modalidades, los aptámeros anti trombina anteriormente descritos de la invención, como por ejemplo ARC2172, disminuyen o inhiben la coagulación en sangre estática, particularmente durante al menos aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente, mas particularmente durante al menos aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente una concentración de 5 µM. En algunas modalidades, se proporciona un método que comprende administrar un aptámero anti trombina de la invención a un paciente, particularmente un paciente humano o en un circuito extra corpóreo, en una cantidad efectiva para disminuir o inhibir la coagulación mediada por trombina en el paciente. En algunas modalidades, se proporciona una composición que comprende un aptámero anti trombina de la invención o una de sus sales en una cantidad efectiva para disminuir o inhibir la coagulación mediada por trombina en un paciente y un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, el aptámero anti trombina comprendido en la composición de la invención es ARC2172 (SEQ ID NO 294) . Se proporciona un método que comprende en administrar la composición de la invención a un paciente, particularmente a un paciente humano que lo necesita. En algunas modalidades, el paciente humano tiene disfunción renal y el aptámero anti trombina de la invención administrada en el método de la invención no está conjugado a PEG. En algunas modalidades, el paciente humano al cual se le administra el aptámero en los métodos de invención tiene trombocitopenia inducida por heparina, es resistente a la heparina y/o tiene función hepática disminuida. En algunas modalidades del método de la invención, el aptámero anti trombina de la invención se • administra al paciente, particularmente a un paciente humano, antes, durante, después o cualquiera de estos, de un procedimiento quirúrgico en el paciente. En algunas modalidades el procedimiento quirúrgico en cirugía cardiaca. En algunas modalidades, el procedimiento quirúrgico se selecciona a partir de un grupo que comprende cirugía de derivación o desvío cardiopulmonar, cirugía de injerto de derivación o de desvío de arterias coronarias, intervención coronaria percutánea, angioplastia, cirugía endovascular y cirugía abierta vascular periférica y cardiovascular, cirugía para colocación de estricador vascular, cirugía de reemplazo de válvulas cardiacas, cirugía para el tratamiento contra enfermedad coronaria y/o enfermedad vascular en venas o arterias y cirugía para el tratamiento contra enfermedad oclusiva de arterias periféricas. En algunas modalidades de los métodos de la invención, el aptámero anti trombina es ARC2172 (SEQ ID NO 294) . En una modalidad particular de los métodos de la invención, el aptámero es ARC2172 y el procedimiento quirúrgico es cirugía de injerto de' derivación o desvío de arterias coronarias. En otra modalidad particular de los métodos de la invención, el aptámero de la invención es ARC2172, y el procedimiento quirúrgico es cirugía de derivación cardiopulmonar y se utiliza un circuito abierto unido sin heparina durante la cirugía. En otra modalidad particular de los métodos de la invención, el aptámero es ARC2172 (SEQ ID NO 294) y el procedimiento quirúrgico es intervención coronaria percutánea.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una representación esquemática de un proceso de selección (SELEX™) de aptámero in vi tro de grupos de secuencias oligonucleotídicas aleatorias. La Figura 2 es una ilustración de un PEG ramificado de 40 kDa. La Figura 3 es una ilustración de un PEG ramificado de un 40 kDa unido al extremo 5' de un aptámero. La Figura 4 es una ilustración que muestra diversas estrategias de PEGilación que representan una mono-PEGilación convencional, PEGilación múltiple y dimerización vía PEGilación. La Figura 5 muestra las estructuras secundarias pronosticadas para aptámeros de trombina ARC2169 (SEQ ID NO 283), ARC2171 (SEQ ID NO 293) y ARC2172 (SEQ ID NO 294). La Figura 6 es un gráfico que muestra las curvas de unión para ARC2172 (SEQ ID NO 294) y ARC183 a trombina de humano, como se cuantifica utilizando la valoración de unión a filtro de nitrocelulosa. La Figura 7 es un gráfico que muestra las curvas de unión para ARC2172 (SEQ ID NO 294) a trombina de humano, cerdo y rata, como se cuantifica utilizando la valoración de unión a filtro de nitrocelulosa. La Figura 8 es un gráfico que muestra una comparación de los efectos de ARC2172 (SEQ ED NO 294) y ARC183 sobre los efectos del tiempo de protrombina (PT) como se valora in vi tro utilizando plasma humano cifrado. La Figura 9 es un gráfico que muestra una comparación de los efectos de ARC2172 (SEQ ID NO 294) y ARC183 con respecto al tiempo de coagulación activada (ACT) como se valora in vi tro utilizando sangre completa de humano. La Figura 10 es un gráfico que muestra una comparación de los efectos de ARC2172 (SEQ ID NO 294) y ARC183 sobre tiempo de tromboplastina parcial activado (aPTT) como se valora in vi tro utilizado plasma humano. La Figura 11 es un gráfico que muestra una comparación de los efectos de ARC2172 y ARC183 sobre la coagulación de sangre estática, en una valoración utilizando sangre completa de humano. La Figura 12 es una tabla que muestra un diseño de estudio experimental para Estudios de Bolo IV de aptámeros antitrombina, como se describe en el Ejemplo 4A. La Figura 13 es un gráfico que muestra una comparación de los efectos de grupos PEG de diferentes tamaños unidos a ARC2172 (SEQ ID NO 294) en tiempo de coagulación activada (ACT) en ratas que reciben aptámero por medio de inyección en Bolo IV a 1.5 µmol/kg. La Figura 14 es una tabla que muestra el diseño experimental para un estudio de Bolo IV de aptámeros antitrombina, que se describe en el Ejemplo 4B.
La Figura 15 es un gráfico que muestra una comparación de los efectos de ARC2172 (SEQ ID NO 294) y ARC
186 con respecto al tiempo de coagulación activada (ACT) en ratas que reciben aptámero mediante inyección en Bolo IV a 12.2 mg/kg (ARC2172 (SEQ ID NO 294) ) o 30 mg/kg (ARC183). La Figura 16 es una tabla que resume los efectos de ARC2172 (SEQ ID NO 294) y ARC186 en el tiempo de coagulación activada (ACT) en ratas que reciben aptámero mediante inyección en Bolo IV a 12.2 mg/kg (ARC2172 (SEQ ID NO 294) ) y 30 mg/kg (ARC183) . La Figura 17 es una tabla que muestra el diseño de estudio experimental de aptámeros antitrombina en un modelo de ligamiento renal en rata, que se describe en el Ejemplo 4C. La Figura 18 es un gráfico que muestra una comparación del efecto de ARC2172 (SEQ ID NO 294) con respecto al tiempo de coagulación activada (ACT) en ratas tanto renalmente ligadas como con cirugía simulada cuando se les administra una inyección en Bolo vía IV a 12.2 mg/kg (ARC2172 (SEQ ID NO 294) ) . La Figura 19 es un gráfico que muestra una comparación del efecto de ARC183 con respecto al tiempo de coagulación activada (ACT) en ratas tanto renalmente ligadas como con cirugía simulada cuando se les administra una inyección en Bolo vía IV a 30 mg/kg (ARC183) . La Figura 20 es una tabla que resume los efectos de aptámeros antitrombina ARC2172 (SEQ ID NO 294) , ARC2949 (SEQ ID NO 434), ARC2169 (SEQ ID NO 283) y ARC2840 (SEQ ID NO 423) con respecto al tiempo de coagulación activada (ACT) en monos cinomolgos que recibieron el aptámero mediante inyección en Bolo IV a 0.46 µmol/kg. La Figura 21 es un gráfico que muestra una comparación de los efectos de aptámeros antitrombina ARC2172 (SEQ ID NO 294) ,
ARC2949 (SEQ ID NO 434), ARC2169 (SEQ ID NO 283) y ARC2840
(SEQ ID NO 423) con respecto al tiempo de coagulación activada (ACT) en monos cinomolgos que recibieron el aptámero mediante inyección en Bolo IV a 0.46 µmol/kg. La Figura 22 es una tabla que muestra el diseño de estudio experimental para un estudio de infusión de aptámeros antitrombina además de inyección en Bolo IV en primate, como se describe en el Ejemplo 4E. La Figura 23 es un gráfico que muestra una comparación de los efectos de ARC2172 (SEQ ID NO 294) (en dos dosis) y ARC183 con respecto al tiempo de coagulación activada (ACT) en monos cinomolgos cuando se les administra mediante un Bolo IV individual seguido de una infusión continua durante una hora.
La Figura 24 es una tabla que resume los efectos de
ARC2172 (SEQ ID NO 294) (en dos dosis) y ARC183 con respecto al tiempo de coagulación activa (ACT) en monos cinomolgos cuando se les administra mediante Bolo IV individual seguido de una infusión continua durante una hora.
La Figura 25 es un gráfico que compara el efecto de ARC2172 (SEQ ID NO 294) 3 con respecto a la agregación plaquetaria inducida por trombina y agregación plaquetaria inducida por ADP. La Figura 26 es un gráfico que compara el efecto de ARC2172 (SEQ ID NO 294) sobre aspirina e inhibición dependiente de integrilina de la agregación plaquetaria. La Figura 27 es una tabla que muestra el diseño experimental de estudio de ARC2172 (SEQ ID NO 294) y heparina en un modelo de derivación cardiopulmonar en porcino, como se describe en el Ejemplo 5A. La Figura 28 es una descripción del protocolo del estudio de derivación cardiopulmonar en porcino. La Figura 29 es un gráfico que muestra el tiempo de coagulación activada (ACT) en animales testigo (sin tratamiento anticoagulante) utilizado en el estudio abierto de derivación cardiopulmonar en porcino sin unión a heparina que se describe en el Ejemplo 5A. La Figura 30 es un gráfico que muestra el tiempo de coagulación activada (ACT) en cerdos que recibieron heparina por medio de inyección en Bolo IV para mantener ACT >400 segundos en el estudio abierto de derivación cardiopulmonar sin unión a heparina, que se describe en el Ejemplo 5A. La Figura 31 es un gráfico que muestra el tiempo de coagulación activada (ACT) en cerdos que recibieron ARC2172 (SEQ ID NO 294) mediante un Bolo IV e infusión para mantener ACT >400 segundos en el estudio abierto de derivación cardiopulmonar sin unión a heparina, que se describe en el Ejemplo 5A. La Figura 32 es un gráfico que muestra una comparación entre el efecto de heparina y ARC2172 (SEQ ID NO 294), con respecto al tiempo de coagulación activada (ACT) (gráfica de segundos sobre el eje vertical) en el modelo de derivación cardiopulmonar utilizando circuitos abiertos de derivación no unidos a heparina, como se describe en el Ejemplo 5A. La Figura 33 es un gráfico que muestra la concentración de complejos TAT plasmáticos en los animales testigo (sin tratamiento anticoagulante) utilizado en el estudio abierto de derivación cardiopulmonar en porcino no unido a heparina, que se describe en el Ejemplo 5A. La Figura 34 es un gráfico que muestra la concentración de complejos TAT plasmáticos en cerdos que recibieron heparina mediante inyección en Bolo IV para mantener ACT >400 segundos en el estudio abierto de derivación cardiopulmonar no unido a heparina, que se describe en el Ejemplo 5A. La Figura 35 es un gráfico que muestra la concentración de complejos TAT plasmáticos en cerdos que recibieron ARC2172 (SEQ ID NO 294) mediante inyección en Bolo IV e infusión para mantener ACT>400 segundos en el estudio de derivación cardiopulmonar abierta no unido a heparina, que se describe en el Ejemplo 5A.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En la siguiente descripción acompañante se exponen los detalles de una o más modalidades de una invención. Aunque se pueden utilizar en la práctica o pruebas de la presente invención cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos aquí, ahora se describen los métodos y materiales preferidos. A partir de la descripción serán evidentes otras características, objetivos y ventajas de la invención. En la especificación, las formas singulares también incluyen las plurales a menos que el contexto claramente indique otra cosa. A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que el entendido por el experto en la técnica a la cual pertenece la invención. En caso de que haya conflicto, tendrá preferencia la presente Especificación.
Método SELEX™ Un método adecuado para generar un aptámero es mediante el proceso titulado "Evolución Sistemática de Ligandos mediante Enriquecimiento Exponencial" ("SELEX™" por sus siglas en inglés) que se muestra de manera general en la Figura 1. El proceso SELEX™ es un método para la evolución in vi tro de moléculas de ácidos nucleicos con una unión altamente específica a moléculas objetivo y se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente de EE.UU. No. 07/536,428, presentada el 11 de junio de 1990, ahora abandonada, patente de EE.UU. No. 5,475,096 titulada' "Nucleic Acid Ligands" (ligandos de ácidos nucleicos) y patente de EE.UU. No.5, 270, 163 (ver también WO 91/19813) titulada "Nucleic Acid Ligands". Se considera que los aptámeros tienen una unión de elevada especificidad a moléculas objetivo, por ejemplo, debido a que un aptámero comprende una afinidad de unión para el objetivo en órdenes de magnitud mayores que la afinidad de unión que el grupo inicial o biblioteca de ácidos nucleicos iniciales que no se ha expuesto previamente al objetivo. Cada ligando de ácido nucleico identificado mediante el método SELEX™, es decir, cada aptámero, es un ligando específico de una molécula o compuesto objetivo determinado. El proceso SELEX™ está basado en la apreciación exclusiva de que los ácidos nucleicos tienen la capacidad suficiente para formar una variedad de estructuras bi y tridimensionales y la suficiente versatilidad química disponible dentro de sus monómeros para actuar como ligandos (es decir, para formar pares de unión específicos) virtualmente con cualquier compuesto químico, ya sea monomérico o polimérico. Las moléculas de cualquier tamaño o composición pueden servir como objetivos. SELEX™ es un punto de inicio con respecto a una gran genoteca o grupo de oligonucleótidos monocatenarios que comprenden secuencias aleatorizadas . Los oligonucleótidos pueden ser ADN, ARN o híbridos de ADN/ARN modificados o sin modificar. En algunos ejemplos, el grupo comprende oligonucleótidos 100% aleatorios o parcialmente aleatorios. En otros ejemplos, el grupo comprende oligonucleótidos aleatorios o parcialmente aleatorios que contienen al menos una secuencia fija y/o una secuencia conservada que se incorpora dentro de la secuencia aleatorizada . En otros ejemplos, el grupo comprende oligonucleótidos aleatorios o parcialmente aleatorios que comprenden al menos una secuencia fija y/o una secuencia conservada en su extremo 5' y/o 3' que puede comprender una secuencia compartida por todas las moléculas del grupo de oligonucleótidos. Las secuencias fijas son secuencias comunes para los oligonucleótidos en el grupo que se incorporan para un propósito preseleccionado tal como motivos CpG o pequeños elementos estructurales reconocibles en varias proteínas que se describen a continuación, sitios de hibridación para cebadores PCR, secuencias promotoras para ARN polimerasas (por ejemplo, T3, T4, T7, y SP6) , sitios de restricción o secuencias homopoliméricas tales como segmentos poli A o poli T, núcleos catalíticos, secuencias o sitios para unión selectiva a columnas de afinidad y otras secuencias para facilitar la clonación y/o secuenciación de un oligonucleótido de interés. Las secuencias conservadas, distintas a las secuencias fijas previamente descritas, están compartidas por una variedad de aptámeros que se unen al mismo objetivo. Preferentemente, los oligonucleótidos del grupo incluyen una porción de secuencia aleatorizada así como secuencias fijas necesarias para una eficiente amplificación. Normalmente, los oligonucleótidos del grupo inicial contienen secuencias terminales fijas en los extremos 5' y 3' que flanquean una región interna de 30-50 nucleótidos aleatorios. Los nucleótidos aleatorizados pueden producirse en una variedad de formas incluyendo síntesis química y selección por tamaños a partir de ácidos nucleicos celulares aleatoreamente separados. La variación de secuencias en ácidos nucleicos de prueba también puede introducirse o ser aumentada mediante mutagénesis antes o durante las iteraciones de selección / amplificación. La porción de secuencia aleatoria del oligonucleótido puede tener cualquier longitud y puede comprender ribonucleótidos y/o desoxirribonucleótidos, y puede incluir nucleótidos modificados o no naturales o análogos de nucleótidos. Ver, por ejemplo, patente de EE.UU. No. 5,958,691; patente de EE.UU. No. 5,660,985; patente de EE.UU. No. 5,958,691; patente de EE.UU. No. 5,698,687; patente de EE.UU. No. 5,817,635; patente de EE.UU. No. 5,672,695 y publicación PCT WO 92/07065. Los oligonucleótidos aleatorios pueden sintetizarse a partir de nucleótidos ligados a fosfodiéster utilizando técnicas de síntesis de oligonucléotidos en fases sólida que se conocen. Ver, por ejemplo, Froehler et al . , Nucí. Acid Res. 14:5399-5467 (1986) y Froehler et al . , Tet. Lett. 27:5575-5578 (1986). Los oligonuclétodios aleatorios pueden también sintetizarse utilizando métodos de fase de solución, tales como los métodos de síntesis de triéster. Ver, por ejemplo, Sood et al . , Nucí. Acid. Res. 4:2557 (1977) y Hirose et al . , Tet. Lett., 28:2449 (1978). La síntesis típica que se lleva a cabo es un equipo automatizado para síntesis de ADN proporciona 1014 -1016 de moléculas individuales, cantidad suficiente para la mayoría de los experimentos SELEX™. Las regiones suficientemente grandes de secuencia aleatoria en el diseño de la secuencia aumentan la probabilidad de que cada molécula sintetizada pueda representar una secuencia exclusiva. La biblioteca de inicio de oligonucleótidos puede generarse mediante síntesis química automatizada en un sintetizador de ADN. Para sintetizar las secuencias aleatorizadas, se agregan mezclas de los cuatro nucleótidos en cada paso de adición de nucleótidos durante el proceso de síntesis, lo que permite una incorporación aleatoria de nucleótidos. Como se indica anteriormente, en una modalidad, los oligonucleótidos o nucleótidos aleatorios comprenden secuencias completamente aleatorias, sin embargo, en otras modalidades, los oligonucleótidos aleatorios pueden comprender tramos de secuencias no aleatorias o parcialmente aleatorias. Las secuencias parcialmente aleatorias pueden crearse al agregar los cuatro nucleótidos en- diferentes proporciones molares en cada paso de adición. La biblioteca de inicio de oligonucleótidos puede ser ya sea ARN o ADN. En aquellos casos en donde se utilice una biblioteca ARN como la biblioteca de inicio, se genera normalmente mediante la transcripción de una genoteca ADN in vi tro utilizando T7 ARN polimerasa o T7 ARN polimerasas modificadas y luego se purifican. La biblioteca ARN o ADN se mezcla entonces con el objetivo en condiciones favorables para su unión y se somete a iteraciones graduales de unión, partición o escisión y amplificación, utilizando el mismo esquema de selección general, para lograr virtualmente cualquier criterio deseado de afinidad de unión y selectividad. Más específicamente, al iniciar con una mezcla que contiene la mezcla inicial de ácidos nucleicos, el método SELEX™ incluye los pasos de: (a) poner en contacto la mezcla con el objetivo bajo condiciones favorables de unión; (b) separar ácidos nucleicos no unidos de los ácidos nucleicos que se han unido específicamente a las moléculas objetivo; (c) disociar los complejos ácido nucleico-objetivo; (d) amplificar los ácidos nucleicos disociados de los complejos ácido nucleico-objetivo para producir una mezcla enriquecida de ligandos de ácidos nucleicos; y (e) reiterar los ácidos nucleicos de unión, escisión, disociación y amplificación a través de tanto ciclos como sean deseados para producir ligandos de ácidos nucleicos altamente específicos y con elevada afinidad hacia la molécula objetivo. En aquellos casos en donde se están seleccionando los aptámeros ARN, el método SELEX™ comprende los pasos de: (i) transcripción inversa de ácidos nucleicos disociados de los complejos de ácido nucleico-objetivo antes de la amplificación en el paso (d) ; y (ii) transcribir los ácidos nucleicos amplificados del paso (d) antes de comenzar nuevamente el proceso. Dentro de una mezcla de ácidos nucleicos que contiene una gran cantidad de posibles secuencias y estructuras, hay una amplia gama de afinidades de unión para un objetivo determinado. Por ejemplo, una mezcla de ácidos nucleicos que comprende un segmento aleatorizado de 20 nucleótidos, puede tener 420 de posibilidades candidatas. Aquellos que tienen las constantes de afinidad más elevadas para el objetivo tienen la mayor probabilidad de unirse al objetivo. Luego de la separación, disociación y amplificación, se genera una segunda mezcla de ácidos nucleicos, enriquecida para los candidatos con mayor afinidad de unión. Las rondas adicionales de selección favorecen progresivamente los mejores ligandos hasta que la mezcla resultante de ácidos nucleicos está predominantemente compuesta solo de una o unas cuantas secuencias. Luego se pueden clonar, secuenciar y analizar individualmente para determinar su afinidad de unión como ligandos puntos o aptámeros. Los ciclos de selección y amplificación se repiten hasta que se logra el objetivo deseado. En el caso más general, la selección/amplificación continua hasta que no se logra una mejoría significativa en cuanto a la fuerza de unión al repetir el ciclo. Normalmente el método se utiliza para una muestra aproximada de 1014 de diferentes especies de ácidos nucleicos pero puede utilizarse para muestrear tantas como aproximadamente 1018 diferentes especies de ácidos nucleicos. En términos generales, las moléculas de aptámero de ácidos nucleicos se seleccionan en un procedimiento de 5 a 20 ciclos. En una modalidad, la heterogeneidad se introduce solamente en las etapas iniciales de selección y no ocurre durante el proceso de replicación. En una modalidad de SELEX™, el proceso de selección es tan eficiente para aislar aquellos ligandos de ácidos nucleicos que se unen con más fuerza al objetivo seleccionado, que solo se requiere de un ciclo de selección y amplificación. Por ejemplo, ésta selección eficiente puede ocurrir en un proceso de tipo cromatográfico en donde la habilidad de los ácidos nucleicos para asociarse con objetivos unidos a una columna opera de tal forma que la columna es suficientemente capaz para permitir la separación y aislamiento de los ligandos de ácidos nucleicos con la más elevada afinidad. En varios casos, no necesariamente se desea llevar a cabo pasos iterativos de SELEX™ hasta que se identifique un solo ligando de ácidos nucleicos. La solución de ligandos de ácidos nucleicos altamente específicos para un objetivo puede incluir una familia de estructuras o motivos de ácidos nucleicos que tengan una variedad de secuencias conservadas y una variedad de secuencias que puedan sustituirse o agregarse sin afectar de manera significativa la afinidad de los ligandos de ácidos nucleicos hacia el objetivo. Al finalizar el proceso SELEX™ antes de completarse, es posible determinar la secuencia de una variedad de miembros de la familia de soluciones de ligandos de ácidos nucleicos. Se sabe que existen una variedad de estructuras primarias, secundarias y terciarias de ácidos nucleicos. Las estructuras o motivos que han demostrado estar más comúnmente involucradas en las iteraciones no de tipo Watsori-Crick se refieren como asas horquilladas, protuberancias simétricas y asimétricas, pseudonudos y una miríada de combinaciones de los mismos. Casi todos los casos conocidos de estos motivos sugieren que estos pueden formarse en una secuencia de ácidos nucleicos no mayor a 30 nucleótidos. Debido a esto, se prefiere comúnmente que se inicien procedimientos SELEX™ con segmentos aleatorizados contiguos con secuencias de ácidos nucleicos que contengan un segmento aleatorizado entre aproximadamente 20 a 50 nucleótidos y en algunas modalidades, de aproximadamente 30 hasta aproximadamente 40 'nucleótidos. En un ejemplo, la secuencia fija 5 ' -fija : aleatoria : 3 ' comprende una secuencia aleatoria de aproximadamente 30 hasta aproximadamente 50 nucleótidos. El fundamento del método SELEX™ se ha modificado para lograr una variedad de objetivos específicos. Por ejemplo, la Patente de EE.UU. No. 5,707,796 describe el uso de SELEX™ en combinación con electroforesis en gel para seleccionar moléculas de ácidos nucleicos con características estructurales específicas, tales como ADN curvo. La Patente de EE.UU. No. 5,763,177 describe métodos basados en SELEX™ para seleccionar ligandos de ácidos nucleicos que contienen grupos fotorreactivos capaces de unirse y/o fotorreticularse y/o fotoinactivar una molécula objetivo. La Patente de EE.UU. No. 5,567,588 y la Patente de EE.UU. No. 5,861,254 describe métodos basados en SELEX™ que logran una separación muy eficiente entre oligonucleótidos que tienen una elevada afinidad y una baja afinidad para una molécula objetivo. La Patente EE.UU. No. 5,496,938 describe métodos para obtener ligandos mejorados de ácidos nucleicos luego de haberse llevado a cabo un proceso SELEX™. La Patente de EE.UU. No. 5,705,337 describe métodos para unir covalentemente un ligando con su objetivo. El método SELEX™ también puede utilizarse para obtener ligandos de ácidos nucleicos que se unen a más de un sitio en una molécula objetivo y para obtener ligandos de ácidos nucleicos que incluyan especies que no son ácidos nucleicos y que se unan a sitios específicos en el objetivo.
SELEX™ proporciona medios para aislar e identificar ligandos de ácidos nucleicos que se unen a un objetivo visualizable, incluyendo biomoléculas grandes y pequeñas tales como proteínas de unión al ácido nucleico y proteínas que se sabe no se unen a ácidos nucleicos como parte de su función biológica así como cofactores y otras pequeñas moléculas. Por ejemplo, la Patente de EE.UU. No. 5,580,737 describe secuencias de ácidos nucleicos identificadas mediante SELEX™ que son capaces de unirse con una elevada afinidad a la cafeína y su análogo muy relacionado, teofilina. Contra-SELEX™ es un método para mejorar la especificidad de ligandos de ácidos nucleicos hacia una molécula objetivo mediante la eliminación de secuencias de ligandos de ácidos nucleicos con reactividad cruzada hacia una o más moléculas .que no son objetivo. El contra-SELEX™ comprende los pasos de (a) preparar una mezcla candidata de ácidos nucleicos; (b) poner en contacto la mezcla candidata con el objetivo, en donde los ácidos nucleicos tienen una afinidad aumentada hacia el objetivo en relación con la mezcla candidata que puede separarse del resto de la mezcla candidata; (c) separar los ácidos nucleicos con afinidad aumentada del resto de la muestra candidata; (d) disociar los ácidos nucleicos con afinidad aumentada del objetivo; (e) poner en contacto los ácidos nucleicos con afinidad aumentada con una o más moléculas no objetivo de manera que se eliminen los ligandos de ácidos nucleicos con una afinidad altamente específica hacia las moléculas no objetivo; y (f) amplificar los ácidos nucleicos con una afinidad altamente específica solo hacia la molécula objetivo para producir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida para secuencias de ácidos nucleicos con una afinidad y especificidad relativamente mayores para unirse a la molécula objetivo. Como se describe anteriormente para SELEX™, se repiten según sea necesario los ciclos de selección y amplificación hasta que se logre el objetivo deseado. Un problema potencial encontrado durante el uso de ácidos nucleicos como agentes terapéuticos y de vacuna, es que los oligonucleótidos en su forma fosfodiéster pueden degradarse rápidamente en fluidos corporales mediante enzimas intracelulares y extracelulares tales como endonucleasas y exonucleasas antes de que se manifieste el efecto deseado. De esta forma, el método SELEX™ abarca la identificación de ligandos de ácidos nucleicos de alta afinidad que contienen nucleótidos modificados que confieren características mejoradas al ligando, tal como una estabilidad in vivo mejorada o características mejoradas de administración. Los ejemplos de estas modificaciones incluyen las sustituciones químicas en las posiciones de ribosa y/o fosfato y/o de bases. Los ligandos de ácidos nucleicos identificados mediante SELEX™ que contienen nucleótidos modificados se describen, por ejemplo en la Patente de EE.UU. No. 5,660,985, que describe lo oligonucleótidos que contienen derivados nucleotídicos químicamente modificados en la posición 2 ' de ribosa, composición 5 de pirimidinas y posición 8 de purinas, Patente de EE.UU. No. 5,756,703 que describe los oligonucleótidos que contienen varias pirimidinas 2'-modificadas y la Patente de EE.UU. No. 5,580,737 que describe los ligandos de ácidos nucleicos altamente específicos que contienen uno o más nucleótidos modificados con sustitutos 2'-amino (2'-NH2), 2 '-fluoro (2'-F), y/o 2 ' -O-metilo (2 '-OMe). Las modificaciones de ligandos de ácidos nucleicos contempladas en la invención incluye, entre otras, aquellas que proporciona otros grupos químicos que incorporan una carga adicional, polarizabilidad, hidrofobicidad, unión a hidrógeno, interacción electrostática y fluxionalidad a las bases del ligando de ácido nucleico o ligando de ácidos nucleico considerado como un todo. Las modificaciones para mejorar poblaciones oligonucleotídicas resistentes a nucleasas también pueden incluir uno o más enlaces internucleotídicos sustitutos, azúcares alteradas, bases alteradas o combinaciones de éstos. Estas modificaciones incluyen, entre otras, modificaciones de azúcar en -2 ' -posición, modificaciones de pirimidina en posición5-, modificaciones de purina en posición -8, modificaciones en aminas exocíclicas, sustitución de 4-tiouridina, sustitución de 5-bromo o 5-yodo/uracilo; modificaciones en la estructura principal, modificaciones en fosforotioato o alquil fosfato, metilaciones y combinaciones inusuales de apareamiento de bases tales como las isobases isocitidina e isoguanosina. Las modificaciones también pueden incluir modificaciones en los extremos 3' -y 5' tal vez como finalización o rematado. En una modalidad, se proporcionan oligonucleótidos en donde el grupo P(0)0 está reemplazado por P(0)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato") , P(0)NR2 ("amidato"), P(0)R, P(0)OR', CO o CH2 ("formacetalo") o 3 ' -amino (-NH-CH2-CH2-) , en donde cada R o R' es indistintamente H o alquilo sustituido o no sustituido. Los grupos de enlace pueden unirse a nucleótidos adyacentes mediante un enlace -O-, -N-, o -S-. No se requiere que todos los enlaces sean idénticos. Como se utiliza aquí, el término "fosforotioato" abarca uno o más átomos de oxígeno no formadores de puente en un enlace fosfodiéster reemplazado por uno o más átomos de azufre. En otras modalidades, los oligonucleótidos comprenden grupos de azúcar modificados, por ejemplo, uno o más grupos hidroxilo se reemplazan con halógeno, grupos alifáticos o se funcionalizan como éteres o aminas. En una modalidad, la posición -2' del residuo furanosa se sustituye por cualquiera de O-metilo, O-alquilo, O-alilo, S-alquilo, S-alilo o grupo halo. Los métodos de síntesis de azúcares 2'-modificadas se describen, por ejemplo, en Sproat, et al, Nucí.
Acid Res. 19:733- 738 (1991); Cotten, et al., Nucí. Acid Res. 19:2629-2635 (1991); y Hobbs, et al, Biochemistry 12:5138-5145 (1973). El experto en la técnica conoce otras modificaciones. Estas modificaciones pueden ser modificaciones de procesos pre-SELEX™ o modificaciones de procesos pos-SELEX™ (modificación de ligandos no modificados previamente identificados) o pueden llevarse a cabo mediante la incorporación en un proceso SELEX™. Las modificaciones en los procesos pre-SELEX™ son aquellas llevadas a cabo mediante la incorporación en los procesos SELEX™ que producen ligandos de ácidos nucleicos tanto con una elevada especificidad para el objetivo SELEX™ como una estabilidad mejorada, por ejemplo, una estabilidad in vivo . Las modificaciones de los procesos post-SELEX™ llevados a cabo a ligandos de ácidos nucleicos puede dar como resultado una estabilidad mejorada, por ejemplo, una estabilidad in vivo sin afectar adversamente la capacidad de unión del ligando de ácido nucleico. El método SELEX™ abarca la combinación de oligonucleótidos seleccionados con otros oligonucleótidos seleccionados y unidades funcionales no oligonucleotídicas como se describen en la Patente de EE.UU. No. 5,637,459 y Patente de EE.UU. No. 5,683,867. El método SELEX™ además abarca la combinación de ácidos nucleicos seleccionados con compuestos lipófilos o no inmunogénicos de elevado peso molecular en un complejo terapéutico o de diagnóstico, como se describe, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. No. 6,011,020, la Patente de EE.UU. No. 6,051,698 y la Publicación PCT No. WO 98/18480. Estas patentes y solicitudes muestran la combinación de una amplia gama de formas y otras propiedades, con eficientes propiedades de amplificación y replicación de oligonucleótidos y con propiedades deseables de otras moléculas. La identificación de ácidos nucleicos a pequeños péptidos flexibles mediante el método SELEX™ también se ha explorado. Los pequeños péptidos tienen estructuras flexibles y usualmente existen en solución en un equilibrio de múltiples conformadores y por lo tanto inicialmente se pensaba que las afinidades de unión pueden estar limitadas por la entropía conformacional que se pierde al unirse con un péptido flexible. Sin embargo, se demostró lo factible que es identificar ligandos de ácidos nucleicos a pequeños péptidos en solución, en la Patente de EE.UU. No. 5,648,214. En esta patente, se identificaron ligandos de ácidos nucleicos ARN de elevada afinidad a sustancia P, un péptido de 11 aminoácidos. Los aptámeros con elevada especificidad y afinidad de unión a los objetivos de la presente invención normalmente se seleccionan mediante el proceso SELEX™ descrito aquí. Como parte del proceso SELEX™, las secuencias seleccionadas para unirse al objetivo se minimizan opcionalmente para determinar la mínima secuencia que tiene la afinidad de unión deseada. Las secuencias seleccionadas y/o las secuencias minimizadas se optimizan opcionalmente al llevar a cabo una mutagénesis aleatoria o dirigida al sitio de la secuencia para aumentar la afinidad de unión o alternativamente para determinar cuales posiciones en las secuencias son esenciales para la actividad de unión. Además, se pueden llevar a cabo las selecciones con secuencias que incorporen nucleótidos modificados para estabilizar las moléculas de aptámeros contra la degradación in vivo.
SELEX™ 2 ' Modificada A fin de que un aptámero sea adecuado para utilizarse como un agente terapéutico, es preferiblemente económico de sintetizar, seguro y estable in vivo . Los aptámeros ADN y ARN naturales normalmente no son estables in vivo debido a su susceptibilidad de degradación por nucleasas.
Se puede aumentar en gran medida la resistencia a la degradación por nucleasas mediante la incorporación de grupos modificadores en la posición-2' . Los grupos fluoro y amino se han incorporado exitosamente en mezclas oligonucleotídicas a partir de las cuales se han seleccionado subsiguientemente los aptámeros.
Sin embargo, estas modificaciones aumentan en gran medida el costo de síntesis del aptámero resultante y puede introducir preocupaciones sobre seguridad en algunos casos debido a la posibilidad de que los nucleótidos modificados pudieran reciclarse en un ADN hospedero mediante la degradación de oligonucleótidos modificados y el uso subsiguiente de los nucleótidos como sustratos para la síntesis de ADN. Los aptámeros que contienen nucleótidos 2'-0-metilo ("2 '-OMe"), como se proporcionan aquí, resuelven varios de estos inconvenientes. Los oligonucleótidos que contienen nucleótidos 2' -OMe son resistentes a nucleasa y económicos de sintetizar. Aunque los nucleótidos 2' -OMe son ubicuos en los sistemas biológicos, las polimerasas naturales no aceptan los NTP de 2' -OMe como sustratos bajo condiciones fisiológicas, por lo tanto no hay preocupaciones sobre seguridad con respecto al reciclamiento de nucleótidos 2' -OMe en un ADN hospedero. El método SELEX™ utilizado para generar aptámeros 2' -modificados se describe, por ejemplo, en la solicitud provisional de patente de EE.UU. No. de serie 60/430,761, presentada el 3 de diciembre de 2002, la solicitud provisional de patente de EE.UU. No. de serie 60/487,474, presentada el 15 de julio de 2003, solicitud provisional de patente de EE.UU. No. de serie 60/517,039, presentada el 4 de noviembre de 2003, solicitud de patente de EE.UU. No. 10/729,581, presentada el 3 de diciembre de 2003 y solicitud de patente de EE.UU. No. 10/873,856, presentada el 21 de julio de 2004, titulada "Method for in vi tro Selection of 2 ' -O-methyl Substituted Nucleic Acids", (Método para Selección in vi tro de Ácidos Nucleicos 2'-0-metilo Sustituidos), cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad. La presente invención incluye aptámeros que se unen y disminuyen o inhiben la función de trombina que contiene nucleótidos modificados (por ejemplo, nucleótidos que tienen una modificación en la posición 2' ) para hacer el oligonucleótido más estable que el oligonucleótido no modificado a la degradación enzimática y química así como a la degradación térmica y física. Aunque hay varios ejemplos de aptámeros que contienen 2' -OMe en la literatura (ver, por ejemplo, Green et al., Current Biology 2, 683-695, 1995), estos fueron generados' mediante la selección in vi tro de bibliotecas de transcriptos modificados en donde los residuos C y U fueron sustituidos en 2' -fluoro (2'-F) y los residuos A y G fueron 2' -OH. Una vez que se identificaron las secuencias funcionales, cada residuo A y G fue analizado para determinar la tolerancia a una sustitución 2' -OMe y el aptámero fue sintetizado nuevamente con todos los residuos A y G que toleran la sustitución 2' -OMe como residuos 2' -OMe. La mayoría de los residuos A y G de aptámeros generados en esta forma en dos etapas toleran la sustitución con residuos 2' -OMe, aunque en promedio, aproximadamente un 20% no lo hacen. En consecuencia, los aptámeros generados utilizando este método tienden a contener de dos a cuatro residuos 2' -OH y como resultado se compromete la estabilidad y costo de síntesis. Al incorporar nucleótidos modificados en la reacción de transcripción que genera oligonucleótidos estabilizados utilizados en las mezclas oligonucleotídicas de las cuales se seleccionan los aptámeros y se enriquecen mediante SELEX™ (y/o cualquiera de sus variaciones y mejoramientos, incluyendo aquellos descritos aquí) , los métodos de la presente invención eliminan la necesidad de estabilizar los oligonucleótidos de aptámeros seleccionados (por ejemplo, mediante la resintetización de oligonucleótidos de aptámero con nucleótidos modificados). En una modalidad, la presente invención proporciona aptámeros que comprenden combinaciones de modificaciones de 2' -OH, 2'-F, 2'-desoxy y 2' -OMe de los nucleótidos ATP, GTP, CTP, TTP, y UTP. En otra modalidad, la presente invención proporciona aptámeros que comprenden combinaciones de modificaciones en 2' -OH, 2'-F, 2'-desoxy, 2' -OMe, 2'-NH2 y2'-metoxietilo de los nucleótidos ATP, GTP, CTP, TTP, y UTP. En otra modalidad, la presente invención proporciona aptámeros que comprenden 5~6 de modificaciones de 2' -OH, 2'-F, 2 ' -desoxy, 2 ' -OMe, 2'-NH2 y 2' -metioxetilo de nucleótidos ATP, GTP, CTP, TTP, y UTP. Los aptámeros 2' modificados de la invención se forman utilizando polimerasas, por ejemplo, T7 polimerasa modificada, que tienen una taza de incorporación de nucleótidos modificados con sustitutos voluminosos en la posición furanosa 2' que es mayor a la de las polimerasas naturales. Por ejemplo, una solo T7 polimerasa mutante (Y639F) en donde el residuo tirosina en la posición 639 ha sido cambiado a fenilalanina utiliza fácilmente 2' desoxy, 2' amino y 2' fluoro nucleótido trifosfato (NTP) como sustratos y se ha utilizado ampliamente para sintetizar ARN modificados para una variedad de aplicaciones. Sin embargo, esta T7 polimerasa mutante supuestamente no puede utilizar con facilidad (es decir, incorporar) NTP con 2' -sustitutos voluminosos tales como sustitutos 2' -OMe o 2' -azido (2'-N3). Para la incorporación de sustitutos 2' voluminosos, se ha descrito y se ha utilizado en circunstancias limitadas para incorporar NTP de pirimidina modificada, un doble mutante T7 polimerasa (Y639F/H784A) que tiene histidina en la posición 784 intercambiada por residuo alanina además de la mutación Y639F. Ver Padilla, R. and Sousa, R., Nucleic Acids Res., 2002, 30(24): 138. También se ha descrito una sola T7 polimerasa mutante (H784A) que tiene histidina en la posición 784 intercambiada por residuo alanina Padilla et al , Nucleic Acids Research, 2002, 30: 138. Durante las T7 polimerasas doblemente mutante, Y639F/H784A y de una sola mutación, H784A, el cambio a un residuo aminoacídico mas pequeño tal como alanina permite la incorporación de sustratos nucleotídicos más voluminosos, por ejemplo, nucleótidos 2' -OMe sustituidos.
En términos generales, se ha descubierto que en condiciones descritas aquí, el mutante individual Y693F puede utilizarse para la incorporación de todos los NTP sustituidos en 2' -OMe excepto GTP y el doble mutante Y639F/H784A que puede utilizar para la incorporación de todos los NTP sustituidos en 2' -OMe, incluyendo GTP. Se espera que el mutante individual H784A tenga propiedades similares a los mutantes Y639F/H784A en las condiciones descritas aquí. Los oligonucleótidos 2' -modificados pueden sintetizarse completamente a partir de nucleótidos modificados, o con un subconjunto de nucleótidos modificados. Las modificaciones pueden ser iguales o diferentes. Todos los nucleótidos pueden estar modificados, y todos pueden contener la misma modificación. Todos los nucleótidos pueden estar modificados, pero contienen diferentes modificaciones, por ejemplo, todos los nucleótidos que contienen la misma base pueden tener un tipo de modificación, mientras que los nucleótidos que contienen otras bases pueden tener diferentes tipos de modificaciones. Todos los nucleótidos de purina pueden tener un tipo de modificación (o estar sin modificar) , mientras que todos los nucleótidos pirimidina tienen otra modificación o un diferente tipo de modificación (o no están modificados) . De esta forma, los transcriptos o grupos de transcriptos se generan utilizando cualquier combinación de modificaciones, incluyendo por ejemploj ribonucleótidos (2'-OH), desoxirribonucleótidos (2' -desoxy), 2'-F y nucleótidos 2' -OMe. Una mezcla de transcripción que contiene 2' -OMe C y U y 2' -OH A y G se refiere como una mezcla "rRmY" y los aptámeros seleccionados a partir de estos se refieren como aptámeros "rRmY". Una mezcla de transcripción que contiene desoxy A y G y 2' -OMe U y C se refiere como una mezcla "dRmY" y los aptámeros seleccionados a partir de estos se refieren como aptámeros "dRmY". Una mezcla de transcripción que contiene 2' -OMe A, C y U y 2' -OH G se refiere como una mezcla "rRmY" y los aptámeros seleccionados a partir de estos se refieren como aptámeros "rGmH". Una mezcla de transcripción que alternadamente contiene 2' -OMe A, C, U y G y 2' -OMe A, U y C y 2'-F G se refiere como una "mezcla alternante" y los aptámeros seleccionados a partir de estos se refieren como aptámeros de "mezcla alternante". Una mezcla de transcripción que contiene 2' -OMe A, U, C y G, en donde hasta 10% de las G son ribonucleótidos, se refiere como una mezcla "r/mGmH" y los aptámeros seleccionados a partir de estos se refieren como aptámeros "r/mGmH". Una mezcla de transcripción que contiene 2' -OMe A, U y C y 2'-F G se refiere como una mezcla "fGmH" y los aptámeros seleccionados a partir de estos se definen como aptámeros "fGmH". Una mezcla de transcripción que contiene 2 ' -OMe A, U y C y desoxy G se refiere como una mezcla "dGmH" y los aptámeros seleccionados a partir de estos se refieren como a aptámeros "dGmH". Una mezcla de transcripción que contiene desoxy A y "2' -OMe C, G y U se refiere como una mezcla "dAmB" y los aptámeros seleccionados a partir de estos se refieren como a aptámeros "dAmB" y una mezcla de transcripción que contiene todos los nucleótidos 2' -OH se refiere como una mezcla "rN" y los aptámeros seleccionados a partir de estos se refiere como aptámeros "rN" o "rRrY". Un aptámero "mRmY" es uno que contiene todos los nucleótidos 2'-0-metilo y normalmente se deriva de un oligonucleótido r/mGmH mediante un reemplazo post-SELEX™, cuando sea posible, de cualquiera de las G de 2' -OH con las G de 2' -OMe. Una modalidad preferida incluye cualquier combinación de nucleótidos 2' -OH, 2' -desoxy y 2' -OMe. Una modalidad más preferida incluye cualquier combinación de nucleótidos 2' -desoxy y 2' -OMe. Una modalidad incluso más preferida es con cualquier combinación de nucleótidos 2 ' -desoxy y 2' -OMe en donde las pirimidinas son 2' -OMe (tales como dRmY, rnR Y o dGmH) . La incorporación de nucleótidos modificados en los aptámeros de la invención se logra antes del proceso de selección (pre-) (por ejemplo, una modificación mediante un proceso pre-SELEX™) . Opcionalmente, los aptámeros de la invención en donde los nucleótidos modificados se han incorporado mediante un proceso de modificación pre-SELEX™ pueden además modificarse mediante una modificación con un proceso post-SELEX™ (es decir, una modificación mediante proceso post-SELEX™ luego de una modificación pre-SELEX™) . Las modificaciones mediante procesos pre-SELEX™ producen ligandos de ácidos nucleicos modificados con una elevada afinidad para el objetivo SELEX™ y también una estabilidad in vivo mejorada. Las modificaciones mediante procesos post-SELEX™, es decir, modificación (por ejemplo, truncamiento, supresión, sustitución o modificaciones nucleotídicas adicionales de ligandos previamente identificados que tengan nucleótidos incorporados mediante una modificación por proceso pre-SELEX™) pueden dar como resultado un mayor mejoramiento de estabilidad in vivo sin afectar adversamente la capacidad de unión del ligando de ácido nucleico que tengan nucleótidos incorporados mediante una modificación por proceso pre-SELEX™. Para generar grupos de transcriptos ARN 2'-modificados (por ejemplo, 2' -OMe) en condiciones mediante las cuales una polimerasa acepte NTP 2' -modificado, la polimerasa preferida es la doble mutante Y693F/H784A o el mutante individual Y693F. Otras polimerasas, particularmente aquellas que muestran una elevada tolerancia para los 2' -sustitutos voluminosos, también pueden utilizarse en la presente invención. Estas polimerasas pueden detectarse para determinar su capacidad mediante la evaluación de su habilidad para incorporar nucleótidos modificados bajo condiciones de transcripción descritas aquí.
Se han determinado una variedad de factores como importantes para las condiciones de transcripción que utilizan los métodos descritos aquí. Por ejemplo, el aumento en las producciones de transcriptos modificado se observan cuando una secuencia líder se incorpora en el extremo 5' de una secuencia fija en el extremo 5' de un molde de transcripción ADN, de manera que al menos aproximadamente los primeros 6 residuos del transcriptos resultantes sean purinas en su totalidad. Otro factor importante para obtener transcriptos que incorporen nucleótidos modificados es la presencia o concentración de 2' -OH GTP. La transcripción puede dividirse en dos fases: la primera fase es el inicio, durante el cual se agrega NTP al extremo 3' -hidroxilo de GTP (u otra guanosina sustituida) para producir un di nucleótido que luego se extiende aproximadamente en 10-12 nucleótidos; la segunda fase es el alargamiento, durante el cual la transcripción procede más allá de la adición de los primeros 10-12 nucleótidos. Se ha descubierto que pequeñas cantidades de 2' -OH GTP que se agregan a la mezcla de transcripción que contiene una cantidad suficiente de 2' -OMe GTP son suficientes para permitir que la polimerasa inicie la transcripción utilizando 2' -OH GTP, pero una vez que la transcripción entra en la fase de alargamiento, la menor discriminación entre 2' -OMe y 2' -OH GTP y la cantidad suficiente de 2' -OMe GTP con respecto a 2' -OH GTP permite la incorporación principalmente de 2' -OMe GTP.
Otro factor importante en la incorporación de nucleótidos sustituidos con 2' -OMe en transcriptos es el uso tanto de manganeso como magnesio divalente en la mezcla de transcripción. Se ha descubierto que diferentes combinaciones de concentraciones de cloruro de magnesio y cloruro de manganeso afectan la producción de los transcriptos 2' -O metilados, la concentración óptima del cloruro de magnesio y manganeso es dependiente de la concentración en la mezcla de reacción de la transcripción de los NTP que forman complejos con iones metálicos divalentes. Para obtener la mayor producción de transcriptos O-metilados máximamente 2' sustituidos (es decir, todos los nucleótidos A, C y U y aproximadamente 90% de G) , se prefieren las concentraciones de aproximadamente 5 mM de cloruro de magnesio y 1.5 mM de cloruro de manganeso cuando cada NTP esta presente en una concentración de 0.5 mM. Cuando la concentración de cada NTP es 1.0 mM, se prefieren las concentraciones de aproximadamente 6.5 mM cloruro de magnesio y 2.0 mM cloruro de manganeso. Cuando la concentración de cada NTP es 2.0 mM, se prefieren las concentraciones de aproximadamente 9.6 mM cloruro de magnesio y 2.9 mM cloruro de manganeso. En cualquier caso, las desviaciones de estas concentraciones hasta dos órdenes de magnitud aún proporcionan cantidades significativas de transcriptos modificados. También, es importante cebar la transcripción con GMP o guanosina. Este efecto resulta en la especificidad de polimerasa para el nucleótido iniciador. Como resultado, el nucleótido 5' -terminal de cualquier transcripto generado de esta forma tiene probabilidades de ser 2' -OH G. La concentración preferida de GMP (o guanosina) es 0.5 mM e incluso más preferiblemente 1 mM. También se ha descubierto que la inclusión de PEG, preferiblemente PEG-8000, en la reacción de transcripción es útil para maximizar la incorporación de nucleótidos modificados. Para una máxima incorporación de 2' -OMe ATP (100%),
UTP (100%), CTP (100%) y GTP (-90%) ("r/mGmH") en transcriptos, se prefieren las siguientes condiciones: amortiguador HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 10% (p/v), Tritón X-100 0.01% (p/v), MgCl2 5 mM (6.5 mM en donde la concentración de cada 2' -OMe NTP es 1.0 mM) , MgCl2 1.5 mM (2.0 mM en donde la concentración de cada 2 '-OMe NTP es Í.O mM) , 2' -OMe NTP (cada uno) 500 µM (más preferiblemente, 1.0 mM) , 2' -OH GTP 30 µM, 2' -OH GMP 500 µM, pH 7.5, T7 ARN polimerasa Y639F/H784A 15 unidades/ml, piro fosfatasa inorgánica 5 unidades/ml y una secuencia líder completamente de purina de al menos 8 nucleótidos de longitud. Como se utiliza aquí, una unidad del mutante T7 ARN polimerasa Y639F/H784A (o cualquier otro mutante de T7 ARN polimerasa especificado aquí) se define como la cantidad de enzima requerida para incorporar 1 nmol de 2' -OMe NTP en transcriptos bajo condiciones r/mGmH. Como se utiliza aquí, una unidad de piro fosfatasa inorgánica se define como la cantidad de enzima que libera 1.0 moles de orto fosfato inorgánico por minuto a pH 7.2 a una temperatura de 25°C. Para una máxima incorporación (100%) de 2 '-OMe ATP,
UTP y CTP ("rGmH") en transcriptos, se prefieren las siguientes condiciones: amortiguador HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 10% (p/v), Tritón X-100 0.01% (p/v), MgCl2 5 mM ( 9.6 mM en donde la concentración de cada 2' -OMe NTP es 2.0 mM) , MgCl2 1.5 mM (2.9 mM en donde la concentración de cada 2' -OMe NTP es 2.0 mM) , 2' -OMe NTP (cada una) 500 µM (más preferiblemente, 2.0 mM) , pH 7.5, T7 ARN polimerasa Y639F 15 unidades/ml, piro fosfatasa inorgánica 5 unidades/ml y una secuencia líder completamente de purina de al menos 8 nucleótidos de longitud. Para una máxima incorporación (100%) de 2' -OMe UTP y CTP ("rRmY") en transcriptos, se prefieren las siguientes condiciones: amortiguador HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 10% (p/v), Tritón X-100 0.01% (p/v), MgCl2 5 mM (9.6 mM en donde, la concentración de cada 2' -OMe NTP es 2.0 mM) , MgCl2 1.5 mM (2.9 mM en donde la concentración de cada 2' -OMe NTP es 2.0 mM) , 2' -OMe NTP (cada una) 500 µM (más preferiblemente, 2.0 mM) , pH 7.5, T7 ARN polimerasa Y639F/H784A 15 unidades/ml, piro fosfatasa inorgánica 5 unidades/ml y una secuencia líder completamente de purina de al menos 8 nucleótidos de longitud. Para una máxima incorporación (100%) de desoxi ATP y GTP y 2' -OMe UTP y CTP ("dRmY") en transcriptos, se prefieren las siguientes condiciones: amortiguador HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermina 2 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 10% (p/v), Tritón X-100 0.01% (p/v), MgCl2 9.6 mM, MgCl2 2.9 mM, 2' -OMe NTP (cada uno) 2.0 mM, pH 7.5, T7 ARN polimerasa Y639F 15 unidades/ml, piro fosfatasa inorgánica 5 unidades/ml y una secuencia líder completamente de purina con al menos 8 nucleótidos de longitud. Para una máxima incorporación (100%) de 2' -OMe ATP, UTP y CTP y 2'-F GTP ("fGmH") en transcriptos, se prefieren las siguientes condiciones: : amortiguador HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 10% (p/v), Tritón X-100 0.01% (p/v), MgCl2 9.6 mM, MgCl22.9 mM, 2'-OMe NTP (cada una) 2.0 mM, pH 7.5, T7 ARN polimerasa Y639F 15 unidades/ml, piro fosfatasa inorgánica 5 unidades/ml y una secuencia líder completamente de purina de al menos 8 nucleótidos de longitud. Para una máxima incorporación (100%) de desoxiATP y
2' -OMe UTP, GTP y CTP ("dAmB") en transcriptos, se prefieren las siguientes condiciones: amortiguador HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 10% (p/v), Tritón X-100 0.01%
(p/v), MgCl2 9.6 mM, MgCl2 2.9 mM, 2' -OMe NTP (cada uno) 2.0 mM, pH 7.5, T7 ARN polimerasa Y639F 15 unidades/ml, piro fosfatasa inorgánica 5 unidades/ml y una secuencia líder completamente de purina con al menos 8 nucleótidos de longitud. Para cada uno de (a) anterior, la transcripción se lleva a cabo preferiblemente a una temperatura de aproximadamente 20 °C hasta aproximadamente 50 °C, preferiblemente de aproximadamente 30°C a 45°C y con mayor preferencia a una temperatura aproximada de 37 °C durante un periodo de tiempo de al menos 2 horas y (b) 50-300 nM de un molde de transcripción ADN bicatenario que se utiliza (se utiliza un molde 200 nM en la primera ronda para aumentar la diversidad (se utiliza un molde 300 nM en transcripciones dRmY)) y para las rondas subsiguientes, se utilizan 50 nM a una dilución 1/10 de una reacción PCR optimizada, utilizando las condiciones descritas aquí). A continuación se describen los moldes de transcripción ADN preferidos (en donde ARC254 y ARC256 transcriben todos bajo condiciones 2' -OMe y ARC255 transcribe bajo condiciones rRmY). SEQ IDNO 1 S^C TCGATGCTAGTCGTAACGATCC WN -W.<WnWh^^ TGAGTCGTATTA-3' SEQ ID NO 2 5'^AT?CATCGCGACTGACTAGCCGNNN pWNNNW^^ GAOTCGTATT?-3' SEQ ID NO 3 5'-CATCGATCGATCGATCQACAGCGNNNNNNNN>nW^^ GAGTC0TATTA-3-
En condiciones de transcripción normal rN de la presente invención, la mezcla de reacción de la transcripción comprende 2' -OH adenosín trifosfatos (ATP), 2' -OH guanosín trifosfatos (GTP), 2' -OH citidín trifosfatos (CTP) y 2' -OH uridín-trifosfatos (UTP) . Los oligonucleótidos modificados producidos utilizando las mezclas de transcripción rN de la presente invención comprenden sustancialmente la totalidad de 2' -OH adenosina, 2' -OH guanosina, 2' -OH citidina y 2' -OH uridina. En una modalidad preferida la transcripción rN los oligonucleótidos resultantes modificados comprenden una secuencia en donde al menos 80% de todos los nucleótidos adenosina son 2' -OH adenosina, al menos 80% de todos los nucleótidos guanosina son 2' -OH guanosina, al menos 80% de todos los nucleótidos citidina son 2' -OH citidina y al menos 80% de todos los nucleótidos uridina son 2' -OH uridina. En una modalidad más preferida de la transcripción rN, los oligonucleótidos modificados resultantes de la presente invención comprenden una secuencia en donde al menos 90% de todos los nucleótidos adenosina son 2' -OH adenosina, al menos 90% de todos los nucleótidos guanosina son 2' -OH guanosina, al menos 90% de todos los nucleótidos citidina son 2' -OH citidina y al menos 90% de todos los nucleótidos uridina con 2' -OH uridina. En una modalidad más preferida de la transcripción rN, los oligonucleótidos modificados de la presente invención comprenden una secuencia en donde 100% de todos los nucleótidos de adenosina son 2' -OH adenosina, 100% de todos los nucleótidos de guanosina son 2' -OH guanosina, 100% de todos los nucleótidos citidina son 2' -OH citidina y 100% de todos los nucleótidos uridina con 2' -OH uridina. Bajo condiciones de transcripción rRmY de la presente invención, la mezcla de reacción de la transcripción comprende 2' -OH adenosín trifosfatos, 2' -OH guanosín trifosfatos, 2'-0-metil citidín trifosfatos y 2'-0-metil uridin trifosfatos. Los oligonucleótidos modificados producidos utilizando las mezclas de transcripción rRmY de la presente invención comprenden sustancialmente de todos los 2'-OH adenosina, 2' -OH guanosina, 2'-0-metil citidina y 2'-0-metil uridina. En una modalidad preferida, los oligonucleótidos modificados resultantes comprenden una secuencia donde al menos 80% de todos los nucleótidos adenosina son 2' -OH adenosina, al menos 80% de todos los nucleótidos guanosina son 2' -OH guanosina, al menos 80% de todos los nucleótidos citidina son 2'-0-metil citidina y al menos 80% de todos los nucleótidos uridina son 2'-0-metil uridina. En una modalidad más preferida, los oligonucleótidos modificados resultantes comprenden una secuencia en donde al menos 90% de todos los nucleótidos adenosina son 2' -OH adenosina, al menos 90% de todos los nucleótidos guanosina son 2' -OH guanosina, al menos 90% de todos los nucleótidos citidina son 2'-0-metil citidina y al menos 90% de todos los nucleótidos uridina son 2'-0-metil uridina. En una modalidad más preferida, los oligonucleótidos modificados resultantes comprenden una secuencia en donde 100% de todos los nucleótidos adenosina 2' -OH adenosina, 100% de todos los nucleótidos guanosina son 2' -OH guanosina, 100% de todos los nucleótidos citidina son 2'-0-metil citidina y 100% de todos los nucleótidos uridina son 2'-0-metil uridina. Bajo condiciones de transcripción dRmY de la presente invención, la mezcla de reacción de la transcripción comprende 2'-desoxi adenosín trifosfatos, 2'-desoxi guanosín trifosfatos, 2'-0-metil citidín trifosfatos y 2'-0-metil uridin trifosfatos. Los oligonucleótidos modificados producidos utilizando las condiciones de transcripción dRmY de la presente invención, comprenden sustancialmente todos de 2'-desoxi adenosina, 2'-desoxi guanosina, 2'-0-metil citidina y 2'-0-metil uridina. En una modalidad preferida, los oligonucleótidos modificados resultantes de la presente invención, comprenden una secuencia en donde al menos 80% de todos los nucleótidos adenosina son 2'-desoxi adenosina, al menos 80% de todos los nucleótidos guanosina son 2'-desoxi guanosina, al menos 80% de todos los nucleótidos de citidina son 2'-0-metil citidina y al menos 80% de todos los nucleótidos uridina son 2'-0-metil uridina. En una modalidad más preferida, los oligonucleótidos modificados resultantes de la presente invención comprenden de una secuencia en donde al menos 90% de todos los nucleótidos adenosina son 2'-desoxi adenosina, al menos 90% de todos los nucleótidos guanosina son 2'-desoxi guanosina, al menos 90% de todos los nucleótidos de citidina son 2'-0-metil citidina y al menos 90% de todos los nucleótidos uridina son 2'-0-metil uridina. En una modalidad más preferida, los oligonucleótidos modificados resultantes de la presente invención comprenden una secuencia en donde 100% de todos los nucleótidos adenosina son 2'-desoxi adenosina, 100% de todos los nucleótidos guanosina son 2'-desoxi guanosina, 100% de todos los nucleótidos citidina son 2'-0-metil citidina y 100% de todos los nucleótidos uridina son 2'-O-metil uridina. En condiciones de transcripción rGmH de la presente invención, la mezcla de reacción de la transcripción comprende 2 ' -OH guanosín trifosfatos, 2 '-O-metil citidín trifosfatos, 2 '-O-metil uridín trifosfato y 2 '-O-metil adenosín trifosfatos. Los oligonucleótidos modificados producidos utilizando las mezclas de transcripción rGmH de la presente invención comprenden sustancialmente todos los 2 ' -0-guanosina, 2 '-O-metil citidina, 2 '-O-metil uridina y 2 ' -0-metil adenosina. En una modalidad preferida, los oligonucleótidos modificados resultantes, comprenden una secuencia en donde al menos 80% de todos los nucleótidos guanosina son 2 ' -OH guanosina, al menos 80% de todos los nucleótidos citidina son 2 '-O-metil citidina, al menos 80% de todos los nucleótidos uridina son 2 ' -O- metil uridina y al menos 80% de todos los nucleótidos adenosina son 2 '-O-metil adenosina. En una modalidad más preferida, los oligonucleótidos modificados resultantes comprenden una secuencia donde al menos 90% de todos los nucleótidos guanosina son 2 ' -OH guanosina, al menos 90% de todos los nucleótidos citidina son 2 ' -O- metil citidina, al menos 90% de todos los nucleótidos uridina son 2 '-O-metil uridina y al menos 90% de todos los nucleótidos adenosina son 2 '-O-metil adenosina. En una modalidad más preferida, solo oligonucleótidos modificados resultantes comprenden una secuencia en donde 100% de todos los nucleótidos guanosina son 2 ' -OH guanosina, 100% de todos los nucleótidos citidina son 2 ' -O- metil citidina, 100% de todos los nucleótidos uridina son 2 '-O-metil uridina y 100% de todos los nucleótidos adenosina son 2 '-O-metil adenosina. Bajo condiciones de transcripción r/mGmH, la mezcla de reacción de la transcripción comprende 2 '-O-metil adenosín trifosfato, 2'-0-metil citidín trifosfato, 2 ' -O- metil guanosín trifosfato, 2 '-O-metil uridín trifosfato y 2'-0-metil guanosín trifosfato. Los oligonucleótidos modificados ' resultantes producidos utilizando las mezclas de transcripción r/mGmH de la presentes invención comprenden sustancialmente todas 2 '-O-metil adenosina, 2 '-O-metil citidina, 2 '-O-metil guanosina y 2 '-O-metil uridina, en donde la población de nucleótidos guanosina tiene un máximo de aproximadamente 10% 2 ' -OH guanosina. En una modalidad preferida los oligonucleótidos modificados resultantes r/mGmH de la presente invención comprenden una secuencia donde al menos 80% de todos los nucleótidos adenosina son 2 '-O-metil adenosina, al menos 80% de todos los nucleótidos citidina son 2 '-O-metil citidina, al menos 80% de todos los nucleótidos guanosina son 2 '-O-metil guanosina, al menos 80% de todos los nucleótidos uridina son 2 '-O-metil uridina y no más de aproximadamente 10% de todos los nucleótidos guanosina son 2 ' -OH- metil guanosina. En una modalidad preferida, los oligonucleótidos modificados resultantes comprenden una secuencia donde al menos 90% de todos los nucleótidos adenosina son 2 '-O-metil adenosina, al menos 90% de todos los nucleótidos citidina son 2 '-O-metil citidina, al menos 90% de todos los nucleótidos guanosina son 2 '-O-metil guanosina, al menos 90% de todos los nucleótidos uridina son 2 ' -O- metil uridina, y no más de aproximadamente 10% de todos los nucleótidos guanosina son 2 ' -OH guanosina. En una modalidad más preferida, los oligonucleótidos modificados resultantes comprenden una secuencia en donde 100% de todos los nucleótidos adenosina son 2 ' -O- metil adenosina, 100% de todos los nucleótidos citidina son 2 '-O-metil citidina, 90% de todos los nucleótidos guanosina son 2 '-O-metil guanosina, y 100% de todos los nucleótidos uridina son 2 '-O-metil uridina y no más de aproximadamente 10% de todos los nucleótidos guanosina son 2 ' -OH- guanosina. Bajo condiciones de transcripción fGmH de la presente invención, la mezcla de reacción de la transcripción comprende 2 '-O-metil adenosín trifosfatos, 2 ' -0- metil uridín trifosfatos, 2 '-O-metil citidín trifosfatos y 2 ' -F-guanosín trifosfatos. Los oligonucleótidos producidos utilizando las condiciones de transcripción fGmH de la presente invención comprende sustancialmente todas las 2 '-O-metil adenosina, 2'-0- metil uridina, 2 ' -0- metil citidina y 2'-F-metil guanosina. En una modalidad preferida, los oligonucleótidos modificados resultantes comprenden una secuencia donde al menos 80% de todos los nucleótidos adenosina son 2'-0- metil adenosina, al menos 80% de todos los nucleótidos uridina son 2 '-O-metil uridina, al menos 80% de todos los nucleótidos citidina son 2'-0- metil citidina, al menos 80% de todos los nucleótidos guanosina son 2'-F guanosina. En una modalidad preferida, los oligonucleótidos modificados resultantes comprenden una secuencia donde al menos 90% de todos los nucleótidos adenosina son 2'-0- metil adenosina, al menos 90% de todos los nucleótidos uridina son 2 ' -0- metil uridina, al menos 90% de todos los nucleótidos citidina son 2 ' -0- metil citidina y al menos 90% de todos los nucleótidos guanosina son 2'-F guanosina. En una modalidad más preferida, los oligonucleótidos modificados resultantes comprenden una secuencia en donde 100% de todos los nucleótidos adenosina son 2 '-O-metil adenosina, 100% de todos los nucleótidos uridina son 2 ' -0- metil uridina, 100% de todos los nucleótidos citidina son 2'-0- metil citidina, y 100% de todos los nucleótidos guanosina son 2'-F guanosina. Bajo condiciones de transcripción dAmB de la presente invención, la mezcla de reacción de la transcripción comprende 2'-desoxi adenosín trifosfatos, 2 ' -O- metil citidín trifosfatos, 2 '-O-metil guanosín trifosfatos y 2 '-O-metil uridín trifosfatos. Los oligonucleótidos modificados producidos utilizando las mezclas de transcripción dAmB de la presente invención comprenden sustancialmente todas las 2'-desoxi- adenosín, 2 ' -O- metil citidina, 2 '-O-metil guanosina y 2 '-O-metil uridina. En una modalidad preferida, los oligonucleótidos modificados resultantes comprenden una secuencia donde al menos 80% de todos los nucleótidos adenosina son 2 ' -desoxi-metil adenosina, al menos 80% de todos los nucleótidos citidina son 2'-0-metil citidina, al menos 80% de todos los nucleótidos guanosina son 2'-0- metil guanosina, al menos 80% de todos los nucleótidos uridina son 2 '-O-metil uridina. En una modalidad más preferida, los oligonucleótidos modificados resultantes comprenden una secuencia en donde al menos 90% de todos los nucleótidos adenosina son 2 '-desoxi adenosina, al menos 90% de todos los nucleótidos citidina son 2' -O- metil citidina, al menos 90% de todos los nucleótidos guanosina son 2'-0- metil guanosina y al menos 90% de todos los nucleótidos uridina son 2 '-O-metil uridina. En una modalidad más preferida, los oligonucleótidos modificados resultantes de la presente invención comprenden una secuencia en donde 100% de todos los nucleótidos adenosina son 2 '-desoxi adenosina, 100% de todos los nucleótidos citidina son 2'-0-metil citidina, 100% de todos los nucleótidos guanosina son 2'-0- metil guanosina, y 100% de todos los nucleótidos uridina son 2 ' -0- metil uridina. En cada caso, los productos de transcripción pueden entonces utilizarse como la genoteca en el proceso SELEX™ para identificar aptámeros y/o para determinar un motivo conservado de secuencias que tienen una elevada especificidad de unión para un objetivo determinado. Las secuencias resultantes ya se estabilizan parcialmente, lo que elimina este paso de proceso para llegar a una secuencia optimizada de aptámero y proporcionar como resultado, un aptámero más estabilizado. Otra ventaja del proceso 2 ' -OMe SELEX™ es que las secuencias resultantes tienen mayores probabilidades de tener menos nucleótidos 2 '-0H requeridos en la secuencia, posiblemente ninguno. Hasta el grado en que los nucleótidos 2 'OH permanecen, estos pueden eliminarse llevando a cabo modificaciones post-SELEX™. Como se describe a continuación, se pueden obtener producciones menores pero aún útiles de transcriptos que incorporan completamente los nucleótidos 2 ' -sustituidos bajo condiciones distintas a las condiciones optimizadas descritas anteriormente. Por ejemplo, las variaciones de las condiciones de transcripciones anteriores incluyen: La concentración de amortiguador HEPES puede abarcar de 0 a 1 M. La presente invención también contempla el uso de otros agentes amortiguadores que tienen un pKa entre 5 y 10 incluyendo, por ejemplo, tris-hidroximetil-aminometano. La concentración DTT puede abarcar de 0 a 400 mM. Los métodos de la presente invención también proporcionan el uso de otros agentes reductores que incluyen, por ejemplo, mercaptoetanol . La concentración de espermidina y/o espermina puede abarcar de 0 a 20 mM. La concentración de PEG-8000 puede abarcar de 0 a
50% (p/v) . Los métodos de la presente invención también proporcionan el uso de otro polímero hidrófilo que incluye, por ejemplo, otro PEG de peso molecular distinto u otros polialquilenglicoles . La concentración de Tritón X-100 puede abarcar de 0 a 0.1% (p/v). Los métodos de la presente invención también proporcionan el uso de otros detergentes no iónicos que incluyen, por ejemplo, otros detergentes distintos a los detergentes Triton-X. La concentración MgCl2 puede abarcar de 0.5 mM a 50 mM. La concentración MnCl2 puede abarcar de 0.15 mM a 15 mM.
Tanto MgCl2 como MnCl2 deben estar presentes dentro de los intervalos descritos y en una modalidad preferida están presentes en una proporción aproximada de 10 a 3 de MgCl2:MnCl2, preferiblemente, la proporción es de aproximadamente 3-5:1, con mayor preferencia la proporción es de 3-4:1. La concentración 2 '-OMe NTP (cada NTP) puede abarcar de 5µM a 5mM. La concentración 2 ' -OH GTP puede abarcar de OµM a 300µM. La concentración 2 ' -OH GMP puede abarcar de 0 a 5mM. El pH puede abarcar de pH6 a pH9. Los métodos de la presente invención pueden llevarse a la práctica dentro del intervalo pH de actividad de la manera de las polimerasas que incorporan nucleótidos modificados. Además, las métodos de la presente invención proporcionan el uso óptimo de agentes quelantes en la condición de, reacción de la transcripción que incluyen, por ejemplo, EDTA, EGTA y DTT.
Química Medicinal de Aptámeros La Química Medicinal de Aptámeros es una técnica de mejoramiento del aptámero en donde los conjuntos de aptámeros variantes se sintetizan químicamente. Estos conjuntos de variantes normalmente difieren del aptámero inicial mediante la introducción de un solo sustituto y difieren entre sí mediante la ubicación de éste sustituto. Luego se comparan estas variantes entre sí y con el aptámero inicial. Los mejoramientos en las características pueden ser lo suficientemente profundos para que la inclusión de un solo sustituto pueda ser suficientemente necesaria para lograr un criterio terapéutico particular. Alternativamente, la información recabada del conjunto de variantes individuales puede utilizarse para diseñar otros conjuntos de variantes en donde se introduce simultáneamente más de un sustituto. En otra estrategia de diseño, se clasifican u ordenan por rango todas las variantes sustitutas individuales, en las cuatro principales se seleccionan y se sintetizan y evalúan todas las posibles combinaciones dobles (6), triples (4) y cuádruples (1) de éstas cuatro variantes sustitutas individuales. En una segunda
' estrategia de diseño, se considera la mejor variante sustituta individual como el nuevo iniciador y se sintetizan y evalúan todas las posibles dobles variantes sustitutas que incluyan esta variante sustituta individual principal. Se pueden uti.lizar otras estrategias si estas estrategias pueden aplicarse repetidamente de manera que la cantidad de sustitutos aumente gradualmente mientras se continúa identificando otras variantes más mejoradas. En particular, la Química Medicinal de Aptámero puede utilizarse como un método para explorar la introducción local en vez de global de sustitutos. Debido a que los aptámeros que descubren dentro de bibliotecas que se generan mediante transcripción, cualquiera de los sustitutos que se introducen mediante el proceso SELEX™ deberán introducirse globalmente. Por ejemplo, si se desea introducir enlaces fosforotioato entre nucleótidos, entonces solo pueden introducirse en cada A (o en cada G, C, T, U, etc.)
(globalmente sustituidas). Los aptámeros que requieren fosforotioatos en algunas A (o en algunas G, C, T, U, etc.)
(localmente sustituidas) pero que no pueden tolerar en otras
A, no pueden descubrirse fácilmente mediante éste proceso. Los tipos de sustitutos que pueden utilizarse en los procesos de Química Medicinal de Aptámeros sólo están limitados por la habilidad para generarlos como reactivos de síntesis de fases sólidas e introducirlos en un esquema de síntesis oligomérica. El proceso no esta limitado a nucleótidos solamente. Los esquemas de Química Medicinal de Aptámeros pueden incluir sustitos que introducen características de masa esférica, hidrofobicidad, hidrofilicidad, lipofilicidad, lipofobicidad, carga positiva, carga negativa, carga neutra, zwitteriones, polarizabilidad, resistencia a nucleasa, rigidez conformacional, flexibilidad conformacional, características de unión proteínica, masa, etc. Los esquemas de Química Medicinal de Aptámero' pueden incluir modificaciones en bases, modificaciones en azúcares o modificaciones en enlace fosfodiéster . Cuando se consideran los tipos de sustitutos que tienen probabilidad de ser benéficos dentro del contexto del aptámero terapéutico, se puede desear introducir sustituciones que se encuentren dentro de una o más de las siguientes categorías : (1) Los sustitutos ya están presentes en el cuerpo, por ejemplo, 2 '-desoxi, 2 '-ribo, 2 '-O-metil purinas o pirimidinas o 5-metil citosina. (2) Los sustitutos ya son parte de un programa terapéutico aprobado por ejemplo oligonucleótidos enlazados a fosforotioato. (3) Los sustitutos que hidrolizan o degradan a una de las dos categorías anteriores, por ejemplo, oligonucleótidos enlazados a metilfosfonato. Los aptámeros de trombina de la invención incluyen aptámeros desarrollados mediante la Química Medicinal de Aptámeros como se describe aquí.
Aptámeros de Unión a Trombina Los materiales de la presente invención comprenden una serie de aptámeros de ácidos nucleicos con una longitud de
13-51 nucleótidos que se unen a trombina en donde, en algunas modalidades, disminuyen o inhiben la actividad de trombina in vivo y/o las valoraciones celulares. Preferiblemente, los aptámeros de la presente invención se unen a trombina con una elevada afinidad, tienen un KD menor que aproximadamente 300 pM, preferiblemente menor a 250 pM y con mayor preferencia menor que aproximadamente 200 pM. Los aptámeros de la presente invención proporcionan una modalidad segura, efectiva y de baja toxicidad para el tratamiento y/o prevención de ciertos trastornos relacionados con la coagulación que se sabe son causados o asociados con trombina. Los aptámeros de la invención también proporcionan una modalidad segura y efectiva para modular la coagulación, particularmente la anticoagulación en relación con procedimiento quirúrgicos como intervención coronaria percutánea, incluyendo la colocación de implantes vasculares expansibles (endoprótesis vascular) , cirugía relacionada a enfermedad de oclusión de arteria periférica (PAOD por sus siglas en inglés) y derivación cardiopulmonar (CPB por sus siglas en inglés) incluyendo injerto de derivación de arterias coronarias (CABG por sus siglas en inglés) . Los aptámeros de la invención tienen efectos sobre la coagulación que pueden cuantificarse mediante el tiempo de coagulación activada (ACT por sus siglas en inglés) y otras cuantificaciones rutinarias de coagulación y falta de efectos secundarios indeseables tales como activación plaquetaria (como ocurre, por ejemplo, con la administración de heparina). Además, en algunas modalidades, los aptámeros antitrombina tienen una corta vida media farmacocinética (PK por sus siglas en inglés) y farmacodinámica (PD por sus siglas en inglés), lo que resulta en efectos antitrombina rápidos y reversibles. Los ejemplos de los aptámeros de unión a trombina para usarse como agentes terapéuticos y/o de diagnóstico en la presente invención incluyen las siguientes secuencias: SEQ ID NOs 9-41, 43-191, 193-204, 208-304, 307-329, 331-332, 334,
336-337, 340-392, 396-397, 400, y 402-440. A continuación se describen otros aptámeros que unen a trombina en los Ejemplos 1 y 2. Estos aptámeros pueden incluir modificaciones como se describen aquí, que incluyen por ejemplo, conjugación a compuestos lipófilos o de elevado peso molecular tales como PEG, incorporación de una entidad de remate o finalización, incorporación de nucleótidos modificados, sustituciones en estructura principal fosfato y enlaces internucleotídicos de fosforotioato. En una modalidad de la invención, se proporciona un aptámero aislado y natural que se une a trombina. En algunas modalidades, el aptámero aislado y no natural tiene una constante redisociación ("KD") para trombina menor a 100 µM, menor a 1 µM, menor a 500 nM, menor a 100 nM, menor a 50 nM, menor a 1 nM, menor a 500 pM, menor que aproximadamente 300 pM, preferiblemente menor que 250 pM y con mayor preferencia menor que aproximadamente 200 pM. La constante de disociación puede determinarse mediante una titulación dot biot como se describe en el siguiente Ejemplo 1.
En otra modalidad, el aptámero de la invención disminuye o inhibe una función de trombina. En otra modalidad de la invención, el aptámero se une y disminuye o inhibe la función de una variante de trombina. Como se utiliza aquí, el término variante de trombina abarca variantes que llevan a cabo esencialmente la misma función que la de trombina, preferiblemente comprenden sustancialmente la misma estructura y en algunas modalidades, comprenden 70% de identidad de secuencia, preferiblemente 80% de identidad de secuencia, con mayor preferencia 90% de identidad de secuencia y más preferiblemente 95% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia aminoacídica de trombina. En unas modalidades de la invención, la identidad de secuencia de las variantes objetivas se determina utilizando BLAST como se describe a continuación. En esta descripción, los términos "identidad de secuencia" en el contexto de dos o más secuencias proteínicas o ácidos nucleicos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de nucleótidos o residuos aminoacídicos que son iguales, cuando se comparan y alinean para una máxima correspondencia, como se cuantifica utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual. Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa como la secuencia de referencia con la cual se comparan las secuencias de la prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se ingresan en un computador, se designan coordenadas de subsecuencias si es necesario y se designan los parámetros del programa de algoritmo de secuencias. Luego el algoritmo de separación de secuencias calcula un porcentaje e identidad de secuencia para la secuencia de prueba en relación con la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa designado. La alineación óptima de secuencias para su comparación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante un algoritmo de homología localizada de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J Mol. Biol. 48: 443 (1970) , mediante la búsqueda del método de similitud de
Pearson y Lipman, Proc. Nat ' 1. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos
(GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics
Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr . , Madison, Wis.), o mediante inspección visual (ver generalmente, Ausubel et al., infra) . Un ejemplo de un algoritmo adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia es el algoritmo utilizado en la herramienta para la búsqueda de alineación básica localizada (de aquí en adelante "BLAST" por sus siglas en inglés), ver, por ejemplo, Altschul et al., J Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) y Altschul et al, Nucleic Acids Res., 15: 3389-3402 (1997). El software para llevar a cabo análisis BLAST está disponible al público mediante el National Center for Biotechnology Information (Centro Nacional para Información Biotecnológica) (de aquí en adelante "NCBI" por sus siglas en inglés). Los parámetros predeterminados utilizados para llevar a cabo la identidad de secuencias utilizando el software disponible de NCBI, por ejemplo, BLASTN (para secuencias nucleotídicas) y BLASTP (para secuencias aminoacídicas) se describe en McGinnis et al, Nucleic Acids Res., 32: W20-W25 (2004). En otra modalidad de la invención, el aptámero tiene sustancialmente la misma habilidad para unirse a trombina que la del aptámero que comprende cualquiera de SEQ ID NOS : 43-44, 48- 49, 52, 63, 72, 82, 84, 92, 97, 116, 130, 141, 143, 146, 166, 172, 185, 283, 292-294, 319-329, 331-332, 334, 336-337, 340-392, 396-397, 400, 402-433. En otra modalidad de la invención, el aptámero tiene sustancialmente la misma estructura y habilidad para unir a trombina que la del aptámero que comprende cualquiera de SEQ ID NOS : 43-44, 48-49, 52, 63, 72, 82, 84, 92, 97, 116, 130, 141, 143, 146, 166, 172, 185, 283, 292-294, 319-329, 331-332, 334, 336-337, 340-392, 396-397, 400, 402-433 . En otra modalidad de la invención, el aptámero tiene sustancialmente la misma habilidad para disminuir o inhibir la coagulación que cualquiera de SEQ ID NOS: 11,15, 21, 23, 32, 34, 84, 86, 92, 94, 116, 191, 197, 200, 283-285, 287, 289-290, 292-304, 307-318, 411, 434-438, y 440. En otra modalidad de la invención, el aptámero tiene sustancialmente la misma habilidad para disminuir o inhibir la coagulación y sustancialmente la misma estructura que cualquiera de SEQ ID NOS: 11,15, 21 ,23, 32, 34, 84, 86, 92, 94, 116, 191, 197, 200, 283-285, 287, 289-290, 292- 304, 307-318, 411, 434-438, y 440. En otra modalidad, los aptámeros de la invención tiene una secuencia según cualquiera de SEQ ID NOS: 191, 197, 283, 292-294, 411, y 434- 440. En otra modalidad, los aptámeros de la invención se utilizan como un ingrediente activo en composiciones farmacéuticas. En otra modalidad, los aptámeros de la invención o las composiciones que comprenden los aptámeros de la invención se utilizan para el tratamiento contra trastornos relacionados con la coagulación, por ejemplo, trastornos agudos y crónicos de coagulación mediados por trombina. En otra modalidad, los aptámeros de la invención o las composiciones que comprenden los aptámeros de la invención se utilizan como un agente anticoagulante, antes, durante o después o cualquier combinación de estos, de un procedimiento quirúrgico tal como un injerto de derivación de arteria coronaria (CABG) o una intervención coronaria percutánea.
En algunas modalidades, los aptámeros terapéuticos de la presente invención tienen una gran afinidad y una alta especificidad hacia sus objetivos mientras que al mismo tiempo se reducen los efectos secundarios nocivos de las sustituciones nucleotídicas naturales si los aptámeros terapéuticos se degradan en el cuerpo de pacientes o personas. En algunas modalidades, las composiciones terapéuticas que contienen los aptámeros terapéuticos de la presente invención están libres o tienen una menor cantidad de nucleótidos fluorados. Los aptámeros de la presente invención pueden sintetizarse utilizando cualquiera de las técnicas para síntesis oligonucleotídica que se conozca incluyendo técnicas de síntesis oligonucleotídica en fase sólida que se conocen bien (ver, por ejemplo, Froehler et al, Nucí. Acid Res. 14:5399-5467 (1986) y Froehler et al, Tet. Lett. 27:5575-5578 (1986) ) y métodos de fase de solución tales como métodos para síntesis de triéster (ver, por ejemplo, Sood et al, Nucí. Acid Res. 4:2557 (1977) y Hirose et al, Tet. Lett., 28:2449 (1978) ) . ARC2172 (SEQ ID NO 294) se elabora sintéticamente y tiene una fórmula molecular de C256H3i9N?o4Oi5gP25 (forma de ácido libre) con un peso molecular (MW por sus siglas en inglés) de 8,155.24 Daltons. La sal sódica de ARC2172 (SEQ ID NO 294) tiene la fórmula molecular de C256H294Na25N?o4Oi58P25 y corresponde a un MW de 8704.77 Daltons. El nombre químico de la sal sódica de ARC2172 (SEQ ID NO 294) es 2' -desoxicitidilil- (3 ' ? 5' 0,0-fosforil) -2 ' -desoxiguanosilil- (3 ' -> 5' O, O-fosforil) -2 ' -desoxicitidilil- (3 ' -> 5' 0,0- fosforil) -2 ' -desoxicitidilil-(3'-> 5' 0,0-fosforil)-2'-desoxitimidilil- (3'-> 5' 0,0-fosforil) -2 '-desoxiadenosilil- (3' -> 5' O, 0~fosforil) -2 ' -desoxiguanosilil- (3 ' -> 5' 0,0- fosforil) -2 ' -desoxiguanosilil-(3'-> 5' 0,0-fosforil)-2'-desoxitimidilil-(3'-> 5' 0,0-fosforil)-2'~desoxitimidilil-(3'-> 5' O, O-fosforil) -2 ' -desoxiguanosilil- (3 ' -> 5' 0,0- fosforil) -2 ' -Desoxiguanosilil-(3'-> 5' 0,0-fosforil) -2 '-desoxiguanosilil- (3'-> 5' 0,0-fosforil)-2'-desoxitimidilil- (3'-> 5' O, O-fosforil) -2 ' -desoxiadenosilil- (3 ' -> 5' 0,0- fosforil) -2 ' -desoxiguanosilil-(3'-> 5' O;, O-fosforil) -2 ' -desoxiguanosilil- (3'-? 5' 0,0-fosforil) -2 '-desoxiguanosilil- (3' -> 5' O, O-fosforil) -2 ' -desoxitimidilil- (3 ' -> 5' 0,0- fosforil) -2 ' -desoxiguanosilil-(3'-> 5' 0,0-fosforil) -2 ' -desoxiguanosilil- (3'-> 5' 0,0-fosforil)-2 ' -desoxitimidilil- (3 ' -> 5 ' O, O-fosforil) -2 ' -desoxiguanosilil- (3 ' -> 5 ' 0,0- fosforil) -2 ' -desoxiguanosilil- (3 ' -> 5' O, O-fosforil) -2 ' -desoxicitidilil- (3' 5' 0,0- fosforil) -2 ' -desoxiguanosina, 25-sal sódica.
Composiciones Farmacéuticas La invención también incluye composiciones farmacéuticas que contienen moléculas de aptámeros que se unen a trombina. En algunas modalidades, las composiciones son adecuadas para su uso interno e incluye una cantidad efectiva de un compuesto farmacológicamente activo de la invención, sola o combinada con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. Los compuestos son especialmente útiles en que tienen una muy baja toxicidad, si es que la hay. Las composiciones de la invención pueden utilizarse para el tratamiento o prevención de una patología, tal como un trastorno o enfermedad o al guiar los síntomas de este trastorno de enfermedad en un paciente. Por ejemplo, las composiciones de la presente invención pueden utilizarse para el tratamiento o prevención de una patología asociada con la coagulación y particularmente, con aquellas patologías asociadas con la coagulación relacionada a trombina. Las composiciones de la invención son útiles para administrarse a un paciente que sufre o está predispuesto a una enfermedad o trastorno en donde se relaciona o deriva de un objetivo al cual los aptámeros de la invención se unen con elevada afinidad. Las composiciones de la invención son útiles para administrarse a una persona que sufre o está predispuesta a una enfermedad o trastorno relacionado o derivado de un objetivo al cual los aptámeros de la invención se unen con elevada afinidad. Las composiciones de la invención pueden utilizarse en un método para el tratamiento de un paciente o persona que tiene una patología. El método implica la administración al paciente o persona de un aptámero o una composición que comprende aptámeros que se unan a una proteína objetiva (por ejemplo, a trombina) que está involucrada con la patología, para que la unión del aptámero a la proteína objetivo altere la función biológica del objetivo, por ejemplo, trombina, con lo cual se trata la patología. El paciente o persona que tenga la patología o que necesite de anticoagulantes, es decir, el paciente o persona sometida a tratamiento por los métodos de la invención, puede ser un vertebrada, más particularmente un mamífero, por ejemplo un perro, gato, mono y/o ungulado como un caballo, más particularmente un humano. En algunas modalidades, el aptámero de la invención, por ejemplo ARC2172 (SEQ ID NO 294), se administran antes, durante o después o cualquier combinación de éstos, de una intervención quirúrgica, tal como CABG, PCI, angioplastia, cirugía endovascular y cirugía periférica vascular abierta, cirugía endovascular y abierta, vascular periférica y cardiovascular, cirugía para colocar endoprótesis vasculares en venas o arterias periféricas/coronarias, órganos artificiales, válvulas cardiacas, para el tratamiento contra enfermedad coronaria y/o enfermedad vascular en venas o arterias, por ejemplo en la arteria renal, aorta abdominal, en la arteria carótida, en la enfermedad oclusiva de arteria periférica ("PAOD"). En algunas modalidades del método, el aptámero de la invención se administra para prevenir trombosis postoperatoria, por ejemplo, luego de un reemplazo de cadera, reemplazo de rodilla, etcétera. En algunas modalidades del método, el aptámero se administra, durante, después o cualquier combinaciones de estos, de procedimientos mínimamente invasivos como laparoscopía, procedimientos ginecológicos, etcétera. Los aptámeros de la invención, por ejemplo ARC2172 (SEQ ID NO 294), se utilizan en el tratamiento anticoagulante de pacientes con trombocitopenia inducida por heparina ("HIT" por sus siglas en inglés) , resistencia a heparina, función renal disminuida y/o función hepática disminuida. En otra modalidad, la invención se relaciona con un tratamiento, en un humano u otro mamífero, de condiciones en donde se desea la disminución o inhibición de trombina. Los aptámeros de la invención pueden utilizarse en mamíferos, incluyendo el hombre, en el tratamiento y/o profilaxis de trombosis y/o hipercoagulabilidad en sangre y tejidos, incluyendo síndrome coronario agudo, falla cardiaca congestiva, fibrilación atrial, trombosis venosa, por ejemplo trombosis de vena profunda, embolia pulmonar, trombosis arterial, tal como isquemia al miocardio, infarto al miocardio, angina inestable, apoplejía basada en trombosis y trombosis arterial periférica. Además los aptámeros pueden utilizarse en el tratamiento y/o profilaxis de trastornos ateroscleróticos (enfermedades) tales como enfermedad de arteria coronaria, enfermedad de arteria cerebral y enfermedad de arteria periférica. En algunas modalidades, los aptámeros de la invención, por ejemplo, ARC2172 (SEQ ID NO 294), puede utilizarse en tratamiento anticoagulante de hemodiálisis en una coagulación intravascular diseminada. En algunas modalidades, los aptámeros de la invención pueden utilizarse en métodos para enjuagar y/o recubrir catéteres, implantes o dispositivos intravasculares y dispositivos mecánicos utilizados en pacientes in vivo y como anticoagulante para la conservación de sangre, plasma y otros productos sanguíneos in vi tro . Además, los aptámeros pueden utilizarse en otras enfermedades en donde la coagulación sanguínea podría ser un proceso fundamentalmente contribuyente o una fuente de patología secundaria, tal como el cáncer, incluyendo metástasis, enfermedades inflamatorias, incluyendo artritis, y diabetes. Las composiciones de la invención pueden utilizarse en un método para el tratamiento de un paciente o persona que necesita de anti coagulación, por ejemplo, antes de, durante y/o después de cirugía, tal como en cirugía cardiaca. En los métodos para la modulación de coagulación en algunas modalidades de la presente invención, por ejemplo, antes de, durante y/o después de cirugía CABG, se puede administrar un aptámero anti trombina mediante infusión intravenosa constante o mediante administración en bolo intravenoso. En estas modalidades, se puede proporcionar un aptámero en una composición de la invención, al igual que su sal sódica, en una solución salina isotónica, acuosa y de pH neutro. Durante la práctica, los aptámeros o sus sales farmacéuticamente aceptables se administran en cantidades que sean suficientes para ejercer su actividad y lógica deseada, por ejemplo, disminuir o inhibir la unión del objetivo del aptámero, trombina al fibrinógeno y PAR-1. Un aspecto de la invención comprende una composición de aptámero de la invención combinada con otros tratamientos contra trastornos relacionados con la coagulación. La composición de aptámero de la invención puede contener, por ejemplo, más de un aptámero. En algunos ejemplos, una composición de aptámero de la invención, que contienen uno o mas compuestos de la invención, se administra combinada con otra composición útil como puede ser un agente anti inflamatorio, un inmunosupresor, un agente anti viral o lo similar. Más aún, los compuestos de la invención también pueden administrarse combinados con un agente citotóxico, citostático o quimioterapéutico tal como un agente alquilante, un anti metabolito, inhibidor mitótico o antibiótico citotóxico, como se describe anteriormente. En términos generales, las formas de dosificación actualmente disponibles de los agentes terapéuticas conocidos para usarse en estas combinaciones son más adecuadas. El término "terapia combinada" (o "terapia concomitante") incluye la administración de una composición de aptámero de la invención y al menos un segundo agente como parte de un programa específico de tratamiento que pretende proporcionar el efecto benéfico de la acción simultánea de estos agentes terapéuticos. El efecto benéfico de la combinación incluye, entre otros, una acción simultanea fármaco cinética o fármaco dinámica como resultado de la combinación de agentes terapéuticos. La administración de estos agentes terapéuticos combinados normalmente se lleva a acabo durante un periodo de tiempo definido (usualmente minutos, horas, días o semanas, dependiendo de la combinación seleccionada) . El término "terapia combinada" puede, pero generalmente no pretende abarcar las administración de dos o más de estos agentes terapéuticos como parte de programas mono terapéuticos separados que incidentalmente o arbitrariamente den como resultado combinaciones de la presente invención. El término "terapia combinada" pretende abarcar la administración de estos agentes terapéuticos en forma secuencial, esto es, en donde cada agente terapéutico se administra en un momento diferente, así como la administración de estos agentes terapéuticos o al menos dos de los agentes terapéuticos en una forma sustancialmente simultanea. La administración sustancialmente simultánea puede llevarse a cabo, como por ejemplo, mediante la administración al paciente de una sola cápsula que tenga una proporción fija de cada agente terapéutico o en cápsulas múltiples o individuales para cada una de los agentes terapéuticos. La administración secuencial o sustancialmente simultánea de cada agente terapéutico puede efectuarse mediante cualquier ruta apropiada que incluya, entre otras, las rutas tópicas, rutas orales, rutas intravenosas, rutas intramusculares y absorción directa a través de los tejidos de la membrana de la mucosa. Los agentes terapéuticos pueden administrarse mediante la misma ruta o diferentes rutas. Por ejemplo, un primer agente terapéutico de la combinación seleccionada puede administrarse mediante inyección mientras que otros agentes terapéuticos o la combinación puede administrarse tópicamente. Alternativamente, todos los agentes terapéuticos pueden administrarse tópicamente o todos los agentes terapéuticos pueden administrarse mediante inyección. La secuencia en la cual se administran los agentes terapéuticos no es muy crítica a menos que se observe otra cosa. El término "terapia combinada" también abarca la administración de agentes terapéuticos como se describe anteriormente además combinados con otros ingredientes biológicamente activos.
Cuando la terapia combinada además comprende un tratamiento que no es fármaco, el tratamiento que no es fármaco puede llevarse a cabo en cualquier momento adecuado siempre y cuando el efecto benéfico de la acción simultanea de la combinación de agentes terapéuticos y el tratamiento que no es fármaco pueda lograrse. Por ejemplo, en casos apropiados, el efecto benéfico aún se logra cuando el tratamiento que no es fármaco se detiene temporalmente de la administración de agentes terapéuticos, tal vez días o incluso semanas. Las composiciones terapéuticas o farmacológicas de la presente invención generalmente comprenden una cantidad efectiva de compuestos activos de terapia, disueltos o dispersos en un medio farmacéuticamente aceptable. Los portadores o medios farmacéuticamente aceptables incluyen cualquiera y todos pueden ser solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y anti fúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y lo similar. El uso de estos medios y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas se conocen en la técnica. Los ingredientes activos complementarios también pueden incorporarse en las composiciones terapéuticas de la presente invención . La preparación de composiciones farmacológicas o farmacéuticas es conocida por los expertos en la técnica en vista de la presente descripción. Normalmente, las composiciones pueden prepararse como principios activos inyectables, ya sea como suspensiones o soluciones líquidas; formas sólidas adecuadas para su solución o suspensión en líquido antes de inyectarse; como tabletas u otros sólidos para la administración oral; como cápsulas de liberación prolongada o en cualquier otra forma actualmente utilizada, incluyendo gotas oculares, cremas, lociones, bálsamos, inhalantes y lo similar. El uso de formulaciones estériles, tales como lavados basados en solución salina por cirujanos, médicos o trabajadores en el cuidado de la salud para el tratamiento de un área particular en el campo de operación también pueden ser particularmente útiles. Las composiciones también pueden administrarse mediante un micro dispositivo, micro partícula o esponja. Al momento de formularse, los principios terapéuticos se administran en forma compatible con la formulación de dosificación y en tal cantidad que sean farmacológicamente efectivos. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación, tal como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente pero las cápsulas de liberación del fármaco y lo similar también pueden emplearse. En este contexto, la cantidad de ingrediente activo y volumen de la composición que se va a administrar depende del animal hospedero que se va a tratar. Las cantidades precisas de compuesto activo requeridas para su administración dependen del juicio del practicante y son peculiares para cada caso. Normalmente se utiliza un volumen mínimo de una composición requerida para dispersar los compuestos activos. Los programas adecuados para administración también son variables pero pueden tipificarse al administrar inicialmente el compuesto y monitorear los resultados y luego administrar otras dosis controladas a mayores intervalos. Por ejemplo, para la administración oral en forma de una tableta o cápsula (por ejemplo, una cápsula de gelatina), el componente del fármaco activo puede combinarse con un portador oral, no tóxico, farmacéuticamente aceptable e inerte tal como etanol, glicerol, agua y lo similar. Más aún, cuando se desea o es necesario, también pueden incorporarse a la mezcla aglutinantes adecuados, lubricantes, agentes disgregantes y agentes colorantes. Los aglutinantes adecuados incluyen almidón, silicato de magnesio y aluminio, pasta de almidón, gelatina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona, azúcares naturales tal como glucosa o beta-lactosa, endulzantes de maíz, gomas naturales y sintéticas como acacia, tragacanto o alginato de sodio, polietilenglicol, ceras y lo similar. Los lubricantes utilizados en estas formas de dosificación incluyen oleato sódico, estearato sódico, estearato de magnesio, benzoato sódico, acetato sódico, cloruro de sodio, sílice, talco, acido esteárico, su sal de magnesio o calcio y/o polietilenglicol, y lo similar. Los agentes disgregantes incluyen, entre otros, almidón, metilcelulosa, agar, bentonita, almidones de goma xantana, agar, acido algínico o su sal sódica o mezclas efervescentes y lo similar. Los diluyentes incluyen, por ejemplo, lactosa, dextrosa, sacarosa, mannitol, sorbitol, celulosa y/o glicina. Los compuestos de la invención también pueden administrarse en formas de dosificación oral como cápsulas o tabletas de liberación prolongada o liberación sostenida, pildoras, polvos, granulos, elixires, tinturas, suspensiones, jarabes y emulsiones. Los supositorios se preparan ventajosamente a partir de suspensiones o emulsiones grasas. Las composiciones farmacéuticas pueden esterilizarse y/o contener adyuvantes, tal como agentes conservadores, estabilizadores, humectantes o emulsionantes, promotores de la solución, sales para regular la presión osmótica y/o de amortiguadores. Además, también pueden contener otras sustancias terapéuticamente valiosas. Las composiciones se preparan según los métodos convencionales de mezclado, granulado o recubrimiento y normalmente contienen de aproximadamente 0.1% a 75%, preferiblemente de aproximadamente 1% a 50% de ingrediente activo. Por ejemplo, las composiciones líquidas, particularmente inyectables, se pueden preparar al disolver, dispersar, etc. El compuesto activo se disuelve o se mezcla con un solvente farmacéuticamente puro como por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa acuosa, glicerol, etanol y lo similar para así formar la solución o suspensión inyectable. Además, las formas sólidas adecuadas para disolverse en líquido antes de inyectarse también pueden formularse. Los compuestos de la presente invención pueden administrarse en forma intravenosa (tanto en bolo como infusión) , intraperitoneal, subcutánea o intramuscular y se utilizan en todos los casos formas que se conocen bien por el experto en la técnica de artes farmacéuticas. Los productos inyectables pueden prepararse en formas convencionales, ya sea como suspensiones o soluciones líquidas. La administración parenteral inyectable generalmente se utiliza para administración subcutánea, intramuscular o intravenosa e infusiones. Además, un método para la administración parenteral emplea el implante de sistemas de liberación prolongada o liberación sostenida, se unen que se mantenga un nivel constante de dosis, según la Patente de EE . UU. No. 3,710,795, incorporada aquí por referencia. Más aún, los compuestos preferidos de la presente invención pueden administrarse en forma intranasal mediante el uso tópico de vehículos intranasales adecuados, así como inhalantes o mediante rutas transdérmicas, como utilizando aquellas formas de parches transdérmicos que son conocidos por el experto en la técnica. Para poderse administrar en forma de un sistema de administración transdérmica, la dosis de administración ciertamente deberá ser continua en vez de intermitente durante el programa de dosificac_*ión. Otras preparaciones tópicas preferidas incluyen cremas, pomadas, lociones, aerosoles y geles, en donde la concentración del ingrediente activo normalmente abarca de 0.01% a 15%, p/p o p/v. Para composiciones sólidas, los excipientes incluyen grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y lo similar. El compuesto activo definido anteriormente, también puede formularse como supositorios utilizando, como por ejemplo, polialquilenglicoles, por ejemplo propilenglicol, a manera del portador. En algunas modalidades, se preparan ventajosamente supositorios a partir de suspensiones o emulsiones grasas. Los compuestos de la presente invención también pueden administrarse en forma de sistemas de administración liposomal, tales como pequeñas vesículas unilamelares, grandes vesículas unilamelares y vesículas multilamelares. Las liposomas pueden formarse a partir de una variedad de fosfolípidos, que contienen colesterol, estearilamina o fosfatidilcolinas . En algunas modalidades, se hidrata una película de componentes lípidos con una solución acuosa del fármaco para formar una capa lipídica que encapsule el fármaco, como se describe en la Patente EE.UU. No. 5,262,564. Por ejemplo, las moléculas de aptámero descritas aquí pueden proporcionarse como un complejo con un compuesto lipofílico o no inmunogénico, un compuesto de elevado peso molecular que se elabora utilizando métodos conocidos en la técnica. Un ejemplo de complejos asociados con ácidos nucleicos se proporciona en la Patente EE.UU. No. 6,011,020. Los compuestos de la presente invención también pueden copularse con polímeros solubles como portadores de fármacos con especificidad de objetivo. Estos polímeros pueden incluir polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, polihidroxipopil-metacrilamida-fenol, polihidroxietilasparaginafenol o polietilenoxidesoxilisina sustituida con residuos palmitoilo. Más aún, los compuestos de la presente invención pueden copularse con una clase de polímeros biodegradables útiles para lograr una liberación controlada del fármaco, por ejemplo, acido poliláctico, caprolactona poliepsilon, acido polihidroxibutírico, poliortoesteres, poliacetalos, polidihidropiranos, policianoacrilatos y copolímeros de bloque anfifáticos o reticulados de hidrogeles. Si se desea, la composición farmacéutica que se va a administrar también puede contener pequeñas cantidades de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes amortiguadores del pH y otras sustancias como por ejemplo, acetato de sodio y oleato de trietanolamina. El programa de dosificación que utilizan los aptámeros se selecciona de conformidad con una variedad de factores que incluye el tipo, especie, edad, peso, sexo y estado médico del paciente; la seriedad de la condición que se va a tratar; la ruta de administración; la función renal y hepática del paciente y el aptámero particular o su sal que se va a emplear. El médico de experiencia común o el veterinario de experiencia común pueden fácilmente determinar y prescribir la cantidad efectiva del fármaco requerido para evitar, contrarrestar, o eliminar el progreso de la condición o estado. Los pesos moleculares proporcionados en las siguientes dosificaciones se relacionan con el peso oligo > del aptámero solamente y no incluyen una masa conferida por la conjugación tal como una entidad PEG. Las dosis orales de la presente invención, cuando se utilizan para los efectos indicados, abarcan entre aproximadamente 0.05 a 7500 mg/día oralmente. Preferiblemente las composiciones se proporcionan en forma de tabletas marcadas que contienen 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0, 50.0, 100.0, 250.0, 500.0 y 1000.0 mg de ingrediente activo. Las dosis infundidas, dosis intranasales y dosis transdérmicas abarcan entre 0.05 a 7500 mg/día. Las dosis subcutáneas, intravenosas e intraperitoneales abarcan entre 0.5 a 12000 mg/día. Los niveles plasmáticos efectivos de los compuestos de la presente invención abarcan de 0.002 mg/ml a 50 mg/ml. Los compuestos de la presente invención pueden administrarse en una sola dosis diaria o la dosis diaria total puede administrarse en dosis divididas de 2, 3 o 4 veces al día .
Modulación de Farmacocinética y Biodistribución de Agentes Terapéuticos Aptoméricos Es importante que las propiedades farmacocinéticas de todos los agentes terapéuticos basados en oligonucleótidos, incluyendo aptámeros, se individualice para ajustarse a la aplicación farmacéutica deseada. Aunque los aptámeros dirigidos contra objetivos extra celulares no sufren de dificultades asociadas con la administración intracelular
(como en el caso con agentes terapéuticos basados en ARN y ARN anti sentido o complementario) , tal como los aptámeros que aún deben ser capaces de distribuirse en tejidos órganos diana que permanecen en el cuerpo (sin modificar) durante un periodo de tiempo consistente con el programa de dosificación deseado. Por lo tanto, la presente invención proporciona materiales y métodos para efectuar la farmacocinética de las composiciones aptoméricas y particularmente, la habilidad de ajustar la farmacocinética aptomérica. Los conjugados PEG-aptámero que se une a trombina de la invención con una mayor vida media (t?/2) puede utilizarse en el tratamiento contra una variedad de trastornos, como por ejemplo, trombocitopenia inducida por heparina (HIT), síndrome coronario agudo (ACS) y trombosis en vena profunda (DVT) . La mayor t?/2 mostrada por estos conjugados aptoméricos afecta, por ejemplo, disminuye, la dosis necesaria para producir el efecto deseado. Los conjugados aptoméricos con una mayor vida media también pueden utilizarse para trastornos crónicos. Un aptámero de la invención con una mayor vida media (X/2) , incluyendo el conjugado aptomérico y/o aptámero estabilizado de la invención, también pueden utilizarse como un anti coagulante en recolección de sangre, circulación sanguínea o en un dispositivo para almacenamiento de sangre en donde los dispositivos incluyan una cantidad efectiva de un aptámero anti trombina de la invención o de una mezcla de aptámeros anti trombina de la invención. Los ejemplos de estos dispositivos incluyen, entre otros, bolsas para recolectar sangre, tubos para recolectar sangre y jeringas para la recolección de sangre. En una modalidad particular, se utiliza una cantidad efectiva de aptámero de la invención en un dispositivo para el almacenamiento de sangre, por ejemplo, una bolsa de sangre, en donde la sangre se almacena a una temperatura aproximada de 4°C durante varios días y preferiblemente durante aproximadamente 2 semanas. La capacidad de ajustarse (es decir, la habilidad de disminuir o inhibir) la farmacocinética del aptámero se logra mediante la conjugación de entidades modificadoras (por ejemplo, polímeros PEG) al aptámero y/o la incorporación de nucleótidos modificados (por ejemplo, 2' -fluoro o 2' -O-metil) para alterar la composición química del ácido nucleico. La habilidad de ajustar la farmacocinética del aptámero se utiliza en el mejoramiento de las aplicaciones terapéuticas existentes o alternativamente, en el desarrollo de nuevas aplicaciones terapéuticas, por ejemplo, algunas aplicaciones terapéuticas, por ejemplo, en casos de anti neoplasia o de cuidado agudo en donde se desea una rápida depuración o eliminación del fármaco, se desea disminuir los tiempos de permanencia de aptámeros en circulación. Alternativamente, en otras aplicaciones terapéuticas, por ejemplo, terapias de mantenimiento en donde la circulación sistémica del agente terapéutico se desea, se puede querer aumentar los tiempos de permanencia de aptámeros en circulación. Además, la capacidad de ajuste de la farmacocinética aptomérica se utiliza para modificar la biodistribución del agente terapéutico aptomérico en un paciente. Por ejemplo, en algunas aplicaciones terapéuticas, se puede desear alterar la biodistribución de un agente terapéutico aptomérico en un esfuerzo de atacar con especificidad de objetivo un tipo particular de tejido u órgano específico (o conjunto de órganos). En estas aplicaciones, el agente terapéutico aptomérico preferiblemente se acumula en un órgano o tejido específico. En otras aplicaciones terapéuticas, se puede desear que los tejidos diana muestren un marcador celular o síntoma asociado con una enfermedad determinada, lesión celular u otra patología anormal, de manera que el agente terapéutico aptomérico preferiblemente se acumule en el tejido afectado. Por ejemplo, como se describe en la solicitud provisional de EE.UU: No. 60/550790 presentada el 5 de marzo del 2004 y titulada "Controlled Modulation of the Pharmacokinetics and Biodistribution of Aptamer Therapeutics" y en la solicitud no provisional de EE.UU. No. de Serie 11/075,648 presentada el 7 de marzo del 2005 y titulada "Controlled Modulation of the Pharmacokinetics and Biodistribution of Aptamer Therapeutics" (Modulación Controlada de la Farmacocinética y Biodistribución de Agentes Terapéuticos Aptoméricos), la PEGilación de un agente terapéutico aptomérico (por ejemplo, PEGilación con un polímero PEG de 20 kDa) se utiliza para tener especificidad de objetivo hacia tejidos inflamados de manera que el agente terapéutico aptomérico PEGilado se acumule preferiblemente en el tejido inflamado. Para determinar los perfiles de farmacocinética y biodistribución de los agentes terapéuticos aptoméricos (por ejemplo, conjugados aptoméricos o aptámeros con química alterada, como nucleótidos modificados) se moitorizan una variedad de parámetros. Los parámetros incluyen, por ejemplo, la vida media (t?/2) , la eliminación plasmática (Cl) , el volumen de distribución (Vss), el área bajo la curva de tiempo-concentración (AUC por sus siglas en inglés), máxima concentración sérica o plasmática observada (Cmax) y el tiempo promedio de permanencia (MRT por sus siglas en ingles) de una composición aptomérica. Como se utiliza aquí, el término "AUC" se refiere al área bajo el gráfico de la concentración plasmática de un agente terapéutico aptomérico con respecto a tiempo luego de la administración del aptámero. El valor AUC se utiliza para estimar la biodisponibilidad (es decir, el porcentaje de agente terapéutica aptomérico administrado en circulación luego de la administración del aptámero) y la eliminación o depuración total (Cl) (es decir, la velocidad a la cual el agente terapéutico aptomérico es eliminado de la circulación) de un agente terapéutico aptomérico determinado. El volumen de distribución se relaciona con la concentración plasmática de un agente terapéutico aptomérico con la cantidad de aptámero presente en el cuerpo. Mientras mayores es el Vss, más cantidad de aptámero se encuentra fuera del plasma (es decir, hay más extravasación) . La presente invención proporciona materiales y métodos para modular, en forma controlada, la farmacocinética y biodistribución de las composiciones aptoméricas estabilizadas in vivo mediante la conjugación de un aptámero a una entidad moduladora tal como una pequeña molécula, péptido o grupo terminal polimérico o mediante la incorporación en un aptámero de nucleótidos modificados. Como se describe aquí, la conjugación de una entidad modificadora y/o la composición química de los nucleótidos de alteración alteran los aspectos fundamentales del tiempo de permanencia del aptámero en la circulación y distribución a tejidos. Además de la eliminación por nucleasas, los agentes terapéuticos oligonucleotídicos están sujetos a la eliminación mediante la filtración renal. Como tal, el oligonucleótido resistente a nucleasa se administra intravenosamente y normalmente muestra una vida media in vivo de < 10 minutos, a menos que pueda bloquearse la filtración. Esto puede lograrse ya sea mediante la facilitación de una rápida distribución fuera del grupo sanguíneo hacia los tejidos o al aumentar el peso molecular aparente del oligonucleótido más allá del tamaño discriminante efectivo para el glomérulo. La conjugación de pequeños terapéuticos de polímero PEG (PEGilación), descrita a continuación, puede aumentar notablemente los tiempos de permanencia de aptámeros en circulación, aumentando así la frecuencia de dosificación y potenciando su efectividad contra objetivos vasculares.
Los aptámeros pueden conjugarse con una variedad de entidades modificadoras tales como polímeros de elevado peso molecular, por ejemplo, PEG; péptidos, por ejemplo, Tat (un fragmento de 3 aminoácidos de la proteína Tat de VIH (Vives, et al . (1997), J. Biol. Chem. 272(25): 16010-7)), Ant (una secuencia de 16 aminoácidos derivada de la tercera hélice de la proteína homeótica de Drosophila antennapedia (Pietersz, et al . (2001), Vaccine 19(11-12): 1397-405)) y Arg7 (pequeños péptidos positivamente cargados y permeables a células compuestos de poliarginina (Arg ) (Rothbard, et al . (2000), Nat. Med. 6(11): 1253-7; Rothbard, J et al . (2002), J. Med. Chem. 45(17): 3612-8)); y pequeñas moléculas, por ejemplo, compuestos lipofílicos como el colesterol. Entre los diversos conjugados descritos aquí, las propiedades ín vivo de los aptámeros se alteran más profundamente mediante la formación de complejos con grupos PEG. Por ejemplo, la formación de complejos de una mezcla de agente terapéutico aptomérico modificado con 2'F y 2 ' -OMe con un polímero PEG de 20kDa impide la filtración renal y promueve la distribución aptomérica tanto en tejidos sanos como inflamados. Más aún, el conjugado de aptámero-polímero PEG de 20 kDa prueba ser casi tan efectivo como el polímero PEG de 40 kDa para evitar la filtración renal de aptámeros. Aunque un efecto de la PEGilación es la eliminación de aptámeros, la exposición sistémica prolongada proporcionada por la presencia por la entidad de 20 kDa también facilita la distribución del aptámero a los tejidos, particularmente aquellos de órganos altamente perfundidos y aquellos en el sitio de inflamación. El conjugado de polímero PEG de 20 kDa y aptámero dirige la distribución aptomérica al sitio de inflamación, de manera que el aptámero PEGilado se acumule en el tejido inflamado. En algunos casos, el conjugado aptomérico PEGilado de 20 kDa es capaz de obtener acceso al interior de las células, por ejemplo, células renales. Los nucleótidos modificados también pueden utilizarse para modular la eliminación plasmática de aptámeros. Por ejemplo, un aptámero no conjugado que se incorpore tanto a la química estabilizadora de 2'F y 2 '-OMe, lo cual es típico de la generación actual de aptámeros conforme exhibe un alto grado de estabilidad de nucleasa in vi tro e in vivo, muestra una rápida pérdida en plasma (es decir, una rápida eliminación plasmática) y una rápida distribución hacia tejidos, principalmente hacia el riñon en comparación con el aptámero no modificado.
cidos nucleicos PEG-derivatizados Como se describe anteriormente, la derivatización de ácidos nucleicos con polímeros no inmunogénicos de elevado peso molecular tienen el potencial de alterar las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de ácidos nucleicos haciéndolos más efectivos como agentes terapéuticos. Los cambios favorables en cuanto a actividad pueden incluir una mayor resistencia a la degradación por nucleasas, menor filtración a través de los ríñones, menor exposición al sistema inmunitario y distribución alterada del agente terapéutico a través del cuerpo. Las composiciones aptoméricas de la invención pueden derivatizarse con entidades polialquilenglicol ("PAG"). Los ejemplos de ácidos nucleicos PAG-derivatizados se encuentran en la Solicitud de Patente de EE.UU. No. de Serie 10/718,833, presentado el 21 de noviembre de 2003, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Los polímeros típicos utilizados en la invención incluyen polietilenglicol ("PEG"), también conocido como polietilenóxido ("PEO") y polipropilenglicol (incluyendo poli isopropilenglicol) . Además, los copolímeros en bloque o aleatorios de diferentes alquilenóxidos (por ejemplo, etilenóxido y propilenóxido) se pueden utilizar en varias aplicaciones. En su forma más común, un polialquilenglicol, tal como PEG, es un polímero lineal terminado en cada extremo con grupos hidroxilo: HO-CH2CH20- (CH2CH20)n-CH2CH2-OH. Este polímero, alfa-, omega-dihidroxilpolietilenglicol, también puede ser representado como HO-PEG-OH, en donde se entiende que el símbolo -PEG representa la siguiente unidad estructural: -CH2CH20- (CH2CH20) n-CH2CH2- en donde n comúnmente abarca de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 10,000. Como se muestra, la molécula PEG es difuncional y algunas veces se refiere como un "PEG diol". Las porciones terminales de la molécula PEG son entidades hidroxilo relativamente no reactivas, los grupos -OH, que pueden activarse o convertirse en entidades funcionales, para la unión de PEG a otros compuestos en sitios reactivos en el compuesto. Estos PEG dioles activados se refieren aquí como PEG diactivado. Por ejemplo, las entidades terminales del PEG diol han sido funcionalizadas como éster de carbonato activo para la reacción selectiva con entidades amino mediante sustitución de las entidades hidroxilo relativamente no reactivas, -OH, con entidades éster con succinimidilo activo de N-hidroxisuccinimida. En varias aplicaciones, se desea rematar en extremos la molécula PEG con una entidad esencialmente no reactiva para que la molécula PEG sea monofuncional (o estén monoactivadas) . En el caso de los agentes terapéuticos proteínicos que generalmente muestran múltiples sitios de reacción para los PEG activados, los PEG bifuncionales activados conllevan a un entrecruzamiento extenso, lo que produce agregados poco funcionales. Para generar más PEG monoactivado, una entidad hidroxilo en el término de la molécula PEG diol normalmente se sustituye con una entidad de extremo metoxilo no reactivo, -OCH3. El otro término rematado en el extremo de la molécula PEG 'normalmente se convierte a una entidad reactiva de extremo que puede activarse para unirse a un sitio reactivo sobre la superficie o en una molécula tal como una proteína. Los PAG son polímeros que normalmente tienen propiedades de solubilidad en agua y en varios- solventes orgánicos, carecen de toxicidad y carecen de inmunogenicidad. Uno de los usos de los PAG es unir covalentemente el polímero a moléculas insolubles para hacer que la molécula PAG resultante sea soluble "conjugada". Por ejemplo, se ha demostrado que el fármaco hidroinsoluble paclitaxel, cuando se copula con PEG, se vuelve hidrosoluble. Greenwald, et al . , J. Org. Chem . , 60:331-336 (1995). Los conjugados PAG comúnmente se utilizan no solo para potenciar la solubilidad y estabilidad pero también para prolongar la vida media en circulación sanguínea de las moléculas. Los compuestos polialquilados de la invención tienen normalmente un tamaño entre 5 y 80 kDa sin embargo, cualquier tamaño puede utilizarse, la elección depende del aptámero y su aplicación. Otros compuestos PAG de la invención tienen un tamaño entre 10 y 80 kDa. Incluso otros compuestos PAG de la invención tienen un tamaño entre 10 y 60 kDa. Por ejemplo, un polímero PAG puede tener un tamaño de al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60 u 80 kDa. Estos polímeros pueden ser lineales o ramificados. En algunas modalidades, los polímeros son PEG. En alguna modalidad, los polímeros son PEG ramificado. Incluso en otras modalidades, los polímeros son PEG ramificados de 40 kDa como se muestra en la Figura 2. En algunas modalidades, el PEG ramificado de 40 kDa está unido al extremo 5' del aptámero como se muestra en la Figura 3. A diferencia de los agentes terapéuticos proteínicos biológicamente expresados, los agentes terapéuticos de ácidos nucleicos normalmente se sintetizan químicamente a partir de nucleótidos monoméricos activados. Los .conjugados de ácidos nucleicos PEG pueden prepararse al incorporar el PEG utilizando la misma síntesis monomérica iterativa. Por ejemplo, los PEG activados mediante conversión a fosforamidita pueden incorporarse en síntesis oligonucleotídica en fase sólida. Alternativamente, la síntesis oligonucleotídica puede complementarse con una incorporación específica de sitio o secuencia de un sitio de unión PEG reactivo. Más comúnmente, esto se ha logrado mediante la adición de una amina primaria libre en el término-5' (se incorpora utilizando un modificador fosforamidita en el último paso de copulación de una síntesis de fase sólida) . Utilizando este método, el PEG reactivo (por ejemplo, uno que esté activado para que reaccione con un enlace con una amina) se combina con el oligonucleótido purificado y la reacción de copulación se lleva a cabo en solución. La habilidad de la conjugación PEG para alterar la biodistribución de un agente terapéutico está relacionada con la cantidad de factores que incluyen el tamaño aparente (por ejemplo, como se mide en términos de radio hidrodinámico) del conjugado. Se sabe que los conjugados mayores (> lOkDa) bloquean más efectivamente la filtración mediante el riñon y en consecuencia aumentan la vida media sérica de las pequeñas macromoléculas (por ejemplo, péptidos, oligonucleótidos antisentido) . La habilidad de los conjugados PEG para bloquear la filtración se ha demostrado porque incrementa el tamaño PEG hasta aproximadamente 50 kDa (otros incrementos tienen un efecto benéfico mínimo ya que la vida media se define por el metabolismo mediado por macrófagos en vez de la eliminación a través de los ríñones). La producción de PEG de elevado peso molecular (> 10 kDa) puede ser difícil, ineficiente y costosa. Como una ruta hacia la síntesis de conjugados de ácido nucleico-PEG de elevado peso molecular, la investigación previa se ha enfocado hacia la generación de PEG activados de elevado peso molecular. Un método para generar estas moléculas implica la formación de PEG activado ramificado de donde dos o más PEG se unen a un núcleo central que transporta el grupo activado. Las porciones terminales de las moléculas PEG de mayor peso molecular, es decir, las entidades hidroxilo (-OH) relativamente no reactivas, pueden activarse o convertirse en entidades funcionales, para unirse a uno o más PEG con otros compuestos en sitios reactivos del compuesto. Los PEG activados y ramificados tienen más de dos términos y en los casos en donde se han activado dos o más términos, éstas moléculas PEG activadas de elevado peso molecular se llaman PEG multiactivadas . En algunos casos, no todos los términos en una molécula PEG ramificada se activan. En casos en donde cualquiera de dos términos de molécula PEG ramificada se activan, estas moléculas PEG se refieren como PEG biactivado. En algunos casos en donde solo un término en la molécula PEG ramificada se activa, éstas moléculas PEG se refieren como monoactivadas . Como un ejemplo de este método, se ha descrito el PEG activado preparado por la unión de dos PEG monometoxilo en el núcleo lisina que subsiguientemente se activa para su reacción (Harris et al . , Nature, vol. 2:214-221, 2003). La presente invención proporciona otra ruta económica para la síntesis de conjugados de ácido nucleico (preferiblemente, aptámero) -PEG de elevado peso molecular que incluye ácidos nucleicos multiPEGilados . La presente invención también abarca oligonucleótidos multiméricos ligados a PEG, por ejemplo, aptámeros dimerizados. La presente invención también se relaciona con composiciones de elevado peso molecular en donde la entidad estabilizadora PEG es un ligador que separa diferentes porciones de un aptámero, por ejemplo, el PEG se conjuga dentro de una sola secuencia aptomérica, de manera que la configuración lineal de la composición aptomérica de elevado peso molecular sea, por ejemplo, un ácido nucleico-PEG-ácido nucleico (-PEG-ácido nucleico) n en donde n es mayor o igual a 1. Las composiciones de elevado peso molecular de la invención incluyen aquellas que tienen un peso molecular de al menos 10 kDa. Normalmente las composiciones tienen un peso molecular entre 10 y 80 kDa de tamaño. Las composiciones de elevado peso molecular de la invención tienen un tamaño de al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60 u 80 kDa. Una entidad estabilizadora es una molécula o porción de una molécula que mejora las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de las composiciones aptoméricas de elevado peso molecular de la invención. En algunos casos, la entidad estabilizadora es una molécula o porción de una molécula que acerca dos o más aptámeros, o .dominios aptoméricos o proporciona una menor libertad giratoria general de las composiciones aptoméricas de elevado peso molecular de la invención. Una entidad estabilizadora puede ser polialquilenglicol tal como polietilenglicol que puede ser lineal o ramificado, un homopolímero o un heteropolímero . Otras entidades estabilizadoras incluyen polímeros como ácidos nucleicos peptídicos (PNA pos sus siglas en inglés). Los oligonucleótidos también pueden ser entidades estabilizadoras. Estos oligonucleótidos pueden incluir nucleótidos modificados y/o enlaces modificados tales como fosforotioatos . Una entidad estabilizadora puede ser parte integral de una composición aptomérica, es decir, está covalentemente unida al aptámero. Las composiciones de la invención incluyen composiciones aptoméricas de elevado peso molecular en donde dos o más entidades de ácidos nucleicos se conjugan covalentemente con al menos una entidad de polialquilenglicol. Las entidades polialquilenglicol sirven como entidades estabilizadoras. En composiciones en donde la entidad polialquilenglicol está covalentemente unida en cualquier extremo de un aptámero, de manera que el polialquilenglicol una las entidades de ácido nucleico en una sola molécula, se dice que el polialquilenglicol es una sola entidad enlazante. En estas composiciones, la estructura principal de la molécula covalente incluye la configuración lineal del ácido nucleico-PAG-ácido nucleico. Un ejemplo es una composición que tiene la estructura principal o primaria de ácido nucleico-PEG-ácido nucleico. Otro ejemplo es una configuración lineal de: ácido nucleico-PEG-ácido nucleico-PEG-ácido nucleico. Para producir el conjugado ácido nucleico-PEG-ácido nucleico, el ácido nucleico se sintetiza originalmente en forma que pueda llevar un solo sitio reactivo (por ejemplo, que esté monoactivado) . En una modalidad preferida, este sitio reactivo es un grupo amino introducido en el término -5' mediante la adición de una fosforamidita modificadora como el último paso en la síntesis de fase sólida del oligonucleótido. Después de la desprotección y purificación del oligonucleótido modificado, se reconstituye a una elevada concentración en una solución que minimice la hidrólisis espontánea del PEG activado. En una modalidad preferida, la concentración del oligonucleótido es 1 mM y la solución reconstituida contiene 20 mM amortiguador -NaHC03, pH 8.3. La síntesis del conjugado se inicia mediante una lenta adición gradual de PEG bifuncional altamente purificado. En una modalidad preferida, el PEG diol se activa en ambos extremos (diactivado) mediante la derivatización con propionato de succinimidilo . Después de la reacción, el conjugado PEG-ácido nucleico se purifica mediante electroforesis en gel o cromatografía líquida para separar las especies completamente, parcialmente y no conjugadas. Las múltiples moléculas PAG concatenadas (por ejemplo, como copolímeros aleatorios o en bloques) o cadenas PAG más pequeñas pueden enlazarse para lograr varias longitudes (o pesos moleculares). Los ligadores que no son PAG pueden utilizarse entre cadenas PAG de varias longitudes. Las modificaciones con nucleótidos modificados y 2'-O-metilo, 2 '-fluoro estabilizan el aptámero contra nucleasas y aumenta su vida media in vivo . El remate 3'-3'-dT también aumenta la' resistencia a exonucleasas . Ver, por ejemplo, Patentes de EE.UU. Nos. 5,674,685; 5,668,264; 6,207,816 y 6,229,002, cada una se incorpora aquí por referencia en su totalidad.
PAG-derivatización de un ácido nucleico reactivo Los conjugados de PAG de elevado peso molecular-ácido nucleico-PAG pueden prepararse mediante reacción de PAG activado monofuncional con un ácido nucleico que contenga más de un sitio reactivo. En una modalidad, el ácido nucleico es birreactivo o está biactivado y contiene dos sitios reactivos: un grupo 5 '-amino y un grupo 3 ' -amino introducido en el oligonucleótido mediante síntesis convencional de fosforamidita, por ejemplo: 3 ' -5 ' -di-PEGilación como se ilustra en la Figura 4. En modalidades alternativas, los sitios reactivos pueden introducirse en posiciones internas, utilizando por ejemplo, 5-posición de pirimidinas, la 8-posición de purinas i 2 '-posición de ribosa en sitios de unión de aminas primarias. En estas modalidades, el ácido nucleico puede tener varios sitios activados o reactivos y se dice que está múltiplemente activado. Luego de la síntesis y purificación, el oligonucleótido modificado se combina con el PEG monoactivado en condiciones que promuevan la reacción selectiva con los sitios reactivos del oligonucleótido mientras que se minimiza la hidrólisis espontánea. En la modalidad preferida, el PEG-monometoxilo se activa con propionato de succinimidilo y la reacción de copulación se lleva a cabo a pH 8.3. Para impulsar la síntesis de PEG bisustituido, se proporciona un exceso estequiométrico de PEG en relación con el oligonucleótido. Luego de la reacción, el conjugado PEG-ácido nucleico se purifica mediante electroforesis en gel o cromatografía líquida para separar completamente, parcialmente y las especies no conjugadas. Los dominios de enlace también pueden tener una o más entidades de polialquilenglicol unidas a éstos. Estos PAG pueden tener longitudes variables y pueden utilizarse en combinaciones apropiadas para lograr el peso molecular deseado de la composición. El efecto de un ligador particular puede estar influenciado tanto por su composición química como por su longitud. Un ligador que sea demasiado largo, demasiado corto o que forme interacciones esféricas y/o únicas desfavorables con trombina precluye la formación del complejo entre el aptámero y trombina. Un ligador, que sea más largo de lo necesario para abarcar la distancia entre ácidos nucleicos, puede reducir la estabilidad de unión al disminuirla concentración efectiva del ligando. Por lo tanto, comúnmente es necesario optimizar las composiciones de ligador a fin de maximizar la afinidad de un aptámero hacia el objetivo. Todas las publicaciones y documentos de patentes citados aquí se incorporan por referencia como si cada publicación o documento fuera específicamente e individualmente indicado, incorporado aquí por referencia. La cita de publicaciones y documentos de patentes no pretende ser una admisión de que cualquiera es la técnica anterior pertinente ni constituye ninguna admisión en cuanto al contenido y fecha del mismo. Habiéndose descrito la invención mediante la descripción escrita, los expertos en la técnica reconocen que la invención puede llevarse a la práctica en una variedad de modalidades y que la descripción anterior y los siguientes ejemplos son para propósitos de ilustración y no pretenden limitar las reivindicaciones que siguen. \ EJEMPLOS Ejemplo 1 : Secuencias y selección de aptámero El objetivo general de este programa fue descubrir un aptámero que actúe como un potente anticoagulante al disminuir o inhibir la actividad de trombina. Específicamente, un potente anticoagulante aptomérico se une al exositio 1 de unión al fibrinógeno de trombina y de esta forma compite con el sustrato (fibrinógeno) para unirse a la enzima. Las selecciones de aptámero se llevan a cabo utilizando una composición de ADN simple a fin de conservar las propiedades farmacodinámicas asociadas con un aptámero ADN de unión a trombina previamente identificado con la siguiente secuencia 5 ' GGTTGGTGTGGTTGG3 ' (SEQ ID NO 4) (ARC183) . El descubrimiento de agentes de unión de exositio 1 de elevada afinidad se logró utilizando la captura en filtro de nitrocelulosa de complejos acompañados mediante la adición de un exceso molar de 10-100 veces de heparina, para bloquear efectivamente el exositio 2 no neutralizante de la mezcla de aptámeros. Además, otras estrategias se llevaron a cabo en nuestro esquema SELEX que incluyen: la captura y desecho de complejos de aptámero protrombina en un paso inicial diseñado para eliminar los aptámeros de unión a protrombina y poner en contacto una mezcla de protrombina y el complejo hirudina/trombina con la mezcla de aptámeros, luego capturar y desechar los complejos de protrombina/aptámero y trombina/hirudina/aptámero. La inclusión del complejo trombina/hirudina pretende presentar efectivamente exositio 2 para la captura y eliminación de la mezcla de agentes de unión no inhibitorios e indeseados en el caso de que la competencia de heparina sea por sí sola ineficaz. Ultimadamente, estas estrategias de selección conllevan a la generación de una serie de aptámeros que tienen una elevada afinidad para trombina y que también disminuyen o inhiben la actividad trombina in vi tro e in vivo .
Ejemplo 1A: Selección #1 de ADN de Trombina Las selecciones basadas en columna con filtro de nitrocelulosa se llevaron a cabo para identificar aptámeros que se unen a trombina humana utilizando una mezcla de nucleótidos que comprende desoxinucleótidos (ADN) , que producen aptámeros de elevada afinidad hacia trombina humana.
Preparación de la mezcla Se sintetiza un molde ADN con la secuencia 5'-GATCGATCCTCAGCCACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGGATTTAGCTTCCRC TTACACGC-3' (ARC1488, SE ID NO 5) utilizando un sintetizador ADN ABI EXPEDIOTE™ y se desprotege mediante métodos convencionales. La serie de N ' en el molde ADN puede ser cualquier combinación de nucleótidos y da lugar a la región de secuencia exclusiva de los aptámeros resultantes. El molde se amplifica mediante PCR con los cebadores 5'- GATCGATCCTCAGCCAC -3' (ARC1489, SEQ ID NO 6) y 5'- TATACGACTC AGCGTGTAAGAGGAAGCTAArA-3' (ARC1490, SEQ ID NO 7) bajo condiciones convencionales. Después de la amplificación, el producto PCR se precipita en etanol y luego se somete a una hidrólisis alcalina (33 mM NaOH, 90°C, 15 min) seguido de neutralización con HCL y adición de un amortiguador con carga de formamida antes de la purificación. Las hebras o cadenas se separan en 10% gel de poliacrilamida desnaturalizante y la mezcla de ADN monocatenario, que migra con una mayor movilidad, se separa del gel, se eluye pasivamente y precipita con isopropanol. La secuencia de la mezcla resultante es el complemento inverso escindido de ARC1488, tiene 50 nt de longitud y tiene la siguiente secuencia: 5'-TCCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTGGCTGAGGATCGARC-3' (ARC1538, SEQ ID NO 8) .
Selección Se llevan a cabo un total de 12 Ciclos de selección contra trombina humana, en el Ciclo 1, se prepara una reacción de unión o aglutinante que comprende 3 ml de IX DPBS (w/Ca2+ y Mg2+) (Gibco, Catálogo #14040, Invitrogen, Carlsbad, CA) , 2 x 1014 moléculas de una mezcla ADN ARC1538 y 900 pmoles de trombina (300 nM concentración final) (Enzyme Research Labs, South Bend; IN) . La reacción de unión se incuba durante dos horas a temperatura ambiente. Durante la incubación, se preparan para la selección columnas para Filtro de Nitrocelulosa Centrex (Schleicher y Schuell, Keene, NH) . Cada columna se somete a tratamiento durante 15 minutos con 1 ml de 0.5 M KOH. Luego del tratamiento, se retira el KOH mediante centrifugación (2000 rpm durante un minuto) y la columna se somete a tratamiento con 1 ml de ddH20 durante 15 minutos adicionales. El ddH20 fue retirado mediante centrifugación (2000 rpm durante 1 minuto) . La reacción de unión selectiva se agrega a la columna del filtro preparada y se centrifuga en una centrifugadora (2000 rpm durante un minuto) . Luego la columna se lava con 1 ml de IX DPBS (w/Ca2+ y Mg2+) (Gibco, Catálogo #14040, Invitrogen, Carlsbad, CA) y se centrifuga detenidamente. Luego de lavarse, la columna se eluye durante 3 minutos con 1 ml de amortiguador para elución (7M urea, 300 mM NaOAc, 5mM EDTA) se precalienta a 90 A y luego se hace girar mediante centrifugación (2000 rpm durante un minuto) y se recolecta en un tubo Eppendorf con capacidad de 1.5 ml . Luego se precipita el eluyente mediante el uso de un volumen de isopropanol y 1 µl de glucógeno. Para todos los siguientes ciclos de selección luego del Ciclo 1, se introduce una columna de selección negativa antes de la selección positiva para eliminar aglutinantes no específicos del filtro en la mezcla. La columna de selección negativa se prepara como se indica anteriormente. Una mezcla de 200 µl de IX DPBS (w/Ca2+ y Mg2+) (Gibco, Catálogo #14040, Invitrogen, Carlsbad, CA) y 60 pmoles de la mezcla de la ronda precia de selección se hace pasar a través de una columna de selección negativa y se recolecta antes de proceder al paso de reacción de unión previamente descrito. También se agrega ARNt competidor en los Ciclos subsiguientes para aumentar la presión selectiva y se agrega heparina al paso de selección positiva en los siguientes ciclos para unirse en el exositio 2 y evitar que los aptámeros se unan al exositio 2 de trombina. Las condiciones de selección utilizadas se describen en la siguiente Tabla 1. La amplificación de las mezclas ADN de ARC1538/ requiere de fosforilación en el extremo 5' seguido de un ligamiento específico de la región constante al extremo 5' de la secuencia, es decir, el cebador-3' utilizado para la amplificación de la secuencia original de ADN sintético de ARC1488), seguido de una amplificación PCR convencional. Por lo tanto, después de la precipitación, la mezcla seleccionada se vuelve a suspender en 9 µl de ddH20 y 10 µl de 2X amortiguador compatible con cinasa (8 ul 1 M DTT más 1 ml 2X amortiguador Quick Ligase (New England Biolabs, Beverly, MA) ) se agrega 1 µl de T4 PNK (New England Biolabs, Beverly, MA) a la reacción y se incuba a 37°C durante 20 minutos. Posterior a la incubación, 100 pmoles del 3' cebador 5'-TATACGACTCAGCGTGTAAGAGGAAGCTAArA-3' (ARC1490) (SEQ ID NO 7) y 100 pmoles de 3' cebador de ligamiento 5 ' -GGGATTTAGCTTCC [3T] -3' (ARC1491) (SEQ ID NO 192) se agregan con 1 µl de T4 ligasa (New England Biolabs, Beverly, MA) y se incuban a temperatura ambiente durante un período de 10 minutos. La reacción se afora a 200 µl en la mezcla PCR que contiene tanto el 5' cebador 5 ' -GATCGATCCTCAGCCAC-3 ' (ARC1489) y 3' cebador (ARC1490). La reacción PCR se cicliza utilizando las siguientes condiciones: desnaturalización a 94 °C durante un minuto, ciclización a 94 °C durante 30 segundos, 54 °C durante 30 segundos y 72°C durante un minuto. El PCR se cicliza hasta que el producto final sea de aproximadamente 10 ng/ml, se estima utilizando 4% E-Gel (Invitrogen, Carlsbad, CA) (referido como "Umbral PCR" en la columna extrema derecha de la siguiente Tabla 1) . Luego el producto se siembra en una reacción PCR de mayor tamaño para una mayor amplificación ADN (20 µl en 400 µl volumen PCR total) . Luego de la amplificación, el producto PCR es etanol y luego se somete a una hidrólisis alcalina (333 mM NaOH, 90°C, 15 min) seguido de neutralización con HCL y la adición de un amortiguador de carga para formamida antes de purificarse en 105 gel PAGE. El producto purificado se eluye pasivamente, se precipita y cuantifica antes de ir al siguiente ciclo de selección. La selección procede como una selección individual hasta el Ciclo 7, en donde la selección se divide en dos ramas (ver Tabla 1) . Una rama de la selección continúa su aumento en cuanto a rigurosidad, como se mide al disminuir la concentración de proteína trombina.
Tabla 1 : Condiciones SELEX para Selección #1 de ADN contra trombina humana:
Moni toreo del progreso de la sel ecci ón : Se llevaron a cabo valoraciones de unión dot biot durante las selecciones para monitorear la afinidad de unión a las proteínas de las mezclas. Se combina ARN marcado con 32P traza con una serie de diluciones (1 nM-1000 nM) de trombina humana y se incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos en IX DPBS (w/Ca2+ y Mg2+) (Gibco Catálogo #14040, Invitrogen, Carlsbad, CA) y además de 0.1 mg/ml BSA en un volumen final de 30 µl. Las reacciones de unión se realizan mediante filtración a través de nitrocelulosa utilizando un Minifold 1 dot biot, colector de filtración al vacío de 96 pocilios (Schleicher y Schuell, Keene, NH) . Se utiliza un medio de filtración de tres capas (de superior a inferior) de nitrocelulosa Protran (Schleicher y Schuell, Keene, NH) , papel para transferencia en gel Hybond-P (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) y GB002 (Schleicher y Schuell, Keene, NH) . El ARN que está unido a la proteína se captura en el filtro de nitrocelulosa, mientras que el ARN que no está unido a proteínas que capturan el filtro de nailon. El papel de transferencia en gel se incluye simplemente como un medio de soporte para los demás filtros . Después de la filtración, las capas de filtro se separan, se secan y se exponen en una pantalla de fósforo (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) y se cuantifica utilizando el sistema de formación de imágenes en transferencia Storm 860 Phosphorimager® (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Cuando se observa una proporción significativamente positiva de unión de ARN en presencia de trombina humana con respecto a la ausencia de trombina, se clonan los grupos utilizando el kit de clonación TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante .
Ciclos 9 y 12 clonación y secuenciación Basándose en la unión de las mezclas , las mezclas del Ciclo 9 y Ciclo 12 se seleccionan para clonarse y secuenciarse . Para el propósito de detección mediante la familia de secuencias , se combinan las mezclas del Ciclo 9 y el Ciclo 12 de ambas ramas de selección . Se sinteti zan todas las secuencias de clones de ADN exclusivo a 25 µmol a escala de síntesis . Se lleva a cabo una detección de los clones del Ciclo 9 para determinar la habilidad de disminuir o inhibir la actividad de trombina utili zando el tiempo de protrombina (valoración PT ) descrito en el siguiente Ejemplo 3A. En la Tabla 17 del siguiente Ejemplo 3 se mencionan los resultados de la valoración PT. La mezcla del' Ciclo 12 demuestra no tener guías exclusivas de la secuencia . Las secuencias de los clones como resultado de las mezclas del Ciclo 9 combinadas se enumeran en la siguiente tabla 2 . La región aleatoria de cada clon comienza después de la secuencia 5 ' TCCC y termina antes de GTGGCTGAGGATCGTATC 3 ' ( SEQ I D NO 42 ) . Sin embargo , ya que la secuencia 5 ' -TCCC no es parte del cebador PCR, se puede observar cierta mutación durante los procesos de SELEX y secuenciación . Por lo tanto , se pueden observar mutantes puntuales en esta región en las siguientes secuencias . A .menos que se observe otra cosa , las secuencias individuales enumeradas a continuación se representan en la orientación 5 ' a 3 ' y fueron seleccionadas bajo condiciones ADN SELEX™ en donde todos los nucleótidos son desoxi .
Tabla 2 : Clones de SELEX #1 del ADN del Ciclo 9 contra trombina humana
AMX(453)_A6 (SEQ ID NO 9) TO ( TCGATCTGGCOTAAttTACTGGGTCGGGTGGCTGAGGATCsATC
AMX(453)_A9 (SEQ ID NO 10) ATCCCAATGT GAGACGAGTAGGTGTGGGTAGGGTsGCTGAGGATCGATC AMX(453)_B6 (SEQ ID NO 11) TCCCATCGAGCTCAGTCTAGGATGGGTAGGGTGGTGGCTGAGGATCGATC
AMX(453)_B8 (SEQ ID NO 12) TCCCATCGAGCCGGGGTATGATTATGGGTGGGGTGGCTGAGGATCGA C
AMX(453)_B10 (SEQ ID NO 13) TCC(^TCGATCTGGGGTAGTTTTATTGGGTCGGG1 _GCTGAGGATCGATC
AMX(453)_B12 (SEQ ID NO 14) TCCCGATCGGTCTGGGGTGTGTrCATGGTTTGGGtGGCTGAGGATCGATC
AMX(453)_C10 (SEQ ID NO 15) TCCTGATTGATCTGAGGGQTATTGTTGGCGTGGGTGGCTGAGGATCGATC
AMX(453)_D12 (SEQ ID NO 16) TCCCGATTGATCTGAGGGGTATrarrGGCGTOGOlOGCTGAGGA CGATC
AMX(453)_E4 (SEQ ID NO 17) TCCCGTAATCGAGTCTGGTATTGtTGGTCTGGGTGGCTGAGGATCGATC
AMX(453)_E8 (SEQ ED NO 18) TCCTATGATXXjAATGACTAAGGGGTGGGGTGGGTGGCTCAGGATCGATC
AMX(453)_E10 (SEQ ID NO 19) TCCCGGGTCGtATCCGTTTGTGGGTsGTCTGGOTGGCTGAGGATCGATC
AMX(453)_E12 (SEQ ID NO 20 CCCGTAATTGAGCCTGGTATTGTTGGTCTGGGTGGCTGAGGATCGATC
AMX(453)_F6 (SEQ ID NO 21) TCCTGATCCK-AtGTGGTGGGTTATTGGTrtGGGTGGCTGAGGA-CGATC
AMX(453)_F7 (SEQ ID NO 22) TCCCGAGCGATACTGTCTAGGTrGGGTAGGGTGG s?CTGAGGATCGATC
AMX(453)_F11 (SEQ ID NO 23) TCCCGAGCGATATTGTCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCTGAGGATCGATC
AMX(453)_G5 (SEQ ID NO 24) CCCATGATCGTTAGATTCAGGGATOGTGTGGGTGGCTGAGGATCGATC
AMX(453)_G11 (SEQ ID NO 25) TCCCGTATCGAGCTTGGtATTGTTGG CTGGsTsGCTGAGGATCGATC
AMX(453)_H11 (SEQ ID NO 26) CCCttTTGACCTGCAAGAA 3GTTaGTGTG K}TGGCT0A0GATCGATC AMX(454)_B7 (SEQ ID NO 27) TrCCGGATCGTTrTGCrrrCAAAsGTTGGGTTGGGTGsCTCAGGATCGATC
AMX(454)J39 (SEQ ID NO 28) CCCGACTGAtTCTTACCTTAGGGATGGTG GGG X GCTGAGGATCGATC
AMX(454)_B12 (SEQ ID NO 29) TCCC GGTrrcGATCTQTrrTGGTrGGTCTG-K-TCGCTCAOGATCsATC
A X(454)JD5 (SEQ ID NO 30) TCCCATCXiATTCGGGGTtriTrAGTG .tATGGGTGGCTGAGsATCGATC
AMX(454)_D6 (SEQ ID NO 31) TCCCATCGATrrGGGGTAG -XrrATrOGGTTGGGTGGCTGAGGATCGATC
A X(454)_D11 (SEQ ID NO 32) TCCCTGCttGTCGATATTTrAGGGTtGGTGTGGGTGGCTGAGGATCGATC
AMX(454)_D12 SEQ ID NO 33) TCCCTCGATCCOGGG'rGTCTTTCGTsGGCrGGGTGGCTGAGGATCGATC
AMX(454)_F2 (SEQ ID NO 34) TCCCGAGCGATAT GCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCTGAGGATCGATC
AMX(454)_F7 (SEQ ID NO 35) TCCCTC_ATCTAAGGTGTTTATtATGGTCTGGGTGGCTGAGGATC_A C
AMX(454)_F9 (SEQ ID NO 36) TCCCTGCATCGAGCCTCTATGsGATGGTrrGGGtGGCTGAGsATCGATC
AMX(454)_G2 (SEQ ID NO 37) trcCGA CGTTCCC TGGGGTAGTGTrGGTTGG?GTGGCTGAGGATCGATC
AMX(454)_G6 (SEQ ID NO 38) TCCCtATG ?TTCGGGGTACGTTAGTGGTCTGGGTGGCTOAGGATCGATC
AMX(454)_H3 (SEQ ID NO 39) TCCCATCGATCTGGGGTAGT1TTATTGGG_TsGsTGGCTGAGGATCGATC
AMX(454)_H6 (SEQ ID NO 40) T XCTGTTGTTCCGGGGTCKSTlTAATGGTrrGaotGGCTGAGGATXXiATC
A3V1X(454)_H7 (SEQ ID NO 41) TCCCATTAGGTCCGTATACIOGTGACM3TT0GGTGGCTaAssATCGATC Ejemplo IB: Selección # 2 y # 3 de ADN de Trombina Se llevan a cabo dos selecciones ADN adicionales basadas en columnas de filtro de nitrocelulosa para: 1) identificar aptámeros que tengan una elevada afinidad para trombina humana con respecto a protrombina , mediante la incorporación mediante la incorporación de protrombina en un paso SELEX negativo; y 2) identificar aptámeros de trombina orientados contra la unión de exositio 2 al agregar el complejo trombina/hirudina en el paso de selección negativa. El complejo trombina/hirudina debe de ocluir efectivamente el exositio 1 y el sitio activo de trombina permitiendo con ello que los agentes de unión potenciales del exositio 2 sean capturados y eliminados de la mezcla. Además, al igual que en la selección 1, se agrega heparina al paso de selección positiva en las siguientes rondas para unir al exositio 2 y evitar que los aptámeros se unan al exositio 2 de trombina.
Selección y preparación de la mezcla La mezcla ADN utilizada para nuevas selecciones se prepara como se escribe en el Ejemplo 1A anterior. Se llevan a cabo un total de 9 Ciclos de selección contra trombina humana (Thrombin (Enzyme Research Labs, South Bend, IN) . En el Ciclo 1, la reacción de unión comprende de 3ml de IX DPBS (w/ Ca2+ y Mg2+) (Gibco Catálogo #14040, Invitrogen, Carlsbad, CA) , 2xl014 moléculas de mezcla ADN ARC1538 y 900 pmoles de trombina (300 nM concentración final) . La reacción de unión se incuba durante dos horas a temperatura ambiente. Durante la incubación, se preparan para la selección columnas Centrex Filter (Schleicher y Schuell, Keene, NH) . Cada columna se somete a tratamiento durante 15 minutos con un ml . De .5M KOH. Luego del tratamiento, el KOH se retira mediante centrifugación (2000 rpm durante 1 minuto) y la columna se somete a tratamiento con 1 ml . de ddH20 durante 15 minutos adicionales. Luego se elimina el ddH20 mediante centrifugación. La reacción de unión selectiva se agrega al Centrex preparado y se hace girar (2000 rpm durante 1 minuto) . Luego la columna se lava con 1 ml. de IX DPBS (w/ Ca2+ y Mg2+) (Gibco, Catálogo #14040, Invitrogen, Carlsbad, CA) y se hace girar mediante centrifugación (2000 rpm durante 1 minuto) . Luego de lavarse, la columna se eluye con 1 ml. de amortiguador de elusión (7M urea, 300 mM NaOAc, 5 mM EDTA) se calienta a 90°C al permitir que el amortiguador de elusión se mantenga en la columna durante 3 minutos antes de centrifugarse a 2000 rpm durante 1 minuto y recolectarse en un tubo eppendorf. El eluyente se precipita utilizando un volumen de isopropanol y 1 µl de glucógeno. Para todos los ciclos subsiguientes del Ciclo 1 se agrega una columna de selección negativa antes de la selección positiva para eliminar los agentes de unión del filtro no específico a partir de la mezcla. Esta columna se prepara como se describe anteriormente se filtran y recolectan antes de proceder a la reacción de unión, una mezcla de 200 µl de DPBS (w/ Ca2+ y Mg2+) (Gibco, Catálogo #14040, Invitrogen, Carlsbad, CA) y 60 pmoles de la mezcla del ciclo previo. El ARNt competidor se agrega también en ciclos subsiguientes para aumentar la presión selectiva y se agrega heparina al paso de selección positiva en ciclos subsiguientes para unirse al exositio 2 y evitar que los aptámeros se unan al exositio 2 de trombina. Las condiciones de selección utilizadas son como las que se describen en la siguiente Tabla 3. Las mezclas seleccionadas se amplifican y purifican como se describe para SELEX 1 en el anterior Ejemplo 1A. La selección prosiguió como una selección individual hasta el Ciclo 3, en donde la selección se divide en dos ramas (ver Tabla 3) . Una rama (Selección 2) continúa como anteriormente, utilizando 300 nM de protrombina humana en el paso de selección negativa de cada sitio. La otra rama (Selección 3) continúa utilizando 150 nM de protrombina (Athens Research, Athens, GA) en el paso de selección negativa y 150 nM de un complejo de trombina e hirudina (American Diagnostica, Stamford, CT) .
Tabla 3 : Condiciones de selección para selecciones #2 y #3 ADN de trombina
Moni toreo del progreso de selección Se llevan a cabo valoraciones de unión dot biot (transferencia en mancha) durante las selecciones para monitorear la afinidad de unión a proteína de las mezclas. Se combina ARN marcado con 32P traza con una serie de diluciones de trombina humana (1 nM-1000 nM) y se incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos en IX DPBS (w/ Ca2+ y Mg2+) (Gibco, Catálogo #14040, Invitrogen, Carlsbad, CA) además de 0.1 mg/ml BSA en un volumen final de 30 µl . Las reacciones de unión se analizan mediante filtración a través de nitroceluloso utilizando un colector de filtración al vacío de 96 pocilios, Minifold I dot biot (Schleicher y Schuell, Keene, NH) . Se utiliza un medio de filtración de tres capas, que comprende (desde arriba hacia abajo) de nitrocelulosa Protran (Schleicher & Schuell, Keene, NH) , papel para transferencia en gel Hybond-P nylon (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) y GB002 (Schleicher & Schuell, Keene, NH) . Se captura el ARN unido a proteína en el filtro de nitrocelulosa, mientras que el ARN no unido a proteínas se captura en el filtro de nylon. El papel de transferencia en gel se incluye simplemente como medio de soporte para los demás filtros. Luego de la filtración, las capas del filtro se separan, se secan y se exponen a una pantalla fosforescente (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) y se cuantifican utilizando un sistema de formación de imágenes por transferencia Storm 860 fosforimager® (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Cuando se observa una proporción positiva significativa de unión de ARN en presencia de trombina humana con respecto a ausencia de trombina, se clonan las mezclas utilizando un kit de clonación TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante.
Ciclo 7 de Selecciones #2 y #3 de ADN: Secuenciación y Detección de Clones Basándose en la unión de las mezclas monitorizadas durante las selecciones como se escribe anteriormente, las mezclas del Ciclo 7 tanto de la Selección #2 y #3 se clonan, se secuencian y se detectan para determinar la habilidad de unirse a trombina utilizando un ensayo de unión a filtro en dos capas. Los clones ADN se sintetizan en orden mediante una escala de síntesis IDT a 25 µmoles. De las 66 secuencia combinadas obtenidas de las mezclas del Ciclo 7 de ambas selecciones, se seleccionan 20 secuencias exclusivas para valorarse en una pantalla dot biot de 1 punto. Los transcriptos de los clones se marcan en el extremo 5' con ?~32P ATP y se purifican mediante centrifugación con columnas Centrisep (Princeton Separations, Adelphia, NJ) para retirar el exceso del marcador. Se incuban la cantidad las cantidades traza del clon marcado con +/- 10 nM trombina y .1 mg/ml BSA en un volumen total de 30 µl IX DPBS (w/ Ca2+ y Mg2+) (Gibco, Catálogo #14040, Invitrogen, Carlsbad, CA) guante 30 minutos. Después de la incubación, la reacción de unión se aplicó al aparato de evaluación de unión dot biot brevemente descrito en el Ejemplo 1A. Para la determinación KD en clones seleccionados, los transcriptos de los clones se marcaron en el extremo 5' con ?~ 32p ATp_ 5- determinaron los valores KD utilizando series de diluciones de trombina humana (que abarcan entre lpM y 1000 nM dependiendo de la afinidad de un clon específico para trombina) en el ensayo de unión dot biot y que se ajusta a una ecuación que describe un complejo ARN:proteína 1:1 a los datos resultantes (fracción de aptámero unido=amplitud* ([ Trombina ]/ ( KD + [Trombina])) ( KaleidaGraph v. 3.51, Synergy Software, Reading, PA) . En la siguiente Tabla 4 se enumeran las secuencias resultantes del Ciclo 7. La caracterización de unión correspondiente de cada clon se tabula en la siguiente Tabla 5. Para cada una de las secuencias enumeradas en la siguiente Tabla 4', la región aleatoria de cada clon comienza luego de la secuencia 5' TCCC y termina antes de GTGGCTGAGGATCGTATC 3' (SEQ ID NO 42) . A menos que se observe otra cosa, las secuencias individuales enumeradas a continuación son representadas en la orientación 5' a 3' y fueron seleccionadas bajo condiciones ADN SELEX™ en donde todos los nucleótidos son desoxy.
Tabla 4: Secuencias de Clones Obtenidos del Ciclo 7, Selección #2 y #3 de ADN de Trombina AMX(395)_A1 (SEQ IDNO43) TCCCTGCAATrcGATCAGCAGGCGTGGTGTGGGTGsCTGAGGAtCGATC
AMX(395)_A4 (SEQ ID NO 44) CCCGGGAGATCactTCGAAAATGGTrGGCGTGGOTGGCTGAGGATCGATC
AMX(395)_A5 (SEQ ID NO 45) TCCCACGCATCQATCCTATATGGGTGGCATGGGGTGGCTGAGGATCGATC
AMX(395)_A11 (SEQ ID NO 46) tCCCGtAAtCGAGCCTGGTATTGtTGGCCTGGG GGCTGAGGATCGA C
AMX(395)_B5 (SEQ ID NO 47) TCCCGCAATCGGTACTCAGGAGGATGGTTGGGGTGGCTGAGGATCGA C
AMX(395)_B7 (SEQ ID NO 48) TCCCGGGATCGAGTCCOATTAGOGATGGTGTGGGTGGCTOAGCATCGATC
AMX(395)_C1 (SEQ ID NO 49) TCCCGGGTGGTTATCTTCTCAGGGATGGTGTGGOTGGCTGAsGA CGATC
AMX(395)_C3 (SEQ ID NO 50) TCCOAAGCGAt(_TGTAAGOGATCGsGrrGCGGGTGaCTGAGGATCGATC
AMX(395)_D5 (SEQ ID NO 51) TCCCGAGTCprATAtCATCAGAGGTTGGAGtGGGTGGCtGAGGATCaATC
AMX(395)_D11 (SEQ ID NO 52) TCCCAAGA CGGTACATACAGTGGGTGGTGAGGGTGGCTGAGGATCGATC
AMX(395)_E2 (SEQ ID NO 53) TCCTATCGATACGOGGTC rcTATTGGGTCGGGGtGGCTGAGGATCGATC
AMX(395)_E4 (SEQ ID NO 54) TCCOSACXrCXJArrACTCAGGGGtGGCTGTGGGTGGCTGAGsATCGATC Tabla 5 : Caracterización de aglutinación de clones de las Selecciones ADN #2 y #3 del Ciclo 7 % Limite a 10 nM SEQ ID NO Clon Trombina (pantalla) Kd (nM) 43 AMX(395)_A1 40.77 6.40 44 AMX(395)_A4 19.64 29.38 45 AMX(395)_A5 3.29 N/A 46 AMX(395) JU1 35.80 N/A 47 AMX(395)_B5 17.10 N/A 48 AMX(395)_B7 32.82 14.48 49 AMX(395)_C1 40.23 7.48 50 AMX(395)_C3 3.57 N/A 51 AMX(395)_D5 13.39 N/A 52 AMX(395)_D11 31.92 5.55 53 AMX(395)_E2 6.51 N/A 54 AMX(395)_E4 24.02 N/A 10 55 AMX(395)_E7 9.12 N/A 56 AMX(395)_E8 21.31 N/A 57 AMX(395)_E11 33.70 N/A 58 AMX(395)_F3 6.29 N/A 59 AMX(395)_G2 33.10 N/A 60 AMX(395)_G11 21.89 N/A 61 AMX(395)_H9 9.61 N/A 62 AMX(395) H10 2.80 N/A -5 **N/A indica que no se cuantificó el KD Ciclo 9 de Selecciones ~2 y #3 de ADN: Secuenciación y Detección de Clones Basándose en la unión de la mezcla monitorizada a través de las selecciones como se describe anteriormente, las mezclas del Ciclo 9 tanto de la Selección #2 y #3 también se
2Q clonaron utilizando el kit de clonación TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante y luego se secuencian. De las 136 secuencias obtenidas del Ciclo 9 de ambas selecciones, se seleccionaron 130 secuencias exclusivas para valorar en una pantalla dot biot de un solo punto contra
trombina y protrombina para evaluar la unión selectiva a trombina. Los clones se ordenaron de IDT (Coralville, IA) a una escala de síntesis de 25 µmoles. Los transcriptos de los clones se marcaron en el extremo 5' con ?~32P ATP y se purificaron mediante centrifugación con columnas Centrisep (Princeton Separations, Adelphia, NJ) para retirar el exceso de marcador. Se incubó una cantidad traza del clon marcado con +/- 10 nM Trombina (o +/- 50 nM protrombina) y .1 mg/ml BSA en un volumen total de 30 µl IX DPBS (w/ Ca2+ y Mg2+) (Gibco, Catálogo #14040, Invitrogen, Carlsbad, CA) durante 30 minutos. Luego de la incubación, la reacción de unión aplicada al aparato de valoración de unión dot biot previamente descrito. Para la determinación de KD en clones seleccionados, los transcriptos de los clones se marcaron en el extremo 5' con ?~ 32p ^ij-p^ LOS valores KD se determinaron utilizando una serie de diluciones de trombina humana (abarcando entre 1 pM y 1000 mN dependiendo de la afinidad de un clon específico para la trombina) en la valoración de unión dot biot ajustándose a una ecuación que describe un complejo 1:1 ARN: proteína a los datos resultantes (fracción de aptámero unido=amplitud* ( [Trombina] / (KD+ [Trombina] ) ) (KaleidaGraph v. 3.51, Synergy Software, Reading, PA) . Las secuencias resultantes del Ciclo 9 de las Selecciones #2 y #3 de ADN se enumeran en la siguiente Tabla 6. La caracterización de unión correspondiente para cada clon se tabula en la siguiente Tabla 7. Para cada una de las secuencias enumeradas en la siguiente Tabla 6, la región aleatoria de cada clon comienza luego de la secuencia 5' TCCC y termina antes de GTGGCTG AGG ATC GTATC 3' (SEQ U) NO 42) . A menos que se observe otra cosa, las secuencias individuales enumeradas a continuación en donde se representan en orientación 5' a 3' fueron seleccionadas bajo condiciones ADN SELEX TM
en donde todos los nucleótidos son desoxy.
Tabla 6: Secuencias de Clones Obtenidos del Ciclo 9, Selección #2 y #3 de ADN de Trombina
Tabla 7: Caracterización de Unión de Clones Obtenidos de Selecciones #2 y #3, Ciclo 9 de ADN de Trombina:
EJEMPLO 2: Secuencias y Optimización de Secuencia y Composición Ejemplo 2A: Minimización de Selección #2 y #3 de ADN de Aptámeros de Trombina Minimi za ción de Clones del ADN del Ci clo 7 de Selección #2 y #3 Se utiliza un programa para el plegamiento de ARN (RNAstructure © (1996-2004) David H. Mathews, Michael Zuker & Douglas H. Turner) para determinar los pliegues secundarios putativos para los clones del Ciclo 7 para los cuales se determina los KD como se escribe anteriormente en el Ejemplo IB. Los clones de elevada afinidad de las secuencias relacionadas y basadas en el plegamiento del clon AMX (395)_C1 (SEQ ID NO 49), las secuencias aptoméricas minimizadas se diseñan y sintetizan. Se determinan los valores KD para cada estructura minimizada utilizando series de dilución de trombina humana (que abarcan entre 1 pM y 1000 nM dependiendo de la afinidad de un clon específico para trombina) en la valoración de unión dot biot previamente descrito en el Ejemplo 1A y que se ajusta a una ecuación que describe un complejo 1:1 ARN:proteína a los datos resultantes (fracción de aptámero unido=amplitud* ( [Trombina] / (KD+ [Trombina] ) ) (KaleidaGraph v. 3.51, Synergy Software, Reading, PA) . La secuencia de la estructura minimizada basada en el aptámero inicial AMX (395) Cl (SEQ ID NO 49), y el KD correspondiente se enumera en la siguiente Tabla 8. Como se muestra, ARC 1985, el polímero de 27 nucleótidos resultante identificado durante la mini ización, muestra la afinidad de unión, más elevada para trombina de todos los clones identificados y minimizados del Ciclo 7 de la Selección ADN #2 y #3. Para los aptámeros ADN minimizados descritos en la siguiente Tabla 8, todos los nucleótidos (A, T, C y G) son desoxy. A menos que se observe otra cosa, las secuencias individuales están representadas en orientación 5' a 3' .
Tabla 8 : Secuencias y Caracterización de Unión de la Estructura Truncada AMX(395)_C1 (SEQ ID NO 49)
Minimi zación de Clones de Selección #2 y #3 de ADN del Ciclo 9
Se diseñan estructuras minimizadas como se escribe anteriormente para los clones identificados en las Selecciones #2 y #3 de ADN del Ciclo 9 y mostraron la afinidad de unión más elevada en la valoración de unión dot biot descrita anteriormente en el Ejemplo IB, así como la mayor habilidad anticoagulante en la valoración PT descrita a continuación en el Ejemplo 3A. Las secuencias de estructuras minimizadas y el aptámero inicial relativo de cada estructura se describen en la siguiente Tabla 9. La actividad funcional de cada estructura minimizada se compara con el aptámero iniciador relativo en la valoración PT descrita a continuación en el Ejemplo 3A. De las estructuras truncadas diseñadas, ARC2091 (SEQ ID NO 197) mostró una potencia comparable al clon inicial en la valoración PT (ver Ejemplo 3A a continuación) . ARC2091 (SEQ ID NO 197) mostró la mejor actividad funcional de todos los clones identificados y minimizados a partir de las Selecciones #2 y #3 de ADN del Ciclo 9 y fue la base para una reselección con aditivo que se escribe en el siguiente Ejemplo 2B. Para los aptámeros ADN minimi zados de scritos en la siguiente Tabla 9 , todos los nucleótidos (A, T , C y G) son de soxy . A menos que se observe otra cosa , las secuencias individuales están representadas en la orientación 5 ' a 3 ' .
Tabla 9: Secuencia de Estructuras Truncadas Diseñadas de Clones Identificados en el Ciclo 9 de Selección ADN #2 y #3 Contra Trombina Humana
Ejemplo 2B: Reselección dopada con ARC2091 Se lleva a cabo una selección utilizando una mezcla dopada basándose en la secuencia de unión a trombina humana minimizada, ARC2091 (SEQ ID NO 197) (que se describe en el Ejemplo 2A) a fin de identificar agentes de unión con mayor afinidad a trombina. Las reselecciones dopadas se utilizan para explorar los requerimientos de secuencia dentro de un clon activo o minímero. Las selecciones se llevan a cabo con una mezcla sintética y degenerada que ha sido diseñada basándose en una sola secuencia. En el nivel de degeneración usualmente varía de 70% a 85% de los nucleótidos naturales. En términos generales, se observan mutaciones neutras pero en algunos casos los cambios de secuencia pueden dan como resultado un mejoramiento de afinidad. La información de secuencia compuesta puede utilizarse para identificar el motivo de unión mínima y ayudar a los esfuerzos de optimización.
Preparación de mezcla.: Se sintetiza un molde ADN con la secuencia 5' ATGCTTTTAT CCTTCGGCGATACTGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCTGAGGATCGCCGA ATTTCCCGAGAGTTCC 3' (ARC2082, SEQ ID NO 205) utilizando un sintetizador ADN ABI EXPEDITE™ y se desprotege mediante métodos convencionales. Los nucleótidos en negritas tienen una probabilidad del 85% de ser el residuo indicado y un 5% de probabilidad de ser uno de los otros 3 nucleótidos. Los moldes se amplifican con 5' Cebador 5' ATGCTTTTATACCTTCGGC 3' (ARC2083, SEQ ID NO 206) y 3' Cebador 5' GGAACTCTCGGGAAATTCG 3' (ARC2084, SEQ ID NO 207) . Después de la amplificación, el producto PCR se precipita en etanol y luego se somete a una hidrólisis alcalina (333 mM NaOH, 90°C, 15 min) seguido de neutralización con HCL y la adición de un amortiguador de carga en formamida antes de purificarse en un gel 10% PAGE.
Selección Se llevan a cabo un total de 3 Ciclos de reselección dopada basada en columna de nitrocelulosa contra trombina (Enzyme Research Labs, South Bend, IN) . Se preparan columnas Centrex (Schleicher y Schuell, Keen, NH) como se describe previamente en el Ejemplo 1A. Se incluye un paso de selección negativa comenzando en el Ciclo 1 para retirar los agentes de unión del filtrado no específico de la mezcla. Para cada ciclo, se prepara el filtro negativo como se describe previamente en el Ejemplo 1 y se centrifugan y recolectan 100 pmoles de ARC2082 en 200 µl de IX DPBS (500 nM concentración de mezcla) . Luego del paso de selección negativa, se agregan 20 pmoles de trombina (100 nM concentración final), 0.1 mg/ml de ARNt competidor y 0.1 mg/ml heparina a la mezcla filtrada y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora. El ARNt competidor se incluye para aumentar la presión selectiva y se agrega heparina al paso de selección positiva para unirse a exositio 2 y evitar que los aptámeros se unan al exositio 2 de trombina. Las condiciones de selección de cada ciclo se muestran en la siguiente Tabla 10. Para cada ciclo, se agrega la reacción de unión por selección al Centrex preparado y se centrifuga cuidadosamente ( 2000 rpm durante 1 minuto ) . Luego se lava la columna con 1 ml de IX DPBS (p/Ca2+ y Mg2+) (Gibco, catálogo # 14040 , Invitrogen, Carlsbad, CA) y se centrifuga ( 2000 rpm durante 1 minuto ) . Luego de lavarse , la columna se eluye con 1 ml de amortiguador de elusión (7M urea, 300 mM NaOAc, 5 mM EDTA) se calienta a 90 °C al permitir que el amortiguador de elusión se mantenga en la columna durante 3 minutos antes de centrifugarse a 2000 rpm durante 1 minuto y recolectarse en un tubo eppendorf . El eluyente se precipita utilizando un volumen de isopropanol y 1 µl de glucógeno. La reacción se afora a 200 µl en una mezcla PCR que contiene 5' Cebador 5' ATGCTTTTATACCTTCGGC 3' (ARC2083) (SEQ ID NO 206) y 3' Cebador 5' GGAACTCTCGGGAAATTCG 3' (ARC2084 ) (SEQ ID NO 2084 ) . La reacción PCR se cicliza utilizando las siguientes condiciones : desnaturalización a 94 °C durante 1 minuto, ciclización a 94 °C durante 30 segundos, 54°C durante 30 segundos, y 72°C durante 1 minuto; hasta que el producto final sea aproximadamente 10 ng/µl como se mide mediante un 4% E-Gel (Invitrogen, Carlsbad, CA) (nombrado como "Umbral PCR" en la columna derecha de la Tabla 10) . Luego el producto se siembra en una reacción PCR más grande para una mayor amplificación (20 µl en 400 ul volumen PCR total) . Después de la amplificación , el producto PCR se precipita en etanol y se somete a hidrólisis alcalina ( 333 mM NaOH, 90 °C , 15 min ) seguido de neutrali zación con HCL y adición de un amortiguador de carga en formamida antes de purificarse en 10% gel PAGE . El producto purificado se eluye , se concentra y se cuantifica antes de pasar al siguiente ciclo de selección. La subsiguiente precipitación y purificación en gel ocurrieron como se menciona previamente.
Tabla 10: Condiciones de reselección dopada ARC2091 (SEQ ID NO 197)
Secuenciación y detección Luego de tres ciclos de selección, la mezcla dopada se clona utilizando el kit de clonación TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las recomendaciones del fabricante y se secuencia. Se identifican un total de 75 secuencias exclusivas, como se muestra en la siguiente Tabla 11. Antes de finalizar la reselección dopada, se diseña y sintetiza un derivado de 30 monómeros de ARC2091 (SEQ ID NO 197) que se refiere como ARC2169 (SEQ ID NO 283) que retienen toda la afinidad de unión a trombina de ARC2091 (SEQ ID NO 197) . Las secuencias de la reselección dopada incluyen mutaciones tanto dentro y fuera del motivo funcional central para el aptámero definido por la secuencia de ARC2169 (SEQ ID NO 283) . No se toman en cuenta las mutaciones fuera de este núcleo y las mutaciones dentro del núcleo se analizan en el contexto de la secuencia ARC2169 (SEQ ID NO 283) . Por lo tanto, a partir de las secuencias que se muestran en la siguiente Tabla 11, se diseña un panel de clones basados en ARC2169 (SEQ ID NO 283) utilizando los datos obtenidos de la reselección dopada (ver Tabla 12) para analizar el efecto de otra minimización y el efecto de la mayoría de las mutaciones prevalentes resultantes de las reselecciones dopadas en la función aptomérica. Se cuantifica el efecto de mutaciones con respecto a la función aptomérica utilizando el ensayo PT y se describe en el siguiente Ejemplo 3. Para los aptámeros ADN descritos en la siguiente Tabla 11 y Tabla 12, todos los nucleótidos (A, T, C y G) son desoxi. A menos que se observe otra cosa, las secuencias individuales se representan en orientación 5' a 3' .
Tabla 11: Clones de reselección dopada de ARC2091 (SEQ ID NO 197) , Ciclo 3
Tabla 12 : Panel de estructuras minimizadas diseñadas con mutaciones resultantes de la reselección dopada de ARC2091 (SEQ ID NO 197)
Al utilizar ARC2091 (SEQ ID NO 197) y los datos de la reselección dopada, se logran una mayor minimización de ARC2169 (SEQ ID N?' 283) a un aptámero de 26 nucleótidos referido como ARC2172 (SEQ ID NO 294) sin comprometer la afinidad de unión para trombina, como se muestra en la siguiente Tabla 13. Para los aptámeros ADN descritos en la siguiente Tabla 13, todos los nucleótidos (A, T, C y G) son desoxi. Las estructuras secundarias putativas son (utilizando RNAstructure © (1996-2004) David H. Mathews, Michael Zuker y Douglas H. Turner) para ARC2169 (SEQ ID NO 283), ARC2171 (SEQ I D NO 293 ) y ARC2172 ( SEQ ID NO 294 ) se muestra en la Figura 5 . A menos que se observe otra cosa , las secuencias individuales se' representan en la orientación 5 ' a 3 ' .
Tabla 13 : Secuencias y caracterización de unión de estructuras minimizadas basadas en el aptámero inicial ARC2169 (SEQ ID NO 283)
La afinidad de unión de ARC2172 (SEQ ID NO 294) se compara con el aptámero ADN de unión a trombina previamente identificado, ARC183, utilizando el ensayo de unión a filtro de nitrocelulosa previamente descrito en el Ejemplo 1A. Como puede observarse en la Figura 6, ARC2172 (SEQ ID NO 294) muestra una afinidad significativamente mejorada para trombina en relación con ARC183. ARC2172 (SEQ ID NO 294) también se analiza para determinar la reactividad cruzada entre especies contra trombina de rata, cerdo y de humano (cada una de Enzyme Research Labs, South Bend, IN) , utilizando el ensayo de unión a filtro de nitrocelulosa. Como se muestra en la Figura 7, ARC2172 (SEQ ID NO 294) se une a trombina de rata y cerdo, además de trombina humana.
Ejemplo 2C: Optimización de clones minimizados ARC1985 y ARC2169 Se observó una tendencia ligeramente hacia abajo entre la función aptomérica como se cuantifica mediante el ensayo ACT (ver Ejemplo 3B) disminuye conforme los aptámeros disminuyen de tamaño mediante esfuerzos de minimización. Por lo tanto, los esfuerzos iniciales de optimización involucrados en el alargamiento de moléculas al agregar pares de bases adicionales o colas de poli-T de la estructura inicial putativa. Las siguientes moléculas cuyas secuencias se enumeran a continuación en la Tabla 14 se basan ya sea en ARC1985 (SEQ ID NO 191) y ARC2169 (SEQ ID NO 283): ARC2173-ARC2184 se diseñan teniendo adiciones de una a cinco pares de bases adicionales, ARC2185-ARC2196 se diseñan teniendo adiciones ya sea de tres o seis adiciones "T" ya sea en el término 5' o 3' ; ARC2183 y ARC2184 son aptámeros basados en aptámeros (ARC183) (SEQ ID NO 4) antitrombina previamente seleccionados incorporando los elementos iniciadores de ARC1985 (para ARC2183) o ARC2169 (para ARC2184) en ARC183 en un esfuerzo para determinar similitudes entre el aptámero de trombina previamente seleccionado, ARC183 y el presente conjunto de moléculas. Estos aptámeros optimizados se analizan para determinar la funcionalidad utilizando una detección de punto único (10 µM concentración aptomérica) en el ensayo ACT descrito a continuación en el Ejemplo 3B. Para los aptámeros ADN descritos en la siguiente Tabla 14, todos los núcleótidos (A, T, C y G) son desoxi. A menos que se observe otra cosa, las secuencias individuales se representan en orientación 5' a 3' .
Tabla 14: Secuencias de aptámeros generados durante la optimización de fase 1 de ARC1985 y ARC2169 (SEQ ID NO 283) Otras optimizaciones se emplean ARC2169 (SEQ ID NO 283) como molécula base, y una serie de derivados se sintetizan a 1 µmol para reemplazar cada base individualmente con ya sea 2' -OMe o base fosforotioato. Todas las bases dG (desoxi guanosina) se sustituyen individualmente por bases di (desoxi inopina) o mi (2' -OMe). Cada molécula se purifica mediante gel PAGE y se evalúan para determinar su unión a trombina utilizando el ensayo de unión dot biot bajo las condiciones previamente descritas en el Ejemplo 1. Las secuencias y caracterización de unión de estos derivados ARC2169 (SEQ ID NO 283) se enumeran en la siguiente Tabla 15. Basándose en los datos de unión que se muestran en la Tabla 15, se puede determinar que ninguna sola sustitución individual aumenta en gran medida la unión a trombina. Para los aptámeros descritos en la siguiente Tabla 15, "d" denota un desoxi nucleótido, "m" denota un nucleótido 2' -OMe, "I" denota inopina y "s" denota un enlace internucleotídico de fosforotioato. A menos que se observe otra cosa, las secuencias individuales se representan en la orientación 5' a 3' . Tabla 15 : Secuencias de aptámeros generados durante otra optimización de ARC2169 (SEQ ID NO 283)
SEQ ID Nombre NO del Secuencia Clon (pM) S19 ARC2613 ¡nAliCtdGdC-CTdAiIGdGTTdGsIG-GTíiAdGilGflG'i-G GTdG is CdAdGT 173 320 ARC2614 dAnCTdG-CdCTdAdGdGTTiIGdOdGTdAdGdGdGTdGdGTdGdGdCdAdGT 52 321 ARC2615 dAdCmUdGdCdCTdAdGdGTTdGdGdGTdAdCdGdGTdGdGTdGdGdCdAdGT 94 322 ARC2616 dAdCTniG.C-CTdAdGdGpdGdGdGTdAdGdGdGTdGdGTdGdOdCdAdGT 91 323 ARC2617 d?dCI-Gn dCTd.AdGdGridndGdGTdArGdGdCTdGcG'rdG-OdCdAdGT 80 324 ARC2618 dAdCTdGdCmCTdAdG-GTTdGdGdGTdAdGdGdGTcGdOTdGdCdCdAdGT 121 325 ARC261 dAdCTdGdrdCmUdAdGdGTTdGdGdGTdAdGJGdGTdGdGTdGdGdC-AflGT 215 326 ARC2620 -AdCTdGdCdCr .AdüdGlTdGílGdGTdAdGdGdGVdGdGTdGdOdCdAdGT 7100 327 ARC2621 JAdrTdGdCdCTdAmGdGpdG-GdOTdAdGdGdGTdGdGTdCi'GdCoAdGT 1519 328 ARC2622 d?dCTdGdCdCIdAdUmGTTilGdGdGT AdOdGdGTdGdGTdGdOOCdAdGT 38 329 ?RC2623 dAdLpdOdCdC'r-AdGdChiiUT.GdGdGT-AdGdU-GTdGdG'IaGdGdCdAdGT 746 330 ARC2624 dAdCTdGdCdCTdAdGdGrmUJGdGdGTdAdGdGdGTdGdsrdGdGdCdAdGT ?N'B 331 ARC2625 dAdCT-GdCdCTd?dGdGTTmG-GdGTdAdGdGdGTdGdGTdGdGdCdAdGT 568 332 ARC2626 d?dCTd&lCdCTdAdGdGTT.&pGdGTdAdGdGdG'T-GdCTdGdGdCd?dOT 1587 333 ARC2627 -AdCTdGdCdCtaAá dGTTdGáG GTdAdGdGdGTdCdGTdGds-CdAdCT NB 334 ARC2628 dAdCTdGdCdCTdAdGdGTTdC-GdGmUdAdGdG-GTdGdGTJGdGdCdAdOT 207 335 ARC2629 dAdCTdGdCdCTdAdGaGTTdGdGdGTmAdsdGdGTdGdG'IdGaGdCdAdGT NB 92 02 ?t oí
191 92 02 91 01
391
£91 Ejemplo 2D: Fase 2 de ARC2169, ARC2170, ARC2171 y ARC2172 Se lleva a cabo una fase adicional de optimización principalmente para modular la duración de actividad de los aptámeros guía in vivo (ya que se desea para este compuesto un perfil de ciclos rápidos de activación y desactivación de síntesis de citocinas) . Para este fin, se diseñan una serie de estructuras- con bases 2' -OMe toleradas en las regiones iniciadoras. También se alteran las iniciadoras para convertir algunos pares de bases G-C en pares de bases A-T para debilitar el apareamiento de bases y posiblemente reducir la estabilidad de la molécula y permitir una degradación más rápida. Las mutaciones en forma de sustituciones 2 '-OMe y en pares de bases G-C en A-T se indican a continuación utilizando ARC2169 (SEQ ID NO 283), ARC2170 (SEQ ID NO 292), ARC2171 (SEQ ID NO 293) y ARC2172 ' (SEQ ID NO 294) como moléculas iniciadoras. Cada aptámero se sintetiza a una escala de síntesis de 1 µmol y se purifica en PAGE antes de llevar a cabo una valoración para la unión a trombina mediante el ensayo dot biot previamente descrito en el Ejemplo 1. Las secuencias y caracterización de unión de esta serie de estructuras optimizadas se enumeran a continuación en la Tabla 16. Para los aptámeros descritos en la siguiente Tabla 16, "d" denota un desoxi nucleótido y "m" denota un nucleótido 2' -OMe. Al menos que se observe otra cosa, las secuencias individuales se representan en la orientación 5' a 3A Tabla 16: Secuencias y caracterización de unión de ARC2169, ARC2170, ARC2171 y ARC2172 optimizados Ejemplo 2E: Síntesis de conjugados Aptámero 5' -PEG Basándose en los resultados preliminares de los primeros esfuerzos de optimización descritos anteriormente utilizando el alargamiento de las regiones iniciadoras, se preparan los pequeños conjugados 5' -PEG de los aptámeros antitrombina ARC2169 (SEQ ID NO 283) y ARC2172 (SEQ ID NO 294) . El concepto es que los pequeños. PEG pueden mejorar la potencia aptomérica sin prolongar significativamente la duración de la actividad funcional in vivo (debido a que para este compuesto se desean ciclos rápidos de activación y desactivación de síntesis de citocinas) . Primero se preparan los aptámeros al sintetizar versiones modificadas con 5' -amino de aptámeros para facilitar la copulación química a 5'NH2-dAdCTdGdCdCTdAdGdGTTdGdGdGTdAdGdGdGTdGdGdCdAdGT3' (ARC2321, SEQ ID NO 435) y 5'NH2-dCdGdCdCTdAdGdGTTdGdGdGTdAdGdGdGTdGdGTdGdGdCdG 3' (ARC2324, SEQ ID NO 436) y se sintetizan en un sintetizador AKTA OligoPilot 100 (GE Healthcare, Uppsala, Suiza) según los procedimientos recomendados del fabricante utilizando fosforamiditas ADN convencionales y comercialmente disponibles (ChemGenes Corp. Wilmington, MA) y un soporte como se indica a continuación: para ARC2327 (SEQ ID NO 439 y 2338 (SEQ ID NO 438) un Primer Support 200 (soporte de cebador) dG (CAT# 17-5262-02, GE Healthcare, Uppsala, Suecia); para ARC2329 (SEQ ID NO 440) un soporte CPG de iBu DMT desoxiguanosina (CAT# CPG60N11DGVN, Prime Synthesis, Aston, PA) y para ARC2323 (SEQ ID NO 437) un soporte CPG de DMT desoxitimidina (CAT# CPG60N11DTN, Prime Synthesis, Aston, PA) . Las funciones amino terminales se fijan con amino C-6 CED fosforamidita 5' -amino-modificadora de TFA (ChemGenes Corp. Wilmington, MA) . Luego de la desprotección, el oligonucleótido se purifica mediante cromatografía de intercambio iónico en resina Súper Q 5PW (30) (Tosoh Biosciences, Montgomeryville, PA) y se precipita en etanol. Se conjugan partes alícuotas de los aptámeros 5'-amino-modificados con entidades PEG, de manera post-sintética (por ejemplo, entidades PEG de 2, 5 y 10 - kDa) . Los aptámeros se disuelven en una solución de agua/DMSO (1:1) a una concentración entre 1.5 y 3 mM. Se agrega amortiguador de carbonato de sodio, pH 8.5, a una concentración final de 100 mM y el oligo se hace reaccionar durante la noche con un exceso molar de 1.7-3 veces el reactivo PEG deseado (éster de p-nitrofenil carbonato Sunbright GL2-400NP de 10 kDa [NOF Corp, Japón]) disuelto en un volumen igual de acetonitrilo. Los productos resultantes PEGilados se purifican mediante cromatografía de intercambio iónico en resina Súper Q 5PW (30) (Tosoh Biosciences, Montgomeryville, PA) y se desalinizan utilizando cromatografía de fase inversa que se lleva a cabo en resina Amberchrom CG300-S (Rohm y Haas, Filadelfia, PA) y se liofilizan.
Las secuencias aptoméricas PEGiladas resultantes se enumeran a continuación. Estos aptámeros, junto con sus contrapartes 5' amina se analizan mediante una valoración ACT a diversas concentraciones de aptámero en sangre completa humana (ver Ejemplo 3B) . Para cada secuencia enumerada a continuación, la letra "d" denota un desoxinucleótido (observación, todos los nucleótidos en la secuencia enumerada a continuación son desoxi, incluyendo "T" que se representa como "T" y no como "dT") , y "NH" denota hexilamina para facilitar la copulación química. ARC2323 ( SEQ ID NO 437 ) (ARC2169 + 5 ' -amina + lOkDa PEG) PEG10K-nh-dAdCTdGdCdCTdAdGdGTTdGdGdGTdAdGdGdGTdGdGTdGdGdCdAdGT Que comprende la siguiente estructura :
En donde el aptamero= dAdCTdGdCdCTdAdGdGTTdGdGdGTdAdGdGdGTdGdGTdGdGdCdAdGT ARC2338 (SEQ ID NO 438) (ARC2172 + 5 ' -amina + 2 IcDa PEG) PEG2K-nh-dCdGdCdCTdAdGdGTTdGdGdGTdAdGdGdGTdGdGTdGdGdCdG Que comprende la siguiente estructura:
En donde el aptamero= CdGdCdCTdAdGdGTTdGdGdGTdAdGdGdGTdGdGTdGdGdCdG ARC2327 (SEQ ID NO 439) (ARC2172 + 5 ' -amina + 5 IcDa PEG) PEG5K--nh-dCdGdCdCTdAdGdGTTdGdGdGTdAdGdGdGTdGdGTdGdGdCdO Que comprende la siguiente estructura:
Aptamero 3' En donde el aptamero=
OCdGdCdCTdAdGdGTTdGdGdGTdAdGdGdGTdGdGTdGdGdCdG ARC2329 (SEQ ID NO 440) (ARC2172 + 5' -amina + 10 IcDaPEG) PEGlOK-nh-dCdGdCdCTdAdGdOTTdGdGdOTdAdGdGdQTdGdGTdGdGdCdG Que comprende la siguiente estructura:
En donde el aptamero= dCdGdCdCTdAdGdGTTdGdGdGTdAdGdGdGTdGdGTdGdGdCdG
EJEMPLO 3: ENSAYOS FUNCIONALES IN VITRO Ejemplo 3A: Ensayo de protrombina El factor tisular es un potente inductor de la vía "extrínseca" de coagulación que se libera en el sitio de la lesión. El tiempo de protrombina ("PT") mide el tiempo de coagulación mediante la adición de una cantidad suficiente del factor tisular al plasma es más sensible a los niveles de la vía extrínseca del factor VII y los factores I (fibrinógeno), II (protrombina), V y X de la vía "común". El agente PT, llamado tromboplastina , comprende de un factor tisular mezclado con fosfolípidos y calcio, los cuales son cofactores necesarios para la activación de varios factores de la coagulación. Además de los diagnósticos de deficiencias de factores, el PT clínico se utiliza más comúnmente para monitorear la warfarina anticoagulante oral, un antagonista de vitamina K. El PT no se utiliza para la monitoreo clínica de heparina, pero es sensible a elevadas concentraciones de heparina utilizadas para CABG, que abarcan hasta 5U/ml (por ejemplo, el tiempo PT a lU/ml heparina es de 142% del testigo normal; no se muestran datos) . Los ensayos PT utilizan un analizador de coagulación Coag-a-mate (Biomerieux, Durham, NC) , tromboplastina liofilizada (Fisher Scientific), plasma humano cifrado (Innovative Research, Southfield, MI) y una concentración conocida de aptámero. La concentración conocida de aptámeros se preincuba a 37°C durante 3 minutos con plasma cifrado en una bandeja de pruebas (Biomerieux, Durham, NC) . Luego se inicia la coagulación con 200 µl de tromboplastina-D (Pacific Hemostasis, Fisher Diagnostics, Middleto n, VA) (se resuspende de la forma liofilizada en 10 mis de ddH20) y se determina el tiempo de coagulación analizando la muestra de prueba en el Coag-a-mate. Se obtienen muestras en duplicado y se promedian para un solo tiempo PT . Un tiempo de coagulación de ~13 segundos se cuantifica en ausencia de cualquier inhibidor/aptámero, lo cual se encuentra del intervalo clínico "normal" para el testigo de 12-14 segundos. Un valor de 300 segundos es el valor máximo cuantificado por el instrumento. Los aptámeros identificados del Ciclo 9 de la Selección #1 de ADN trombina (ver Ejemplo 1A) se detectan para demostrar su habilidad de disminución o inhibición de actividad de trombina utilizando el ensayo PT descrito. Los valores PT se cuantifican en presencia de 3 o 10 micromolares de aptámero mediante la adición de tromboplastina de conejo (Pacific Hemostasis, Fisher Diagnostics, Middletown, VA) al plasma humano cifrado, utilizando el Coag-A-Mate (Biomerieux, Durham, NC) para la detección óptica de la formación de polímeros de fibrina. Los valores PT para 10 uM de aptámeros de unión a trombina identificados del Ciclo 9 de Selección #1 de ADN se enumera en la siguiente Tabla 17. Obsérvese que los valores de referencia no se sustraen de los valores PT enumerados en la Tabla 17.
Tabla 17: Valores PT para Selección #1 ADN del Ciclo 9 de Aptámeros de Trombina
Las estructuras minimizadas de aptámeros de unión a trombina identificados durante el Ciclo 7 de las Selecciones #2 y #3 de ADN (ver Ejemplo 2A) también se detectan para determinar su habilidad para disminuir o inhibir la actividad de trombina utilizando 10 µM aptámero en el ensayo PT descrito anteriormente. Los valores PT (incluyendo los de referencia) para la estructura minimizada ARC1985 se muestran a continuación en la Tabla 18.
Tabla 18 : Valores PT para Aptámeros de Trombina Minimizado del Ciclo 7, Selección #2 ADN
Los aptámeros de unión a trombina seleccionados que se identificaron durante el Ciclo 9 de Selecciones #2 y #3 de ADN (ver Ejemplo 2A) que mostraron una elevada afinidad de unión a trombina también se detectan para determinar su habilidad para disminuir o inhibir la actividad de trombina utilizando 10 µM aptámero en el ensayo PT descrito anteriormente. Los resultados se muestran en la siguiente Tabla 19. Observe que el "N-A" en la siguiente Tabla 19 indica que los valores PT no fueron cuantificados .
Tabla 19: Valores PT (incluyendo las referencias) para Aptámeros de Trombina del Ciclo 9 con la Selección #2 y #3 de ADN
Las estructuras minimizadas de los aptámeros altamente específicos para trombina identificados durante el Ciclo 9 de las Selecciones #2 y #3 de ADN (ver Ejemplo 2A) también se detectan para determinar su habilidad para disminuir o inhibir la trombina utilizando 10 µM aptámero en el ensayo PT descrito anteriormente. Una comparación de los valores PT (incluyendo la referencia) para estos aptámeros minimizados en relación con el aptámero inicial del cual se derivan las estructuras minimizadas se enumera a continuación en la Tabla 20.
Tabla 20: SELEX #2 Y #3 ADN de Ciclo 9: Valores PT de Aptámeros Minimizados en Comparación con los Aptámeros Iniciales Respectivos en Ensayo PT
Las estructuras minimizadas diseñadas basándose en la Reselección Dopada descrita en el Ejemplo 2B también se detectan para determinar su habilidad para disminuir o inhibir la actividad de trombina en el ensayo PT descrito anteriormente. Los resultados se muestran en la siguiente Tabla 21.
Tabla 21: Valores PT (incluyendo las referencias) para Aptámeros de Trombina Minimizados de Reselección Dopada de ARC2091 (SEQ ID NO 197)
También, se detecta ARC2172 (SEQ ID NO 29'4) para determinar su habilidad para disminuir o inhibir la actividad de trombina en comparación con ARC183 utilizando el ensayo PT descrito anteriormente. Como se muestra en la Figura 8, ARC2172 (SEQ ID NO 294) es más potente que cualquiera de ARC183 a las mismas concentraciones molares.
Ejemplo 3B: Ensayo de Tiempo de Coagulación Activada ACT cuantifica el tiempo de coagulación en sangre completa no cifrada al agregarle un activador de la vía intrínseca. Siendo menos sensible a la heparina que aPTT (por ejemplo, el tiempo ACT a 1 U/ml heparina es de 181% del testigo normal; no se muestran datos) , el ACT se utiliza comúnmente como la prueba básica para monitorear las elevadas dosis de heparina durante CABG. A diferencia de otras pruebas de coagulación, el ACT no está estandarizado; por lo tanto, los resultados ACT varían dependiendo del tipo de activador y método de detección utilizado. El tiempo de coagulación objetivo publicado para este instrumento es > 420 segundos para la anticoagulación con heparina mediante una cirugía de derivación, que corresponde a una concentración de 3-5 U/ml. Se llevaron a cabo las siguientes cuantificaciones en un analizador de coagulación que utiliza la detección óptica (Hemochron Jr., ITC Med, Edison NJ) utilizando ACT+tubo de laboratorio (ITC Med, Edison NJ) . Los aptámeros seleccionados descritos en los Ejemplos 1 y 2 que muestran una elevada afinidad de unión para trombina o excelentes valores PT en el ensayo PT descrito anteriormente se detectan para determinar su habilidad para disminuir o inhibir la actividad de trombina utilizando el ensayo ACT. En resumen, 70 µl de sangre completa recién extraída se preincuban con un intervalo de concentración conocido (0-10 µM) de aptámeros seleccionados, se agrega a la sangre un volumen de 7 µl durante 30 segundos a temperatura ambiente. Inmediatamente después, 30 µl de 25 mM CaCl2 se agregan a la mezcla de sangre/aptámero, luego las muestras se cargan en tubos de laboratorio + ACT (Hemochron Jr., ITC Med, Edison NJ) y se precalientan a 37°C para el análisis en el analizador de coagulación Hemocron Jr (Hemochron Jr., ITC Med, Edison NJ) . Se considera como valor de referencia un tiempo cuantificado de 125-150 segundos para el ensayo ACT. Los resultados de aptámeros seleccionados en el ensayo ACT se muestran en la siguiente Tabla 22. Observe que el valor de referencia no ha sido sustraído de los valores ACT enumerados en la siguiente Tabla 22. Tabla 22: Valores ACT para ARC1985, ARC2026, ARC2027, ARC2091 ARC2169 y ARC2171
La habilidad de ARC2172 (SEQ ID NO 294) para disminuir o inhibir la actividad de trombina en comparación con el aptámero ARC183 ADN de trombina también se cuantifica utilizando el ensayo ACT como se describe anteriormente. Como se muestra en la Figura 9, ARC2172 (SEQ ID NO 294) produjo una prolongación relacionada a la concentración de ACT con =2 µM aptámero requerido para alcanzar el tiempo de coagulación objetivo de >400 segundos. Más allá del intervalo de concentración de 2-10 µM, ARC2172 (SEQ IN NO 294) mostró una potencia significativa entre mayor que ARC183. Los aptámero optimizados descritos anteriormente en el Ejemplo 2C también se detectaron para determinar su habilidad para disminuir o inhibir la actividad de trombina a una concentración aptomérica de 10 µM utilizando el ensayo ACT descrito anteriormente. Estos resultados se muestran en la siguiente Tabla 23. Las regiones del asa de ARC2169 y ARC1985 se mutan para corresponder con la secuencia de ARC183, dando como resultado ARC2183 y ARC2184, respectivamente. Estas moléculas no fueron más potentes que ARC183 como puede observarse en la siguiente Tabla 23.
Tabla 23: Valores ACT (incluyendo las referencias) para
Aptámeros Identificados Durante los Esfuerzos de Optimización de Fase 1
Los valores ACT de los aptámeros PEGilados de sus intermediarios conjugados en 5' -amina descritos anteriormente en el Ejemplo 2E también se cuantifican utilizando un intervalo de concentración de aptámeros de (0-10 uM) en el ensayo ACT descrito anteriormente. Los resultados se muestran en la siguiente Tabla 24. Tabla 24: Valores ACT (incluyendo las referencias) para un Subconjunto de Aptámeros PEGilados y sus Respectivos Intermediarios 5' -amina
Ejemplo 3C: Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada (aPTT) El contacto con superficies de carga negativa (por ejemplo, vidrio, silice, colágeno) activan la vida de coagulación "intrínseca". El aPTT cuantifica el tiempo de coagulación mediante la adición de un activador de carga negativa en el plasma y es sensible a los factores VIII, IX, XI, XII, precalicreína, cininógeno de elevado peso molecular y los componentes de la vía común. El reactivo a PTT, que contiene fosfolípidos (tromboplastina parcial) además de activador, se preincuba en plasma cifrado (el paso de activación) antes del inicio de la coagulación mediante la adición de CaCl2. Debido a que la heparina (formada en complejo con antitrombinas) tienen como objetivo diversos factores tanto en la vía intrínseca como en las vías comunes, el aPTT es considerablemente más sensible a heparina que PT (por ejemplo, el tiempo aPTT a 1 U/ml heparina es de >1000% del testigo normal; no se muestran datos) y pueden utilizarse para monitorear heparina terapéutica a bajas dosis. Los efectos de ARC2172 (SEQ ID NO 294) en comparación con ARC183 en aPTT se cuantifican en plasma humano utilizando el instrumento Coag-a-Mate (Biomerieux, Durham, NC) , esencialmente como se describe para el ensayo PT, excepto que la mezcla de plasma/inhibidor se activa durante 3 minutos con 100 µL de reactivo aPTT-LS (Pacific Hemostasis, Fisher Diagnostics, Middletown, VA) antes la adición de 100 µL de 20 mM CaCl2 para iniciar la coagulación. El tiempo de coagulación de aproximadamente 20 segundos, cuantificado en ausencia de aptámero, se encuentra dentro del intervalo clínicamente normal (20-40 segundos) . Como se muestra en la Figura 10, la sensibilidad de aPTT para ARC2172 (SEQ ID NO 294) se reduce de alguna forma en relación con PT; no obstante, el tiempo de coagulación en el ensayo aPTT se prolonga significativamente mediante la actividad anticoagulante de ARC2172 (SEQ ID NO 294). Más aún, ARC2172 (SEQ ID NO 294) demostró nuevamente ser significativamente más potente en el ensayo aPTT que a ARC183.
Ejemplo 3D: Coagulación de Sangre Estática La habilidad de ARC2172 (SEQ ID NO 294) para mantener un efecto anticoagulante con respecto a un período de tiempo suficientemente largo para evitar la coagulación de sangre estática, en comparación con ARC183, se mide de la siguiente manera. Se incuban concentraciones equimolares (5 µM) de ARC2172 (SEQ ID NO 294) o ARC183 en sangre completa humana a 37°C durante 1.5 horas y las muestras se monitorizan durante el tiempo para verificar la activación de la cascada de coagulación. El activador de plasminógeno tisular (5 kU/mL) se agrega para facilitar el desdoblamiento de fibrina polimerizada y mantener la fluidez de la muestra para que puedan obtenerse los puntos temporales. La generación de trombina, valorada en cada punto temporal mediante ELISA de fragmento 1.2 proteolítico de protrombina se utiliza como marcador de la activación de la cascada de coagulación. En resumen, se agregan directamente muestras a pocilios pre recubiertos con Enzygnost® TAT micro ELISA (Dade Behring; Deerfield, Illinois; cat. # 0WMG1 5). Subsiguientemente se completa ELISA según el protocolo del fabricante. A fin de obtener una indicación de la potencia anticoagulante bajo estas condiciones, se cuantifica ACT como se describe previamente en el Ejemplo 3B, al inicio de la incubación y se observan los tiempo de coagulación de 388 y 266 segundos para cada uno de los compuestos, respectivamente. Como se muestra en la Figura 11 ARC2172 (SEQ ID NO 294) a 5 µM evita la activación de la cascada de coagulación en sangre estática durante 30 minutos. Este efecto representa un mejoramiento significativo con respecto al ARC183, para el cual la duración del efecto anticoagulante es de solamente aproximadamente 10 minutos en condiciones similares y apenas igual a la potencia mejorada de ARC2172 (SEQ ID NO 294) como se cuantifica mediante la prolongación de los valores ACT.
EJEMPLO 4: ESTUDIOS FARMACODINAMICOS Y FARMACOCINETICOS En Los Ejemplos 4 y 5, todos los datos de concentración aptomérica basada en masa se refieren solamente al peso molecular de la porción oligonucleotídica del aptámero, sin importar la masa conferida mediante la conjugación PEG.
Ejemplo 4A: Estudio de Bolo IV de Aptámeros Anti trombina en Rata Se ordenaron 10 de los aptámeros de unión a trombina descritos en los Ejemplos 1 y 2 anteriores ARC2949 (SEQ ID NO 434), ARC2172 (SEQ ID NO 294), ARC2324 (SEQ ID NO 436), ARC2327 (SEQ ID NO 439), ARC2338 (SEQ ID NO 438), ARC2329 (SEQ ID NO 440), ARC2840 (SEQ ID NO 423), ARC2321 (SEQ ID NO 435), ARC2323 (SEQ ID NO 437); ARC2828 (SEQ ID NO 411) con propiedades in vi tro deseables con respecto a sus características farmacodinámicas de anti coagulación y se compararon con ARC183 después de haber sido administradas como un bolo IV en ratas Sprague-Dowley . Se preparan soluciones de dosificación de aptámero previamente al disolver el aptámero liofilizado en solución salina normal, ajustar la concentración de la solución de dosificación con solución salina normal hasta que pueda determinarse la concentración correcta mediante análisis espectrofotométrico, y luego llevar a cabo una filtración estéril de las soluciones resultantes a través de un filtro de 0.22 µM en tubos de laboratorio estériles para muestra que luego se congelan a -20°C hasta su uso. Los tubos de laboratorio descongelados se mantienen en hielo húmedo durante la dosificación y los tubos de laboratorio usados se almacenan a 4°C cuando no se están usando para dosificación. Todos los aptámeros, excepto ARC183, se dosifican a 1.5 µmol/kg, una dosis que proporciona la máxima cantidad de ACT dentro del intervalo de 300-700 segundos. ARC183 se dosifica a 6.35 µmol/kg. A las ratas Sprague-Dowley macho consientes y sin tratamiento previo determinado, se les introduce una cánula en la vena femoral y yugular, se les administra aptámero intravenosamente por medio de la cánula de la vena yugular. En puntos temporales predeterminados (pre dosis; 0.83, 1.83, 2.83, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 y 60 minutos post dosificación; si el valor basal ACT no se logra en 60 minutos, los puntos temporales de 90 y 120 minutos posteriores a la dosis también se utilizan) se obtienen 300 µl de muestras de sangre a partir de la cánula de la vena femoral. Se determinan ACT en tiempo real utilizando el ensayo ACT descrito en el Ejemplo 3B anterior. Los resultados del diseño del estudio se resumen en la Figura 12. ARC2949 (SEQ ID NO 434), ARC2172 (SEQ ID NO 294) y ARC2321 (SEQ ID NO 435), son versiones no PEGiladas de ARC2169 (SEQ ID NO 283) compuesto de 24, 26 o 30 oligonucleótidos, respectivamente, son más potentes que ARC183 a una dosis significativamente menor (38-48% de mg/kg y 24% de mol/kg de dosis de ARC183) . Cuando se comparan estos tres aptámeros con base a su tamaño, se observa una fuerte tendencia hacia el aumento de potencia conforme se mide mediante el ACT máximo. También se observa la correlación de mayor tamaño con la prolongación de actividad aptomérica como se indica mediante el tiempo de un ACT de 170 segundos. ARC2172 (SEQ ID NO 294) muestra una mayor potencia en comparación con ARC2949 (SEQ ID NO 434), como se indica mediante el ACT máximo. Se descubrió que ARC2840 (SEQ ID NO 423), un ARC2172 (SEQ ID NO 294) similar a 26 monómeros, que se prepara con un iniciador rico en AU,2'-OMe, es el menos potente que cualquiera de los nuevos aptámeros. ARC2828 (SEQ ID NO 411), una versión de 30 monómeros de ARC2321 (SEQ ID NO 435), preparado con un iniciador debilitado rico en AT, 2' -OMe es indistinguible de ARC2321 (SEQ ID NO 435) . Los aptámeros restantes analizados son modificaciones de ARC2172 (SEQ ID NO 294) y ARC2321 (SEQ ID NO 435) anteriores ya sea con la adición de un ligador 5' amina ± grupos PEG de 2-10K. Estas modificaciones produjeron un incremento moderado de potencia pero también aumentaron la prolongación del efecto farmacodinámico (ver Figura 13) . Por lo tanto, los 10 aptámeros analizados muestran un intervalo de propiedades farmacodinámicas con una correlación entre un mayor tamaño y prolongación del efecto PD (como se cuantifica mediante ACT) balanceándose hacia una tendencia con mayor potencia. ARC2172 (SEQ ID NO 294) mostró una mayor potencia en comparación con ARC183.
Ejemplo 4B: Administración de Bolo Intravenoso en Ratas Sprague-Dowley Se administran intravenosamente (IV), ARC2172 (SEQ ID NO 294) y ARC183 por medio de una cánula en vena yugular, como de delinea en el diseño de estudio presentado en la Figura 14. Además de la inyección en bolo IV, estas ratas se someten a un ligamiento renal simulado como parte del estudio para determinar la eliminación renal de estos compuestos; una descripción de la operación simulada y los resultados PK/PD en relación con los efectos del ligamiento renal se describe en el siguiente Ejemplo 4C. La sangre se recolecta mediante un catéter de vena femoral para la determinación ACT como se define en puntos temporales de hasta 2 horas posteriores a la inyección. Los valores ACT se cuantifican utilizando un instrumento Hemochron® Jr. Signature + con tubos de laboratorio ACT (+) como se describe previamente en el ejemplo 3B. Los efectos de ACT de la administración de ARC2172
(SEQ ID NO 294) y ARC183 se muestran en la Figura 15 resumiéndose los parámetros relevantes en la Figura 16. La administración mediante bolo intravenoso de ARC2172 (SEQ ID NO 294) produce un promedio máximo de valor ACT de 418. La dosificación de ARC183 a 2.5 veces mg/kg (4.2 veces mol/kg) de dosis de ARC2172 (SEQ ID NO 294) da como resultado un menor promedio máximo 'ACT de 328 segundos. La constante de disociación para ARC183 es rápida, con un tiempo promedio de un ACT de 200 o 170 segundos de 2.7 y 4.1 minutos, respectivamente. ARC2172 (SEQ ID NO 294) muestra un tiempo promedio para un ACT de 200 o 170 segundos para 9.5 y 12.2 minutos, respectivamente. En conclusión, luego de la administración intravenosa en bolo en ratas con operación simulada, se descubrió que ARC2172 (SEQ ID NO 294) es más potente que ARC183.
Ejemplo 4C: ARC2172 y ARC183 en Ratas Sprague-Dowley con Operación Simulada y Renalmente Ligadas El objetivo de este estudio es determinar y comparar la eliminación renal y su efecto sobre la. actividad farmacodinámica de ARC2172 (SEQ ID NO 294) y ARC183 en ratas Sprague-Dowley macho con operación simulada y renalmente ligadas. Las ratas macho Sprague-Dowley que experimentaron una cirugía de ligamiento renal completo o una operación simulada se les administró ARC183 y ARC2172 (SEQ ID NO 294) mediante bolo IV. El diseño del estudio se muestra en la Figura 17. Se recolecta sangre en puntos temporales especificados y antes de las dosis para la cuantificación ACT y ARC2172 (SEQ ID NO 294) o análisis de concentración ARC183. Se cuantifica ACT como se describe en el Ejemplo 3B. Las concentraciones plasmáticas de ARC2172 (SEQ ID NO 294) y ARC183 se determinan mediante un ensayo HPLC con límites inferiores de cuantificación (LLOQ por sus siglas en inglés) de 0.05 µg/ml y 0.16 µg/ml, respectivamente. Los análisis PK y PK/PD se llevan a cabo utilizando perfiles de concentración plasmática-tiempo individual mediante los modelos no compartiméntales y Emax (E=E0+ (Emax-EO) * (C?/ (C?+EC50?) ) , respectivamente utilizando WinNolin™, versión 5.1 (Pharsight Corporation, Mountainview, CA) . Se utilizó un análisis estadístico de varianza de una sola vía (ANOVA, ex = 0.05) para Cmax, UCu??mo y MRTúitimo de ratas con operación simulada y renalmente ligadas. De los perfiles farmacodinámicos (ACT) para ARC2172 (SEQ ID NO 294) y ARC183 para los grupos de operación simulada y ligados renalmente se muestran en la Figura 18 y la Figura 19, respectivamente. El valor promedio máximo de ACT alcanzado por ARC2172 (SEQ ID NO 294) en ratas de operación simulada y renalmente ligadas es de 422 segundos y 419 segundos, respectivamente, mientras que para ARC183 el valor promedio máximo ACT es de 325 segundos y 363 segundos, respectivamente. El promedio ACT de ARC2172 (SEQ ID NO 294) cayó de su valor máximo a 170 segundos dentro de 15 minutos, mientras que para ARC183 el promedio ACT declinó a 170 segundos dentro de 5 a 10 minutos. Los perfiles generales PD de ARC2172 (SEQ ID NO 294) y ARC183 no fueron significativamente afectados por el ligamiento renal en ratas en comparación con ratas de operación simulada (P>0.05, utilizando la prueba Mann-Whitney) sin embargo, en puntos temporales anteriores (t=5-20 y t=0.83-5 minutos para ARC2172 (SEQ ID NO 294) y ARC183, respectivamente) son pequeños, pero es un efecto estadísticamente significativo del ligamiento renal en ratas en comparación con ratas de operación simulada (P<0.05, utilizando la prueba Mann-Whitney) . Luego de la administración intravenosa tanto en ratas de operación simulada como de ligamiento renal, los perfiles de concentración plasmática-tiempo tanto para ARC2172
(SEQ ID NO 294) y ARC183 son bifásicos. Los grupos renalmente ligados para ambos compuestos muestran un aumento en consideraciones plasmáticas en la mayoría de los tiempos de muestreo, en comparación con los grupos de operación simulada. Los mayores valores en Cmax y AUC0-u?t?mos en ARC2172 (SEQ ID NO 294) y ARC183 son estadísticamente significativos en P<0.05. En resumen, los perfiles PD generales de ARC2172 (SEQ ID NO 294) y ARC183 no se afectan significativamente por el ligamiento renal en ratas en comparación con ratas de operación simulada (P>0.05, utilizando la prueba Mann-Whitney) . Sin embargo, en puntos temporales anteriores (t=5-20 y t=0.83-5 minutos para ARC2172 (SEQ ID NO 294) y ARC183, respectivamente) son pequeños, pero estadísticamente significativos sobre el efecto del ligamiento renal en ratas en comparación con ratas de operación simulada (P>0.05, utilizando prueba Mann-Whitney) . Hubo un efecto pequeño pero estadísticamente significativo con respecto a la exposición general tanto de ARC2172 (SEQ ID NO 294) y ARC183 luego del bolo intravenoso único en ratas renalmente ligadas en comparación con ratas de operación simulada. Los valores promedio Cmax y AUC0-úitimo en ratas renalmente ligadas fueron aproximadamente 1.5 veces y 2 veces mayores que las ratas de operación simulada para ARC2172 (SEQ ID NO 294). Para ARC183, los valores promedio Cmax y AUC0-úitimo en ratas renalmente ligadas fue de aproximadamente 2.4 veces y 2.9 veces mayores que ratas de operación simulada. Los análisis estadísticos no mostraron diferencia significativa para MRT0-_?timo para ratas renalmente ligadas en comparación con ratas de operación simulada tanto para ARC183 como para ARC2172 (SEQ ID NO 294). Estos datos muestran que en el modelo de rata de ligamiento renal de la forma más severa de disfunción renal, el efecto farmacodinámico de ARC2172 es mínimamente afectado. Aunque no se desea estar limitado por ninguna teoría, ya que ARC2172 mostró un cambio mínimo en su reversibilidad farmacodinámica (tiempo para regresar a un valor promedio ACT de 200 segundos) y solo un cambio moderado en su farmacocinética en este modelo de rata que representa una disfunción renal severa (ligamiento bilateral) , la eliminación renal no parece ser un mecanismo primario de eliminación de ARC2172. Además, aunque no se desea estar limitado por ninguna teoría considerada conjuntamente con estos datos, se sugiere que no es necesario ningún ajuste de dosis para ARC2172 (SEQ ID NO 294) en pacientes con disfunción renal.
Ejemplo 4D: Ejemplo 4F: Estudios de Bolo Intravenoso en Mono para Ordenar por Preferencias los Aptámeros Anti Trombina Cuatro de los aptámeros de unión a trombina comparados en el estudio con rata y descritos en el Ejemplo 4A (ARC2172 (SEQ ID NO 294) ARC2949 (SEQ ID NO 434) ARC2169 (SEQ ID NO 283 y ARC2840 (SEQ ID NO 423)) se evaluaron en un estudio bolo intravenoso en primates. (ARC2169 (SEQ ID NO 283) es la versión de ARC2321 (SEQ ID NO 435) de 30 oligonucleótidos sin 5' amina) . Se preparan soluciones de dosificación de aptámero al disolver aptámero o péptido liofilizado en solución salina normal, luego ajustar la concentración de la solución de dosis con solución salina normal hasta que se pueda determinar la concentración correcta mediante un análisis espectrofotométrico, y luego filtrar para esterilizar las soluciones resultantes a través de un filtro de 0.22 µm en tubos estériles para muestras que luego se congelan a -20° hasta su uso. Los tubos de laboratorio descongelados se mantienen en hielo húmedo durante la dosificación y los tubos de laboratorio usados se almacenan a 4°C cuando no se están utilizando para la dosificación. En el siguiente estudio de bolo intravenoso en monos cinomolgos, todos los aptámeros se dosificaron a 0.46 µmol/kg. Se coloca un catéter intravenoso en la vena cefálica del mono Cinomolgo anestesiado y se utiliza para administrar el aptámero mediante bolo. Se proporciona solución lactosada de Ringer mediante este catéter de vena cefálica a una velocidad de aproximadamente 5-10 ml/kg/hora para proporcionar el mantenimiento fluido y la patencia del catéter. Se extrae sangre del puerto de acceso vascular como se describe previamente en puntos temporales definidos para una hora luego de la inyección en bolo (volumen total = aproximadamente 3 ml) . Para todos los aptámeros, los puntos temporales fueron pre dosificación 0.83, 1.83, 2.83, 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60 minutos posterior a la dosis; en el caso de ARC2169 (SEQ ID NO 283) también se utilizaron puntos temporales adicionales de 90 y 120 minutos por dosis. Se determinaron los ACT activados en tiempo real con un instrumento Hemochron® Jr. Signature + (ITC Med, Edison NJ) utilizando cartuchos ACT + (ITC Med, Edison NJ) como se describe previamente en el ejemplo 3B. La Figura 20 y la Figura 21 resumen los resultados. Todos los aptámeros muestran una mayor potencia en primates en comparación con los resultados obtenidos con ellos en el modelo de bolo intravenoso en ratas (Ejemplo 4A) , como puede evidenciarse por los ACT máximos logrados utilizando la dosis de mol/kg en monos que fue 31% de la que se utilizó en ratas. ARC2840 (SEQ ID NO 423), los 26 monómeros con el agente iniciador rico AU, 2' -OMe, mostró la menor potencia, con un
ACT máximo de solo 223.3 segundos y un tiempo para un ACT de
170 segundos de 2.2 minutos. ARC2949 (SEQ ID NO 434) logró un
ACT máximo de 402.7 segundos y un tiempo para un ACT de 170 segundos de 14.9 minutos. ARC2172 (SEQ ID NO 294) y ARC2169
(SEQ ID NO 283) son bastante similares en cuanto a sus ACT máximos (526.8 y 541.7 segundos, respectivamente), pero el tiempo para un ACT de 170 segundos para ARC2169 (SEQ ID NO
283) es casi el doble de tardado que para ARC2172 (SEQ ID NO 294) (54.6 minutos con respecto a 24.9 minutos).
Ejemplo 4E: Administración de infusión + bolo intravenoso de ARC2172 y ARC183 en monos cinomolgos Se evalúa ARC2172 (SEQ ID NO 294) y ARC183 en el siguiente estudio individual de infusión intravenosa continua de 1 hora + bolo intravenoso en un macaco cinomolgo. A los monos cinomolgos se les administra ARC2172 (SEQ ID NO 294) o ARC183 en un bolo intravenoso seguido inmediatamente por el inicio de una infusión continua durante 1 hora como se muestra en el diseño del estudio en la Figura 22. Se extrae sangre desde un puerto de acceso vascular como se describe anteriormente y se cuantifican los valores ACT con un instrumento Hemachron Jr Signatura + instrument (ITC Med, Edison NJ) utilizando los cartuchos ACT + (ITC Med, Edison NJ) como se describe previamente en el Ejemplo 3B.
El efecto como se cuantifica mediante ACT seguido de la administración de infusión de 1 hora + bolo intravenoso de ARC2172 (SEQ ID NO 294) o ARC183 se muestra en la Figura 23, resumiéndose en la Figura 24 los parámetros relevantes. La administración de ARC2172 (SEQ ID NO 294) mediante bolo intravenoso además de una infusión de una hora con objetivo a una concentración plasmática de 5 µM, produce un valor máximo promedio ACT de 397 segundos y un tiempo promedio para un ACT de 200 ó 170 segundos de 22.2 y 26.5 minutos, respectivamente. El aumento de la dosis de ARC2172 (SEQ ID NO 294) para lograr una concentración plasmática objetivo de 7.5 µM aumenta el valor máximo promedio ACT a 414 segundos, mientras que el tiempo promedio para un ACT de 200 ó 170 segundos es de 13.9 y 18.0 minutos, respectivamente (las diferencias en estos últimos tiempos entre ambos programas de dosificación ARC2172
(SEQ ID NO 294) se encuentran dentro del error experimental).
ARC183, cuando se administra como una infusión de una hora + bolo intravenoso para lograr una concentración plasmática de
µM da como resultado un valor máximo promedio ACT de 343 segundos y un tiempo promedio para un ACT de 200 ó 170 segundos de 4.9 y 7.3 minutos, respectivamente. Por lo tanto, al comparar los resultados con ARC183 a los que se observan con el programa de baja dosis de ARC2172 (SEQ ID NO 294), en donde la dosis total administrada es 7% de miligramo/kilogramo de la dosis administrada con ARC183, el tratamiento con ARC2172 (SEQ ID NO 294) es capaz de producir un ACT estable de aproximadamente 400 segundos durante la infusión. La constante de disociación es aproximadamente 4 veces más lenta para ARC2172 (SEQ ID'NO 294) en comparación con ARC183.
Ejemplo 4F: Interacciones farmacodinámicas del fármaco Efecto de ARC21 12 sobre agregación plaquetaria Además de la generación de fibrina, la trombina además estimula la formación de coágulos mediante la activación plaquetaria. In vitro, las plaquetas se activan mediante una variedad de agonistas que incluyen trombina, colágeno y ADP. Una vez activas, las plaquetas experimentan profundos cambios en cuanto a morfología, expresión del receptor y factores liberados. Estos cambios, bajo ciertas condiciones, inducen a que las plaquetas se agreguen, esta agregación no es dependiente de la presencia de otras células. El plasma rico en plaquetas (PRP) se genera mediante la centrifugación a baja velocidad de sangre completa. Para agregar agonistas plaquetarios al PRP se puede inducir la activación plaquetaria y su agregación. La agregación plaquetaria en PRP puede monitorearse mediante el grado de absorbancia de luz ya que el PRP normalmente turbio se aclara conforme se agregan las plaquetas y se caen de la solución. El objetivo de este estudio es evaluar el efecto de ARC2172 (SEQ ID NO 294) sobre la agregación plaquetaria en PRP de humano.
El PRP se mezcla con a-trombina (0.25 unidades/ml) o ADP (10 µM) en presencia y ausencia de ARC2172 (SEQ ID NO 294) a diversas concentraciones. Se evalúa la agregación plaquetaria con un agregómetro óptico. ARC2172 (SEQ ID NO 294) inhiben la agregación plaquetaria (es decir, la activación del receptor GPIIb/IIIa) inducida por trombina, pero no por ADP (Figura 25). Estos datos demuestran que ARC2172 (SEQ ID NO 294) es un antagonista de trombina que se une a trombina con una elevada afinidad.
Efecto in vi tro de ARC21 12 sobre la actividad de aspirina e integrílina In vitro, las plaquetas se activan mediante una variedad de agonistas incluyendo trombina, colágeno, ADP o se inhiben mediante antagonistas tales como aspirina o inhibidores de plaquetas Ilb/IIa. El objetivo de este estudio se valora al efecto de ARC2172 (SEQ ID NO 294) sobre la actividad de aspirina o el inhibidor heptapeptídico ligado disulfuro, GPIIb/IIIa, integrilina sobre la agregación plaquetaria en PRP humano. El PRP se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente con integrilina (1 µM) en presencia o ausencia de aspirina (6 mg/l) y en presencia y ausencia de ARC2172 (SEQ ID NO 294) a diversas concentraciones. La mezcla plaquetaria se precalienta a 37 °C durante 3 minutos antes de evaluar la agregación plaquetaria mediante ADP (3 µM) utilizando un agregómetro óptico. La aspirina pudo reducir la agregación plaquetaria inducida por ADP en PRP de humano, mientras que integrilina bloqueó completamente la agregación plaquetaria inducida por ADP en PRP humano con y sin aspirina. ARC2172 (SEQ ID NO 294) no disminuyó o inhibió la actividad ni de aspirina o integrilina (Figura 26) .
EJEMPLO 5: ESTUDIOS FUNCIONALES EN ANIMAL Ejemplo 5A: ARC2172 en circuitos de derivación abierta no unidos a heparina Se evaluó ARC2172 (SEQ ID NO 294) en un modelo de derivación cardiopulmonar porcino utilizando un circuito de derivación abierto no unido a heparina. Los animales se sometieron a tratamiento con solución salina (n = 2), heparina (n = 5) y a ARC2172 (SEQ ID NO 294) (n = 5, animales 38 y 39 no se incluyeron en los análisis estadísticos) mediante infusión + bolo o bolo para lograr un objetivo ACT de 400 segundos antes del inicio de la derivación. Un tercer grupo de animales (n = 2) no recibió tratamiento anticoagulante y no fue sometido a cardioplegia ni a pinzamiento cruzado de la aorta. El diseño del estudio se muestra en la Figura 27. ARC2172 (SEQ ID NO 294) se sintetiza en un PrimerSupport 200 con una carga de 202 mmol/g. El ciclo de síntesis convencional emplea 1.8 equivalentes de amidita y 3 equivalentes de oxidante. Un lavado de base postsintética se lleva a cabo con 20% dietilamina en acetonitrilo y se desprotege con amonio durante la noche, seguido de SAX-HPLC preparativo. El aptámero se liofiliza subsiguientemente y luego se resuspende en solución salina estéril a una concentración de 20.0 mg/ml. Se utiliza heparina sódica preparada de páncreas de cerdo en el estudio.
Modelo de derivación en cerdo Se seleccionan aleatoriamente cerdos hembra y macho en diversos grupos de tratamiento como se muestra en la Figura 27. No se incluyeron en los análisis estadísticos los animales 38 y 39. Los animales fueron preanestesiados con atropina S04/Telazol®/Xylazina (0.04 mg/kg/4-6 mg/kg/ 2 mg/kg intramuscularmente [IM], respectivamente) antes de la preparación quirúrgica. Luego los animales se intubaron y mantuvieron con anestesia inhalada de isoflurano hasta lograr el efecto administrado a través de un respirador regulado por volumen. Después de la manifestación de anestesia, la vena y arteria femoral se canularon para monitorear la presión sanguínea y obtener muestras de sangre, respectivamente. La patencia de la cánula de la vena femoral se mantiene ya sea mediante un lento goteo de solución salina o mediante infusión de ARC2172 (SEQ ID NO 294). Se hace una incisión en la piel a lo largo del esternón. Subsiguientemente se hace una incisión en el esternón y se abre la cavidad torácica. Se logra hemostasia mediante una sonda de electrocauterización bovina. El pericardio se abre para proporcionar acceso al corazón. Se disecta y se libera la aorta de tejido circundante y se coloca una sutura en bolsa de tabaco o jareta en la aorta ascendente 4 cm. de distancia del corazón utilizando suturas 5.0 de poliéster. Similarmente, se coloca una sutura en bolsa de tabaco o jareta en el apéndice atrial derecho utilizando suturas 5.0 de poliéster. Luego de colocar las suturas, los animales se someten a tratamiento ya sea con heparina o ARC2172 (SEQ ID NO 294) . Se administra heparina (40,000 a 60,000 unidades) como múltiples bolos intravenosos para lograr un ACT mayor a 400 como se cuantifica mediante el sistema ACT Plus (Medtronic, Minneapolis MN) y aproximadamente 1000 en el instrumento de microcoagulación Hemochron Júnior Signature+ (ITC Med, Edison, NJ) con tubos de laboratorio para pruebas + ACT (ITC Med, Edison, NJ) como se describe en el Ejemplo 3B. Generalmente tarda entre 10-20 minutos ajustar la dosis de heparina y asegurar que el ACT se encuentra en el intervalo correcto. Se administró ARC2172 (SEQ ID NO 294) mediante infusión en bolo + continua (0.139) para lograr un ACT de aproximadamente 400 segundos en el instrumento de microcoagulación Hemochron Júnior Signature+ (ITC Med, Edison, NJ) con tubos de laboratorio para prueba +
ACT (ITC Med, Edison, NJ) como se describe en el Ejemplo 3B
(ver Figura 27). Generalmente tardó entre 10 y 20 minutos administrar el fármaco y asegurar que el ACT se encuentra dentro del intervalo correcto. Luego de la administración de la dosis apropiada de anticoagulante, se coloca la cánula venosa y arterial. La cánula aórtica se fija rápidamente a la línea arterial preparada previamente del aparato pulmonar/cardiaco, teniendo cuidado de llenar tanto la cánula aórtica y la línea arterial con solución salina para eliminar burbujas antes de conectarse. La línea arterial se fija rápidamente. Se utiliza una técnica similar para colocar y asegurar la cánula venosa (cánula venoso en dos etapas 29/37, Medtronic, Minneapolis, MN) en el apéndice del atrio derecho y luego asegurar la cánula a la línea venosa del aparato pulmonar/cardiaco. Todo el circuito de derivación se compone de componentes no asociados con heparina (cardiotomía CVR de afinidad/oxigenador de membrana y reserva venosa con fibra resistente a plasma, Medtronic, Minneapolis, MN) . Subsiguientemente, el animal se coloca en una derivación cardiopulmonar durante un periodo de 3 horas. Las líneas venosa y arterial del aparato pulmonar/cardiaco tienen sondas ultrasónicas Doppler fijas a la mitad entre el animal y el aparato para monitorear la presencia de émbolos de coágulo. Se monitoriza la presión sanguínea directa durante el procedimiento y se mantiene la presión sanguínea durante la derivación mediante a) ajustar la velocidad de flujo de sangre de la derivación, b) administrar fluidos intravenosos y c) administrar diversos fármacos mediante inyección intravenosa, incluyendo neosinef r ina , dopamina, epinefrina y calcio hasta lograr el efecto. El animal se mantiene en plano quirúrgico de anestesia al ajustar la velocidad de flujo del vaporizador de isoflurano y la administración ocasional de un bolo intravenoso de pentobarbital, según sea necesario. Luego de haberse completado la derivación de tres horas, los animales se sacan de la derivación, se retiran las cánulas cuando se haya estabilizado la presión sanguínea y luego finaliza la actividad anticoagulante mediante el tratamiento con protamina (grupo tratado con heparina) o mediante la finalización de infusión con aptámero (grupo de tratamiento con ARC2172) . Los animales se mantuvieron durante una hora adicional luego del cese de la infusión del fármaco. La presión sanguínea se mantuvo posterior a la derivación utilizando una combinación de neosinefrina intravenosa y/o administración de fluido intravenoso hasta lograr el efecto. En la Figura 28 se muestra un esquema del protocolo del estudio CPG.
Examen y evaluación ACT de circui to de derivación cardiopulmonar para evidencia de depósi to de fibrina o coágulo sanguíneo macroscópico : Se obtienen muestras de sangre completa recientemente extraída en un tiempo de recolección de muestra programado y se cuantifica inmediatamente utilizando el instrumento de microcoagulación Hemochron Júnior Signature+ (ITC Med, Edison, NJ) con tubos de laboratorio para pruebas ACT+ (ITC Med, Edison, NJ) y el sistema ACT Plus (Medtronic, Minneapolis, MN) , como se describe en el Ejemplo 3B. Luego de terminar cada experimento, el circuito de derivación cardiopulmonar se enjuaga con solución salina y la reserva, la membrana oxigenadora y el filtro arterial se inspeccionan para encontrar evidencia de formación macroscópica de coágulos y luego se fotografía. Los valores ACT de animales testigo permanecen relativamente constantes durante el procedimiento, pero se desplazan hacia arriba luego de la derivación (Figura 29) . Se pudieron observar grandes coágulos sanguíneos en el circuito de concentración 15 minutos luego de comenzar la derivación y se hicieron tan grandes que casi se impidió el flujo a través del circuito de derivación luego de 3 horas de derivación. Luego de la administración de heparina, los animales en este grupo de tratamiento tuvieron valores ACT excepcionalmente elevados que se encuentran usualmente fuera de escala (más de 1000 segundos) (ver Figura 30) . A los animales se les administró bolos repetidos para mantener el ACT a este nivel elevado. La administración de protamina al final del experimento hizo que los valores ACT regresaran a la línea basal. No se pudieron observar en el circuito de derivación coágulos macroscópicos. En los animales sometidos a tratamiento con ARC2172 (SEQ ID NO 294) mediante bolos + infusión, el ACT se mantuvo dentro de un margen relativamente estrecho durante la derivación y el ACT regresó al valor de referencia dentro de un periodo de 20 minutos luego de haber finalizado la administración de ARC2172
(SEQ ID NO 294) (ver Figura 31) . No se pudieron observar en el circuito de derivación coágulos macroscópicos. En la Figura 32 se muestra una comparación de los valores ACT durante la derivación con cada uno de los anticoagulantes utilizados.
Correla ción entre ACT de sangre completa y formación de complej os T/ATIII: Durante la derivación, se recolectan muestras de plasma cifrado para monitorear la presencia de complejos trombina/antitrombina III (TAT) como una medición indirecta de la activación de la cascada de coagulación. En resumen, las muestras de plasma sin diluir se agregan directamente a pocilios cubiertos previamente con Enzygnost® TAT micro ELISA (Dade Behring; Deerfield, Illinois; cat. # OWMG15).
Subsiguientemente se completa el ELISA según el protocolo del fabricante. Todos los pasos de lavado se completan utilizando un lavado de placas automatizado (Bio-Tek; Winnoski, Vermont; cat. # ELx405 Magna MVR). Se detectan los valores de absorbancia con un lector de microplacas Versamax Aunable (Molecular Devices; Sunnyvale, California) . En todos los animales, la concentración de complejos TAT plasmáticos se mide a menos de 10 ng/ml al valor de referencia. En animales testigo que no fueron sometidos a tratamiento con anticoagulante, los complejos TAT comienzan a acumularse en el plasma a unos cuantos minutos de haberse colocado en la derivación hasta un máximo de 150 +/- 87 ng/ml inmediatamente antes de que finalizara la derivación. La concentración de complejos TAT plasmáticos disminuye en esos animales durante el periodo de observación posterior a la derivación, pero nunca regresa al valor de referencia (ver Figura 33) . A diferencia, el tratamiento con heparina suprime la activación de la cascada de coagulación durante la derivación como se indica mediante la concentración de complejos TAT plasmáticos relativamente baja (< 50 ng/ml) (ver Figura 34) . La heparina inhibe la actividad de múltiples factores de coagulación mucho más arriba de la- cascada de coagulación intrínseca, además de inhibir la actividad de trombina. Aunque ARC2172 (SEQ ID NO 294) evita la formación de coágulos sanguíneos macroscópicos en el circuito de derivación, no pudo inhibir la activación de la cascada de coagulación como se indica por el rápido aumento en las concentraciones de complejo TAT plasmático luego del inicio de la derivación (ver Figura 35) . Sin embargo, las concentraciones del complejo TAT no fueron tan altas como aquéllas que se observan en los animales testigo. Aunque no se desea estar limitado por ninguna teoría, este resultado es el esperado ya que ARC2172 (SEQ ID NO 294) sólo disminuye la actividad de trombina, y no de otros factores de coagulación activados más arriba de la cascada de coagulación intrínseca.
En resumen, ARC2172 (SEQ ID NO 294) se evaluó en un modelo de derivación cardiopulmonar en porcino utilizando un circuito de derivación abierto no ligado a heparina. Los animales fueron sometidos a tratamiento con solución salina (n = 2), heparina (n = 5) y ARC2172 (SEQ ID NO 294) (n = 5) mediante bolo o bolos + infusión para lograr un ACT objetivo de 400 segundos (como se cuantifican mediante el instrumento Hemachron Jr.) antes del inicio de la derivación. Los valores promedio ACT durante la derivación de cada uno de estos grupos fueron de 123 +/- 39 segundos (testigos), 950 +/- 158 segundos (heparina) y 433 +/- 61 segundos (ARC2172 (SEQ ID NO 294)). La heparina y ARC2172 (SEQ ID NO 294) disminuyeron la formación de coágulos macroscópicos durante la derivación. Más aún, sólo la heparina pudo inhibir la acumulación de complejos TAT durante la derivación. Aunque no se desea estar limitado por ninguna teoría, se piensa que esto indica que los otros tratamientos no inhibieron la activación de la cascada de coagulación intrínseca. Habiéndose descrito la invención a manera de descripción y ejemplos escritos, los expertos en la técnica pueden reconocer que la invención puede llevarse a la práctica en una variedad de modalidades y que la descripción y ejemplos anteriores son sólo para propósitos de ilustración y no limitantes de las siguientes reivindicaciones. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Claims (39)
- REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un aptámero que se une a un objetivo trombina, caracterizado porque disminuye o inhibe la coagulación mediada por trombina y el aptámero es ARC2172 (SEQ ID NO 294) o un aptámero que tiene sustancialmente la misma habilidad que ARC2172 (SEQ OD NO 294) para disminuir o inhibir la coagulación mediada por trombina, en donde el aptámero se une a trombina humana con una KD menor que 1 nM y en donde el aptámero tiene una longitud de 555 nucleótidos o menos.
- 2. Un aptámero que se une a un objetivo trombina, caracterizado porque disminuye o inhibe la coagulación mediada por trombina y el aptámero es ARC2172 (SEQ ID NO 294) o un aptámero que tiene sustancialmente la misma habilidad que ARC2172 (SEQ OD NO 294) para disminuir o inhibir la coagulación mediada por trombina y en donde el aptámero no comprende una modificación 5-bromodesoxiuridina en la mayoría de sus residuos timidina o uridina.
- 3. El aptámero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la habilidad del aptámero para disminuir o inhibir la coagulación mediada por trombina se evalúa al cuantificar la habilidad del aptámero para disminuir o inhibir el tiempo de coagulación activada o tiempo de protrombina.
- 4. El aptámero de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque disminuye o inhibe la coagulación mediada por trombina in vivo .
- 5. El aptámero de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque disminuye o inhibe la coagulación mediada por trombina en un paciente humano.
- 6. Un aptámero que se une a trombina caracterizado porque es seleccionado del grupo que comprende SEQ ID NOs 9- 41, 43-191, 193-204, 208-304, 307-329, 331-332, 334, 336-337, 340-392, 396-397, 400 y 402-440.
- 7. Un aptámero que se une a trombina, caracterizado porque comprende la siguiente secuencia de ácidos nucleicos: CCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGG .
- 8. El aptámero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que comprende : ACTGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCAGT (A C2169 (SEQ ID NO 283) ) GCTGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCAGC (ARC2170 (SEQ ID NO 292) ) CTGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCAG (ARC2171 (SEQ IS NO 293)) y CGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCG (ARC2172 (SEQ ID NO 294) ) .
- 9. Un aptámero que comprende la siguiente secuencia de ácidos nucleicos: N?N2N3TAGGTTGGGTAGGGTGGTN ' 3N ' 2N ' i caracterizado porque Ni, N2 o N3 es cualquier nucleótido que forma pares de bases con N'i, N'2 o N'3 respectivamente, en donde N , N2 y N3 pueden ser cada uno el mismo nucleótido o diferentes nucleótidos y el aptámero disminuye o inhibe la coagulación mediada por trombina.
- 10. El aptámero de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque Ni, N2 y N3 son desoxinucleótidos.
- 11. El aptámero de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque al menos dos de Ni, N2 o N3 comprenden una modificación 2 ' OMe .
- 12. El aptámero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9, 10 u 11 caracterizado porque además comprende la secuencia: N?N2N3N4N5N6TAGGTTGGGTAGGGTGGT ' 6N ' 5N• 4N' 3N ' 2N ' i en donde Ni, N2, N3 N4, N5 o N6 es cualquier nucleótido que forma pares de bases con N'i, N'2/ N'3,N'4, N'5, N'6 respectivamente, en donde i, N2, N3, N4 , N5 o N6 pueden ser cada uno el mismo nucleótido o diferentes nucleótidos y el aptámero disminuye o inhibe la coagulación mediada por trombina.
- 13. El aptámero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9, 10, 11 o 12, caracterizado porque N es un residuo de un nucleótido de guanosina o citidina.
- 14. Un aptámero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, caracterizado porque el aptámero se une a trombina con un KD menor que 1 nM.
- 15. Un aptámero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14, caracterizado porque el aptámero tiene al menos sustancialmente la misma habilidad como ARC2172 (SEQ ID NO 294) para disminuir o inhibir la coagulación mediada por trombina.
- 16. Un aptámero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la trombina objetivo es trombina humana.
- 17. Un aptámero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el aptámero es ácido desoxirribonucleico.
- 18. Un aptámero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el aptámero es ácido desoxirribonucleico monocatenario.
- 19. Un aptámero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el aptámero comprende al menos una modificación química.
- 20. El aptámero de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la modificación se selecciona del grupo que consiste de: una sustitución química en una posición de azúcar; una sustitución química en una posición fosfato y una sustitución química en una posición de base del ácido nucleico.
- 21. El aptámero de conformidad con la reivindicación 19 0 20, caracterizado porque la modificación se selecciona a partir del grupo que comprende: incorporación de un nucleótido modificado, remate en el extremo 3' y conjugación con un compuesto no inmunogénico de elevado peso molecular y conjugación a un compuesto lipofílico.
- 22. El aptámero de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la modificación es una conjugación de un compuesto de elevado peso molecular, no inmunogénico y en donde el compuesto es polialquilenglicol .
- 23. El aptámero de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el polialquilenglicol es polietilenglicol .
- 24. Un aptámero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y 5-23, caracterizado porque el aptámero disminuye o inhibe la coagulación mediada por trombina in vi tro .
- 25. Uso de un aptámero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para elaborar un medicamento, para disminuir o inhibir la coagulación mediada por trombina en un paciente o en un circuito extracorpóreo.
- 26. El uso de conformidad con la reivindicación 25, en donde el paciente es humano.
- 27. Una composición caracterizada porque comprende un aptámero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26 o una sal del mismo en una cantidad efectiva para disminuir o inhibir la coagulación mediada por trombina en un paciente y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptables .
- 28. El uso de la composición de conformidad la reivindicación 27, para elaborar un medicamento para ser usado por un paciente.
- 29. El uso de conformidad con la reivindicación 28, en donde el paciente es humano.
- 30. Un uso de conformidad con la reivindicación 25, 26, 28 o 29, en donde el paciente humano tiene disfunción renal y en donde el aptámero para utilizarse no está conjugado a PEG.
- 31. Un uso de conformidad con la reivindicación 25, 26, 28, 29 o 30, en donde el paciente humano tiene trombocitopenia inducida por heparina.
- 32. Un uso de conformidad con la reivindicación 25, 26, 28, 29, 30 o 31, en donde el paciente humano es resistente a heparina.
- 33. Un uso de conformidad con la reivindicación 25, 26, 28, 29, 30, 31 o 32, en donde el paciente tiene disfunción hepática.
- 34. Un uso de conformidad con la reivindicación 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32 o 33, en donde el aptámero se administra al paciente antes, durante o después y cualquier combinación, de un procedimiento quirúrgico.
- 35. El uso de conformidad con la reivindicación 34, en donde el procedimiento quirúrgico se selecciona a partir del grupo que comprende cirugía de derivación cardiopulmonar, cirugía de injerto de derivación de arteria coronaria, intervención coronaria percutánea, angioplastia, cirugía endovascular y cirugía abierta vascular periférica y cardiovascular, cirugía de colocación de endoprótesis vascular, cirugía de reemplazo de válvula cardiaca, cirugía para el tratamiento contra enfermedad vascular y/o enfermedad coronaria en venas o arterias y cirugía para el tratamiento contra enfermedad oclusiva arterial periférica.
- 36. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 o 35, en donde el aptámero es ARC2172 (SEQ ID NO 294) .
- 37. El uso de conformidad con la reivindicación 35, en donde el aptámero es ARC2172 (SEQ ID NO 294) y el procedimiento quirúrgico es cirugía de injerto de derivación de arteria coronaria.
- 38. El uso de conformidad con la reivindicación 35, en donde el aptámero es ARC2172 (SEQ ID NO 294) y el procedimiento quirúrgico es intervención coronaria percutánea.
- 39. El uso de conformidad con la reivindicación 35, en donde el procedimiento quirúrgico es cirugía de derivación cardiopulmonar y durante esta cirugía se utiliza un circuito abierto no mediado por heparina.
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