JP7459172B2 - リラキシンをコードするポリヌクレオチド - Google Patents

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Description

関連出願
本願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）のもと、その全体において本明細書中に参照により組み込まれる２０１６年５月１８日提出の米国特許仮出願第６２／３３８，４７０号明細書の優先権を主張する。
急性心不全（ＡＨＦ）は、急激な低下であり、その結果、心臓が身体の心臓要求量を満たすのに十分な血液を送り込み得なくなる。徴候および症状としては、呼吸困難、浮腫および疲労が挙げられ得、これは、急性呼吸窮迫および死亡につながり得る。ＡＨＦおよび他の心血管系疾患は、循環リラキシンの欠乏により引き起こされ得る。
リラキシンは、６０００Ｄａヘテロ二量体ポリペプチド内分泌および自己分泌／傍分泌ホルモンであり、インスリン遺伝子スーパーファミリーに属する。リラキシンは、血管形成を促進し、血管内皮の修復に寄与する。これは、様々な組織におけるその受容体への結合を通じて筋骨格および他の系に対してその効果を発揮するが、この過程は、様々なシグナル伝達経路が介在する過程である。リラキシン（ＲＬＮ）１、ＲＬＮ２、ＲＬＮ３およびインスリン様ペプチド（ＩＮＳＬ）３、ＩＮＳＬ４、ＩＮＳＬ５、ＩＮＳＬ６を含め、７つの既知のリラキシンファミリーペプチドがある。ＲＬＮ１およびＲＬＮ２は、線維芽細胞におけるコラーゲン制御および代謝に関与する一方、ＲＬＮ３は、脳に特異的である。ＲＬＮ１およびＲＬＮ２は、心拍出量、腎臓血流および動脈コンプライアンスを含め、妊娠中に起こる血行動態変化にも関与する。さらに、ＲＬＮ２は、リン酸化カスケードを通じた一酸化窒素の産生増加を通じて血管拡張に介在する。リラキシンは、強心薬でもあり、これは、２つの強力な血管収縮薬であるアンジオテンシンＩＩおよびエンドセリンの阻害を通じて血管拡張を引き起こし得る。このホルモンは、心臓筋フィラメントのカルシウム感受性を向上させ、タンパク質キナーゼＣによる筋フィラメントのリン酸化を増加させることも示されている。心筋細胞のエネルギー消費が増加しない一方、筋フィラメントにより生じる力は増加する。腎臓において、リラキシンは、クレアチニンクリアランスを上昇させ、腎臓血流を増加させる。
血管作動性ペプチドであるリラキシンは、血管系がオーバーワークにならないように保護し、腎臓機能を向上させ、細胞増殖および生存を促進し、良好な管構造を維持する。対象へのリラキシンの投与は、線維症、例えば腎臓線維症、心筋繊維化または肺線維症および循環器疾患、例えば急性心不全、冠動脈疾患、微小血管疾患、心機能不全を伴う急性冠症候群または虚血再灌流を処置および予防するなどの治療効果を有する。
リラキシン欠乏に関連する障害の多くに対するケア療法の標準には、ベータブロッカー、ヒドララジン／二硝酸イソルビド、ジギタリス、利尿薬、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンジオテンシン受容体ブロッカー（ＡＲＢ）、ジゴキシン、抗凝固薬、アルドステロン拮抗薬、ならびに高コレステロール、高血圧、心房細動および糖尿病を含むが限定されない併発を調節するための薬物が含まれる。一般的に食餌および運動を含む生活スタイルの変更も推奨される。
リラキシンは、顕著な治療効果をもたらすものの、組み換え野生型リラキシンの半減期は短く、それにより体内での治療レベルの達成は困難なものとなっている。リラキシンの組み換え型は、セレラキシンと呼ばれ、Ｎｏｖａｒｔｉｓにより市販されており、毒性が低いことが明らかになっているが、血流中での分解が非常に速いため、有効性に疑問が残る。セレラキシンの半減期は、血清中で約１５分であり、連続４８時間点滴中では７～８
時間である。
本発明は、線維症および／または循環器疾患の処置のためのｍＲＮＡ治療薬を提供する。本発明のｍＲＮＡ治療薬は、線維症および／または循環器疾患の処置に特によく適しており、なぜなら、この技術により、リラキシン（ＲＸＮ）をコードするｍＲＮＡの細胞内送達と、それに続いて標的細胞内での機能的ＲＸＮタンパク質のデノボ合成とがもたらされるからである。本発明は、（１）不要な免疫活性化（例えば、外来核酸のインビボ導入に関連する自然免疫反応）を最小限に抑え、（２）タンパク質へのｍＲＮＡの翻訳効率を最適化するために、治療用ｍＲＮＡ内に修飾ヌクレオチドを組み込むことを特徴とする。本発明の代表的な態様は、特にタンパク質発現を促進するためのＲＸＮをコードする治療用ｍＲＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内における、自然免疫反応の低下および配列最適化のためのムクレオチド修飾の組み合わせを特徴とする。
本発明のｍＲＮＡ治療技術は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達系を介したＲＸＮをコードするｍＲＮＡの送達も特徴とする。本発明は、例えば、細胞取り込み、細胞内輸送および／またはエンドソーム放出もしくはエンドソーム脱出など、インビボで投与された場合に特性が改善された新規のイオン化可能脂質に基づくＬＮＰを特徴とする。本発明のＬＮＰは、ＬＮＰのインビボ投与に関連する免疫原性の低下も示す。
特定の態様において、本発明は、治療用リラキシンタンパク質をコードするポリヌクレオチド、例えばリボ核酸（ＲＮＡ）、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む組成物および送達処方物と、その投与により、それを必要とする対象において心不全および／または他の障害を処置するための方法とに関する。
本発明の態様は、リラキシンポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＲＮＡポリヌクレオチドに関する。リラキシンポリペプチドは、半減期向上を促進するために修飾され得る。例えば、リラキシンポリペプチドは、融合タンパク質の一部であり得る。
本組成物は、イオン化可能脂質ナノ粒子中に処方され得、このイオン化可能脂質ナノ粒子は、約２０～６０％のイオン化可能脂質、約５～２５％の非カチオン性脂質、約２５～５５％のステロールおよび約０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を有する。いくつかの本発明の態様は、イオン化可能脂質ナノ粒子中に処方される、リラキシンポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＲＮＡポリヌクレオチドに関する。
本発明の他の態様は、イオン化可能脂質ナノ粒子中に処方される、リラキシンポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＲＮＡポリヌクレオチドに関し、このイオン化可能脂質ナノ粒子中のＲＮＡポリヌクレオチドは、このＲＮＡポリヌクレオチド単独の治療指数の１０％より大きい治療指数を有する。
いくつかの態様において、本発明は、イオン化可能脂質ナノ粒子中に処方される、少なくとも１つのリラキシンタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドの組成物であり、このイオン化可能脂質ナノ粒子は、約２０～６０％のイオン化可能脂質、約５～２５％の非カチオン性脂質、約２５～５５％のステロールおよび約０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を有する。
他の態様において、本発明は、少なくとも１つのリラキシン融合タンパク質をコードす
るオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸である。
また他の態様において、本発明は、リラキシンが可変軽鎖断片に融合される、リラキシン－ＶＬ融合タンパク質を含むポリペプチドである。
いくつかの実施形態において、リラキシンポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、本ポリペプチドは、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、リラキシンタンパク質は、リラキシン融合タンパク質である。リラキシン融合タンパク質は、免疫グロブリン（Ｉｇ）断片であり得る。いくつかの実施形態において、Ｉｇ断片は、可変鎖断片である。他の実施形態において、Ｉｇ断片は、定常鎖断片である。いくつかの実施形態において、Ｉｇ断片は、可変軽鎖断片である。いくつかの実施形態において、可変軽鎖断片は、ＶＬκ ＩｇＧ領域である。いくつかの実施形態において、リラキシンは、リンカーを通じてＶＬκ ＩｇＧ領域に連結される。
リラキシンタンパク質は、融合タンパク質であり、いくつかの実施形態において、配列番号１の配列と８１％～１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。他の実施形態において、リラキシンタンパク質は、融合タンパク質であり、配列番号１の配列と８５％～９９％同一であるヌクレオチド配列を有する。
他の態様において、リラキシンに関連する障害の処置を、それを必要とする対象において行う方法が提供される。本方法は、リラキシンに関連する障害を処置するために、リラキシンポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＲＮＡポリヌクレオチドの治療的有効量を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態において、リラキシンに関連する障害を処置する方法は、ＲＮＡポリヌクレオチドの単回投与を伴う。いくつかの実施形態において、リラキシンに関連する障害を処置する方法は、毎週投与を行うことをさらに含む。
実施形態において、リラキシンに関連する障害は、心機能不全を伴う急性冠症候群、肺、腎臓、肝臓、心臓などの実質臓器移植に関連する虚血再灌流、腎臓を含む心肺バイパス術臓器保護および角膜治癒、慢性心不全、糖尿病性ニューロパチー、ＮＡＳＨ、心房細動、心筋繊維化、糖尿病性創傷治癒ならびに肝硬変からなる群から選択される。
他の態様において、本発明は、心不全の処置を、それを必要とする対象において行う方法であって、心不全を処置するために、リラキシンポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＲＮＡポリヌクレオチドの治療的有効量を対象に投与することを含む方法である。
いくつかの実施形態において、本方法は、本ＲＮＡポリヌクレオチドの単回投与を伴う。他の実施形態において、本方法は、毎週、２週間毎、３週間毎、１か月毎または２か月毎に投与を行うことをさらに含む。
いくつかの実施形態において、イオン化可能脂質を伴うＲＮＡポリヌクレオチドの投与は、イオン化可能脂質の非存在下でのＲＮＡポリヌクレオチド単独の治療指数に対して本組成物中でのＲＮＡポリヌクレオチドの治療指数を向上させる。他の実施形態において、本組成物中でのＲＮＡポリヌクレオチドの治療指数は、１０：１または５０：１より大きい。
いくつかの実施形態において、対象への投与時、ＲＮＡポリヌクレオチドは、ａ）投与から約３０～約２４０分後のＴｍａｘ、およびｂ）約６０～約２４０分間の持続時間にわたる少なくとも５０％Ｃｍａｘの血中薬物（ＲＮＡポリヌクレオチドによって産生されるリラキシンポリペプチド）濃度プラトーを含む薬物動態（ＰＫ）プロファイルを呈する剤型である。他の実施形態において、対象への投与時、ベースラインレベルに対して少なくとも２５％または５０％の循環リラキシンの上昇が達成される。組み換え野生型リラキシンの半減期は短く、例えば、リラキシンの組み換え型であるセレラキシンの半減期は、血清中でちょうど１５分である。しかし、実施例１４および１５で示されるように、インビボモデルから、本開示の実施形態によって半減期が顕著により長くなり、それによってそれらの治療効果がより大きくなることが明らかになった。
また他の実施形態において、循環リラキシンレベルは、２時間～７日間、５日間または３日間にわたって達成される。
いくつかの実施形態において、対象への投与時、本剤型は、薬物の少なくとも約９０％が約５～７日間の血漿薬物濃度プラトー内で血漿から排除されるＰＫプロファイルを示す。
他の実施形態において、ＲＮＡは、少なくとも１つの化学的修飾を含む。いくつかの実施形態において、化学的修飾は、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジンおよび２’－Ｏ－メチルウリジンから選択される。
いくつかの実施形態において、イオン化可能脂質ナノ粒子中に処方されるＲＮＡポリヌクレオチドは、このＲＮＡポリヌクレオチド単独の治療指数の６０％より大きい治療指数を有する。いくつかの実施形態において、イオン化可能脂質ナノ粒子中に処方されるＲＮＡポリヌクレオチドの治療指数は、このＲＮＡポリヌクレオチド単独の治療指数の１０％よりも大きい。
他の実施形態において、本イオン化可能脂質は、式（Ｉ）：
Figure 0007459172000001
（式中、
Ｒ１は、Ｃ５～３０アルキル、Ｃ５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ’’、－ＹＲ’’および－Ｒ’’Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１～１４アルキル、Ｃ２～１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ’’、
－ＹＲ’’および－Ｒ＊ＯＲ’’からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらが連結される原子と一緒に複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３～６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２および未置換Ｃ１～６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲおよび－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、かつ各ｎは、１、２、３、４および５から独立して選択され、
各Ｒ５は、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ６は、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
ＭおよびＭ’は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基およびヘテロアリール基から独立して選択され、
Ｒ７は、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニルおよびＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３～６炭素環および複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１～６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ３～６炭素環および複素環からなる群から選択され、
各Ｒは、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ’は、Ｃ１～１８アルキル、Ｃ２～１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ’’、－ＹＲ’’およびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ’’は、Ｃ３～１４アルキルおよびＣ３～１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｒ＊は、Ｃ１～１２アルキルおよびＣ２～１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｙは、独立してＣ３～６炭素環であり、
各Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から独立して選択され、および
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３から選択される）
の脂質またはその塩もしくは異性体である。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲまたは－ＣＱ（Ｒ）２である場合、（ｉ）ｎが１、２、３、４または５であるとき、Ｑが、－Ｎ（Ｒ）２ではなく、または（ｉｉ）ｎが１または２であるとき、Ｑが、５、６または７員ヘテロシクロアルキルではないものを含む。いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、
Ｒ１が、Ｃ５～３０アルキル、Ｃ５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ’’、－ＹＲ’’および－Ｒ’’Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３が、Ｈ、Ｃ１～１４アルキル、Ｃ２～１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ’’、－ＹＲ’’および－Ｒ＊ＯＲ’’からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２およ
びＲ３が、それらが連結される原子と一緒に複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３～６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２および未置換Ｃ１～６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑが、Ｃ３～６炭素環、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲならびにオキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、モノまたはジ－アルキルアミノおよびＣ１～３アルキルから選択される１つ以上の置換基で置換される、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロシクロアルキルからなる群から選択され、かつ各ｎが、１、２、３、４および５から独立して選択され、
各Ｒ５が、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ６が、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
ＭおよびＭ’が、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基およびヘテロアリール基から独立して選択され、
Ｒ７が、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニルおよびＨからなる群から選択され、
Ｒ８が、Ｃ３～６炭素環および複素環からなる群から選択され、
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１～６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ３～６炭素環および複素環からなる群から選択され、
各Ｒが、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ’が、Ｃ１～１８アルキル、Ｃ２～１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ’’、－ＹＲ’’およびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ’’が、Ｃ３～１４アルキルおよびＣ３～１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｒ＊が、Ｃ１～１２アルキルおよびＣ２～１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｙが、独立してＣ３～６炭素環であり、
各Ｘが、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から独立して選択され、および
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３から選択されるものまたはその塩もしくは異性体を含む。
他の実施形態において、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、
Ｒ１が、Ｃ５～３０アルキル、Ｃ５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ’’、－ＹＲ’’および－Ｒ’’Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３が、Ｈ、Ｃ１～１４アルキル、Ｃ２～１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ’’、－ＹＲ’’および－Ｒ＊ＯＲ’’からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２およびＲ３が、それらが連結される原子と一緒に複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３～６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－
ＣＱ（Ｒ）２および未置換Ｃ１～６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑが、Ｃ３～６炭素環、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員の複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲおよび－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２から選択され、かつ各ｎが、１、２、３、４および５から独立して選択され、Ｑが５～１４員の複素環である場合、および（ｉ）Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱであり、ｎが１または２であるか、または（ｉｉ）Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、ｎが１であるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４が－ＣＨＱＲおよび－ＣＱ（Ｒ）２であるとき、Ｑが、５～１４員のヘテロアリールまたは８～１４員のヘテロシクロアルキルの何れかであり、
各Ｒ５が、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ６が、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
ＭおよびＭ’が、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基およびヘテロアリール基から独立して選択され、
Ｒ７が、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニルおよびＨからなる群から選択され、
Ｒ８が、Ｃ３～６炭素環および複素環からなる群から選択され、
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１～６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ３～６炭素環および複素環からなる群から選択され、
各Ｒが、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ’が、Ｃ１～１８アルキル、Ｃ２～１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ’’、－ＹＲ’’およびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ’’が、Ｃ３～１４アルキルおよびＣ３～１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｒ＊が、Ｃ１～１２アルキルおよびＣ２～１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｙが、独立してＣ３～６炭素環であり、
各Ｘが、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から独立して選択され、および
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３から選択されるものまたはその塩もしくは異性体を含む。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、
Ｒ１が、Ｃ５～３０アルキル、Ｃ５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ’’、－ＹＲ’’および－Ｒ’’Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３が、Ｈ、Ｃ１～１４アルキル、Ｃ２～１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ’’、－ＹＲ’’および－Ｒ＊ＯＲ’’からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２およびＲ３が、それらが連結される原子と一緒に複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３～６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２および未置換Ｃ１～６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑが、Ｃ
３～６炭素環、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲおよび－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２から選択され、かつ各ｎが、１、２、３、４および５から独立して選択され、
各Ｒ５が、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ６が、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
ＭおよびＭ’が、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基およびヘテロアリール基から独立して選択され、
Ｒ７が、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニルおよびＨからなる群から選択され、
Ｒ８が、Ｃ３～６炭素環および複素環からなる群から選択され、
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１～６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ３～６炭素環および複素環からなる群から選択され、
各Ｒが、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ’が、Ｃ１～１８アルキル、Ｃ２～１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ’’、－ＹＲ’’およびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ’’が、Ｃ３～１４アルキルおよびＣ３～１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｒ＊が、Ｃ１～１２アルキルおよびＣ２～１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｙが、独立してＣ３～６炭素環であり、
各Ｘが、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から独立して選択され、および
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３から選択されるものまたはその塩もしくは異性体を含む。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、
Ｒ１が、Ｃ５～３０アルキル、Ｃ５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ’’、－ＹＲ’’および－Ｒ’’Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３が、Ｈ、Ｃ２～１４アルキル、Ｃ２～１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ’’、－ＹＲ’’および－Ｒ＊ＯＲ’’からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２およびＲ３が、それらが連結される原子と一緒に複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＱまたは－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、ここで、Ｑが、－Ｎ（Ｒ）２であり、かつｎが、３、４および５から選択され、
各Ｒ５が、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ６が、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
ＭおよびＭ’が、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基およびヘテロアリール基から独立して選択され、
Ｒ７が、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニルおよびＨからなる群から選択され、
各Ｒが、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ’が、Ｃ１～１８アルキル、Ｃ２～１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ’’、－ＹＲ’’およびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ’’が、Ｃ３～１４アルキルおよびＣ３～１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｒ＊が、Ｃ１～１２アルキルおよびＣ１～１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｙが、独立してＣ３～６炭素環であり、
各Ｘが、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から独立して選択され、および
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３から選択されるものまたはその塩もしくは異性体を含む。
他の実施形態において、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、
Ｒ１が、Ｃ５～３０アルキル、Ｃ５～２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ’’、－ＹＲ’’および－Ｒ’’Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３が、Ｃ１～１４アルキル、Ｃ２～１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ’’、－ＹＲ’’および－Ｒ＊ＯＲ’’からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２およびＲ３が、それらが連結される原子と一緒に複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲおよび－ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、ここで、Ｑが、－Ｎ（Ｒ）２であり、かつｎが、１、２、３、４および５から選択され、
各Ｒ５が、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ６が、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
ＭおよびＭ’が、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基およびヘテロアリール基から独立して選択され、
Ｒ７が、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニルおよびＨからなる群から選択され、
各Ｒが、Ｃ１～３アルキル、Ｃ２～３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ’が、Ｃ１～１８アルキル、Ｃ２～１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ’’、－ＹＲ’’およびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ’’が、Ｃ３～１４アルキルおよびＣ３～１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｒ＊が、Ｃ１～１２アルキルおよびＣ１～１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｙが、独立してＣ３～６炭素環であり、
各Ｘが、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から独立して選択され、および
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３から選択されるものまたはその塩もしくは異性体を含む。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＡ）：
Figure 0007459172000002
（式中、ｌは、１、２、３、４および５から選択され、ｍは、５、６、７、８および９から選択され、Ｍ１は、結合またはＭ’であり、Ｒ４は、未置換Ｃ１～３アルキルまたは－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、ＭおよびＭ’は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基およびヘテロアリール基から独立して選択され、およびＲ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１～１４アルキルおよびＣ２～１４アルケニルからなる群から独立して選択される）のものまたはその塩もしくは異性体を含む。
いくつかの実施形態において、本ナノ粒子は、０．４未満の多分散値を有する。いくつかの実施形態において、本ナノ粒子は、中性ｐＨで正味中性電荷を有する。
いくつかの実施形態において、オープンリーディングフレーム中のウラシルの８０％は、化学的修飾を有する。いくつかの実施形態において、オープンリーディングフレーム中のウラシルの１００％は、化学的修飾を有する。いくつかの実施形態において、化学的修飾は、ウラシルの５位にある。いくつかの実施形態において、本化学的修飾は、Ｎ１－メチルシュードウリジンである。他の実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドのウラシルおよびチミン含量は、野生型リラキシンポリヌクレオチドの場合よりも１００～１５０％多い。
本発明の態様は、リラキシンポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＲＮＡポリヌクレオチドの治療指数を向上させる方法に関し、本方法は、ＲＮＡポリヌクレオチドをイオン化可能脂質と連結して組成物を生成させ、それによりＲＮＡポリヌクレオチド単独の治療指数に対して組成物中のＲＮＡポリヌクレオチドの治療指数を上昇させることを含む。
いくつかの実施形態において、本組成物中のＲＮＡポリヌクレオチドの治療指数は、１０：１よりも大きい。他の実施形態において、本組成物中のＲＮＡポリヌクレオチドの治療指数は、５０：１よりも大きい。
本発明のさらなる態様は、対象を処置するための方法であって、それを必要とする対象に、対象を処置するための有効量で生成される組成物を投与することを含む方法に関する。
本発明の態様は、心不全および／または他の障害の処置を、それを必要とする対象において行う方法に関し、本方法は、リラキシンポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＲＮＡポリヌクレオチドの治療的有効量を対象に投与することを含み、このＲＮＡポリヌクレオチドの投与の結果、対象の欠損タンパク質を生理学的レベルまで増加させる。
いくつかの実施形態において、心不全および／または他の障害を処置する方法は、ＲＮＡポリヌクレオチドの単回投与を伴う。いくつかの実施形態において、心不全および／または他の障害を処置する方法は、毎週投与を行うことをさらに含む。他の実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドは、イオン化可能脂質ナノ粒子中に処方される。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドは、既に記載のような組成物中にある。いくつかの実施形態において、対象への投与時、本剤型は、ａ）投与から約３０～約２４０分後のＴｍａｘ、およびｂ）約９０～約２４０分間の持続時間にわたる少なくとも５０％Ｃｍａｘの血中薬物（ＲＮＡポリヌクレオチドによって産生されるリラキシンポリペプチド）濃度プラトーを含む薬物動態（ＰＫ）プロファイルを呈する。
いくつかの実施形態において、対象への投与時、ベースラインレベルに対して少なくとも２５％のリラキシンタンパク質レベルの上昇が達成される。他の実施形態において、対象への投与時、ベースラインレベルに対して少なくとも５０％のリラキシンタンパク質レベルの上昇が達成される。
いくつかの実施形態において、対象への投与時、ベースラインレベルに対して少なくとも６０％のリラキシンタンパク質レベルの上昇が達成される。他の実施形態において、リラキシンタンパク質レベルの上昇は、最大で３日間にわたって達成される。他の実施形態において、リラキシンタンパク質レベルの上昇は、最大で５日間にわたって達成される。
いくつかの実施形態において、リラキシンタンパク質レベル上昇は、最大で７日間にわたって達成される。いくつかの実施形態において、リラキシンタンパク質レベル上昇は、対象への投与の１時間以内に達成される。他の実施形態において、リラキシンタンパク質レベル上昇は、対象への投与の３時間以内に達成される。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドは、３週間～１年にわたって１回／週投与される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドは、静脈内投与によって対象に投与される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドは、皮下投与によって対象に投与される。
いくつかの実施形態は、心不全に対するケア治療の標準を対象に投与することをさらに含む。他の実施形態において、ケア治療の標準は、ベータブロッカー、ヒドララジン／二硝酸イソルビド、ジギタリス、利尿薬、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンジオテンシン受容体ブロッカー（ＡＲＢ）、ジゴキシン、抗凝固薬、アルドステロン拮抗薬、ならびに高コレステロール、高血圧、心房細動および糖尿病を含むが限定されない併発を調節するための薬物からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドは、２５～１００マイクログラムの投与量で存在する。他の実施形態において、本方法は、０．００１ｍｇ／ｋｇ～０．００５ｍｇ／ｋｇのＲＮＡポリヌクレオチドの単回投与量を対象に投与することを含む。
本発明の態様は、心不全および／または他の障害の処置を、それを必要とする対象において行う方法に関し、本方法は、リラキシンポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＲＮＡポリヌクレオチドと、心不全および／または他の障害のためのケア治療の標準とを対象に投与することを含み、ＲＮＡポリヌクレオチドおよびケア治療の標準の併用投与の結果、対象のリラキシンタンパク質レベルを生理学的レベルに上昇させる。
本開示は、リラキシンポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲ
Ｆ）を含むポリヌクレオチドを提供し、ＯＲＦのウラシルまたはチミン含量は、リラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論的な最低ウラシルまたはチミン含量（それぞれ％ＵＴＭまたは％ＴＴＭ）の１００％～約１５０％である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦ中のウラシルまたはチミン含量は、％ＵＴＭまたは％ＴＴＭの約１０５％～約１４５％、約１０５％～約１４０％、約１１０％～約１４５％、約１１０％～約１４０％、約１１５％～約１４５％、約１１５％～約１４０％、約１２０％～約１４５％、約１２０％～約１４０％、約１２５％～約１４５％または約１２５％～約１４０％である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦ中のウラシルまたはチミン含量は、％ＵＴＭまたは％ＴＴＭの（ｉ）１１５％、１１６％、１１７％、１１８％、１１９％、１２０％、１２１％、１２２％、１２３％、１２４％または１２５％～（ｉｉ）１３９％、１４０％、１４１％、１４２％、１４３％、１４４％または１４５％である。
いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、少なくとも１つの低頻度コドンをさらに含む。
いくつかの実施形態において、ＯＲＦは、表５の配列から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、リラキシンポリペプチドは、野生型リラキシンタンパク質のポリペプチド配列（表５）と少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含み、このリラキシンポリペプチドは、治療活性を有する。いくつかの実施形態において、リラキシンポリペプチドは、治療活性を有する変異体、誘導体または突然変異体である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、輸送ペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、表４から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１４２に結合する。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１４２－３ｐまたはｍｉＲ－１４２－５ｐに結合する。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ１４２は、配列番号５３９を含む。
いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲをさらに含む。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、配列番号５４５～５６９からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である核酸配列またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、３’ＵＴＲをさらに含む。いくつかの実施形態において、３’ＵＴＲは、配列番号４９３～５０５および５７０～５８７からなる群から選択される配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である核酸配列またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲ内に位置する。
いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、５’末端キャップをさらに含む。いくつかの実施形態において、５’末端キャップは、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’－フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グア
ノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジドグアノシン、Ｃａｐ２、Ｃａｐ４、５’メチルＧキャップまたはその類似体を含む。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、ポリＡ領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、ポリＡ領域は、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０または少なくとも約９０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、ポリＡ領域は、約１０～約２００、約２０～約１８０、約５０～約１６０、約７０～約１４０、約８０～約１２０ヌクレオチド長を有する。
いくつかの実施形態において、対象への投与時、本ポリヌクレオチドは、野生型リラキシンポリヌクレオチドを含む対応するポリヌクレオチドに対して（ｉ）より長い血漿半減期、（ｉｉ）ＯＲＦによりコードされるリラキシンポリペプチドの発現増加、（ｉｉｉ）発現断片を生じさせる翻訳抑止頻度の低下、（ｉｖ）より高い構造安定性または（ｖ）それらの任意の組み合わせを有する。
いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、（ｉ）５’末端キャップ、（ｉｉ）５’－ＵＴＲ、（ｉｉｉ）リラキシンポリペプチドをコードするＯＲＦ、（ｉｖ）３’－ＵＴＲおよび（ｖ）ポリＡ領域を含む。いくつかの実施形態において、３’－ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
本開示は、本明細書中に記載のポリヌクレオチドを作製する方法も提供し、本方法は、少なくとも１つのウラシル核酸塩基をアデニン、グアニンまたはシトシン核酸塩基で置換することにより、または少なくとも１つのアデニン、グアニンまたはシトシン核酸塩基をウラシル核酸塩基で置換することにより、リラキシンポリペプチドをコードするＯＲＦを修飾することを含み、この置換は、全て同義の置換である。いくつかの実施形態において、本方法は、ウラシルの少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または約１００％を５－メトキシウラシルで置き換えることをさらに含む。
特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）または（ＩＩｅ）：
Figure 0007459172000003
（式中、Ｒ４は、本明細書中に記載のとおりである）
のものまたはその塩もしくは異性体を含む。
いくつかの実施形態において、Ｒ４は、本明細書中に記載のとおりである。
いくつかの実施形態において、本化合物は、式（ＩＩｄ）
Figure 0007459172000004
（式中、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ５～１４アルキルおよびＣ５～１４アルケニルからなる群から独立して選択され、ｎは、２、３および４から選択され、およびＲ’、Ｒ’’、Ｒ５、Ｒ６およびｍは、請求項１６で定められるとおりである）
の化合物またはその塩もしくは立体異性体である。
いくつかの実施形態において、Ｒ２は、Ｃ８アルキルである。いくつかの実施形態にお
いて、Ｒ３は、Ｃ５アルキル、Ｃ６アルキル、Ｃ７アルキル、Ｃ８アルキルまたはＣ９アルキルである。いくつかの実施形態において、ｍは、５、７または９である。いくつかの実施形態において、各Ｒ５は、Ｈである。いくつかの実施形態において、各Ｒ６は、Ｈである。
別の態様において、本開示は、本明細書中に記載のような化合物（例えば、式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）または（ＩＩｅ）による化合物）を含む脂質構成要素を含むナノ粒子組成物を特徴とする。
また別の態様において、本開示は、先行する態様によるナノ粒子組成物と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を特徴とする。例えば、本医薬組成物は、保管および／または輸送のために冷蔵または凍結される（例えば、－１５０℃～約０℃または約－８０℃～約－２０℃（例えば、約－５℃、－１０℃、－１５℃、－２０℃、－２５℃、－３０℃、－４０℃、－５０℃、－６０℃、－７０℃、－８０℃、－９０℃、－１３０℃または－１５０℃）の温度など、４℃以下の温度で保管される）。例えば、本医薬組成物は、例えば、約－２０℃、－３０℃、－４０℃、－５０℃、－６０℃、－７０℃または－８０℃で保管および／または輸送のために冷蔵される溶液である。
別の態様において、本開示は、細胞（例えば、哺乳動物細胞）に治療薬および／または予防薬（例えば、ｍＲＮＡ）を送達する方法を提供する。本方法は、対象（例えば、哺乳動物、例えばヒトなど）に、（ｉ）リン脂質（多不飽和脂質など）、ＰＥＧ脂質、構造脂質および式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）または（ＩＩｅ）の化合物を含む脂質構成要素と、（ｉｉ）治療薬および／または予防薬とを含むナノ粒子組成物を投与するステップを含み、この投与は、細胞をナノ粒子組成物と接触させることを伴い、それにより治療薬および／または予防薬が細胞に送達される。
別の態様において、本開示は、細胞（例えば、哺乳動物細胞）中で関心のあるポリペプチドを産生させる方法を提供する。本方法は、細胞を、（ｉ）リン脂質（多不飽和脂質など）、ＰＥＧ脂質、構造脂質および式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）または（ＩＩｅ）の化合物を含む脂質構成要素と、（ｉｉ）関心のあるポリペプチドをコードするｍＲＮＡとを含むナノ粒子組成物と接触させるステップを含み、それによりポリペプチドを産生させるために細胞中でｍＲＮＡが翻訳可能となる。
別の態様において、本開示は、疾患または障害の処置を、それを必要とする哺乳動物（例えば、ヒト）において行う方法を提供する。本方法は、哺乳動物に、（ｉ）リン脂質（多不飽和脂質など）、ＰＥＧ脂質、構造脂質および式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）または（ＩＩｅ）の化合物を含む脂質構成要素と、（ｉｉ）治療薬および／または予防薬（例えば、ｍＲＮＡ）とを含む治療的有効量のナノ粒子組成物を投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、疾患または障害は、機能障害性のまたは異常なタンパク質またはポリペプチド活性を特徴とする。
別の態様において、本開示は、治療薬および／または予防薬を哺乳動物の臓器（例えば、肝臓、脾臓、肺または大腿骨）に送達する（例えば、特異的に送達する）方法を提供する。本方法は、対象（例えば、哺乳動物）に、（ｉ）リン脂質、ＰＥＧ脂質、構造脂質および式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）または（ＩＩｅ）の化合物を含む脂質構成要素と、（ｉｉ）治療薬および／または予防薬（例えば、ｍＲＮＡ）とを含むナノ粒子組成物を投与するステップを含み、この投与は、細胞をナノ粒子組成物と接触させることを伴い、それにより治療薬および／または予防薬
が標的器官（例えば、肝臓、脾臓、肺または大腿骨）に送達される。
別の態様において、本開示は、標的組織（例えば、肝臓、脾臓、肺、筋肉または大腿骨）への治療薬および／または予防薬（例えば、ｍＲＮＡ）の送達促進のための方法を特徴とする。本方法は、対象（例えば、哺乳動物）にナノ粒子組成物を投与することを含み、この組成物は、（ｉ）式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）または（ＩＩｅ）の化合物、リン脂質、構造脂質およびＰＥＧ脂質を含む脂質構成要素と、（ｉｉ）治療薬および／または予防薬とを含み、この投与は、標的組織をナノ粒子組成物と接触させることを含み、それにより治療薬および／または予防薬が標的組織に送達される。
いくつかの実施形態において、本明細書中で開示される組成物は、ナノ粒子組成物である。いくつかの実施形態において、送達剤は、リン脂質をさらに含む。いくつかの実施形態において、リン脂質は、
１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、
１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、
１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、
１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、
１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、
１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、
１－オレオイル－２－コレステリルへミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、
１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、
１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、
１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ １６：０ ＰＥ）、
１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、
１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、
１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、
１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、
１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリンおよびそれらの任意の混合物からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、送達剤は、構造脂質をさらに含む。いくつかの実施形態において、構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、アルファ－トコフェロールおよびそれらの任意の混合物からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、送達剤は、ＰＥＧ脂質をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシ
ルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールおよびそれらの任意の混合物からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、送達剤は、３－（ジドデシルアミノ）－Ｎ１，Ｎ１，４－トリドデシル－１－ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、
Ｎ１－［２－（ジドデシルアミノ）エチル］－Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４－トリドデシル－１，４－ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、
１４，２５－ジトリデシル－１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、
１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、
へプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、
２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、
１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、
２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ）、
（２Ｒ）－２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、および
（２Ｓ）－２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））
からなる群から選択されるイオン化可能脂質をさらに含む。
いくつかの実施形態において、送達剤は、リン脂質、構造脂質、ＰＥＧ脂質またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。
いくつかの実施形態において、本組成物は、インビボ送達のために処方される。いくつかの実施形態において、本組成物は、筋肉内、皮下または皮内送達のために処方される。
本発明の限定のそれぞれは、本発明の様々な実施形態を包含し得る。したがって、何れか１つの要素または要素の組み合わせを含む本発明の限定のそれぞれは、本発明の各態様に含まれ得ることが想定される。本発明は、以下の説明で示されるかまたは図面で例示される構成要素の構築および配置の詳細に対するその適用に限定されない。本発明は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実施または実行可能である。また、本明細書中で使用される表現および用語は、説明を目的とするものであり、限定としてみなされるべきものではない。「包含する」、「含む」または「有する」、「含有する」、「伴う」および本明細書中のそれらの変形物の使用は、後に列挙する項目およびそれらの均等物ならびにさらなる項目を包含することを意味するものとする。
先行するおよび他の目的、特性および長所は、異なる視点全体を通じて、同様の参照文字が同じ部分を指す添付の図面で示されるような、本発明の特定の実施形態の以下の記載から明らかとなるであろう。図面は、必ずしも縮尺どおりではなく、代わりに本発明の様々な実施形態の原理を説明する際に強調される。
野生型リラキシンおよび「ＶＬｋ」－ｈＲＬＮ２融合タンパク質を示す概略図である。（Ｇ４Ｓ）３配列は、配列番号５８９に対応する。 インビトロ活性証明アッセイにおいてＶＬｋ－ＲＬＮ２融合タンパク質ｍＲＮＡが機能タンパク質を産生させることを示す一連のグラフである。 ＶＬｋ－ＲＬＮ２融合タンパク質ｍＲＮＡが、ＩＶ注射を受けた自然発症高血圧ラットにおいて活性が保持された機能タンパク質を産生させることを示すグラフである。図３Ａは、ラットの心拍を示し、図３Ｂは、拡張期動脈圧を示す。このデータは、動物の操作期間を除いて昼間および夜間毎に平均をとる（平均＋／－ＳＤ）（Ｎ＝ラット８匹／群）。 ＶＬｋ－ＲＬＮ２融合タンパク質ｍＲＮＡが、ＩＶ注射を受けた自然発症高血圧ラットにおいて活性が保持された機能タンパク質を産生させることを示すグラフである。図３Ａは、ラットの心拍を示し、図３Ｂは、拡張期動脈圧を示す。このデータは、動物の操作期間を除いて昼間および夜間毎に平均をとる（平均＋／－ＳＤ）（Ｎ＝ラット８匹／群）。 自然発症高血圧ラットにおける循環タンパク質データを示す。 最大で６日間にわたり、リラキシンＶＬｋ－ＲＬＮ２融合タンパク質ｍＲＮＡが、ＩＶ注射カニクイザルにおいて標的濃度を上回る循環タンパク質レベルを生じさせることを示す。 インビボ恥骨間靭帯伸長（ＩＬＥ）アッセイの結果を示し、ＶＬｋ－ＲＬＮ２融合タンパク質ｍＲＮＡが機能タンパク質を産生することを示す。 ＶＬｋ－ＲＬＮ２融合タンパク質ｍＲＮＡ発現に対するインビボスクリーニングを示し、循環リラキシンタンパク質レベルがｍＲＮＡ注射ラットにおいて最長で６日間にわたり標的濃度を上回ることを示す。 ＶＬｋ－ＲＬＮ２融合タンパク質ｍＲＮＡ発現リラキシン濃度がＩＶ注射マウスにおいて最長８日間にわたり標的濃度を超えることを示す。 カニクイザルにおける再投与実験からのデータを示す（実施例１４を参照されたい）。 カニクイザルにおける再投与実験からのデータを示す（実施例１４を参照されたい）。 各投与（３回）後のカニクイザルにおけるリラキシン－ＶＬｋの循環ｍＲＮＡレベルを示す。 恥骨間靭帯伸長（ＩＬＥ）アッセイにおいて測定された、MC3-NTFIX、化 合物 18-NTFIX、MC3-RLN2、化合物18-RLN2、またはrRLN2を用いた処置後の恥骨間靭帯測定値を示す。
本発明は、線維症および／または循環器疾患の処置のためのｍＲＮＡ治療薬を提供する。線維症および循環器疾患の両方は、循環リラキシンの欠乏によるものであり得る。ｍＲＮＡ治療薬は、循環器疾患、線維症およびリラキシン欠乏に関連する他の障害の処置に特によく適しており、なぜなら、この技術により、リラキシンをコードするｍＲＮＡの細胞内送達と、それに続く標的細胞内の機能的リラキシンタンパク質のデノボ合成とがもたらされるからである。標的細胞へのｍＲＮＡ送達後、細胞自体の翻訳機構によって所望のリラキシンタンパク質が発現され、したがって、完全に機能的なリラキシンタンパク質が、欠失があるかまたは欠損があるタンパク質と置き換わる。
インビボでの核酸に基づく治療薬（例えば、ｍＲＮＡ治療薬）の送達と関連する１つの課題は、身体の免疫系が外来核酸と遭遇する際に生じ得る自然免疫反応に起因する。外来ｍＲＮＡは、トール様受容体（ＴＬＲ）、特にＴＬＲ７／８を通じた認識を介して免疫系を活性化し得、これは、１本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）により活性化される。非免疫細胞において、外来ｍＲＮＡの認識は、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）を通じて起こり得る。外来ｍＲＮＡの免疫認識の結果、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）産生、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）分布および強力なＩ型インターフェロン（Ｉ型ＩＦＮ）反応を含む、不要なサイトカインの影響が生じ得る。本発明は、免疫活性化を最低限に抑え、タンパク質へのｍＲＮＡの翻訳効率を最適化するための、治療用ｍＲＮＡ内での様々な修飾型ヌクレオチドの組み込みを特徴とする。本発明の特定の態様は、特にタンパク質発現を促進するために、リラキシンをコードする治療用ｍＲＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内における、自然免疫反応の低下および配列最適化のためのヌクレオチド修飾の組み合わせを特徴とする。
本発明のｍＲＮＡ治療技術は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達系を介した、リラキシンをコードするｍＲＮＡの送達も特徴とする。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、標的細胞へのｍＲＮＡの安全で有効な送達のための理想的なプラットフォームである。ＬＮＰは、細胞取り込み、細胞内輸送およびエンドソーム放出またはエンドソーム脱出を含む機序によるユニークな核酸送達能を有する。本発明は、インビボで投与した場合に特性が向上している新規イオン化可能脂質に基づくＬＮＰを特徴とする。理論に拘束されるものではないが、本発明の新規イオン化可能脂質に基づくＬＮＰは、例えば、細胞取り込み、細胞内輸送および／またはエンドソーム放出もしくはエンドソーム脱出といった特性が改善されていると考えられる。例えば、第１の投与において、全身経路により投与されるＬＮＰ（例えば、静脈内（ＩＶ）投与）は、引き続いて、例えばさらなる投与において注射されるＬＮＰのクリアランスを加速させ得る。この現象は、血液クリアランス加速（ＡＢＣ）として知られ、特に治療に関連して欠損ホルモン（例えば、リラキシン）を補充する場合に重要な問題である。これは、対象の標的組織において酵素の必要なレベルを維持するために、ｍＲＮＡ治療薬の反復投与が殆どの場合に必須となるためである（例えば、急性心不全に罹患している対象）。反復投与の課題は、複数のレベルにおいて対処され得る。ｍＲＮＡ操作および／またはＬＮＰによる効率的な送達の結果、１回目の投与後に発現されるタンパク質（例えば、リラキシン）レベルが向上し、その持続時間が延長され得、続いて１回目の投与と続く投与との間の時間が長くなり得る。ＡＢＣ現象は、少なくとも部分的に一過性のものであり、全身投与から十分な時間が経過した後、ＡＢＣの基礎となる免疫反応が解消することが知られている。このように、一態様において、本発明のｍＲＮＡ薬の全身送達後のタンパク質発現および／または活性の持続時間の延長は、ＡＢＣ現象に効果がある。さらに、免疫検知および／または認識を回避するためにＬＮＰを操作し得、したがって続くまたは反復投与の際にＡＢＣをさらに回避し得る。本発明の代表的な態様は、ＡＢＣが軽減されるように改変されている新規ＬＮＰを特徴とする。
リラキシン
野生型リラキシンは、６０００Ｄａヘテロ二量体ポリペプチド内分泌および自己分泌／傍分泌ホルモンであり、インスリン遺伝子スーパーファミリーに属する。これは、２つの鎖間ジスルフィド結合により連結されるＡおよびＢ鎖を含有し、１つはＡ鎖内ジスルフィド結合である。リラキシンは、血管形成を促進し、血管内皮の修復に寄与する。これは、様々な組織におけるその受容体への結合を通じて筋骨格および他の系に対してその効果を発揮するが、この過程は、様々なシグナル伝達経路が介在する過程である。リラキシン（ＲＬＮ）１、ＲＬＮ２、ＲＬＮ３およびインスリン様ペプチド（ＩＮＳＬ）３、ＩＮＳＬ４、ＩＮＳＬ５、ＩＮＳＬ６を含め、７つの既知のリラキシンファミリーペプチドがある。ＲＬＮ１およびＲＬＮ２は、線維芽細胞におけるコラーゲン制御および代謝に関与する一方、ＲＬＮ３は、脳に特異的である。ＲＬＮ１およびＲＬＮ２は、心拍出量、腎臓血流および動脈コンプライアンスを含め、妊娠中に起こる血行動態変化にも関与する。さらに、ＲＬＮ２は、リン酸化カスケードを通じた一酸化窒素の産生増加を通じて血管拡張に介在する。リラキシンは、強心薬でもあり、これは、２つの強力な血管収縮薬であるアンジオテンシンＩＩおよびエンドセリンの阻害を通じて血管拡張を引き起こし得る。このホルモンは、心臓筋フィラメントのカルシウム感受性を向上させ、タンパク質キナーゼＣによる筋フィラメントのリン酸化を増加させることも示されている。心筋細胞のエネルギー消費が増加しない一方、筋フィラメントにより生じる力は増加する。腎臓において、リラキシンは、クレアチニンクリアランスを上昇させ、腎臓血流を増加させる。
ヒトにおいて、Ｈ２リラキシン（リラキシン－２）は、主要な循環形態である。Ｈ２リラキシンの機能は、主にリラキシンファミリーペプチド１（ＲＸＦＰ１）受容体を通じて媒介されるが、これは、弱い効力でＲＸＦＰ２受容体も活性化し得る。本明細書中で使用される場合、「リラキシン」という用語は、ＲＸＦＰ１および／またはＲＸＦＰ２を活性化可能なヘテロ二量体ポリペプチドを指す。
いくつかの実施形態において、リラキシンは、配列番号１もしくは３またはそれらの断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドであるか、または配列番号２もしくは４またはそれらの断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。他の実施形態において、リラキシンは、配列番号１もしくは３またはそれらの断片と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドであるか、または配列番号２もしくは４またはそれらの断片と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
本発明は、いくつかの態様において、リラキシンタンパク質をコードするｍＲＮＡである。リラキシンは、血管系がオーバーワークにならないように保護する血管作動性ペプチドであり、腎臓機能を向上させ、細胞増殖および生存を促進し、良好な管構造を維持する。対象へのリラキシンの投与は、線維症、例えば腎臓線維症、心筋繊維化または肺線維症および循環器疾患、例えば急性心不全、冠動脈疾患、微小血管疾患、心機能不全を伴う急性冠症候群または虚血再灌流を処置および予防するなどの治療効果を有する。
リラキシンは、顕著な治療効果をもたらすものの、組み換え野生型リラキシンの半減期は短く、それにより体内での治療レベルの達成は困難なものとなる。リラキシンの組み換え型は、セレラキシンと呼ばれ、Ｎｏｖａｒｔｉｓにより市販されており、毒性が低いことが明らかになっているが、血流中での分解が非常に速いため、有効性に疑問が残る。セレラキシンの半減期は、血清中で約１５分であり、連続４８時間点滴中では７～８時間である。
いくつかの態様において、本発明は、野生型または安定化リラキシンタンパク質、例えば半減期が大きく延長し、したがって疾患の処置においてより有効であり得るリラキシン－免疫グロブリン融合タンパク質などをコードするｍＲＮＡなどの治療用リラキシンである。他の態様において、治療用リラキシンは、リラキシン融合タンパク質である。さらに、本明細書中に記載の安定化リラキシン治療薬の半減期がより長いことにより、投与間の間隔をより長くし、患者への投与回数を少なくすることが可能となり得る。リラキシンのＰＥＧ化形態が野生型リラキシンよりも安定であることが明らかになっているものの、セレラキシンを超える血清安定性の向上が明らかになっているのは僅か１３．５％前後である。本発明の安定融合タンパク質は、顕著により安定である。例えば、リラキシンのＡ鎖の後にＶＬｋ領域が融合される融合タンパク質の血清中の半減期は、セレラキシンと比べて１～２週間長くなっている。
ＲＸＦＰ１および／またはＲＸＦＰ２を活性化する能力は、リラキシン治療薬の非存在下での活性化レベルを超える活性化上昇を指す。活性化能は、例えば、インビトロまたはインビボアッセイ、例えば本明細書中に記載のアッセイを用いて評価され得る。
リラキシン融合タンパク質は、本明細書中で使用される場合、安定化タンパク質に連結されるリラキシンから構成されるタンパク質である。いくつかの実施形態において、安定
化タンパク質は、免疫グロブリンタンパク質である。他の実施形態において、安定化タンパク質は、ＶＬｋタンパク質である。
リラキシン核酸またはリラキシンｍＲＮＡは、本明細書中で使用される場合、野生型リラキシン、それらの変異体またはそれらの断片（野生型リラキシンとも呼ばれる）をコードするＲＮＡまたはリラキシン融合タンパク質、すなわち安定化タンパク質に連結されるリラキシン（安定化リラキシン融合タンパク質と呼ばれる）をコードするＲＮＡである。いくつかの実施形態において、安定化タンパク質は、免疫グロブリンタンパク質である。他の実施形態において、安定化タンパク質は、ＶＬｋタンパク質である。
本発明のリラキシン治療薬は、様々な障害を処置するのに有用である。例えば、リラキシン治療薬は、心不全（急性または慢性）ならびに急性の投薬徴候および慢性の投薬徴候を処置するのに有用である。急性の投薬徴候としては、急性心不全（非虚血）、心機能不全を伴う急性冠症候群、肺、腎臓、肝臓、心臓などの実質臓器移植に関連する虚血再灌流、心肺バイパス術臓器保護、例えば腎臓、ならびに角膜治癒、すなわち眼への投与によるものが挙げられるが限定されない。慢性の投薬徴候としては、慢性心不全、糖尿病性ニューロパチー、ＮＡＳＨ、心房細動、心筋繊維化、糖尿病性創傷治癒および肝硬変が挙げられるが限定されない。
心不全（ＨＦ）は、左心室が血液を満たすかまたは駆出することができないことを含み、含酸素血液を身体の他の部分に送達する能力が低下する。これは、癌よりも多く、コストが高く、死亡率が高い。心不全は、多くの基礎となる原因および様々な共存症を伴う複合疾患である。ＨＦの主要な原因の一部としては、冠動脈疾患、心臓発作、高血圧、異常な心臓弁、心筋症、心筋炎、先天性心臓欠陥、糖尿病、肥満、肺疾患および睡眠時無呼吸が挙げられる。心不全に反応して、身体は、必要な血液を順応させ、送達しようとし、その結果、心臓が拡張し、心筋質量が増加し、心拍が上昇し、血管が狭窄し、血液が他の臓器から迂回するようになり得る。一般的に、疾患の不均一性のために患者毎に治療選択がなされる。
２つのタイプのＨＦがある：急性（ＨＦ症例のおよそ１０％）（これは、急速に進行し、入院加療を必要とする）および慢性（ＨＦ症例のおよそ９０％）（これは、徐々に進行し、長期の処置を必要とする）。この２タイプ間に４クラスの心不全：クラスＩ（無症候性、ＨＦ患者の４０％）、クラスＩＩ（中等度の労作でＨＦ症状、ＨＦ患者の３０％）、クラスＩＩＩ（最小の労作でＨＦ症状、ＨＦ患者の２０％）およびクラスＩＶ（安静時にＨＦ症状、ＨＦ患者の１０％）がある。心不全がある対象の死亡率は、次のとおりである：入院中（６％）、退院後３０日（１１％）、１年（３０％）および５年（５０％）。
心臓が身体へどの程度良好に血液を送り出すかの目安である駆出率（ＥＦ）を使用して心不全をグレード付けし、定量し得る。ＥＦは、押し出された血液量と心臓中の血液量とを比較する。これは、押し出された血液量を心房中の血液量により除したものとして計算される。
いくつかの実施形態において、本開示のリラキシンｍＲＮＡは、入院患者および経過観察投薬の両方に対して急性ＨＦを処置するために使用される。さらなる実施形態において、リラキシンｍＲＮＡは、ＨＦ症状を軽減し、疾患進行および死亡を防ぎ、および／またはＨＦ入院を減少させるために使用される。他の実施形態において、本開示のリラキシンｍＲＮＡは、心機能不全を伴う急性冠症候群、実質臓器移植（例えば、肺、腎臓、肝臓、および／または心臓）に関連する虚血再灌流、心肺バイパス術（例えば、腎臓機能を保護するため）、角膜治癒、糖尿病性ニューロパチー、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、心房細動（心筋繊維化）、糖尿病性創傷治癒ならびに肝硬変などの疾患を処置するために使用される。
当業者にとって当然のことながら、本発明の薬物または処置の治療効果は、対象から（例えば、発症前検査対象（げっ歯類、霊長類など）から、または臨床対象（ヒト）から）採取された試料中でのコードされるタンパク質の発現レベルを測定することを特徴とし得るか、またはこれにより決定され得る。同様に、本発明の薬物または処置の治療効果は、対象から（例えば、発症前検査対象（げっ歯類、霊長類など）から、または臨床対象（ヒト）から）採取された試料中でのコードされるタンパク質の活性レベルを測定することを特徴とし得るか、またはこれにより決定され得る。さらに、本発明の薬物または処置の治療効果は、対象から採取された試料中での適切なバイオマーカーのレベルを測定することを特徴とし得るか、またはこれにより決定され得る。タンパク質および／またはバイオマーカーのレベルは、本発明のｍＲＮＡ治療薬の単回投与での投与後に決定され得るか、または単回投与での投与後のいくつかの時間点で決定および／もしくは監視され得、または一連の処置、例えば複数回投与処置全体を通じて決定および／もしくは監視され得る。
リラキシンタンパク質発現レベル
本発明の特定の態様は、対象、例えば動物（例えば、げっ歯類、霊長類など）またはヒト対象における発現レベルまたはリラキシンタンパク質のレベルの測定、決定および／または監視を特徴とする。動物としては、正常で健康なまたは野生型動物ならびに循環器疾患およびその処置の理解での使用のための動物モデルが挙げられる。代表的な動物モデルとしては、げっ歯類モデルが挙げられ、例えばリラキシン欠損マウスは循環器疾患マウスとも呼ばれる。リラキシンタンパク質発現レベルは、生体試料、例えば血清または血漿試料中でタンパク質レベルを決定するための任意の当技術分野で認められている方法により測定または決定され得る。「レベル」または「タンパク質レベル」という用語は、本明細書中で使用される場合、好ましくは、試料または対象内でのタンパク質の重量、質量または濃度を意味する。当業者により理解されるであろうが、特定の実施形態において、試料は、例えば、次のもの：精製、沈殿、分離、例えば遠心分離および／またはＨＰＬＣの何れかに供され、続いて例えば質量および／または分光測定分析を使用したタンパク質レベルの決定に供される。代表的な実施形態において、タンパク質発現レベルを決定するために、酵素－結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用し得る。他の代表的な実施形態において、タンパク質精製、分離およびＬＣ－ＭＳは、本発明によるタンパク質のレベルを決定するための手段として使用され得る。いくつかの実施形態において、本発明のｍＲＮＡ療法（例えば、単回静脈内用量）の結果、ｍＲＮＡ療法の単回用量の投与後、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも８４時間、少なくとも９６時間、少なくとも１０８時間、少なくとも１２２時間にわたり、対象の血漿または血清中のリラキシンタンパク質発現レベルが上昇する（例えば、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍上昇および／または少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％正常レベルまで上昇）。
リラキシンタンパク質活性
循環器疾患患者において、リラキシン活性は、例えば、正常の約２５％、３０％、４０％または５０％まで低下する。本発明のさらなる態様は、対象、例えば動物（例えば、げっ歯類、霊長類など）またはヒト対象におけるリラキシンタンパク質の活性レベルの測定、決定および／または監視を特徴とする。活性レベルは、生体試料中で活性レベルを決定するための任意の当技術分野で認められている方法により測定または決定され得る。「活性レベル」という用語は、本明細書中で使用される場合、好ましくは試料または試料内の総タンパク質の体積、質量または重量あたりのタンパク質の活性を意味する。
代表的な実施形態において、本発明のｍＲＮＡ療法は、投与後６～１２時間または１２～２４、２４～４８もしくは４８～７２時間（例えば、投与後４８または７２時間）において、組織（例えば、血漿）中で少なくとも５Ｕ／ｍｇ、少なくとも１０Ｕ／ｍｇ、少なくとも２０Ｕ／ｍｇ、少なくとも３０Ｕ／ｍｇ、少なくとも４０Ｕ／ｍｇ、少なくとも５０Ｕ／ｍｇ、少なくとも６０Ｕ／ｍｇ、少なくとも７０Ｕ／ｍｇ、少なくとも８０Ｕ／ｍｇ、少なくとも９０Ｕ／ｍｇ、少なくとも１００Ｕ／ｍｇまたは少なくとも１５０Ｕ／ｍｇのリラキシン活性を生じさせるのに有効なｍＲＮＡ用量を含む医薬組成物を特徴とする。代表的な実施形態において、本発明のｍＲＮＡ療法は、投与後６～１２時間または１２～２４、２４～４８もしくは４８～７２時間（例えば、投与後４８または７２時間）において、血漿中で少なくとも５０Ｕ／ｍｇ、少なくとも１００Ｕ／ｍｇ、少なくとも２００Ｕ／ｍｇ、少なくとも３００Ｕ／ｍｇ、少なくとも４００Ｕ／ｍｇ、少なくとも５００Ｕ／ｍｇ、少なくとも６００Ｕ／ｍｇ、少なくとも７００Ｕ／ｍｇ、少なくとも８００Ｕ／ｍｇ、少なくとも９００Ｕ／ｍｇ、少なくとも１，０００Ｕ／ｍｇまたは少なくとも１，５００Ｕ／ｍｇのリラキシン活性を生じさせるのに有効なｍＲＮＡ用量を含む医薬組成物を特徴とする。
代表的な実施形態において、本発明のｍＲＮＡ療法は、上記の活性レベルを生じさせるｍＲＮＡの単回静脈内用量を含む医薬組成物を特徴とする。別の実施形態において、本発明のｍＲＮＡ療法は、上記の活性レベルを維持する複数回の単回単位静脈内用量のｍＲＮＡで投与され得る医薬組成物を特徴とする。
リラキシンバイオマーカー
本発明のさらなる態様は、バイオマーカー、例えばＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、システインＣ、ＢＮＰのＮ末端プロホルモン（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）の（１つまたは複数の）レベルを決定すること、別の試料中、例えば同じ患者、別の患者、対照、および／または同じもしくは異なる時間点からの同じまたは異なるバイオマーカーのレベル（例えば、参照レベル）、および／または生理的レベル、および／または高レベル、および／または超生理学的レベル、および／または対照のレベルと比較して試料中で決定することを特徴とする。当業者は、バイオマーカーの生理的レベル、例えば正常または野生型動物、正常または健康な対象などでのレベル、特に健康なおよび／または正常な機能を有する対象の特徴となる１つまたは複数のレベルをよく知っている。本明細書中で使用される場合、「高レベル」という句は、正常または野生型発症前動物において、または正常または健康な対象、例えばヒト対象において通常見られるものより大きい量を意味する。本明細書中で使用される場合、「超生理学的」という用語は、正常もしくは野生型発症前動物において、または正常もしくは健康な対象、例えばヒト対象において通常見られるものよりも大きく、任意選択により生理的反応を顕著に向上させる量を意味する。本明細書中で使用される場合、「比較する」または「比較して」という用語は、好ましくは、２つ以上の値、例えばバイオマーカーのレベルの値の数学的比較を意味する。したがって、このような値の少なくとも２つを互いに比較する場合、値の一方がもう一方の値または値の群よりも高いか、低いかまたはそれと同一であるかの何れかであることは当業者にとって容易に明らかとなるであろう。比較することまたは比較は、これに関連して、例えば投与前のその対象における（例えば、循環器疾患に罹患している者における）または正常もしくは健康な対象における参照血清ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ、参照血清システインＣおよび／または参照血清ＢＮＰレベルと比較する場合、例えば対照値と比較することであり得る。比較することまたは比較は、これに関連して、例えば投与前のその対象における（例えば、循環器疾患に罹患している者における）または正常もしくは健康な対象における参照尿中ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ排出レベルまたは血清ＢＮＰ、システインＣ、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰレベルと比較する場合、例えば対照値と比較することでもあり得る。
本明細書中で使用される場合、「対照」は、好ましくは、その対象の循環器疾患状態が
分かっている対象からの試料である。ある実施形態において、対照は、健康な患者の試料である。別の実施形態において、対照は、既知の循環器疾患の状態、例えば重度、軽度または健康な循環器疾患状態を有する少なくとも１名の対象、例えば対照患者からの試料である。別の実施形態において、対照は、循環器疾患に対して処置されていない対象からの試料である。またさらなる実施形態において、対照は、単一の対象からの試料または様々な対象からの試料のプールおよび／またはある対象から異なる時間点で採取された試料である。
「レベル」または「バイオマーカーのレベル」という用語は、本明細書中で使用される場合、好ましくは試料または対象内の本発明のバイオマーカーの質量、重量または濃度を意味する。本発明のバイオマーカーとしては、例えば、ＢＮＰ、システインＣ、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰが挙げられる。当業者により理解されるであろうが、特定の実施形態において、試料は、例えば次の１つ以上：物質精製、沈殿、分離、例えば遠心分離および／またはＨＰＬＣに供され得、続いて例えば質量分光測定分析を用いたバイオマーカーレベルの決定に供され得る。代表的な実施形態において、本発明によるバイオマーカーレベルを決定するための手段としてＬＣ－ＭＳを使用し得る。
バイオマーカーの「レベルを決定する」という用語は、本明細書中で使用される場合、対象からの試料中、例えば対象からの体液（例えば、血清、血漿、尿、血液、リンパ、糞便など）中または対象の組織（例えば、肝臓、心臓、脾臓、腎臓など）中の少なくとも１つの物質の量を定量することを含む方法を意味し得る。
「参照レベル」という用語は、本明細書中で使用される場合、（例えば、循環器疾患に罹患している者における）または正常もしくは健康な対象における、本発明のｍＲＮＡ療法の投与前の対象における（例えば、バイオマーカーの）レベルを指し得る。
本明細書中で使用される場合、「正常な対象」または「健康な対象」という用語は、循環器疾患に関連する症状に罹患していない対象を指す。さらに、リラキシン名（リラキシン）遺伝子の機能的部分またはドメインの突然変異がなく、かつ／または循環器疾患に関連する症状を生じさせるリラキシンまたはその活性の低下または欠損が起こるリラキシン遺伝子の突然変異がない場合、対象は、正常（または健康）とみなされるであろう。対象からの試料がこのようなリラキシン突然変異に対する遺伝子検査に供される場合、この突然変異が検出される。本発明の代表的な実施形態において、健康な対象からの試料が対照試料として使用されるか、または健康もしくは正常な対象の試料からのバイオマーカーレベルに対する既知または標準化された値を対照として使用する。
いくつかの実施形態において、循環器疾患に対する処置を必要とする対象からの試料中または循環器疾患に対して処置されている対象におけるバイオマーカーレベルの、バイオマーカーの対照レベルとの比較は、対象（循環器疾患に対して処置を必要とするかまたは処置されている）からの試料中のバイオマーカーレベルをベースラインまたは参照レベルと比較することを含み、対象（循環器疾患に対して処置を必要とするかまたは処置されている）からの試料中のバイオマーカーレベルがベースラインまたは参照レベルと比較して上昇しているか、向上しているか、またはより高くなっている場合、これは、対象が循環器疾患に罹患しており、および／または処置を必要としていることを示し、および／または対象（循環器疾患に対して処置を必要とするかまたは処置されている）からの試料中のバイオマーカーレベルがベースラインレベルと比較して低下しているかまたはより低くなっている場合、これは、対象が循環器疾患に罹患していないか、循環器疾患に対して問題なく処置されているか、または循環器疾患に対する処置が必要ないことを示す。特定の時間内、例えば６時間以内、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間または７２時間以内かつ／または特定の持続時間、例えば４８時間、７２時間、９６時間、１２０
時間、１４４時間、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１８か月、２４か月などにわたり、バイオマーカー、例えばＢＮＰ、システインＣ、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰのレベルの低下が強いほど（例えば、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍低下および／または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％低下）、例えば本発明のｍＲＮＡ療法（例えば、単回投与または複数回計画）などの治療がより良好に成功している。
投与後１、２、３、４、５、６日以内またはそれを超える、特に体液（例えば、血漿、尿、例えば尿沈渣）中または対象における組織（例えば、肝臓、心臓、脾臓、腎臓、脳または肺）での、例えばＢＮＰ、システインＣ、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰなど、バイオマーカーレベルの少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも１００％またはそれを超える低下は、循環器疾患を問題なく治療するのに適切な用量であることを示し、本明細書中で使用される場合、低下は、好ましくは、特定の時間の終わり（例えば、投与後、例えば単回静脈内投与後）に決定されたバイオマーカーレベルを、その時間の始め（例えば、その用量の投与前）に決定された同じバイオマーカーのレベルと比較することを意味する。代表的な時間としては、投与後１２、２４、４８、７２、９６、１２０または１４４時間、特に投与後２４、４８、７２または９６時間が挙げられる。
基質レベル（例えば、ＢＮＰ、システインＣ、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）の持続的低下は、特にｍＲＮＡ治療投与および／または投与計画が循環器疾患の処置について成功していることを示す。このような持続的低下は、本明細書中では効果の「持続時間」と呼ばれ得る。代表的な実施形態において、投与後４、５、６、７、８日以内またはそれを超える、特に体液（例えば、血漿、尿、例えば尿沈渣）中または対象の組織（例えば、肝臓、心臓、脾臓、腎臓、脳または肺）中での、例えばＢＮＰ、システインＣ、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰなどのバイオマーカーのレベルの少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％もしくは少なくとも約９５％またはそれを超える低下は、治療アプローチが成功していることを示す。代表的な実施形態において、１つ以上の試料（例えば、体液および／または組織）中での基質（例えば、バイオマーカー）レベルの持続的低下が好ましい。任意選択により、少なくとも１つの組織、好ましくは２、３、４、５つまたはそれを超える組織でのそのバイオマーカーの持続的低下と組み合わせて、例えばＢＮＰ、システインＣ、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ（本明細書中で定義されるとおり）の持続的低下を生じさせるｍＲＮＡ療法は、処置が成功していることを示す。
いくつかの実施形態において、本発明のｍＲＮＡ療法の単回投与は、約０．２～約０．８ｍｐｋ、約０．３～約０．７ｍｐｋ、約０．４～約０．８ｍｐｋまたは約０．５ｍｐｋである。別の実施形態において、本発明のｍＲＮＡ療法の単回投与は、１．５ｍｐｋ未満、１．２５ｍｐｋ未満、１ｍｐｋ未満または０．７５ｍｐｋ未満である。
本発明において有用なＲＮＡポリヌクレオチドとしては、１つ以上のリラキシンタンパク質をコードするＲＮＡが挙げられる。
いくつかの実施形態において、イオン化可能脂質ナノ粒子中に処方されるＲＮＡポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリヌクレオチド単独の治療指数の１０％を超える治療指数を有す
る。他の実施形態において、イオン化可能脂質ナノ粒子中に処方されるＲＮＡポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリヌクレオチド単独の治療指数の２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％より大きい治療指数を有する。治療指数（ＴＩ）（治療可能比とも呼ばれる）は、毒性を引き起こす量に対する治療効果を生じさせる治療薬の量の比較である。
本発明は、リラキシンタンパク質の安定性または循環時間を向上させるための方法を含む。いくつかの実施形態において、本組成物は、２０分より長い循環半減期を有する。いくつかの実施形態において、本組成物は、２０～５００分、３０～５００分、５０～５００分、３０～３００分、３０～２００分、３０～１００分、５０～５００分、５０～４００分、５０～３００分、５０～２００分、５０～１００分、１００～５００分、１００～４００分、１００～３００分、１００～２００分または１００～１５０分の循環半減期を有する。他の実施形態において、リラキシン融合タンパク質は、野生型リラキシン循環半減期レベルと比較して循環半減期が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０、９５％または９９％長くなっている。
本発明の方法の別の長所は、対象の投与後にリラキシンタンパク質レベル上昇が急速に達成されることである。例えば、治療または最大治療レベルは、対象への投与から１、２、３または４時間以内に達成され得る。Ｃｍａｘという用語は、薬物が投与された後および２回目の投与前の、薬物が指定区画または身体の試験領域で到達する最大（またはピーク）血清濃度を指す。Ｔｍａｘは、最大血漿濃度に到達するとき、吸収速度が排出速度と等しくなるときの薬物投与後の時間を指す。
野生型リラキシンに対するアイソフォーム１および２の配列は、それぞれ受託番号ＮＭ＿１３４４４１．２およびＮＭ＿００５０５９．３でＮＣＢＩ参照配列データベース（ＲｅｆＳｅｑ）に記載されている（「ホモ・サピエンスリラキシン２（ＲＬＮ２）、転写変異体１」（配列番号３２５）および「ホモ・サピエンスリラキシン２（ＲＬＮ２）、転写変異体２」（配列番号３２６））。野生型リラキシン基準タンパク質配列は、受託番号ＡＡＩ２６４１６．１（「リラキシン２［ホモサピエンス］」）（配列番号１）でＲｅｆＳｅｑデータベースに記載されている。
特定の態様において、本発明は、リラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ））を含むポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））を提供する。いくつかの実施形態において、本発明のリラキシンポリペプチドは、野生型リラキシンまたは変異体リラキシンタンパク質である。いくつかの実施形態において、本発明のリラキシンポリペプチドは、野生型リラキシンタンパク質配列に対して置換ならびに挿入および／または付加、欠失および／または共有修飾を含有する変異体、ペプチドまたはポリペプチドである。いくつかの実施形態において、例えば局在化のために、本発明のポリヌクレオチドによりコードされる配列（例えば、Ｎ末端またはＣ末端）に配列タグまたはアミノ酸が付加され得る。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドのカルボキシ、アミノ末端または内部領域に配置されるアミノ酸残基を任意選択により欠失させ得、断片を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明のヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）は、野生型リラキシンタンパク質配列の置換変異体をコードし、これは、１、２または３つ以上の置換を含み得る。いくつかの実施形態において、置換変異体は、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含み得る。他の実施形態において、変異体は、挿入変異体である。他の実施形態において、変異体は、欠失
変異体である。
当業者により認識されるように、野生型または変異体リラキシンタンパク質断片、機能タンパク質ドメイン、変異体および相同タンパク質（オルソログ）も本発明のリラキシンポリペプチドの範囲内にあるとみなされる。
本開示で提示される特定の組成物および方法は、野生型または変異体リラキシンタンパク質のタンパク質またはポリヌクレオチド配列を指す。当業者は、このような開示が当技術分野で公知のリラキシンタンパク質の任意の他のアイソフォームに等しく適用可能であることを理解する。
ポリヌクレオチドおよびオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）
特定の態様において、本発明は、１つ以上のリラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）を提供する。いくつかの実施形態において、本発明のコードされる治療用ポリペプチドは、次のものから選択され得る：
全長リラキシンポリペプチド（例えば、野生型リラキシンポリペプチドと同じまたは基本的に同じ長さを有する）、
本明細書中に記載の野生型リラキシンタンパク質の何れかの機能的断片などの変異体（例えば、野生型リラキシンタンパク質よりも短い短縮型（例えば、カルボキシ、アミノ末端または内部領域の欠失）配列であるが、依然としてタンパク質の機能的活性を保持する）、１つ以上のアミノ酸が置き換えられている全長または短縮された野生型リラキシンタンパク質などの変異体、例えば参照アイソフォームに対してポリペプチドのリラキシン活性の全てまたは殆どを保持する変異体（例えば、当技術分野で公知の任意の天然または人工変異体）、または
（ｉ）全長野生型リラキシンタンパク質、変異体リラキシンタンパク質、それらの機能的断片または変異体および（ｉｉ）異種タンパク質を含む融合タンパク質。
特定の実施形態において、コードされるリラキシンポリペプチドは、哺乳動物リラキシンポリペプチド、例えばヒトリラキシンポリペプチドなど、それらの機能的断片または変異体である。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）は、細胞に導入された際、本発明のポリヌクレオチド投与前の細胞中のリラキシンタンパク質発現レベルと比較して例えば少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％だけ細胞においてリラキシンタンパク質発現レベルを上昇させる。リラキシンタンパク質発現レベルは、当技術分野で公知の方法に従って測定され得る。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、インビトロで細胞に導入される。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、インビボで細胞に導入される。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）は、コドン最適化される核酸配列を含み、コドン最適化核酸配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、リラキシンタンパク質配列由来である。例えば、特異的なリラキシンタンパク質をコードする配列最適化ＯＲＦを含む本発明のポリヌクレオチドに対して、対応する野生型配列は、ネイティブリラキシンタンパク質である。同様に、リ
ラキシンタンパク質の機能的断片をコードする配列最適化ｍＲＮＡに対して、対応する野生型配列は、野生型リラキシンタンパク質からの対応する断片である。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）は、野生型ヒトリラキシンタンパク質の全長配列（すなわちイニシエーターメチオニンを含む）を有する野生型リラキシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。成熟野生型リラキシンタンパク質において、イニシエーターメチオニンは、翻訳産物の２つから残りのアミノ酸のアミノ酸残基を含む「成熟リラキシンタンパク質」を生じさせるために除去し得る。ヒトリラキシンタンパク質の全長配列に対する本開示の教示は、イニシエーターメチオニンを欠くヒトリラキシンタンパク質の成熟型にも適用可能である。したがって、いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）は、野生型ヒトリラキシンタンパク質の成熟配列（すなわちイニシエーターメチオニンを欠く）を有する野生型リラキシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ヒト野生型リラキシンタンパク質の全長または成熟配列を有する野生型リラキシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）は、配列最適化されている。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）は、突然変異体リラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、リラキシンタンパク質配列において少なくとも１つの点突然変異を含み、リラキシンタンパク質活性を保持するリラキシンポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。いくつかの実施形態において、突然変異体リラキシンポリペプチドは、対応する野生型リラキシンタンパク質（すなわち同じ野生型リラキシンタンパク質であるが、突然変異がない）のリラキシン活性の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％であるリラキシン活性を有する。いくつかの実施形態において、突然変異体リラキシンポリペプチドをコードするＯＲＦを含む本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）は、配列最適化されている。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）は、リラキシンタンパク質活性を変化させない突然変異を伴うリラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。このような突然変異体リラキシンポリペプチドは、機能中性と呼ばれ得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、１つ以上の機能中性点突然変異を含む突然変異体リラキシンポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。
いくつかの実施形態において、突然変異体リラキシンポリペプチドは、対応する野生型リラキシンタンパク質よりも高いリラキシンタンパク質活性を有する。いくつかの実施形態において、突然変異体リラキシンポリペプチドは、対応する野生型リラキシンタンパク質（すなわち同じ野生型リラキシンタンパク質であるが、突然変異がない）の活性よりも少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％高いリラキシン活性を有する。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）は、機能的リラキシンタンパク質断片をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、例えば、１つ以上の断片が野生型リラキシンポリペプチドのポリペプチドサブ配列に対応し、リラキシンタンパク質活性を保持する。いくつかの実施形態において、リラキシンタンパク質断片は、対応する全長リラキシンタンパク質のリラキシンタンパク質活性の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％である活性を有する。いくつかの実施形態において、機能的リラキシンタンパク質断片をコードするＯＲＦを含む本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）は、配列最適化されている。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）は、対応する全長リラキシンタンパク質よりも高いリラキシンタンパク質活性を有するリラキシンタンパク質断片をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。したがって、いくつかの実施形態において、リラキシンタンパク質断片は、対応する全長リラキシンタンパク質のリラキシン活性よりも少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％高いリラキシン活性を有する。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）は、野生型リラキシンタンパク質よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％または２５％短いリラキシンタンパク質断片をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）は、約１，２００～約１００，０００ヌクレオチド（例えば、１，２００～１，５００、１，２００～１，６００、１，２００～１，７００、１，２００～１，８００、１，２００～１，９００、１，２００～２，０００、１，３００～１，５００、１，３００～１，６００、１，３００～１，７００、１，３００～１，８００、１，３００～１，９００、１，３００～２，０００、１，４２５～１，５００、１，４２５～１，６００、１，４２５～１，７００、１，４２５～１，８００、１，４２５～１，９００、１，４２５～２，０００、１，４２５～３，０００、１，４２５～５，０００、１，４２５～７，０００、１，４２５～１０，０００、１，４２５～２５，０００、１，４２５～５０，０００、１，４２５～７０，０００または１，４２５～１００，０００）を含む。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）は、リラキシンポリペプチド（例えば、野生型配列、機能的断片またはそれらの変異体）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）の長さは、少なくとも５００ヌクレオチド長（例えば、少なくとも約５００、６００、７００、８０、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，４２５、１４５０、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，１００、２，２００、２，３００、２，４００、２，５００、２，６００、２，７００、２，８００、２，９００、３，０００、３，１００、３，２００、３，３００、３，４００、３，５００、３，６００、３，７００、３，８００、３，９００、４，０００、４，１００、４，２００、４，３００、４，４００、４，５００、４，６００、４，７００、４，８００、４，９００、５，０００、５，１００、５，２００、５，３００、５，４００、５，５００、５，６００、５，７００、５，８００、５，９００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００もしくはそれを超えるか、または１００，０００ヌクレオチド以下）である。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）は、例えば、ｍｉＲＮＡ結合部位など、非コード配列である少なくとも１つの核酸配列をさらに含む、リラキシンポリペプチド（例えば、野生型配列、機能的断片またはそれらの変異体）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
いくつかの実施形態において、リラキシンポリペプチド（例えば、野生型配列、機能的断片またはそれらの変異体）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であるかまたはそれとして機能する。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、少なくとも１つのリラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、インビトロ、インビボ、インシトゥまたはエクスビボで、コードされるリラキシンポリペプチドを産生するために翻訳可能である。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）は、リラキシンポリペプチド（例えば、野生型配列、機能的断片またはそれらの変異体）をコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、本ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基、例えば５－メトキシウラシルを含む。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えばｍｉＲ－１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。いくつかの実施形態において、本明細書中で開示されるポリヌクレオチドは、送達剤、例えば式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）または（ＩＩｅ）を有する脂質、例えば化合物１～２３２の何れかの脂質を含むイオン化可能脂質ナノ粒子とともに処方される。
シグナル配列
本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）は、治療的に関心のある部位へのコードされるポリペプチドの輸送を促進するさらなる特性をコードするヌクレオチド配列も含み得る。タンパク質輸送を促進する１つのこのような特性は、シグナル配列または標的化配列である。これらのシグナル配列によりコードされるペプチドは、標的化ペプチド、輸送ペプチドおよびシグナルペプチドを含め、様々な名称により知られている。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）は、本明細書中に記載のリラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結されるシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
いくつかの実施形態において、「シグナル配列」または「シグナルペプチド」は、それぞれ約９～２００ヌクレオチド（３～７０アミノ酸）長であるポリヌクレオチドまたはポリペプチドであり、これらは、任意選択によりそれぞれコード領域またはポリペプチドの５’（またはＮ末端）に組み込まれる。これらの配列の付加の結果、１つ以上の標的化経路を通じて、小胞体またはミトコンドリアなどの所望の部位にコードされるポリペプチドが輸送されるようになる。いくつかのシグナルペプチドは、タンパク質が所望の部位に輸
送された後、例えばシグナルペプチダーゼによってタンパク質から切り出される。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、野生型リラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列は、ネイティブシグナルペプチドをコードする５’核酸配列をさらに含む。別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、野生型リラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列は、ネイティブシグナルペプチドをコードする核酸配列を欠く。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、リラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列は、異種シグナルペプチドをコードする５’核酸配列をさらに含む。
融合タンパク質
いくつかの実施形態において、リラキシン治療薬は、ポリペプチドまたは関心のあるポリペプチドをコードする複数の核酸配列（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、リラキシンポリペプチド、機能的断片またはその変異体をコードする１つのＯＲＦを含む。しかし、いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、複数のＯＲＦ、例えばリラキシンポリペプチド（第１の関心のあるポリペプチド）、機能的断片またはその変異体をコードする第１のＯＲＦおよび安定化配列などの第２のポリペプチドを発現させる第２のＯＲＦを含み得る。いくつかの実施形態において、２つ以上の関心のあるポリペプチドは、遺伝子操作により融合され得、すなわち２つ以上のポリペプチドが同じＯＲＦによりコードされ得る。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、２つ以上の関心のあるポリペプチド間のリンカー（例えば、Ｇ４Ｓペプチドリンカー（配列番号５８８）または当技術分野で公知の別のリンカー）をコードする核酸配列を含み得る。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）は、２、３、４つまたはそれを超えるＯＲＦを含み得、それぞれがポリペプチドを発現する。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）は、リラキシンポリペプチドをコードする第１の核酸配列（例えば、第１のＯＲＦ）および安定化配列などの第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列（例えば、第２のＯＲＦ）を含み得る。
安定化配列は、本明細書中で使用される場合、融合タンパク質において安定性を付与するペプチド配列である。安定化配列は、いくつかの実施形態において、免疫グロブリン（Ｉｇ）またはそれらの断片であり得る。免疫グロブリンは、ヒトにおいて、血清中のそれらの存在量の順に名付けられた４つのＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１、２、３および４）を含む。ＩｇＧアイソタイプは、各重鎖が３つの定常重鎖ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）を含有する２本の軽鎖および２本の重鎖から構成される。ＩｇＧの２本の重鎖は、互いに連結され、ジスルフィド結合によりそれぞれ軽鎖に連結される。ＩｇＧの抗原結合部位は、断片抗原結合領域（Ｆａｂ領域）に位置し、可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）ドメインならびに定常軽鎖（ＣＬ）および定常重鎖（ＣＨ１）ドメインを含有する。ＩｇＧの断片結晶化可能領域（Ｆｃ領域）は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を含め、ある種の細胞の表面上で見られるＦｃ受容体に結合するＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含有する重鎖の一部である。ＩｇＧの重鎖は、Ｆｃ領域からＦａｂ領域を分離し、ジスルフィド結合を介して２本の重鎖を一緒に連結するのに関与する、ＣＨ１とＣＨ２ドメインとの
間のヒンジ領域（ヒンジ）も有する。
いくつかの実施形態において、Ｉｇ断片は、Ｉｇ分子由来の定常重鎖領域（ＣＨ）または可変重鎖領域（ＶＨ）の一部である。Ｉｇ断片は、１つ以上の定常または可変重鎖ドメイン、ヒンジ領域、Ｆｃ領域および／またはそれらの組み合わせを含め、定常または可変重鎖領域の何れかの部分を含み得る。
いくつかの実施形態において、Ｉｇ断片は、Ｉｇ分子由来の定常軽鎖領域（ＣＬ）または可変軽鎖領域（ＶＬ）の一部である。Ｉｇ断片は、１つ以上の定常または可変軽鎖ドメイン、ヒンジ領域、Ｆｃ領域および／またはそれらの組み合わせを含め、定常または可変軽鎖領域の何れかの部分を含み得る。
特定の実施形態において、融合タンパク質のＩｇ断片は、１本鎖Ｆｃ（ｓＦｃまたはｓｃＦｃ）、モノマーを含み、これは、２量体を形成不可能である。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、免疫グロブリンヒンジ領域に対応する配列を含む。様々な実施形態において、ヒンジ領域は、融合タンパク質が別の融合タンパク質または別の免疫グロブリン分子とジスルフィド結合を形成することを防ぐ修飾を含有する。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域は、ジスルフィド結合の形成を防ぐために１つ以上のシステインアミノ酸を突然変異および／または欠失させることにより修飾される。
いくつかの実施形態において、Ｉｇ断片は、カッパ軽鎖可変領域（ＶＬκ）配列である。
融合タンパク質は、リラキシンがＩｇ断片のＮ末端に連結され得る。あるいは、融合タンパク質は、リラキシンがＩｇ断片のＣ末端に連結され得る。具体的な実施形態において、融合タンパク質は、ＶＬκに連結されるそのＮ末端にリラキシンを含む。他の実施形態において、融合タンパク質は、ＶＬκに連結されるそのＣ末端にリラキシンを含む。
連結は、共有結合、好ましくはペプチド結合であり得る。融合タンパク質は、任意選択により少なくとも１つのリンカーを含み得る。したがって、リラキシンは、Ｉｇ断片に直接連結され得ない。リンカーは、リラキシンとＩｇ断片との間に介入し得る。リンカーは、Ｉｇ断片のＮ末端またはＩｇ断片のＣ末端に連結され得る。ある実施形態において、リンカーは、アミノ酸を含む。リンカーは、１～５つのアミノ酸を含み得る。
リラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の配列最適化
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）は、配列最適化される。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）は、配列最適化されている、リラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、別の関心のあるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、ｍｉＲＮＡ、リンカーをコードするヌクレオチド配列またはそれらの任意の組み合わせ）を含む。
リラキシンポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列、例えばコドン最適化ｍＲＮＡ配列は、参照配列（例えば、リラキシンポリペプチドをコードする野生型ヌクレオチド配列）に対して少なくとも１つの同義の核酸塩基置換を含む配列である。
配列最適化ヌクレオチド配列は、部分的にまたは完全に参照配列と配列において異なり得る。例えば、均一にＴＣＴコドンによりコードされるポリセリンをコードする参照配列は、ＡＧＣコドンにより均一にコードされるポリセリンをコードする配列を生じさせるた
めにその核酸塩基の１００％が置換されることによって（各コドンに対して、位置１のＴがＡにより置き換えられ、位置２のＣがＧにより置き換えられ、位置３のＴがＣにより置き換えられる）配列最適化され得る。参照ポリセリン核酸配列と配列最適化ポリセリン核酸配列との間の網羅的ペアワイズアライメントから得られる配列同一性のパーセンテージは、０％である。しかし、両方の配列からのタンパク質産物は、１００％同一である。
いくつかの配列最適化（コドン最適化とも呼ばれることがある）方法が当技術分野で公知であり、１つ以上の所望の結果を達成するために有用であり得る。これらの結果には、例えば、適正な折り畳みを確実にするためにある種の組織標的および／または宿主生物においてコドン頻度を合致させること、ｍＲＮＡ安定性を向上させるために、または二次構造を低下させるためにＧ／Ｃ含量を偏らせること、遺伝子構築または発現に障害を与え得る縦列反復コドンまたはベースランを最小限にすること、転写および翻訳調節領域をカスタマイズすること、タンパク質輸送配列を挿入または除去すること、コードされるタンパク質（例えば、グリコシル化部位）において翻訳後修飾部位を除去／付加すること、タンパク質ドメインを付加、除去またはシャッフルすること、制限部位を挿入するかまたは欠失させること、リボソーム結合部位およびｍＲＮＡ分解部位を修飾すること、タンパク質の様々なドメインを適正に折り畳ませることができるようにするために翻訳率を調整すること、および／またはポリヌクレオチド内の問題のある二次構造を減少させるかまたは排除することが含まれ得る。配列最適化ツール、アルゴリズムおよびサービスが当技術分野で公知であり、非限定例としては、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からのサービス、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ ＣＡ）および／または独自の方法が挙げられる。
各アミノ酸に対するコドンオプションを下の表１で与える。
Figure 0007459172000005
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）は、リラキシンポリペプチド、機能的断片またはそれらの変異体をコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、配列最適化ヌクレオチド配列によりコードされるリラキシンポリペプチド、機能的断片またはそれらの変異体は、（例えば、配列最適化されていない参照ヌクレオチド配列によりコードされるリラキシンポリペプチド、機能的断片またはそれらの変異体と比較して）特性が向上しており、例えばインビボでの投与後の発現効力に関する特性が向上している。このような特性としては、核酸安定性（例えば、ｍＲＮＡ安定性）の向上、標的組織における翻訳効力の上昇、発現される短縮タンパク質数の減少、折り畳みの改善または発現されるタンパク質の誤った折り畳みを防ぐこと、発現産物の毒性低下、発現産物により引き起こされる細胞死の減少、タンパク質凝集の増加および／または減少が挙げられるが限定されない。
いくつかの実施形態において、配列最適化ヌクレオチド配列は、ヒト対象での発現のためにコドン最適化され、当技術分野での問題の１つ以上を回避する構造および／または化学的特性、例えば構造および機能的完全性を保持しながら核酸に基づく治療薬の処方およ
び送達を最適化するのに有用である特性を有し、発現の閾値を克服し、発現率、半減期および／またはタンパク質濃度を改善し、タンパク質局在化を最適化し、免疫反応および／または分解経路などの有害な生体反応を回避する。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、（ｉ）ウリジン含量を増減させてウリジン修飾配列を生成させるために、参照ヌクレオチド配列（例えば、リラキシンポリペプチドをコードするＯＲＦ）中の少なくとも１つのコドンを代替的コドンで置換すること、（ｉｉ）参照ヌクレオチド配列（例えば、リラキシンポリペプチドをコードするＯＲＦ）中の少なくとも１つのコドンを、同義のコドンセット中でのコドン頻度がより高い代替的コドンで置換すること、（ｉｉｉ）Ｇ／Ｃ含量を上昇させるために参照ヌクレオチド配列（例えば、リラキシンポリペプチドをコードするＯＲＦ）中の少なくとも１つのコドンを代替的コドンで置換すること、または（ｉｖ）それらの組み合わせを含む方法に従って配列最適化されているヌクレオチド配列（例えば、リラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、別の関心のあるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、マイクロＲＮＡ、リンカーをコードする核酸配列またはそれらの任意の組み合わせ）を含む。
いくつかの実施形態において、配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、リラキシンポリペプチドをコードするＯＲＦ）は、参照ヌクレオチド配列に関して少なくとも１つの特性が改善されている。
いくつかの実施形態において、配列最適化方法は、多パラメーターであり、１、２、３、４つまたはそれを超える本明細書中で開示される方法および／または当技術分野で公知の他の最適化方法を含む。
本発明のいくつかの実施形態において有益であると考えられ得る特性は、ポリヌクレオチドの領域によりコードされ得るかまたはその領域内にあり得、このような領域は、リラキシンポリペプチドをコードする領域に対して上流（５’）、下流（３’）またはその領域内であり得る。これらの領域は、領域またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードするタンパク質の配列最適化前および／または後にポリヌクレオチドに組み込まれ得る。このような特性の例としては、非翻訳領域（ＵＴＲ）、マイクロＲＮＡ配列、Ｋｏｚａｋ配列、オリゴ（ｄＴ）配列、ポリＡテールおよび検出可能なタグが挙げられるが限定されず、ＸｂａＩ認識を有し得る複数のクローニング部位が含まれ得る。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲおよび／またはｍｉＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、２つ以上の５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲを含み、これらは、同じまたは異なる配列であり得る。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、２つ以上のｍｉＲＮＡを含み、これらは、同じまたは異なる配列であり得る。存在しないことを含め、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲおよび／またはｍｉＲＮＡの何れの部分も配列最適化され得、配列最適化前および／または後に１つ以上の異なる構造または化学的修飾を独立に含有し得る。
いくつかの実施形態において、最適化後、本ポリヌクレオチドが再構成され、プラスミド、ウイルス、コスミドおよび人工染色体などであるが限定されないベクターに形質転換される。例えば、最適化ポリヌクレオチドを再構成し、ケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、ニューロスポラ、トウモロコシ、ショウジョウバエなどに形質転換し得る。本明細書中に記載の方法により高コピープラスミド様または染色体構造が生じる。
リラキシンポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書中で開示されるリラキシンポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、リラキシンポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、このＯＲＦは、配列最適化されている。
本明細書中で開示される配列最適化ヌクレオチド配列は、対応する野生型ヌクレオチド酸配列および他の公知の配列最適化ヌクレオチド配列と異なり、例えば、これらの配列最適化核酸は、ユニークな組成上の特徴を有する。
いくつかの実施形態において、（例えば、リラキシンポリペプチド、機能的断片またはそれらの変異体をコードする）配列最適化ヌクレオチド配列中のウラシルまたはチミン核酸塩基のパーセンテージは、参照野生型ヌクレオチド配列におけるウラシルまたはチミン核酸塩基のパーセンテージに対して改変される（例えば、低下）。このような配列は、ウラシル修飾またはチミン修飾配列と呼ばれる。ヌクレオチド配列中のウラシルまたはチミン含量のパーセンテージは、配列中のウラシルまたはチミンの数をヌクレオチドの総数で除し、１００をかけることによって決定され得る。いくつかの実施形態において、配列最適化ヌクレオチド配列のウラシルまたはチミン含量は、参照野生型配列中のウラシルまたはチミン含量よりも低い。いくつかの実施形態において、本発明の配列最適化ヌクレオチド配列中のウラシルまたはチミン含量は、参照野生型配列中のウラシルまたはチミン含量よりも高く、依然として有益な効果を維持し、例えば参照野生型配列と比較した場合、発現が上昇し、および／またはトール様受容体（ＴＬＲ）反応が低下する。
本明細書中で開示される配列のウラシルまたはチミン含量、すなわちその総ウラシルまたはチミン含量は、本明細書中で％ＵＴＬまたは％ＴＴＬと略する。
本発明のリラキシンポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾配列はまた、対応する野生型核酸配列中のウラシルまたはチミン含量に対するそのウラシルまたはチミン含量（％ＵＷＴまたは％ＴＷＴ）に従って、または野生型タンパク質配列をコードする核酸の理論的な最低ウラシルまたはチミン含量に対するそのウラシルまたはチミン含量（％ＵＴＭまたは（％ＴＴＭ）に従って記載され得る。
「野生型核酸配列中のウラシルまたはチミン含量に対するウラシルまたはチミン含量」という句は、配列最適化核酸中のウラシルまたはチミン数を対応する野生型核酸配列中のウラシルまたはチミンの総数により除し、１００をかけることにより決定されるパラメーターを指す。このパラメーターは、本明細書中で％ＵＷＴまたは％ＴＷＴと略する。
ウラシルまたはチミン理論的最低値に対するウラシルまたはチミン含量は、配列最適化ヌクレオチド配列中のウラシルまたはチミンの数を、仮説的配列中のコドンの全てが可能な限り少ないウラシルまたはチミン含量を有する同義コドンで置き換えられている仮説的ヌクレオチド配列中のウラシルまたはチミンの総数で除し、１００をかけることにより決定されるパラメーターを指す。このパラメーターは、本明細書中で％ＵＴＭまたは％ＴＴＭと略する。
いくつかの実施形態において、本発明のリラキシンポリペプチドをコードするウラシル修飾配列の％ＵＴＭは、３００％未満、２９５％未満、２９０％未満、２８５％未満、２８０％未満、２７５％未満、２７０％未満、２６５％未満、２６０％未満、２５５％未満、２５０％未満、２４５％未満、２４０％未満、２３５％未満、２３０％未満、２２５％未満、２２０％未満、２１５％、２００％未満、１９５％未満、１９０％未満、１８５％未満、１８０％未満、１７５％未満、１７０％未満、１６５％未満、１６０％未満、１５５％未満、１５０％未満、１４５％未満、１４０％未満、１３９％未満、１３８％未満、１３７％未満、１３６％未満、１３５％未満、１３４％未満、１３３％未満、１３２％未満、１３１％未満、１３０％未満、１２９％未満、１２８％未満、１２７％未満、１２６％未満、１２５％未満、１２４％未満、１２３％未満、１２２％未満、１２１％未満、１２０％未満、１１９％未満、１１８％未満、１１７％未満、１１６％未満または１１５％未満である。
いくつかの実施形態において、本発明のリラキシンポリペプチドをコードするウラシル修飾配列の％ＵＴＭは、１００％超、１０１％超、１０２％超、１０３％超、１０４％超、１０５％超、１０６％超、１０７％超、１０８％超、１０９％超、１１０％超、１１１％超、１１２％超、１１３％超、１１４％超、１１５％超、１１６％超、１１７％、１１８％超、１１９％超、１２０％超、１２１％超、１２２％超、１２３％超、１２４％超、１２５％超または１２６％超、１２７％超、１２８％超、１２９％超または１３０％超、１３１％超、１３２％超、１３３％超、１３４％超、１３５％超、１３６％超、１３７％超または１３８％超である。
いくつかの実施形態において、本発明のリラキシンポリペプチドをコードするウラシル修飾配列の％ＵＴＭは、１３１％～１３３％、１３０％～１３４％、１２９％～１３５％、１２８％～１３６％、１２７％～１３７％、１２６％および１３８％、１２５％～１３９％、１２４％～１４０％、１２３％～１４１％、１２２％～１４２％、１２１％～１４３％、１２０％～１４４％または１１９％～１４５％である。
いくつかの実施形態において、本発明のリラキシンポリペプチドをコードするウラシル修飾配列の％ＵＴＭは、約１２５％～約１３９％、例えば１２５％～１３８％である。
いくつかの実施形態において、本発明のリラキシンポリペプチドをコードするウラシル修飾配列の連続ウラシル数は、対応する野生型核酸配列に対して減少している。例えば、２つの連続ロイシンは、配列ＣＵＵＵＵＧによりコードされ得、これは、４つのウラシルクラスターを含む。このようなサブ配列は、例えば、ＣＵＧＣＵＣで置換され得、ウラシルクラスターが除去される。
フェニルアラニンは、ＵＵＣまたはＵＵＵによりコードされ得る。したがって、ＵＵＵによってコードされるフェニルアラニンがＵＵＣにより置き換えられたとしても、同義コドンは、依然としてウラシル対（ＵＵ）を含有する。したがって、配列中のフェニルアラニン数は、コードされるポリペプチド中でフェニルアラニン数を変更することなく削除され得ない最小数のウラシル対（ＵＵ）を確立する。例えば、ポリペプチド、例えば野生型リラキシンタンパク質が例えば１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３のフェニルアラニンを有する場合、このポリペプチド、例えば野生型リラキシンタンパク質をコードするウラシル修飾配列が含有し得るウラシル対（ＵＵ）の絶対的最小数は、それぞれ１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３である。
いくつかの実施形態において、野生型核酸配列中のウラシル対（ＵＵ）の数に対して、リラキシンポリペプチドをコードするウラシル修飾配列のウラシル対（ＵＵ）の数が減少している。いくつかの実施形態において、本発明のリラキシンポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、野生型核酸配列中の最小の可能なウラシル対（ＵＵ）の数に対応するウラシル対（ＵＵ）の数を有する。
いくつかの実施形態において、本発明のリラキシンポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、野生型核酸配列中のウラシル対（ＵＵ）よりも少なくとも１、２、３、４、
５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７ウラシル対（ＵＵ）だけ少ない。いくつかの実施形態において、本発明のリラキシンポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、１３～２９のウラシル対（ＵＵ）を有する。
「野生型核酸配列中のウラシル対（ＵＵ）に対するウラシル対（ＵＵ）」という句は、配列最適化ヌクレオチド配列中のウラシル対（ＵＵ）の数を、対応する野生型ヌクレオチド配列中のウラシル対（ＵＵ）の総数で除し、１００をかけることによって決定されるパラメーターを指す。このパラメーターは、本明細書中で％ＵＵｗｔと略する。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書中で開示されるリラキシンポリペプチドをコードするウラシル修飾配列を含む。いくつかの実施形態において、リラキシンポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基、例えば５－メトキシウラシルを含む。いくつかの実施形態において、本発明のリラキシンポリペプチドをコードするウラシル修飾配列中の核酸塩基（例えば、ウラシル）の少なくとも９５％が修飾核酸塩基である。いくつかの実施形態において、リラキシンポリペプチドをコードするウラシル修飾配列中のウラシルの少なくとも９５％が５－メトキシウラシルである。いくつかの実施形態において、ウラシル修飾配列を含むポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えばｍｉＲ－１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。いくつかの実施形態において、ウラシル修飾配列を含むポリヌクレオチドは、送達剤、例えば式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）または（ＩＩｅ）を有する脂質、例えば化合物１～２３２の何れかの脂質を含むＬＮＰとともに処方される。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、リラキシンポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、このＯＲＦは、配列最適化されており、ここで、％ＵＴＬ、％ＵＷＴ、％ＵＴＭ、％ＧＴＬ、％ＧＷＴ、％ＧＴＭＸ、％ＣＴＬ、％ＣＷＴ、％ＣＴＭＸ、％Ｇ／ＣＴＬ、％Ｇ／ＣＷＴまたは％Ｇ／ＣＴＭＸのそれぞれは、単独でまたはそれらの組み合わせで、（ｉ）パラメーターの最大値（ＭＡＸ）＋約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５または１０標準偏差（ＳＴＤ ＤＥＶ）に対応する最大値から、（ｉｉ）パラメーターの最小値（ＭＩＮ）から０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５または１０標準偏差（ＳＴＤ ＤＥＶ）を差し引いた数に対応する最小値の範囲である。
いくつかの実施形態において、リラキシンタンパク質をコードする参照核酸配列中のコドンの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％または少なくとも約７５％が代替的コドンで置換され、各代替的コドンは、同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度よりも高いコドン頻度を有する。
いくつかの実施形態において、より高いコドン頻度を有する少なくとも１つの代替的コドンは、同義コドンセット中で最高のコドン頻度を有する。他の実施形態において、より高いコドン頻度を有する全ての代替的コドンは、同義コドンセット中で最高コドン頻度を有する。
いくつかの実施形態において、より低いコドン頻度を有する少なくとも１つの代替的コドンは、同義コドンセット中で最低のコドン頻度を有する。いくつかの実施形態において
、より高いコドン頻度を有する全ての代替的コドンは、同義コドンセット中で最高のコドン頻度を有する。
いくつかの具体的な実施形態において、少なくとも１つの代替的コドンは、同義コドンセット中で２番目に高い、３番目に高い、４番目に高い、５番目に高い、または６番目に高い頻度を有する。いくつかの具体的な実施形態において、少なくとも１つの代替的コドンは、同義コドンセット中で２番目に低い、３番目に低い、４番目に低い、５番目に低い、または６番目に低い頻度を有する。
コドン頻度に基づく最適化は、上記のように、広く適用され得るか、またはリラキシンポリペプチドをコードする参照核酸配列に局所的に適用され得る。いくつかの実施形態において、局所的に適用される場合、参照核酸配列の領域は、コドン頻度に基づいて修飾され得、特定のサブ配列中の全てのまたは特定のパーセンテージのコドンが、それらの個々の同義コドンセット中でより高いかまたはより低い頻度を有するコドンで置換される。したがって、いくつかの実施形態において、参照核酸配列のサブ配列中のコドンの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００％が代替的コドンで置換され、各代替的コドンは、同義コドンセット中の置換されるコドンのコドン頻度よりも高いコドン頻度を有する。
いくつかの実施形態において、リラキシンポリペプチドをコードする参照核酸配列のサブ配列中の少なくとも１つのコドンが、同義コドンセット中の置換されるコドンのコドン頻度よりも高いコドン頻度を有する代替的コドンで置換され、参照核酸配列のサブ配列中の少なくとも１つのコドンが、同義コドンセット中の置換されるコドンのコドン頻度よりも低いコドン頻度を有する代替的コドンで置換される。
いくつかの実施形態において、リラキシンポリペプチドをコードする参照核酸配列のサブ配列中のコドンの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％または少なくとも約７５％が代替的コドンで置換され、各代替的コドンは、同義コドンセット中の置換されるコドンのコドン頻度よりも高いコドン頻度を有する。
いくつかの実施形態において、リラキシンポリペプチドをコードする参照核酸配列のサブ配列中で置換され、より高いコドン頻度を有する少なくとも１つの代替的コドンは、同義コドンセット中の最高のコドン頻度を有する。他の実施形態において、参照核酸配列のサブ配列中で置換され、より低いコドン頻度を有する全ての代替的コドンは、同義コドンセット中で最低のコドン頻度を有する。
いくつかの実施形態において、リラキシンポリペプチドをコードする参照核酸配列のサブ配列中で置換され、より低いコドン頻度を有する少なくとも１つの代替的コドンは、同義コドンセット中で最低のコドン頻度を有する。いくつかの実施形態において、参照核酸配列のサブ配列中で置換され、より高いコドン頻度を有する全ての代替的コドンは、同義コドンセット中で最高のコドン頻度を有する。
具体的な実施形態において、リラキシンポリペプチドをコードする配列最適化核酸は、
特異的な位置、例えば配列最適化核酸の５’末端または３’末端においてまたはそれらの領域からの所定の距離（例えば、配列最適化核酸の５’末端または３’末端から少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００のコドン）内において、参照核酸配列の対応するサブ配列において全体的なコドン頻度よりも高いかまたは低い全体的なコドン頻度を有するサブ配列を含み得る。
いくつかの実施形態において、リラキシンポリペプチドをコードする配列最適化核酸は、参照核酸配列の対応するサブ配列中の全体的なコドン頻度よりも高いかまたは低い全体的なコドン頻度を有する複数のサブ配列を含み得る。当業者が理解するように、全体的により高いかまたはより低い全体的コドン頻度を有するサブ配列は、全体的なコドン頻度がより高いかまたはより低いかにかかわらず、サブ配列の長さ、サブ配列間の距離、サブ配列の位置などに依存して無数のパターンで構築され得る。
リラキシンポリペプチドをコードする修飾ヌクレオチド配列
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）は、化学的に修飾された核酸塩基を含む。本発明は、本明細書中に記載のポリヌクレオチド（例えば、リラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む修飾ポリヌクレオチドを含む。修飾ポリヌクレオチドは、化学的に修飾され得、および／または構造的に修飾され得る。本発明のポリヌクレオチドが化学的および／または構造的に修飾される場合、本ポリヌクレオチドは、「修飾ポリヌクレオチド」と呼ばれ得る。
本開示は、リラキシンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡポリヌクレオチドなど）の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを提供する。「ヌクレオシド」は、有機塩基（例えば、プリンまたはピリミジン）またはその誘導体（本明細書中で「核酸塩基」とも呼ぶ）と組み合わせて糖分子（例えば、ペントースまたはリボース）またはその誘導体を含有する化合物を指す。「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾ヌクレオチドは、１つ以上の修飾または非天然ヌクレオシドを含むように、何れかの有用な方法、例えば化学的に、酵素的にまたは組み換えなどにより合成され得る。ポリヌクレオチドは、ヌクレオシドに連結される１つまたは複数の領域を含み得る。このような領域は、可変骨格結合を有し得る。結合は、標準的なホスホジエステル結合であり得、この場合、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの領域を含む。
本明細書中で開示される修飾ポリヌクレオチドは、様々な個別の修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、修飾ポリヌクレオチドは、１つ、２つまたはそれを超える（任意選択により異なる）ヌクレオシドまたはヌクレオチド修飾を含有する。いくつかの実施形態において、細胞に導入される修飾ポリヌクレオチドは、例えば、非修飾ポリヌクレオチドと比較した場合、タンパク質発現向上、免疫原性低下または細胞での変性低下など、１つ以上の所望の特性を示し得る。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、リラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、構造的に修飾される。本明細書中で使用される場合、「構造的」修飾は、ヌクレオチド自体に対する顕著な化学的修飾なく、ポリヌクレオチドにおいて２つ以上の連結ヌクレオシドが挿入されているか、欠失しているか、重複しているか、反転されているか、またはランダム化されているものである。化学結合は、構造的修飾をなすために必ず破壊され、再形成されるため、構造的修飾は、化学的な性質のものであり、したがって化学的修飾である。しかし、構造的修飾の結果、ヌクレオチドの異なる配列が生じる。例えば、ポリヌクレオチド「ＡＴＣＧ」は、「ＡＴ－５ｍｅＣ－Ｇ」へと化学的に修飾され得る。同じポリヌクレオチドが「ＡＴＣＧ」から「ＡＴＣＣＣＧ」に構造的に修飾され得る。ここで、ジヌクレオチド「ＣＣ」が挿入されており、その結果、ポリヌクレオチドに対する構造的修飾が生じる。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、化学的に修飾される。ポリヌクレオチドに対して本明細書中で使用される場合、「化学的修飾」または適切な場合には「化学的に修飾される」という用語は、それらの位置、パターン、パーセントまたは集団の１つ以上におけるアデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、ウリジン（Ｕ）またはシチジン（Ｃ）リボもしくはデオキシリボヌクレオシドに対する修飾を指す。一般に、本明細書中では、これらの用語は、天然の５’末端ｍＲＮＡキャップ部分におけるリボヌクレオチド修飾を指すものではない。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、同じヌクレオシドタイプの全てまたは何れかの均一な化学的修飾または同じヌクレオシドタイプの全てまたは何れかにおける同じ出発修飾の単なる下向きの調整により生成される修飾の集団または同じヌクレオシドタイプの全ての何れかの化学的修飾であるが、組み込みがランダムであるものの測定パーセントを有し得、例えばウリジン類似体、例えばシュードウリジンまたは５－メトキシウリジンにより全てのウリジンが置き換えられるなどである。別の実施形態において、本ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド全体を通じて、同じヌクレオシドタイプの２、３または４つの均一な化学的修飾を有し得る（全てのウリジンおよび全てのシトシンなどが同じように修飾されるなど）。
修飾ヌクレオチド塩基対形成は、標準的なアデノシン－チミン、アデノシン－ウラシルまたはグアノシン－シトシン塩基対だけでなく、非標準的または修飾塩基を含むヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチド間で形成される塩基対も包含し、水素結合ドナーおよび水素結合アクセプターの構成により、非標準塩基と標準塩基との間または２つの相補的な非標準塩基構造間での水素結合形成が可能になる。このような非標準塩基対形成の一例は、修飾ヌクレオチドイノシンと、アデニン、シトシンまたはウラシルとの間の塩基対形成である。塩基／糖またはリンカーの何れの組み合わせも本開示のポリヌクレオチドに組み込まれ得る。
当業者にとって当然であるが、別段の記載がある場合を除き、本願で示されるポリヌクレオチド配列は、代表的なＤＮＡ配列中で「Ｔ」を挙げるが、配列がＲＮＡを表す場合、「Ｔ」は、「Ｕ」に置き換えられる。
本開示の組成物、方法および合成工程で有用なポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡポリヌクレオチドなど）の修飾としては、次のヌクレオチド、ヌクレオシドおよび核酸塩基：２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン；２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデノシン；２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン；Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン；Ｎ６－イソペンテニルアデノシン；Ｎ６－メチルアデノシン；Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン；１，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン；１－メチルアデノシン；２’－Ｏ－メチルアデノシン；２’－Ｏ－リボシルアデノシン（ホスフェート）；２－メチルアデノシン；２－メチルチオ－Ｎ６イソペンテニルアデノシン；２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン；２’－Ｏ－メチルアデノシン；２’－Ｏ－リボシルアデノシン（ホスフェート）；イソペンテニルアデノシン；Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン；Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン；Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン；Ｎ６，Ｎ６，２’－Ｏ－トリメチルアデノシン；Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン；Ｎ６－アセチルアデノシン；Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン；Ｎ６－メチル－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン；２－メチルアデノシン；２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデノシン；７－デアザ－アデノシン；Ｎ１－メチル－アデノシン；Ｎ６，Ｎ６（ジメチル）アデニン；Ｎ６－シス－ヒドロキシ－イソペンテニル－アデノシン；α－チオ－アデノシン；２（アミノ）アデニン；２（アミノプロピル）アデニン；２（メチルチオ）Ｎ６（イソペンテニル）アデニン；２－（アルキル）アデニン；２－（アミノアルキル）アデニン；２－（アミノプロピル）アデニン；２－（ハロ）アデニン；２－（ハロ）アデニン；２－（プロピル）アデニン；２’－アミノ－２’－デオキシ－ＡＴＰ；２’－アジド－２’－デオキシ－ＡＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－アミノアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－アジドアデノシンＴＰ；６（アルキル）アデニン；６（メチル）アデニン；６－（アルキル）アデニン；６－（メチル）アデニン；７（デアザ）アデニン；８（アルケニル）アデニン；８（アルキニル）アデニン；８（アミノ）アデニン；８（チオアルキル）アデニン；８－（アルケニル）アデニン；８－（アルキル）アデニン；８－（アルキニル）アデニン；８－（アミノ）アデニン；８－（ハロ）アデニン；８－（ヒドロキシル）アデニン；８－（チオアルキル）アデニン；８－（チオール）アデニン；８－アジド－アデノシン；アザアデニン；デアザアデニン；Ｎ６（メチル）アデニン；Ｎ６－（イソペンチル）アデニン；７－デアザ－８－アザ－アデノシン；７－メチルアデニン；１－デアザアデノシンＴＰ；２’フルオロ－Ｎ６－Ｂｚ－デオキシアデノシンＴＰ；２’－ＯＭｅ－２－アミノ－ＡＴＰ；２’Ｏ－メチル－Ｎ６－Ｂｚ－デオキシアデノシンＴＰ；２’－ａ－エチニルアデノシンＴＰ；２－アミノアデニン；２－アミノアデノシンＴＰ；２－アミノ－ＡＴＰ；２’－ａ－トリフルオロメチルアデノシンＴＰ；２－アジドアデノシンＴＰ；２’－ｂ－エチニルアデノシンＴＰ；２－ブロモアデノシンＴＰ；２’－ｂ－トリフルオロメチルアデノシンＴＰ；２－クロロアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオロアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－メルカプトアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－チオメトキシアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－アミノアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－アジドアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－ブロモアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－クロロアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－フルオロアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－ヨードアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－メルカプトアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－チオメトキシアデノシンＴＰ；２－フルオロアデノシンＴＰ；２－ヨードアデノシンＴＰ；２－メルカプトアデノシンＴＰ；２－メトキシ－アデニン；２－メチルチオ－アデニン；２－トリフルオロメチルアデノシンＴＰ；３－デアザ－３－ブロモアデノシンＴＰ；３－デアザ－３－クロロアデノシンＴＰ；３－デアザ－３－フルオロアデノシンＴＰ；３－デアザ－３－ヨードアデノシンＴＰ；３－デアザアデノシンＴＰ；４’－アジドアデノシンＴＰ；４’－炭素環アデノシンＴＰ；４’－エチニルアデノシンＴＰ；５’－ホモ－アデノシンＴＰ；８－アザ－ＡＴＰ；８－ブロモ－アデノシンＴＰ；８－トリフルオロメチルアデノシンＴＰ；９－デアザアデノシンＴＰ；２－アミノプリン；７－デアザ－２，６－ジアミノプリン；７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン；７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン；２，６－ジアミノプリン；７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン；２－チオシチジン；３－メチルシチジン；５－ホルミルシチジン；５－ヒドロキシメチルシチジン；５－メチルシチジン；Ｎ４－アセチルシチジン；２’－Ｏ－メチルシチジン；２’－Ｏ－メチルシチジン；５，２’－Ｏ－ジメチルシチジン；５－ホルミル－２’－Ｏ－メチルシチジン；リシジン；Ｎ４，２’－Ｏ－ジメチルシチジン；Ｎ４－アセチル－２’－Ｏ－メチルシチジン；Ｎ４－メチルシチジン；Ｎ４，Ｎ４－ジメチル－２’－ＯＭｅ－シチジンＴＰ；４－メチルシチジン；５－アザ－シチジン；シュード－イソ－シチジン；ピロロ－シチジン；α－チオ－シチジン；２－（チオ）シトシン；２’－アミノ－２’－デオキシ－ＣＴＰ；２’－アジド－２’－デオキシ－ＣＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－アミノシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－アジドシチジンＴＰ；３（デアザ）５（アザ）シトシン；３（メチル）シトシン；３－（アルキル）シトシン；３－（デアザ）５（アザ）シトシン；３－（メチル）シチジン；４，２’－Ｏ－ジメチルシチジン；５（ハロ）シトシン；５（メチル）シトシン；５（プロピニル）シトシン；５（トリフルオロメチル）シトシン；５－（アルキル）シトシン；５－（アルキニル）シトシン；５－（ハロ）シトシン；５－（プロピニル）シトシン；５－（トリフルオロメチル）シトシン；５－ブロモ－シチジン；５－ヨード－シチジン；５－プロピニルシトシン；６－（アゾ）シトシン；６－アザ－シチジン；アザシトシン；デアザシトシン；Ｎ４（アセチル）シトシン；１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン；１－メチル－シュードイソシチジン；２－メトキシ－５－メチル－シチジン；２－メトキシ－シチジン；２－チオ－５－メチル－シチジン；４－メトキシ－１－メチル－シュードイソシチジン；４－メトキシ－シュードイソシチジン；４－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン；４－チオ－１－メチル－シュードイソシチジン；４－チオ－シュードイソシチジン；５－アザ－ゼブラリン；５－メチル－ゼブラリン；ピロロ－シュードイソシチジン；ゼブラリン；（Ｅ）－５－（２－ブロモ－ビニル）シチジンＴＰ；２，２’－アンヒドロ－シチジンＴＰ塩酸塩；２’フルオロ－Ｎ４－Ｂｚ－シチジンＴＰ；２’フルオロ－Ｎ４－アセチル－シチジンＴＰ；２’－Ｏ－メチル－Ｎ４－アセチル－シチジンＴＰ；２’Ｏ－メチル－Ｎ４－Ｂｚ－シチジンＴＰ；２’－ａ－エチニルシチジンＴＰ；２’－ａ－トリフルオロメチルシチジンＴＰ；２’－ｂ－エチニルシチジンＴＰ；２’－ｂ－トリフルオロメチルシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオロシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－メルカプトシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－チオメトキシシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－アミノシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－アジドシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－ブロモシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－クロロシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－フルオロシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－ヨードシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－メルカプトシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－チオメトキシシチジンＴＰ；２’－Ｏ－メチル－５－（１－プロピニル）シチジンＴＰ；３’－エチニルシチジンＴＰ；４’－アジドシチジンＴＰ；４’－炭素環シチジンＴＰ；４’－エチニルシチジンＴＰ；５－（１－プロピニル）アラ－シチジンＴＰ；５－（２－クロロ－フェニル）－２－チオシチジンＴＰ；５－（４－アミノ－フェニル）－２－チオシチジンＴＰ；５－アミノアリル－ＣＴＰ；５－シアノシチジンＴＰ；５－エチニルアラ－シチジンＴＰ；５－エチニルシチジンＴＰ；５’－ホモ－シチジンＴＰ；５－メトキシシチジンＴＰ；５－トリフルオロメチル－シチジンＴＰ；Ｎ４－アミノ－シチジンＴＰ；Ｎ４－ベンゾイル－シチジンＴＰ；シュードイソシチジン；７－メチルグアノシン；Ｎ２，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン；Ｎ２－メチルグアノシン；ワイオシン；１，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン；１－メチルグアノシン；２’－Ｏ－メチルグアノシン；２’－Ｏ－リボシルグアノシン（ホスフェート）；２’－Ｏ－メチルグアノシン；２’－Ｏ－リボシルグアノシン（ホスフェート）；７－アミノメチル－７－デアザグアノシン；７－シアノ－７－デアザグアノシン；アルカエオシン；メチルワイオシン；Ｎ２，７－ジメチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２，２’－Ｏ－トリメチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン；Ｎ２，７，２’－Ｏ－トリメチルグアノシン；６－チオ－グアノシン；７－デアザ－グアノシン；８－オキソ－グアノシン；Ｎ１－メチル－グアノシン；α－チオ－グアノシン；２（プロピル）グアニン；２－（アルキル）グアニン；２’－アミノ－２’－デオキシ－ＧＴＰ；２’－アジド－２’－デオキシ－ＧＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－アミノグアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－アジドグアノシンＴＰ；６（メチル）グアニン；６－（アルキル）グアニン；６－（メチル）グアニン；６－メチル－グアノシン；７（アルキル）グアニン；７（デアザ）グアニン；７（メチル）グアニン；７－（アルキル）グアニン；７－（デアザ）グアニン；７－（メチル）グアニン；８（アルキル）グアニン；８（アルキニル）グアニン；８（ハロ）グアニン；８（チオアルキル）グアニン；８－（アルケニル）グアニン；８－（アルキル）グアニン；８－（アルキニル）グアニン；８－（アミノ）グアニン；８－（ハロ）グアニン；８－（ヒドロキシル）グアニン；８－（チオアルキル）グアニン；８－（チオール）グアニン；アザグアニン；デアザグアニン；Ｎ（メチル）グアニン；Ｎ－（メチル）グアニン；１－メチル－６－チオ－グアノシン；６－メトキシ－グアノシン；６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン；６－チオ－７－デアザ－グアノシン；６－チオ－７－メチル－グアノシン；７－デアザ－８－アザ－グアノシン；７－メチル－８－オキソ－グアノシン；Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシン；Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン；１－Ｍｅ－ＧＴＰ；２’フルオロ－Ｎ２－イソブチル－グアノシンＴＰ；２’Ｏ－メチル－Ｎ２－イソブチル－グアノシンＴＰ；２’－ａ－エチニルグアノシンＴＰ；２’－ａ－トリフルオロメチルグアノシンＴＰ；２’－ｂ－エチニルグアノシンＴＰ；２’－ｂ－トリフルオロメチルグアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオログアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－メルカプトグアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－チオメトキシグアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－アミノグアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－アジドグアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－ブロモグアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－クロログアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－フルオログアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－ヨードグアノシンＴＰ；２’－デオ
キシ－２’－ｂ－メルカプトグアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－チオメトキシグアノシンＴＰ；４’－アジドグアノシンＴＰ；４’－炭素環グアノシンＴＰ；４’－エチニルグアノシンＴＰ；５’－ホモ－グアノシンＴＰ；８－ブロモ－グアノシンＴＰ；９－デアザグアノシンＴＰ；Ｎ２－イソブチル－グアノシンＴＰ；１－メチルイノシン；イノシン；１，２’－Ｏ－ジメチルイノシン；２’－Ｏ－メチルイノシン；７－メチルイノシン；２’－Ｏ－メチルイノシン；エポキシキューオシン；ガラクトシル－キューオシン；マンノシルキューオシン；キューオシン；アリルアミノ－チミジン；アザチミジン；デアザチミジン；デオキシ－チミジン；２’－Ｏ－メチルウリジン；２－チオウリジン；３－メチルウリジン；５－カルボキシメチルウリジン；５－ヒドロキシウリジン；５－メチルウリジン；５－タウリノメチル－２－チオウリジン；５－タウリノメチルウリジン；ジヒドロウリジン；シュードウリジン；（３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン；１－メチル－３－（３－アミノ－５－カルボキシプロピル）シュードウリジン；１－メチルプセドウオウリジン；１－エチル－シュードウリジン；２’－Ｏ－メチルウリジン；２’－Ｏ－メチルシュードウリジン；２’－Ｏ－メチルウリジン；２－チオ－２’－Ｏ－メチルウリジン；３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン；３，２’－Ｏ－ジメチルウリジン；３－メチル－シュード－ウリジンＴＰ；４－チオウリジン；５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン；５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル；５，２’－Ｏ－ジメチルウリジン；５，６－ジヒドロ－ウリジン；５－アミノメチル－２－チオウリジン；５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン；５－カルバモイルメチルウリジン；５－カルボキシヒドロキシメチルウリジン；５－カルボキシヒドロキシメチルウリジンメチルエステル；５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン；５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン；５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン；５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン；５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン；５－カルバモイルメチルウリジンＴＰ；５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン；５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン；５－メトキシカルボニルメチルウリジン；５－メチルウリジン、）、５－メトキシウリジン；５－メチル－２－チオウリジン；５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン；５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン；５－メチルアミノメチルウリジン；５－メチルジヒドロウリジン；５－オキシ酢酸－ウリジンＴＰ；５－オキシ酢酸－メチルエステル－ウリジンＴＰ；Ｎ１－メチル－シュード－ウラシル；Ｎ１－エチル－シュード－ウラシル；ウリジン５－オキシ酢酸；ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル；３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）－ウリジンＴＰ；５－（イソ－ペンテニルアミノメチル）－２－チオウリジンＴＰ；５－（イソ－ペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチルウリジンＴＰ；５－（イソ－ペンテニルアミノメチル）ウリジンＴＰ；５－プロピニルウラシル；α－チオ－ウリジン；１（アミノアルキルアミノ－カルボニルエチルエニル）－２（チオ）－シュードウラシル；１（アミノアルキルアミノカルボニルエチルエニル）－２，４－（ジチオ）シュードウラシル；１（アミノアルキルアミノカルボニルエチルエニル）－４（チオ）シュードウラシル；１（アミノアルキルアミノカルボニルエチルエニル）－シュードウラシル；１（アミノカルボニルエチルエニル）－２（チオ）－シュードウラシル；１（アミノカルボニルエチルエニル）－２，４－（ジチオ）シュードウラシル；１（アミノカルボニルエチルエニル）－４（チオ）シュードウラシル；１（アミノカルボニルエチルエニル）－シュードウラシル；１置換２（チオ）－シュードウラシル；１置換２，４－（ジチオ）シュードウラシル；１置換４（チオ）シュードウラシル；１置換シュードウラシル；１－（アミノアルキルアミノ－カルボニルエチルエニル）－２－（チオ）－シュードウラシル；１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジンＴＰ；１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュード－ＵＴＰ；１－メチル－シュード－ＵＴＰ；１－エチル－シュード－ＵＴＰ；２（チオ）シュードウラシル；２’デオキシウリジン；２’フルオロウリジン；２－（チオ）ウラシル；２，４－（ジチオ）プスエドウラシル；２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルロ－グアノシン；２’－アミノ－２’－デオキシ－ＵＴＰ；２’－アジド－２’－デオキシ－ＵＴＰ；２’－アジド－デオキシウリジンＴＰ；２’－Ｏ－メチルシュードウリジン；２’デオキシウリジン；２’フルオロウリジン；２’－デオキシ－２’－ａ－アミノウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－アジドウリジンＴＰ；２－メチルシュードウリジン；３（３アミノ－３カルボキシプロピル）ウラシル；４（チオ）シュードウラシル；４－（チオ）シュードウラシル；４－（チオ）ウラシル；４－チオウラシル；５（ｌ，３－ジアゾール－ｌ－アルキル）ウラシル；５（２－アミノプロピル）ウラシル；５（アミノアルキル）ウラシル；５（ジメチルアミノアルキル）ウラシル；５（グアニジニウムアルキル）ウラシル；５（メトキシカルボニルメチル）－２－（チオ）ウラシル；５（メトキシカルボニル－メチル）ウラシル；５（メチル）２（チオ）ウラシル；５（メチル）２，４（ジチオ）ウラシル；５（メチル）４（チオ）ウラシル；５（メチルアミノメチル）－２（チオ）ウラシル；５（メチルアミノメチル）－２，４（ジチオ）ウラシル；５（メチルアミノメチル）－４（チオ）ウラシル；５（プロピニル）ウラシル；５（トリフルオロメチル）ウラシル；５－（２－アミノプロピル）ウラシル；５－（アルキル）－２－（チオ）シュードウラシル；５－（アルキル）－２，４（ジチオ）シュードウラシル；５－（アルキル）－４（チオ）シュードウラシル；５－（アルキル）シュードウラシル；５－（アルキル）ウラシル；５－（アルキニル）ウラシル；５－（アリルアミノ）ウラシル；５－（シアノアルキル）ウラシル；５－（ジアルキルアミノアルキル）ウラシル；５－（ジメチルアミノアルキル）ウラシル；５－（グアニジニウムアルキル）ウラシル；５－（ハロ）ウラシル；５－（１，３－ジアゾール－１－アルキル）ウラシル；５－（メトキシ）ウラシル；５－（メトキシカルボニルメチル）－２－（チオ）ウラシル；５－（メトキシカルボニル－メチル）ウラシル；５－（メチル）２（チオ）ウラシル；５－（メチル）２，４（ジチオ）ウラシル；５－（メチル）４（チオ）ウラシル；５－（メチル）－２－（チオ）シュードウラシル；５－（メチル）－２，４（ジチオ）シュードウラシル；５－（メチル）－４（チオ）シュードウラシル；５－（メチル）シュードウラシル；５－（メチルアミノメチル）－２（チオ）ウラシル；５－（メチルアミノメチル）－２，４（ジチオ）ウラシル；５－（メチルアミノメチル）－４－（チオ）ウラシル；５－（プロピニル）ウラシル；５－（トリフルオロメチル）ウラシル；５－アミノアリル－ウリジン；５－ブロモ－ウリジン；５－ヨード－ウリジン；５－ウラシル；６（アゾ）ウラシル；６－（アゾ）ウラシル；６－アザ－ウリジン；アリルアミノ－ウラシル；アザウラシル；デアザウラシル；Ｎ３（メチル）ウラシル；シュード－ＵＴＰ－１－２－エタン酸；シュードウラシル；４－チオ－シュード－ＵＴＰ；１－カルボキシメチル－シュードウリジン；１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン；１－プロピニル－ウリジン；１－タウリノメチル－１－メチル－ウリジン；１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン；１－タウリノメチル－シュードウリジン；２－メトキシ－４－チオ－シュードウリジン；２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン；２－チオ－１－メチル－シュードウリジン；２－チオ－５－アザ－ウリジン；２－チオ－ジヒドロシュードウリジン；２－チオ－ジヒドロウリジン；２－チオ－シュードウリジン；４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン；４－メトキシ－シュードウリジン；４－チオ－１－メチル－シュードウリジン；４－チオ－シュードウリジン；５－アザ－ウリジン；ジヒドロシュードウリジン；（±）１－（２－ヒドロキシプロピル）シュードウリジンＴＰ；（２Ｒ）－１－（２－ヒドロキシプロピル）シュードウリジンＴＰ；（２Ｓ）－１－（２－ヒドロキシプロピル）シュードウリジンＴＰ；（Ｅ）－５－（２－ブロモ－ビニル）アラ－ウリジンＴＰ；（Ｅ）－５－（２－ブロモ－ビニル）ウリジンＴＰ；（Ｚ）－５－（２－ブロモ－ビニル）アラ－ウリジンＴＰ；（Ｚ）－５－（２－ブロモ－ビニル）ウリジンＴＰ；１－（２，２，２－トリフルオロエチル）－シュード－ＵＴＰ；１－（２，２，３，３，３－ペンタフルオロプロピル）シュードウリジンＴＰ；１－（２，２－ジエトキシエチル）シュードウリジンＴＰ；１－（２，４，６－トリメチルベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（２，４，６－トリメチル－ベンジル）シュード－ＵＴＰ；１－（２，４，６－トリメチル－フェニル）シュード－ＵＴＰ；１－（２－アミノ－２－カルボキシエチル）シュード－ＵＴＰ；１－（２－アミノ－エチル）シュード－ＵＴＰ；１－（２－ヒドロキシエチル）シュードウリジンＴＰ；１－（２－メトキシエチル）シュードウリジンＴＰ；１－（３，４－ビス－トリフルオロメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（３，４－ジメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュード－ＵＴＰ；１－（３－アミノ－プロピル）シュード－ＵＴＰ；１－（３－シクロプロピル－プロプ－２－イニル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－アミノ－４－カルボキシブチル）シュード－ＵＴＰ；１－（４－アミノ－ベンジル）シュード－ＵＴＰ；１－（４－アミノ－ブチル）シュード－ＵＴＰ；１－（４－アミノ－フェニル）シュード－ＵＴＰ；１－（４－アジドベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－ブロモベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－クロロベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－フルオロベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－ヨードベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－メタンスルホニルベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－メトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－メトキシ－ベンジル）シュード－ＵＴＰ；１－（４－メトキシ－フェニル）シュード－ＵＴＰ；１－（４－メチルベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－メチル－ベンジル）シュード－ＵＴＰ；１－（４－ニトロベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－ニトロ－ベンジル）シュード－ＵＴＰ；１（４－ニトロ－フェニル）シュード－ＵＴＰ；１－（４－チオメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－トリフルオロメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－トリフルオロメチルベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（５－アミノ－ペンチル）シュード－ＵＴＰ；１－（６－アミノ－ヘキシル）シュード－ＵＴＰ；１，６－ジメチル－シュード－ＵＴＰ；１
－［３－（２－｛２－［２－（２－アミノエトキシ）－エトキシ］－エトキシ｝－エトキシ）－プロピオニル］シュードウリジンＴＰ；１－｛３－［２－（２－アミノエトキシ）－エトキシ］－プロピオニル｝シュードウリジンＴＰ；１－アセチルシュードウリジンＴＰ；１－アルキル－６－（１－プロピニル）－シュード－ＵＴＰ；１－アルキル－６－（２－プロピニル）－シュード－ＵＴＰ；１－アルキル－６－アリル－シュード－ＵＴＰ；１－アルキル－６－エチニル－シュード－ＵＴＰ；１－アルキル－６－ホモアリル－シュード－ＵＴＰ；１－アルキル－６－ビニル－シュード－ＵＴＰ；１－アリルシュードウリジンＴＰ；１－アミノメチル－シュード－ＵＴＰ；１－ベンゾイルシュードウリジンＴＰ；１－ベンジルオキシメチルシュードウリジンＴＰ；１－ベンジル－シュード－ＵＴＰ；１－ビオチニル－ＰＥＧ２－シュードウリジンＴＰ；１－ビオチニルシュードウリジンＴＰ；１－ブチル－シュード－ＵＴＰ；１－シアノメチルシュードウリジンＴＰ；１－シクロブチルメチル－シュード－ＵＴＰ；１－シクロブチル－シュード－ＵＴＰ；１－シクロヘプチルメチル－シュード－ＵＴＰ；１－シクロヘプチル－シュード－ＵＴＰ；１－シクロヘキシルメチル－シュード－ＵＴＰ；１－シクロヘキシル－シュード－ＵＴＰ；１－シクロオクチルメチル－シュード－ＵＴＰ；１－シクロオクチル－シュード－ＵＴＰ；１－シクロペンチルメチル－シュード－ＵＴＰ；１－シクロペンチル－シュード－ＵＴＰ；１－シクロプロピルメチル－シュード－ＵＴＰ；１－シクロプロピル－シュード－ＵＴＰ；１－エチル－シュード－ＵＴＰ；１－ヘキシル－シュード－ＵＴＰ；１－ホモアリルシュードウリジンＴＰ；１－ヒドロキシメチルシュードウリジンＴＰ；１－イソ－プロピル－シュード－ＵＴＰ；１－Ｍｅ－２－チオ－シュード－ＵＴＰ；１－Ｍｅ－４－チオ－シュード－ＵＴＰ；１－Ｍｅ－アルファ－チオ－シュード－ＵＴＰ；１－メタンスルホニルメチルシュードウリジンＴＰ；１－メトキシメチルシュードウリジンＴＰ；１－メチル－６－（２，２，２－トリフルオロエチル）シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－（４－モルホリノ）－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－（４－チオモルホリノ）－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－（置換フェニル）シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－アミノ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－アジド－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－ブロモ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－ブチル－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－クロロ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－シアノ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－ジメチルアミノ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－エトキシ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－エチルカルボキシレート－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－エチル－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－フルオロ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－ホルミル－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－ヒドロキシアミノ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－ヒドロキシ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－ヨード－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－イソ－プロピル－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－メトキシ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－メチルアミノ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－フェニル－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－プロピル－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－ｔｅｒｔ－ブチル－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－トリフルオロメトキシ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－トリフルオロメチル－シュード－ＵＴＰ；１－モルホリノメチルシュードウリジンＴＰ；１－ペンチル－シュード－ＵＴＰ；１－フェニル－シュード－ＵＴＰ；１－ピバロイルシュードウリジンＴＰ；１－プロパルギルシュードウリジンＴＰ；１－プロピル－シュード－ＵＴＰ；１－プロピニル－シュードウリジン；１－ｐ－トリル－シュード－ＵＴＰ；１－ｔｅｒｔ－ブチル－シュード－ＵＴＰ；１－チオメトキシメチルシュードウリジンＴＰ；１－チオモルホリノメチルシュードウリジンＴＰ；１－トリフルオロアセチルシュードウリジンＴＰ；１－トリフルオロメチル－シュード－ＵＴＰ；１－ビニルシュードウリジンＴＰ；２，２’－アンヒドロ－ウリジンＴＰ；２’－ブロモ－デオキシウリジンＴＰ；２’－Ｆ－５－メチル－２’－デオキシ－ＵＴＰ；２’－ＯＭｅ－５－Ｍｅ－ＵＴＰ；２’－ＯＭｅ－シュード－ＵＴＰ；２’－ａ－エチニルウリジンＴＰ；２’－ａ－トリフルオロメチルウリジンＴＰ；２’－ｂ－エチニルウリジンＴＰ；２’－ｂ－トリフルオロメチルウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオロウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－メルカプトウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－チオメトキシウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－アミノウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－アジドウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－ブロモウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－クロロウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－フルオロウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－ヨードウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－メルカプトウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－チオメトキシウリジンＴＰ；２－メトキシ－４－チオ－ウリジン；２－メトキシウリジン；２’－Ｏ－メチル－５－（１－プロピニル）ウリジンＴＰ；３－アルキル－シュード－ＵＴＰ；４’－アジドウリジンＴＰ；４’－炭素環ウリジンＴＰ；４’－エチニルウリジンＴＰ；５－（１－プロピニル）アラ－ウリジンＴＰ；５－（２－フラニル）ウリジンＴＰ；５－シアノウリジンＴＰ；５－ジメチルアミノウリジンＴＰ；５’－ホモ－ウリジンＴＰ；５－ヨード－２’－フルオロ－デオキシウリジンＴＰ；５－フェニルエチニルウリジンＴＰ；５－トリジュウテロメチル－６－ジュウテロウリジンＴＰ；５－トリフルオロメチル－ウリジンＴＰ；５－ビニルアラウリジンＴＰ；６－（２，２，２－トリフルオロエチル）－シュード－ＵＴＰ；６－（４－モルホリノ）－シュード－ＵＴＰ；６－（４－チオモルホリノ）－シュード－ＵＴＰ；６－（置換－フェニル）－シュード－ＵＴＰ；６－アミノ－シュード－ＵＴＰ；６－アジド－シュード－ＵＴＰ；６－ブロモ－シュード－ＵＴＰ；６－ブチル－シュード－ＵＴＰ；６－クロロ－シュード－ＵＴＰ；６－シアノ－シュード－ＵＴＰ；６－ジメチルアミノ－シュード－ＵＴＰ；６－エトキシ－シュード－ＵＴＰ；６－エチルカルボキシレート－シュード－ＵＴＰ；６－エチル－シュード－ＵＴＰ；６－フルオロ－シュード－ＵＴＰ；６－ホルミル－シュード－ＵＴＰ；６－ヒドロキシアミノ－シュード－ＵＴＰ；６－ヒドロキシ－シュード－ＵＴＰ；６－ヨード－シュード－ＵＴＰ；６－イソ－プロピル－シュード－ＵＴＰ；６－メトキシ－シュード－ＵＴＰ；６－メチルアミノ－シュード－ＵＴＰ；６－メチル－シュード－ＵＴＰ；６－フェニル－シュード－ＵＴＰ；６－フェニル－シュード－ＵＴＰ；６－プロピル－シュード－ＵＴＰ；６－ｔｅｒｔ－ブチル－シュード－ＵＴＰ；６－トリフルオロメトキシ－シュード－ＵＴＰ；６－トリフルオロメチル－シュード－ＵＴＰ；アルファ－チオ－シュード－ＵＴＰ；シュードウリジン１－（４－メチルベンゼンスルホン酸）ＴＰ；シュードウリジン１－（４－メチル安息香酸）ＴＰ；シュードウリジンＴＰ １－［３－（２－エトキシ）］プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ １－［３－｛２－（２－［２－（２－エトキシ）－エトキシ］－エトキシ）－エトキシ｝］プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ １－［３－｛２－（２－［２－｛２（２－エトキシ）－エトキシ｝－エトキシ］－エトキシ）－エトキシ｝］プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ １－［３－｛２－（２－［２－エトキシ］－エトキシ）－エトキシ｝］プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ １－［３－｛２－（２－エトキシ）－エトキシ｝］プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ １－メチルホスホン酸；シュードウリジンＴＰ １－メチルホスホン酸ジエチルエステル；シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－３－プロピオン酸；シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－４－ブタン酸；シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－５－ペンタン酸；シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－６－ヘキサン酸；シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－７－ヘプタン酸；シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－メチル－ｐ－安息香酸；シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－ｐ－安息香酸；ワイブトシン；ヒドロキシワイブトシン；イソワイオシン；ペルオキシワイブトシン；不完全修飾ヒドロキシワイブトシン；４－デメチルワイオシン；２，６－（ジアミノ）プリン；１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル：１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェンチアジン－１－イル；１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル；１，３，５－（トリアザ）－２，６－（ジオキサ）－ナフタレン；２（アミノ）プリン；２，４，５－（トリメチル）フェニル；２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルロ－シチジン；２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルロ－アデニン；２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルロ－ウリジン；２’－アミノ－２’－デオキシリボース；２－アミノ－６－クロロ－プリン；２－アザ－イノシニル；２’－アジド－２’－デオキシリボース；２’フルオロ－２’－デオキシリボース；２’－フルオロ－修飾塩基；２’－Ｏ－メチル－リボース；２－オキソ－７－アミノピリドピリミジン－３－イル；２－オキソ－ピリドピリミジン－３－イル；２－ピリジノン；３ニトロピロール；３－（メチル）－７－（プロピニル）イソカルボスチリリル；３－（メチル）イソカルボスチリリル；４－（フルオロ）－６－（メチル）ベンゾイミダゾール；４－（メチル）ベンゾイミダゾール；４－（メチル）インドリル；４，６－（ジメチル）インドリル；５ニトロインドール；５置換ピリミジン；５－（メチル）イソカルボスチリリル；５－ニトロインドール；６－（アザ）ピリミジン；６－（アゾ）チミン；６－（メチル）－７－（アザ）インドリル；６－クロロ－プリン；６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル；７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェンチアジン－１－イル；７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル；７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル；７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェンチアジン－１－イル；７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル；７－（アザ）インドリル；７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン１－イル；７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェンチアジン－１－イル；７－（グアニジニウムアルキルヒドロキ
シ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル；７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル；７－（グアニジニウムアルキル－ヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェンチアジン－１－イル；７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル；７－（プロピニル）イソカルボスチリリル；７－（プロピニル）イソカルボスチリリル、プロピニル－７－（アザ）インドリル；７－デアザ－イノシニル；７－置換１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル；７－置換１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル；９－（メチル）－イミジゾピリジニル；アミノインドリル；アントラセニル；ビス－オルト－（アミノアルキルヒドロキシ）－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル；ビス－オルト－置換－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル；ジフルオロトリル；ヒポキサンチン；イミジゾピリジニル；イノシニル；イソカルボスチリリル；イソグアニシン；Ｎ２－置換プリン；Ｎ６－メチル－２－アミノ－プリン；Ｎ６－置換プリン；Ｎ－アルキル化誘導体；ナフタレニル；ニトロベンゾイミダゾリル；ニトロイミダゾリル；ニトロインダゾリル；ニトロピラゾリル；ヌブラリン；Ｏ６－置換プリン；Ｏ－アルキル化誘導体；オルト－（アミノアルキルヒドロキシ）－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル；オルト－置換－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル；オキソホルマイシンＴＰ；パラ－（アミノアルキルヒドロキシ）－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル；パラ－置換－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル；ペンタセニル；フェンアントラセニル；フェニル；プロピニル－７－（アザ）インドリル；ピレニル；ピリドピリミジン－３－イル；ピリドピリミジン－３－イル、２－オキソ－７－アミノ－ピリドピリミジン－３－イル；ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル；ピロロピリミジニル；ピロロピリジニル；スチルベンジル；置換１，２，４－トリアゾール；テトラセニル；ツベルシジン；キサンチン；キサントシン－５’－ＴＰ；２－チオ－ゼブラリン；５－アザ－２－チオ－ゼブラリン；７－デアザ－２－アミノ－プリン；ピリジン－４－オンリボヌクレオシド；２－アミノ－リボシド－ＴＰ；ホルマイシンＡ ＴＰ；ホルマイシンＢ ＴＰ；ピロロシンＴＰ；２’－ＯＨ－アラ－アデノシンＴＰ；２’－ＯＨ－アラ－シチジンＴＰ；２’－ＯＨ－アラ－ウリジンＴＰ；２’－ＯＨ－アラ－グアノシンＴＰ；５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジンＴＰ；およびＮ６－（１９－アミノ－ペンタオキサノナデシル）アデノシンＴＰが挙げられるが限定されない。
いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡポリヌクレオチドなど）は、前述の修飾核酸塩基の少なくとも２つ（例えば、２、３、４つまたはそれを超える）の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドは、シュードウリジン（Ψ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１Ψ）、１－エチル－シュードウリジン（ｅ１Ψ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、α－チオ－グアノシン、α－チオ－アデノシン、５－シアノウリジン、４’－チオウリジン７－デアザ－アデニン、１－メチル－アデノシン（ｍ１Ａ）、２－メチル－アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）および２，６－ジアミノプリン、（Ｉ）、１－メチル－イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、７－デアザ－グアノシン、７－シアノ－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７－アミノメチル－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ１）、７－メチル－グアノシン（ｍ７Ｇ）、１－メチル－グアノシン（ｍ１Ｇ）、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、２，８－ジメチルアデノシン、２－ゲラニルチオウリジン、２－リシジン、２－セレノウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）－５，６－ジヒドロウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジン、３－メチルシュードウリジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）－２’－Ｏ－メチルウリジンメチルエステル、５－アミノメチル－２－ゲラニルチオウリジン、５－アミノメチル－２－セレノウリジン、５－アミノメチルウリジン、５－カルバモイルヒドロキシメチルウリジン、５－カルバモイルメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－ゲラニルチオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－セレノウリジン、５－シアノメチルウリジン、５－ヒドロキシシチジン、５－メチルアミノメチル－２－ゲラニルチオウリジン、７－アミノカルボキシプロピル－デメチルワイオシン、７－アミノカルボキシプロピルワイオシン、７－アミノカルボキシプロピルワイオシンメチルエステル、８－メチルアデノシン、Ｎ４，Ｎ４－ジメチルシチジン、Ｎ６－ホルミルアデノシン、Ｎ６－ヒドロキシメチルアデノシン、アグマチジン、環状Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、グルタミル－キューオシン、メチル化不完全修飾ヒドロキシワイブトシン、Ｎ４，Ｎ４，２’－Ｏ－トリメチルシチジン、ゲラニル化５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン、ゲラニル化５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、Ｑ塩基、ｐｒｅＱ０塩基、ｐｒｅＱ１塩基および２つ以上のそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドは、シュードウリジン、１－メチル－シュードウリジン、１－エチル－シュードウリジン、５－メチルシトシン、５－メトキシウリジンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡポリヌクレオチドなど）は、前述の修飾核酸塩基の少なくとも２つ（例えば、２、３、４つまたはそれを超える）の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、リラキシンポリペプチドをコードするＯＲＦを含むウラシル修飾配列であり、このｍＲＮＡは、化学的に修飾された核酸塩基、例えば５－メトキシウラシルを含む。本発明の特定の態様において、５－メトキシウラシル塩基がリボース糖に連結される場合、ポリヌクレオチドの場合のように、得られる修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを５－メトキシウリジンと呼ぶ。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチド中のウラシルは、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または約１００％が５－メトキシウラシルである。ある実施形態において、本ポリヌクレオチド中のウラシルは、少なくとも９５％が５－メトキシウラシルである。別の実施形態において、本ポリヌクレオチド中のウラシルは、１００％が５－メトキシウラシルである。
実施形態において、本ポリヌクレオチド中のウラシルの少なくとも９５％が５－メトキシウラシルである場合、免疫反応がほぼまたは全く誘発されないようにしながらｍＲＮＡが適切なタンパク質発現レベルをもたらすように全体的なウラシル含量を調整し得る。いくつかの実施形態において、ＯＲＦのウラシル含量は、対応する野生型ＯＲＦ中の理論的な最低ウラシル含量（％Ｕｔｍ）の約１０５％～約１４５％、約１０５％～約１４０％、約１１０％～約１４０％、約１１０％～約１４５％、約１１５％～約１３５％、約１０５％～約１３５％、約１１０％～約１３５％、約１１５％～約１４５％または約１１５％～約１４０％である。他の実施形態において、ＯＲＦのウラシル含量は、％ＵＴＭの約１１７％～約１３４％または１１８％～１３２％である。いくつかの実施形態において、リラキシンポリペプチドをコードするＯＲＦのウラシル含量は、％Ｕｔｍの約１１５％、約１２０％、約１２５％、約１３０％、約１３５％、約１４０％、約１４５％または約１５０％である。これに関連して、「ウラシル」という用語は、５－メトキシウラシルおよび／または天然のウラシルを指し得る。
いくつかの実施形態において、本発明のリラキシンポリペプチドをコードするｍＲＮＡ中のＯＲＦ中のウラシル含量は、ＯＲＦ中の総核酸塩基含量の約５０％未満、約４０％、約３０％、約２０％、約１５％または約１２％である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦ中のウラシル含量は、ＯＲＦ中の総核酸塩基含量の約１２％～約２５％である。他の実施形態において、ＯＲＦ中のウラシル含量は、ＯＲＦ中の総核酸塩基含量の約１５％～約１７％である。ある実施形態において、リラキシンポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦ中のウラシル含量は、オープンリーディングフレーム中の総核酸塩基含量の約２０％未満である。これに関連して、「ウラシル」という用語は、５－メトキシウラシルおよび／または天然のウラシルを指し得る。
さらなる実施形態において、本発明のリラキシンポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、５－メトキシウラシルを含み、リラキシンポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列よりも少ないウラシル対（ＵＵ）、および／またはウラシルトリプレット（ＵＵＵ）、および／またはウラシルクアドラプレット（ＵＵＵＵ）を含有するウラシル含量に調整されている。いくつかの実施形態において、本発明のリラキシンポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、ウラシル対、および／またはウラシルトリプレット、および／またはウラシルクアドラプレットを含有しない。いくつかの実施形態において、ウラシル対、および／またはウラシルトリプレット、および／またはウラシルクアドラプレットは、特定の閾値未満、例えばリラキシンポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦ中で発生数が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０回を超えないように減少される。特定の実施形態において、本発明のリラキシンポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、２０未満、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１つの非フェニルアラニンウラシル対および／またはトリプレットを含有する。別の実施形態において、リラキシンポリペプチドをコードするｍＲＮＡ中のＯＲＦは、非フェニルアラニンウラシル対および／またはトリプレットを含有しない。
さらなる実施形態において、本発明のリラキシンポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、５－メトキシウラシルを含み、リラキシンポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列よりも少ないウラシルに富むクラスターを含有するウラシル含量に調整されている。いくつかの実施形態において、本発明のリラキシンポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、リラキシンポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列中の対応するウラシルに富むクラスターよりも短いウラシルに富むクラスターを含有する。
さらなる実施形態において、代替的なより低頻度のコドンが使用される。５－メトキシウラシルを含むｍＲＮＡのリラキシンポリペプチドをコードするＯＲＦ中のコドンの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００％が代替的コドンで置換され、各代替的コドンは、同義コドンセット中の置換されるコドンのコドン頻度よりも低いコドン頻度を有する。ＯＲＦは、上記のようにウラシル含量も調整されている。いくつかの実施形態において、リラキシンポリペプチドをコードするｍＲＮＡにおけるＯＲＦ中の少なくとも１つのコドンが、同義コドンセット中の置換されるコドンのコドン頻度よりも低いコドン頻度を有する代替的コドンで置換される。
いくつかの実施形態において、５－メトキシウラシルを含むｍＲＮＡのリラキシンポリペプチドをコードするＯＲＦのウラシル含量の調整は、哺乳動物細胞に投与した場合、対応する野生型ｍＲＮＡからのリラキシンタンパク質発現レベルよりも高いリラキシンタンパク質の発現レベルを呈する。他の実施形態において、リラキシンタンパク質の発現レベルは、哺乳動物細胞に投与した場合、少なくとも９５％の５－メトキシウラシルを含有し、理論的最小値の約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％または約２００％のウラシル含量を有する対応するｍＲＮＡと比較して上昇する。また他の実施形態において、哺乳動物細胞への投与時のリラキシンタンパク質の発現レベルは、対応するｍＲＮＡと比較して上昇しており、ここで、ウラシルの少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％が１－メチルシュードウラシルまたはシュードウラシルである。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、マウス細胞、ラット細胞またはウサギ細胞である。他の実施形態において、哺乳動物細胞は、サル細胞またはヒト細胞である。いくつかの実施形態において、ヒト細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＢＪ線維芽細胞または末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）である。いくつかの実施形態において、本ｍＲＮＡが哺乳動物細胞にインビボで投与される場合、リラキシンタンパク質が発現される。いくつかの実施形態において、本ｍＲＮＡがマウス、ウサギ、ラット、サルまたはヒトに投与される。ある実施形態において、マウスは、ヌルマウスである。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇまたは約０．１５ｍｇ／ｋｇの量でマウスに投与される。いくつかの実施形態において、本ｍＲＮＡは、静脈内または筋肉内投与される。他の実施形態において、リラキシンポリペプチドは、本ｍＲＮＡが哺乳動物細胞にインビトロで投与される場合に発現される。いくつかの実施形態において、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１５００倍または少なくとも約３０００倍だけ発現が上昇する。他の実施形態において、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％だけ発現が上昇する。
いくつかの実施形態において、ウラシル含量調整、５－メトキシウラシルを含むｍＲＮＡのリラキシンポリペプチドをコードするＯＲＦは、安定性向上を示す。いくつかの実施形態において、本ｍＲＮＡは、同じ条件下での対応する野生型ｍＲＮＡの安定性と比較して細胞での安定性向上を示す。いくつかの実施形態において、本ｍＲＮＡは、ヌクレアーゼに対する耐性、熱安定性および／または二次構造の安定性向上を含む安定性向上を示す。いくつかの実施形態において、本ｍＲＮＡにより呈される安定性向上は、本ｍＲＮＡの半減期（例えば、血漿、細胞または組織試料中）を決定することおよび／または経時的な本ｍＲＮＡによるタンパク質発現の曲線下面積（ＡＵＣ）（例えば、インビトロまたはインビボ）を決定することによって測定される。ｍＲＮＡは、半減期および／またはＡＵＣが同じ条件下での対応する野生型ｍＲＮＡの半減期および／またはＡＵＣよりも大きい場合、安定性が向上していると判定される。
いくつかの実施形態において、本発明のｍＲＮＡが誘導する免疫反応（例えば、自然または獲得）は、同じ条件下での対応する野生型ｍＲＮＡにより誘導される免疫反応と比較して検出可能に低い。他の実施形態において、本開示のｍＲＮＡが誘導する免疫反応（例えば、自然または獲得）は、同じ条件下でリラキシンポリペプチドをコードするが、５－メトキシウラシルを含まないｍＲＮＡにより誘導される免疫反応と比較して、または同じ条件下でリラキシンポリペプチドをコードし、５－メトキシウラシルを含むが、ウラシル含量が調整されていないｍＲＮＡにより誘導される免疫反応と比較して検出可能に低い。自然免疫反応は、炎症促進性サイトカインの発現上昇、細胞内ＰＲＲ（ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤ
Ａ５など）の活性化、細胞死および／またはタンパク質翻訳の終結または減少により明らかにされ得る。いくつかの実施形態において、自然免疫反応の低下は、１型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－κ、ＩＦＮ－δ、ＩＦＮ－ε、ＩＦＮ－τ、ＩＦＮ－ωおよびＩＦＮ－ζ）の発現もしくは活性レベルまたはトール様受容体（例えば、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８）などのインターフェロン制御遺伝子の発現により、および／または細胞への本発明のｍＲＮＡの１回以上の投与後の細胞死の減少により測定され得る。
いくつかの実施形態において、本開示のｍＲＮＡと反応した哺乳動物細胞による１型インターフェロンの発現は、対応する野生型ｍＲＮＡ、リラキシンポリペプチドをコードするが、５－メトキシウラシルを含まないｍＲＮＡ、またはリラキシンポリペプチドをコードし、５－メトキシウラシルを含むがウラシル含量が調整されていないｍＲＮＡと比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％または９９．９％を超えて低下する。いくつかの実施形態において、インターフェロンは、ＩＦＮ－βである。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞への本開示のｍＲＮＡの投与により引き起こされる細胞死頻度は、対応する野生型ｍＲＮＡ、リラキシンポリペプチドをコードするが、５－メトキシウラシルを含まないｍＲＮＡ、またはリラキシンポリペプチドをコードし、５－メトキシウラシルを含むがウラシル含量が調整されていないｍＲＮＡで観察される細胞死頻度よりも１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％または９５％を超えて少ない。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、ＢＪ線維芽細胞である。他の実施形態において、哺乳動物細胞は、脾細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、マウスまたはラットの細胞である。他の実施形態において、哺乳動物細胞は、ヒトの細胞である。ある実施形態において、本開示のｍＲＮＡは、ｍＲＮＡが導入される哺乳動物細胞の自然免疫反応を実質的に誘導しない。
いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、リラキシンポリペプチドをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡであり、このｍＲＮＡ中のウラシルは、少なくとも約９５％が５－メトキシウラシルであり、このＯＲＦのウラシル含量は、対応する野生型ＯＲＦ中の理論的な最低ウラシル含量の約１１５％～約１３５％であり、リラキシンポリペプチドをコードするＯＲＦ中のウラシル含量は、ＯＲＦ中の総核酸塩基含量の約２３％未満である。いくつかの実施形態において、リラキシンポリペプチドをコードするＯＲＦは、対応する野生型ＯＲＦと比較してＯＲＦのＧ／Ｃ含量（絶対または相対）を少なくとも約４０％低下させるためにさらに修飾される。また他の実施形態において、リラキシンポリペプチドをコードするＯＲＦが含有する非フェニルアラニンウラシル対および／またはトリプレットは、２０未満である。いくつかの実施形態において、リラキシンポリペプチドをコードするｍＲＮＡにおけるＯＲＦ中の少なくとも１つのコドンが同義コドンセット中の置換されるコドンのコドン頻度よりもコドン頻度が低い代替的コドンでさらに置換される。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ中のウラシルの少なくとも約９５％が５－メトキシウラシルであり、ＯＲＦのウラシル含量が対応する野生型ＯＲＦ中の理論的な最低ウラシル含量の約１１５％～約１３５％であるＯＲＦを含むｍＲＮＡによりコードされるリラキシンポリペプチドの発現は、対応する野生型ｍＲＮＡからのリラキシンポリペプチドの発現と比較した場合、少なくとも約１０倍上昇する。いくつかの実施形態において、本ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ中のウラシルの少なくとも約９５％が５－メトキシウラシルであり、ＯＲＦのウラシル含量が、対応する野生型ＯＲＦ中の理論的な最低ウラシル含量の約１１５％～約１３５％であり、ｍＲＮＡが、ｍＲＮＡが導入される哺乳動物細胞の自然免疫反応を実質的に誘導しないオープンＯＲＦを含む。
特定の実施形態において、本ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例
えばｍＲＮＡポリヌクレオチドなど）中の核酸塩基に化学的修飾がある。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡポリヌクレオチドなど）中の修飾核酸塩基は、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１Ψ）、１－エチル－シュードウリジン（ｅ１Ψ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、シュードウリジン（Ψ）、α－チオ－グアノシンおよびα－チオ－アデノシンからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、前述の修飾核酸塩基の少なくとも２つ（例えば、２、３、４つまたはそれを超える）の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡポリヌクレオチドなど）は、シュードウリジン（Ψ）および５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡポリヌクレオチドなど）は、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１Ψ）を含む。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡポリヌクレオチドなど）は、１－エチル－シュードウリジン（ｅ１Ψ）を含む。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡポリヌクレオチドなど）は、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１Ψ）および５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡポリヌクレオチドなど）は、１－エチル－シュードウリジン（ｅ１Ψ）および５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡポリヌクレオチドなど）は、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）を含む。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡポリヌクレオチドなど）は、２－チオウリジンおよび５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡポリヌクレオチドなど）は、メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）を含む。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡポリヌクレオチドなど）は、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）および５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡポリヌクレオチドなど）は、２’－Ｏ－メチルウリジンを含む。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡポリヌクレオチドなど）は、２’－Ｏ－メチルウリジンおよび５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡポリヌクレオチドなど）は、Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）を含む。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡポリヌクレオチドなど）は、Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）および５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。
いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡポリヌクレオチドなど）は、特定の修飾について均一に修飾される（例えば、完全に修飾される、配列全体にわたり修飾される）。例えば、ポリヌクレオチドは、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）で均一に修飾され得、すなわちｍＲＮＡ配列中の全てのシトシン残基が５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）で置き換えられる。同様に、ポリヌクレオチドは、上で示されるものの何れかなどの修飾残基での置き換えにより、配列中に存在するあらゆるタイプのヌクレオシド残基について均一に修飾され得る。
いくつかの実施形態において、オープンリーディングフレーム中の化学的に修飾されたヌクレオシドは、ウリジン、アデニン、シトシン、グアニンおよびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する核酸塩基およびヌクレオシドの例としては、Ｎ４－アセチル－シチジン（ａｃ４Ｃ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、５－ハロ－シチジン（例えば、５－ヨード－シチジン）、５－ヒドロキシメチル－シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１－メチル－シュードイソシチジン、２－チオ－シチジン（ｓ２Ｃ）、２－チオ－５－メチル－シチジンが挙げられる。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾ウリジンである。修飾ウリジンを有する核酸塩基およびヌクレオシドの例としては、５－シアノウリジンまたは４’－チオウリジンが挙げられる。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する核酸塩基およびヌクレオシドの例としては、７－デアザ－アデニン、１－メチル－アデノシン（ｍ１Ａ）、２－メチル－アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６－メチル－アデニン（ｍ６Ａ）および２，６－ジアミノプリンが挙げられる。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する核酸塩基およびヌクレオシドの例としては、イノシン（Ｉ）、１－メチル－イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、７－デアザ－グアノシン、７－シアノ－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７－アミノメチル－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ１）、７－メチル－グアノシン（ｍ７Ｇ）、１－メチル－グアノシン（ｍ１Ｇ）、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシンが挙げられる。
いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡポリヌクレオチドなど）中の核酸塩基修飾ヌクレオチドは、５－メトキシウリジンである。
いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡポリヌクレオチドなど）は、修飾核酸塩基の少なくとも２つ（例えば、２、３、４つまたはそれを超える）の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡポリヌクレオチドなど）は、５－メトキシウリジン（５ｍｏ５Ｕ）および５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。
いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡポリヌクレオチドなど）は、特定の修飾について均一に修飾される（例えば、完全に修飾される、配列全体にわたり修飾される）。例えば、ポリヌクレオチドは、５－メトキシウリジンで均一に修飾され得、すなわちｍＲＮＡ配列中の実質的に全てのウリジン残基が５－メトキシウリジンで置き換えられる。同様に、ポリヌクレオチドは、上で示されるものの何れかなどの修飾残基での置き換えにより、配列中に存在するあらゆるタイプのヌクレオシド残基について均一に修飾され得る。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾シトシンである。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する核酸塩基およびヌクレオシドの例としては、５－メトキシウラシルが挙げられる。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。
いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、ヌクレオシド間にあらゆる有用なリンカーを含み得る。骨格修飾を含め、本開示の組成物中で有用であるこのようなリンカーとしては、次のもの：３’－アルキレンホスホネート、３’－アミノホスホルアミダート、アルケン含有骨格、アミノアルキルホスホルアミダート、アミノアルキルホスホトリエステル、ボラノホスフェート、－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ２－、キラルホスホネート、キラルホスホロチオエート、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレン（メチルイミノ）、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、モルホリノ結合、－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－、ヘテロ原子ヌクレオシド間結合があるオリゴヌクレオシド、ホスフィネート、ホスホルアミダート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ＰＮＡ、シロキサン骨格、スルファメート骨格、スルフィドスルホキシドおよびスルホン骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステルおよびチオノホスホルアミダートが挙げられるが限定されない。
ポリヌクレオチド（例えば、本明細書中に記載のようなＲＮＡまたはｍＲＮＡ）に組み込まれ得る修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチド（例えば、基本単位分子）は、リボ核酸の糖において修飾され得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）をいくつかの異なる置換基で修飾するかまたは置き換え得る。２’－位での代表的な置換としては、Ｈ、ハロ、任意選択により置換されるＣ１～６アルキル、任意選択により置換されるＣ１～６アルコキシ、任意選択により置換されるＣ６～１０アリールオキシ、任意選択により置換されるＣ３～８シクロアルキル、任意選択により置換されるＣ３～８シクロアルコキシ、任意選択により置換されるＣ６～１０アリールオキシ、任意選択により置換されるＣ６～１０アリール－Ｃ１～６アルコキシ、任意選択により置換されるＣ１～１２（ヘテロシクリル）オキシ、糖（例えば、本明細書中に記載のリボース、ペントースなど）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ（式中、Ｒは、Ｈまたは任意選択により置換されるアルキルであり、ｎは、０～２０（例えば、０～４、０～８、０～１０、０～１６、１～４、１～８、１～１０、１～１６、１～２０、２～４、２～８、２～１０、２～１６、２～２０、４～８、４～１０、４～１６および４～２０）の整数である）、２’－ヒドロキシルがＣ１～６アルキレンまたはＣ１～６ヘテロアルキレン架橋により同じリボース糖の４’－炭素に連結される「ロックド」核酸（ＬＮＡ）（代表的な架橋には、メチレン、プロピレン、エーテルまたはアミノ架橋が含まれた）、本明細書中で定義されるようなアミノアルキル、本明細書中で定義されるようなアミノアルコキシ、本明細書中で定義されるようなアミノ、および本明細書中で定義されるようなアミノ酸が挙げられるが限定されない。
一般に、ＲＮＡは、糖基リボースを含み、これは、酸素を有する５員環である。代表的な非限定修飾ヌクレオチドは、（例えば、Ｓ、Ｓｅまたはアルキレン、例えばメチレンまたはエチレンなどでの）リボース中の酸素の置換、（例えば、シクロペンテニルまたはシクロヘキセニルでリボースを置換するための）二重結合の付加、（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成させるための）リボースの環縮小、（例えば、ホスホルアミダート骨格も有する、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニルおよびモルホリノに対するものなど、付加的な炭素またはヘテロ原子を有する６または７員環を形成するための）リボースの環の拡大、多環系形態（例えば、トリシクロ、および「アンロックド」形態、例えばグリコール核酸（ＧＮＡ）（例えば、Ｒ－ＧＮＡまたはＳ－ＧＮＡ、リボースがホスホジエステル結合に連結されるグリコール単位により置換される）、トレオース核酸（ＴＮＡ、リボースがα－Ｌ－
スレオフラノシル－（３’→２’）により置換される）およびペプチド核酸（ＰＮＡ、２－アミノ－エチル－グリシン結合がリボースおよびホスホジエステル骨格を置換する）を含む。糖基は、リボース中の対応する炭素以外に逆の立体化学配置を保持する１つ以上の炭素も含有し得る。したがって、ポリヌクレオチド分子は、糖として例えばアラビノースを含有するヌクレオチドを含み得る。このような糖修飾は、国際公開第２０１３０５２５２３号パンフレットおよび同第２０１４０９３９２４号パンフレットで教示され、これらの各内容は、それらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる。
本発明のポリヌクレオチド（例えば、リラキシンポリペプチドまたは機能的断片またはそれらの変異体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、糖、核酸塩基および／またはヌクレオシド間結合に対する修飾の組み合わせを含み得る。これらの組み合わせは、本明細書中に記載の任意の１つ以上の修飾を含み得る。
非翻訳領域（ＵＴＲ）
非翻訳領域（ＵＴＲ）は、翻訳されない、開始コドン（５’ＵＴＲ）前および終止コドン（３’ＵＴＲ）後のポリヌクレオチドの核酸セクションである。いくつかの実施形態において、リラキシンポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、本発明のポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、ＵＴＲ（例えば、５’ＵＴＲもしくはその機能的断片、３’ＵＴＲもしくはその機能的断片またはそれらの組み合わせ）をさらに含む。
ＵＴＲは、ポリヌクレオチド中のコード領域に対して相同または異種であり得る。いくつかの実施形態において、ＵＴＲは、リラキシンポリペプチドをコードするＯＲＦに対して相同である。いくつかの実施形態において、ＵＴＲは、リラキシンポリペプチドをコードするＯＲＦに対して異種である。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、２つ以上の５’ＵＴＲまたはその機能的断片を含み、これらのそれぞれは、同じまたは異なるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、２つ以上の３’ＵＴＲまたはその機能的断片を含み、これらのそれぞれは、同じまたは異なるヌクレオチド配列を有する。
いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲもしくはその機能的断片、３’ＵＴＲもしくはその機能的断片またはそれらの任意の組み合わせは、配列最適化される。
いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲもしくはその機能的断片、３’ＵＴＲもしくはその機能的断片またはそれらの任意の組み合わせは、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基、例えば５－メトキシウラシルを含む。
ＵＴＲは、制御的役割、例えば安定性、局在化および／または翻訳効率を増減させる役割をもたらす特性を有し得る。ＵＴＲを含むポリヌクレオチドは、細胞、組織または生物に投与し得、通常の方法を使用して１つ以上の制御特性を測定し得る。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲの機能的断片は、それぞれ全長５’または３’ＵＴＲの１つ以上の制御特性を含む。
天然の５’ＵＴＲは、翻訳開始に関与する特性を保有する。これらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始させる過程に関与することが一般に知られているＫｏｚａｋ配列のような特性を保有する。Ｋｏｚａｋ配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧ（配列番号４９２）を有し、式中、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニンまたはグアニン）であり、これに別の「Ｇ」が続く。５’ＵＴＲは、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することも知られている。
特異的な標的器官の多量に発現される遺伝子において一般的に見られる特性を改変することにより、ポリヌクレオチドの安定性およびタンパク質産生を促進し得る。例えば、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、アルファフェトプロテイン、エリスロポエチンまたは第ＶＩＩＩ因子などの肝臓発現ｍＲＮＡの５’ＵＴＲの導入は、肝臓細胞株または肝臓においてポリヌクレオチド発現を促進し得る。同様に、ある組織での発現を向上させるための他の組織特異的なｍＲＮＡからの５’ＵＴＲの使用は、筋肉（例えば、ＭｙｏＤ、ミオシン、ミオグロビン、ミオゲニン、ヘルキュリン）に対して、内皮細胞（例えば、Ｔｉｅ－１、ＣＤ３６）に対して、骨髄系細胞（例えば、Ｃ／ＥＢＰ、ＡＭＬ１、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ１１ｂ、ＭＳＲ、Ｆｒ－１、ｉ－ＮＯＳ）に対して、白血球（例えば、ＣＤ４５、ＣＤ１８）に対して、脂肪組織（例えば、ＣＤ３６、ＧＬＵＴ４、ＡＣＲＰ３０、アディポネクチン）に対して、および肺上皮細胞（例えば、ＳＰ－Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ）に対して可能である。
いくつかの実施形態において、ＵＴＲは、タンパク質が共通の機能、構造、特色または特性を共有する転写物のファミリーから選択される。例えば、コードされるポリペプチドは、（すなわち少なくとも１つの機能、構造、特色、局在化、起源または発現パターンを共有する）タンパク質のファミリーに属し得、これらは、発生中に特定の細胞、組織においてまたはいくつかの時点で発現される。遺伝子またはｍＲＮＡの何れかからのＵＴＲは、新しいポリヌクレオチドを作製するために、タンパク質の同じまたは異なるファミリーの任意の他のＵＴＲに対して交換され得る。
いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲは、異種であり得る。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、３’ＵＴＲと異なる種由来であり得る。いくつかの実施形態において、３’ＵＴＲは、５’ＵＴＲと異なる種由来であり得る。
共同所有国際公開第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０２１５２２号明細書（その全体において参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第２０１４／１６４２５３号パンフレット）は、ＯＲＦに対する隣接領域として本発明のポリヌクレオチド中で利用され得る代表的なＵＴＲのリストを提供する。
本願の代表的なＵＴＲとしては、グロビン、例えばα－またはβ－グロビンなど（例えば、ツメガエル、マウス、ウサギまたはヒトグロビン）；強力なＫｏｚａｋ翻訳開始シグナル；ＣＹＢＡ（例えば、ヒトチトクロムｂ－２４５αポリペプチド）；アルブミン（例えば、ヒトアルブミン７）；ＨＳＤ１７Ｂ４（ヒドロキシステロイド（１７－β）デヒドロゲナーゼ）；ウイルス（例えば、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、デング熱ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、ＣＭＶ前初期１（ＩＥ１））、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、シンドビスウイルスまたはＰＡＶオオムギ黄化萎縮ウイルス）；熱ショックタンパク質（例えば、ｈｓｐ７０）；翻訳開始因子（例えば、ｅｌＦ４Ｇ）；グルコース輸送体（例えば、ｈＧＬＵＴ１（ヒトグルコース輸送体１））；アクチン（例えば、ヒトαまたはβアクチン）；ＧＡＰＤＨ；チューブリン；ヒストン；クエン酸回路酵素；トポイソメラーゼ（例えば、５’ＴＯＰモチーフ（オリゴピリミジントラクト）を欠くＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ）；リボソームタンパク質大サブユニット３２（Ｌ３２）；リボソームタンパク質（例えば、ヒトまたはマウスリボソームタンパク質、例えばｒｐｓ９など）；ＡＴＰシンターゼ（例えば、ＡＴＰ５Ａ１またはミトコンドリアＨ＋－ＡＴＰシンターゼのβサブユニット）；成長ホルモン（例えば、ウシ（ｂＧＨ）またはヒト（ｈＧＨ））；伸長因子（例えば、伸長因子１α１（ＥＥＦ１Ａ１））；マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）；筋細胞エンハンサー因子２Ａ（ＭＥＦ２Ａ）；β－Ｆ１－ＡＴＰａｓｅ、クレアチンキナーゼ、ミオグロビン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）；コラーゲン（例えば、１型コラーゲン、アルファ２（Ｃｏｌ１Ａ２）、１型コラーゲン、アルファ１（Ｃｏｌ１Ａ１）、ＶＩ型コラーゲン、アルファ２（Ｃｏｌ６Ａ２）、ＶＩ型コラーゲン、アルファ１（Ｃｏｌ６Ａ１））；リボホリン（例えば、リボホリンＩ（ＲＰＮＩ））；低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（例えば、ＬＲＰ１）；カルジオトロフィン様サイトカイン因子（例えば、Ｎｎｔ１）；カルレティキュリン（Ｃａｌｒ）、プロコラーゲン－リジン、２－オキソグルタレート５－ジオキシゲナーゼ１（Ｐｌｏｄ１）；およびヌクレオバインディン（例えば、Ｎｕｃｂ１）の核酸配列由来の１つ以上の５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲが挙げられるが限定されない。
いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、β－グロビン５’ＵＴＲ；強力なＫｏｚａｋ翻訳開始シグナルを含有する５’ＵＴＲ；チトクロムｂ－２４５αポリペプチド（ＣＹＢＡ）５’ＵＴＲ；ヒドロキシステロイド（１７－β）デヒドロゲナーゼ（ＨＳＤ１７Ｂ４）５’ＵＴＲ；タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）５’ＵＴＲ；ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＴＥＥＶ）５’ＵＴＲ；非構造タンパク質をコードする風疹ウイルス（ＲＶ）ＲＮＡの５’近位オープンリーディングフレーム；デング熱ウイルス（ＤＥＮ）５’ＵＴＲ；熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）５’ＵＴＲ；ｅＩＦ４Ｇ ５’ＵＴＲ；ＧＬＵＴ１ ５’ＵＴＲ；その機能的断片およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、３’ＵＴＲは、β－グロビン３’ＵＴＲ；ＣＹＢＡ ３’ＵＴＲ；アルブミン３’ＵＴＲ；成長ホルモン（ＧＨ）３’ＵＴＲ；ＶＥＥＶ ３’ＵＴＲ；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）３’ＵＴＲ；α－グロビン３’ＵＴＲ；ＤＥＮ ３’ＵＴＲ；ＰＡＶオオムギ黄化萎縮ウイルス（ＢＹＤＶ－ＰＡＶ）３’ＵＴＲ；伸長因子１α１（ＥＥＦ１Ａ１）３’ＵＴＲ；マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）３’ＵＴＲ；ミトコンドリアＨ（＋）－ＡＴＰシンターゼのβサブユニット（β－ｍＲＮＡ）３’ＵＴＲ；ＧＬＵＴ１ ３’ＵＴＲ；ＭＥＦ２Ａ ３’ＵＴＲ；β－Ｆ１－ＡＴＰａｓｅ ３’ＵＴＲ；その機能的断片およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
任意の遺伝子またはｍＲＮＡ由来の野生型ＵＴＲを本発明のポリヌクレオチドに組み込み得る。いくつかの実施形態において、ＵＴＲは、例えば、ＯＲＦに対してＵＴＲの方向または位置を変化させることにより、またはさらなるヌクレオチドを含むことにより、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチドの交換または転位により、変異体ＵＴＲを生成させるために野生型またはネイティブＵＴＲに対して改変され得る。いくつかの実施形態において、５’または３’ＵＴＲの変異体、例えば野生型ＵＴＲの突然変異体または１つ以上のヌクレオチドがＵＴＲの末端に付加されるか、またはＵＴＲの末端から除去される変異体を利用し得る。
さらに、１つ以上の合成ＵＴＲが１つ以上の非合成ＵＴＲと組み合わせて使用され得る。例えば、それらの内容がそれらの全体において参照により本明細書中に組み込まれるｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／Ｄｅｒｒｉｃｋ＿Ｒｏｓｓｉ／で入手可能なＭａｎｄａｌおよびＲｏｓｓｉ，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３ ８（３）：５６８－８２および配列を参照されたい。ＵＴＲまたはその一部は、それらが選択された転写物と同じ方向で配置し得るか、または方向もしくは位置を変更し得る。したがって、５’および／または３’ＵＴＲは、反転、短縮、伸長され得るか、または１つ以上の他の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲと組み合わせられ得る。
いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、複数のＵＴＲ、例えば二重、三重または四重の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを含む。例えば、二重ＵＴＲは、連続してまたは実質的に連続しての何れかで同じＵＴＲの２コピーを含む。例えば、二重ベータ－グロビン３’ＵＴＲを使用し得る（それらの内容がその全体において参照により本明細書中
に組み込まれる米国特許出願第２０１０／０１２９８７７号明細書を参照されたい）。
特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書中で開示されるＵＴＲの何れかから選択される５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、次のものを含む。
Figure 0007459172000006
Figure 0007459172000007
Figure 0007459172000008
特定の実施形態において、本発明の５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲ配列は、配列番号５４５～５６９の何れかを含む５’ＵＴＲ配列からなる群から選択される配列と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるヌクレオチド配列を含み、および／または３’ＵＴＲ配列は、配列番号４９３～５０５および５７０～５８７の何れかおよびそれらの任意の組み合わせを含む。
本発明のポリヌクレオチドは、特性の組み合わせを含み得る。例えば、ＯＲＦは、強力なＫｏｚａｋ翻訳開始シグナルを含む５’ＵＴＲおよび／またはポリＡテールの鋳型となる付加のためのオリゴ（ｄＴ）配列を含む３’ＵＴＲに隣接し得る。５’ＵＴＲは、同じおよび／または異なるＵＴＲからの第１のポリヌクレオチド断片および第２のポリヌクレオチド断片を含み得る（例えば、その全体において本明細書中で参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／０２９３６２５号明細書を参照されたい）。
他の非ＵＴＲ配列は、本発明のポリヌクレオチド内で領域またはサブ領域として使用され得る。例えば、イントロンまたはイントロン配列の一部を本発明のポリヌクレオチドに組み込み得る。イントロン配列の組み込みにより、タンパク質産生ならびにポリヌクレオチド発現レベルが上昇し得る。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＵＴＲの代わりにまたはＵＴＲに加えて、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む（例えば、それらの内容がそれらの全体において参照により本明細書中に組み込まれるＹａｋｕｂｏｖら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０
３９４（１）：１８９－１９３を参照されたい）。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ配列の代わりにＩＲＥＳを含む。いくつかの実施形態にお
いて、本ポリヌクレオチドは、ＯＲＦおよびウイルスキャプシド配列を含む。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、非合成３’ＵＴＲと組み合わせて合成５’ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態において、ＵＴＲは、少なくとも１つの翻訳エンハンサーポリヌクレオチド、１つまたは複数の翻訳エンハンサーエレメント（まとめて、ポリヌクレオチドから産生されるポリペプチドまたはタンパク質の量を増加させる核酸配列を指す「ＴＥＥ」も含み得る。非限定例として、ＴＥＥは、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第２００９／０２２６４７０号明細書に記載のものおよび当技術分野で公知の他のものを含み得る。非限定例として、ＴＥＥは、転写プロモーターと開始コドンとの間に配置され得る。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、ＴＥＥを含む。
ある態様において、ＴＥＥは、キャップ依存的またはキャップ非依存的翻訳などであるが限定されない、核酸の翻訳活性を促進し得るＵＴＲにおける保存的エレメントである。
一非限定例において、ＴＥＥは、Ｇｔｘホメオドメインタンパク質の５’－リーダー中のＴＥＥ配列を含む。その全体において参照により本明細書中に組み込まれるＣｈａｐｐｅｌｌら、ＰＮＡＳ ２００４ １０１：９５９０－９５９４を参照されたい。
「翻訳エンハンサーポリヌクレオチド」または「翻訳エンハンサーポリヌクレオチド配列」は、本明細書中で提供されるおよび／または当技術分野で公知のＴＥＥの１つ以上を含むポリヌクレオチド（例えば、それぞれの内容がそれらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第６３１０１９７号明細書、同第６８４９４０５号明細書、同第７４５６２７３号明細書、同第７１８３３９５号明細書、米国特許出願公開第２００９／０２２６４７０号明細書、同第２００７／００４８７７６号明細書、同第２０１１／０１２４１００号明細書、同第２００９／００９３０４９号明細書、同第２０１３／０１７７５８１号明細書、国際公開第２００９／０７５８８６号パンフレット、同第２００７／０２５００８号パンフレット、同第２０１２／００９６４４号パンフレット、同第２００１／０５５３７１号パンフレット、同第１９９９／０２４５９５号パンフレット、欧州特許第２６１０３４１Ａ１号明細書および同第２６１０３４０Ａ１号明細書を参照されたい）またはそれらの変異体、相同体もしくは機能的誘導体を指す。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＴＥＥの１つまたは複数のコピーを含む。翻訳エンハンサーポリヌクレオチド中のＴＥＥは、１つ以上の配列セグメントにおいて構築され得る。配列セグメントは複数コ本明細書中で提供されるＴＥＥの１つ以上を有し得、各ＴＥＥは、１つ以上のコピーで存在する。翻訳エンハンサーポリヌクレオチド中に複数の配列セグメントが存在する場合、それらは、均一または不均一であり得る。したがって、翻訳エンハンサーポリヌクレオチド中の複数の配列セグメントは、本明細書中で提供される同一であるかまたは異なるタイプのＴＥＥを、それぞれのＴＥＥの同一であるかまたは異なる数のコピーおよび／または各配列セグメント内のＴＥＥの同一であるかまたは異なる機構で有し得る。ある実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、翻訳エンハンサーポリヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載の少なくとも１つのＴＥＥを含む５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、ベクター系または核酸ベクターなどであるが限定されないモノシストロニック配列において組み込まれ得る。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、本明細書中に記載のＴＥＥまたはその一部を含む。いくつかの実施形態において、３’ＵＴＲ中のＴＥＥは、５’ＵＴＲにおいて配置されるＴＥＥと同じでありか
つ／または異なり得る。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、または６０を超えるＴＥＥ配列を含み得る。ある実施形態において、本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、１～６０、１～５５、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１つのＴＥＥ配列を含み得る。本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ中のＴＥＥ配列は、同じまたは異なるＴＥＥ配列であり得る。本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ中の異なるＴＥＥ配列の組み合わせは、異なるＴＥＥ配列の何れかの複数のコピーが組み込まれる組み合わせを含み得る。
いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、２つのＴＥＥ配列を分離するためのスペーサーを含む。非限定例として、スペーサーは、１５ヌクレオチドスペーサーおよび／または当技術分野で公知の他のスペーサーであり得る。別の非限定例として、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲにおいてそれぞれ少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、または１０回を超えて反復するＴＥＥ配列－スペーサーモジュールを含む。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回反復するＴＥＥ配列－スペーサーモジュールを含む。
いくつかの実施形態において、２つのＴＥＥ配列を分離するスペーサーは、本発明のポリヌクレオチド、例えば本明細書中に記載のｍｉＲ配列（例えば、ｍｉＲ結合部位およびｍｉＲシード）の翻訳を制御し得る当技術分野で公知の他の配列を含み得る。非限定例として、２つのＴＥＥ配列を分離するために使用される各スペーサーは、異なるｍｉＲ配列またはｍｉＲ配列の構成要素（例えば、ｍｉＲシード配列）を含み得る。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲおよび／またはＴＥＥ配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドへのｍｉＲ配列および／またはＴＥＥ配列の組み込みは、ステムループ領域の形状を変化させ得、翻訳を増加および／または減少させ得る。例えば、その全体において本明細書中で参照により組み込まれるＫｅｄｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１０ １２（１０）：１０１４～２０を参照されたい）。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位
本発明のポリヌクレオチドは、制御エレメント、例えばマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位、転写因子結合部位、構造化ｍＲＮＡ配列および／またはモチーフ、内在性核酸結合分子に対する偽受容体として作用するように改変された人工的結合部位およびそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、このような制御エレメントを含むポリヌクレオチドは、「センサー配列」を含むと言われる。センサー配列の非限定例は、それらの内容がそれらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０２００２６１号明細書に記載されている。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、関心のあるポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。ｍｉＲＮＡ結合部位を含むことおよび組み込むことにより、本発明のポリヌクレオチド制御がもたらされ、次に天然ｍｉＲＮＡの組織特異的なおよび／または細胞タイプ特異的な発現に基づき、それからコードされるポリペプチドが制御されるようになる。
ｍｉＲＮＡ、例えば天然ｍｉＲＮＡは、ポリヌクレオチドに結合し、安定性を低下させることによるかまたはポリヌクレオチドの翻訳を阻害することによるかの何れかで遺伝子発現を下方制御する１９～２５ヌクレオチド長の非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち成熟ｍｉＲＮＡの位置２～８の領域の配列を含む。ｍｉＲＮＡシードは、成熟ｍｉＲＮＡの位置２～８または２～７を含み得る。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡシードは、７ヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２～８）を含み得、対応するｍｉＲＮＡ結合部位におけるシード相補部位は、ｍｉＲＮＡ位置１に対して反対側のアデノシン（Ａ）に隣接する。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡシードは、６ヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２～７）を含み得、対応するｍｉＲＮＡ結合部位中のシード相補性部位は、ｍｉＲＮＡ位置１に対して反対側のアデノシン（Ａ）に隣接する。例えば、Ｇｒｉｍｓｏｎ Ａ，Ｆａｒｈ ＫＫ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＷＫ，Ｇａｒｒｅｔｔ－Ｅｎｇｅｌｅ Ｐ，Ｌｉｍ ＬＰ，Ｂａｒｔｅｌ ＤＰ；Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２００７ Ｊｕｌ ６；２７（１）：９１－１０５を参照されたい。細胞または組織中でのｍｉＲＮＡの有無を判定するために、標的細胞または組織のｍｉＲＮＡプロファイリングを行い得る。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、１つ以上のマイクロＲＮＡ結合部位、マイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ相補性配列またはマイクロＲＮＡシード相補性配列を含む。このような配列は、それぞれの内容がそれらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第２００５／０２６１２１８号明細書および同第２００５／００５９００５号明細書で教示されているものなどの任意の公知のマイクロＲＮＡに対応し得、例えばそれに対して相補性を有し得る。
本明細書中で使用される場合、「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）結合部位」という用語は、ｍｉＲＮＡと相互作用するか、会合するかまたは結合するためにｍｉＲＮＡの全てまたはその領域に対して十分な相補性を有する、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲにおけるものを含め、ポリヌクレオチド内、例えばＤＮＡ内またはＲＮＡ転写物内の配列を指す。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、関心のあるポリペプチドをコードするＯＲＦを含み、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。代表的な実施形態において、本ポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））の５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位は、ポリヌクレオチドのｍｉＲＮＡ介在性の制御、例えばｍｉＲＮＡ介在性の翻訳抑制またはポリヌクレオチド分解を促進するのに十分な相補性の度合いを指す。本発明の代表的な態様において、ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位は、ポリヌクレオチドのｍｉＲＮＡ介在性分解、例えばｍＲＮＡのｍｉＲＮＡガイドＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）介在性切断を促進するのに十分な相補性の度合いを指す。ｍｉＲＮＡ結合部位は、例えば、１９～２５ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ配列、１９～２３ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ配列、または２２ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ配列と相補性を有し得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡの一部とのみ、例えば天然のｍｉＲＮＡ配列の全長の１、２、３または４ヌクレオチド未満の部分とのみ相補的であり得る。全長または完全な相補性（例えば、天然のｍｉＲＮＡの長さの全てまたは重要な部分にわたる全長相補性または完全相補性）は、所望の制御がｍＲＮＡ分解である場合に好ましい。
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡシード配列と相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡシード配列と完全な相補性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列と相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列と完全な相補性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、１、２または３つのヌクレオチド置換、末端付加および／または短縮を別にすれば、ｍｉＲＮＡ配列と完全な相補性を有する。
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡと同じ長さである。他の実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、５’末端、３’末端またはその両方において、対応するｍｉＲＮＡよりも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヌクレオチド短い。さらに他の実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、５’末端、３’末端またはその両方において、対応するマイクロＲＮＡよりも２ヌクレオチド短い。対応するｍｉＲＮＡよりも短いｍｉＲＮＡ結合部位は、依然としてｍｉＲＮＡ結合部位の１つ以上を組み込むｍＲＮＡを分解可能であるか、またはｍＲＮＡの翻訳を妨げることが可能である。
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ダイサーを含有する活性ＲＩＳＣの一部である対応する成熟ｍｉＲＮＡに結合する。別の実施形態において、ＲＩＳＣ中の対応するｍｉＲＮＡへのｍｉＲＮＡ結合部位の結合により、ｍｉＲＮＡ結合部位を含有するｍＲＮＡが分解されるか、またはｍＲＮＡの翻訳が妨害される。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体がｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドを切断するようにｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有する。他の実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、不完全な相補性を有し、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体がｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドにおける不安定性を誘導するようになる。別の実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体がｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドの転写を抑制するように不完全な相補性を有する。
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡから、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のミスマッチを有する。
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡのそれぞれ少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０または少なくとも約２１の連続ヌクレオチドと相補的な少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０または少なくとも約２１の連続ヌクレオチドを有する。
１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチドに操作することにより、本ポリヌクレオチドを分解または翻訳低下の標的にし得るが、ただし、対象のｍｉＲＮＡが入手可能であるものとする。これは、ポリヌクレオチドの送達に対するオフターゲット効果を減少させ得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドをある組織または細胞に送達しようとしないが、最終目標がその組織または細胞である場合、その組織または細胞中で多量
に存在するｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの１つまたは複数の結合部位がポリヌクレオチドの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲに操作される場合、関心のある遺伝子の発現を阻害し得る。
逆に、特異的な組織におけるタンパク質発現を増加させるために自然にそれらが生じるポリヌクレオチド配列からｍｉＲＮＡ結合部位を除去し得る。例えば、ｍｉＲＮＡを含有する組織または細胞におけるタンパク質発現を増加させるために、特異的なｍｉＲＮＡに対する結合部位をポリヌクレオチドから除去し得る。
ある実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、正常なおよび／または癌細胞などであるが限定されない特異的な細胞に対する細胞毒性または細胞保護的ｍＲＮＡ治療薬を制御するために、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲ中に少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、正常なおよび／または癌細胞などであるが限定されない特異的な細胞に対する細胞毒性または細胞保護的ｍＲＮＡ治療薬を制御するために、５’－ＵＴＲおよび／または３’－ＵＴＲにおいて２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超えるｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。
複数組織における発現の制御は、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位、例えば１つ以上の別個のｍｉＲＮＡ結合部位の導入または除去を通じて行い得る。ｍｉＲＮＡ結合部位を除去するかまたは挿入するかの選択は、発生および／または疾患における、組織および／または細胞での、ｍｉＲＮＡ発現パターンおよび／またはそれらのプロファイリングに基づいてなされ得る。生物学におけるｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位およびそれらの発現パターンおよび役割の同定が報告されている（例えば、Ｂｏｎａｕｅｒら、Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ２０１０ １１：９４３－９４９；ＡｎａｎｄおよびＣｈｅｒｅｓｈ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０１１ １８：１７１－１７６；ＣｏｎｔｒｅｒａｓおよびＲａｏ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２０１２ ２６：４０４－４１３（２０１１ Ｄｅｃ ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）；Ｂａｒｔｅｌ Ｃｅｌｌ ２００９ １３６：２１５－２３３；Ｌａｎｄｇｒａｆら、Ｃｅｌｌ，２００７ １２９：１４０１－１４１４；ＧｅｎｔｎｅｒおよびＮａｌｄｉｎｉ，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ２０１２ ８０：３９３－４０３ならびにこれらの中の全ての参考文献を参照されたい。これらのそれぞれは、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる）。
ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ結合部位は、それぞれがそれらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０２００２６１号明細書、同第２００５／０２６１２１８号明細書および同第２００５／００５９００５号明細書に記載の非限定例を含む任意の公知の配列に対応し得る。
ｍｉＲＮＡがｍＲＮＡを制御し、それによりタンパク質発現が制御されることが知られている組織の例としては、肝臓（ｍｉＲ－１２２）、筋肉（ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ－１７－９２、ｍｉＲ－１２６）、骨髄細胞（ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７）、脂肪組織（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ－１ｄ、ｍｉＲ－１４９）、腎臓（ｍｉＲ－１９２、ｍｉＲ－１９４、ｍｉＲ－２０４）および肺上皮細胞（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－１２６）が挙げられるが限定されない。
具体的に、ｍｉＲＮＡは、免疫細胞（造血細胞とも呼ばれる）において、例えば抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞およびマクロファージ）、マクロファージ、単球、
Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、顆粒球、ナチュラルキラー細胞などにおいて異なって発現されることが知られている。免疫細胞特異的なｍｉＲＮＡは、免疫原性、自己免疫、感染に対する免疫反応、炎症ならびに遺伝子治療および組織／臓器移植後の不要な免疫反応に関与する。免疫細胞特異的なｍｉＲＮＡは、造血細胞（免疫細胞）の発生、増殖、分化およびアポトーシスの多くの態様も制御する。例えば、ｍｉＲ－１４２およびｍｉＲ－１４６は、免疫細胞において排他的に発現され、骨髄系の樹状細胞において特に多量に存在する。ポリヌクレオチドに対する免疫反応が、ポリヌクレオチドの３’－ＵＴＲにｍｉＲ－１４２結合部位を付加することによって遮断され得、組織および細胞においてより安定なトランスフェクションを可能にすることが示されている。ｍｉＲ－１４２は、抗原提示細胞において外因性ポリヌクレオチドを効率的に分解し、形質導入細胞の細胞毒性除去を抑制する（例えば、これらのそれぞれがその全体において参照により本明細書中に組み込まれるＡｎｎｏｎｉ Ａら、ｂｌｏｏｄ，２００９，１１４，５１５２－５１６１；Ｂｒｏｗｎ ＢＤら、Ｎａｔ ｍｅｄ．２００６，１２（５），５８５－５９１；Ｂｒｏｗｎ ＢＤら、ｂｌｏｏｄ，２００７，１１０（１３）：４１４４－４１５２）。
抗原介在性免疫反応は、生物に侵入した際、抗原提示細胞によりプロセシングされ、抗原提示細胞の表面に提示される外来抗原により引き起こされる免疫反応を指し得る。Ｔ細胞は、提示された抗原を認識し、抗原を発現する細胞の細胞毒性排除を誘導し得る。
本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲにｍｉＲ－１４２結合部位を導入することにより、ｍｉＲ－１４２介在性分解を通じて抗原提示細胞において遺伝子発現が選択的に抑制され得、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）での抗原提示が限定され、それによってポリヌクレオチド送達後の抗原介在性免疫反応が妨げられる。次に、細胞毒性排除を引き起こさずに、ポリヌクレオチドが標的組織または細胞において安定して発現される。
ある実施形態において、免疫細胞、特に抗原提示細胞において発現されることが知られているｍｉＲＮＡに対する結合部位を本発明のポリヌクレオチドに操作して、ｍｉＲＮＡ介在性ＲＮＡ分解を通じて抗原提示細胞においてポリヌクレオチドの発現を抑制し得、抗原介在性免疫反応を抑止する。本ポリヌクレオチドの発現は、免疫細胞特異的なｍｉＲＮＡが発現されない非免疫細胞中で維持される。例えば、いくつかの実施形態において、肝臓特異的なタンパク質に対する免疫原性反応を妨げるために、任意のｍｉＲ－１２２結合部位を除去し得、ｍｉＲ－１４２（および／またはｍｉｒＲ－１４６）結合部位を本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲに遺伝子操作し得る。
ＡＰＣおよびマクロファージにおいて選択的分解および抑制をさらに促進するために、本発明のポリヌクレオチドは、単独でまたはｍｉＲ－１４２および／もしくはｍｉＲ－１４６結合部位と組み合わせるかの何れかで５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲにおいて負の制御エレメントをさらに含み得る。非限定例として、さらなる負の制御エレメントは、構成的崩壊エレメント（ＣＤＥ）である。
免疫細胞特異的なｍｉＲＮＡとしては、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－２－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－３ｐ、ｈｓａ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｍｉＲ－１０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１１８４、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－１－－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－２－－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－１－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２７９、ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－１３２－５ｐ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｍｉＲ－１４３－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１４７ａ、ｍｉＲ－１４７ｂ、ｍｉＲ－１４８ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１４８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５０－３ｐ、ｍｉＲ－１５０－５ｐ、ｍｉＲ－１５１ｂ、ｍｉＲ－１５５－３ｐ、ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｍｉＲ－１５ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１５ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１６－１－３ｐ、ｍｉＲ－１６－２－３ｐ、ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１８２－３ｐ、ｍｉＲ－１８２－５ｐ、ｍｉＲ－１９７－３ｐ、ｍｉＲ－１９７－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－５ｐ、ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｍｉＲ－２２３－５ｐ、ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｍｉＲ－２２１－５ｐ、ｍｉＲ－２３ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２４－１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－２－５ｐ、ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－１－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－２－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２７ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２７ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２７ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２８－３ｐ、ｍｉＲ－２８－５ｐ、ｍｉＲ－２９０９、ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｂ－１－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－２９ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｍｉＲ－３３１－５ｐ、ｍｉＲ－３３９－３ｐ、ｍｉＲ－３３９－５ｐ、ｍｉＲ－３４５－３ｐ、ｍｉＲ－３４５－５ｐ、ｍｉＲ－３４６、ｍｉＲ－３４ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３６３－３ｐ、ｍｉＲ－３６３－５ｐ、ｍｉＲ－３７２、ｍｉＲ－３７７－３ｐ、ｍｉＲ－３７７－５ｐ、ｍｉＲ－４９３－３ｐ、ｍｉＲ－４９３－５ｐ、ｍｉＲ－５４２、ｍｉＲ－５４８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ５４８ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｉ、ｍｉＲ－５４８ｊ、ｍｉＲ－５４８ｎ、ｍｉＲ－５７４－３ｐ、ｍｉＲ－５９８、ｍｉＲ－７１８、ｍｉＲ－９３５、ｍｉＲ－９９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９９ｂ－３ｐおよびｍｉＲ－９９ｂ－５ｐが挙げられるが限定されない。さらに、マイクロアレイハイブリッド形成およびミクロトーム分析を通じて免疫細胞において新規ｍｉＲＮＡが同定され得る（例えば、それぞれの内容がその全体において参照により本明細書中に組み込まれるＪｉｍａ ＤＤら、Ｂｌｏｏｄ，２０１０，１１６：ｅ１１８－ｅ１２７；Ｖａｚ Ｃら、ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１０，１１，２８８）。
肝臓において発現されることが知られているｍｉＲＮＡとしては、ｍｉＲ－１０７、ｍｉＲ－１２２－３ｐ、ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｍｉＲ－１２２８－３ｐ、ｍｉＲ－１２２８－５ｐ、ｍｉＲ－１２４９、ｍｉＲ－１２９－５ｐ、ｍｉＲ－１３０３、ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１５２、ｍｉＲ－１９４－３ｐ、ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２９６－５ｐ、ｍｉＲ－５５７、ｍｉＲ－５８１、ｍｉＲ－９３９－３ｐおよびｍｉＲ－９３９－５ｐが挙げられるが限定されない。肝臓でのポリヌクレオチド発現を制御するために、任意の肝臓特異的なｍｉＲＮＡからのＭｉＲＮＡ結合部位が本発明のポリヌクレオチドに導入され得るかまたはそれから除去され得る。肝臓特異的なｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドにおいて、単独でまたはさらに免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて操作され得る。
肺において発現されることが知られているｍｉＲＮＡとしては、ｌｅｔ－７ａ－２－３ｐ、ｌｅｔ－７ａ－３ｐ、ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｍｉＲ－１２７－３ｐ、ｍｉＲ－１２７－５ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１３４、ｍｉＲ－１８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１８ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２４－１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－２－５ｐ、ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｍｉＲ－２９６－３ｐ、ｍｉＲ－２９６－５ｐ、ｍｉＲ－３２－３ｐ、ｍｉＲ－３３７－３ｐ、ｍｉＲ－３３７－５ｐ、ｍｉＲ－３８１－３ｐおよびｍｉＲ－３８１－５ｐが挙げられるが限定されない。肺でのポリヌクレオチド発現を制御するために、任意の肺特異的なｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位が本発明のポリヌクレオチドに導入され得るかまたはそれから除去され得る。肺特異的なｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドにおいて、単独でまたはさらに免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて操作され得る。
心臓において発現されることが知られているｍｉＲＮＡとしては、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１４９－３ｐ、ｍｉＲ－１４９－５ｐ、ｍｉＲ－１８６－３ｐ、ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｍｉＲ－２０８ａ、ｍｉＲ－２０８ｂ、ｍｉＲ－２１０、ｍｉＲ－２９６－３ｐ、ｍｉＲ－３２０、ｍｉＲ－４５１ａ、ｍｉＲ－４５１ｂ、ｍｉＲ－４９９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－４９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－４９９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－４９９ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－７４４－３ｐ、ｍｉＲ－７４４－５ｐ、ｍｉＲ－９２ｂ－３ｐおよびｍｉＲ－９２ｂ－５ｐが挙げられるが限定されない。心臓でのポリヌクレオチド発現を制御するために、任意の心臓特異的なマイクロＲＮＡからのｍＭｉＲＮＡ結合部位が本発明のポリヌクレオチドに導入され得るかまたはそれから除去され得る。心臓特異的なｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドにおいて、単独でまたはさらに免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて操作され得る。
神経系において発現されることが知られているｍｉＲＮＡとしては、ｍｉＲ－１２４－５ｐ、ｍｉＲ－１２５ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－１－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２７１－３ｐ、ｍｉＲ－１２７１－５ｐ、ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－１３２－５ｐ、ｍｉＲ－１３５ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１３５ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１３５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１３７、ｍｉＲ－１３９－５ｐ、ｍｉＲ－１３９－３ｐ、ｍｉＲ－１４９－３ｐ、ｍｉＲ－１４９－５ｐ、ｍｉＲ－１５３、ｍｉＲ－１８１ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－１８１ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－１８３－３ｐ、ｍｉＲ－１８３－５ｐ、ｍｉＲ－１９０ａ、ｍｉＲ－１９０ｂ、ｍｉＲ－２１２－３ｐ、ｍｉＲ－２１２－５ｐ、ｍｉＲ－２１９－１－３ｐ、ｍｉＲ－２１９－２－３ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－１－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－２－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｄ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－３２９、ｍｉＲ－３４２－３ｐ、ｍｉＲ－３６６５、ｍｉＲ－３６６６、ｍｉＲ－３８０－３ｐ、ｍｉＲ－３８０－５ｐ、ｍｉＲ－３８３、ｍｉＲ－４１０、ｍｉＲ－４２５－３ｐ、ｍｉＲ－４２５－５ｐ、ｍｉＲ－４５４－３ｐ、ｍｉＲ－４５４－５ｐ、ｍｉＲ－４８３、ｍｉＲ－５１０、ｍｉＲ－５１６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－５７１、ｍｉＲ－７－１－３ｐ、ｍｉＲ－７－２－３ｐ、ｍｉＲ－７－５ｐ、ｍｉＲ－８０２、ｍｉＲ－９２２、ｍｉＲ－９－３ｐおよびｍｉＲ－９－５ｐが挙げられるが限定されない。神経系で豊富なｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－１４８ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１４８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２１２－３ｐ、ｍｉＲ－２１２－５ｐ、ｍｉＲ－３２０ｂ、ｍｉＲ－３２０ｅ、ｍｉＲ－３２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３２４－５ｐ、ｍｉＲ－３２５、ｍｉＲ－３２６、ｍｉＲ－３２８、ｍｉＲ－９２２を含むが限定されない、ニューロンで特異的に発現されるものおよびｍｉＲ－１２５０、ｍｉＲ－２１９－１－３ｐ、ｍｉＲ－２１９－２－３ｐ、ｍｉＲ－２１９－５ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０６５－３ｐ、ｍｉＲ－３０６５－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｍｉＲ－３２－５ｐ、ｍｉＲ－３３８－５ｐおよびｍｉＲ－６５７を含むが限定されないグリア細胞で特異的に発現されるものをさらに含む。神経系でのポリヌクレオチド発現を制御するために、任意のＣＮＳ特異的なｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位が本発明のポリヌクレオチドに導入され得るかまたはそれから除去され得る。神経系特異的なｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドにおいて、単独でまたはさらに免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて操作され得る。
膵臓において発現されることが知られているｍｉＲＮＡとしては、ｍｉＲ－１０５－３ｐ、ｍｉＲ－１０５－５ｐ、ｍｉＲ－１８４、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１９６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２１４－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－５ｐ、ｍｉＲ－２１６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２１６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３７５、ｍｉＲ－７－１－３ｐ、ｍｉＲ－７－２－３ｐ、ｍｉＲ－４９３－３ｐ、ｍｉＲ－４９３－５ｐおよびｍｉＲ－９４４が挙げられるが限定されない。膵臓でのポリヌクレオチド発現を制御するために、任意の膵臓特異的なｍｉＲＮＡからのＭｉＲＮＡ結合部位が本発明のポリヌクレオチドに導入され得るかまたはそれから除去され得る。膵臓特異的なｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドにおいて、単独でまたはさらに免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて操作され得る。
腎臓において発現されることが知られているｍｉＲＮＡとしては、ｍｉＲ－１２２－３ｐ、ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－１９２－３ｐ、ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｍｉＲ－１９４－３ｐ、ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２０４－３ｐ、ｍｉＲ－２０４－５ｐ、ｍｉＲ－２１０、ｍｉＲ－２１６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２１６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２９６－３ｐ、ｍｉＲ－３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－１－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－２－３ｐ、ｍｉＲ３０ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３２４－３ｐ、ｍｉＲ－３３５－３ｐ、ｍｉＲ－３３５－５ｐ、ｍｉＲ－３６３－３ｐ、ｍｉＲ－３６３－５ｐおよびｍｉＲ－５６２が挙げられるが限定されない。腎臓でのポリヌクレオチド発現を制御するために、任意の腎臓特異的なｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位が本発明のポリヌクレオチドに導入され得るかまたはそれから除去され得る。腎臓特異的なｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドにおいて、単独でまたはさらに免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて操作され得る。
筋肉において発現されることが知られているｍｉＲＮＡとしては、ｌｅｔ－７ｇ－３ｐ、ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１２８６、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１４０－３ｐ、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｍｉＲ－１４３－５ｐ、ｍｉＲ－１４５－３ｐ、ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｍｉＲ－１８８－３ｐ、ｍｉＲ－１８８－５ｐ、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－２０８ａ、ｍｉＲ－２０８ｂ、ｍｉＲ－２５－３ｐおよびｍｉＲ－２５－５ｐが挙げられるが限定されない。筋肉でのポリヌクレオチド発現を制御するために、任意の筋肉特異的なｍｉＲＮＡからのＭｉＲＮＡ結合部位が本発明のポリヌクレオチドに導入され得るかまたはそれから除去され得る。筋肉特異的なｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドにおいて、単独でまたはさらに免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて操作され得る。
ｍｉＲＮＡは、内皮細胞、上皮細胞および脂肪細胞などであるが限定されない様々なタイプの細胞でも異なって発現される。
内皮細胞において発現されることが知られているｍｉＲＮＡとしては、ｌｅｔ－７ｂ－３ｐ、ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１００－３ｐ、ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－１０１－３ｐ、ｍｉＲ－１０１－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｍｉＲ－１２３６－３ｐ、ｍｉＲ－１２３６－５ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－１７－３ｐ、ｍｉＲ－１８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１８ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９ｂ－１－５ｐ、ｍｉＲ－１９ｂ－２－５ｐ、ｍｉＲ－１９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２１７、ｍｉＲ－２１０、ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｍｉＲ－２２１－５ｐ、ｍｉＲ－２２２－３ｐ、ｍｉＲ－２２２－５ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２９６－５ｐ、ｍｉＲ－３６１－３ｐ、ｍｉＲ－３６１－５ｐ、ｍｉＲ－４２１、ｍｉＲ－４２４－３ｐ、ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｍｉＲ－５１３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－１－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－９２ｂ－３ｐおよびｍｉＲ－９２ｂ－５ｐが挙げられるが限定されない。ディープシーケンス分析から多くの新規ｍｉＲＮＡが内皮細胞において発見されている（例えば、その全体において本明細書中で参照により組み込まれるＶｏｅｌｌｅｎｋｌｅ Ｃら、ＲＮＡ，２０１２，１８，４７２－４８４）。内皮細胞でのポリヌクレオチド発現を制御するために、任意の内皮細胞特異的なｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位が本発明のポリヌクレオチドに導入され得るかまたはそれから除去され得る。
上皮細胞において発現されることが知られているｍｉＲＮＡとしては、ｌｅｔ－７ｂ－３ｐ、ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２４６、ｍｉＲ－２００ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｍｉＲ－４２９、ｍｉＲ－４５１ａ、ｍｉＲ－４５１ｂ、ｍｉＲ－４９４、ｍｉＲ－８０２およびｍｉＲ－３４ａ、ｍｉＲ－３４ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３４ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－４４９ａ、ｍｉＲ－４４９ｂ－３ｐ、呼吸器繊毛性上皮細胞において特異的なｍｉＲ－４４９ｂ－５ｐ、ｌｅｔ－７ファミリー、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３３ｂ、肺上皮細胞において特異的なｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－３８２－３ｐ、腎臓上皮細胞において特異的なｍｉＲ－３８２－５ｐおよび角膜上皮細胞において特異的なｍｉＲ－７６２が挙げられるが限定されない。上皮細胞でのポリヌクレオチド発現を制御するために、任意の上皮細胞特異的なｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位が本発明のポリヌクレオチドに導入され得るかまたはそれから除去され得る。
さらに、ｍｉＲＮＡの大きいグループが胚性幹細胞において豊富であり、幹細胞自己再生ならびに神経細胞、心臓、造血細胞、皮膚細胞、骨形成細胞および筋肉細胞などの様々な細胞系列の発生および／または分化を調節する（例えば、それぞれがその全体において本明細書中で参照により組み込まれるＫｕｐｐｕｓａｍｙ ＫＴら、Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ Ｍｅｄ，２０１３，１３（５），７５７－７６４；Ｖｉｄｉｇａｌ ＪＡおよびＶｅｎｔｕｒａ Ａ，Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．２０１２，２２（５－６），４２８－４３６；Ｇｏｆｆ ＬＡら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２００９，４：ｅ７１９２；Ｍｏｒｉｎ ＲＤら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，２００８，１８，６１０－６２１；Ｙｏｏ ＪＫら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．２０１２，２１（１１），２０４９－２０５７）。胚性幹細胞において多量にあるＭｉＲＮＡとしては、ｌｅｔ－７ａ－２－３ｐ、ｌｅｔ－ａ－３ｐ、ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｌｅｔ７ｄ－３ｐ、ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１０６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１０６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２４６、ｍｉＲ－１２７５、ｍｉＲ－１３８－１－３ｐ、ｍｉＲ－１３８－２－３ｐ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－１５４－３ｐ、ｍｉＲ－１５４－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－２９０、ｍｉＲ－３０１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３０１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３０２ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３０２ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－３０２ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ｄ－３ｐ、ｍｉＲ－３０２ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ｅ、ｍｉＲ－３６７－３ｐ、ｍｉＲ－３６７－５ｐ、ｍｉＲ－３６９－３ｐ、ｍｉＲ－３６９－５ｐ、ｍｉＲ－３７０、ｍｉＲ－３７１、ｍｉＲ－３７３、ｍｉＲ－３８０－５ｐ、ｍｉＲ－４２３－３ｐ、ｍｉＲ－４２３－５ｐ、ｍｉＲ－４８６－５ｐ、ｍｉＲ－５２０ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｅ、ｍｉＲ－５４８ｆ、ｍｉＲ－５４８ｇ－３ｐ、ｍｉＲ－５
４８ｇ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｉ、ｍｉＲ－５４８ｋ、ｍｉＲ－５４８ｌ、ｍｉＲ－５４８ｍ、ｍｉＲ－５４８ｎ、ｍｉＲ－５４８ｏ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｏ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｐ、ｍｉＲ－６６４ａ－３ｐ、ｍｉＲ－６６４ａ－５ｐ、ｍｉＲ－６６４ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－６６４ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－７６６－３ｐ、ｍｉＲ－７６６－５ｐ、ｍｉＲ－８８５－３ｐ、ｍｉＲ－８８５－５ｐ、ｍｉＲ－９３－３ｐ、ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｍｉＲ－９４１、ｍｉＲ－９６－３ｐ、ｍｉＲ－９６－５ｐ、ｍｉＲ－９９ｂ－３ｐおよびｍｉＲ－９９ｂ－５ｐが挙げられるが限定されない。ヒト胚性幹細胞においてディープシーケンスによって多くの予想される新規ｍｉＲＮＡが発見される（例えば、それぞれの内容がその全体において参照により本明細書中に組み込まれるＭｏｒｉｎ ＲＤら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，２００８，１８，６１０－６２１；Ｇｏｆｆ ＬＡら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２００９，４：ｅ７１９２；Ｂａｒ Ｍら、Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，２００８，２６，２４９６－２５０５）。
ある実施形態において、胚性幹細胞の発生および／または分化を調整するために、変性状態（例えば、変性疾患）において幹細胞の老化を阻害するために、または疾患状態における幹細胞（例えば、癌幹細胞）の老化およびアポトーシスを刺激するために、胚性幹細胞特異的なｍｉＲＮＡの結合部位が本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに含まれ得るかまたはそれから除去され得る。
非限定例として、ある種の癌および／または腫瘍細胞において過剰発現されるｍｉＲＮＡに対するｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲから除去し得、癌細胞における過剰発現ｍｉＲＮＡにより抑制される発現を回復させ、このようにして対応する生物学的機能、例えば転写刺激および／または抑制、細胞周期停止、アポトーシスおよび細胞死を改善する。ｍｉＲＮＡ発現が上方制御されていない正常な細胞および組織は、影響を受けないままである。
ｍｉＲＮＡは、血管形成（例えば、ｍｉＲ－１３２）などの複雑な生物学的過程も制御し得る（ＡｎａｎｄおよびＣｈｅｒｅｓｈ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０１１ １８：１７１－１７６）。本発明のポリヌクレオチドにおいて、生物学的に関連のある細胞タイプまたは関連のある生物学的過程に対してポリヌクレオチドの発現を調整するために、このような過程に関与するｍｉＲＮＡ結合部位を除去または導入し得る。これに関連して、本発明のポリヌクレオチドは、栄養要求性ポリヌクレオチドとして定められる。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含み、このｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ結合部位配列の任意の１つ以上の１つ以上のコピーを含む、表４から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、それらの任意の組み合わせを含め、表４から選択される同じまたは異なるｍｉＲＮＡ結合部位の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超えるものをさらに含む。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１４２に結合するか、またはｍｉＲ－１４２に対して相補的である。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ－１４２は、配列番号５３９を含む。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１４２－３ｐまたはｍｉＲ－１４２－５ｐに結合する。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位は、配列番号５４１を含む。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位は、配列番号５４３を含む。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、配列番号５４１または配列番号５４３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
Figure 0007459172000009
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド中にｍｉＲＮＡ結合部位をポリヌクレオチドの何れかの位置（例えば、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲ）で挿入する。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。ポリヌクレオチドにおける挿入部位は、ポリヌクレオチドにおけるｍｉＲＮＡ結合部位の挿入が対応するｍｉＲＮＡの非存在下で機能的ポリペプチドの翻訳を妨害せず、ｍｉＲＮＡの存在下において、ポリヌクレオチドにおけるｍｉＲＮＡ結合部位の挿入および対応するｍｉＲＮＡに対するｍｉＲＮＡ結合部位の結合がポリヌクレオチドを分解するかまたはポリヌクレオチドの翻訳を妨げることが可能である限り、ポリヌクレオチドの何れの場所でもあり得る。
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ＯＲＦを含む本発明のポリヌクレオチド中のＯＲＦの終止コドンから少なくとも約３０ヌクレオチド下流に挿入される。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチド中のＯＲＦの終止コドンから少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約５５ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約６５ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約８５ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約９５ヌクレオチドまたは少なくとも約１００ヌクレオチド下流で挿入される。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチド中のＯＲＦの終止コドンから約１０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約９０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド～約８０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド～約７０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド～約６０ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド～約６５ヌクレオチド下流に挿入される。
ｍｉＲＮＡ遺伝子制御は、周囲の配列の種類、配列のタイプ（例えば、異種、相同、外因性、内在性または人工）、周囲配列における制御エレメントおよび／または周囲配列における構造エレメントなどであるが限定されないｍｉＲＮＡを取り囲む配列により影響を受け得る。ｍｉＲＮＡは、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲにより影響を受け得る。非限定例として、非ヒト３’ＵＴＲは、同じ配列タイプのヒト３’ＵＴＲと比較して、関心のあるポリペプチドの発現におけるｍｉＲＮＡ配列の制御効果を向上させ得る。
ある実施形態において、５’ＵＴＲの他の制御エレメントおよび／または構造エレメン
トは、ｍｉＲＮＡ介在性遺伝子制御に影響を与え得る。制御エレメントおよび／または構造エレメントの一例は、５’ＵＴＲにおける構造化ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）であり、これは、タンパク質翻訳を開始させるために翻訳伸長因子の結合が必要である。５’－ＵＴＲにおけるこの二次構造的構造化エレメントに対するＥＩＦ４Ａ２結合は、ｍｉＲＮＡ介在性遺伝子発現に必要である（その全体において本明細書中で参照により組み込まれるＭｅｉｊｅｒ ＨＡら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３４０，８２－８５）。本発明のポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ介在性遺伝子制御を促進するためにこの構造化５’ＵＴＲをさらに含み得る。
少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに操作し得る。これに関連して、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０またはそれを超えるｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに操作し得る。例えば、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、２または１つのｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに操作し得る。ある実施形態において、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡ結合部位は、同じであり得るかまたは異なるｍｉＲＮＡ部位であり得る。本発明のポリヌクレオチドに組み込まれる異なるｍｉＲＮＡ結合部位の組み合わせは、異なるｍｉＲＮＡ部位の何れかの複数のコピーが組み込まれる組み合わせを含み得る。別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡ結合部位は、体内の同じまたは異なる組織を標的とし得る。非限定例として、本発明のポリヌクレオチドの３’－ＵＴＲにおける組織、細胞タイプまたは疾患特異的なｍｉＲＮＡ結合部位の導入を通じて、特異的な細胞タイプ（例えば、肝細胞、骨髄細胞、内皮細胞、癌細胞など）における発現度を低下させ得る。
ある実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチド中の３’ＵＴＲの５’末端付近、３’ＵＴＲの５’末端と３’末端との間の約半分および／または３’ＵＴＲの３’末端付近に操作し得る。非限定例として、ｍｉＲＮＡ結合部位を３’ＵＴＲの５’末端付近および３’ＵＴＲの５’末端と３’末端との間の約半分で操作し得る。別の非限定例として、ｍｉＲＮＡ結合部位を３’ＵＴＲの３’末端付近および３’ＵＴＲの５’末端と３’末端との間の約半分で遺伝子操作し得る。また別の非限定例として、ｍｉＲＮＡ結合部位を３’ＵＴＲの５’末端付近および３’ＵＴＲの３’末端付近で操作し得る。
別の実施形態において、３’ＵＴＲは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡシード配列および／またはシード配列に隣接するｍｉＲＮＡ配列に対して相補的であり得る。
ある実施形態において、対象の異なる組織または異なる細胞タイプにおいて発現される複数のｍｉＲＮＡ部位を含むように本発明のポリヌクレオチドを操作し得る。非限定例として、対象の肝臓および腎臓においてポリヌクレオチドの発現を制御するためにｍｉＲ－１９２およびｍｉＲ－１２２を含むように、本発明のポリヌクレオチドを操作し得る。別の実施形態において、同じ組織に対する複数のｍｉＲＮＡ部位を含むように本発明のポリヌクレオチドを操作し得る。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド中で少なくとも１つのｍｉＲ結合部位を組み込み、投与のためにポリヌクレオチドを処方することにより、本発明のポリヌクレオチドの発現を調節し得る。非限定例として、ｍｉＲＮＡ結合部位を組み込み、明細書中に記載の脂質の何れかを含むイオン化可能脂質を含むナノ粒子中で本ポリヌクレオチドを処方することにより、本発明のポリヌクレオチドを組織または細胞に対して標的指向化し
得る。
異なる組織、細胞タイプまたは生物学的状態におけるｍｉＲＮＡの発現パターンに基づいて、特異的な組織、細胞タイプまたは生物学的状態においてより標的指向化された発現のために本発明のポリヌクレオチドを操作し得る。組織特異的なｍｉＲＮＡ結合部位の導入を通じて、組織または細胞におけるまたは生物学的状態との関連で最適なタンパク質発現のために本発明のポリヌクレオチドを設計し得る。
いくつかの実施形態において、既知のｍｉＲＮＡシード配列と１００％の同一性を有するかまたはｍｉＲＮＡシード配列に対して１００％未満の同一性を有するかの何れかであるｍｉＲＮＡ結合部位を組み込むように本発明のポリヌクレオチドを設計し得る。いくつかの実施形態において、既知のｍｉＲＮＡシード配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するｍｉＲＮＡ結合部位を組み込むように本発明のポリヌクレオチドを設計し得る。ｍｉＲＮＡ結合親和性を低下させるように、およびその結果、ポリヌクレオチドの下方調整を軽減するようにｍｉＲＮＡシード配列を部分的に突然変異させ得る。本質的に、ｍｉＲＮＡ結合部位とｍｉＲＮＡシードとの間のマッチまたはミスマッチの度合いは、タンパク質発現を調整するというｍｉＲＮＡの能力をより精密に調節するためにレオスタットとして作用し得る。さらに、ｍｉＲＮＡ結合部位の非シード領域中の突然変異は、タンパク質発現を調整するというｍｉＲＮＡの能力にも影響を及ぼし得る。
ある実施形態において、ｍｉＲＮＡ配列をステムループのループに組み込み得る。
別の実施形態において、ｍｉＲＮＡシード配列をステムループのループにおいて組み込み得、ｍｉＲＮＡ結合部位をステムループの５’または３’ステムに組み込み得る。
ある実施形態において、翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）をステムループのステムの５’末端で組み込み得、ｍｉＲＮＡシードをステムループのステムに組み込み得る。別の実施形態において、ＴＥＥをステムループのステムの５’末端において組み込み得、ｍｉＲＮＡシードをステムループのステムに組み込み得、ｍｉＲＮＡ結合部位をステムの３’末端またはステムループの後の配列に組み込み得る。ｍｉＲＮＡシードおよびｍｉＲＮＡ結合部位は、同じおよび／または異なるｍｉＲＮＡ配列に対するものであり得る。
ある実施形態において、ｍｉＲＮＡ配列および／またはＴＥＥ配列の組み込みにより、翻訳を増加および／または減少させ得るステムループ領域の形状が変化する。（例えば、その全体において参照により本明細書中に組み込まれるＫｅｄｄｅら、“Ａ Ｐｕｍｉｌｉｏ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｓｗｉｔｃｈ ｉｎ ｐ２７－３’ＵＴＲ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｍｉＲ－２２１ ａｎｄ ｍｉＲ－２２ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ．”Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１０を参照されたい）。
ある実施形態において、本発明のポリヌクレオチドの５’－ＵＴＲは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列を含み得る。ｍｉＲＮＡ配列は、１９または２２ヌクレオチド配列および／またはシードなしのｍｉＲＮＡ配列であり得るが限定されない。
ある実施形態において、本明細書中に記載の本発明のポリヌクレオチドを安定化させるために５’ＵＴＲ中のｍｉＲＮＡ配列を使用し得る。
別の実施形態において、開始コドンなどであるが限定されない翻訳開始部位の到達性を低下させるために、本発明のポリヌクレオチドの５’－ＵＴＲ中のｍｉＲＮＡ配列を使用
し得る。例えば、その全体において参照により本明細書中に組み込まれるＭａｔｓｕｄａら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１０ １１（５）：ｅ１５０５７を参照されたい。これは、最初の開始コドン（ＡＵＧ）への到達性を低下させるために、開始コドン（－４～＋３７、ＡＵＧコドンのＡが＋１である）周囲でアンチセンスロックド核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチドおよびエクソン連結複合体（ＥＪＣ）を使用した。Ｍａｔｓｕｄａは、開始コドン周囲の配列をＬＮＡまたはＥＪＣで変化させると、ポリヌクレオチドの効率、長さおよび構造安定性に影響を与えることを示した。翻訳開始部位への到達性を低下させるために、本発明のポリヌクレオチドは、翻訳開始部位の付近で、Ｍａｔｓｕｄａらにより記載されるＬＮＡまたはＥＪＣ配列の代わりにｍｉＲＮＡ配列を含み得る。翻訳開始部位は、ｍｉＲＮＡ配列の前、その後またはその内部であり得る。非限定例として、翻訳開始部位は、シード配列または結合部位など、ｍｉＲＮＡ配列内に配置され得る。別の非限定例として、翻訳開始部位は、シード配列またはｍｉｒ－１２２結合部位など、ｍｉＲ－１２２配列内に配置され得る。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、抗原提示細胞による抗原提示を弱めるために少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含み得る。ｍｉＲＮＡは、完全なｍｉＲＮＡ配列、ｍｉＲＮＡシード配列、シードなしのｍｉＲＮＡ配列またはそれらの組み合わせであり得る。非限定例として、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡは、造血系に特異的であり得る。別の非限定例として、抗原提示を弱めるための本発明のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１４２－３ｐである。
いくつかの実施形態において、関心のある組織または細胞におけるコードされるポリペプチドの発現を弱めるために、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含み得る。非限定例として、肝臓におけるコードされる関心のあるポリペプチドの発現を弱めるために、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１つのｍｉＲ－１２２結合部位を含み得る。別の非限定例として、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－３ｐシード配列、シードなしのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－５ｐシード配列、シードなしのｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４６結合部位、ｍｉＲ－１４６シード配列および／またはシード配列なしのｍｉＲ－１４６結合部位を含み得る。
いくつかの実施形態において、免疫細胞においてｍＲＮＡ治療薬を選択的に分解させて、治療薬送達により引き起こされる不要な免疫原性反応を抑止するために、本発明のポリヌクレオチドは、３’ＵＴＲにおいて少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。非限定例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、抗原提示細胞において本発明のポリヌクレオチドをより不安定にし得る。これらのｍｉＲＮＡの非限定例としては、ｍｉｒ－１４２－５ｐ、ｍｉｒ－１４２－３ｐ、ｍｉｒ－１４６ａ－５ｐおよびｍｉｒ－１４６－３ｐが挙げられる。
ある実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ結合タンパク質と相互作用し得るポリヌクレオチドの領域において少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）は、（ｉ）野生型リラキシンポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）と、（ｉｉ）ｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位）とを含む。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書中で開示されるリラキシンポリペプチドをコードするウラシル修飾配列および本明細書中で開示されるｍｉＲＮＡ結合部位、例えばｍｉＲ－１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつ
かの実施形態において、リラキシンポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基、例えば５－メトキシウラシルを含む。いくつかの実施形態において、本発明のリラキシンポリペプチドをコードするウラシル修飾配列における核酸塩基のタイプ（例えば、ウラシル）の少なくとも９５％が修飾核酸塩基である。いくつかの実施形態において、リラキシンポリペプチドをコードするウラシル修飾配列中のウラシルの少なくとも９５％が５－メトキシウリジンである。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、本明細書中で開示されるリラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ｍｉＲＮＡ結合部位は、送達剤、例えば式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）または（ＩＩｅ）を有する脂質、例えば化合物１～２３２の何れかの脂質を含むＬＮＰとともに処方される。
３’ＵＴＲ
特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、本発明のリラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、３’ＵＴＲをさらに含む。
３’－ＵＴＲは、翻訳終結コドンの直後にあり、転写後に遺伝子発現に影響を与える制御領域を含有することが多いｍＲＮＡのセクションである。３’－ＵＴＲ内の制御領域は、ポリアデニル化、翻訳効率、局在化およびｍＲＮＡの安定性に影響を与え得る。ある実施形態において、本発明に有用な３’－ＵＴＲは、制御タンパク質またはマイクロＲＮＡに対する結合部位を含む。
５’キャップを有する領域
本発明は、５’キャップおよび本発明のポリヌクレオチド（例えば、リラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含むポリヌクレオチドも含む。
天然ｍＲＮＡの５’キャップ構造は、ｍＲＮＡ安定性を向上させる核外輸送に関与し、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合し、これは、成熟環状ｍＲＮＡ種を形成させるためのポリ（Ａ）結合タンパク質とのＣＢＰの会合を通じて細胞および翻訳適格性におけるｍＲＮＡ安定性に寄与する。このキャップは、ｍＲＮＡスプライシング中の５’近位イントロンの除去をさらに支援する。
内在ｍＲＮＡ分子は、５’末端キャップ付加され得、ｍＲＮＡ分子の末端のグアノシンキャップ残基と５’末端転写センスヌクレオチドとの間に５’－ｐｐｐ－５’－三リン酸結合を生成させる。次に、この５’－グアニル酸キャップがメチル化されて、Ｎ７－メチル－グアニル酸残基が生成され得る。ｍＲＮＡの５’末端の末端および／または末端前転写ヌクレオチドのリボース糖も任意選択により２’－Ｏ－メチル化され得る。グアニル酸キャップ構造の加水分解および切断を通じた５’－キャップ除去は、分解のためにｍＲＮＡ分子などの核酸分子を標的とし得る。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、リラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、キャップ部分を組み込む。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、リラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、キャップ除去を防ぎ、したがってｍＲＮＡ半減期を延長させる非加水分解性キャップ構造を含む。キャップ構造加水分解は、５’－ｐｐｐ－５’ホスホロジエステル結合の切断を必要とするため、キ
ャップ付加反応中に修飾ヌクレオチドを使用し得る。例えば、５’－ｐｐｐ－５’キャップにおいてホスホロチオエート結合を生成させるために、製造者の説明書に従い、α－チオ－グアノシンヌクレオチドとともに、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）からのワクシニアキャップ付加酵素を使用し得る。α－メチル－ホスホネートおよびセレノ－ホスフェートヌクレオチドなど、さらなる修飾グアノシンヌクレオチドを使用し得る。
さらなる修飾としては、糖環の２’－ヒドロキシル基上のポリヌクレオチド（上述のような）の５’末端および／または５’末端前ヌクレオチドのリボース糖の２’－Ｏ－メチル化が挙げられるが限定されない。ｍＲＮＡ分子として機能するポリヌクレオチドなど、核酸分子の５’－キャップを生成させるために、複数の別個の５’－キャップ構造を使用し得る。本明細書中で合成キャップ類似体、化学的キャップ、化学的キャップ類似体または構造もしくは機能的キャップ類似体とも呼ばれるキャップ類似体は、キャップ機能を保持する一方、それらの化学構造において天然（すなわち内在性、野生型または生理的）５’－キャップと異なる。キャップ類似体を化学的（すなわち非酵素的）または酵素的に合成し、および／または本発明のポリヌクレオチドに連結し得る。
例えば、抗リバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）キャップは、５’－５’－三リン酸基により連結される２つのグアニンを含有し、１つのグアニンがＮ７メチル基ならびに３’－Ｏ－メチル基を含有する（すなわちＮ７，３’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－三リン酸－５’－グアノシン（ｍ７Ｇ－３’ｍｐｐｐ－Ｇ；３’Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇと同様に名付けられ得る。他方の未修飾のグアニンの３’－Ｏ原子は、キャップ付きポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに連結されるようになる。Ｎ７－および３’－Ｏ－メチル化グアニンは、キャップ付きポリヌクレオチドの末端部分を提供する。
別の代表的なキャップは、ｍＣＡＰであり、ＡＲＣＡと同様であるが、グアノシン上に２’－Ｏ－メチル基を有する（すなわちＮ７，２’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－三リン酸－５’－グアノシン、ｍ７Ｇｍ－ｐｐｐ－Ｇ）。
いくつかの実施形態において、キャップは、ジヌクレオチドキャップ類似体である。非限定例として、異なるリン酸の位置でジヌクレオチドキャップ類似体は、その内容がその全体において本明細書中で参照により組み込まれる米国特許第８，５１９，１１０号明細書に記載のジヌクレオチドキャップ類似体など、ボラノリン酸基またはホスホロセレノエート基で修飾され得る。
別の実施形態において、キャップは、キャップ類似体であり、当技術分野で公知のおよび／または本明細書中に記載のキャップ類似体のＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）置換ジククレオチド形態である。キャップ類似体のＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）置換ジククレオチド形態の非限定例としては、Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）－Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＧおよびＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）－ｍ３’－ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体（例えば、その内容がその全体において本明細書中で参照により組み込まれるＫｏｒｅら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１３ ２１：４５７０－４５７４に記載の様々なキャップ類似体およびキャップ類似体合成方法を参照されたい）が挙げられる。別の実施形態において、本発明のキャップ類似体は、４－クロロ／ブロモフェノキシエチル類似体である。
インビトロ転写反応においてキャップ類似体がポリヌクレオチドまたはその領域の同時キャップ付加を可能にする一方、最大で転写物の２０％までキャップがないままにし得る
。これおよび内在性の細胞転写機構により生成される核酸の内在性５’－キャップ構造とのキャップ類似体の構造的な相違は、翻訳適格性の低下および細胞安定性低下につながり得る。
本発明のポリヌクレオチド（例えば、リラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、より真正の５’－キャップ構造を生成させるために、酵素を使用して製造後（ＩＶＴまたは化学合成の何れか）にもキャップ付加され得る。本明細書中で使用される場合、「より真正」という句は、内在性または野生型の特性と、構造的または機能的の何れかで酷似しているか、またはそれを模倣する特性を指す。すなわち、「より真正の」特性は、先行技術の合成特性または類似体などと比較した場合、内在性、野生型、天然または生理的細胞機能および／または構造のより良好な代表であるか、または１つ以上の点について対応する内在性、野生型、天然または生理的特性よりも優れている。本発明のより真正の５’キャップ構造の非限定例は、とりわけ当技術分野で公知の合成５’キャップ構造と（または野生型、天然または生理的５’キャップ構造と）比較した場合、キャップ結合タンパク質の結合が促進され、半減期が延長し、５’エンドヌクレアーゼに対する感受性が低下し、および／または５’キャップ除去が減少しているものである。例えば、組み換えワクシニアウイルスキャップ付加酵素および組み換え２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ酵素は、ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドとグアニンキャップヌクレオチドとの間で標準の５’－５’－三リン酸結合を生成させ得、キャップグアニンは、Ｎ７メチル化を含有し、ｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルを含有する。このような構造は、Ｃａｐ１構造と呼ばれる。このキャップの結果、例えば当技術分野で公知の他の５’キャップ類似体構造と比較した場合、翻訳適格性および細胞安定性がより高くなり、細胞性炎症促進性サイトカインの活性化が抑制される。キャップ構造としては、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ、ｐＮ２ｐ（キャップ０）、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ（キャップ１）および７ｍＧ（５’）－ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ｍｐ（キャップ２）が挙げられるが限定されない。
非限定例として、製造後のキャップ付加キメラポリヌクレオチドは、キメラポリヌクレオチドのほぼ１００％がキャップ付加され得るため、より効率的であり得る。対照的に、一連のインビトロ転写反応においてキメラポリヌクレオチドにキャップ類似体が連結される場合、これは、約８０％である。
本発明によれば、５’末端キャップは、内在性キャップまたはキャップ類似体を含み得る。本発明によれば、５’末端キャップは、グアニン類似体を含み得る。有用なグアニン類似体としては、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシンおよび２－アジド－グアノシンが挙げられるが限定されない。
ポリＡテール
いくつかの実施形態において、本開示のポリヌクレオチド（例えば、リラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、ポリＡテールをさらに含む。さらなる実施形態において、ポリＡテール上の末端基が安定性のために組み込まれ得る。他の実施形態において、ポリＡテールは、デス－３’ヒドロキシルテールを含む。
ＲＮＡプロセシング中に、安定性を向上させるために、ｍＲＮＡ分子などのポリヌクレオチドに、アデニンヌクレオチドの長鎖（ポリＡテール）を添加し得る。転写直後に３’ヒドロキシルを遊離させるために転写物の３’末端を切断し得る。次いで、ポリＡポリメラーゼは、アデニンヌクレオチドの鎖をＲＮＡに付加する。ポリアデニル化と呼ばれる過程は、例えば、およそ８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、
１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０または２５０残基長を含め、およそ８０～およそ２５０残基長であり得るポリＡテールを付加する。
ポリＡテールは、コンストラクトが核から輸出された後にも付加され得る。
本発明によれば、安定性のためにポリＡテール上の末端基が組み込まれ得る。本発明のポリヌクレオチドは、デス－３’ヒドロキシルテールを含み得る。これらは、Ｊｕｎｊｉｅ Ｌｉら（その内容がその全体において参照により本明細書中に組み込まれるＣｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５，１５０１－１５０７，Ａｕｇｕｓｔ ２３，２００５）により教示されるような構造部分または２’－Ｏメチル修飾も含み得る。
ヒストンｍＲＮＡを含め、代替的ポリＡテール構造付きで転写物をコードさせるように本発明のポリヌクレオチドを設計し得る。Ｎｏｒｂｕｒｙによれば、「ヒト複製依存的ヒストンｍＲＮＡにおいて末端ウリジル化も検出された。染色体ＤＮＡ複製の達成または阻害後、これらのｍＲＮＡの代謝回転は、毒性の可能性があるヒストン蓄積の予防に重要であると考えられる。これらのｍＲＮＡは、それらの３’ポリ（Ａ）テールの欠如により区別され、その機能は、代わりに安定したステムループ構造およびその同族のステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）により想定され、後者は、ポリアデニル化ｍＲＮＡ上でのＰＡＢＰと同じ機能を果たす」（それらの内容がその全体において参照により本明細書中に組み込まれるＮｏｒｂｕｒｙ，“Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ＲＮＡ：ａ ｃａｓｅ ｏｆ
ｔｈｅ ｔａｉｌ ｗａｇｇｉｎｇ ｔｈｅ ｄｏｇ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ；ＡＯＰ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２９ Ａｕｇｕｓｔ ２０１３；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍ３６４５）。
ユニークなポリＡテール長は、本発明のポリヌクレオチドに対してある種の長所を提供する。一般に、ポリＡテールの長さは、存在する場合、３０ヌクレオチド長よりも長い。別の実施形態において、ポリＡテールは、３５ヌクレオチド長よりも長い（例えば、少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００および３，０００ヌクレオチドまたはそれを超える）。
いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドまたはその領域は、約３０～約３，０００のヌクレオチド（例えば、３０～５０、３０～１００、３０～２５０、３０～５００、３０～７５０、３０～１，０００、３０～１，５００、３０～２，０００、３０～２，５００、５０～１００、５０～２５０、５０～５００、５０～７５０、５０～１，０００、５０～１，５００、５０～２，０００、５０～２，５００、５０～３，０００、１００～５００、１００～７５０、１００～１，０００、１００～１，５００、１００～２，０００、１００～２，５００、１００～３，０００、５００～７５０、５００～１，０００、５００～１，５００、５００～２，０００、５００～２，５００、５００～３，０００、１，０００～１，５００、１，０００～２，０００、１，０００～２，５００、１，０００～３，０００、１，５００～２，０００、１，５００～２，５００、１，５００～３，０００、２，０００～３，０００、２，０００～２，５００および２，５００～３，０００）を含む。
いくつかの実施形態において、全体的なポリヌクレオチドの長さまたはポリヌクレオチドの特定領域の長さに対してポリＡテールを設計する。この設計は、コード領域の長さ、特定の特性もしくは領域の長さに基づき得るか、またはポリヌクレオチドから発現される
最終生成物の長さに基づき得る。
これに関連して、ポリＡテールは、ポリヌクレオチドまたはその特性よりも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％超えて長いものであり得る。ポリＡテールは、それが属するポリヌクレオチドのごく一部としても設計され得る。これに関連して、ポリＡテールは、コンストラクトの全長、コンストラクト領域またはコンストラクトの全長－ポリＡテールの１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％以上であり得る。さらに、ポリＡ結合タンパク質に対するポリヌクレオチドの遺伝子操作した結合部位および抱合反応は、発現を促進し得る。
さらに、ポリＡテールの３’末端で、修飾ヌクレオチドを使用して、３’末端を通じてＰＡＢＰ（ポリＡ結合タンパク質）を介して複数の別個のポリヌクレオチドを一緒に連結し得る。トランスフェクションから１２時間、２４時間、４８時間、７２時間および７日後に関連性のある細胞株においてトランスフェクション実験を行い得、ＥＬＩＳＡによりタンパク質産生をアッセイし得る。
いくつかの実施形態において、ポリＡ－Ｇカルテット領域を含むように本発明のポリヌクレオチドを設計する。Ｇ－カルテットは、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方におけるＧ－リッチ配列によって形成され得る４つのグアニンヌクレオチドの環状水素結合アレイである。この実施形態において、ポリＡテールの末端でＧ－カルテットが組み込まれる。得られるポリヌクレオチドを安定性、タンパク質産生および様々な時間点での半減期を含む他のパラメーターについてアッセイする。ポリＡ－Ｇカルテットにより、１２０ヌクレオチドのポリＡテールのみを使用して見られるものの、少なくとも７５％と等しいｍＲＮＡからのタンパク質産生が起こることを発見した。
開始コドン領域
本発明は、開始コドン領域および本明細書中に記載のポリヌクレオチド（例えば、リラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含むポリヌクレオチドも含む。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、開始コドン領域と類似するかまたは開始コドン領域のように機能する領域を有し得る。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの翻訳は、開始コドンＡＵＧではないコドンで開始し得る。ポリヌクレオチドの翻訳は、ＡＣＧ、ＡＧＧ、ＡＡＧ、ＣＴＧ／ＣＵＧ、ＧＴＧ／ＧＵＧ、ＡＴＡ／ＡＵＡ、ＡＴＴ／ＡＵＵ、ＴＴＧ／ＵＵＧなどであるが限定されない代替的開始コドンで開始し得る（そのそれぞれの内容がその全体において本明細書中で参照により組み込まれるＴｏｕｒｉｏｌら、Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ ９５（２００３）１６９－１７８およびＭａｔｓｕｄａおよびＭａｕｒｏ ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１を参照されたい）。
非限定例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替的開始コドンＡＣＧで開始する。別の非限定例として、ポリヌクレオチド翻訳は、代替的開始コドンＣＴＧまたはＣＵＧで開始する。また別の非限定例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替的開始コドンＧＴＧまたはＧＵＧで開始する。
開始コドンまたは代替的開始コドンなどであるが限定されない翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチドは、翻訳効率、ポリヌクレオチドの長さおよび／または構造に影響を与えることが知られている（例えば、その内容がその全体において本明細書中で参照により組み込まれるＭａｔｓｕｄａおよびＭａｕｒｏ ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１を参照されたい）。翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチドの何れかの遮蔽は、翻訳開始位置、翻訳効率、ポリヌクレオチドの長さおよび／または構造を変化させるために使用され得る。
いくつかの実施形態において、コドンを遮蔽するかまたは隠して、遮蔽開始コドンまたは代替的開始コドンでの翻訳開始の可能性を低下させるために、開始コドンまたは代替的開始コドン付近で遮蔽剤を使用し得る。遮蔽剤の非限定例としては、アンチセンスロックド核酸（ＬＮＡ）ポリヌクレオチドおよびエクソン連結複合体（ＥＪＣ）が挙げられる。（例えば、その内容がその全体において本明細書中で参照により組み込まれる、遮蔽剤ＬＮＡポリヌクレオチドおよびＥＪＣを記載するＭａｔｓｕｄａおよびＭａｕｒｏ（ＰＬｏＳ ＯＮＥ、２０１０ ５：１１）を参照されたい）。
別の実施形態において、代替的開始コドンで翻訳が開始される可能性を上昇させるために、遮蔽剤を使用してポリヌクレオチドの開始コドンを遮蔽し得る。いくつかの実施形態において、遮蔽された開始コドンまたは代替的開始コドンの下流の開始コドンまたは代替的開始コドンで翻訳が開始される機会を増加させるために、遮蔽剤を使用して第１の開始コドンまたは代替的開始コドンを遮蔽し得る。
いくつかの実施形態において、開始コドンまたは代替的開始コドンは、ｍｉＲ結合部位に対する完全な相補体内に配置され得る。ｍｉＲ結合部位の完全な相補体は、遮蔽剤と同様に、ポリヌクレオチドの翻訳、長さおよび／または構造の調節を促進し得る。非限定例として、開始コドンまたは代替的開始コドンは、ｍｉＲＮＡ結合部位に対する完全な相補体の中央に配置され得る。開始コドンまたは代替的開始コドンは、第１のヌクレオチド、第２のヌクレオチド、第３のヌクレオチド、第４のヌクレオチド、第５のヌクレオチド、第６のヌクレオチド、第７のヌクレオチド、第８のヌクレオチド、第９のヌクレオチド、第１０のヌクレオチド、第１１のヌクレオチド、第１２のヌクレオチド、第１３のヌクレオチド、第１４のヌクレオチド、第１５のヌクレオチド、第１６のヌクレオチド、第１７のヌクレオチド、第１８のヌクレオチド、第１９のヌクレオチド、第２０のヌクレオチドまたは第２１のヌクレオチドの後に配置され得る。
別の実施形態において、開始コドンではないコドンにおいてポリヌクレオチドの翻訳を開始させるために、ポリヌクレオチドの開始コドンをポリヌクレオチド配列から除去し得る。ポリヌクレオチドの翻訳は、除去した開始コドンの後のコドンにおいてまたは開始コドンもしくは代替的開始コドンの下流で開始され得る。非限定例において、開始コドンまたは代替的開始コドンの下流で翻訳を開始させるために、ポリヌクレオチド配列の最初の３ヌクレオチドとしての開始コドンＡＴＧまたはＡＵＧを除去する。翻訳開始、ポリヌクレオチドの長さおよび／またはポリヌクレオチドの構造を調節するかまたは調節を試みるために、開始コドンが除去されたポリヌクレオチド配列は、下流の開始コドンおよび／または代替的開始コドンに対する少なくとも１つの遮蔽剤をさらに含み得る。
終止コドン領域
本発明は、終止コドン領域および本明細書中に記載のポリヌクレオチド（例えば、リラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含むポリヌクレオチドも含む。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の前に少なくとも２つの終止コドンを含み得る。終止コドンは、ＤＮＡの場合にはＴＧＡ、ＴＡＡおよびＴＡＧから、またはＲＮＡの場合にはＵＧＡ、ＵＡＡおよびＵＡＧから選択され得る。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡの場合には終止コドンＴＧＡまたはＲＮＡの場合には終止コドンＵＧＡおよび１つのさらなる終止コドンを含む。さらなる実施形態において、さらなる終止コドンは、ＴＡＡまたはＵＡＡであり得る。別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、３つの連続終止コドン、４つの終止コドンまたはそれを超える終止コドンを含む。
挿入および置換
本発明は、挿入および／または置換をさらに含む本開示のポリヌクレオチドも含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、少なくとも１つの領域および／または同じ塩基のヌクレオシドのストリングの挿入によって置き換えられ得る。ヌクレオチドの領域および／またはストリングは、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つまたは少なくとも８つのヌクレオチドを含み得るが限定されず、ヌクレオチドは、天然および／または非天然であり得る。非限定例として、ヌクレオチドの基は、５～８つのアデニン、シトシン、チミン、本明細書中で開示される他のヌクレオチドの何れかのストリングおよび／またはそれらの組み合わせを含み得る。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、アデニン、シトシン、チミン、本明細書中で開示される他のヌクレオチドの何れかおよび／またはそれらの組み合わせなどであるが限定されない２つの異なる塩基のヌクレオチドの少なくとも２つの領域および／またはストリングの挿入によって置き換えられ得る。例えば、５’ＵＴＲは、５～８つのアデニン塩基を挿入し、続いて５～８つのシトシン塩基を挿入することによって置き換えられ得る。別の例において、５’ＵＴＲは、５～８つのシトシン塩基を挿入し、続いて５～８つのアデニン塩基を挿入することによって置き換えられ得る。
いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼによって認識され得る転写開始部位の下流に少なくとも１つの置換および／または挿入を含み得る。非限定例として、少なくとも１つの置換および／または挿入は、転写開始部位の直接下流（＋１～＋６などであるが限定されない）の領域において少なくとも１つの核酸を置換することにより、転写開始部位の下流で生じ得る。転写開始部位の直接下流のヌクレオチドの領域に対する変化は、開始率に影響を与え、見かけのヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）反応定数の値を上昇させ、初期の転写中に転写複合体からの短い転写物の解離を増加させ得る（その全体において本明細書中で参照により組み込まれるＢｒｉｅｂａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２）４１：５１４４－５１４９）。少なくとも１つのヌクレオシドの修飾、置換および／または挿入は、配列のサイレント突然変異を引き起こし得るか、またはアミノ酸配列における突然変異を引き起こし得る。
いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、転写開始部位の下流に少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２または少なくとも１３のグアニン塩基の置換を含み得る。
いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、転写開始部位のちょうど下流の領域において少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５または少なくとも６つのグアニン塩基の置換を含み得る。非限定例として、その領域中のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡである場合、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３または少なくとも４つのアデニンヌクレオチドによってグアニン塩基が置換され得る。別の非限定例において、その領域のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡである場合、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３または少なくとも４つのシトシン塩基によってグアニン塩基を置換し得る。別の非限定例において、その領域のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡである場合、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３または少なくとも４つのチミン、および／または本明細書中に記載のヌクレオチドの何れかにより、グアニン塩基を置換し得る。
いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、開始コドンの上流に少なくとも
１つの置換および／または挿入を含み得る。明確にするために、当業者にとって当然のことながら、開始コドンは、タンパク質コード領域の最初のコドンである一方、転写開始部位は、転写が開始される部位である。本ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド塩基の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７または少なくとも８つの置換および／または挿入を含み得るが限定されない。ヌクレオチド塩基は、開始コドンの上流で１か所、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４または少なくとも５か所の位置で挿入または置換され得る。挿入および／または置換されるヌクレオチドは、同じ塩基（例えば、全てＡまたは全てＣまたは全てＴまたは全てＧ）、２つの異なる塩基（例えば、ＡおよびＣ、ＡおよびＴまたはＣおよびＴ）、３つの異なる塩基（例えば、Ａ、ＣおよびＴまたはＡ、ＣおよびＴ）または少なくとも４つの異なる塩基であり得る。
非限定例として、ポリヌクレオチドにおけるコード領域の上流のグアニン塩基がアデニン、シトシン、チミンまたは本明細書中に記載のヌクレオチドの何れかで置換され得る。別の非限定例において、ポリヌクレオチドにおけるグアニン塩基の置換は、１つのグアニン塩基が転写開始部位の下流および開始コドンの前の領域に残るように設計され得る（その内容がその全体において本明細書中で参照により組み込まれるＥｓｖｅｌｔら、Ｎａｔｕｒｅ（２０１１）４７２（７３４４）：４９９－５０３を参照されたい）。非限定例として、転写開始部位の下流であるが、開始コドンの上流の１つの位置に少なくとも５つのヌクレオチドを挿入し得、少なくとも５つのヌクレオチドが同じ塩基タイプであり得る。
リラキシンポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含むポリヌクレオチド
特定の実施形態において、本開示のポリヌクレオチド、例えばリラキシンポリペプチドをコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、５’から３’末端に次のものを含む：
（ｉ）上記で提供される５’キャップ、
（ｉｉ）５’ＵＴＲ、例えば上記で提供される配列など、
（ｉｉｉ）リラキシンポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、例えば本明細書中で開示されるリラキシンポリペプチドをコードする配列最適化される核酸配列、
（ｉｖ）少なくとも１つの終止コドン、
（ｖ）３’ＵＴＲ、例えば上記で提供される配列など、および
（ｖｉ）上記で提供されるポリＡテール。
いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えばｍｉＲＮＡ－１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
いくつかの実施形態において、本開示のポリヌクレオチドは、野生型リラキシンタンパク質のタンパク質配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
ポリヌクレオチドを作製する方法
本開示は、本発明のポリヌクレオチド（例えば、リラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）またはその相補体を作製するための方法も提供する。
いくつかの態様において、インビトロ転写を用いて、本明細書中で開示され、リラキシンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）を構築し得る。他の態様において、オリゴヌクレオチド合成装置を用いた化学合成により、本明細書中で開示され、リラキシンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）を構築し得る。
他の態様において、宿主細胞を使用することにより、本明細書中で開示され、リラキシンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）を作製する。特定の態様において、ＩＶＴ、化学合成、宿主細胞発現または当技術分野で公知の任意の他の方法の１つ以上の組み合わせにより、本明細書中で開示され、リラキシンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）を作製する。
天然のヌクレオシド、非天然のヌクレオシドまたはそれらの組み合わせは、完全にまたは部分的に天然に、候補ヌクレオチド配列中に存在する生じるヌクレオシドを置き換え、リラキシンポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）に組み込まれ得る。次に、タンパク質を作製させかつ／またはリラキシンという成果を作製させるその能力について、得られるポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡを調べ得る。
ａ．インビトロ転写／酵素による合成
本明細書中で開示される本発明のポリヌクレオチド（例えば、リラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、インビトロ転写（ＩＶＴ）系を用いて転写され得る。この系は、一般的に転写緩衝液、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、ＲＮａｓｅ阻害剤およびポリメラーゼを含む。ＮＴＰは、天然および非天然（修飾）ＮＴＰを含む本明細書中に記載のものから選択され得るが限定されない。ポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、および本明細書中で開示されるポリヌクレオチドを組み込み可能であるポリメラーゼなどであるが限定されない突然変異体ポリメラーゼから選択され得るが限定されない。その全体において本明細書中で参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０１３０２５９９２３号明細書を参照されたい。
本発明のポリヌクレオチドの合成においてあらゆる数のＲＮＡポリメラーゼまたは変異体を使用し得る。ＲＮＡポリメラーゼ配列のアミノ酸を挿入するかまたは欠失させることにより、ＲＮＡポリメラーゼを修飾し得る。非限定例として、未修飾ＲＮＡポリメラーゼと比較した場合の２’－修飾ヌクレオチド三リン酸を組み込む能力の向上を示すために、ＲＮＡポリメラーゼを修飾し得る（それらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第２００８０７８１８０号パンフレットおよび米国特許第８，１０１，３８５号明細書を参照されたい）。
ＲＮＡポリメラーゼを進化させ、ＲＮＡポリメラーゼアミノ酸および／または核酸配列を最適化することにより、および／または当技術分野で公知の他の方法を使用することにより変異体を得ることができる。非限定例として、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのクローンが、位置９３のリジンのスレオニンに対する置換（Ｋ９３Ｔ）、Ｉ４Ｍ、Ａ７Ｔ、Ｅ６３Ｖ、Ｖ６４Ｄ、Ａ６５Ｅ、Ｄ６６Ｙ、Ｔ７６Ｎ、Ｃ１２５Ｒ、Ｓ１２８Ｒ、Ａ１３６Ｔ、Ｎ１６５Ｓ、Ｇ１７５Ｒ、Ｈ１７６Ｌ、Ｙ１７８Ｈ、Ｆ１８２Ｌ、Ｌ１９６Ｆ、Ｇ１９８Ｖ、Ｄ２０８Ｙ、Ｅ２２２Ｋ、Ｓ２２８Ａ、Ｑ２３９Ｒ、Ｔ２４３Ｎ、Ｇ２５９Ｄ、Ｍ２６７Ｉ、Ｇ２８０Ｃ、Ｈ３００Ｒ、Ｄ３５１Ａ、Ａ３５４Ｓ、Ｅ３５６Ｄ、Ｌ３６０Ｐ、Ａ３８３Ｖ、Ｙ３８５Ｃ、Ｄ３８８Ｙ、Ｓ３９７Ｒ、Ｍ４０１Ｔ、Ｎ４１０Ｓ、Ｋ４５０Ｒ、Ｐ４５１Ｔ、Ｇ４５２Ｖ、Ｅ４８４Ａ、Ｈ５２３Ｌ、Ｈ５２４Ｎ、Ｇ５４２Ｖ、Ｅ５６５Ｋ、Ｋ５７７Ｅ、Ｋ５７７Ｍ、Ｎ６０１Ｓ、Ｓ６８４Ｙ、Ｌ６９９Ｉ、Ｋ７１３Ｅ、Ｎ７４８Ｄ、Ｑ７５４Ｒ、Ｅ７７５Ｋ、Ａ８２７Ｖ、Ｄ８５１ＮまたはＬ８６４Ｆなどであるが限定されない少なくとも１つの突然変異をコードし得る、Ｅｓｖｅｌｔらにより設定される連続的な直接的進化系（その全体において本明細書中で参照により組み込まれるＮａｔｕｒｅ ４７２：４９９－５０３（２０１１））を使用することにより、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ変異体を進化させ得る。別の非限定例として、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、それらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第２０１００１２００２４号明細書および同第２００７０１１７１１２号明細書に記載のような少なくとも突然変異をコードし得る。ＲＮＡポリメラーゼの変異体としては、置換変異体、保存的アミノ酸置換、挿入変異体、欠失変異体および／または共有結合誘導体も挙げられ得るが限定されない。
ある態様において、野生型または変異体ＲＮＡポリメラーゼにより認識させるようにポリヌクレオチドが設計され得る。このようにすることにおいて、野生型または親キメラポリヌクレオチドからの配列変化の部位または領域を含有させるようにポリヌクレオチドを修飾し得る。
ポリメラーゼを利用する酵素による方法により、ポリヌクレオチドまたは核酸合成反応を行い得る。ポリメラーゼは、ポリヌクレオチドまたは核酸鎖中のヌクレオチド間のホスホジエステル結合の生成を触媒する。現在知られているＤＮＡポリメラーゼは、アミノ酸配列比較および結晶構造分析に基づいて異なるファミリーに分類され得る。ＤＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ Ｉ）または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＫｌｅｎｏｗ断片、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、サーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ７ ＲＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼを含むポリメラーゼファミリーは、とりわけこれらのファミリーの中で最もよく研究されている。別の大きいファミリーは、ＤＮＡポリメラーゼα（ｐｏｌα）またはＢポリメラーゼファミリーであり、全ての真核複製ＤＮＡポリメラーゼおよびファージＴ４およびＲＢ６９からのポリメラーゼを含む。それらが同様の触媒機序を使用するものの、ポリメラーゼのこれらのファミリーは、基質特異性、基質類似体組み込み効率、プライマー伸長の度合いおよび速度、ＤＮＡ合成方式、エクソヌクレアーゼ活性および阻害剤に対する感度が異なる。
ＤＮＡポリメラーゼはまた、それらが必要とする最適反応条件、例えば反応温度、ｐＨおよび鋳型およびプライマー濃度に基づいて選択される。所望のＤＮＡ断片サイズおよび合成効率を達成するために、複数のＤＮＡポリメラーゼの組み合わせが使用されることがある。例えば、Ｃｈｅｎｇらは、ｐＨを上昇させ、グリセロールおよびジメチルスルホキシドを添加し、変性時間を短縮し、伸長時間を延長し、クローニングした挿入物およびヒトゲノムＤＮＡから効率的に長い標的を増幅するために３’から５’エクソヌクレアーゼ活性を保持する二次的な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを利用する。（それらの内容がそれらの全体において参照により本明細書中に組み込まれるＣｈｅｎｇら、ＰＮＡＳ ９１：５６９５－５６９９（１９９４））。生化学および生物物理学研究用にＲＮＡを調製するために、バクテリオファージＴ３、Ｔ７およびＳＰ６からのＲＮＡポリメラーゼが広く使用されている。ＲＮＡポリメラーゼ、キャップ付加酵素およびポリＡポリメラーゼは、それらの内容がそれらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる同時係属中の国際公開第２０１４０２８４２９号パンフレットにおいて開示される。
ある態様において、本発明のポリヌクレオチドの合成において使用され得るＲＮＡポリメラーゼは、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼである（その全体において本明細書中で参照により組み込まれるＺｈｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１
３，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１１９３を参照されたい）。Ｚｈｕらにより、海洋シアノファージＳｙｎ５からＳｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼの特徴が最近分かり、Ｚｈｕらは、プロモーター配列も同定した（その内容がその全体において本明細書中で参照により組み込まれるＺｈｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１３を参照されたい）。Ｚｈｕらは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと比較した場合により広い範囲の温度および塩分にわたり、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡ合成を触媒したことを見出した。さらに、プロモーターでの開始ヌクレオチドに対する要件が、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと比較してＳｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼの場合にはあまり厳しくないことが分かり、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡ合成に有望なものとなった。
ある態様において、本明細書中に記載のポリヌクレオチドの合成においてＳｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼを使用し得る。非限定例として、正確な３’末端を必要とするポリヌクレオチドの合成においてＳｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼを使用し得る。
ある態様において、ポリヌクレオチドの合成においてＳｙｎ５プロモーターを使用し得る。非限定例として、Ｓｙｎ５プロモーターは、Ｚｈｕら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３）により記載のような５’－ＡＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＧＴＡＡＧＧＧ－３’（配列番号５４４）であり得る。
ある態様において、本明細書中に記載のおよび／または当技術分野で公知の少なくとも１つの化学的修飾を含むポリヌクレオチドの合成においてＳｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼを使用し得る（例えば、Ｚｈｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３に記載のシュード－ＵＴＰおよび５Ｍｅ－ＣＴＰの組み込みを参照されたい）。
ある態様において、Ｚｈｕら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３）により記載の、改変し改善された精製手順を使用して精製されたＳｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼを使用して、本明細書中に記載のポリヌクレオチドを合成し得る。
遺伝子操作における様々なツールは、鋳型として働く標的遺伝子の酵素による増幅に基づく。関心のある個別の遺伝子または特異的な領域の配列の研究および他の研究ニーズのために、ポリヌクレオチドまたは核酸の小さい試料から複数のコピーの標的遺伝子を生成させることが必要である。本発明のポリヌクレオチドの製造においてこのような方法を適用し得る。
例えば、本発明のポリヌクレオチドの１つ以上の領域の作製において、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写介在性増幅（ＴＭＡ）とも呼ばれる核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）およびローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を利用し得る。
リガーゼによりポリヌクレオチドまたは核酸を構築することも広く使用される。ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼは、ホスホジエステル結合の形成を通じたポリヌクレオチド鎖の５’および３’末端の分子間ライゲーションを促進する。
ｂ．化学合成
関心のある単離ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列、例えば本発明のポリヌクレオチド（例えば、リラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を合成するために標準的方法を適用し得る。例えば、特定の単離ポリペプチドをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含有する単一ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴマーを合成し得る。他の態様において、所望のポリペプチドの一部分をコードするいくつかの小さいオリゴヌクレオチドを合成し得、次にライゲーションし得る。いくつ
かの態様において、個々のオリゴヌクレオチドは、一般的に相補的アセンブリのための５’または３’突出を含有する。
当技術分野で公知の化学合成方法および可能な核酸塩基置換を使用して、本明細書中で開示されるポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）を化学的に合成し得る。例えば、全てがその全体において参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第２０１４０９３９２４号パンフレット、同第２０１３０５２５２３号パンフレット、同第２０１３０３９８５７号パンフレット、同第２０１２１３５８０５号パンフレット、同第２０１３１５１６７１号パンフレット、米国特許出願公開第２０１３０１１５２７２号明細書、または米国特許第８９９９３８０号明細書もしくは同第８７１０２００号明細書を参照されたい。
ｃ．リラキシンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの精製
本明細書中に記載のポリヌクレオチド（例えば、リラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の精製は、ポリヌクレオチドクリーンアップ、品質保証および品質管理を含み得るが限定されない。クリーンアップは、ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ポリ－Ｔビーズ、ＬＮＡ（商標）オリゴ－Ｔ捕捉プローブ（ＥＸＩＱＯＮ（登録商標）Ｉｎｃ．，Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、または強いアニオン交換ＨＰＬＣ、弱いアニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）および疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）などであるが限定されないＨＰＬＣに基づく精製方法などであるが限定されない当技術分野で公知の方法によって行われ得る。
「精製する」という用語は、「精製ポリヌクレオチド」などのポリヌクレオチドに関して使用される場合、少なくとも１つの夾雑物から分離されるものを指す。本明細書中で使用される場合、「夾雑物」は、別のものを不適切で不純または劣等なものにする任意の物質である。したがって、精製ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）は、それが天然でみられるものと異なる形態もしくは設定、または処理もしくは精製法にそれを供する前に存在したものと異なる形態もしくは設定で存在する。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、リラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の精製は、不要な免疫反応を低下させるかまたは排除し得る、例えばサイトカイン活性を低下させる不純物を除去する。
いくつかの実施形態において、カラムクロマトグラフィー（例えば、強いアニオン交換ＨＰＬＣ、弱いアニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）および疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）または（ＬＣＭＳ））を使用して、投与前に本発明のポリヌクレオチド（例えば、リラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を精製する。
いくつかの実施形態において、カラムクロマトグラフィー（例えば、強いアニオン交換ＨＰＬＣ、弱いアニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ、疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）または（ＬＣＭＳ））を使用して精製された本発明のポリヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド配列、リラキシンポリペプチドを含むポリヌクレオチド）は、異なる精製方法により精製された本開示の同じポリヌクレオチドで得られる発現レベルと比較して、コードされるリラキシンタンパク質の発現上昇を示す。
いくつかの実施形態において、カラムクロマトグラフィー（例えば、強いアニオン交換ＨＰＬＣ、弱いアニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、疎水性相互作
用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）または（ＬＣＭＳ））精製ポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の点突然変異の１つ以上を含むリラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドの使用により、細胞に導入された場合、その細胞においてリラキシンタンパク質発現レベルが、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドが細胞において導入される前または非ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドが細胞において導入された後の細胞中でのリラキシンタンパク質の発現レベルに対して例えば１０～１００％、すなわち少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約１００％上昇する。
いくつかの実施形態において、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドの使用により、細胞に導入された場合、細胞中の機能的リラキシンタンパク質発現レベルが、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドが細胞において導入される前または非ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドが細胞において導入された後の細胞中でのリラキシンタンパク質の機能的発現レベルに対して例えば１０～１００％、すなわち少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約１００％上昇する。
いくつかの実施形態において、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドの使用により、細胞に導入された場合、その細胞において検出可能なリラキシン活性が、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドが細胞において導入される前または非ＲＰ－ＨＰＬＣ精製ポリヌクレオチドが細胞において導入された後の細胞中での機能的リラキシンタンパク質の活性レベルに対して例えば１０～１００％、すなわち少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約１００％上昇する。
いくつかの実施形態において、精製ポリヌクレオチドは、少なくとも約８０％純粋、少なくとも約８５％純粋、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、少なくとも約９６％純粋、少なくとも約９７％純粋、少なくとも約９８％純粋、少なくとも約９９％純粋または約１００％純粋である。
品質保証および／または品質管理チェックは、ゲル電気泳動、ＵＶ吸収または分析的ＨＰＬＣなどであるが限定されない方法を使用して行われ得る。別の実施形態において、逆転写酵素－ＰＣＲを含むが限定されない方法により、本ポリヌクレオチドのシーケンシングを行い得る。
ｄ．リラキシンタンパク質をコードする発現ポリヌクレオチドの定量
いくつかの実施形態において、当技術分野で公知の方法に従い、本発明のポリヌクレオチド（例えば、リラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）、それらの発現産物ならびに分解産物および代謝産物を定量し得る。
いくつかの実施形態において、エキソソーム中においてまたは１つ以上の体液に由来す
る場合に本発明のポリヌクレオチドを定量し得る。本明細書中で使用される場合、「体液」としては、末梢血液、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液または射精前の体液、汗、糞便物質、毛髪、涙、嚢胞液、胸膜および腹腔液、心膜液、リンパ液、粥状液、乳糜、胆汁、間質液、月経、膿汁、皮脂、嘔吐物、腟分泌物、粘膜分泌液、便汁、膵液、副鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液および臍帯血が挙げられる。あるいは、エキソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、精巣、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓および胎盤からなる群から選択される臓器から回収され得る。
エキソソーム定量方法において、対象から２ｍＬ以下の試料を得て、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、ナノ膜限外ろ過、免疫吸着捕捉、アフィニティー精製、マイクロ流体分離またはそれらの組み合わせによってエキソソームを単離する。分析において、ポリヌクレオチドのレベルまたは濃度は、投与されるコンストラクトの発現レベル、存在、非存在、短縮化または改変であり得る。このレベルを１つ以上の臨床現象またはヒト疾患バイオマーカーに対するアッセイと相関させることは有利である。
本アッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法などの免疫組織化学的方法を使用してエキソソームを単離し得る一方、コンストラクト特異的なプローブ、サイトメトリー、ｑＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、電気泳動、質量分析またはそれらの組み合わせを用いて行われ得る。サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、ナノ膜限外ろ過、免疫吸着捕捉、アフィニティー精製、マイクロ流体分離またはそれらの組み合わせによってもエキソソームを単離し得る。
これらの方法により、残存しているかまたは送達されたポリヌクレオチドのレベルをリアルタイムで研究者が監視できるようになる。本発明のポリヌクレオチドが構造または化学的修飾のために内在性形態と異なることから、これが可能とある。
いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、紫外可視分光法（ＵＶ／Ｖｉｓ）などであるが限定されない方法を使用して定量され得る。ＵＶ／Ｖｉｓ分光計の非限定例はＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）分光計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）である。ポリヌクレオチドが適正なサイズであり得るか否かを決定し、ポリヌクレオチドの分解が起こっていないことをチェックするために、定量したポリヌクレオチドを分析し得る。アガロースゲル電気泳動、強いアニオン交換ＨＰＬＣ、弱いアニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）および疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）などであるが限定されないＨＰＬＣに基づく精製法、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣＭＳ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）およびキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）などであるが限定されない方法により、ポリヌクレオチドの分解をチェックし得る。
医薬組成物および処方物
本発明は、上記のポリヌクレオチドの何れかを含む医薬組成物および処方物を提供する。いくつかの実施形態において、本組成物または処方物は、送達剤をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本組成物または処方物は、リラキシンポリペプチドをコードする本明細書中で開示される配列最適化核酸を含むポリヌクレオチドを含有し得る。いくつかの実施形態において、本組成物または処方物は、リラキシンポリペプチドをコードする本明細書中で開示される配列最適化核酸配列に対する顕著な配列同一性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）を含有し得る。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えばｍｉＲ－１４２および／またはｍｉＲ－１２６に結合するｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。
医薬組成物または処方物は、任意選択により、例えば治療的および／または予防的活性物質など、１つ以上のさらなる活性物質を含み得る。本発明の医薬組成物または処方物は、無菌性および／または発熱物質不含であり得る。医薬品の処方および／または製造における全般的な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（その全体において参照により本明細書中に組み込まれる）において見出され得る。いくつかの実施形態において、ヒト、ヒト患者または対象に組成物を投与する。本開示の目的に対して、「有効成分」という句は、一般に本明細書中に記載のように送達しようとするポリヌクレオチドを指す。
薬理学の技術分野において公知であるかまたは本明細書で以後開発される任意の方法により、本明細書中に記載の処方物および医薬組成物を調製し得る。一般に、このような調製方法は、有効成分を賦形剤および／または１つ以上の他の補助成分と合わせ、次いで必要に応じておよび／または所望の場合、所望の単回または複数回投与単位に生成物を分割、成型および／またはパッケージ化するステップを含む。
本開示による医薬組成物または処方物は、バルクで、単回単位用量として、および／または複数の単回単位用量として調製、パッケージ化および／または販売し得る。本明細書中で使用される場合、「単位用量」は、有効成分の所定の量を含む医薬組成物の個別量を指す。有効成分の量は、一般に、対象に投与される有効成分の投与量および／またはこのような投与量の好都合な割合、例えばこのような投与量の２分の１または３分の１などと等しい。
有効成分、薬学的に許容可能な賦形剤および／または本開示による医薬組成物中の任意のさらなる成分の相対量は、処置を受けている対象が誰であるか、そのサイズおよび／または状態に依存して、およびさらに組成物を投与しようとする経路に依存して変動し得る。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載の組成物および処方物は、少なくとも１つの本発明のポリヌクレオチドを含有し得る。非限定例として、組成物または処方は、１、２、３、４または５つの本発明のポリヌクレオチドを含有し得る。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載の組成物または処方物は、複数のタイプのポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、本組成物または処方物は、直鎖状および環状形態のポリヌクレオチドを含み得る。別の実施形態において、本組成物または処方物は、環状ポリヌクレオチドおよびＩＶＴポリヌクレオチドを含み得る。また別の実施形態において、本組成物または処方物は、ＩＶＴポリヌクレオチド、キメラポリヌクレオチドおよび環状ポリヌクレオチドを含み得る。
本明細書中で提供される医薬組成物および処方物の説明は、原理的にヒトへの投与に適切な医薬組成物および処方物を対象とするものの、当業者により理解されるように、このような組成物は、一般にあらゆる他の動物、例えば非ヒト動物、例えば非ヒト哺乳動物への投与に適切である。
本発明は、本明細書中に記載のポリヌクレオチド（例えば、リラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む製剤処方物を提供する。本
明細書中に記載のポリヌクレオチドは、（１）安定性を向上させるために、（２）細胞トランスフェクションを向上させるために、（３）持続または遅延放出を可能にするために（例えば、ポリヌクレオチドのデポー製剤から）、（４）生体内分布を変化させるために（例えば、特異的な組織または細胞タイプに対してポリヌクレオチドを標的指向化する）、（５）インビボでコードされるタンパク質の翻訳を向上させるために、および／または（６）インビボでのコードされるタンパク質の放出プロファイルを変化させるために１つ以上の賦形剤を使用して処方され得る。いくつかの実施形態において、製剤処方物は、送達剤（例えば、式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）または（ＩＩｅ）を有する脂質、例えば化合物１～２３２の何れかの脂質を含むＬＮＰ）をさらに含む。
薬学的に許容可能な賦形剤としては、本明細書中で使用される場合、所望の特定の剤型に適するようなあらゆる溶媒、分散媒または他の液体ビヒクル、分散または懸濁助剤、希釈剤、造粒および／または分散剤、界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存剤、結合剤、滑沢剤または油、着色、甘味または香味剤、安定化剤、抗酸化剤、抗菌剤または抗真菌剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、緩衝液、ケラント、キオプロテクタントおよび／または充填剤が挙げられるが限定されない。医薬組成物を処方するための様々な賦形剤および本組成物を調製するための技術は当技術分野で公知である（その全体において参照により本明細書中に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６を参照されたい）。
代表的な希釈剤としては、炭酸カルシウムまたはナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトールなどおよび／またはそれらの組み合わせが挙げられるが限定されない。
代表的な造粒および／または分散剤としては、デンプン、アルファ化デンプンまたは微結晶デンプン、アルギン酸、グアーガム、寒天、ポリ（ビニル－ピロリドン）、（プロビドン）、架橋ポリ（ビニル－ピロリドン）（クロスポビドン）、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、ケイ酸マグネシウムアルミニウム（ＶＥＥＧＵＭ（登録商標））、ラウリル硫酸ナトリウムなどおよび／またはそれらの組み合わせが挙げられるが限定されない。
代表的な界面活性剤および／または乳化剤としては、天然乳化剤（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、コンドラックス、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックスおよびレシチン）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン［ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０］、モノパルミチン酸ソルビタン［ＳＰＡＮ（登録商標）４０］、モノオレイン酸グリセリル、ポリオキシエチレンエステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ＢＲＩＪ（登録商標）３０］）、ＰＬＵＯＲＩＮＣ（登録商標）Ｆ６８、ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ（登録商標）１８８などおよび／またはそれらの組み合わせが挙げられるが限定されない。
代表的な結合剤としては、デンプン、ゼラチン、糖（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、モラセス、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）、アミノ酸（例えば、グリシン）、天然および合成ゴム（例えば、アカシア、アルギン
酸ナトリウム）、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどおよびそれらの組み合わせが挙げられるが限定されない。
酸化は、ｍＲＮＡ、特に液体ｍＲＮＡ処方物に対する潜在的な分解経路である。酸化を防ぐために抗酸化剤を処方物に添加し得る。代表的な抗酸化剤としては、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アコルビル、ベンジルアルコール、ブチル化ヒドロキシアニソール、ｍ－クレゾール、メチオニン、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸ナトリウムまたはカリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウムなどおよびそれらの組み合わせが挙げられるが限定されない。
代表的なキレート剤としては、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、エデト酸三ナトリウムなどおよびそれらの組み合わせが挙げられるが限定されない。
代表的な抗菌または抗真菌剤としては、塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウム塩化物、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウムまたはナトリウム、ソルビン酸カリウムまたはナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸などおよびそれらの組み合わせが挙げられるが限定されない。
代表的な保存剤としては、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ベータ－カロテン、クエン酸、アスコルビン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）などおよびそれらの組み合わせが挙げられるが限定されない。
いくつかの実施形態において、安定性を向上させるために、ポリヌクレオチド溶液のｐＨは、ｐＨ５～ｐＨ８に維持される。ｐＨを調節するための代表的な緩衝液としては、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、ヒスチジン（またはヒスチジン－ＨＣｌ）、リンゴ酸ナトリウム、炭酸ナトリウムなどおよび／またはそれらの組み合わせが挙げられ得るが限定されない。
代表的な滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、硬化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウムまたはマグネシウムなどおよびそれらの組み合わせが挙げられるが限定されない。
ここに記載の医薬組成物または処方物は、凍結中に本明細書中に記載のポリヌクレオチドを安定化させるための凍結保護物質を含有し得る。代表的な凍結保護物質としては、マンニトール、スクロース、トレハロース、ラクトース、グリセロール、デキストロースなどおよびそれらの組み合わせが挙げられるが限定されない。
ここに記載の医薬組成物または処方物は、「薬学的に洗練された」ケーキを生じさせ、長期（例えば、３６か月）保存中に凍結乾燥ポリヌクレオチドを安定化するために、凍結乾燥ポリヌクレオチド処方物中に充填剤を含有し得る。本発明の代表的な充填剤としては、スクロース、トレハロース、マンニトール、グリシン、ラクトース、ラフィノースおよびそれらの組み合わせが挙げられ得るが限定されない。
いくつかの実施形態において、医薬組成物または処方物は、送達剤をさらに含む。本開
示の送達剤としては、リポソーム、脂質ナノ粒子、リピドイド、ポリマー、リポプレックス、微小胞、エキソソーム、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドをトランスフェクションした細胞、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣物、ナノチューブ、複合物およびそれらの組み合わせが挙げられ得るが限定されない。
送達剤
本開示は、有利な特性を有する医薬組成物を提供する。特に、本願は、リラキシンポリペプチデッドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、本明細書中に記載の脂質化合物とを含む医薬組成物を提供する。
血中クリアランス加速（ＡＢＣ）
本発明は、生物学的に活性のある物質などの活性物質の反復投与時のＡＢＣの効果を低下させるための化合物、組成物およびその使用方法を提供する。容易に明らかになるように、活性物質投与時にＡＢＣの効果を低下させるかまたは全体的に排除することにより、その半減期が効果的に延長され、したがってその有効性が向上する。
いくつかの実施形態において、ＡＢＣを低下させるという用語は、ＭＣ３ ＬＮＰなどのＬＮＰを誘導する正の参照対照ＡＢＣと比較した場合のＡＢＣの任意の低下を指す。ＡＢＣ誘発ＬＮＰは、ある時間枠内において、２回目または続く投与時の活性物質の循環レベルの低下を引き起こす。したがって、ＡＢＣの低下は、標準的なＬＮＰと比較した場合の２回目または続く薬剤投与時の循環物質のクリアランス低下を指す。この低下は、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％であり得る。いくつかの実施形態において、この低下は、１０～１００％、１０～５０％、２０～１００％、２０～５０％、３０～１００％、３０～５０％、４０％～１００％、４０～８０％、５０～９０％または５０～１００％である。あるいは、ＡＢＣの低下は、２回目または続く投与後の少なくとも検出可能なレベルの循環物質、または標準的ＬＮＰ投与後の循環物質に対する循環物質の少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍の増加として特徴付けられ得る。いくつかの実施形態において、この低下は、２～１００倍、２～５０倍、３～１００倍、３～５０倍、３～２０倍、４～１００倍、４～５０倍、４～４０倍、４～３０倍、４～２５倍、４～２０倍、４～１５倍、４～１０倍、４～５倍、５～１００倍、５～５０倍、５～４０倍、５～３０倍、５～２５倍、５～２０倍、５～１５倍、５～１０倍、６～１００倍、６～５０倍、６～４０倍、６～３０倍、６～２５倍、６～２０倍、６～１５倍、６～１０倍、８～１００倍、８～５０倍、８～４０倍、８～３０倍、８～２５倍、８～２０倍、８～１５倍、８～１０倍、１０～１００倍、１０～５０倍、１０～４０倍、１０～３０倍、１０～２５倍、１０～２０倍、１０～１５倍、２０～１００倍、２０～５０倍、２０～４０倍、２０～３０倍または２０～２５倍である。
本開示は、クリアランスの影響を受けにくく、したがってインビボ半減期がより長い、脂質を含む化合物および組成物を提供する。これは、特に、本組成物が、慢性投与を含めた反復、さらにより特にはこのような反復投与が数日または数週間内に行われることなどが意図される場合である。
重要なこととして、これらの組成物は、血中クリアランス加速（ＡＢＣ）の観察される現象が起こりにくいか、または完全にこれを回避する。ＡＢＣは、ある種の外因的に投与される薬剤が２回目または続く投与時に血液から急速に排除されるという現象である。この現象は、部分的に、脂質付加剤、リポソームまたは他の脂質に基づく送達ビヒクルおよび脂質封入薬剤を含むが限定されない様々な脂質含有組成物に対して観察されている。これまで、ＡＢＣの基礎は、あまりよく理解されておらず、一部の場合には液性免疫反応に
起因し、したがって特に臨床の状況でのインビボでのその影響を制限するためのストラテジーは、依然として理解することが困難である。
本開示は、ＡＢＣに対して、結局影響を受けやすい場合により影響を受けにくい化合物および組成物を提供する。いくつかの重要な態様において、このような化合物および組成物は、脂質を含む化合物または組成物である。本開示の脂質含有化合物または組成物は、驚くべきことに、インビボで２回目または続く投与時にＡＢＣが起こらない。ＡＢＣに対するこの耐性により、数日または１～２週間を含む短い期間内での反復使用を含め、これらの化合物および組成物がインビボでの反復使用に特に適切となる。この安定性および／または半減期の増強は、部分的に、これらの組成物がＢ１ａ、および／またはＢ１ｂ細胞、および／または通常のＢ細胞、ｐＤＣおよび／または血小板を活性化することができないからである。
したがって、本開示は、血中クリアランス加速（ＡＢＣ）の基礎となる機序の説明を提供する。本明細書中で提供される本開示および本発明に従い、ＡＢＣ現象は、少なくともそれが脂質および脂質ナノ粒子に関するため、少なくとも部分的に、Ｂ１ａおよび／またはＢ１ｂ細胞、ｐＤＣおよび／または血小板を含む自然免疫反応が介在することが分かった。Ｂ１ａ細胞は、通常、循環ＩｇＭの形態で天然抗体分泌に関与する。このＩｇＭは、多反応性であり、これは、それぞれに対して比較的親和性が低いにもかかわらず、様々な抗原に結合可能であることを意味する。
本発明によれば、いくつかの脂質付加薬剤または脂質を含む処方物、例えばインビボで投与される脂質ナノ粒子などは、ＡＢＣを引き起こし、これに供されることが分かった。今回、本発明によれば、ＬＮＰの１回目の投与時、自然免疫反応生成に関与する１つ以上の細胞（本明細書中でセンサーと呼ぶ）がこのような物質と結合し、活性化され、次いでＡＢＣおよび毒性を促進する免疫因子（本明細書中でエフェクターと呼ぶ）のカスケードを開始することが分かった。例えば、Ｂ１ａおよびＢ１ｂ細胞は、ＬＮＰに結合し、（単独またはｐＤＣなどの他のセンサーおよび／またはＩＬ６などのエフェクターの存在下で）活性化され、ＬＮＰに結合する天然ＩｇＭを分泌し得る。対象中の既存の天然ＩｇＭもＬＮＰを認識し、これに結合し得、それによって補体結合が引き起こされる。１回目の投与後、天然ＩｇＭの産生がＬＮＰ投与の１～２時間以内に開始される。一般的には、約２～３週間までにＩｇＭの天然半減期のために天然ＩｇＭが系から排除される。ＬＮＰ投与後９６時間前後に天然ＩｇＧが産生され始める。ナイーブの状況で投与される場合、本薬剤は、Ｂ１ａ細胞もしくはＢ１ｂ細胞または天然ＩｇＧの活性化後に産生される天然ＩｇＭにより比較的邪魔されずにその生物学的効果を発揮し得る。天然ＩｇＭおよび天然ＩｇＧは、非特異的であり、したがって抗ＰＥＧ ＩｇＭおよび抗ＰＥＧ ＩｇＧと異なる。
本出願人が機序により拘束されることはないが、次の機序を通じてＬＮＰがＡＢＣおよび／または毒性を生じさせることが提案される。ＬＮＰが対象に投与される場合、ＬＮＰが血液を通じて脾臓に急速に輸送されると考えられる。ＬＮＰは、血液および／または脾臓において免疫細胞に遭遇し得る。血液および／または、脾臓内のＬＮＰの提示に反応して、急速な自然免疫反応が引き起こされる。本出願人は、本明細書中において、ＬＮＰの投与時間内にいくつかの免疫センサーがＬＮＰの存在に対して反応したことを示した。これらのセンサーとしては、免疫反応生成に関与する免疫細胞、例えばＢ細胞、ｐＤＣおよび血小板などが挙げられるが限定されない。センサーは、脾臓、例えば脾臓の辺縁帯および／または血中に存在し得る。ＬＮＰは、１つ以上のセンサーと物理的に相互作用し得、このセンサーが他のセンサーと相互作用し得る。このような場合、ＬＮＰは、センサーと直接的または間接的に相互作用する。センサーは、ＬＮＰ認識に反応して互いに直接相互作用し得る。例えば、多くのセンサーが脾臓に位置し、互いに容易に相互作用し得る。あるいは、センサーの１つ以上が血中でＬＮＰと相互作用し、活性化されるようになり得る
。次に、活性化されたセンサーが他のセンサーと直接または（例えば、サイトカイン、例えばＩＬ６などのメッセンジャーの刺激または産生を通じて）間接的に相互作用し得る。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、次のセンサーのそれぞれと直接相互作用し、活性化し得る：ｐＤＣ、Ｂ１ａ細胞、Ｂ１ｂ細胞および血小板。次に、これらの細胞は、互いに直接または間接的に相互作用して、最終的に、ＬＮＰ反復投与に関連するＡＢＣおよび／または毒性につながるエフェクター産生を開始し得る。例えば、本出願人らは、ＬＮＰ投与がｐＤＣ活性化、血小板凝集および活性化およびＢ細胞活性化につながることを示した。ＬＮＰに反応して、血小板も凝集し、活性化され、Ｂ細胞とともに凝集する。ｐＤＣ細胞が活性化される。ＬＮＰは、比較的急速に血小板およびＢ細胞の表面と相互作用することが分かった。ＬＮＰと反応したこれらのセンサーの何れか１つまたは組み合わせの活性化の阻止は、通常起こる免疫反応を弱めるために有用である。この免疫反応弱化の結果、ＡＢＣおよび／または毒性が回避される。
活性されたセンサーは、エフェクターを産生させる。本明細書中で使用される場合、エフェクターは、Ｂ細胞などの免疫細胞により産生される免疫分子である。エフェクターとしては、免疫グロブリン、例えば天然ＩｇＭおよび天然ＩｇＧなど、およびサイトカイン、例えばＩＬ６などが挙げられるが限定されない。Ｂ１ａおよびＢ１ｂ細胞は、ＬＮＰ投与後２～６時間以内に天然ＩｇＭの産生を刺激する。９６時間以内に天然ＩｇＧが検出され得る。ＩＬ６レベルは、数時間以内に上昇する。天然ＩｇＭおよびＩｇＧは、数日間～数週間にわたり体内で循環する。この時間中、循環エフェクターは、新たに投与されたＬＮＰと相互作用し得、身体によるクリアランスのためにＬＮＰを刺激する。例えば、エフェクターは、ＬＮＰを認識し、それに結合し得る。エフェクターのＦｃ領域は、マクロファージにより装飾されたＬＮＰにより認識され、その取り込みを刺激し得る。次いで、マクロファージが脾臓に輸送される。免疫センサーによるエフェクターの産生は、ＡＢＣに対して観察されるタイミングと相関する一時的な反応である。
投与される用量が２回目または続く投与用量である場合、およびこのような２回目または続く用量が、すでに誘導されている天然ＩｇＭおよび／またはＩｇＧが系から排除される前に投与される場合（例えば、２～３の猶予期間前）、このような２回目または続く用量は、代替的な補体経路活性化を引き起こす循環天然ＩｇＭおよび／または天然ＩｇＧまたはＦｃにより標的とされ、それ自体急速に排除される。エフェクターが身体から排除されるかまたは数の上で減少した後にＬＮＰが投与される場合、ＡＢＣは観察されない。
したがって、ＬＮＰによる１つ以上のセンサーの活性化（直接または間接的）を阻害するために、１つ以上のエフェクターの産生を阻害するために、および／または１つ以上のエフェクターの活性を阻害するために、本発明の態様によれば、ＬＮＰと１つ以上のセンサーとの間の相互作用を阻害することは有用である。いくつかの実施形態において、センサーとのＬＮＰの相互作用を制限するかまたは阻止するようにＬＮＰが設計される。例えば、ＬＮＰは、センサーとの相互作用を防ぐためのＰＣおよび／またはＰＥＧの変更を有し得る。あるいはまたはさらに、これらの効果の何れか１つ以上を達成するために、ＬＮＰにより誘導される免疫反応を阻害する薬剤を使用し得る。
通常のＢ細胞がＡＢＣに関わることも分かった。具体的には、薬剤の１回目の投与時、本明細書中でＣＤ１９（＋）と呼ぶ通常のＢ細胞は、この薬剤と結合し、それに対して反応する。Ｂ１ａおよびＢ１ｂ細胞と異なるものの、通常のＢ細胞は、最初にＩｇＭ反応（ＬＮＰ投与後９６時間前後に開始）を開始させ、続いてＩｇＧ反応（ＬＮＰ投与後１４日前後に開始）を記憶反応と同時に開始させることが可能である。したがって、通常のＢ細胞は、投与された薬剤に対して反応し、ＡＢＣに介在するＩｇＭ（および最終的にＩｇＧ）に寄与する。ＩｇＭおよびＩｇＧは、一般的には抗ＰＥＧ ＩｇＭおよび抗ＰＥＧ ＩｇＧである。
一部の例において、Ｂ１ａ細胞およびＢ１ａ介在性免疫反応を通じてＡＢＣ反応の大部分が媒介されることが企図される。一部の例において、ＡＢＣ反応にはＩｇＭおよびＩｇＧの両方が介在し、通常のＢ細胞およびＢ１ａ細胞の両方がこのような効果に介在することがさらに企図される。またさらなる他の例において、ＡＢＣ反応に天然ＩｇＭ分子が介在し、これらの一部は、天然ＩｇＭとの結合が可能であり、これは、活性化されたＢ１ａ細胞により産生され得る。天然ＩｇＭは、ＬＮＰの１つ以上の構成要素に結合し得、例えばＬＮＰのリン脂質構成要素に結合し（リン脂質のＰＣ部分への結合など）および／またはＬＮＰのＰＥＧ－脂質構成要素に結合し得る（ＰＥＧ－ＤＭＧへの結合、特にＰＥＧ－ＤＭＧのＰＥＧ部分への結合など）。Ｂ１ａは、ホスファチジルコリンがリガンドであるＣＤ３６を発現させるため、ＣＤ３６受容体がＢ１ａ細胞の活性化、したがって天然ＩｇＭの産生に介在し得ることが企図される。またさらなる他の例において、ＡＢＣ反応には主に通常のＢ細胞が介在する。
本発明によれば、少なくとも部分的に、Ｂ１ａ細胞を活性化しない化合物および組成物（薬剤、送達ビヒクルおよび処方物など）の使用を通じて、ＡＢＣ現象を軽減または抑止し得ることが分かった。Ｂ１ａ細胞を活性化しない化合物および組成物は、本明細書中でＢ１ａ不活性化化合物および組成物と呼ばれ得る。本発明によれば、少なくとも部分的に、通常のＢ細胞を活性化しない化合物および組成物の使用を通じてＡＢＣ現象を軽減または抑止し得ることがさらに分かった。通常のＢ細胞を活性化しない化合物および組成物は、いくつかの実施形態において、本明細書中でＣＤ１９不活性化化合物および組成物と呼ばれ得る。したがって、本明細書中で提供されるいくつかの実施形態において、本化合物および組成物は、Ｂ１ａ細胞を活性化せず、それらは、通常のＢ細胞を活性化しない。Ｂ１ａ細胞および通常のＢ細胞を活性化しない化合物および組成物は、いくつかの実施形態において、本明細書中でＢ１ａ／ＣＤ１９不活性化合物および組成物と呼ばれ得る。
これらの基礎的な機序は、これまで理解されておらず、Ｂ１ａおよびＢ１ｂ細胞の役割およびこの現象における通常のＢ細胞とのそれらの相互作用も認識されていなかった。
したがって、本開示は、ＡＢＣを促進しない化合物および組成物を提供する。これらは、Ｂ１ａおよび／またはＢ１ｂ細胞、血小板および／またはｐＤＣ、ならびに任意選択により通常のＢ細胞も活性化可能ではないことをさらに特徴とし得る。これらの化合物（例えば、予防薬、治療薬および診断薬などの生物学的活性物質を含む薬剤、リポソーム、脂質ナノ粒子および他の脂質に基づく封入構造などを含む送達ビヒクル）および組成物（例えば、処方物など）が、反復投与および特に短期間内に行われる反復投与（例えば、１～２週間内）を要する適用のために特に所望される。これは、例えば、薬剤が、規則的な密な間隔で対象に提供される核酸に基づく治療薬である場合である。本明細書中で提供される知見は、同様に投与されかつ／またはＡＢＣに供されるこれらのおよび他の薬剤に適用され得る。
特に関心があるものは、脂質を含む化合物、脂質を含む粒子および脂質を含む組成物であり、なぜなら、これらは、ＡＢＣを受けやすいことが知られているからである。このような脂質を含む化合物粒子および組成物は、生物学的活性物質として、またはこのような薬剤のための送達ビヒクルとして広く使用されてきた。したがって、このような薬剤のそれらの有効性を向上させるという能力は、薬剤自体におけるかまたはその送達ビヒクルにおけるＡＢＣの影響を軽減することによるかにかかわらず、多岐にわたる活性物質に対して有益である。
１つ以上の生物学的活性物質の反復投与に関連する急性期反応（ＡＲＰ）を刺激しない
かまたは促進しない組成物も本明細書中で提供される。
本組成物は、一部の例において、天然ＩｇＭを含むが限定されないＩｇＭに結合し得ない。
本組成物は、一部の例において、Ｃ－反応性タンパク質などであるが限定されない急性期タンパク質に結合し得ない。
本組成物は、一部の例において、ＣＤ５（＋）介在性免疫反応を引き起こし得ない。本明細書中で使用される場合、ＣＤ５（＋）介在性免疫反応は、Ｂ１ａおよび／またはＢ１ｂ細胞が介在する免疫反応である。このような反応は、ＡＢＣ反応、急性期反応、天然ＩｇＭおよび／またはＩｇＧなどの誘導を含み得る。
本組成物は、一部の例において、ＣＤ１９（＋）介在性免疫反応を引き起こし得ない。本明細書中で使用される場合、ＣＤ１９（＋）介在性免疫反応は、通常のＣＤ１９（＋）、ＣＤ５（－）Ｂ細胞が介在する免疫反応である。このような反応は、ＩｇＭの誘導、ＩｇＧの誘導、記憶Ｂ細胞の誘導、ＡＢＣ反応、タンパク質がＬＮＰ内に封入され得る抗タンパク質反応を含む抗薬物抗体（ＡＤＡ）反応などを含み得る。
Ｂ１ａ細胞は、自然免疫に関与する細胞のサブセットである。これらの細胞は、天然抗体または天然血清抗体と呼ばれる循環ＩｇＭのソースである。天然ＩｇＭ抗体は、多くの抗原に対する弱い親和性を有することを特徴とし、したがって、これは、「多特異的」または「多反応性」と呼ばれ、これにより複数の抗原へのそれらの結合能が示される。Ｂ１ａ細胞は、ＩｇＧを産生可能ではない。さらに、それらは、記憶細胞にはならず、したがって適応免疫反応に関与しない。しかし、これらは、活性化時にＩｇＭを分泌可能である。分泌されるＩｇＭは、一般的に約２～３週間以内に排除され、この時点で免疫系が前に投与された抗原に対して比較的ナイーブになる。この時点後に同じ抗原が提示される場合（例えば、最初の曝露後約３週間）、抗原は、急速に排除されない。しかし、顕著には、その期間内に抗原が提示される場合（例えば、１週間以内または数日以内を含め、２週間以内）、抗原は、急速に排除される。この連続投与間の遅延により、ある種の脂質含有治療薬または診断薬が使用に適切でなくなっている。
ヒトにおいて、Ｂ１ａ細胞は、ＣＤ１９（＋）、ＣＤ２０（＋）、ＣＤ２７（＋）、ＣＤ４３（＋）、ＣＤ７０（－）およびＣＤ５（＋）である。マウスにおいて、Ｂ１ａ細胞は、ＣＤ１９（＋）、ＣＤ５（＋）およびＣＤ４５Ｂ細胞アイソフォームＢ２２０（＋）である。これは、一般的にＢ１ａ細胞を他の通常のＢ細胞と区別するＣＤ５の発現である。Ｂ１ａ細胞は高レベルのＣＤ５を発現させ得、これに基づいて、低いかまたは検出不可能なレベルのＣＤ５を発現するＢ－１ｂ細胞などの他のＢ－１細胞と区別され得る。ＣＤ５は、パン－Ｔ細胞表面糖タンパク質である。Ｂ１ａ細胞は、脂肪酸トランスロカーゼとしても知られるＣＤ３６も発現させる。ＣＤ３６は、クラスＢスカベンジャー受容体ファミリーのメンバーである。ＣＤ３６は、酸化低密度リポタンパク質、ネイティブリポタンパク質、酸化リン脂質および長鎖脂肪酸を含む多くのリガンドと結合し得る。
Ｂ１ｂ細胞は、自然免疫に関与するＢ細胞の別のサブセットである。これらの細胞は、循環天然ＩｇＭの別のソースである。ＰＳを含むいくつかの抗原は、Ｂ１ｂ活性化を通じてＴ細胞依存的免疫を誘導可能である。ＣＤ２７は、抗原活性化に反応してＢ１ｂ細胞において一般的に上方制御される。Ｂ１ａ細胞と同様に、Ｂ１ｂ細胞は、一般的には、脾臓および腹膜腔など、特異的な身体の位置に局在し、血中の存在量は非常に少ない。Ｂ１ｂ分泌天然ＩｇＭは、一般的には約２～３週間以内に排除され、この時点で免疫系が前に投与された抗原に対して比較的ナイーブになる。この時点後に同じ抗原が提示される場合（
例えば、最初の曝露後約３週間）、抗原は、急速に排除されない。しかし、顕著には、その期間内に抗原が提示される場合（例えば、１週間以内または数日以内を含め、２週間以内）、抗原は、急速に排除される。この連続投与間の遅延により、特定の脂質含有治療薬または診断薬が使用に適切でなくなっている。
いくつかの実施形態において、Ｂ１ａおよび／またはＢ１ｂ細胞活性化を阻止することが望まれる。Ｂ１ａおよび／またはＢ１ｂ細胞活性化を阻止するためのあるストラテジーは、何れの脂質ナノ粒子構成要素がＢ細胞活性化を促進するかを判定し、これらの構成要素を中和することを含む。本明細書中において、少なくともＰＥＧおよびホスファチジルコリン（ＰＣ）が他の細胞とのＢ１ａおよびＢ１ｂ細胞相互作用および／または活性化に寄与することが発見された。ＰＥＧは、Ｂ１細胞と血小板との間の凝集の促進に関与し得、これは、活性化につながり得る。おそらくＢ細胞表面でのＣＤ３６受容体との相互作用を通じて、ＰＣ（ＬＮＰ中のヘルパー脂質）もＢ１細胞の活性化に関与する。多くの粒子がＰＥＧ－脂質代替物を有し、ＰＥＧが少ないおよび／またはＰＣ置き換え脂質（例えば、オレイン酸またはその類似体）を設計し、試験した。本出願人は、反復投与時にＡＢＣを促進するＬＮＰ内でのこれらの構成要素の１つ以上の置き換えが、天然ＩｇＭの産生および／またはＢ細胞活性化を低下させることにより、ＡＢＣの防止において有用であることを裏付けた。したがって、本発明は、Ｂ細胞トリガーの包含を排除する設計の結果としてＡＢＣが軽減されたＬＮＰを包含する。
Ｂ１ａおよび／またはＢ１ｂ細胞活性化を阻止するための別のストラテジーは、ＬＮＰにより誘導される免疫反応を阻害する薬剤の使用を含む。これらのタイプの薬剤を以下でより詳細に論じる。いくつかの実施形態において、これらの薬剤は、Ｂ１ａ／Ｂ１ｂ細胞とＬＮＰまたは血小板またはｐＤＣとの間の相互作用を阻止する。例えば、この薬剤は、相互作用を物理学的に阻止する抗体または他の結合剤であり得る。この例は、ＣＤ３６またはＣＤ６に結合する抗体である。この薬剤は、Ｂ１ａ／Ｂ１ｂ細胞が活性化されるかまたは活性化される前にシグナル伝達を防ぐかまたは無効にする化合物でもあり得る。例えば、Ｂ１ａ／Ｂ１ｂシグナル伝達カスケードにおいて１つ以上の構成要素を阻止することが可能であり、これは、ＬＮＰまたは他の免疫細胞とのＢ細胞相互作用からの結果である。他の実施形態において、この薬剤は、活性化後にＢ１ａ／Ｂ１ｂ細胞により産生される１つ以上のエフェクターとして作用し得る。これらのエフェクターとしては、例えば、天然ＩｇＭおよびサイトカインが挙げられる。
本発明の態様によれば、ｐＤＣ細胞の活性化が阻止される場合、ＬＮＰに反応したＢ細胞活性化が低下することが明らかになった。したがって、ＡＢＣおよび／または毒性を回避するために、ｐＤＣ活性化を防ぐことが望まれ得る。上で論じたストラテジーと同様に、ｐＤＣ細胞活性化は、ｐＤＣとＬＮＰおよび／またはＢ細胞／血小板との間の相互作用を妨害する薬剤によって阻止され得る。あるいは、その活性化能を阻止するためにｐＤＣにおいてまたはそのエフェクターにおいて作用する薬剤は、ＡＢＣを回避するためにＬＮＰと一緒に使用され得る。
血小板もＡＢＣおよび毒性において重要な役割を果たし得る。対象へのＬＮＰの初回投与が行われた後、非常に急速に血小板がＬＮＰと結合し、凝集し、活性化される。いくつかの実施形態において、血小板凝集および／または活性化を阻止することが望まれる。血小板凝集および／または活性化を阻止するためのあるストラテジーは、脂質ナノ粒子の何れの構成要素が血小板凝集および／または活性化を促進するかを判定し、これらの構成要素を中和することを含む。本明細書中において、少なくともＰＥＧが血小板凝集、活性化および／または他の細胞との相互作用に寄与することが発見された。多くの粒子がＰＥＧ－脂質代替物を有しおよびＰＥＧが少ないものを設計し、試験した。本出願人は、反復投与時にＡＢＣを促進するＬＮＰ内のこれらの構成要素の１つ以上の置き換えが、天然Ｉｇ
Ｍの産生および／または血小板凝集の低下によるＡＢＣの防止において有用であることを裏付けた。したがって、本発明は、血小板トリガーの包含を除去する設計の結果としてＡＢＣが軽減されているＬＮＰを包含する。あるいは、ＡＢＣを回避するために、活性化されたらその活性を阻止するために血小板において、またはそのエフェクターにおいて作用する薬剤をＬＮＰと一緒に使用し得る。
ＡＢＣ活性および関連活性の測定
ＬＮＰを含む本明細書中で提供される様々な化合物および組成物は、インビボでの投与時にＡＢＣ活性を促進しない。これらのＬＮＰは、以下に記載のものならびに実施例の方法サブセクションを含む実施例セクションで開示されるアッセイの何れかなどであるが限定されない多くのアッセイの何れかを通じて特徴評価および／または同定され得る。
いくつかの実施形態において、本方法は、ＡＢＣを促進する免疫反応を生じさせることなくＬＮＰを投与することを含む。ＡＢＣを促進する免疫反応は、１つ以上のセンサー、例えばＢ１細胞、ｐＤＣまたは血小板など、および１つ以上のエフェクター、例えば天然ＩｇＭ、天然ＩｇＧなど、またはサイトカイン、例えばＩＬ６などの活性化を含む。したがって、ＡＢＣを促進する免疫反応を生じさせないＬＮＰの投与は、少なくとも、１つ以上のセンサーの顕著な活性化および１つ以上のエフェクターの顕著な産生がないＬＮＰの投与を含む。これに関連して使用される顕著は、ＡＢＣ惹起ＬＮＰの２回目の投与に対して予想される血中クリアランスレベルに関して２回目の用量の全てまたは一部の血中クリアランス加速の生理学的結果につながる量を指す。例えば、免疫反応は、２回目の投与後に観察されるＡＢＣがＡＢＣ惹起ＬＮＰに対して予想されているものよりも低くなるように弱められるべきである。
Ｂ１ａまたはＢ１ｂ活性化アッセイ
本開示で提供されるある種の組成物は、Ｂ細胞、例えばＢ１ａまたはＢ１ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ５＋）および／または通常のＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ５－）を活性化しない。Ｂ１ａ細胞、Ｂ１ｂ細胞または通常のＢ細胞の活性化は、多くの方法で判定され得、これらの一部を以下で提供する。Ｂ細胞集団は、脾臓細胞または末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）の分画化Ｂ細胞集団または非分画化集団として提供され得る。後者の場合、ある期間にわたり第１選択ＬＮＰとともに細胞集団を温置し、次いでさらなる分析のために回収し得る。あるいは、上清を回収し、分析し得る。
活性化マーカー細胞表面発現の上方制御
Ｂ１ａ細胞、Ｂ１ｂ細胞または通常のＢ細胞の活性化は、ＣＤ８６などの後期活性化マーカーを含むＢ細胞活性化マーカーの発現上昇として示され得る。代表的な非限定アッセイにおいて、非分画化Ｂ細胞は、脾細胞集団としてまたはＰＢＭＣ集団として提供され、特定の時間にわたり第１選択のＬＮＰとともに温置し、次いでＣＤ１９などの標準的なＢ細胞マーカーについて、およびＣＤ８６などの活性化マーカーについて染色し、例えばフローサイトメトリーを使用して分析する。適切な陰性対照は、同じ集団を培地とともに温置し、次いで同じ染色および視覚化ステップを行うことを含む。陰性対照と比較した試験集団でのＣＤ８６発現の上昇は、Ｂ細胞活性化を示す。
炎症促進性サイトカイン放出
サイトカイン放出アッセイによってもＢ細胞活性化を評価し得る。例えば、関心のあるＬＮＰとの曝露時のＩＬ－６および／またはＴＮＦ－アルファなどのサイトカインの産生および／または分泌を通じて活性化を評価し得る。
このようなアッセイは、当技術分野で周知の通常のサイトカイン分泌アッセイを使用して行われ得る。サイトカイン分泌の増加は、Ｂ細胞活性化の指標である。
Ｂ細胞に対するＬＮＰ結合／会合および／またはＢ細胞による取り込み
関心のあるＬＮＰを評価するために、およびこのようなＬＮＰの特徴をさらに調べるために、Ｂ細胞へのＬＮＰ会合または結合も使用し得る。蛍光標識など、検出可能標識ＬＮＰを使用し、様々な温置時間後のＢ細胞におけるかまたはＢ細胞上のこのようなＬＮＰの局在を追跡して、会合／結合および／または取り込み／内部移行を評価し得る。
本発明は、本明細書中で提供される組成物が、循環ＩｇＭなどのＡＢＣの下流メディエーターおよび／または急性期タンパク質（例えば、Ｃ－反応タンパク質（ＣＲＰ）などの急性期反応メディエーターによる認識または検出および任意選択により結合を逃れることが可能であり得ることをさらに企図する。
ＡＢＣを軽減するための使用方法
ＡＢＣを促進することなく、対象に対して、治療薬などの薬剤を封入し得るＬＮＰを送達するための方法も本明細書中で提供される。
いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書中に記載のＬＮＰの何れかを投与することを含み、これは、ＡＢＣを促進せず、例えばＬＮＰに結合する天然ＩｇＭの産生を誘導せず、Ｂ１ａおよび／またはＢ１ｂ細胞を活性化しない。本明細書中で使用される場合、「ＡＢＣを促進しない」ＬＮＰは、実質的なＡＢＣにつながる免疫反応を誘導しないか、または実質的なＡＢＣに導くには十分でない実質的に低レベルの免疫反応のみを誘導するＬＮＰを指す。ＬＮＰに結合する天然ＩｇＭの産生を誘導しないＬＮＰは、ＬＮＰに結合する天然ＩｇＭを誘導しないかまたは天然ＩｇＭ分子レベルが実質的に低く、実質的なＡＢＣを導くには不十分であるＬＮＰを指す。Ｂ１ａおよび／またはＢ１ｂ細胞を活性化しないＬＮＰは、ＬＮＰに結合する天然ＩｇＭを産生するためのＢ１ａおよび／またはＢ１ｂ細胞の反応を誘導しないか、またはＢ１ａおよび／またはＢ１ｂ反応のレベルが実質的に低く、実質的なＡＢＣに導くには不十分であるＬＮＰを指す。
いくつかの実施形態において、産生を活性化せず、誘導しないという用語は、参照値または状態に対する相対的な低下である。いくつかの実施形態において、参照値または状態は、ＭＣ３ ＬＮＰなどの標準的ＬＮＰによるＩｇＭなどの分子の活性化または産生誘導の量である。いくつかの実施形態において、相対的低下は、少なくとも３０％、例えば少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の低下である。他の実施形態において、この用語は、Ｂ細胞などの細胞を活性化せず、ＩｇＭなどのタンパク質の産生を誘導せず、活性のある細胞または特異的なタンパク質の検出不可能な量を指し得る。
血小板効果および毒性
本発明は、さらに、部分的には、ＬＮＰ投与に関連する用量を制限する毒性の基礎をなす機序の説明を前提とする。このような毒性は、急性であれまたは慢性であれ、凝固障害、管内凝固症候群（ＤＩＣ、消費性凝固障害とも呼ばれる）および／または血管血栓症を含み得る。一部の例において、ＬＮＰに関連する用量制限毒性は、急性期反応（ＡＰＲ）または補体活性化関連偽アレルギー（ＣＡＲＰＡ）である。
本明細書中で使用される場合、凝固障害は、インビボでの凝固（血液凝固）の上昇を指す。本開示で報告される知見は、このような凝固の上昇と一致し、顕著に基礎をなす機序に対する洞察を提供する。凝固は、多くの様々な因子および細胞タイプを含む過程であり、これまでＬＮＰと血小板との間の関係および相互作用は、この点について理解されていなかった。本開示は、このような相互作用の証拠を提供し、血小板会合減少、血小板凝集減少および／または血小板凝集減少を含め、血小板効果を低下させるように修飾される化合物および組成物も提供する。このような血小板効果を、好ましくは下方制御することを含めて調整する能力により、ＬＮＰ投与後の凝固障害の発症率および／または重症度が低下し得る。次に、これによりこのようなＬＮＰに関連する毒性が低下し、それによってより高用量のＬＮＰが可能となり、重要なこととして、それを必要とする患者に対して投与しようとするカーゴ量がより高くなる。
ＣＡＲＰＡは、過敏反応（ＨＳＲ）において顕在化する急性免疫毒性のクラスであり、これは、ナノ医薬および生物薬により引き起こされ得る。アレルギー性反応と異なり、ＣＡＲＰＡは、一般的に、ＩｇＥを含まないが、身体の病原体排除能を促進する自然免疫系の一部である補体系の活性化の結果として生じる。次の経路の１つ以上、古典的な補体経路（ＣＰ）、代替的経路（ＡＰ）およびレクチン経路（ＬＰ）がＣＡＲＰＡに関与し得る。Ｓｚｅｂｅｎｉ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６１：１６３－１７３（２０１４）。
古典的経路は、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓまたはＣ１ｑｒ２ｓ２を含有するＣ１－複合体の活性化により引き起こされる。Ｃ１－複合体の活性化は、Ｃ１ｑが抗原と複合体形成するＩｇＭまたはＩｇＧに結合したとき、またはＣ１ｑが病原体の表面に直接結合したときに起こる。このような結合は、Ｃ１ｑ分子における立体構造変化につながり、これがＣ１ｒの活性化につながり、続いてＣ１ｓを開裂させる。現在、Ｃ１ｒ２ｓ２構成要素はＣ４および次いでＣ２を開裂させ、Ｃ４ａ、Ｃ４ｂ、Ｃ２ａおよびＣ２ｂを生じさせる。Ｃ４ｂおよびＣ２ｂは、結合して古典的な経路Ｃ３－コンバターゼ（Ｃ４ｂ２ｂ複合体）を形成させ、Ｃ３ａおよびＣ３ｂへのＣ３の開裂を促進する。次いで、Ｃ３ｂは、Ｃ３コンバターゼに結合してＣ５コンバターゼ（Ｃ４ｂ２ｂ３ｂ複合体）を形成させる。代替経路は、自発的なＣ３加水分解の結果として連続的に活性化される。Ｐ因子（プロパージン）は、代替経路の正の制御因子である。プロパージンのオリゴマー化によってＣ３コンバターゼが安定化し、次いでより多くのＣ３を開裂させ得る。Ｃ３分子は表面に結合し、より多くのＢ、ＤおよびＰ活性を補充し得、これが補体活性化の増幅につながる。
急性期反応（ＡＰＲ）は、感染を防ぎ、病原体の可能性のあるものを排除するための複雑な全身性の自然免疫反応である。多くのタンパク質がＡＰＲに関与し、Ｃ－反応タンパク質は、特徴がよく分かっているものである。
本発明によれば、インビボでの投与のほぼ直後にある種のＬＮＰが血小板と物理的に会合可能である一方、他のＬＮＰは、血小板と全く会合しないかまたはバックグランドレベルでのみ会合することが分かった。顕著には、血小板と会合するこれらのＬＮＰは、その後に形成される血小板凝集体も明らかに安定化させる。ある種のＬＮＰとの血小板の物理的接触は、このような血小板が投与後長時間にわたり依然として凝集するかまたは連続的に凝集体を形成する能力に相関する。このような凝集体は、活性化血小板およびまたマクロファージおよびＢ細胞などの自然免疫細胞も含む。
ａ．脂質化合物
本開示は、有利な特性を有する医薬組成物を提供する。例えば、本明細書中に記載の脂質（例えば、式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）の何れかを有するものは、哺乳動物細胞または臓器への治療薬および／または予防薬の送達のために脂質ナノ粒子組成物において有利に使用され得る。例えば、本明細書中に記載の脂質は、免疫原性が殆どないかまたは全くない。例えば、本明細書中で開示される脂質化合物の免疫原性は、参照脂質（例えば、ＭＣ３、ＫＣ２またはＤＬｉｎＤＭＡ）と比較してより低い。例えば、本明細書中で開示される脂質および治療薬または予防薬を含む処方物の治療指数は、参照脂質（例えば、ＭＣ３、ＫＣ２またはＤＬｉｎＤＭＡ）および同じ治療薬または予防薬を含む対応する処方物と比較して向上している。特に、本願は、
（ａ）リラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、
（ｂ）送達剤と
を含む医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、本送達剤は、式（Ｉ）
Figure 0007459172000010
（式中、
Ｒ１は、Ｃ５３０アルキル、Ｃ５２０アルケニル、Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’および－Ｒ’’Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１１４アルキル、Ｃ２１４アルケニル、Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’およびＲ＊ＯＲ’’からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらが連結される原子と一緒に複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３６炭素環、（ＣＨ２）ｎＱ、（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、ＣＱ（Ｒ）２および未置換Ｃ１６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、炭素環、複素環、ＯＲ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＣＸ３、ＣＸ２Ｈ、ＣＸＨ２、ＣＮ、Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲおよびＣ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、かつ各ｎは、１、２、３、４および５から独立して選択され、
各Ｒ５は、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ６は、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
ＭおよびＭ’は、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｓ、ＳＣ（Ｓ）、ＣＨ（ＯＨ）、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、－Ｓ－Ｓ－、アリール基およびヘテロアリール基から独立して選択され、Ｒ７は、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３～６炭素環および複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１～６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ３～６炭素環および複素環からなる群から選択され、
各Ｒは、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、各Ｒ’は、Ｃ１１８アルキル、Ｃ２１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’およびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ’’は、Ｃ３１４アルキルおよびＣ３１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｒ＊は、Ｃ１１２アルキルおよびＣ２１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｙは、独立してＣ３６炭素環であり、
各Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から独立して選択され、およびｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３から選択される）
を有する脂質化合物またはその塩もしくは立体異性体を含む。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、
Ｒ１が、Ｃ５２０アルキル、Ｃ５２０アルケニル、Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’および－Ｒ’’Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３が、Ｈ、Ｃ１１４アルキル、Ｃ２１４アルケニル、Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’およびＲ＊ＯＲ’’からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２およびＲ３が、それらが連結される原子と一緒に複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３６炭素環、（ＣＨ２）ｎＱ、（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、ＣＱ（Ｒ）２および未置換Ｃ１６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑが、炭素環、複素環、ＯＲ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＣＸ３、ＣＸ２Ｈ、ＣＸＨ２、ＣＮ、Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２および－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、かつ各ｎが、１、２、３、４および５から独立して選択され、
各Ｒ５が、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ６が、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
ＭおよびＭ’が、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｓ、ＳＣ（Ｓ）、ＣＨ（ＯＨ）、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、アリール基およびヘテロアリール基から独立して選択され、
Ｒ７が、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から選択され、
各Ｒが、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、各Ｒ’が、Ｃ１１８アルキル、Ｃ２１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’およびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ’’が、Ｃ３１４アルキルおよびＣ３１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｒ＊が、Ｃ１１２アルキルおよびＣ２１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｙが、独立してＣ３６炭素環であり、
各Ｘが、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から独立して選択され、およびｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含み、アルキルおよびアルケニル基は、直鎖状または分岐状であり得る。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、Ｒ４が（ＣＨ２）ｎＱ、（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、ＣＨＱＲまたはＣＱ（Ｒ）２である場合、（ｉ）ｎが１、２、３、４または５であるとき、Ｑが、Ｎ（Ｒ）２ではないか、または（ｉｉ）ｎが１または２であるとき、Ｑが、５、６または７員ヘテロシクロアルキルではないものを含む。
別の実施形態において、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、
Ｒ１が、Ｃ５３０アルキル、Ｃ５２０アルケニル、Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’および－Ｒ’’Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３が、Ｈ、Ｃ１１４アルキル、Ｃ２１４アルケニル、Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’およびＲ＊ＯＲ’’からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２およびＲ３が、それらが連結される原子と一緒に複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３６炭素環、（ＣＨ２）ｎＱ、（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、ＣＱ（Ｒ）２および未置換Ｃ１６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑが、Ｃ３６炭素環、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロアリール、ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＣＸ３、ＣＸ２Ｈ、ＣＸＨ２、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲならびにオキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノおよびＣ１３アルキルから選択される１つ以上の置換基で置換される、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロアルキルから選択され、かつ各ｎが、１、２、３、４および５から独立して選択され、
各Ｒ５が、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ６が、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
ＭおよびＭ’が、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｓ、ＳＣ（Ｓ）、ＣＨ（ＯＨ）、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、－Ｓ－Ｓ－、アリール基およびヘテロアリール基から独立して選択され、Ｒ７が、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から選択され、
Ｒ８が、Ｃ３～６炭素環および複素環からなる群から選択され、
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１～６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ３～６炭素環および複素環からなる群から選択され、
各Ｒが、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、各Ｒ’が、Ｃ１１８アルキル、Ｃ２１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’およびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ’’が、Ｃ３１４アルキルおよびＣ３１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｒ＊が、Ｃ１１２アルキルおよびＣ２１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｙが、独立してＣ３６炭素環であり、
各Ｘが、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から独立して選択され、および
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
別の実施形態において、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、
Ｒ１が、Ｃ５３０アルキル、Ｃ５２０アルケニル、Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’および－Ｒ’’Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３が、Ｈ、Ｃ１１４アルキル、Ｃ２１４アルケニル、Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’およびＲ＊ＯＲ’’からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２およびＲ３が、それらが連結される原子と一緒に複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３６炭素環、（ＣＨ２）ｎＱ、（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、ＣＱ（Ｒ）２および未置換Ｃ１６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑが、Ｃ３６炭素環
、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロアリール、ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＣＸ３、ＣＸ２Ｈ、ＣＸＨ２、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲならびにオキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノおよびＣ１３アルキルから選択される１つ以上の置換基で置換される、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロシクロアルキルから選択され、かつ各ｎが、１、２、３、４および５から独立して選択され、
各Ｒ５が、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ６が、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
ＭおよびＭ’が、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｓ、ＳＣ（Ｓ）、ＣＨ（ＯＨ）、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、アリール基およびヘテロアリール基から独立して選択され、
Ｒ７が、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から選択され、
各Ｒが、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、各Ｒ’が、Ｃ１１８アルキル、Ｃ２１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’およびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ’’が、Ｃ３１４アルキルおよびＣ３１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｒ＊が、Ｃ１１２アルキルおよびＣ２１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｙが、独立してＣ３６炭素環であり、
各Ｘが、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から独立して選択され、および
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
また別の実施形態において、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、
Ｒ１が、Ｃ５２０アルキル、Ｃ５２０アルケニル、Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’および－Ｒ’’Ｍ’Ｒ’Ｒ＊からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３が、Ｈ、Ｃ１１４アルキル、Ｃ２１４アルケニル、Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’およびＲ＊ＯＲ’’からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２およびＲ３が、それらが連結される原子と一緒に複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３６炭素環、（ＣＨ２）ｎＱ、（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、ＣＱ（Ｒ）２および未置換Ｃ１６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑが、Ｃ３６炭素環、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員の複素環、ＯＲ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＣＸ３、ＣＸ２Ｈ、ＣＸＨ２、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｎ（Ｒ）Ｒ８、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲおよびＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２から選択され、かつ各ｎが、１、２、３、４および５から独立して選択され、Ｑが５～１４員の複素環であり、かつ（ｉ）Ｒ４が（ＣＨ２）ｎＱであり、ｎが１または２であるか、または（ｉｉ）Ｒ４が（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、ｎが１であるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４がＣＨＱＲおよびＣＱ（Ｒ）２である場合、Ｑが、５～１４員のヘテロアリールまたは８～１４員のヘテロシクロアルキルの何れかであり、
各Ｒ５が、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ６が、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
ＭおよびＭ’が、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｓ、ＳＣ（Ｓ）、ＣＨ（ＯＨ）、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、－Ｓ－Ｓ－、アリール基およびヘテロアリール基から独立して選択され、Ｒ７が、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から選択され、
Ｒ８が、Ｃ３～６炭素環および複素環からなる群から選択され、
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１～６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ３～６炭素環および複素環からなる群から選択され、
各Ｒが、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、各Ｒ’が、Ｃ１１８アルキル、Ｃ２１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’およびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ’’が、Ｃ３１４アルキルおよびＣ３１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｒ＊が、Ｃ１１２アルキルおよびＣ２１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｙが、独立してＣ３６炭素環であり、
各Ｘが、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から独立して選択され、および
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
また別の実施形態において、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、
Ｒ１が、Ｃ５２０アルキル、Ｃ５２０アルケニル、Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’および－Ｒ’’Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３が、Ｈ、Ｃ１１４アルキル、Ｃ２１４アルケニル、Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’およびＲ＊ＯＲ’’からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２およびＲ３が、それらが連結される原子と一緒に複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３６炭素環、（ＣＨ２）ｎＱ、（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、ＣＱ（Ｒ）２および未置換Ｃ１６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑが、Ｃ３６炭素環、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員の複素環、ＯＲ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＣＸ３、ＣＸ２Ｈ、ＣＸＨ２、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、かつ各ｎが、１、２、３、４および５から独立して選択され、Ｑが５～１４員の複素環であり、かつ（ｉ）Ｒ４が、（ＣＨ２）ｎＱであり、ｎが１または２であるか、または（ｉｉ）Ｒ４が（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、ｎが１であるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４がＣＨＱＲおよびＣＱ（Ｒ）２である場合、Ｑが、５～１４員のヘテロアリールまたは８～１４員のヘテロシクロアルキルの何れかであり、
各Ｒ５が、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ６が、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
ＭおよびＭ’が、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｓ、ＳＣ（Ｓ）、ＣＨ（ＯＨ）、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、アリール基およびヘテロアリール基から独立して選択され、
Ｒ７が、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から選択され、
各Ｒが、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ’が、Ｃ１１８アルキル、Ｃ２１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’およびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ’’が、Ｃ３１４アルキルおよびＣ３１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｒ＊が、Ｃ１１２アルキルおよびＣ２１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｙが、独立してＣ３６炭素環であり、
各Ｘが、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から独立して選択され、および
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
さらに別の実施形態において、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、
Ｒ１が、Ｃ５３０アルキル、Ｃ５２０アルケニル、Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’および－Ｒ’’Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３が、Ｈ、Ｃ１１４アルキル、Ｃ２１４アルケニル、Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’およびＲ＊ＯＲ’’からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２およびＲ３が、それらが連結される原子と一緒に複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３６炭素環、（ＣＨ２）ｎＱ、（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、ＣＱ（Ｒ）２および未置換Ｃ１６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑが、Ｃ３６炭素環、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロアリール、－ＯＲ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＣＸ３、ＣＸ２Ｈ、ＣＸＨ２、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲおよびＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２から選択され、かつ各ｎが、１、２、３、４および５から独立して選択され、
各Ｒ５が、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ６が、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
ＭおよびＭ’が、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｓ、ＳＣ（Ｓ）、ＣＨ（ＯＨ）、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、－Ｓ－Ｓ－、アリール基およびヘテロアリール基から独立して選択され、Ｒ７が、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から選択され、
Ｒ８が、Ｃ３～６炭素環および複素環からなる群から選択され、
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１～６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ３～６炭素環および複素環からなる群から選択され、
各Ｒが、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、各Ｒ’が、Ｃ１１８アルキル、Ｃ２１８アルケニル、Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’およびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ’’が、Ｃ３～１４アルキルおよびＣ３１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｒ＊が、Ｃ１１２アルキルおよびＣ２１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｙが、独立してＣ３６炭素環であり、
各Ｘが、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から独立して選択され、および
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
さらに別の実施形態において、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、
Ｒ１が、Ｃ５２０アルキル、Ｃ５２０アルケニル、Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’および－Ｒ’’Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３が、Ｈ、Ｃ１１４アルキル、Ｃ２１４アルケニル、Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’およびＲ＊ＯＲ’’からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２およびＲ３が、それらが連結される原子と一緒に複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３６炭素環、（ＣＨ２）ｎＱ、（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、ＣＱ（Ｒ）２および未置換Ｃ１６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑが、Ｃ３６炭素環、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロアリール、－ＯＲ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＣＸ３、ＣＸ２Ｈ、ＣＸＨ２、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、かつ各ｎが、１、２、３、４および５から独立して選択され、
各Ｒ５が、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ６が、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
ＭおよびＭ’が、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｓ、ＳＣ（Ｓ）、ＣＨ（ＯＨ）、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、アリール基およびヘテロアリール基から独立して選択され、
Ｒ７が、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から選択され、
各Ｒが、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、各Ｒ’が、Ｃ１１８アルキル、Ｃ２１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’およびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ’’が、Ｃ３ー１４アルキルおよびＣ３１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｒ＊が、Ｃ１１２アルキルおよびＣ２１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｙが、独立してＣ３６炭素環であり、
各Ｘが、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から独立して選択され、および
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
また別の実施形態において、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、
Ｒ１が、Ｃ５３０アルキル、Ｃ５２０アルケニル、Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’および－Ｒ’’Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３が、Ｈ、Ｃ２１４アルキル、Ｃ２１４アルケニル、Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’およびＲ＊ＯＲ’’からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２およびＲ３が、それらが連結される原子と一緒に複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４が、（ＣＨ２）ｎＱまたは（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、ここで、Ｑが、Ｎ（Ｒ）２であり、かつｎが、３、４および５から選択され、
各Ｒ５が、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ６が、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
ＭおよびＭ’が、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）、
－Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｓ、ＳＣ（Ｓ）、ＣＨ（ＯＨ）、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、－Ｓ－Ｓ－、アリール基およびヘテロアリール基から独立して選択され、Ｒ７が、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から選択され、
各Ｒが、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、各Ｒ’が、Ｃ１１８アルキル、Ｃ２１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’およびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ’’が、Ｃ３１４アルキルおよびＣ３１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｒ＊が、Ｃ１１２アルキルおよびＣ１１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｙが、独立してＣ３６炭素環であり、
各Ｘが、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から独立して選択され、および
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
また別の実施形態において、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、
Ｒ１が、Ｃ５２０アルキル、Ｃ５２０アルケニル、Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’および－Ｒ’’Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３が、Ｈ、Ｃ２１４アルキル、Ｃ２１４アルケニル、Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’およびＲ＊ＯＲ’’からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２およびＲ３が、それらが連結される原子と一緒に複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４が、（ＣＨ２）ｎＱまたは（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、ここで、Ｑが、Ｎ（Ｒ）２であり、かつｎが、３、４および５から選択され、
各Ｒ５が、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ６が、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
ＭおよびＭ’が、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｓ、ＳＣ（Ｓ）、ＣＨ（ＯＨ）、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、アリール基およびヘテロアリール基から独立して選択され、
Ｒ７が、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から選択され、
各Ｒが、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、各Ｒ’が、Ｃ１１８アルキル、Ｃ２１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’およびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ’’が、Ｃ３１４アルキルおよびＣ３１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｒ＊が、Ｃ１１２アルキルおよびＣ１１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｙが、独立してＣ３６炭素環であり、
各Ｘが、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から独立して選択され、および
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
さらに他の実施形態において、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、
Ｒ１が、Ｃ５３０アルキル、Ｃ５２０アルケニル、Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’および－Ｒ’’Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３が、Ｃ１１４アルキル、Ｃ２１４アルケニル、Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’およびＲ＊ＯＲ’’からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２およびＲ３が、それらが連結される原子と一緒に複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４が、（ＣＨ２）ｎＱ、（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、ＣＨＱＲおよびＣＱ（Ｒ）２からなる
群から選択され、ここで、Ｑが、Ｎ（Ｒ）２であり、かつｎが、１、２、３、４および５から選択され、
各Ｒ５が、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ６が、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
ＭおよびＭ’が、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｓ、ＳＣ（Ｓ）、ＣＨ（ＯＨ）、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、－Ｓ－Ｓ－、アリール基およびヘテロアリール基から独立して選択され、Ｒ７が、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から選択され、
各Ｒが、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、各Ｒ’が、Ｃ１～１８アルキル、Ｃ２～１８アルケニル、Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’およびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ’’が、Ｃ３１４アルキルおよびＣ３１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｒ＊が、Ｃ１１２アルキルおよびＣ１１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｙが、独立してＣ３６炭素環であり、
各Ｘが、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から独立して選択され、および
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
さらに他の実施形態において、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、
Ｒ１が、Ｃ５２０アルキル、Ｃ５２０アルケニル、Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’および－Ｒ’’Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ３が、Ｃ１１４アルキル、Ｃ２１４アルケニル、Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’およびＲ＊ＯＲ’’からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２およびＲ３が、それらが連結される原子と一緒に複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４が、（ＣＨ２）ｎＱ、（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、ＣＨＱＲおよびＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、ここで、Ｑが、Ｎ（Ｒ）２であり、かつｎが、１、２、３、４および５から選択され、
各Ｒ５が、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ６が、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、
ＭおよびＭ’が、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｓ、ＳＣ（Ｓ）、ＣＨ（ＯＨ）、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、アリール基およびヘテロアリール基から独立して選択され、
Ｒ７が、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から選択され、
各Ｒが、Ｃ１３アルキル、Ｃ２３アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、各Ｒ’が、Ｃ１～１８アルキル、Ｃ２～１８アルケニル、Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’およびＨからなる群から独立して選択され、
各Ｒ’’が、Ｃ３１４アルキルおよびＣ３１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｒ＊が、Ｃ１１２アルキルおよびＣ１１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｙが、独立してＣ３６炭素環であり、
各Ｘが、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から独立して選択され、および
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＡ）：
Figure 0007459172000011
（式中、ｌは、１、２、３、４および５から選択され、ｍは、５、６、７、８および９から選択され、Ｍ１は、結合またはＭ’であり、Ｒ４は、未置換Ｃ１３アルキルまたは（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、Ｑは、ＯＨ、ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、ＭおよびＭ’は、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ、－Ｓ－Ｓ－、アリール基およびヘテロアリール基から独立して選択され、および
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１１４アルキルおよびＣ２１４アルケニルからなる群から独立して選択される）のものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＡ）
（式中、ｌは、１、２、３、４および５から選択され、ｍは、５、６、７、８および９から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、未置換Ｃ１３アルキルまたは（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、Ｑは、ＯＨ、ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり、
ＭおよびＭ’は、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ、アリール基およびヘテロアリール基から独立して選択され、および
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１１４アルキルおよびＣ２１４アルケニルからなる群から独立して選択される）
のものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＩ）：
Figure 0007459172000012
（式中、ｌは、１、２、３、４および５から選択され、Ｍ１は、結合またはＭ’であり、Ｒ４は、未置換Ｃ１３アルキルまたは（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、ｎは、２、３または４であり、かつＱは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｒ８、ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、ＭおよびＭ’は、Ｃ（Ｏ）Ｏ、
ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ、－Ｓ－Ｓ－、アリール基およびヘテロアリール基から独立して選択され、および
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１１４アルキルおよびＣ２１４アルケニルからなる群から独立して選択される）のものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＩ）
（式中、ｌは、１、２、３、４および５から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、未置換Ｃ１３アルキルまたは（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、ｎは、２、３または４であり、かつＱは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２またはＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり、
ＭおよびＭ’は、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ、アリール基およびヘテロアリール基から独立して選択され、および
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１１４アルキルおよびＣ２１４アルケニルからなる群から独立して選択される）
のものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩａ）
Figure 0007459172000013
（式中、Ｒ４は、上記のとおりである）
のものまたはその塩である。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｂ）
Figure 0007459172000014
（式中、Ｒ４は、上記のとおりである）
のものまたはその塩である。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｃ）
Figure 0007459172000015
（式中、Ｒ４は、上記のとおりである）
のものまたはその塩である。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｅ）
Figure 0007459172000016
（式中、Ｒ４は、上記のとおりである）
のものまたはその塩である。
いくつかの実施形態において、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）または（ＩＩｅ）の化合物は、（ＣＨ２）ｎＱおよび（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ（式中、Ｑ、Ｒおよびｎは、上記で定められるとおりである）から選択されるＲ４を含む。
いくつかの実施形態において、Ｑは、ＯＲ、ＯＨ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＣＸ３、ＣＮ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）および複素環（式中、Ｒは、上記で定められるとおりである）からなる群から選択される。いくつかの態様において、ｎは、１または２である。いくつかの実施形態において、Ｑは、ＯＨ、ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２またはＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２である。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｄ）
Figure 0007459172000017
（式中、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ５１４アルキルおよびＣ５１４アルケニルからなる群から独立して選択され、ｎは、２、３および４から選択され、およびＲ’、Ｒ’’、Ｒ５、Ｒ６およびｍは、上記で定められるとおりである）
のものまたはその塩である。
式（ＩＩｄ）の化合物のいくつかの態様において、Ｒ２は、Ｃ８アルキルである。式（ＩＩｄ）の化合物のいくつかの態様において、Ｒ３は、Ｃ５Ｃ９アルキルである。式（ＩＩｄ）の化合物のいくつかの態様において、ｍは、５、７または９である。式（ＩＩｄ）の化合物のいくつかの態様において、各Ｒ５は、Ｈである。式（ＩＩｄ）の化合物のいくつかの態様において、各Ｒ６は、Ｈである。
別の態様において、本願は、（１）式（Ｉ）を有する化合物、（２）任意選択によりヘルパー脂質（例えば、リン脂質）、（３）任意選択により構造脂質（例えば、ステロール）、および（４）任意選択により脂質複合物（例えば、ＰＥＧ－脂質）を含む脂質組成物（例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ））を提供する。代表的な実施形態において、本脂質組成物（例えば、ＬＮＰ）は、リラキシンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えばそれに封入されるポリヌクレオチドをさらに含む。
本明細書中で使用される場合、「アルキル」または「アルキル基」という用語は、１つ以上の炭素原子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれを超える炭素原子）を含む直鎖状または分岐状、飽和炭化水素を意味する。
「Ｃ１１４」アルキルという表示法は、１～１４の炭素原子を含む直鎖状または分岐状の飽和炭化水素を意味する。アルキル基は、任意選択により置換され得る。
本明細書中で使用される場合、「アルケニル」または「アルケニル基」という用語は、２つ以上の炭素原子（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれを超える炭素原子）および少なくとも１つの二重結合を含む直鎖状または分岐状炭化水素を意味する。
「Ｃ２１４アルケニル」という表示法は、２～１４の炭素原子および少なくとも１つの二重結合を含む直鎖状または分岐状炭化水素を意味する。アルケニル基は、１、２、３、４つまたはそれを超える二重結合を含み得る。例えば、Ｃ１８アルケニルは、１つ以上の二重結合を含み得る。２つの二重結合を含むＣ１８アルケニル基は、リノレイル基であり得る。アルケニル基は、任意選択により置換され得る。
本明細書中で使用される場合、「炭素環」または「炭素環基」という用語は、１つ以上の炭素原子の環を含む単または多環系を意味する。環は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５員環であり得る。
「Ｃ３６炭素環」という表示法は、３～６つの炭素原子を有する単環を含む炭素環を意味する。炭素環は、１つ以上の二重結合を含み得、芳香環（例えば、アリール基）であり得る。炭素環の例としては、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、フェニル、ナフチルおよび１，２－ジヒドロナフチル基が挙げられる。炭素環は、任意選択により置換され得る。
本明細書中で使用される場合、「複素環」または「複素環基」という用語は、少なくとも１つの環が少なくとも１つのヘテロ原子を含む１つ以上の環を含む単または多環系を意味する。ヘテロ原子は、例えば、窒素、酸素または硫黄原子であり得る。環は、３、４、
５、６、７、８、９、１０、１１または１２員環であり得る。複素環は、１つ以上の二重結合を含み得、芳香環（例えば、ヘテロアリール基）であり得る。複素環の例としては、イミダゾリル、イミダゾリジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、チアゾリル、チアゾリジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリル、イソオキサゾリジニル、イソオキサゾリル、イソチアゾリジニル、イソチアゾリル、モルホリニル、ピロリル、ピロリジニル、フリル、テトラヒドロフリル、チオフェニル、ピリジニル、ピペリジニル、キノリルおよびイソキノリル基が挙げられる。複素環は、任意選択により置換され得る。
本明細書中で使用される場合、「生体分解基」は、対象における脂質のより速い代謝を促進し得る基である。生体分解基は、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｓ、ＳＣ（Ｓ）、ＣＨ（ＯＨ）、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、アリール基およびヘテロアリール基であり得るが限定されない。
本明細書中で使用される場合、「アリール基」は、１つ以上の芳香環を含む炭素環基である。アリール基の例としては、フェニルおよびナフチル基が挙げられる。
本明細書中で使用される場合、「ヘテロアリール基」は、１つ以上の芳香環を含む複素環基である。ヘテロアリール基の例としては、ピロリル、フリル、チオフェニル、イミダゾリル、オキサゾリルおよびチアゾリルが挙げられる。アリールおよびヘテロアリール基の両方とも任意選択により置換され得る。例えば、ＭおよびＭ’は、任意選択により置換フェニル、オキサゾールおよびチアゾールからなる非限定群から選択され得る。本明細書中の式において、ＭおよびＭ’は、上記の生体分解基のリストから独立して選択され得る。
アルキル、アルケニルおよびシクリル（例えば、カルボシクリルおよびヘテロシクリル）基は、別段の指定がない限り、任意選択により置換され得る。任意選択の置換基は、ハロゲン原子（例えば、塩素、臭素、フッ素またはヨウ素基）、カルボン酸（例えば、Ｃ（Ｏ）ＯＨ）、アルコール（例えば、ヒドロキシル、ＯＨ）、エステル（例えば、Ｃ（Ｏ）ＯＲまたはＯＣ（Ｏ）Ｒ）、アルデヒド（例えば、Ｃ（Ｏ）Ｈ）、カルボニル（例えば、Ｃ（Ｏ）Ｒ、あるいはＣ＝Ｏにより表される）、アシルハロゲン化物（例えば、Ｃ（Ｏ）Ｘ（式中、Ｘは、臭素、フッ素、塩素およびヨウ素から選択されるハロゲン化物）、炭酸基（例えば、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ）、アルコキシ（例えば、ＯＲ）、アセタール（例えば、－Ｃ（ＯＲ）２Ｒ’’’’、ここで、各ＯＲは、同じまたは異なり得るアルコキシ基であり、Ｒ’’’’はアルキルまたはアルケニル基である）、リン酸基（例えば、Ｐ（Ｏ）４ ３）、チオール（例えば、ＳＨ）、スルホキシド（例えば、Ｓ（Ｏ）Ｒ）、スルフィン酸（例えば、Ｓ（Ｏ）ＯＨ）、スルホン酸（例えば、Ｓ（Ｏ）２ＯＨ）、チアール（例えば、Ｃ（Ｓ）Ｈ）、硫酸基（例えば、Ｓ（Ｏ）４ ２）、スルホニル（例えば、Ｓ（Ｏ）２）、アミド（例えば、Ｃ（Ｏ）ＮＲ２または－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ）、アジド（例えば、Ｎ３）、ニトロ（例えば、ＮＯ２）、シアノ（例えば、ＣＮ）、イソシアノ（例えば、－ＮＣ）、アシルオキシ（例えば、ＯＣ（Ｏ）Ｒ）、アミノ（例えば、ＮＲ２、ＮＲＨまたはＮＨ２）、カルバモイル（例えば、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、ＯＣ（Ｏ）ＮＲＨまたはＯＣ（Ｏ）ＮＨ２）、スルホンアミド（例えば、Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、Ｓ（Ｏ）２ＮＲＨ、－Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２、Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２ＨまたはＮ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｈ）、アルキル基、アルケニル基およびシクリル（例えば、カルボシクリルまたはヘテロシクリル）基からなる群から選択され得るが限定されない。
先行するものの何れかにおいて、Ｒは、本明細書中で定義されるようなアルキルまたはアルケニル基である。いくつかの実施形態において、置換基自体が、例えば本明細書中で定義されるような１、２、３、４、５または６つの置換基でさらに置換され得る。例えば
、Ｃ１６アルキル基は、本明細書中に記載のような１、２、３、４、５または６つの置換基でさらに置換され得る。
式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）および（ＩＩｅ）の何れか１つの化合物は、適用可能である場合、次の特性の１つ以上を含む。
いくつかの実施形態において、Ｒ４は、Ｃ３６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、ＣＨＱＲおよびＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、ここで、Ｑは、Ｃ３６炭素環、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＰから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員芳香または非芳香複素環、ＯＲ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＣＸ３、ＣＸ２Ｈ、ＣＸＨ２、－ＣＮ、Ｎ（Ｒ）２、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２および－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、かつ各ｎは、１、２、３、４および５から独立して選択される。
別の実施形態において、Ｒ４は、Ｃ３６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、ＣＨＱＲおよびＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、ここで、Ｑは、Ｃ３６炭素環、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロアリール、ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＣＸ３、ＣＸ２Ｈ、ＣＸＨ２、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲならびにオキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノおよびＣ１３アルキルから選択される１つ以上の置換基で置換される、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロシクロアルキルから選択され、かつ各ｎは、１、２、３、４および５から独立して選択される。
別の実施形態において、Ｒ４は、Ｃ３６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、ＣＨＱＲおよびＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、ここで、Ｑは、Ｃ３６炭素環、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員の複素環、ＯＲ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＣＸ３、ＣＸ２Ｈ、ＣＸＨ２、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、かつ各ｎは、１、２、３、４および５から独立して選択され、Ｑが５～１４員の複素環である場合、（ｉ）Ｒ４が（ＣＨ２）ｎＱであり、ｎが１または２であるか、または（ｉｉ）Ｒ４が（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、ｎが１であるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４がＣＨＱＲおよびＣＱ（Ｒ）２であるとき、Ｑは、５～１４員のヘテロアリールまたは８～１４員のヘテロシクロアルキルの何れかである。
別の実施形態において、Ｒ４は、Ｃ３６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、ＣＨＱＲおよびＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、ここで、Ｑは、Ｃ３６炭素環、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロアリール、ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＣＸ３、ＣＸ２Ｈ、ＣＸＨ２、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、かつ各ｎは、１、２、３、４および５から独立して選択される。
別の実施形態において、Ｒ４は、未置換Ｃ１４アルキル、例えば未置換メチルである。
特定の実施形態において、本開示は、Ｒ４が（ＣＨ２）ｎＱまたは（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、ここで、Ｑが、Ｎ（Ｒ）２であり、かつｎが、３、４および５から選択される式（Ｉ）を有する化合物を提供する。
特定の実施形態において、本開示は、Ｒ４が（ＣＨ２）ｎＱ、（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、ＣＨＱＲおよび－ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、ここで、Ｑが、Ｎ（Ｒ）２であり、かつｎが、１、２、３、４および５から選択される式（Ｉ）を有する化合物を提供する。
特定の実施形態において、本開示は、Ｒ２およびＲ３が、Ｃ２１４アルキル、Ｃ２１４アルケニル、Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’およびＲ＊ＯＲ’’からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２およびＲ３が、それらが連結される原子と一緒に複素環または炭素環を形成し、Ｒ４が、（ＣＨ２）ｎＱまたは（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、ここで、Ｑが、－Ｎ（Ｒ）２であり、かつｎが、３、４および５から選択される式（Ｉ）を有する化合物を提供する。
特定の実施形態において、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ２１４アルキル、Ｃ２１４アルケニル、Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’およびＲ＊ＯＲ’’からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、それらが連結される原子と一緒に複素環または炭素環を形成する。
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、Ｃ５２０アルキルおよびＣ５２０アルケニルからなる群から選択される。
他の実施形態において、Ｒ１は、Ｒ＊ＹＲ’’、ＹＲ’’および－Ｒ’’Ｍ’Ｒ’からなる群から選択される。
特定の実施形態において、Ｒ１は、Ｒ＊ＹＲ’’およびＹＲ’’から選択される。いくつかの実施形態において、Ｙは、シクロプロピル基である。いくつかの実施形態において、Ｒ＊は、Ｃ８アルキルまたはＣ８アルケニルである。特定の実施形態において、Ｒ’’は、Ｃ３１２アルキルである。例えば、Ｒ’’は、Ｃ３アルキルであり得る。例えば、Ｒ’’は、Ｃ４８アルキル（例えば、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８アルキル）であり得る。
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、Ｃ５２０アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１は、Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１は、Ｃ８アルキルである。他の実施形態において、Ｒ１は、Ｃ９アルキルである。特定の実施形態において、Ｒ１は、Ｃ１４アルキルである。他の実施形態において、Ｒ１は、Ｃ１８アルキルである。
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、Ｃ５２０アルケニルである。特定の実施形態において、Ｒ１は、Ｃ１８アルケニルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１は、リノレイルである。
特定の実施形態において、Ｒ１は、分岐状（例えば、デカン－２－イル、ウンデカン－３－イル、ドデカン－４－イル、トリデカン－５－イル、テトラデカン－６－イル、２－メチルウンデカン－３－イル、２－メチルデカン－２－イル、３－メチルウンデカン－３－イル、４－メチルドデカン－４－イルまたはヘプタデカ－９－イル）である。特定の実施形態において、Ｒ１は、
Figure 0007459172000018
である。
特定の実施形態において、Ｒ１は、未置換Ｃ５２０アルキルまたはＣ５２０アルケニルである。特定の実施形態において、Ｒ’は、置換Ｃ５２０アルキルまたはＣ５２０アルケニル（例えば、１－シクロプロピルノニルなどのＣ３６炭素環で置換される）である。
他の実施形態において、Ｒ１は、Ｒ’’Ｍ’Ｒ’である。
いくつかの実施形態において、Ｒ’は、Ｒ＊ＹＲ’’およびＹＲ’’から選択される。いくつかの実施形態において、Ｙは、Ｃ３８シクロアルキルである。いくつかの実施形態において、Ｙは、Ｃ６１０アリールである。いくつかの実施形態において、Ｙは、シクロプロピル基である。いくつかの実施形態において、Ｙは、シクロヘキシル基である。特定の実施形態において、Ｒ＊は、Ｃ１アルキルである。
いくつかの実施形態において、Ｒ’’は、Ｃ３～１２アルキルおよびＣ３１２アルケニルからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Ｙに隣接するＲ’’は、Ｃ１アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｙに隣接するＲ’’は、Ｃ４９アルキル（例えば、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８またはＣ９アルキル）である。
いくつかの実施形態において、Ｒ’は、Ｃ４アルキルおよびＣ４アルケニルから選択される。特定の実施形態において、Ｒ’は、Ｃ５アルキルおよびＣ５アルケニルから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ’は、Ｃ６アルキルおよびＣ６アルケニルから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ’は、Ｃ７アルキルおよびＣ７アルケニルから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ’は、Ｃ９アルキルおよびＣ９アルケニルから選択される。
他の実施形態において、Ｒ’は、Ｃ１１アルキルおよびＣ１１アルケニルから選択される。他の実施形態において、Ｒ’は、Ｃ１２アルキル、Ｃ１２アルケニル、Ｃ１３アルキル、Ｃ１３アルケニル、Ｃ１４アルキル、Ｃ１４アルケニル、Ｃ１５アルキル、Ｃ１５アルケニル、Ｃ１６アルキル、Ｃ１６アルケニル、Ｃ１７アルキル、Ｃ１７アルケニル、Ｃ１８アルキルおよびＣ１８アルケニルから選択される。特定の実施形態において、Ｒ’は、分岐状（例えば、デカン－２－イル、ウンデカン－３－イル、ドデカン－４－イル、トリデカン－５－イル、テトラデカン－６－イル、２－メチルウンデカン－３－イル、２－メチルデカン－２－イル、３－メチルウンデカン－３－イル、４－メチルドデカン－４－イルまたはヘプタデカ－９－イル）である。特定の実施形態において、Ｒ’は、
Figure 0007459172000019
である。
特定の実施形態において、Ｒ’は、未置換Ｃ１１８アルキルである。特定の実施形態に
おいて、Ｒ’は、置換Ｃ１１８アルキル（例えば、１－シクロプロピルノニルなどのＣ３６炭素環で置換されるＣ１１５アルキル）である。
いくつかの実施形態において、Ｒ’’は、Ｃ３１４アルキルおよびＣ３１４アルケニルからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ’’は、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキル、Ｃ６アルキル、Ｃ７アルキルまたはＣ８アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ’’は、Ｃ９アルキル、Ｃ１０アルキル、Ｃ１１アルキル、Ｃ１２アルキル、Ｃ１３アルキルまたはＣ１４アルキルである。
いくつかの実施形態において、Ｍ’は、Ｃ（Ｏ）Ｏである。いくつかの実施形態において、Ｍ’は、ＯＣ（Ｏ）である。
他の実施形態において、Ｍ’は、アリール基またはヘテロアリール基である。例えば、Ｍ’は、フェニル、オキサゾールおよびチアゾールからなる群から選択され得る。
いくつかの実施形態において、Ｍは、Ｃ（Ｏ）Ｏである。いくつかの実施形態において、Ｍは、ＯＣ（Ｏ）である。いくつかの実施形態において、Ｍは、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）である。いくつかの実施形態において、Ｍは、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏである。
他の実施形態において、Ｍは、アリール基またはヘテロアリール基である。例えば、Ｍは、フェニル、オキサゾールおよびチアゾールからなる群から選択され得る。
いくつかの実施形態において、Ｍは、Ｍ’と同じである。他の実施形態において、Ｍは、Ｍ’と異なる。
いくつかの実施形態において、各Ｒ５は、Ｈである。特定のこのような実施形態において、各Ｒ６もＨである。
いくつかの実施形態において、Ｒ７は、Ｈである。他の実施形態において、Ｒ７は、Ｃ１３アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピルまたはｉ－プロピル）である。
いくつかの実施形態において、Ｒ２およびＲ３は、独立してＣ５１４アルキルまたはＣ５１４アルケニルである。
いくつかの実施形態において、Ｒ２およびＲ３は、同じである。いくつかの実施形態において、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ８アルキルである。特定の実施形態において、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ２アルキルである。他の実施形態において、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ３アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ４アルキルである。特定の実施形態において、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ５アルキルである。他の実施形態において、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ７アルキルである。
他の実施形態において、Ｒ２およびＲ３は、異なる。特定の実施形態において、Ｒ２は、Ｃ８アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ３は、Ｃ１７（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６またはＣ７アルキル）またはＣ９アルキルである。
いくつかの実施形態において、Ｒ７およびＲ３は、Ｈである。
特定の実施形態において、Ｒ２は、Ｈである。
いくつかの実施形態において、ｍは、５、７または９である。
いくつかの実施形態において、Ｒ４は、（ＣＨ２）ｎＱおよび（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択される。
いくつかの実施形態において、Ｑは、ＯＲ、ＯＨ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＣＸ３、ＣＮ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、炭素環および複素環からなる群から選択される。
特定の実施形態において、Ｑは、ＯＨである。
特定の実施形態において、Ｑは、置換または未置換５～１０員ヘテロアリールであり、例えばＱは、イミダゾール、ピリミジン、プリン、２－アミノ－１，９－ジヒドロ－６Ｈ－プリン－６－オン－９－イル（またはグアニン－９－イル）、アデニン－９－イル、シトシン－１－イルまたはウラシル－１－イルである。特定の実施形態において、Ｑは、置換５～１４員ヘテロシクロアルキル、例えばオキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノおよびＣ１～３アルキルから選択される１つ以上の置換基で置換される。例えば、Ｑは、４－メチルピペラジニル、４－（４－メトキシベンジル）ピペラジニルまたはイソインドリン－２－イル－１，３－ジオンである。
特定の実施形態において、Ｑは、未置換または置換Ｃ６１０アリール（フェニルなど）またはＣ３６シクロアルキルである。
いくつかの実施形態において、ｎは、１である。他の実施形態において、ｎは、２である。さらなる実施形態において、ｎは、３である。特定の他の実施形態において、ｎは、４である。例えば、Ｒ４は、（ＣＨ２）２ＯＨであり得る。例えば、Ｒ４は、（ＣＨ２）３ＯＨであり得る。例えば、Ｒ４は、（ＣＨ２）４ＯＨであり得る。例えば、Ｒ４は、ベンジルであり得る。例えば、Ｒ４は、４－メトキシベンジルであり得る。
いくつかの実施形態において、Ｒ４は、Ｃ３６炭素環である。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、Ｃ３６シクロアルキルである。例えば、Ｒ４は、任意選択により、例えばＯＨ、ハロ、Ｃ１６アルキルなどで置換されるシクロヘキシルであり得る。例えば、Ｒ４は、２－ヒドロキシシクロヘキシルであり得る。
いくつかの実施形態において、Ｒは、Ｈである。
いくつかの実施形態において、Ｒは、未置換Ｃ１３アルキルまたは未置換Ｃ２３アルケニルである。例えば、Ｒ４は、ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３またはＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＣＨ３であり得る。
いくつかの実施形態において、Ｒは、置換Ｃ１３アルキル、例えばＣＨ２ＯＨである。例えば、Ｒ４は、－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨであり得る。
いくつかの実施形態において、Ｒ２およびＲ３は、それらが連結される原子と一緒に複素環または炭素環を形成する。いくつかの実施形態において、Ｒ２およびＲ３は、それらが連結される原子と一緒に、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＰから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員芳香または非芳香複素環を形成する。いくつかの実施形態において、Ｒ
２およびＲ３は、それらが連結される原子と一緒に、芳香または非芳香の何れかである、任意選択により置換されるＣ３２０炭素環（例えば、Ｃ３１８炭素環、Ｃ３１５炭素環、Ｃ３１２炭素環またはＣ３１０炭素環）を形成する。いくつかの実施形態において、Ｒ２およびＲ３は、それらが連結される原子と一緒にＣ３６炭素環を形成する。他の実施形態において、Ｒ２およびＲ３は、それらが連結される原子と一緒にＣ６炭素環、例えばシクロヘキシルまたはフェニル基などを形成する。特定の実施形態において、複素環またはＣ３６炭素環は、１つ以上のアルキル基（例えば、同じ環原子、または隣接もしくは非隣接環原子において）で置換される。例えば、Ｒ２およびＲ３は、それらが連結される原子と一緒に、１つ以上のＣ５アルキル置換を保有するシクロヘキシルまたはフェニル基を形成し得る。特定の実施形態において、Ｒ２およびＲ３により形成される複素環またはＣ３６炭素環は、炭素環基で置換される。例えば、Ｒ２およびＲ３は、それらが連結される原子と一緒に、シクロヘキシルまたはシクロヘキシルで置換されるフェニル基を形成し得る。いくつかの実施形態において、Ｒ２およびＲ３は、それらが連結される原子と一緒にＣ７１５炭素環、例えばシクロヘプチル、シクロペンタデカニルまたはナフチル基などを形成する。
いくつかの実施形態において、Ｒ４は、（ＣＨ２）ｎＱおよび（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択される。いくつかの実施形態において、Ｑは、ＯＲ、ＯＨ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、ＣＮ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）および複素環からなる群から選択される。他の実施形態において、Ｑは、イミダゾール、ピリミジンおよびプリンからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、Ｒ２およびＲ３は、それらが連結される原子と一緒に複素環または炭素環を形成する。いくつかの実施形態において、Ｒ２およびＲ３は、それらが連結される原子と一緒にＣ３６炭素環、例えばフェニル基などを形成する。特定の実施形態において、複素環またはＣ３６炭素環は、１つ以上のアルキル基で（例えば、同じ環原子において、または隣接もしくは非隣接環原子において）置換される。例えば、Ｒ２およびＲ３は、それらが連結される原子と一緒に、１つ以上のＣ５アルキル置換を保有するフェニル基を形成し得る。
いくつかの実施形態において、本開示の医薬組成物、式（Ｉ）の化合物は、
Figure 0007459172000020
Figure 0007459172000021
Figure 0007459172000022
Figure 0007459172000023
Figure 0007459172000024
Figure 0007459172000025
Figure 0007459172000026
Figure 0007459172000027
Figure 0007459172000028
Figure 0007459172000029
Figure 0007459172000030
Figure 0007459172000031
Figure 0007459172000032
Figure 0007459172000033
Figure 0007459172000034
Figure 0007459172000035
Figure 0007459172000036
Figure 0007459172000037
Figure 0007459172000038
Figure 0007459172000039
Figure 0007459172000040
Figure 0007459172000041
Figure 0007459172000042
Figure 0007459172000043
Figure 0007459172000044
Figure 0007459172000045
Figure 0007459172000046
Figure 0007459172000047
Figure 0007459172000048
Figure 0007459172000049
Figure 0007459172000050
Figure 0007459172000051
およびそれらの塩または立体異性体からなる群から選択される。
他の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、化合物１～化合物２３２またはそれらの塩もしくは立体異性体からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、中心のピペラジン部分を含むイオン化可能脂質が提供される。本明細書中に記載の脂質は、哺乳動物細胞または臓器への治療薬および／または予防薬の送達のために脂質ナノ粒子組成物中で有利に使用され得る。例えば、本明細書中に記載の脂質は、免疫原性があまりないかまたは全くない。例えば、本明細書中で開示される脂質化合物の免疫原性は、参照脂質（例えば、ＭＣ３、ＫＣ２またはＤＬｉｎＤＭＡ）と比較してより低い。例えば、本明細書中で開示される脂質および治療薬または予防薬を含む処方物の治療指数は、参照脂質（例えば、ＭＣ３、ＫＣ２またはＤＬｉｎＤＭＡ）および同じ治療薬または予防薬を含む対応する処方物と比較した場合に向上している。
いくつかの実施形態において、本送達剤は、式（ＩＩＩ）
Figure 0007459172000052
（式中、
環Ａは、
Figure 0007459172000053
であり、
ｔは、１または２であり、
Ａ１およびＡ２は、それぞれＣＨまたはＮから独立して選択され、
Ｚは、ＣＨ２であるかまたは存在せず、ＺがＣＨ２である場合、点線（１）および（２）のそれぞれは、単結合を表し、かつＺが存在しない場合、点線（１）および（２）は、両方とも存在せず、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、Ｃ５～２０アルキル、Ｃ５～２０アルケニル、－Ｒ’’ＭＲ’、－Ｒ＊ＹＲ’’、－ＹＲ’’および－Ｒ＊ＯＲ’’からなる群から独立して選択され、
各Ｍは、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｓ、ＳＣ（Ｓ）、ＣＨ（ＯＨ）、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、アリール基およびヘテロアリール基からなる群から独立して選択され、
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、結合、ＣＨ２、－（ＣＨ２）２－、ＣＨＲ、ＣＨＹ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２、ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２、ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）、ＣＨ（ＯＨ
）、Ｃ（Ｓ）およびＣＨ（ＳＨからなる群から独立して選択され、
各Ｙは、独立してＣ３～６炭素環であり、
各Ｒ＊は、Ｃ１～１２アルキルおよびＣ２１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｒは、Ｃ１～３アルキルおよびＣ３～６炭素環からなる群から独立して選択され、
各Ｒ’は、Ｃ１～１２アルキル、Ｃ２～１２アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、および
各Ｒ’’は、Ｃ３～１２アルキルおよびＣ３１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
環Ａが、
Figure 0007459172000054
である場合、
ｉ）Ｘ１、Ｘ２およびＸ３の少なくとも１つは、－ＣＨ２－ではなく、および／または
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つは、－Ｒ’’ＭＲ’である）を有する脂質化合物またはその塩もしくは立体異性体を含む。
いくつかの実施形態において、本化合物は、式（ＩＩＩａ１）～（ＩＩＩａ６）：
Figure 0007459172000055
の何れかのものである。
式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩａ１）～（ＩＩＩａ６）の何れか化合物は、適用可能である場合、次の特性の１つ以上を含む。
いくつかの実施形態において、環Ａは、
Figure 0007459172000056
である。
いくつかの実施形態において、環Ａは、
Figure 0007459172000057
である。
いくつかの実施形態において、環Ａは、
Figure 0007459172000058
である。
いくつかの実施形態において、環Ａは、
Figure 0007459172000059
である。
いくつかの実施形態において、環Ａは、
Figure 0007459172000060
である。
いくつかの実施形態において、環Ａは、
Figure 0007459172000061
であり、この環において、Ｎ原子は、Ｘ２と連結される。
いくつかの実施形態において、Ｚは、ＣＨ２である。
いくつかの実施形態において、Ｚは、存在しない。
いくつかの実施形態において、Ａ１およびＡ２の少なくとも１つは、Ｎである。
いくつかの実施形態において、Ａ１およびＡ２のそれぞれは、Ｎである。
いくつかの実施形態において、Ａ１およびＡ２のそれぞれは、ＣＨである。
いくつかの実施形態において、Ａ１は、Ｎであり、およびＡ２は、ＣＨである。
いくつかの実施形態において、Ａ１は、ＣＨであり、およびＡ２は、Ｎである。
いくつかの実施形態において、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３の少なくとも１つは、－ＣＨ２－ではない。例えば、特定の実施形態において、Ｘ１は、－ＣＨ２－ではない。いくつかの実施形態において、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のなくとも１つは、－Ｃ（Ｏ）－である。
いくつかの実施形態において、Ｘ２は、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２、ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２、ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）ＯまたはＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）である。
いくつかの実施形態において、Ｘ３は、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２、ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）ＯまたはＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）である。他の実施形態において、Ｘ３は、－ＣＨ２－である。
いくつかの実施形態において、Ｘ３は、結合または－（ＣＨ２）２－である。
いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、同じである。特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、同じである。いくつかの実施形態において、Ｒ４およびＲ５は、同じである。特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、同じである。
いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つは、－Ｒ’’ＭＲ’である。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の最大で１つは、－Ｒ’’ＭＲ’である。例えば、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の少なくとも１つは、－Ｒ’’ＭＲ’であり得、かつ／またはＲ４およびＲ５の少なくとも１つは、－Ｒ’’ＭＲ’である。特定の実施形態において、少なくとも１つのＭは、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態において、各Ｍは、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＭは、－ＯＣ（Ｏ）－である。いくつかの実施形態において、各Ｍは、－ＯＣ（Ｏ）－である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＭは、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態において、各Ｍは、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲ’’は、Ｃ３アルキルである。特定の実施形態において、各Ｒ’’は、Ｃ３アルキルである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲ’’は、Ｃ５アルキルである。特定の実施形態において、各Ｒ’’は、Ｃ５アルキルである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲ’’は、Ｃ６アルキルである。特定の実施形態において、各Ｒ’’は、Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲ’’は、Ｃ７アルキルである。特定の実施形態において、各Ｒ’’は、Ｃ７アルキルである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲ’は、Ｃ５アルキルである。特定の実施形態において、各Ｒ’は、Ｃ５アルキルである。他の実施形態において、少なくとも１つのＲ’は、Ｃ１アルキルである。特定の実施形態において、各Ｒ’は、Ｃ１アルキルである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲ’は、Ｃ２アルキルである。特定の実施形態において、各Ｒ’は、Ｃ２アルキルである。
いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つは、Ｃ１２アルキルである。特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のそれぞれは、Ｃ１２アルキルである。
特定の実施形態において、本化合物は、次のものからなる群から選択される。
Figure 0007459172000062
Figure 0007459172000063
Figure 0007459172000064
Figure 0007459172000065
Figure 0007459172000066
Figure 0007459172000067
Figure 0007459172000068
Figure 0007459172000069
Figure 0007459172000070
Figure 0007459172000071
Figure 0007459172000072
Figure 0007459172000073
いくつかの実施形態において、本送達剤は、化合物２３６を含む。
いくつかの実施形態において、本送達剤は、式（ＩＶ）
Figure 0007459172000074
（式中、
Ａ１およびＡ２は、それぞれＣＨまたはＮから独立して選択され、Ａ１およびＡ２の少なくとも１つは、Ｎであり、
Ｚは、ＣＨ２であるかまたは存在せず、ＺがＣＨ２である場合、点線（１）および（２）のそれぞれは、単結合を表し、かつＺが存在しない場合、点線（１）および（２）は、両
方とも存在せず、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、Ｃ６２０アルキルおよびＣ６～２０アルケニルからなる群から独立して選択され、
環Ａが、
Figure 0007459172000075
である場合、
ｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、同じであり、Ｒ１は、Ｃ１２アルキル、Ｃ１８アルキルまたはＣ１８アルケニルではないか、
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の１つのみは、Ｃ６～２０アルケニルから選択されるか、
ｉｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つの他のものと異なる炭素原子数を有するか、
ｉｖ）Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ６～２０アルケニルから選択され、かつＲ４およびＲ５は、Ｃ６～２０アルキルから選択されるか、または
ｖ）Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ６～２０アルキルから選択され、かつＲ４およびＲ５は、Ｃ６～２０アルケニルから選択される）
を有する化合物またはその塩もしくは立体異性体を含む。
いくつかの実施形態において、本化合物は、式（ＩＶａ）：
Figure 0007459172000076
のものである。
式（ＩＶ）または（ＩＶａ）の化合物は、適用可能である場合、次の特性の１つ以上を含む。
いくつかの実施形態において、Ｚは、ＣＨ２である。
いくつかの実施形態において、Ｚは、存在しない。
いくつかの実施形態において、Ａ１およびＡ２の少なくとも１つは、Ｎである。
いくつかの実施形態において、Ａ１およびＡ２のそれぞれは、Ｎである。
いくつかの実施形態において、Ａ１およびＡ２のそれぞれは、ＣＨである。
いくつかの実施形態において、Ａ１は、Ｎであり、およびＡ２は、ＣＨである。
いくつかの実施形態において、Ａ１は、ＣＨであり、およびＡ２は、Ｎである。
いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、同じであり、Ｃ１２アルキル、Ｃ１８アルキルまたはＣ１８アルケニルではない。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、同じであり、Ｃ９アルキルまたはＣ１４アルキルである。
いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の１つのみは、Ｃ６～２０アルケニルから選択される。特定のこのような実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、同じ数の炭素原子を有する。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、Ｃ５～２０アルケニルから選択される。例えば、Ｒ４は、Ｃ１２アルケニルまたはＣ１８アルケニルであり得る。
いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つの他のものと異なる炭素原子数を有する。
特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ６～２０アルケニルから選択され、かつＲ４およびＲ５は、Ｃ６～２０アルキルから選択される。他の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ６～２０アルキルから選択され、かつＲ４およびＲ５は、Ｃ６～２０アルケニルから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、同じ数の炭素原子を有し、かつ／またはＲ４およびＲ５は、同じ数の炭素原子を有する。例えば、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３またはＲ４およびＲ５は、６、８、９、１２、１４または１８の炭素原子を有し得る。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３またはＲ４およびＲ５は、Ｃ１８アルケニル（例えば、リノレイル）である。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３またはＲ４およびＲ５は、６、８、９、１２または１４の炭素原子を含むアルキル基である。
いくつかの実施形態において、Ｒ１は、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５と異なる数の炭素原子を有する。他の実施形態において、Ｒ３は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５と異なる数の炭素原子を有する。さらなる実施形態において、Ｒ４は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ５と異なる数の炭素原子を有する。
いくつかの実施形態において、本化合物は、
Figure 0007459172000077
Figure 0007459172000078
Figure 0007459172000079
からなる群から選択される。
他の実施形態において、本送達剤は、式（Ｖ）
Figure 0007459172000080
（式中、
Ａ３は、ＣＨまたはＮであり、
Ａ４は、ＣＨ２またはＮＨであり、Ａ３およびＡ４の少なくとも１つは、ＮまたはＮＨであり、
Ｚは、ＣＨ２であるかまたは存在せず、ＺがＣＨ２である場合、点線（１）および（２）のそれぞれは、単結合を表し、かつＺが存在しない場合、点線（１）および（２）は、両方とも存在せず、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ５～２０アルキル、Ｃ５～２０アルケニル、－Ｒ’’ＭＲ’、－Ｒ＊ＹＲ’’、－ＹＲ’’および－Ｒ＊ＯＲ’’からなる群から独立して選択され、各Ｍは、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｓ、ＳＣ（Ｓ）、ＣＨ（ＯＨ）、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、アリール基およびヘテロアリール基から独立して選択され、
Ｘ１およびＸ２は、ＣＨ２、（ＣＨ２）２、ＣＨＲ、－ＣＨＹ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ２、ＯＣ（Ｏ）ＣＨ２、ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）、ＣＨ（ＯＨ）、Ｃ（Ｓ）およびＣＨ（ＳＨ）からなる群から独立して選択され、
各Ｙは、独立してＣ３～６炭素環であり、
各Ｒ＊は、Ｃ１～１２アルキルおよびＣ２１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｒは、Ｃ１～３アルキルおよびＣ３～６炭素環からなる群から独立して選択され、
各Ｒ’は、Ｃ１～１２アルキル、Ｃ２～１２アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、および
各Ｒ’’は、Ｃ３～１２アルキルおよびＣ３１２アルケニルからなる群から独立して選択される）
を有する化合物またはその塩もしくは立体異性体を含む。
いくつかの実施形態において、本化合物は、式（Ｖａ）：
Figure 0007459172000081
のものである。
式（Ｖ）または（Ｖａ）の化合物は、適用可能である場合、次の特性の１つ以上を含む。
いくつかの実施形態において、Ｚは、ＣＨ２である。
いくつかの実施形態において、Ｚは、存在しない。
いくつかの実施形態において、Ａ３およびＡ４の少なくとも１つは、ＮまたはＮＨである。
いくつかの実施形態において、Ａ３は、Ｎであり、およびＡ４は、ＮＨである。
いくつかの実施形態において、Ａ３は、Ｎであり、およびＡ４は、ＣＨ２である。
いくつかの実施形態において、Ａ３は、ＣＨであり、およびＡ４は、ＮＨである。
いくつかの実施形態において、Ｘ１およびＸ２の少なくとも１つは、－ＣＨ２－ではない。例えば、特定の実施形態において、Ｘ１は、－ＣＨ２－ではない。いくつかの実施形態において、Ｘ１およびＸ２の少なくとも１つは、－Ｃ（Ｏ）－である。
いくつかの実施形態において、Ｘ２は、－Ｃ（Ｏ）－、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２、ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２、ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）ＯまたはＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）である。
いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ５～２０アルキルおよびＣ５～２０アルケニルからなる群から独立して選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、同じである。特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ６、Ｃ９、Ｃ１２またはＣ１４アルキルである。他の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ１８アルケニルである。例えば、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、リノレイルであり得る。
いくつかの実施形態において、本化合物は、
Figure 0007459172000082
からなる群から選択される。
他の実施形態において、本送達剤は、式（ＶＩ）：
Figure 0007459172000083
（式中、
Ａ６およびＡ７は、それぞれＣＨまたはＮから独立して選択され、Ａ６およびＡ７の少なくとも１つは、Ｎであり、
Ｚは、ＣＨ２であるかまたは存在せず、ＺがＣＨ２である場合、点線（１）および（２）のそれぞれは、単結合を表し、かつＺが存在しない場合、点線（１）および（２）は、両
方とも存在せず、
Ｘ４およびＸ５は、－ＣＨ２－、ＣＨ２）２－、ＣＨＲ、ＣＨＹ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ２、ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２、ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）、ＣＨ（ＯＨ）、Ｃ（Ｓ）およびＣＨ（ＳＨ）からなる群から独立して選択され、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、Ｃ５～２０アルキル、Ｃ５～２０アルケニル、－Ｒ’’ＭＲ’、－Ｒ＊ＹＲ’’、－ＹＲ’’および－Ｒ＊ＯＲ’’からなる群からそれぞれ独立して選択され、
各Ｍは、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｓ、ＳＣ（Ｓ）、ＣＨ（ＯＨ）、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、アリール基およびヘテロアリール基からなる群から独立して選択され、
各Ｙは、独立してＣ３～６炭素環であり、
各Ｒ＊は、Ｃ１～１２アルキルおよびＣ２１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Ｒは、Ｃ１～３アルキルおよびＣ３～６炭素環からなる群から独立して選択され、
各Ｒ’は、Ｃ１～１２アルキル、Ｃ２～１２アルケニルおよびＨからなる群から独立して選択され、および
各Ｒ’’は、Ｃ３～１２アルキルおよびＣ３１２アルケニルからなる群から独立して選択される）
を有する化合物またはその塩もしくは立体異性体を含む。
いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、Ｃ６～２０アルキルおよびＣ６～２０アルケニルからなる群からそれぞれ独立して選択される。
いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、同じである。特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、同じである。いくつかの実施形態において、Ｒ４およびＲ５は、同じである。特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、同じである。
いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つは、Ｃ９～１２アルキルである。特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のそれぞれは、独立してＣ９、Ｃ１２またはＣ１４アルキルである。特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のそれぞれは、Ｃ９アルキルである。
いくつかの実施形態において、Ａ６は、Ｎであり、およびＡ７は、Ｎである。いくつかの実施形態において、Ａ６は、ＣＨであり、およびＡ７は、Ｎである。
いくつかの実施形態において、Ｘ４は、－ＣＨ２－であり、およびＸ５は、－Ｃ（Ｏ）－である。いくつかの実施形態において、Ｘ４およびＸ５は、－Ｃ（Ｏ）－である。
いくつかの実施形態において、Ａ６がＮであり、およびＡ７がＮである場合、Ｘ４およびＸ５の少なくとも１つは、－ＣＨ２－ではなく、例えば、Ｘ４およびＸ５の少なくとも１つは、－Ｃ（Ｏ）－である。いくつかの実施形態において、Ａ６がＮであり、およびＡ７がＮである場合、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つは、－Ｒ’’ＭＲ’である。
いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つは、－Ｒ’’ＭＲ’ではない。
いくつかの実施形態において、本化合物は、
Figure 0007459172000084
である。
他の実施形態において、本送達剤は、式：
Figure 0007459172000085
を有する化合物を含む。
本明細書中で開示される脂質化合物のアミン部分は、特定の条件下で保護され得る。例えば、式（Ｉ）に記載の脂質の中心のアミン部分は、一般的には、アミノ部分のｐＫａを下回るｐＨでプロトン化され（すなわち正荷電）、ｐＫａを上回るｐＨで実質的に荷電していない。このような脂質は、イオン化可能アミノ脂質に付託され得る。
ある具体的な実施形態において、本イオン化可能アミノ脂質は、化合物１８である。別の実施形態において、本イオン化可能アミノ脂質は、化合物２３６である。
いくつかの実施形態において、本イオン化可能アミノ脂質、例えば式（Ｉ）の化合物の量は、脂質組成物中で約１ｍｏｌ％～９９ｍｏｌ％の範囲である。
ある実施形態において、本イオン化可能アミノ脂質、例えば式（Ｉ）の化合物の量は、脂質組成物中で少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９ｍｏｌ％である。
ある実施形態において、本イオン化可能アミノ脂質、例えば式（Ｉ）の化合物の量は、脂質組成物中で約３０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％および約４５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％の範囲である。
ある具体的な実施形態において、本イオン化可能アミノ脂質、例えば式（Ｉ）の化合物の量は、脂質組成物中で約５０ｍｏｌ％である。
本明細書中で開示されるイオン化可能アミノ脂質、例えば式（Ｉ）の化合物に加えて、本明細書中で開示される医薬組成物の脂質組成物は、さらなる構成要素、例えばリン脂質、構造脂質、ＰＥＧ－脂質およびそれらの任意の組み合わせを含み得る。
ｂ．脂質組成物中のさらなる構成要素
（ｉ）リン脂質
本明細書中で開示される医薬組成物の脂質組成物は、１つ以上のリン脂質、例えば１つ以上の飽和もしくは（多）不飽和リン脂質またはそれらの組み合わせを含み得る。一般に、リン脂質は、リン脂質部分および１つ以上の脂肪酸部分を含む。
リン脂質部分は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２－リゾホスファチジルコリンおよびスフィンゴミエリンからなる非限定群から選択され得る。
脂肪酸部分は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファ－リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘニン酸、ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸からなる非限定群から選択され得る。
特定のリン脂質は、膜への融合を促進し得る。例えば、カチオン性リン脂質は、膜（例えば、細胞膜または細胞内の膜）の１つ以上の負荷電リン脂質と相互作用し得る。膜へのリン脂質の融合により、脂質含有組成物（例えば、ＬＮＰ）の１つ以上の要素（例えば、治療薬）が膜を通過できるようになり得、例えば標的組織への１つ以上の要素の送達が可能になる。
分岐、酸化、環状化およびアルキンを含む修飾および置換を有する天然種を含む非天然リン脂質種も企図される。例えば、リン脂質は、１つ以上のアルキン（例えば、１つ以上の二重結合が三重結合で置き換えられるアルケニル基）で官能化され得るかまたはこれに架橋され得る。適切な反応条件下において、アルキン基は、アジドへの曝露時に銅触媒による環付加を受け得る。このような反応は、膜透過または細胞認識を促進するためにナノ粒子組成物の脂質二重層を機能付与することにおいて、またはナノ粒子組成物を標的指向化またはイメージング部分（例えば、色素）などの有用な構成要素と複合化することにおいて有用であり得る。
リン脂質としては、グリセロリン脂質、例えばホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジグリセロールおよびホスファチジン酸が挙げられるが限定されない。リン脂質は、ホスホスフィンゴ脂質、例えばスフィンゴミエリンなども含む。
リン脂質の例としては、次のもの：
Figure 0007459172000086
Figure 0007459172000087
が挙げられるが限定されない。
特定の実施形態において、本発明において有用であるかまたは有用である可能性があるリン脂質は、ＤＳＰＣの類似体または変異体である。特定の実施形態において、本発明において有用であるかまたは有用である可能性があるリン脂質は、式（ＩＸ）：
Figure 0007459172000088
（式中、
各Ｒ１は、独立して、任意選択により置換されるアルキルであるか、または任意選択により、２つのＲ１は、介在原子と一緒に連結されて、任意選択により置換される単環式カルボシクリルまたは任意選択により置換される単環式ヘテロシクリルを形成するか、または任意選択により、３つのＲ１は、介在原子と一緒に連結されて、任意選択により置換される二環式カルボシクリルまたは任意選択により置換される二環式ヘテロシクリルを形成し、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、
Ａは、式：
Figure 0007459172000089
のものであり、
Ｌ２の各例は、独立して結合であるかまたは任意選択により置換されるＣ１～６アルキレンであり、任意選択により置換されるＣ１～６アルキレンの１つのメチレン単位は、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、－ＮＲＮＣ（Ｏ）ＯまたはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）で任意選択により置き換えられ、
Ｒ２の各例は、独立して、任意選択により置換されるＣ１～３０アルキル、任意選択により置換されるＣ１～３０アルケニルまたは任意選択により置換されるＣ１～３０アルキニルであり、任意選択により、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は、独立して、任意選択により置換されるカルボシクリレン、任意選択により置換されるヘテロシクリレン、任意選択により置換されるアリーレン、任意選択により置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、－Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置き換えられ、
ＲＮの各例は、独立して水素、任意選択により置換されるアルキルまたは窒素保護基であり、
環Ｂは、任意選択により置換されるカルボシクリル、任意選択により置換されるヘテロシクリル、任意選択により置換されるアリールまたは任意選択により置換されるヘテロアリールであり、および
ｐは、１または２であり、
ただし、本化合物は、式：
Figure 0007459172000090
（式中、Ｒ２の各例は、独立して未置換アルキル、未置換アルケニルまたは未置換アルキニルである）
ではない）
の化合物またはその塩である。
リン脂質頭部修飾
特定の実施形態において、本発明において有用であるかまたは有用である可能性があるリン脂質は、修飾リン脂質頭部（例えば、修飾コリン基）を含む。特定の実施形態において、修飾頭部があるリン脂質は、修飾四級アミンを有するＤＳＰＣまたはその類似体である。例えば、式（ＩＸ）の実施形態において、Ｒ１の少なくとも１つは、メチルではない。特定の実施形態において、Ｒ１の少なくとも１つは、水素またはメチルではない。特定の実施形態において、式（ＩＸ）の化合物は、次の式の１つ：
Figure 0007459172000091
（式中、
各ｔは、独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、
各ｕは、独立して０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、および
各ｖは、独立して１、２または３である）
またはその塩である。
特定の実施形態において、式（ＩＸ）の化合物は、次の式の１つ：
Figure 0007459172000092
またはその塩である。
特定の実施形態において、式（ＩＸ）の化合物は次の１つ：
Figure 0007459172000093
Figure 0007459172000094
またはその塩である。
特定の実施形態において、式（ＩＸ）の化合物は、式（ＩＸ－ａ）：
Figure 0007459172000095
のものまたはその塩である。
特定の実施形態において、本発明において有用であるかまたは有用である可能性があるリン脂質は、修飾コアを含む。特定の実施形態において、本明細書中に記載の修飾コアを有するリン脂質は、修飾コア構造を有するＤＳＰＣまたはそれらの類似体である。例えば、式（ＩＸ－ａ）の特定の実施形態において、基Ａは、次の式：
Figure 0007459172000096
のものではない。
特定の実施形態において、式（ＩＸ－ａ）の化合物は、次の式の１つ：
Figure 0007459172000097
またはその塩である。
特定の実施形態において、式（ＩＸ）の化合物は、次の１つ：
Figure 0007459172000098
またはその塩である。
特定の実施形態において、本発明において有用であるかまたは有用である可能性があるリン脂質は、グリセリド部分の代わりに環状部分を含む。特定の実施形態において、本発明で有用なリン脂質は、グリセリド部分の代わりに環状部分を有するＤＳＰＣまたはその類似体である。特定の実施形態において、式（ＩＸ）の化合物は、式（ＩＸ－ｂ）：
Figure 0007459172000099
のものまたはその塩である。
特定の実施形態において、式（ＩＸ－ｂ）の化合物は、式（ＩＸ－ｂ－１）：
Figure 0007459172000100
（式中、ｗは、０、１、２または３である）
のものまたはその塩である。
特定の実施形態において、式（ＩＸ－ｂ）の化合物は、式（ＩＸ－ｂ－２）：
Figure 0007459172000101
のものまたはその塩である。
特定の実施形態において、式（ＩＸ－ｂ）の化合物は、式（ＩＸ－ｂ－３）：
Figure 0007459172000102
のものまたはその塩である。
特定の実施形態において、式（ＩＸ－ｂ）の化合物は、式（ＩＸ－ｂ－４）：
Figure 0007459172000103
のものまたはその塩である。
特定の実施形態において、式（ＩＸ－ｂ）の化合物は、次の１つ：
Figure 0007459172000104
またはその塩である。
リン脂質テール修飾
特定の実施形態において、本発明において有用であるかまたは有用である可能性があるリン脂質は、修飾テールを含む。特定の実施形態において、本発明において有用であるかまたは有用である可能性があるリン脂質は、修飾テールを有するＤＳＰＣまたはその類似体である。本明細書中に記載のように、「修飾テール」は、より短いかまたはより長い脂肪族鎖を有するテールであり得、脂肪族鎖は、分岐が導入されているか、脂肪族鎖は置換基が導入されているか、脂肪族鎖において１つ以上のメチレンが環状またはヘテロ原子基により置き換えられているか、またはそれらの何れかの組み合わせである。例えば、特定の実施形態において、（ＩＸ）の化合物は、式（ＩＸ－ａ）のものまたはその塩であり、ここで、Ｒ２の少なくとも１つの例は、Ｒ２の各例であり、任意選択により置換されるＣ１～３０アルキルであり、ここで、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は、独立して、任意選択により置換されるカルボシクリレン、任意選択により置換されるヘテロシクリレン、任意選択により置換されるアリーレン、任意選択により置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、－Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、－Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、－Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置き換えられる。
特定の実施形態において、式（ＩＸ）の化合物は式（ＩＸ－ｃ）：
Figure 0007459172000105
（式中、
各Ｘは、独立して（両端を含む）０～３０の整数であり、および
Ｇの各例は、任意選択により置換されるカルボシクリレン、任意選択により置換されるヘテロシクリレン、任意選択により置換されるアリーレン、任意選択により置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、－Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏからなる群から独立して選択される）
のものまたはその塩である。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態に相当する。
特定の実施形態において、式（ＩＸ－ｃ）の化合物は、式（ＩＸ－ｃ－１）：
Figure 0007459172000106
（式中、ｖの各例は、独立して１、２または３である）
のものまたはその塩である。
特定の実施形態において、式（ＩＸ－ｃ）の化合物は、式（ＩＸ－ｃ－２）：
Figure 0007459172000107
のものまたはその塩である。
特定の実施形態において、式（ＩＸ－ｃ）の化合物は、次の式：
Figure 0007459172000108
のものまたはその塩である。
特定の実施形態において、式（ＩＸ－ｃ）の化合物は、次のもの：
Figure 0007459172000109
またはその塩である。
特定の実施形態において、式（ＩＸ－ｃ）の化合物は、式（ＩＸ－ｃ－３）：
Figure 0007459172000110
のものまたはその塩である。
特定の実施形態において、式（ＩＸ－ｃ）の化合物は、次の式：
Figure 0007459172000111
のものまたはその塩である。
特定の実施形態において、式（ＩＸ－ｃ）の化合物は、次のもの：
Figure 0007459172000112
またはその塩である。
特定の実施形態において、本発明において有用であるかまたは有用である可能性があるリン脂質は、修飾ホスホコリン部分を含み、この場合、ホスホリル基に四級アミンを連結
するアルキル鎖は、エチレンではない（例えば、ｎは、２ではない）。したがって、特定の実施形態において、本発明において有用であるかまたは有用である可能性があるリン脂質は、式（ＩＸ）の化合物（式中、ｎは、１、３、４、５、６、７、８、９または１０である）である。例えば、特定の実施形態において、式（ＩＸ）の化合物は、次の式：
Figure 0007459172000113
の１つのものまたはその塩である。
特定の実施形態において、式（ＩＸ）の化合物は、次の１つ：
Figure 0007459172000114
Figure 0007459172000115
Figure 0007459172000116
またはその塩である。
代替脂質
特定の実施形態において、本発明のリン脂質の代わりに代替脂質が使用される。このような代替脂質の非限定例としては、次のもの：
Figure 0007459172000117
が挙げられる。
（ｉｉ）構造脂質
本明細書中で開示される医薬組成物の脂質組成物は、１つ以上の構造脂質を含み得る。本明細書中で使用される場合、「構造脂質」という用語は、ステロールを指し、ステロー
ル部分を含有する脂質も指す。
脂質ナノ粒子における構造脂質の組み込みは、粒子における他の脂質の凝集の緩和を促進し得る。構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、アルファ－トコフェロール、ホパノイド、フィトステロール、ステロイドおよびこれらの混合物を含むが限定されない群から選択され得る。いくつかの実施形態において、構造脂質は、ステロールである。本明細書中で定義されるような「ステロール」は、ステロイドアルコールからなるステロイドのサブグループである。特定の実施形態において、構造脂質は、ステロイドである。特定の実施形態において、構造脂質は、コレステロールである。特定の実施形態において、構造脂質は、コレステロールの類似体である。特定の実施形態において、構造脂質は、アルファ－トコフェロールである。構造脂質の例としては、次のもの：
Figure 0007459172000118
が挙げられるが限定されない。
ある実施形態において、本明細書中で開示される医薬組成物の脂質組成物中の構造脂質（例えば、コレステロールなどのステロール）の量は、約２０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％または約３５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％の範囲である。
ある実施形態において、本明細書中で開示される脂質組成物中の構造脂質（例えば、コレステロールなどのステロール）の量は、約２５ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約３５ｍｏｌ％または約３５ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％の範囲である。
ある実施形態において、本明細書中で開示される脂質組成物中の構造脂質（例えば、コレステロールなどのステロール）の量は、約２４ｍｏｌ％、約２９ｍｏｌ％、約３４ｍｏｌ％または約３９ｍｏｌ％である。
いくつかの実施形態において、本明細書中で開示される脂質組成物中の構造脂質（例えば、コレステロールなどのステロール）の量は、少なくとも約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３
７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９または６０ｍｏｌ％である。
（ｉｉｉ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質
本明細書中で開示される医薬組成物の脂質組成物は、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質を含み得る。
本明細書中で使用される場合、「ＰＥＧ－脂質」という用語は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を指す。ＰＥＧ－脂質の非限定例としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジン酸、ＰＥＧ－セラミド複合物（例えば、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミンおよびＰＥＧ修飾１，２－ジアシルオキシプロパン－３－アミンが挙げられる。このような脂質は、ＰＥＧ化脂質とも呼ばれる。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣまたはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であり得る。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ－脂質としては、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＧ）、ＰＥＧ－ジパルメトレイル、ＰＥＧ－ジオレイル、ＰＥＧ－ジステアリル、ＰＥＧ－ジアシルグリカミド（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＰＰＥ）またはＰＥＧ－１，２－ジミリスチルオキシルプロピル－３－アミン（ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ）が挙げられるが限定されない。
ある実施形態において、ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールおよびこれらの混合物からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ－脂質の脂質部分としては、約Ｃ１４～約Ｃ２２、好ましくは約Ｃ１４～約Ｃ１６の長さを有するものが挙げられる。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ部分、例えばｍＰＥＧ－ＮＨ２のサイズは、約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００または２０，０００ダルトンである。ある実施形態において、ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。
ある実施形態において、本明細書中に記載の脂質ナノ粒子は、非拡散性ＰＥＧであるＰＥＧ脂質を含み得る。非拡散性ＰＥＧの非限定例としては、ＰＥＧ－ＤＳＧおよびＰＥＧ－ＤＳＰＥが挙げられる。
ＰＥＧ－脂質は、それらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第８１５８６０１号明細書および国際公開第２０１５／１３０５８４Ａ２号パンフレットに記載のものなど、当技術分野で公知である。
一般に、本明細書中に記載の様々な式の他の脂質構成要素の一部（例えば、ＰＥＧ脂質）は、その全体において参照により組み込まれる“Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ”という名称の２０１６年１２月１０日提出の国際公開第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１６／０００１２９号明細書に記載のとおり合成され得る。
脂質ナノ粒子組成物の脂質構成要素は、ポリエチレングリコール、例えばＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質などを含む１つ以上の分子を含み得る。このような種は、あるいはＰＥＧ化脂質と呼ばれ得る。ＰＥＧ脂質は、ポリエチレングリコールで修飾される脂質である。ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールおよびこれらの混合物を含む非限定例から選択され得る。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣまたはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であり得る。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ ＤＭＧの修飾形態である。ＰＥＧ ＤＭＧは、次の構造：
Figure 0007459172000119
を有する。
ある実施形態において、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、その内容がその全体において本明細書中で参照により組み込まれる国際公開第２０１２０９９７５５号パンフレットに記載のＰＥＧ化脂質であり得る。本明細書中に記載のこれらの代表的なＰＥＧ脂質の何れも、ＰＥＧ鎖上でヒドロキシル基を含むように修飾され得る。特定の実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ＯＨ脂質である。一般的に本明細書中で定められるように、「ＰＥＧ－ＯＨ脂質」（本明細書中で「ヒドロキシ－ＰＥＧ化脂質」とも呼ばれる）は、脂質上に１つ以上のヒドロキシル（－ＯＨ）基を有するＰＥＧ化脂質である。特定の実施形態において、ＰＥＧ－ＯＨ脂質は、ＰＥＧ鎖上に１つ以上のヒドロキシル基を含む。特定の実施形態において、ＰＥＧ－ＯＨまたはヒドロキシ－ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ鎖の末端に－ＯＨ基を含む。各可能性は、本発明の個別の実施形態に相当する。
特定の実施形態において、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、式（ＶＩＩ）の化合物である。本明細書中で提供されるのは、式（ＶＩＩ）：
Figure 0007459172000120
（式中、
Ｒ３は、－ＯＲＯであり、
ＲＯは、水素、任意選択により置換されるアルキルまたは酸素保護基であり、
ｒは、（両端を含む）１～１００の整数であり、
Ｌ１は、任意選択により置換されるＣ１～１０アルキレンであり、任意選択により置換されるＣ１～１０アルキレンの少なくとも１つのメチレンは、独立して、任意選択により置換されるカルボシクリレン、任意選択により置換されるヘテロシクリレン、任意選択により置換されるアリーレン、任意選択により置換されるヘテロアリーレン、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、－ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）ＯまたはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）によって置き換えられ、
Ｄは、クリックケミストリーにより得られる部分または生理的条件下で切断可能な部分で
あり、
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、
Ａは、式：
Figure 0007459172000121
のものであり、
Ｌ２の各例は、独立して、結合または任意選択により置換されるＣ１～６アルキレンであり、任意選択により置換されるＣ１～６アルキレンの１つのメチレン単位は、任意選択により、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、－ＮＲＮＣ（Ｏ）ＯまたはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）で置き換えられ、
Ｒ２の各例は、独立して、任意選択により置換されるＣ１～３０アルキル、任意選択により置換されるＣ１～３０アルケニルまたは任意選択により置換されるＣ１～３０アルキニルであり、任意選択により、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は、独立して、任意選択により置換されるカルボシクリレン、任意選択により置換されるヘテロシクリレン、任意選択により置換されるアリーレン、任意選択により置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、－Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置き換えられ、
ＲＮの各例は、独立して、水素、任意選択により置換されるアルキルまたは窒素保護基であり、
環Ｂは、任意選択により置換されるカルボシクリル、任意選択により置換されるヘテロシクリル、任意選択により置換されるアリールまたは任意選択により置換されるヘテロアリールであり、および
ｐは１または２である）
の化合物またはその塩である。
特定の実施形態において、式（ＶＩＩ）の化合物は、ＰＥＧ－ＯＨ脂質（すなわち、Ｒ３は、－ＯＲＯであり、およびＲＯは、水素である）である。特定の実施形態において、式（ＶＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩ－ＯＨ）：
Figure 0007459172000122
のものまたはその塩である。
特定の実施形態において、Ｄは、クリックケミストリーによって得られる部分である（例えば、トリアゾール）。特定の実施形態において、式（ＶＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩ－ａ－１）または（ＶＩＩ－ａ－２）：
Figure 0007459172000123
またはその塩である。
特定の実施形態において、式（ＶＩＩ）の化合物は、次の式：
Figure 0007459172000124
（式中、ｓは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である）
の１つのものまたはその塩である。
特定の実施形態において、式（ＶＩＩ）の化合物は、次の式：
Figure 0007459172000125
の１つのものまたはその塩である。
特定の実施形態において、式（ＶＩＩ）の化合物は、次の式：
Figure 0007459172000126
の１つのものまたはその塩である。
特定の実施形態において、式（ＶＩＩ）の化合物は、次の式：
Figure 0007459172000127
の１つのものまたはその塩である。
特定の実施形態において、Ｄは、生理的条件下で切断可能な部分（例えば、エステル、アミド、カルボネート、カルバメート、尿素）である。特定の実施形態において、式（ＶＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩ－ｂ－１）または（ＶＩＩ－ｂ－２）：
Figure 0007459172000128
のものまたはその塩である。
特定の実施形態において、式（ＶＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩ－ｂ－１－ＯＨ）または（ＶＩＩ－ｂ－２－ＯＨ）：
Figure 0007459172000129
のものまたはその塩である。
特定の実施形態において、式（ＶＩＩ）の化合物は、次の式：
Figure 0007459172000130
の１つのものまたはその塩である。
特定の実施形態において、式（ＶＩＩ）の化合物は、次の式：
Figure 0007459172000131
の１つのものまたはその塩である。
特定の実施形態において、式（ＶＩＩ）の化合物は、次の式：
Figure 0007459172000132
の１つのものまたはその塩である。
特定の実施形態において、式（ＶＩＩ）の化合物は、次の式：
Figure 0007459172000133
の１つのものまたはその塩である。
特定の実施形態において、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ化脂肪酸である。特定の実施形態において、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、式（ＶＩＩＩ）の化合物である。本明細書中で提供されるのは、式（ＶＩＩＩ）：
Figure 0007459172000134
（式中、
Ｒ３は、－ＯＲＯであり、
ＲＯは、水素、任意選択により置換されるアルキルまたは酸素保護基であり、
ｒは、（両端を含む）１～１００の整数であり、
Ｒ５は、任意選択により置換されるＣ１０～４０アルキル、任意選択により置換されるＣ１０～４０アルケニルまたは任意選択により置換されるＣ１０～４０アルキニルであり、任意選択により、Ｒ５の１つ以上のメチレン基は、任意選択により置換されるカルボシクリレン、任意選択により置換されるヘテロシクリレン、任意選択により置換されるアリーレン、任意選択により置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、－Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、－Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置き換えられ、および
ＲＮの各例は、独立して、水素、任意選択により置換されるアルキルまたは窒素保護基である）の化合物またはその塩である。
特定の実施形態において、式（ＶＩＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩＩ－ＯＨ）：
Figure 0007459172000135
のものまたはその塩である。いくつかの実施形態において、ｒは、４５である。
特定の実施形態において、式（ＶＩＩＩ）の化合物は、次の式：
Figure 0007459172000136
の１つのものまたはその塩である。いくつかの実施形態において、ｒは、４５である。
また他の実施形態において、式（ＶＩＩＩ）の化合物は、
Figure 0007459172000137
またはその塩である。
ある実施形態において、式（ＶＩＩＩ）の化合物は、
Figure 0007459172000138
である。
ある実施形態において、本明細書中で開示される医薬組成物の脂質組成物中のＰＥＧ－
脂質の量は、約０．１ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約１．５ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約１．５ｍｏｌ％または約１ｍｏｌ％～約１．５ｍｏｌ％の範囲である。
ある実施形態において、本明細書中で開示される脂質組成物中のＰＥＧ－脂質の量は、約２ｍｏｌ％である。ある実施形態において、本明細書中で開示される脂質組成物中のＰＥＧ－脂質の量は、約１．５ｍｏｌ％である。
ある実施形態において、本明細書中で開示される脂質組成物中のＰＥＧ－脂質の量は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９または５ｍｏｌ％である。
いくつかの態様において、本明細書中で開示される医薬組成物の脂質組成物は、ＰＥＧ－脂質を含まない。
（ｉｖ）他のイオン化可能アミノ脂質
本明細書中で開示される医薬組成物の脂質組成物は、式（Ｉ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）による脂質に加えて、１つ以上のイオン化可能アミノ脂質を含み得る。
イオン化可能脂質は、
３－（ジドデシルアミノ）－Ｎ１，Ｎ１，４－トリドデシル－１－ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、
Ｎ１－［２－（ジドデシルアミノ）エチル］－Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４－トリドデシル－１，４－ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、
１４，２５－ジトリデシル－１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、
１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、
へプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、
２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、
１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、（１３Ｚ，１６５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニドコサ－１３－１６－ジエン－１－アミン（Ｌ６０８）、
２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ）、
（２Ｒ）－２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、および
（２Ｓ）－２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））
からなる非限定群から選択され得る。これらに加えて、イオン化可能アミノ脂質は、環状アミン基を含む脂質でもあり得る。
イオン化可能脂質は、その全体において参照により本明細書によって組み込まれる国際公開第２０１７／０７５５３１Ａ１号パンフレットで開示される化合物でもあり得る。例えば、イオン化可能アミノ脂質としては、
Figure 0007459172000139
およびそれらの任意の組み合わせが挙げられるが限定されない。
イオン化可能脂質は、その全体において参照により本明細書によって組み込まれる国際公開第２０１５／１９９９５２Ａ１号パンフレットで開示される化合物でもあり得る。例えば、イオン化可能アミノ脂質としては、
Figure 0007459172000140
Figure 0007459172000141
Figure 0007459172000142
およびそれらの任意の組み合わせが挙げられるが限定されない。
（ｖ）他の脂質組成物構成要素
本明細書中で開示される医薬組成物の脂質組成物は、上記のものに加えて、１つ以上の構成要素を含み得る。例えば、本脂質組成物は、１つ以上の透過性促進分子、炭水化物、ポリマー、表面変化剤（例えば、界面活性剤）または他の構成要素を含み得る。例えば、透過性促進分子は、米国特許出願公開第２００５／０２２２０６４号明細書により記載される分子であり得る。炭水化物は、単糖（例えば、グルコース）および多糖（例えば、グリコーゲンならびにその誘導体および類似体）を含み得る。
ポリマーは、本明細書中で開示される医薬組成物（例えば、脂質ナノ粒子形態の医薬組成物）を封入するかまたは部分的に封入するために含まれ得、および／または使用され得る。ポリマーは、生体分解性および／または生体適合性であり得る。ポリマーは、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリウレア、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリルおよびポリアリレートから選択され得るが限定されない。
脂質組成物とポリヌクレオチドとの間の比は、約１０：１～約６０：１（ｗｔ／ｗｔ）の範囲であり得る。
いくつかの実施形態において、脂質組成物とポリヌクレオチドとの間の比は、約１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：
１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１、５０：１、５１：１、５２：１、５３：１、５４：１、５５：１、５６：１、５７：１、５８：１、５９：１または６０：１（ｗｔ／ｗｔ）であり得る。いくつかの実施形態において、脂質組成物と治療薬をコードするポリヌクレオチドとの間のｗｔ／ｗｔ比は、約２０：１または約１５：１である。
ある実施形態において、本明細書中に記載の脂質ナノ粒子は、５：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１または７０：１の脂質：ポリヌクレオチド重量比、または５：１～約１０：１、約５：１～約１５：１、約５：１～約２０：１、約５：１～約２５：１、約５：１～約３０：１、約５：１～約３５：１、約５：１～約４０：１、約５：１～約４５：１、約５：１～約５０：１、約５：１～約５５：１、約５：１～約６０：１、約５：１～約７０：１、約１０：１～約１５：１、約１０：１～約２０：１、約１０：１～約２５：１、約１０：１～約３０：１、約１０：１～約３５：１、約１０：１～約４０：１、約１０：１～約４５：１、約１０：１～約５０：１、約１０：１～約５５：１、約１０：１～約６０：１、約１０：１～約７０：１、約１５：１～約２０：１、約１５：１～約２５：１、約１５：１～約３０：１、約１５：１～約３５：１、約１５：１～約４０：１、約１５：１～約４５：１、約１５：１～約５０：１、約１５：１～約５５：１、約１５：１～約６０：１または約１５：１～約７０：１などのこれらの比の範囲もしくは何れかであるが限定されない脂質：ポリヌクレオチド重量比で、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を含み得る。
ある実施形態において、本明細書中に記載の脂質ナノ粒子は、およそ０．１ｍｇ／ｍＬ～２ｍｇ／ｍＬ、例えば０．１ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．６ｍｇ／ｍＬ、０．７ｍｇ／ｍＬ、０．８ｍｇ／ｍＬ、０．９ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、１．１ｍｇ／ｍＬ、１．２ｍｇ／ｍＬ、１．３ｍｇ／ｍＬ、１．４ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬ、１．６ｍｇ／ｍＬ、１．７ｍｇ／ｍＬ、１．８ｍｇ／ｍＬ、１．９ｍｇ／ｍＬ、２．０ｍｇ／ｍＬまたは２．０ｍｇ／ｍＬ超の濃度でポリヌクレオチドを含み得る。
（ｖｉ）ナノ粒子組成物
いくつかの実施形態において、本明細書中で開示される医薬組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として処方される。したがって、本開示は、（ｉ）本明細書中に記載のような式（Ｉ）または（ＩＩＩ）の化合物などの送達剤を含む脂質組成物と、（ｉｉ）リラキシンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含むナノ粒子組成物も提供する。このようなナノ粒子組成物において、本明細書中で開示される脂質組成物は、リラキシンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを封入し得る。
ナノ粒子組成物は、一般的には、マイクロメートルまたはそれより小さい桁のサイズであり、脂質二重層を含み得る。ナノ粒子組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム（例えば、脂質小胞）およびリポプレックスを包含する。例えば、ナノ粒子組成物は、直径５００ｎｍ以下で脂質二重層を有するリポソームであり得る。
ナノ粒子組成物としては、例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソームおよびリポプレックスが挙げられる。いくつかの実施形態において、ナノ粒子組成物は、１つ以上の脂質二重層を含む小胞である。特定の実施形態において、ナノ粒子組成物は、水性の区画により分離される２つ以上の同心円状の二重層を含む。脂質二重層は、官能性であり得、お
よび／または互いに架橋され得る。脂質二重層は、１つ以上のリガンド、タンパク質またはチャネルを含み得る。
いくつかの実施形態において、本開示のナノ粒子組成物は、式（Ｉ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）による少なくとも１つの化合物を含む。例えば、本ナノ粒子組成物は、化合物１～１４７の１つ以上または化合物１～３４２の１つ以上を含み得る。ナノ粒子組成物は、様々な他の構成要素も含み得る。例えば、本ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）による脂質、例えば（ｉ）少なくとも１つのリン脂質、（ｉｉ）少なくとも１つの構造脂質、（ｉｉｉ）少なくとも１つのＰＥＧ－脂質または（ｉｖ）それらの任意の組み合わせなどに加えて、１つ以上の他の脂質を含み得る。構造脂質の包含は、任意選択であり得、例えば本発明の脂質ナノ粒子組成物中で式ＩＩＩによる脂質が使用される場合である。
いくつかの実施形態において、本ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）を含む。いくつかの実施形態において、本ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）およびリン脂質（例えば、ＤＳＰＣ）を含む。
いくつかの実施形態において、本ナノ粒子組成物は、式（ＩＩＩ）の化合物（例えば、化合物２３６）を含む。いくつかの実施形態において、本ナノ粒子組成物は、式（ＩＩＩ）の化合物（例えば、化合物２３６）およびリン脂質（例えば、ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣ）を含む。
いくつかの実施形態において、本ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）からなるかまたは基本的にそれらからなる脂質組成物を含む。いくつかの実施形態において、本ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）およびリン脂質（例えば、ＤＳＰＣ）からなるかまたは基本的にそれらからなる脂質組成物を含む。
いくつかの実施形態において、本ナノ粒子組成物は、式の化合物（ＩＩＩ）（例えば、化合物２３６）からなるかまたは基本的にそれらからなる脂質組成物を含む。いくつかの実施形態において、本ナノ粒子組成物は、式（ＩＩＩ）の化合物（例えば、化合物２３６）およびリン脂質（例えば、ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣ）からなるかまたは基本的にそれらからなる脂質組成物を含む。
ある実施形態において、脂質ナノ粒子は、イオン化可能脂質、構造脂質、リン脂質およびｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、本ＬＮＰは、イオン化可能脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロールおよび構造脂質を含む。いくつかの実施形態において、本ＬＮＰのモル比は、約２０～６０％のイオン化可能脂質：約５～２５％の構造脂質：約２５～５５％のステロール、および約０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質である。いくつかの実施形態において、本ＬＮＰは、約５０％のイオン化可能脂質、約１．５％のＰＥＧ修飾脂質、約３８．５％のコレステロールおよび約１０％の構造脂質のモル比を含む。いくつかの実施形態において、本ＬＮＰは、約５５％のイオン化可能脂質、約２．５％のＰＥＧ脂質、約３２．５％のコレステロールおよび約１０％の構造脂質のモル比を含む。いくつかの実施形態において、本イオン化可能脂質は、イオン化可能脂質であり、構造脂質は、中性脂質であり、ステロールは、コレステロールである。いくつかの実施形態において、本ＬＮＰのモル比は、５０：３８．５：１０：１．５のイオン化可能脂質：コレステロール：ＤＳＰＣ：ＰＥＧ脂質である。いくつかの実施形態において、本イオン化可能脂質は、化合物１８または化合物２３６であり、ＰＥＧ脂質は、化合物４２８である。
いくつかの実施形態において、本ＬＮＰのモル比は、５０：３８．５：１０：１．５の化合物１８：リン脂質：コレステロール：化合物４２８である。いくつかの実施形態において、本ＬＮＰのモル比は、５０：３８．５：１０：１．５の化合物１８：ＤＳＰＣ：コレステロール：化合物４２８である。
いくつかの実施形態において、本ＬＮＰのモル比は、５０：３８．５：１０：１．５の化合物２３６：リン脂質：コレステロール：化合物４２８である。いくつかの実施形態において、本ＬＮＰのモル比は、５０：３８．５：１０：１．５の化合物２３６：ＤＳＰＣ：コレステロール：化合物４２８である。
いくつかの実施形態において、本ＬＮＰは、０．４未満の多分散値を有する。いくつかの実施形態において、本ＬＮＰは、中性ｐＨで正味の中性電荷を有する。いくつかの実施形態において、本ＬＮＰの平均直径は、５０～１５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、本ＬＮＰの平均直径は、８０～１００ｎｍである。
本明細書中で一般に定められるように、「脂質」という用語は、疎水性または両親媒性特性を有する低分子を指す。脂質は、天然または合成であり得る。脂質のクラスの例としては、脂肪、ワックス、ステロール含有代謝産物、ビタミン、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質およびポリケタイドおよびプレノール脂質が挙げられるが限定されない。一部の例において、一部の脂質の両親媒性特性により、水性媒体中でそれらがリポソーム、小胞または膜を形成するようになる。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、イオン化可能脂質を含み得る。本明細書中で使用される場合、「イオン化可能脂質」という用語は、当技術分野でのその通常の意味を有し、１つ以上の荷電部分を含む脂質を指し得る。いくつかの実施形態において、イオン化可能脂質は、正に荷電し得るか、または負に荷電し得る。イオン化可能脂質は、正に荷電し得、この場合、これは、「カチオン性脂質」と呼ばれ得る。特定の実施形態において、イオン化可能脂質分子は、アミン基を含み得、イオン化可能アミノ脂質と呼ばれ得る。本明細書中で使用される場合、「荷電部分」は、形式電荷を保有する化学部分、例えば１価（＋１または－１）、２価（＋２または－２）、３価（＋３または－３）などである。荷電部分は、アニオン性（すなわち負に荷電）またはカチオン性（すなわち正に荷電）であり得る。正荷電部分の例としては、アミン基（例えば、一級、二級および／または三級アミン）、アンモニウム基、ピリジニウム基、グアニジン基およびイミジゾリウム基が挙げられる。特定の実施形態において、荷電部分は、アミン基を含む。負荷電基またはその前駆体の例としては、カルボン酸基、スルホン酸基、硫酸基、ホスホン酸基、リン酸基、ヒドロキシル基などが挙げられる。荷電部分の電荷は、一部の場合、環境的条件で変動し得、例えばｐＨの変化はその部分の電荷を変化させ得、および／またはその部分を荷電させ得るかまたは非荷電にし得る。一般に分子の電荷密度を必要に応じて選択し得る。
「荷電される」または「荷電部分」という用語は、分子上の「部分的な負電荷」または「部分的な正電荷」を指すものではないことを理解すべきである。「部分的な負電荷」および「部分的な正電荷」という用語は、当技術分野でのその通常の意味を与えられる。「部分的な負電荷」は、極性になる結合を官能基が含み、電子密度が結合の１つの原子に向かって引かれ、原子上で部分的な負電荷を生じさせるようになる場合に起こり得る。当業者は、一般にこのように極性になり得る結合を認識する。
いくつかの実施形態において、本イオン化可能脂質は、イオン化可能アミノ脂質であり、当技術分野で「イオン化可能カチオン脂質」と呼ばれることがある。ある実施形態において、イオン化可能アミノ脂質は、リンカー構造を介して連結される正荷電親水性頭部および疎水性テールを有し得る。
これらに加えて、イオン化可能脂質は、環状アミン基を含む脂質でもあり得る。
ある実施形態において、イオン化可能脂質は、そのそれぞれの内容がその全体において参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第２０１３０８６３５４号パンフレットおよび同第２０１３１１６１２６号パンフレットに記載のイオン化可能脂質から選択され得るが限定されない。
また別の実施形態において、イオン化可能脂質は、それぞれがその全体において参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第７，４０４，９６９号明細書の式ＣＬＩ－ＣＬＸＸＸＸＩＩから選択され得るが限定されない。
ある実施形態において、脂質は、その全体において本明細書中で参照により組み込まれる国際公開第２０１２１７０８８９号パンフレットに記載のものなどの切断可能な脂質であり得る。ある実施形態において、脂質は、当技術分野で公知の方法により、および／またはそのそれぞれの内容がその全体において参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第２０１３０８６３５４号パンフレットに記載のように合成され得る。
ナノ粒子組成物は、様々な方法により特徴を評価し得る。例えば、ナノ粒子組成物の形態およびサイズ分布を調べるために、顕微鏡（例えば、透過型電子顕微鏡または走査電子顕微鏡）を使用し得る。ゼータ電位を測定するために、動的光散乱または電位差測定（例えば、電位差滴定）を使用し得る。粒径を決定するためにも動的光散乱を利用し得る。粒径、多分散指数およびゼータ電位など、ナノ粒子組成物の複数の特徴を測定するために、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）などの機器も使用し得る。
いくつかの実施形態において、本ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）からなるかまたは基本的にそれらからなる脂質組成物を含む。いくつかの実施形態において、本ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）およびリン脂質（例えば、ＤＳＰＣまたはＭＳＰＣ）からなるかまたは基本的にそれらからなる脂質組成物を含む。
ナノ粒子組成物は、様々な方法により特徴を評価され得る。例えば、ナノ粒子組成物の形態およびサイズ分布を調べるために、顕微鏡（例えば、透過型電子顕微鏡または走査電子顕微鏡）を使用し得る。ゼータ電位を測定するために、動的光散乱または電位差測定（例えば、電位差滴定）を使用し得る。粒径を決定するためにも動的光散乱を利用し得る。粒径、多分散指数およびゼータ電位など、ナノ粒子組成物の複数の特徴を測定するために、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）などの機器も使用し得る。
ナノ粒子のサイズは、炎症などであるが限定されない生物学的反応に対抗することを促進し得るか、またはポリヌクレオチドの生物学的効果を向上させ得る。
本明細書中で使用される場合、ナノ粒子組成物に関連して、「サイズ」または「平均サイズ」は、ナノ粒子組成物の平均直径を指す。
ある実施形態において、リラキシンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、約１０～約１００ｎｍ、例えば約１０～約２０ｎｍ、約１０～約３０ｎｍ、約１０～約４０
ｎｍ、約１０～約５０ｎｍ、約１０～約６０ｎｍ、約１０～約７０ｎｍ、約１０～約８０ｎｍ、約１０～約９０ｎｍ、約２０～約３０ｎｍ、約２０～約４０ｎｍ、約２０～約５０ｎｍ、約２０～約６０ｎｍ、約２０～約７０ｎｍ、約２０～約８０ｎｍ、約２０～約９０ｎｍ、約２０～約１００ｎｍ、約３０～約４０ｎｍ、約３０～約５０ｎｍ、約３０～約６０ｎｍ、約３０～約７０ｎｍ、約３０～約８０ｎｍ、約３０～約９０ｎｍ、約３０～約１００ｎｍ、約４０～約５０ｎｍ、約４０～約６０ｎｍ、約４０～約７０ｎｍ、約４０～約８０ｎｍ、約４０～約９０ｎｍ、約４０～約１００ｎｍ、約５０～約６０ｎｍ、約５０～約７０ｎｍ、約５０～約８０ｎｍ、約５０～約９０ｎｍ、約５０～約１００ｎｍ、約６０～約７０ｎｍ、約６０～約８０ｎｍ、約６０～約９０ｎｍ、約６０～約１００ｎｍ、約７０～約８０ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約７０～約１００ｎｍ、約８０～約９０ｎｍ、約８０～約１００ｎｍおよび／または約９０～約１００ｎｍなどであるが限定されない直径を有する脂質ナノ粒子中に処方される。
ある実施形態において、本ナノ粒子の直径は、約１０～５００ｎｍである。ある実施形態において、本ナノ粒子の直径は、１００ｎｍ超、１５０ｎｍ超、２００ｎｍ超、２５０ｎｍ超、３００ｎｍ超、３５０ｎｍ超、４００ｎｍ超、４５０ｎｍ超、５００ｎｍ超、５５０ｎｍ超、６００ｎｍ超、６５０ｎｍ超、７００ｎｍ超、７５０ｎｍ超、８００ｎｍ超、８５０ｎｍ超、９００ｎｍ超、９５０ｎｍ超または１０００ｎｍ超である。
いくつかの実施形態において、本ナノ粒子組成物の最大直径は、１μｍ以下（例えば、１μｍ、９００ｎｍ、８００ｎｍ、７００ｎｍ、６００ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１７５ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍまたはそれを超える）である。
ナノ粒子組成物は、比較的均一であり得る。ナノ粒子組成物の均一性、例えばナノ粒子組成物の粒径分布を示すために多分散指数を使用し得る。小さい（例えば、０．３未満）の多分散指数は、一般に狭い粒径分布を示す。ナノ粒子組成物は、約０～約０．２５、例えば０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４または０．２５などの多分散指数を有し得る。いくつかの実施形態において、本明細書中で開示されるナノ粒子組成物の多分散指数は、約０．１０～約０．２０であり得る。
本組成物の界面動電位を示すために、ナノ粒子組成物のゼータ電位を使用し得る。例えば、ゼータ電位は、ナノ粒子組成物の表面電荷を示し得る。比較的低い正または負電荷を有するナノ粒子組成物が一般に望ましく、なぜなら、高い電荷を有する種ほど、細胞、組織および体内の他の要素と不要に相互作用し得るからである。いくつかの実施形態において、本明細書中で開示されるナノ粒子組成物のゼータ電位は、約－１０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約１０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－１０ｍＶ～約０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約－５ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－５ｍＶ～約０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約＋５ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約＋５ｍＶ～約＋１５ｍＶまたは約＋５ｍＶ～約＋１０ｍＶであり得る。
いくつかの実施形態において、本脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約０ｍＶ～約１００ｍＶ、約０ｍＶ～約９０ｍＶ、約０ｍＶ～約８０ｍＶ、約０ｍＶ～約７０ｍＶ、約０ｍＶ～約６０ｍＶ、約０ｍＶ～約５０ｍＶ、約０ｍＶ～約４０ｍＶ、約０ｍＶ～約３０ｍＶ、約０ｍＶ～約２０ｍＶ、約０ｍＶ～約１０ｍＶ、約１０ｍＶ～約１００ｍＶ、約１０ｍＶ～約９０ｍＶ、約１０ｍＶ～約８０ｍＶ、約１０ｍＶ～約７０ｍＶ、約１０ｍＶ～約６０ｍ
Ｖ、約１０ｍＶ～約５０ｍＶ、約１０ｍＶ～約４０ｍＶ、約１０ｍＶ～約３０ｍＶ、約１０ｍＶ～約２０ｍＶ、約２０ｍＶ～約１００ｍＶ、約２０ｍＶ～約９０ｍＶ、約２０ｍＶ～約８０ｍＶ、約２０ｍＶ～約７０ｍＶ、約２０ｍＶ～約６０ｍＶ、約２０ｍＶ～約５０ｍＶ、約２０ｍＶ～約４０ｍＶ、約２０ｍＶ～約３０ｍＶ、約３０ｍＶ～約１００ｍＶ、約３０ｍＶ～約９０ｍＶ、約３０ｍＶ～約８０ｍＶ、約３０ｍＶ～約７０ｍＶ、約３０ｍＶ～約６０ｍＶ、約３０ｍＶ～約５０ｍＶ、約３０ｍＶ～約４０ｍＶ、約４０ｍＶ～約１００ｍＶ、約４０ｍＶ～約９０ｍＶ、約４０ｍＶ～約８０ｍＶ、約４０ｍＶ～約７０ｍＶ、約４０ｍＶ～約６０ｍＶおよび約４０ｍＶ～約５０ｍＶであり得る。いくつかの実施形態において、本脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約１０ｍＶ～約５０ｍＶ、約１５ｍＶ～約４５ｍＶ、約２０ｍＶ～約４０ｍＶおよび約２５ｍＶ～約３５ｍＶであり得る。いくつかの実施形態において、本脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約１０ｍＶ、約２０ｍＶ、約３０ｍＶ、約４０ｍＶ、約５０ｍＶ、約６０ｍＶ、約７０ｍＶ、約８０ｍＶ、約９０ｍＶおよび約１００ｍＶであり得る。
ポリヌクレオチドの「封入効率」という用語は、提供される最初の量に対する、調製後の、ナノ粒子組成物により封入されるかまたはそうでなければナノ粒子組成物と会合するポリヌクレオチドの量を述べる。本明細書中で使用される場合、「封入」は、完全な、実質的または部分的な封じ込め、閉じ込め、包囲または内包を指し得る。
封入効率は、望ましくは高い（例えば、１００％近い）。例えば、１つ以上の有機溶媒または界面活性剤を用いてナノ粒子組成物を崩壊させる前後でナノ粒子組成物を含有する溶液中のポリヌクレオチドの量を比較することにより、封入効率を測定し得る。
溶液中の遊離ポリヌクレオチドの量を測定するために蛍光を使用し得る。本明細書中に記載のナノ粒子組成物の場合、ポリヌクレオチドの封入効率は、少なくとも５０％、例えば５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であり得る。いくつかの実施形態において、封入効率は、少なくとも８０％であり得る。特定の実施形態において、封入効率は、少なくとも９０％であり得る。
本明細書中で開示される医薬組成物中に存在するポリヌクレオチドの量は、ポリヌクレオチドのサイズ、所望の標的および／または適用またはナノ粒子組成物の他の特性などの複数の要因、ならびにポリヌクレオチドの特性などに依存し得る。
例えば、ナノ粒子組成物において有用なｍＲＮＡの量は、ｍＲＮＡのサイズ（長さまたは分子質量として表される）、配列および他の特徴に依存し得る。ナノ粒子組成物中のポリヌクレオチドの相対量も変動し得る。
有効性および忍容性を考慮して、脂質組成物および本開示のナノ粒子組成物中に存在するポリヌクレオチドの相対量を最適化し得る。ポリヌクレオチドとしてｍＲＮＡを含む組成物に対して、Ｎ：Ｐ比は、有用な基準となり得る。
ナノ粒子組成物のＮ：Ｐ比は、発現および忍容性の両方を調節するため、Ｎ：Ｐ比が低く、発現が強いナノ粒子組成物が望ましい。Ｎ：Ｐ比は、ナノ粒子組成物中の脂質とＲＮＡとの比率により変動する。
一般に、より低いＮ：Ｐが好ましい。１つ以上のＲＮＡ、脂質およびそれらの量は、約２：１～約３０：１、例えば２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１２：１、１４：１、１６：１、１８：１、２０：１、２２：１、２４：１、２６：１、２８：１または３０：１などのＮ：Ｐ比を提供するように選択され得る。特定の実施形態において、Ｎ：Ｐ比は、約２：１～約８：１であり得る。他の実施形態において、Ｎ：Ｐ比は、約５：１～約８：１である。特定の実施形態において、Ｎ：Ｐ比は、５：１～６：１である。ある具体的な態様において、Ｎ：Ｐ比は、約５．６７：１である。
ナノ粒子組成物を提供することに加えて、本開示は、ポリヌクレオチドを封入することを含む、脂質ナノ粒子を作製する方法も提供する。このような方法は、本明細書中で開示される医薬組成物の何れかを使用することおよび当技術分野で公知の脂質ナノ粒子の作製の方法に従って脂質ナノ粒子を作製することを含む。例えば、Ｗａｎｇら（２０１５）“Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．８７：６８－８０；Ｓｉｌｖａら（２０１５）“Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．Ｐａｒｔ Ｉ：Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１６：９４０－９５４；Ｎａｓｅｒｉら（２０１５）“Ｓｏｌｉｄ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｃａｒｒｉｅｒｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．５：３０５－１３；Ｓｉｌｖａら（２０１５）“Ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ”Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２９１～３０２およびそこで引用される参考文献を参照されたい。
他の送達剤
ａ．リポソーム、リポプレックスおよび脂質ナノ粒子
いくつかの実施形態において、本開示の組成物または処方物は、送達剤、例えばリポソーム、リポプレックス、脂質ナノ粒子またはそれらの任意の組み合わせを含む。本明細書中に記載のポリヌクレオチド（例えば、リラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、１つ以上のリポソーム、リポプレックスまたは脂質ナノ粒子を使用して処方され得る。リポソーム、リポプレックスまたは脂質ナノ粒子は、タンパク質産生に向けられるポリヌクレオチドの有効性を向上させるために使用され得るが、それは、これらの処方物が、ポリヌクレオチドによる細胞トランスフェクションを増進させ得、および／またはコードされるタンパク質の翻訳を向上させ得る。ポリヌクレオチドの安定性を向上させるためにもリポソーム、リポプレックスまたは脂質ナノ粒子が使用され得る。
リポソームは、主に脂質二重層から構成される人工的に調製された小胞であり、製剤処方物の投与のための送達ビヒクルとして使用され得る。リポソームは、異なるサイズであり得る。多重膜小胞（ＭＬＶ）は、直径が数百ナノメートルであり得、狭い水性の区画により分離される一連の同心円状二重層を含有し得る。小型の単細胞小胞（ＳＵＶ）は、直径が５０ｎｍ未満であり得、大型の単層膜小胞（ＬＵＶ）は、直径が５０～５００ｎｍであり得る。リポソーム設計は、不健康な組織へのリポソームの連結を向上させるため、またはエンドサイトーシスなどであるが限定されない事象を活性化するためのオプソニンまたはリガンドを含み得るが限定されない。製剤処方物の送達を改善するために、リポソームは、低いかまたは高いｐＨ値を含有し得る。
リポソームの形成は、封入される製剤処方物およびリポソームの成分、脂質小胞が分散される媒体の性質、封入される物質の有効濃度およびその潜在的な毒性、小胞の適用および／または送達中に含まれる任意のさらなる過程、最適サイズ、多分散および意図される適用に対する小胞の有効期間およびバッチ間の再現性および安全で効率的なリポソーム生成物の作製のスケールアップなどに依存し得る。
非限定例として、合成膜小胞などのリポソームは、米国特許出願公開第２０１３０１７７６３８号明細書、同第２０１３０１７７６３７号明細書、同第２０１３０１７７６３６号明細書、同第２０１３０１７７６３５号明細書、同第２０１３０１７７６３４号明細書、同第２０１３０１７７６３３号明細書、同第２０１３０１８３３７５号明細書、同第２０１３０１８３３７３号明細書および同第２０１３０１８３３７２号明細書に記載の方法、器具および装置によって調製し得る。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載のポリヌクレオチドをリポソームによって封入し得、および／またはこれは、水性コア中に含有され得、次いで例えば国際公開第２０１２０３１０４６号パンフレット、同第２０１２０３１０４３号パンフレット、同第２０１２０３０９０１号パンフレット、同第２０１２００６３７８号パンフレットおよび同第２０１３０８６５２６号パンフレットならびに米国特許出願公開第２０１３０１８９３５１号明細書、同第２０１３０１９５９６９号明細書および同第２０１３０２０２６８４号明細書に記載のようにリポソームによって封入され得る。各参照文献がその全体において本明細書中で参照により組み込まれる。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載のポリヌクレオチドは、カチオン水中油エマルション中に処方され得、ここで、エマルション粒子は、油性コアと、エマルション粒子に対して分子を係留するポリヌクレオチドと相互作用し得るカチオン脂質とを含む。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載のポリヌクレオチドは、親水相が分散される連続的な疎水相を含む油中水エマルション中に処方され得る。代表的なエマルションは、それぞれがその全体において本明細書中で参照により組み込まれる国際公開第２０１２００６３８０号パンフレットおよび同第２０１０８７７９１号パンフレットに記載の方法によって作製され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載のポリヌクレオチドは、脂質－ポリカチオン複合体中に処方され得る。脂質－ポリカチオン複合体の形成は、例えば、米国特許出願公開第２０１２０１７８７０２号明細書に記載のような方法によって達成され得る。非限定例として、ポリカチオンは、ポリリジン、ポリオルニチンおよび／またはポリアルギニンなどであるが限定されないカチオンペプチドまたはポリペプチド、および国際公開第２０１２０１３３２６号パンフレットまたは米国特許出願公開第２０１３０１４２８１８号明細書に記載のカチオンペプチドを含み得る。各参考文献は、その全体において本明細書中で参照により組み込まれる。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載のポリヌクレオチドは、それぞれがその全体において本明細書中で参照により組み込まれる国際公開第２０１３１２３５２３号パンフレット、同第２０１２１７０９３０号パンフレット、同第２０１１１２７２５５号パンフレッおよび同第２００８１０３２７６号パンフレットならびに米国特許出願公開第２０１３０１７１６４６号明細書に記載のものなどの脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に処方され得る。
脂質ナノ粒子処方物は、一般的には１つ以上の脂質を含む。いくつかの実施形態において、脂質は、カチオン性またはイオン化可能脂質である。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子処方物は、リン脂質、構造脂質、四級アミン化合物および粒子凝集を軽減可能な分子、例えばＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む他の構成要素をさらに含む。
カチオンおよびイオン化可能脂質は、例えば、それぞれがその全体において本明細書中で参照により組み込まれる国際公開第２０１５１９９９５２号パンフレット、同第２０１５１３０５８４号パンフレット、同第２０１５０１１６３３号パンフレットおよび同第２０１２０４０１８４号パンフレット、同第２０１３１２６８０３号パンフレット、同第２０１１１５３１２０号パンフレット、同第２０１１１４９７３３、同第２０１１０９０９６５号パンフレット、同第２０１１０４３９１３号パンフレット、同第２０１１０２２４６０号パンフレット、同第２０１２０６１２５９号パンフレット、同第２０１２０５４３６５号パンフレット、同第２０１２０４４６３８号パンフレット、同第２０１００８０７２４号パンフレット、同第２０１０２１８６５号パンフレット、同第２００８１０３２７６号パンフレットおよび同第２０１３０８６３７３号パンフレット、米国特許第７，８９３，３０２号明細書、同第７，４０４，９６９号明細書、同第８，２８３，３３３号明細書および同第８，４６６，１２２号明細書ならびに米国特許出願公開第２０１１０２２４４４７号明細書、同第２０１２０２９５８３２号明細書、同第２０１５０３１５１１２号明細書、同第２０１０００３６１１５号明細書、同第２０１２０２０２８７１号明細書、同第２０１３００６４８９４号明細書、同第２０１３０１２９７８５号明細書、同第２０１３０１５０６２５号明細書、同第２０１３０１７８５４１号明細書、同第２０１３０１２３３３８号明細書および同第２０１３０２２５８３６号明細書に記載のようなものを含み得る。いくつかの実施形態において、脂質組成物中のカチオンおよびイオン化可能脂質の量は、約０．０１ｍｏｌ％～約９９ｍｏｌ％の範囲である。
代表的なイオン化可能脂質としては、本明細書中で開示される化合物１～１４７の何れか１つ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｄ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ４－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＰ－ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ、ＤＬｉｎ－ＤＡＣ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎＡＰ、ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ、ＫＬ１０、ＫＬ２２、ＫＬ２５、オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ、オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ）、オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ）およびそれらの任意の組み合わせが挙げられるが限定されない。他の代表的なイオン化可能脂質としては、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニルドコサ－１３，１６－ジエン－１－アミン（Ｌ６０８）、（２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－２０，２３－ジエン－１０アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメミルヘキサコサ－１７，２０－ジエン－９－アミン、（１６Ｚ，１９Ｚ）－Ｎ５Ｎ－ジメチルペンタコサ－１６，１９－ジエン－８－アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルドコサ－１３，１６－ジエン－５－アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘニコサ－１２，１５－ジエン－４－アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリコサ－１４，１７－ジエン－６－アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルテトラコサ－１５，１８－ジエン－７－アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１８，２１－ジエン－１０－アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルテトラコサ－１５，１８－ジエン－５－アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリコサ－１４，１７－ジエン－４－アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメイヒルオクタコサ－１９，２２－ジエン－９－アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１８，２１－ジエン－８－アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキサコサ－１７，２０－ジエン－７－アミン、（１６Ｚ，１９Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタコサ－１６，１９－ジエン－６－アミン、（２２Ｚ，２５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘントリアコンタ－２２，２５－ジエン－１０－アミン、（２１Ｚ，２４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリアコンタ－２１，２４－ジエン－９－アミン、（１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコス－１８－エン－１０－アミン、（１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキサコス－１７－エン－９－アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルオクタコサ－１９，２２－ジエン－７－アミン、Ν，Ν－ジメチルヘプタコサン－１０－アミン、（２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ－エチル－Ｎ－メチルノナコサ－２０，２３－ジエン－１０－アミン、１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－１－ノニルイコサ－１１，１４－ジエン－１－イル］ピロリジン、（２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコス－２０－エン－１０－アミン、（１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエプタコス－１５－エン－１０－アミン、（１４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコス－１４－エン－１０－アミン、（１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコス－１７－エン－１０－アミン、（２４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリトリアコント－２４－エン－１０－アミン、（２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコス－２０－エン－１０－アミン、（２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘントリアコント－２２－エン－１０－アミン、（１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタコス－１６－エン－８－アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２－ノニルヘンイコサ－１２，１５－ジエン－１－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］エプタデカン－８－アミン、１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－ヘキシルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナデカン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ノナデカン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘンイコサン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｓ）－２－｛［（１Ｒ，２Ｒ）－２－ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］ノナデカン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘキサデカン－８－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－［（１Ｒ，２Ｓ）－２－ウンデシルシクロプロピル］テトラデカン－５－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－｛７－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘプチル｝ドデカン－１－アミン、１－［（１Ｒ，２Ｓ）－２－ヘプチルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルオクタデカン－９－アミン、１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－デシルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタデカン－６－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ペンタデカン－８－アミン、Ｒ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、Ｓ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、１－｛２－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－１－［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝ピロリジン、（２Ｓ）－Ν，Ν－ジメチル－１－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－３－［（５Ｚ）－オクト－５－エン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、１－｛２－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－１－［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝アゼチジン、（２Ｓ）－１－（ヘキシルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－（ヘプチルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、Ν，Ν－ジメチル－１－（ノニルオキシ）－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、Ν，Ν－ジメチル－１－［（９Ｚ）－オクタデク－９－エン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン；（２Ｓ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－６，９，１２－トリエン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－１１，１４－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（ペンチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－（ヘキシルオキシ）－３－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－１１，１４－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン、１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－１１，１４－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、１－［（１３Ｚ，１６Ｚ）－ドコサ－１３，１６－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－［（１３Ｚ、１６Ｚ）－ドコサ－１３，１６－ジエン－１－イルオキシ］－３－（ヘキシルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－［（１３Ｚ）－ドコス－１３－エン－１－イルオキシ］－３－（ヘキシルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン、１－［（１３Ｚ）－ドコス－１３－エン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、１－［（９Ｚ）－ヘキサデク－９－エン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｒ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｈ（１－メトイルオクチル）オキシ］－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、（２Ｒ）－１－［（３，７－ジメチルオクチル）オキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、Ν，Ν－ジメチル－１－（オクチルオキシ）－３－（｛８－［（１Ｓ，２Ｓ）－２－｛［（１Ｒ，２Ｒ）－２－ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］オクチル｝オキシ）プロパン－２－アミン、Ν，Ν－ジメチル－１－｛［８－（２－オクリルシクロプロピル）オクチル］オキシ｝－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミンおよび（１１Ｅ，２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－１１，２０，２－トリエン－１０－アミンならびにそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
リン脂質としては、グリセロリン脂質、例えばホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジグリセロールおよびホスファチジン酸などが挙げられるが限定されない。リン脂質は、スフィンゴミエリンなどのホスホスフィンゴ脂質も含む。いくつかの実施形態において、リン脂質は、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＵＰＣ、１８：０ジエーテルＰＣ、ＤＬｎＰＣ、ＤＡＰＣ、ＤＨＡＰＣ、ＤＯＰＥ、４ＭＥ １６：０ ＰＥ、ＤＳＰＥ、ＤＬＰＥ、ＤＬｎＰＥ、ＤＡＰＥ、ＤＨＡＰＥ、ＤＯＰＧおよびそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、リン脂質は、ＭＰＰＣ、ＭＳＰＣ、ＰＭＰＣ、ＰＳＰＣ、ＳＭＰＣ、ＳＰＰＣ、ＤＨＡＰＥ、ＤＯＰＧおよびそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、本脂質組成物中のリン脂質（例えば、ＤＳＰＣ）の量は、約１ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％の範囲である。
構造脂質としては、ステロールおよびステロール部分を含有する脂質が挙げられる。いくつかの実施形態において、構造脂質としては、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、アルファ－トコフェロールおよびこれらの混合物が挙げられる。いくつかの実施形態において、構造脂質は、コレステロールである。いくつかの実施形態において、本脂質組成物中の構造脂質（例えば、コレステロール）の量は、約２０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の範囲である。
ＰＥＧ修飾脂質としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジン酸、ＰＥＧ－セラミド複合物（例えば、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミンおよびＰＥＧ修飾１，２－ジアシルオキシプロパン－３－アミンが挙げられる。このような脂質は、ＰＥＧ化脂質とも呼ばれる。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣまたはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であり得る。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ－脂質は、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＧ）、ＰＥＧ－ジパルメトレイル（ｄｉｐａｌｍｅｔｏｌｅｙｌ）、ＰＥＧ－ジオレイル、ＰＥＧ－ジステアリル、ＰＥＧ－ジアシルグリカミド（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＰＰＥ）またはＰＥＧ－１，２－ジミリスチルオキスルプロピル－３－アミン（ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ）である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ部分のサイズは、約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００または２０，０００ダルトンである。いくつかの実施形態において、本脂質組成物中のＰＥＧ－脂質の量は、約０．１ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％の範囲である。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載のＬＮＰ処方物は、透過性促進分子さ
らに含み得る。非限定透過性促進分子は、その全体において本明細書中で参照により組み込まれる米国特許出願公開第２００５０２２２０６４号明細書に記載されている。
本ＬＮＰ処方物は、リン酸複合物をさらに含有し得る。リン酸複合物は、インビボ循環時間を延長させ得、および／またはナノ粒子の標的送達を向上させ得る。リン酸複合物は、例えば、国際公開第２０１３０３３４３８号パンフレットまたは米国特許出願公開第２０１３０１９６９４８号明細書に記載の方法によって作製され得る。本ＬＮＰ処方物は、例えば、米国特許出願公開第２０１３００５９３６０号明細書、同第２０１３０１９６９４８号明細書および同第２０１３００７２７０９号明細書に記載のようなポリマー複合物（例えば、水溶性複合物）も含有し得る。各参考文献は、その全体において本明細書中で参照により組み込まれる。
本ＬＮＰ処方物は、対象において本発明のナノ粒子の送達を促進するために複合物を含み得る。さらに、本複合物は、対象においてナノ粒子の食作用性クリアランスを阻害し得る。いくつかの実施形態において、本複合物は、ヒト膜タンパク質ＣＤ４７から設計される「自己」ペプチドであり得る（例えば、その全体において本明細書中で参照により組み込まれるＲｏｄｒｉｇｕｅｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３ ３３９，９７１－９７５に記載の「自己」粒子）。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚらにより示されるように、自己ペプチドは、ナノ粒子送達を促進したナノ粒子のマクロファージ介在性クリアランスを遅延させた。
本ＬＮＰ処方物は炭水化物担体を含み得る。非限定例として、炭水化物担体は、無水修飾フィトグリコーゲンまたはグリコーゲン型物質、オクテニルコハク酸フィトグリコーゲン、フィトグリコーゲンベータ－デキストリン、無水修飾フィトグリコーゲンベータ－デキストリンを含み得るが限定されない（例えば、その全体において本明細書中で参照により組み込まれる国際公開第２０１２１０９１２１号パンフレット）。
本ＬＮＰ処方物は、粒子送達を改善するために界面活性剤またはポリマーでコーティングされ得る。いくつかの実施形態において、ＰＥＧコーティングおよび／またはその全体において本明細書中で参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０１３０１８３２４４号明細書に記載のような中性表面電荷を有するコーティングなどであるが限定されない親水性コーティングでＬＮＰをコーティングし得る。
脂質ナノ粒子が、それぞれがその全体において本明細書中で参照により組み込まれる米国特許第８，２４１，６７０号明細書または国際公開第２０１３１１００２８号パンフレットに記載のような粘膜バリアに浸透し得るように粒子の表面特性を変化させるために、本ＬＮＰ処方物を改変し得る。
粘液に浸透するように改変されるＬＮＰは、ポリマー性物質（すなわちポリマー性コア）および／またはポリマー－ビタミン複合物および／またはトリ－ブロックコポリマーを含み得る。ポリマー性物質としては、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリウレア、ポリカーボネート、ポリ（スチレン）、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリルおよびポリアリレートが挙げられ得るが限定されない。
粘液に浸透させるために改変されるＬＮＰは、ポリヌクレオチド、アニオン性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、カチオン界面活性剤、例えばジメチルジオクタデシル－アンモニウムブロミドなど）、糖または糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコールおよびポロキサマー）、粘液溶解薬（例えば、Ｎ－アセチルシステイン、ヨモギ、ブロメライ
ン、パパイン、クサギ属（ｃｌｅｒｏｄｅｎｄｒｕｍ）、アセチルシステイン、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アンブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルゾリン、サイモシンβ４ドルナーゼアルファ、ネルテネキシン、エルドステイン）およびｒｈＤＮａｓｅを含む様々なＤＮａｓｅなどであるが限定されない表面変化剤も含み得る。
いくつかの実施形態において、粘液浸透ＬＮＰは、粘膜浸透促進コーティングを含む低浸透圧性処方物であり得る。本処方物は、それが送達されている上皮に対して低浸透圧性であり得る。低浸透圧性処方物の非限定例は、例えば、その全体において本明細書中で参照により組み込まれる国際公開第２０１３１１００２８号パンフレットで見られ得る。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載のポリヌクレオチドは、ＡＴＵＰＬＥＸＴＭ ｓｙｓｔｅｍ、ＤＡＣＣ ｓｙｓｔｅｍ、ＤＢＴＣ ｓｙｓｔｅｍおよびＳｉｌｅｎｃｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）からの他のｓｉＲＮＡ－リポプレックス技術、ＳＴＥＭＧＥＮＴ（登録商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）からのＳＴＥＭＦＥＣＴＴＭおよび核酸のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはプロタミンに基づく標的および非標的送達（Ａｌｅｋｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８ ６８：９７８８－９７９８；Ｓｔｒｕｍｂｅｒｇら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１２ ５０：７６－７８；Ｓａｎｔｅｌら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６ １３：１２２２－１２３４；Ｓａｎｔｅｌら、Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ ２００６ １３：１３６０－１３７０；Ｇｕｔｂｉｅｒら、Ｐｕｌｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０ ２３：３３４－３４４；Ｋａｕｆｍａｎｎら、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ２０１０ ８０：２８６－２９３ Ｗｅｉｄｅら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００９ ３２：４９８－５０７；Ｗｅｉｄｅら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００８ ３１：１８０－１８８；Ｐａｓｃｏｌｏ Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：１２８５－１２９４；Ｆｏｔｉｎ－Ｍｌｅｃｚｅｋら、２０１１ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３４：１－１５；Ｓｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５，２３：７０９－７１７；Ｐｅｅｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００７ ６；１０４：４０９５－４１００；ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８ １９：１２５－１３２；これらの全ては、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる）などであるが限定されないリポプレックスとして処方される。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載のポリヌクレオチドは、固形脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）として処方され、これは、平均直径が１０～１０００ｎｍの球状であり得る。ＳＬＮは、脂溶性分子を可溶化し得、界面活性剤および／または乳化剤で安定化され得る固形脂質コアマトリクスを保持する。代表的なＳＬＮは、その全体において本明細書中で参照により組み込まれる国際公開第２０１３１０５１０１号パンフレットに記載のものであり得る。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載のポリヌクレオチドは、制御放出および／または標的送達のために処方され得る。本明細書中で使用される場合、「制御放出」は、治療成果をもたらすための特定の放出パターンと順応する医薬組成物または化合物放出プロファイルを指す。ある実施形態において、制御放出および／または標的送達のために、本明細書中に記載のおよび／または当技術分野で公知の送達剤に本ポリヌクレオチドを封入し得る。本明細書中で使用される場合、「封入する」という用語は、封じ込める、取り囲む、または内包することを意味する。これは本発明の化合物の処方物に関連するため、封入は、実質的、完全または部分的であり得る。「実質的に封入される」という用語は、本発明の医薬組成物または化合物の少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９超、９９．９または９９．９９９％超が送達剤内に封じ込められるか、取り囲まれるか、または内包され得ることを意味する。「部分的に封入する」とは、本発明の医薬組成物または化合物の１０未満、１０、２０、３０、４０、５０またはそれ未満が送達剤内に封じ込められるか、取り囲まれるか、または内包され得ることを意味する。
有利に、封入は、蛍光および／または電子顕微鏡写真を使用して、本発明の医薬組成物または化合物の脱出または活性を測定することによって決定され得る。例えば、本発明の医薬組成物または化合物の少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９または９９．９９％超が送達剤中で封入される。
いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチド制御放出処方物は、少なくとも１つの制御放出コーティング（例えば、ＯＰＡＤＲＹ（登録商標）、ＥＵＤＲＡＧＩＴ ＲＬ（登録商標）、ＥＵＤＲＡＧＩＴ ＲＳ（登録商標）およびエチルセルロース水性分散物（ＡＱＵＡＣＯＡＴ（登録商標）およびＳＵＲＥＬＥＡＳＥ（登録商標））などのセルロース誘導体）を含み得る。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチド制御放出処方物は、米国特許出願公開第２０１３０１３０３４８号明細書に記載のようなポリマー系またはＰＥＧおよび／または米国特許第８，４０４，２２２号明細書に記載のようなＰＥＧ関連ポリマー誘導体（それぞれがその全体において参照により組み込まれる）を含み得る。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載のポリヌクレオチドは、治療用ナノ粒子中で封入され得、本明細書中で「治療用ナノ粒子ポリヌクレオチド」と呼ばれる。治療用ナノ粒子は、例えば、それぞれがその全体において本明細書中で参照により組み込まれる国際公開第２０１０００５７４０号パンフレット、同第２０１００３０７６３号パンフレット、同第２０１０００５７２１号パンフレット、同第２０１０００５７２３号パンフレットおよび同第２０１２０５４９２３号パンフレットならびに米国特許出願公開第２０１１０２６２４９１号明細書、同第２０１００１０４６４５号明細書、同第２０１０００８７３３７号明細書、同第２０１０００６８２８５号明細書、同第２０１１０２７４７５９号明細書、同第２０１０００６８２８６号明細書、同第２０１２０２８８５４１号明細書、同第２０１２０１４０７９０号明細書、同第２０１３０１２３３５１号明細書および同第２０１３０２３０５６７号明細書ならびに米国特許第８，２０６，７４７号明細書、同第８，２９３，２７６号明細書、同第８，３１８，２０８号明細書および同第８，３１８，２１１号明細書に記載の方法によって処方され得る。
いくつかの実施形態において、本治療用ナノ粒子ポリヌクレオチドは持続放出のために処方され得る。本明細書中で使用される場合、「持続放出」は、指定の時間にわたる放出速度に適合する医薬組成物または化合物を指す。時間としては、数時間、数日、数週、数か月および数年が挙げられ得るが限定されない。非限定例として、本明細書中に記載のポリヌクレオチドの持続放出ナノ粒子は、それぞれがその全体において参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第２０１００７５０７２号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１００２１６８０４号明細書、同第２０１１０２１７３７７号明細書、同第２０１２０２０１８５９号明細書および同第２０１３０１５０２９５号明細書において開示されるように処方され得る。
いくつかの実施形態において、本治療用ナノ粒子ポリヌクレオチドは、それぞれがその全体において本明細書中で参照により組み込まれる国際公開第２００８１２１９４９号パンフレット、同第２０１０００５７２６号パンフレット、同第２０１０００５７２５号パンフレット、同第２０１１０８４５２１号パンフレットおよび同第２０１１０８４５１８号パンフレットならびに米国特許出願公開第２０１０００６９４２６号明細書、同第２０
１２０００４２９３号明細書および同第２０１００１０４６５５号明細書に記載のものなど、標的特異的となるように処方され得る。
マイクロ流体ミキサーまたはマイクロミキサーを使用してＬＮＰを調製し得る。代表的なマイクロ流体ミキサーとしては、Ｍｉｃｒｏｉｎｎｏｖａ（Ａｌｌｅｒｈｅｉｌｉｇｅｎ ｂｅｉ Ｗｉｌｄｏｎ，Ａｕｓｔｒｉａ）により製造されるものを含むが限定されないスリットインターデジタル型マイクロミキサーおよび／またはスタガードヘリングボーンマイクロミキサー：ＳＨＭ）が挙げられ得るが限定されない（それぞれがその全体において本明細書中で参照により組み込まれるＺｈｉｇａｌｔｓｅｖら、“Ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌｉｍｉｔ ｓｉｚｅ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｗｉｔｈ ａｑｕｅｏｕｓ ａｎｄ
ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｃｏｒｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍｉｌｌｉｓｅｃｏｎｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｍｉｘｉｎｇ”，Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２８：３６３３－４０（２０１２）；Ｂｅｌｌｉｖｅａｕら、“Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｐｏｔｅｎｔ ｌｉｍｉｔ－ｓｉｚｅ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ”，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．１：ｅ３７（２０１２）；Ｃｈｅｎら、“Ｒａｐｉｄ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ｓｉＲＮＡ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｅｎａｂｌｅｄ ｂｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ”，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３４（１６）：６９４８－５１（２０１２）を参照されたい）。代表的なマイクロミキサーとしては、スリットインターデジタル型マイクロ構造ミキサー（ＳＩＭＭ－Ｖ２）、または標準的なスリットインターデジタル型マイクロミキサー（ＳＳＩＭＭ）、またはキャタピラー（ＣＰＭＭ）、またはＩｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｅｒ Ｍｉｋｒｏｔｅｃｈｎｉｋ Ｍａｉｎｚ ＧｍｂＨ，Ｍａｉｎｚ ＧｅｒｍａｎｙからのＩｍｐｉｎｇｉｎｇ－ｊｅｔ（ＩＪＭＭ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、ＳＨＭを使用してＬＮＰを作製する方法は、微細構造誘導性カオス的輸送（ＭＩＣＡ）により混合が起こる少なくとも２つの流入ストリームの混合をさらに含む。この方法によれば、流体の流れは、矢筈状パターンで存在するチャネルを通って流れ、これにより回転流が起こり、流体が互いの周囲で折り重なる。この方法は、流体混合のための表面も含み得、ここで、流体の循環中に表面が方向を変化させる。ＳＨＭを使用したＬＮＰ作製方法としては、それぞれがそれらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第２００４０２６２２２３号明細書および同第２０１２０２７６２０９号明細書に記載のものが挙げられる。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載のポリヌクレオチドは、マイクロ流体技術を用いて脂質ナノ粒子中に処方され得る（それぞれがその全体において本明細書中で参照により組み込まれるＷｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇｅｏｒｇｅ Ｍ．，“Ｔｈｅ Ｏｒｉｇｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ”，Ｎａｔｕｒｅ ４４２：３６８－３７３（２００６）；およびＡｂｒａｈａｍら、“Ｃｈａｏｔｉｃ Ｍｉｘｅｒ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５：６４７－６５１（２００２）を参照されたい）。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）またはＤｏｌｏｍｉｔｅ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｒｏｙｓｔｏｎ，ＵＫ）からのものなどであるが限定されないマイクロミキサーチップを使用して脂質ナノ粒子中に処方され得る。スプリットおよび再合流機序による２つ以上の流体の流れの急速混合のためにマイクロミキサーチップを使用し得る。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載のポリヌクレオチドは、約１ｎｍ～約１００ｎｍ、例えば約１ｎｍ～約２０ｎｍ、約１ｎｍ～約３０ｎｍ、約１ｎｍ～約４０ｎ
ｍ、約１ｎｍ～約５０ｎｍ、約１ｎｍ～約６０ｎｍ、約１ｎｍ～約７０ｎｍ、約１ｎｍ～約８０ｎｍ、約１ｎｍ～約９０ｎｍ、約５ｎｍ～約１００ｎｍ、約５ｎｍ～約１０ｎｍ、約５ｎｍ～約２０ｎｍ、約５ｎｍ～約３０ｎｍ、約５ｎｍ～約４０ｎｍ、約５ｎｍ～約５０ｎｍ、約５ｎｍ～約６０ｎｍ、約５ｎｍ～約７０ｎｍ、約５ｎｍ～約８０ｎｍ、約５ｎｍ～約９０ｎｍ、約１０～約２０ｎｍ、約１０～約３０ｎｍ、約１０～約４０ｎｍ、約１０～約５０ｎｍ、約１０～約６０ｎｍ、約１０～約７０ｎｍ、約１０～約８０ｎｍ、約１０～約９０ｎｍ、約２０～約３０ｎｍ、約２０～約４０ｎｍ、約２０～約５０ｎｍ、約２０～約６０ｎｍ、約２０～約７０ｎｍ、約２０～約８０ｎｍ、約２０～約９０ｎｍ、約２０～約１００ｎｍ、約３０～約４０ｎｍ、約３０～約５０ｎｍ、約３０～約６０ｎｍ、約３０～約７０ｎｍ、約３０～約８０ｎｍ、約３０～約９０ｎｍ、約３０～約１００ｎｍ、約４０～約５０ｎｍ、約４０～約６０ｎｍ、約４０～約７０ｎｍ、約４０～約８０ｎｍ、約４０～約９０ｎｍ、約４０～約１００ｎｍ、約５０～約６０ｎｍ、約５０～約７０ｎｍ、約５０～約８０ｎｍ、約５０～約９０ｎｍ、約５０～約１００ｎｍ、約６０～約７０ｎｍ、約６０～約８０ｎｍ、約６０～約９０ｎｍ、約６０～約１００ｎｍ、約７０～約８０ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約７０～約１００ｎｍ、約８０～約９０ｎｍ、約８０～約１００ｎｍおよび／または約９０～約１００ｎｍなどであるが限定されない直径を有する脂質ナノ粒子中に処方され得る。
いくつかの実施形態において、本脂質ナノ粒子の直径は、約１０～５００ｎｍであり得る。ある実施形態において、本脂質ナノ粒子の直径は、１００ｎｍ超、１５０ｎｍ超、２００ｎｍ超、２５０ｎｍ超、３００ｎｍ超、３５０ｎｍ超、４００ｎｍ超、４５０ｎｍ超、５００ｎｍ超、５５０ｎｍ超、６００ｎｍ超、６５０ｎｍ超、７００ｎｍ超、７５０ｎｍ超、８００ｎｍ超、８５０ｎｍ超、９００ｎｍ超、９５０ｎｍ超または１０００ｎｍ超であり得る。
いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、より小型のＬＮＰを使用して送達され得る。このような粒子は、０．１μｍ未満～最大１００ｎｍ、例えば０．１μｍ未満、１．０μｍ未満、５μｍ未満、１０μｍ未満、１５μｍ未満、２０μｍ未満、２５μｍ未満、３０μｍ未満、３５μｍ未満、４０μｍ未満、５０μｍ未満、５５μｍ未満、６０μｍ未満、６５μｍ未満、７０μｍ未満、７５μｍ未満、８０μｍ未満、８５μｍ未満、９０μｍ未満、９５μｍ未満、１００μｍ未満、１２５μｍ未満、１５０μｍ未満、１７５μｍ未満、２００μｍ未満、２２５μｍ未満、２５０μｍ未満、２７５μｍ未満、３００μｍ未満、３２５μｍ未満、３５０μｍ未満、３７５μｍ未満、４００μｍ未満、４２５μｍ未満、４５０μｍ未満、４７５μｍ未満、５００μｍ未満、５２５μｍ未満、５５０μｍ未満、５７５μｍ未満、６００μｍ未満、６２５μｍ未満、６５０μｍ未満、６７５μｍ未満、７００μｍ未満、７２５μｍ未満、７５０μｍ未満、７７５μｍ未満、８００μｍ未満、８２５μｍ未満、８５０μｍ未満、８７５μｍ未満、９００μｍ未満、９２５μｍ未満、９５０μｍ未満または９７５μｍ未満などであるが限定されない直径を含み得る。
本明細書中に記載のナノ粒子および微粒子は、マクロファージおよび／または免疫反応を調整するために幾何学的に改変され得る。幾何学的に改変された粒子は、肺送達などであるが限定されない標的送達のために本明細書中に記載のポリヌクレオチドを組み込むために、様々な形状、サイズおよび／または表面電荷を有し得る（例えば、その全体において本明細書中で参照により組み込まれる国際公開第２０１３０８２１１１号パンフレットを参照されたい）。幾何学的に改変された粒子の他の物理的特性としては、窓形成、曲がったアーム、非対称および表面の粗さ、細胞および組織との相互作用を変化させ得る電荷が挙げられ得るが限定されない。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載のナノ粒子は、その全体において本明
細書中で参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０１３０１７２４０６号明細書に記載のものなどであるが限定されない、ステルスナノ粒子または標的特異的なステルスナノ粒子である。ステルスまたは標的特異的なステルスナノ粒子は、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリウレア、ポリスチレン、ポリアミン、ポリエステル、ポリ無水物、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレートまたはそれらの組み合わせなどであるが限定されない２つ以上のポリマーを含み得るポリマー性マトリクスを含み得る。
非限定例として、修飾ｍＲＮＡは、調節可能な放出速度（例えば、数日および数週）でＰＬＧＡミクロスフェアを調製し、封入工程中に修飾ｍＲＮＡの完全性を維持しながら、ＰＬＧＡミクロスフェア中に修飾ｍＲＮＡを封入することにより、ＰＬＧＡミクロスフェア中に処方され得る。ＥＶＡｃは、前臨床持続放出インプラント適用において広く使用される非生体分解性、生体適合性ポリマーである（例えば、延長放出製品、Ｏｃｕｓｅｒｔ、緑内障用のピロカルピン眼内挿入物またはプロゲスタサート、持続放出プロゲステロン子宮内装置、経皮送達系テストダーム、デュラゲシクおよびセレギリン、カテーテル）。ポロキサマーＦ－４０７ＮＦは、５℃未満の温度で低粘度であるポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン－ポリオキシエチレンの親水性の非イオン性界面活性剤トリブロックコポリマーであり、１５℃より高い温度で固形ゲルを形成する。
非限定例として、本明細書中に記載のポリヌクレオチドは、米国特許第６，１７７，２７４号明細書に記載のようにＰＬＬとともに移植されるＰＥＧのポリマー性化合物とともに処方され得る。別の非限定例として、本明細書中に記載のポリヌクレオチドは、ＰＬＧＡ－ＰＥＧブロックコポリマー（例えば、米国特許出願公開第２０１２０００４２９３号明細書および米国特許第８，２３６，３３０号明細書および同第８，２４６，９６８号明細書を参照されたい）またはＰＬＧＡ－ＰＥＧ－ＰＬＧＡブロックコポリマー（例えば、米国特許第６，００４，５７３号明細書を参照されたい）などのブロックコポリマーとともに処方され得る。各参考文献は、その全体において本明細書中で参照により組み込まれる。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載のポリヌクレオチドは、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、ポリ（アミン－コ－エステル）またはそれらの組み合わせなどであるが限定されない少なくとも１つのアミン含有ポリマーとともに処方され得る。代表的なポリアミンポリマーおよび送達剤としてのそれらの使用は、例えば、それぞれがその全体において本明細書中で参照により組み込まれる米国特許第８，４６０，６９６号明細書、同第８，２３６，２８０号明細書に記載される。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載のポリヌクレオチドは、例えば、それぞれがその全体において本明細書中で参照により組み込まれる米国特許第６，６９６，０３８号明細書、同第６，５１７，８６９号明細書、同第６，２６７，９８７号明細書、同第６，２１７，９１２号明細書、同第６，６５２，８８６号明細書、同第８，０５７，８２１号明細書および同第８，４４４，９９２号明細書、米国特許出願公開第２００３００７３６１９号明細書、同第２００４０１４２４７４号明細書、同第２０１００００４３１５号明細書、同第２０１２００９１４５号明細書および同第２０１３０１９５９２０号明細書ならびに国際公開第２００６０６３２４９号パンフレットおよび同第２０１３０８６３２２号パンフレットに記載のように、生体分解性カチオンリポポリマー、生体分解性ポリマーまたは生体分解性コポリマー、生体分解性ポリエステルコポリマー、生体分解性ポリエステルポリマー、直鎖状生体分解性コポリマー、ＰＡＧＡ、生体分解性架橋カチオンマルチブロックコポリマーまたはそれらの組み合わせ中に処方され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書中で開示されるポリヌクレオチドは、ポリマー、脂質および／またはリン酸カルシウムなどであるが限定されない他の生体分解剤の組み合わせを使用してナノ粒子として処方される。送達のためにナノ粒子の微調整を可能にするために、構成要素がコア－シェル、ハイブリッドおよび／または多層構造で組み合わせられ得る（それらの全体において参照により本明細書中に組み込まれるＷａｎｇら、Ｎａｔ Ｍａｔｅｒ．２００６ ５：７９１－７９６；Ｆｕｌｌｅｒら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００８ ２９：１５２６－１５３２；ＤｅＫｏｋｅｒら、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１１ ６３：７４８－７６１；Ｅｎｄｒｅｓら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１１ ３２：７７２１－７７３１；Ｓｕら、Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．２０１１ Ｊｕｎ ６；８（３）：７７４－８７）。非限定例として、本ナノ粒子は、親水性－疎水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ－ＰＬＧＡ）、疎水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）および／または親水性ポリマー（その全体において本明細書中で参照により組み込まれる国際公開第２０１２０２２５１２９号パンフレット）などであるが限定されない複数のポリマーを含み得る。
コア－シェルナノ粒子の使用は、さらに、カチオン架橋ナノゲルコアおよび様々なシェルを合成するためのハイスループットアプローチに焦点が置かれている（その全体において本明細書中で参照により組み込まれるＳｉｅｇｗａｒｔら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１１ １０８：１２９９６－１３００１）。ポリマー性ナノ粒子の複合体形成、送達および内部移行は、ナノ粒子のコアおよびシェル構成要素の両方で化学組成を変化させることにより、的確に調節され得る。例えば、コア－シェルナノ粒子は、それらがコレステロールをナノ粒子に共有結合させた後、ｓｉＲＮＡをマウス肝細胞に効率的に送達され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載のようなポリヌクレオチドを送達するために、中間ＰＬＧＡ層と、ＰＥＧを含有する外側の中性脂質コアとを含む中空脂質コアを使用し得る。いくつかの実施形態において、本脂質ナノ粒子は、本明細書中で開示されるポリヌクレオチドのコアおよびポリマーシェルを含み得、これは、コア中のポリヌクレオチドを保護するために使用される。ポリマーシェルは、本明細書中に記載のポリマーの何れかであり得、および当技術分野で公知であり、ポリマーシェルは、コア中のポリヌクレオチドを保護するために使用され得る。
本明細書中に記載のポリヌクレオチドとの使用のためのコア－シェルナノ粒子は、それぞれがその全体において参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第８，３１３，７７７号明細書または国際公開第２０１３１２４８６７号パンフレットに記載されている。
ｂ．複合物
いくつかの実施形態において、本開示の組成物または処方物は、担体または標的指向化基に共有結合されるか、または一緒に複合物として融合タンパク質（例えば、標的指向化基およびリラキシンタンパク質またはペプチドを有する）を生成させる２つのコード領域を含む本明細書中に記載のポリヌクレオチド（例えば、リラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。複合物は、選択的に組織または生物中でナノ粒子をニューロンに向けるか、または脳血管関門の通過を支援するペプチドであり得る。
本複合物は、天然物質、例えばタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）またはグロブリン）
、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）、または脂質などを含む。リガンドは、組み換えまたは合成分子、例えば合成ポリマーなど、例えば合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（例えば、アプタマー）などでもあり得る。ポリアミノ酸の例としては、ポリアミノ酸、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－グリコリエド）コポリマー、ジビニルエーテル－マレイン酸無水物コポリマー、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン脂質、カチオンポルフィリン、ポリアミンの四級塩またはアルファヘリックスペプチドが挙げられる。
いくつかの実施形態において、本複合物は、本明細書中で開示されるポリヌクレオチドに対する担体として機能し得る。本複合物は、ポリアミン、ポリリジン、ポリアルキレンイミン、およびポリ（エチレングリコール）にグラフトされ得るポリエチレンイミンなどであるが限定されないカチオンポリマーを含み得る。代表的な複合物およびそれらの調製は、それぞれがその全体において参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第６，５８６，５２４号明細書および米国特許出願公開第２０１３０２１１２４９号明細書に記載されている。
本複合物は、標的指向化基、例えば細胞または組織標的化剤、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば腎臓細胞などの特定の細胞タイプに結合する抗体も含み得る。標的指向化基は、サイロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣物またはアプタマーであり得る。
標的指向化基は、タンパク質、例えば糖タンパク質、またはペプチド、例えばコリガンドに対して特異的な親和性を有する分子または抗体、例えば癌細胞、内皮細胞または骨細胞などの特異的な細胞タイプに結合する抗体であり得る。標的指向化基は、ホルモンおよびホルモン受容体も含み得る。これらは、非ペプチド種、例えば脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補助因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、多価フルコースまたはアプタマーも含み得る。リガンドは、例えば、リポ多糖またはｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化因子であり得る。
標的指向化基は、特異的な受容体を標的とすることが可能なあらゆるリガンドであり得る。例としては、葉酸、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース－６Ｐ、アプタマー、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬおよびＨＤＬリガンドが挙げられるが限定されない。特定の実施形態において、標的指向化基は、アプタマーである。アプタマーは、未修飾であり得、または本明細書中で開示される修飾の任意の組み合わせを有し得る。非限定例として、標的指向化基は、例えば米国特許出願公開第２０１３０２１６６１０１２号明細書（その全体にお
いて本明細書中で参照により組み込まれる）に記載のように、血液－中枢神経系障壁を横切る標的送達のためのグルタチオン受容体（ＧＲ）－結合複合物であり得る。
いくつかの実施形態において、本複合物は、より大きい治療用有効性を提供するために長時間作用連続放出系を含む相乗的生体分子－ポリマー複合物であり得る。相乗的生体分子－ポリマー複合物は、米国特許出願公開２０１３０１９５７９９第号明細書に記載のものであり得る。いくつかの実施形態において、本複合物は、国際公開第２０１２０４０５２４号パンフレットに記載のようなアプタマー複合物であり得る。いくつかの実施形態において、本複合物は、米国特許第８，５０７，６５３号明細書に記載のようなアミン含有ポリマー複合物であり得る。各参考文献は、その全体において本明細書中で参照により組み込まれる。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、ＳＭＡＲＴＴ ＰＯＬＹＭＥＲ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（登録商標）（ＰＨＡＳＥＲＸ（登録商標），Ｉｎｃ．Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）に複合化され得る。
いくつかの実施形態において、シグナル配列または標的指向化配列も含み得る細胞浸透ポリペプチドに本明細書中に記載のポリヌクレオチドを共有結合により複合化させる。この複合物は、安定性を向上させ、および／または細胞トランスフェクションを向上させるために設計され得、および／または生体内分布を変化させ得る（例えば、特異的な組織または細胞タイプに標的化される）。
いくつかの実施形態において、送達を促進するための薬剤に、本明細書中に記載のポリヌクレオチドを複合化し得る。いくつかの実施形態において、この薬剤は、国際公開第２０１１０６２９６５号パンフレットに記載のような標的指向化ブロックを有する標的指向化モノマーまたはポリマーなどのモノマーまたはポリマーであり得る。いくつかの実施形態において、この薬剤は、例えば、米国特許第６，８３５．３９３号明細書および同第７，３７４，７７８号明細書に記載のようなポリヌクレオチドに共有結合される輸送剤であり得る。いくつかの実施形態において、本薬剤は、米国特許第７，７３７，１０８号明細書および同第８，００３，１２９号明細書に記載のものなどの膜障壁輸送促進剤であり得る。各参考文献は、その全体において本明細書中で参照により組み込まれる。
使用方法
上記のポリヌクレオチド、医薬組成物および処方物は、調製、製造、ならびに／または心不全および／もしくは他の障害もしくは状態を処置するための治療での使用において使用される。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、組成物および処方物は、急性心不全（ＡＨＦ）を処置および／または予防するために使用される。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物および処方物は、それを必要とする対象においてリラキシンタンパク質のレベルを上昇させるための方法において使用される。例えば、本発明の一態様は、対象においてＨＦの症状を緩和する方法を提供し、この方法は、その対象への治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、リラキシンポリペプチドの機能的構成要素をコードするｍＲＮＡ）を含む組成物または処方物の投与を含む。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物または処方物を含む組成物または処方物の対象への投与の結果、細胞中のリラキシンタンパク質は、本組成物または処方物の投与前に観察されるレベルよりも少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％高いレベルに上昇する。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物または処方物の投与の結果、対象の細胞においてリラキシンタンパク質が発現される。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物または処方物の投与の結果、対象においてリラキシンタンパク質活性が上昇する。例えば、いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、リラキシンポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む組成物または処方物を対象に投与する方法において使用され、この方法の結果、対象の少なくとも一部の細胞でリラキシンタンパク質活性が上昇する。
いくつかの実施形態において、リラキシンポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む組成物または処方物の対象への投与の結果、細胞対象中のリラキシンタンパク質活性は、正常な対象、例えば心疾患に罹患していないヒトにおいて予想される活性レベルの少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％またはそれを超えるレベルまで上昇する。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物または処方物の投与の結果、顕著な代謝が起こるのが可能となるのに十分な時間にわたり持続する、対象の細胞の少なくとも一部におけるリラキシンタンパク質発現が起こる。
いくつかの実施形態において、コードされるポリペプチドの発現が上昇する。いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、細胞に導入した場合、細胞におけるリラキシンタンパク質発現レベルを、本ポリペプチドが細胞に導入される前の細胞におけるリラキシンタンパク質発現レベルに対して例えば少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％上昇させる。
本開示の他の態様は、哺乳動物対象へのポリヌクレオチドを含有する細胞の移植に関する。哺乳動物対象への細胞の投与は、当業者にとって公知であり、これには局所移植（例えば、局所または皮下投与）、臓器送達または全身的な注入（例えば、静脈内注射または吸入）および薬学的に許容可能な担体中での細胞の処方が含まれるが限定されない。
使用のための組成物および処方物
本発明の特定の態様は、上で開示されるポリヌクレオチドの何れかを含む組成物または処方物を対象とする。
いくつかの実施形態において、本組成物または処方物は、次のもの：
（ｉ）リラキシンポリペプチド（例えば、野生型配列、機能的断片またはそれらの変異体）をコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）であって、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基、例えば５－メトキシウラシル（例えば、ウラシルの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００％が５－メトキシウラシルである）を含み、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えばｍｉＲ－１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１４２－３
ｐまたはｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位）をさらに含むもの、および
（ｉｉ）例えば、式（Ｉ）を有する脂質、例えば化合物１～１４７の何れか（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）を含むＬＮＰを含む送達剤
を含む。
いくつかの実施形態において、リラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論的な最低ウラシルまたはチミン含量と比較したＯＲＦのウラシルまたはチミン含量（％ＵＴＭまたは％ＴＴＭ）は、約１００％～約１５０％である。
いくつかの実施形態において、疾患または障害、例えば急性心不全を処置および／または予防するために上記のポリヌクレオチド、組成物または処方物が使用される。
投与形態
上記の本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物および処方物は、治療的に有効な成果を生じさせるあらゆる経路により投与され得る。これらとしては、腸内（腸へ）、胃腸内、硬膜外（硬膜へ）、経口（口腔を通じて）、経皮、硬膜周囲、脳内（大脳へ）、脳室内（脳室へ）、皮膚上（皮膚上への塗布）、皮内（皮膚自体へ）、皮下（皮膚下へ）、鼻腔投与（鼻を通じて）、静脈内（静脈へ）、静脈内ボーラス、静脈内点滴、動脈内（動脈へ）、筋肉内（筋肉へ）、心内（心臓へ）、骨内注入（骨髄へ）、膜腔内（脊柱管へ）、腹腔内、（腹膜への点滴または注射）、膀胱内点滴、硝子体内（眼を通じて）、空洞内注射（病的な腔へ）腔内（陰茎の基部へ）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身分布のための無傷の皮膚を通じた拡散）、経粘膜（粘膜を通じた拡散）、経膣、吹送（鼻から吸引）、舌下、口唇下、浣腸、点眼（結膜上へ）、点耳薬中、耳介（耳に、または耳を通じて）、頬側（頬に向けられる）、結膜、皮膚、歯（１つまたは複数の歯へ）、電気浸透、子宮頸管内、洞内、気管内、体外、血液透析、浸潤、組織内、腹腔内、羊膜内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、軟骨内（軟骨内部）、仙骨内（馬尾内部）、大槽内（小脳延髄大槽内部）、角膜内（角膜内部）、歯冠内、冠内（冠動脈内部）、陰核海綿体内（陰茎の陰核海綿体の膨張スペース内部）、椎間板内（椎間板内部）、管内（腺管内部）、十二指腸内（十二指腸の内部）、硬膜内（硬膜内部または下）、表皮内（表皮へ）、食道内（食道へ）、胃内（胃の内部）、歯肉内（歯肉内部）、回腸内（小腸遠位部の内部）、病巣内（局所病変内または局所病変に直接導入）、管腔内（管腔内部）、リンパ内（リンパ内部）、髄内（骨髄腔内部）、髄膜内（髄膜内部）、眼内（眼の内部）、卵巣内（卵巣内部）、心膜内（心膜内部）、胸膜内（胸膜内部）、前立腺内（前立腺内部）、肺内（肺またはその気管支内部）、洞内（鼻洞または眼窩周囲洞内部）、脊髄内（脊柱内部）、滑膜内（関節の滑膜腔内部）、腱内（腱の内部）、精巣内（精巣内部）、髄腔内（脳脊髄軸の何れかのレベルの脳脊髄液内）、胸腔内（胸腔の内部）、管内（臓器の管内）、腫瘍内（腫瘍の内部）、鼓室内（アウルスメディア（ａｕｒｕｓ ｍｅｄｉａ）の内部）、血管内（１つまたは複数の血管の内部）、心室内（心室の内部）、イオントフォレーシス（電流を用いて、ここでは可溶性塩のイオンが体の組織中に移動する）、潅注（開放創または体腔を浴洗またはフラッシュするため）、喉頭（喉頭上に直接）、経鼻胃（鼻から胃へ）、密封包帯技術（局所経路投与、その後包帯で被覆して範囲を閉塞）、眼（外眼部に）、口腔咽頭（口および咽頭に直接）、非経口、経皮、関節周囲、硬膜周囲、神経周囲、歯周、直腸、呼吸器（局所または全身的効果のために経口または経鼻的に吸入することによって気道の内部へ）、球後（橋の後方または眼球の後方）、心筋内（心筋に入る）、軟部組織、くも膜下、結膜下、粘膜下、局所、経胎盤（胎盤を通じて、または横断して）、経気管（気管壁を通じて）、経鼓室（鼓室を横切るかまたはそれを通じて）、尿管（尿管へ）、尿道（尿道へ）、腟、仙骨ブロック、診断、神経ブロック、胆管かん流、心かん流、フォトフェレーシスまたは脊髄が挙げられるが限定されない。具体的な実施形態において、組成物は、それらが脳血管関門、血管障壁または他の上皮障壁を横断可能となるように投与され得る。いくつかの実施形態において、投与経路に対する処方物は、少なくとも１つの不活
性成分を含み得る。
本発明のポリヌクレオチド（例えば、リラキシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたは機能的断片またはそれらの変異体）を裸の状態で細胞に送達し得る。本明細書中で使用される場合、「裸の状態」は、トランスフェクションを促進する薬剤不含でポリヌクレオチドを送達することを指す。当技術分野で公知のおよび本明細書中に記載の投与経路を使用して、裸の状態のポリヌクレオチドを細胞に送達し得る。
本明細書中に記載の方法を使用して、本発明のポリヌクレオチド（例えば、リラキシンポリペプチドまたは機能的断片またはそれらの変異体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を処方し得る。本処方物は、修飾され得かつ／または未修飾のポリヌクレオチドを含有し得る。本処方物は、細胞浸透剤、薬学的に許容可能な担体、送達剤、生体浸食性または生体適合性ポリマー、溶媒および持続放出送達デポーをさらに含み得るが限定されない。処方されたポリヌクレオチドは、当技術分野で公知のおよび本明細書中に記載の投与経路を使用して細胞に送達され得る。
非経口投与のための医薬組成物は、少なくとも１つの不活性成分を含み得る。使用される不活性成分は、何れかが米国食品医薬品局（ＵＳ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）により承認されたものであり得るか、または使用される不活性成分の中に承認されているものがなくてもよい。非経口投与用の医薬組成物中での使用のための不活性成分の非網羅的リストには、塩酸、マンニトール、窒素、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムおよび水酸化ナトリウムが含まれる。
適切な分散剤、湿潤剤および／または懸濁剤を使用して、公知の技術に従い、注射用の製剤、例えば滅菌注射用水性または油性懸濁液を処方し得る。滅菌注射用製剤は、無毒性で非経口的に許容可能な希釈剤および／または溶媒中の滅菌注射用溶液、懸濁液および／またはエマルション、例えば１，３－ブタンジオール中の溶液としてのものであり得る。使用され得る許容可能なビヒクルおよび溶媒の中でも、水、リンゲル溶液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．および等張塩化ナトリウム溶液が挙げられる。滅菌固定油は、溶媒または懸濁媒として従来から使用されている。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む何れかの無味無臭の固定油が使用され得る。注射剤の調製において、オレイン酸などの脂肪酸が使用され得る。滅菌処方物は、局所麻酔薬、保存剤および緩衝剤などのアジュバントも含み得る。
注射用処方物は、例えば、細菌捕捉フィルターを通じたろ過により、および／または使用前に滅菌水または他の滅菌注射用媒体中で溶解また分散され得る滅菌固形組成物の形態で滅菌剤を組み込むことにより滅菌され得る。
注射用処方物は、組織、臓器および／または対象のある領域に直接注射するためのものであり得る。非限定例として、虚血領域への心筋内注射によって処方物を組織、臓器および／または対象に直接注射し得る。（例えば、その内容がその全体において本明細書中で参照により組み込まれるＺａｎｇｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１３を参照されたい）。
有効成分の効果を延長させるために、皮下または筋肉内注射からの有効成分の吸収を遅延させることが所望されることが多い。これは、水溶性に乏しい結晶性または非晶質物質の液体懸濁液の使用によって達成し得る。薬物の吸収速度は、その溶解速度に依存し、同様に結晶サイズおよび結晶形態に依存し得る。あるいは、非経口投与された薬物の吸収遅延は、油性ビヒクル中で薬物を溶解させるかまたは懸濁することによって達成される。注
射用デポー形態は、ポリラクチド－ポリグリコリドなどの生体分解性ポリマー中で薬物のマイクロカプセルマトリクスを形成することによって作製される。薬物とポリマーとの比率および使用される特定のポリマーの性質に依存して薬物放出速度が調節され得る。他の生体分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射用処方物は、身体組織と適合性があるリポソームまたはマイクロエマルション中で薬物を封入することによって調製される。
キットおよび装置
ａ．キット
本発明は、本発明の特許請求されるヌクレオチドを好都合におよび／または効果的に使用するための様々なキットを提供する。一般的には、キットは、使用者が対象の複数回の処置を行えるようにするために、および／または複数回の実験を行うために十分な量および／または数の構成要素を含む。
ある態様において、本発明は、本発明の分子（ポリヌクレオチド）を含むキットを提供する。
前記キットは、翻訳可能領域を含む第１のポリヌクレオチドを含む、タンパク質産生のためのものであり得る。本キットは、処方組成物を形成させるための包装および説明書および／または送達剤をさらに含み得る。本送達剤は、生理食塩水、緩衝溶液、リピドイドまたは本明細書中で開示される任意の送達剤を含み得る。
いくつかの実施形態において、緩衝溶液は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸塩および／またはＥＤＴＡを含み得る。別の実施形態において、緩衝溶液は、生理食塩水、２ｍＭカルシウム入りの生理食塩水、５％スクロース、２ｍＭカルシウム入りの５％スクロース、５％マンニトール、２ｍＭカルシウム入りの５％マンニトール、乳酸リンゲル液、塩化ナトリウム、２ｍＭカルシウム入りの塩化ナトリウムおよびマンノースを含み得るが限定されない（例えば、その全体において本明細書中で参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０１２０２５８０４６号明細書を参照されたい）。さらなる実施形態において、本緩衝溶液を沈殿させ得るか、またはこれを凍結乾燥し得る。一貫し、再現性のあるより高濃度の生理食塩水または単純な緩衝液処方を可能にするために各構成要素の量を変動させ得る。長期間にわたる、および／または様々な条件下における緩衝溶液中での修飾ＲＮＡの安定性を向上させるために構成要素も変動させ得る。ある態様において、本発明は、標的細胞に導入した場合に翻訳可能領域によりコードされるタンパク質の所望の量を産生させるのに有効な量で提供される、翻訳可能領域を含むポリヌクレオチド、細胞の自然免疫反応を実質的に阻害するために有効な量で提供される、阻害性核酸を含む第２のポリヌクレオチド、および包装および説明書を含む、タンパク質産生のためのキットを提供する。
ある態様において、本発明は、細胞ヌクレアーゼによる分解低下を示す、翻訳可能領域を含むポリヌクレオチドと、包装と、説明書とを含むタンパク質産生のためのキットを提供する。
ある態様において、本発明は、細胞ヌクレアーゼによる分解低下を示す、翻訳可能領域を含むポリヌクレオチドと、第１の核酸の翻訳可能領域の翻訳に適切な哺乳動物細胞とを含む、タンパク質産生のためのキットを提供する。
ｂ．装置
本発明は、関心のあるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込み得る装置を提供する。これらの装置は、安定な処方物において、ヒト患者など、それを必要とする
対象に直ちに送達するために利用可能である処方物中でポリヌクレオチドを合成するための試薬を含有する。
本明細書中で教示される単回、複数回または分割投与計画に従い、本発明のポリヌクレオチドを送達するために投与のための装置を使用し得る。このような装置は、例えば、内容がそれらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレットにおいて教示される。
本発明の実施形態のような本明細書中で開示される方法および組成物と組み合わせた使用のための、細胞、臓器および組織への複数回投与のための当技術分野で公知の方法および装置が企図される。これらには、例えば、複数の針を有する方法および装置、例えば管腔またはカテーテルを使用したハイブリッド装置ならびに熱、電流または放射線により駆動される機序を利用した装置が含まれる。
本発明によれば、これらの複数回投与装置は、本明細書中で企図される単回、複数回または分割用量を送達するために利用され得る。このような装置は、例えば、内容がそれらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレットにおいて教示される。
いくつかの実施形態において、本ポリヌクレオチドは、同時にまたは６０分以内において、３か所の異なる任意選択により隣接する部位に少なくとも３本の針を介して皮下または筋肉内投与される（例えば、４、５、６、７、８、９または１０か所に同時にまたは６０分以内に投与）。
ｃ．カテーテルおよび／または管腔を利用する方法および装置
単回、複数回または分割投与計画で本発明のポリヌクレオチドを投与するために、カテーテルおよび管腔を使用する方法および装置を使用し得る。このような方法および装置は、内容がそれらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレットに記載されている。
ｄ．電流を利用する方法および装置
本明細書中で教示される単回、複数回または分割投与計画に従い、本発明のポリヌクレオチドを送達するために、電流を利用する方法および装置を使用し得る。このような方法および装置は、内容がそれらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第２０１３１５１６６６号パンフレットに記載されている。
定義
本開示をより容易に理解し得るようにするために、特定の用語を最初に定義する。本願で使用される場合、本明細書中で他に明らかに提供される場合を除き、次の各用語は、以下で示す意味を有するものとする。本願全体を通じてさらなる定義が示される。
本発明は、その群の正確に１つのメンバーがある生成物または過程に存在するか、それで使用されるか、またはそうでなければそれと関連する実施形態を含む。本発明は、その群のメンバーの複数または全てがある生成物または過程に存在するか、それで使用されるか、またはそうでなければそれと関連する実施形態を含む。
本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈から明らかに示されない限り、複数形を含む。「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）という語ならびに「１つ以上」および「少なくとも１つ」という語は、本明細書中で交換可能に使用され得る。特定の態様において、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という語は、「単数」を意味する。他の態様において、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という語は、「２つ以上」または「複数」を含む。
さらに、「および／または」は、本明細書中で使用される場合、他のものと一緒に、または他のものなしで、２つの指定される特性または構成要素のそれぞれの具体的な開示として解釈されるべきものである。したがって、「および／または」という語は、本明細書中の「Ａおよび／またはＢ」などの句で使用される場合、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）および「Ｂ」（単独）を含むものとする。同様に、「および／または」という用語は、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」などの句で使用される場合、次の態様のそれぞれを包含するものとする：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）。
別段の定義がない限り、本明細書中で使用される全ての技術および科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；およびｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、本開示で使用される用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。
態様が「含む」という語とともに本明細書中に記載される場合には常に、「からなる」および／または「から基本的になる」という語において記載される他に類似の態様も提供される。
単位、接頭辞およびシンボルは、それらの国際単位系（ＳＩ）により許容される形態で示される。数の範囲は、範囲を定める数を包含する。値の範囲が挙げられる場合、このような値間の各サブ範囲とともに、その範囲の挙げられる上限と下限との間にある各整数値およびその各部分も具体的に開示されるものと理解されたい。あらゆる範囲の上限および下限は、その範囲に独立して含まれ得るかまたはその範囲から排除され得、上限および下限の何れかが含まれるか、何れも含まれないか、または両方が含まれる各範囲も本発明内に包含される。値が明確に挙げられる場合、挙げられる値とほぼ同じ数量または量である値も本発明の範囲内であることを理解されたい。組み合わせが開示される場合、その組み合わせの要素の各サブコンビネーションも具体的に開示され、本発明の範囲内である。逆に異なる要素または要素群が個々に開示される場合、それらの組み合わせも開示される。本発明の何れかの要素が複数の代替物を有するように開示される場合、各代替物が単独でまたは他の代替物との任意の組み合わせで排除される本発明の例も、本明細書により開示され、本発明の複数の要素がこのような排除を有し得、このような排除を有する要素の全ての組み合わせが本明細書により開示される。
ヌクレオチドは、それらの一般的に受容される１文字表記により示される。別段の断りがない限り、核酸は、５’から３’方向に左から右に記述される。核酸塩基は、本明細書中において、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ
Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨されるそれらの一般的に知られる１文字表記により示される。したがって、Ａは、アデニンを指し、Ｃは、シトシンを指し、Ｇは、グアニンを指し、Ｔは、チミンを指し、Ｕは、ウラシルを指す。
アミノ酸は、本明細書中において、何れかのそれらの一般的に公知の３文字表記により、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字表記により示される。別段の断りがない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向に左から右に記述される。
約：「約」という用語は、本明細書および特許請求の範囲を通じて数値と連結して使用する場合、当業者によく知られかつ許容可能な精度の間隔を示し、このような精度の間隔は、±１０％である。
範囲が与えられる場合、終点が含まれる。さらに、別段の指示がない限りまたは文脈および当業者の理解から別段明らかとならない限り、範囲として表される値は、内容から別段明らかに示されない限り、範囲の下限の単位の１０分の１まで、本発明の様々な実施形態において述べられる範囲内のあらゆる具体的な値またはサブ範囲を想定し得る。
併用による投与：本明細書中で使用される場合、「併用による投与」または「併用投与」という用語は、患者に対して各薬剤の効果の重複が存在し得るように、２つ以上の薬剤を同時にまたはある時間間隔内において対象に投与することを意味する。いくつかの実施形態において、これらは、互いに約６０、３０、１５、１０、５または１分以内に投与される。いくつかの実施形態において、薬剤の投与は、併用（例えば、相乗）効果が達成されるように十分に接近して間隔をあけられる。
アミノ酸置換：「アミノ酸置換」という用語は、親または参照配列（例えば、野生型リラキシン配列）中に存在するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置き換えることを指す。アミノ酸は、例えば、化学ペプチド合成を介してまたは当技術分野で公知の組み換え方法を通じて親または参照配列（例えば、野生型リラキシンポリペプチド配列）中で置換され得る。したがって、「位置Ｘでの置換」への言及は、位置Ｘに存在するアミノ酸の代替的アミノ酸残基での置換を指す。いくつかの態様において、置換パターンは、概略図ＡｎＹ（ここで、Ａは、天然にまたは元来位置ｎに存在するアミノ酸に対応する１文字コードであり、Ｙは、置換するアミノ酸残基である）に従って記され得る。他の態様において、置換パターンは、概略図Ａｎ（ＹＺ）（ここで、Ａは、天然にまたは元来位置Ｘに存在するアミノ酸を置換するアミノ酸残基に対応する１文字コードであり、すなわち、ＹおよびＺは、代替的な置換するアミノ酸残基である）に従って記され得る。
本開示との関連で、置換（それらがアミノ酸置換と呼ばれる場合でも）は、核酸レベルで行われ、すなわち、アミノ酸残基の代替的アミノ酸残基での置換は、第１のアミノ酸をコードするコドンを、第２のアミノ酸をコードするコドンで置換することにより行われる。
動物：本明細書中で使用される場合、「動物」という用語は、動物界のあらゆるメンバーを指す。いくつかの実施形態において、「動物」は、発生のあらゆる段階のヒトを指す。いくつかの実施形態において、「動物」は、発生のあらゆる段階の非ヒト動物を指す。特定の実施形態において、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類またはブタ）である。いくつかの実施形態において、動物としては、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類および寄生虫が挙げられるが限定されない。いくつかの実施形態において、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子改変動物またはクローンである。
およそ：本明細書中で使用される場合、「およそ」という語は、関心のある１つ以上の値に適用する場合、記載される参照値に類似する値を指す。特定の実施形態において、「
およそ」という用語は、別段の断りがない限りまたは文脈から別段明らかでない限り、記載される参照値の何れかの方向の（より大きいかまたはより小さい）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ未満内に入る値の範囲を指す（このような数が可能な値の１００％を超える場合を除く）。
関連する：疾患に関して本明細書中で使用される場合、「関連する」という用語は、対象の症状、測定結果、特徴または状況が、その疾患の診断、発生、存在または進行と関連があることを意味する。関連は、疾患に原因として関連し得るが、それが必要ではない。
２つ以上の部分に関して使用される場合、「会合する」、「複合化する」、「連結される」、「結合される」および「係留される」という用語は、２つ以上の部分に関して使用される場合、これらの部分が、直接もしくは結合物質として作用する１つ以上のさらなる部分を介しての何れかで互いに物理的に結合または連結して、その構造が用いられる条件、例えば生理学的条件下において、ある部分が依然として物理的に結合したままであるように十分に安定である構造を形成することを意味する。「会合」は、厳密に直接的共有化学結合によるものである必要はない。これは、「会合した」実体が物理的に結合したままであるように十分に安定したイオンもしくは水素結合またはハイブリッド形成に基づく結合性も示唆し得る。
二官能性：本明細書中で使用される場合、「二官能性」という用語は、少なくとも２つの機能を維持可能であるか、または維持するあらゆる物質、分子もしくは部分を指す。機能は、同じ成果または異なる成果をもたらし得る。機能をもたらす構造は、同じであるかまたは異なり得る。例えば、本発明の二官能性修飾ＲＮＡは、リラキシンペプチドをコードし得る（第１の機能）一方、コードＲＮＡを含むヌクレオチドは、それ自体でかつ自ずからＲＮＡの半減期を延長可能である（第２の機能）。この例において、タンパク質欠乏が起こっている対象に対する二官能性修飾ＲＮＡの送達は、疾患または状態を改善または処置し得るペプチドもしくはタンパク質分子を産生させるだけでなく、長期間にわたり対象において存在する集団修飾ＲＮＡも維持する。他の態様において、二官能性修飾ｍＲＮＡは、例えば、リラキシンペプチドおよび第１のタンパク質に融合されるか、または第１のタンパク質と同時発現されるかの何れかの第２のタンパク質をコードするＲＮＡ（第１の機能）を含むキメラまたはキメラ分子であり得る。
生体適合性：本明細書中で使用される場合、「生体適合性」という用語は、免疫系による損傷、毒性または拒絶のリスクが殆どないかまたは全くなく、生きている細胞、組織、臓器または系と適合性があることを意味する。
生体分解性：本明細書中で使用される場合、「生体分解性」という用語は、生物の作用によって無害の生成物に分解可能であることを意味する。
生物学的に活性：本明細書中で使用される場合、「生物学的に活性」という句は、生物系および／または生物において活性を有する任意の物質の特徴を指す。例えば、ある生物に投与された場合にこの生物に生物学的作用を及ぼす物質は、生物学的に活性であるとみなされる。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドの一部でさえも生物学的に活性であるか、または生物学的に関連すると考えられる活性を模倣する場合、生物学的に活性であるとみなされ得る。
キメラ：本明細書中で使用される場合、「キメラ」は、２つ以上の不調和であるかまたは異種である部分または領域を有するものである。例えば、キメラ分子は、リラキシンポリペプチドを含む第１の部分および第２のリラキシンタンパク質（例えば、別個の酵素性
活性を有するタンパク質、抗原結合部分またはリラキシンの血漿半減期を延長可能な部分、例えば抗体のＦｃ領域）を含む第２の部分（例えば、第１の部分に遺伝子操作により融合）を含み得る。
配列最適化：「配列最適化」という用語は、参照核酸配列中の核酸塩基が代替的核酸塩基で置き換えられ、その結果、核酸配列の特性が向上する、例えばタンパク質発現が向上するか、または免疫原性が低下する工程または一連の工程を指す。
一般に、配列最適化における最終目的は、参照ヌクレオチド配列によりコードされる同じポリペプチド配列をコードする同義のヌクレオチド配列を生成させることである。したがって、参照ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに関して、コドン最適化ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド中に（コドン最適化の結果として）アミノ酸置換はない。
コドン置換：配列最適化に関連して、「コドン置換」または「コドン置き換え」という用語は、参照核酸配列中に存在するコドンを別のコドンで置き換えることを指す。例えば、化学ペプチド合成を介してまたは当技術分野で公知の組み換え方法を通じて参照核酸配列においてコドンを置換し得る。したがって、核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）中の特定の位置でのまたは核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）の特定の領域もしくはサブ配列内での「置換」または「置き換え」への言及は、代替的コドンによるこのような位置または領域でのコドンの置換を指す。
本明細書中で使用される場合、「コード領域」および「コードする領域」という用語およびその文法的変形は、発現時にポリペプチドまたはタンパク質を生じさせるポリヌクレオチド中のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を指す。
化合物：本明細書中で使用される場合、「化合物」という用語は、示される構造の全ての立体異性体および同位体を含むことを意味する。本明細書中で使用される場合、「立体異性体」という用語は、化合物のあらゆる幾何異性体（例えば、シスおよびトランス異性体）、エナンチオマーまたはジアステレオマーを意味する。本開示は、立体異性的に純粋な形態（例えば、幾何的に純粋、エナンチオマーの面で純粋またはジアステレオマーの面で純粋）およびエナンチオマーおよび立体異性体混合物、例えばラセミ体を含む、本明細書中に記載の化合物のあらゆる立体異性体を包含する。化合物のエナンチオマーおよび立体異性体混合物、ならびにそれらをその構成要素となるエナンチオマーまたは立体異性体に分割する手段は周知である。「同位体」は、同じ原子数であるが、核においてニュートロン数が異なることから異なる質量数を有する原子を指す。例えば、水素の同位体は、トリチウムおよび重水素を含む。さらに、通常の方法により溶媒和物および水和物を形成させるために、本開示の化合物、塩または複合体を溶媒または水分子と組み合わせて調製し得る。
接触：本明細書中で使用される場合、「接触」という用語は、２つ以上のものの間の物理的な連結を確立することを意味する。例えば、哺乳動物細胞をナノ粒子組成物と接触させるとは、哺乳動物細胞およびナノ粒子が物理的連結を共有するようにすることを意味する。インビボおよびエクスビボの両方で外部のものと細胞を接触させる方法は、生物学的分野で周知である。例えば、ナノ粒子組成物および哺乳動物内で配置される哺乳動物細胞の接触は、様々な投与経路（例えば、静脈内、筋肉内、皮内および皮下）により行われ得、様々な量のナノ粒子組成物を含み得る。さらに、複数の哺乳動物細胞をナノ粒子組成物により接触させ得る。
保存的アミノ酸置換：「保存的アミノ酸置換」は、タンパク質配列中のアミノ酸残基が
、同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定められており、これには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニンまたはヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシンまたはシステイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンまたはトリプトファン）、ベータ－分岐状側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはヒスチジン）が含まれる。したがって、ポリペプチド中のアミノ酸が同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸で置き換えられる場合、アミノ酸置換は、保存的とみなされる。別の態様において、アミノ酸のストリングは、側鎖ファミリーメンバーのオーダーおよび／または組成が異なる構造的に同様のストリングで保存的に置き換えられ得る。
非保存的アミノ酸置換：非保存的アミノ酸置換には、（ｉ）陽性側鎖を有する残基（例えば、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓ）が、陰性残基（例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐ）に対してまたはこれにより置換される、（ｉｉ）親水性残基（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）が疎水性残基（例えば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＰｈｅまたはＶａｌ）に対してまたはこれにより置換される、（ｉｉｉ）システインまたはプロリンが任意の他の残基に対するかまたはこれにより置換される、または（ｉｖ）巨大な疎水性または芳香側鎖を有する残基（例えば、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、ＩｌｅまたはＴｒｐ）がより小さい側鎖を有する（例えば、ＡｌａまたはＳｅｒ）かまたは側鎖がないもの（例えば、Ｇｌｙ）に対してまたはこれにより置換されるものを含む。
他のアミノ酸置換は、当業者により容易に同定され得る。例えば、アミノ酸アラニンの場合、置換は、Ｄ－アラニン、グリシン、ベータ－アラニン、Ｌ－システインおよびＤ－システインの何れか１つから取られ得る。リジンの場合、置換は、Ｄ－リジン、アルギニン、Ｄ－アルギニン、ホモ－アルギニン、メチオニン、Ｄ－メチオニン、オルニチンまたはＤ－オルニチンの何れか１つであり得る。一般に、単離ポリペプチドの特性の変化を誘導すると予想され得る機能的に重要な領域における置換は、（ｉ）極性残基、例えばセリンまたはスレオニンが疎水性残基、例えばロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンまたはアラニンに対して（またはこれにより）置換される、（ｉｉ）システイン残基が任意の他の残基に対して（またはこれにより）置換される、（ｉｉｉ）陽性側鎖を有する残基、例えばリジン、アルギニンまたはヒスチジンが、陰性側鎖を有する残基、例えばグルタミン酸またはアスパラギン酸に対して（またはこれにより）置換される、または（ｉｖ）巨大な側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンが、このような側鎖を有するもの、例えばグリシンに対して（またはこれにより）置換されるものである。前述の非保存的置換の１つがタンパク質の機能的特性を変更させ得る可能性も、タンパク質の機能的に重要な領域に対して置換の位置と相関し、したがって、いくつかの非保存的置換は、生物学的特性において影響が殆どないかまたは全くないものであり得る。
保存される：本明細書中で使用される場合、「保存される」という用語は、それぞれ比較される２つ以上の配列の同じ位置で改変が起こらないポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のヌクレオチドまたはアミノ酸残基を指す。比較的保存されるヌクレオチドまたはアミノ酸は、配列の他の場所で出現するヌクレオチドまたはアミノ酸よりも多くの関連配列間で保存されるものである。
いくつかの実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに１００％同一である場合、「完全に保存される」と言われる。いくつかの実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合、「よく保存される」と言われる。いくつか
の実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％、約９８％または約９９％同一である場合、「よく保存される」と言われる。いくつかの実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも３０％同一、少なくとも４０％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合、「保存される」と言われる。いくつかの実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに約３０％同一、約４０％同一、約５０％同一、約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一または約９９％同一である場合、「保存される」と言われる。配列の保存は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの全長に適用され得るか、または部分、領域もしくはその特性に適用され得る。
制御放出：本明細書中で使用される場合、「制御放出」という用語は、治療成果をもたらすための特定の放出パターンと適合する医薬組成物または化合物放出プロファイルを指す。
環状または環状化：本明細書中で使用される場合、「環状」という用語は、連続的ループの存在を指す。環状分子は、環状である必要はなく、サブユニットの非破壊鎖を形成させるために連結されるのみである。本発明の改変ＲＮＡまたはｍＲＮＡなどの環状分子は、単一の単位もしくはマルチマーであり得るか、または複合体もしくはより高次の構造の１つ以上の構成要素を含み得る。
細胞毒性：本明細書中で使用される場合、「細胞毒性」は、細胞（例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、寄生生物、プリオンまたはそれらの組み合わせにおいて、死滅させるかまたは傷害性、毒性もしくは致命的な影響を生じさせることを指す。
送達：本明細書中で使用される場合、「送達」という用語は、目的に対して物体を提供することを意味する。例えば、対象へのポリヌクレオチドの送達は、本ポリヌクレオチドを含むナノ粒子組成物を対象に（例えば、静脈内、筋肉内、皮内または皮下経路によって）投与することを含み得る。哺乳動物または哺乳動物細胞へのナノ粒子組成物の投与は、ナノ粒子組成物との１つ以上の細胞の接触を含み得る。
送達剤：本明細書中で使用される場合、「送達剤」は、少なくとも部分的に、インビボ、インビトロまたはエクスビボでの標的とする細胞へのポリヌクレオチドの送達を促進するあらゆる物質を指す。
不安定化：本明細書中で使用される場合、「不安定」、「不安定化」または「不安定化する領域」という用語は、同じ領域または分子の出発野生型またはネイティブ型よりも安定性が低い領域または分子を意味する。
ジアステレオマー：本明細書中で使用される場合、「ジアステレオマー」という用語は、互いに鏡像ではなく、互いに重ねることができない立体異性体を意味する。
消化：本明細書中で使用される場合、「消化」という用語は、より小さい断片または構成要素に分解することを意味する。ポリペプチドまたはタンパク質を指す場合、消化の結果、ペプチドが生成される。
遠位：本明細書中で使用される場合、「遠位」という用語は、中心から離れた位置にあるか、または関心のある点または領域から離れた位置にあることを意味する。
ドメイン：本明細書中で使用される場合、ポリペプチドに言及するとき、「ドメイン」という用語は、１つ以上の同定可能な構造または機能的特徴または特性（例えば、結合能、タンパク質－タンパク質相互作用の部位となる）を有するポリペプチドのモチーフを指す。
投与計画：本明細書中で使用される場合、「投与計画」または「投与の計画」は、投与のスケジュールまたは医師が決定した処置、予防または緩和ケアの計画である。
有効量：本明細書中で使用される場合、薬剤の「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果、例えば臨床結果などをもたらすのに十分な量であり、このように、「有効量」は、それが適用される文脈に依存する。例えば、タンパク質欠乏（例えば、リラキシン欠乏）を処置する薬剤の投与との関連で、薬剤の有効量は、例えば、薬剤の投与なしで観察される症状の重症度と比較した場合、リラキシン欠乏に関連する徴候または症状を緩和、軽減、排除または予防するのに十分なリラキシンを発現させるｍＲＮＡの量である。「有効量」という用語は、「有効用量」、「治療的有効量」または「治療的有効用量」と交換可能に使用され得る。
エナンチオマー：本明細書中で使用される場合、「エナンチオマー」という用語は、少なくとも８０％（すなわち少なくとも９０％が一方のエナンチオマーであり、最大で１０％が他方のエナンチオマーである）、少なくとも９０％または少なくとも９８％の光学純度またはエナンチオマー過剰率（当技術分野で標準的な方法により決定した場合）を有する本発明の化合物の各個別の光学的に活性のある形態を意味する。
封入：本明細書中で使用される場合、「封入」という用語は、封じ込め、囲い込みまたは内包を意味する。
封入効率：本明細書中で使用される場合、「封入効率」は、ナノ粒子組成物の調製において使用されるポリヌクレオチドの最初の総量と比較した、ナノ粒子組成物の一部となるポリヌクレオチドの量を指す。例えば、最初に組成物に提供される全部で１００ｍｇのポリヌクレオチドから９７ｍｇのポリヌクレオチドがナノ粒子組成物中に封入される場合、封入効率は、９７％として与えられ得る。本明細書中で使用される場合、「封入」は、完全、実質的または部分的な封じ込め、閉じ込め、囲い込みまたは内包を指し得る。
コードされるタンパク質切断シグナル：本明細書中で使用される場合、「コードされるタンパク質切断シグナル」は、タンパク質切断シグナルコードするヌクレオチド配列を指す。
操作される：本明細書中で使用される場合、本発明の実施形態は、それらが、構造であれまたは化学であれ、出発点、野生型またはネイティブ分子から変動する特徴または特性を有するように設計される場合、「操作されている」。
送達促進：本明細書中で使用される場合、「送達促進」という用語は、関心のある標的組織への対照ナノ粒子（例えば、ＭＣ３、ＫＣ２またはＤＬｉｎＤＭＡ）によるポリヌクレオチドの送達レベルと比較した場合の、関心のある標的組織（例えば、哺乳動物肝臓）へのナノ粒子による、より多くの（例えば、少なくとも１．５倍多い、少なくとも２倍多い、少なくとも３倍多い、少なくとも４倍多い、少なくとも５倍多い、少なくとも６倍多い、少なくとも７倍多い、少なくとも８倍多い、少なくとも９倍多い、少なくとも１０倍多い）ポリヌクレオチドの送達を意味する。組織の重量に対してその組織で産生されるタンパク質の量を比較するか、組織の重量に対してその組織中のポリヌクレオチドの量を比
較するか、組織の総タンパク質の量に対してその組織で産生されるタンパク質の量を比較するか、または組織における総ポリヌクレオチドの量に対してその組織でのポリヌクレオチドの量を比較することにより、特定の組織へのナノ粒子の送達レベルを測定し得る。標的組織へのナノ粒子の送達促進は、処置される対象において決定されることを必要とせず、動物モデル（例えば、ラットモデル）などの代理物において決定され得ることが理解されるであろう。
エキソソーム：本明細書中で使用される場合、「エキソソーム」は、哺乳動物細胞により分泌される小胞またはＲＮＡ分解に関与する複合体である。
発現：本明細書中で使用される場合、核酸配列の「発現」は、次の事象の１つ以上を指す：（１）（例えば、転写による）ＤＮＡ配列からのｍＲＮＡ鋳型の産生、（２）（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成および／または３’末端プロセシングによる）ｍＲＮＡ転写物のプロセシング、（３）ポリペプチドまたはタンパク質へのｍＲＮＡの翻訳、および（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
エクスビボ：本明細書中で使用される場合、「エクスビボ」という用語は、生物（例えば、動物、植物もしくは微生物またはそれらの細胞もしくは組織）の外側で起こる事象を指す。エクスビボ事象により、環境において、天然（例えば、インビボ）環境からの変化は最小であり得る。
特性：本明細書中で使用される場合、「特性」は、特徴、特性または特有の要素を指す。ポリペプチドに対して言及する場合、「特性」は、分子の、別個のアミノ酸配列に基づく構成要素として定義される。本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの特性は、表面の所見、局所的な立体構造の形状、折り畳み、ループ、半ループ、ドメイン、半ドメイン、部位、末端またはそれらの任意の組み合わせを含む。
処方物：本明細書中で使用される場合、「処方物」は、少なくとも１つのポリヌクレオチドと、担体、賦形剤および送達剤の１つ以上とを含む。
断片：「断片」は、本明細書中で使用される場合、部分を指す。例えば、タンパク質の断片は、培養細胞から単離される全長タンパク質を消化することにより得られるポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、Ｎ末端、および／またはＣ末端、および／または内部サブ配列が欠失している、全長タンパク質のサブ配列である。本発明のいくつかの好ましい態様において、本発明のタンパク質の断片は、機能的断片である。
機能的：本明細書中で使用される場合、「機能的」生体分子は、それが、特徴とする特性および／または活性を呈する形態の生体分子である。したがって、本発明のポリヌクレオチドの機能的断片は、機能的リラキシン断片を発現可能なポリヌクレオチドである。本明細書中で使用される場合、リラキシンの機能的断片は、野生型リラキシン（すなわちその天然のアイソフォームの何れかの断片）またはその突然変異体もしくは変異体の断片を指し、このとき、断片は、対応する全長タンパク質の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％の生物学的活性を保持する。
ヘルパー脂質：本明細書中で使用される場合、「ヘルパー脂質」という用語は、脂質部
分（脂質層、例えば脂質二重層への挿入のため）および極性部分（脂質層表面での生理的溶液との相互作用のため）を含む化合物または分子を指す。一般的には、ヘルパー脂質は、リン脂質である。ヘルパー脂質の機能は、アミノ脂質を補完し、二重層の膜融合性を向上させること、および／または例えば細胞へ送達される核酸のエンドソーム脱出促進を補助することである。ヘルパー脂質は、ＬＮＰの表面に対する重要な構造要素であるとも考えられる。
相同性：本明細書中で使用される場合、「相同性」という用語は、ポリマー分子間、例えば核酸分子間（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）および／またはポリペプチド分子間の全体的な関係性を指す。一般に、「相同性」という用語は、２つの分子間の進化的な関係を暗示する。したがって、相同である２分子は、共通の進化的祖先を有するであろう。本発明との関連で、相同性という用語は、同一性および類似性の両方を包含する。
いくつかの実施形態において、ポリマー分子は、分子中のモノマーの少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％が同一である（完全に同じモノマー）かまたは類似している（保存的置換）場合、互いに対して「相同」であるとみなされる。「相同」という用語は、必ず少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）間の比較を指す。
同一性：本明細書中で使用される場合、「同一性」という用語は、ポリマー分子間、例えばポリヌクレオチド分子間（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）および／またはポリペプチド分子間の全体的なモノマー保存を指す。２つのポリヌクレオチド配列のパーセント同一性の計算は、例えば、最適比較のためにこの２つの配列に対してアライメントを行うことによって行われ得る（例えば、ギャップは、最適アライメントのために第１および第２の核酸配列の一方または両方に導入され得、比較のために非同一配列を無視し得る）。特定の実施形態において、比較のためにアライメントを行う配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％である。次に、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じヌクレオチドにより占有される場合、その分子は、その位置で同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、この２つの配列の最適アライメントのために導入する必要があるギャップ数および各ギャップの長さを考慮した、これらの配列により共有される同一である位置数の関数である。２つの配列間での配列比較およびパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。ＤＮＡおよびＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）は、均等とみなされ得る。
適切なソフトウェアプログラムは、様々なソースからかつタンパク質およびヌクレオチド配列の両方のアライメントのために利用可能である。パーセント配列同一性を決定するためのある適切なプログラムは、ｂｌ２ｓｅｑであり、プログラムのＢＬＡＳＴ ｓｕｉｔｅのパートは、米国連邦政府のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から利用可能である。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの何れかを使用して２つの配列間で比較を行う。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を比較するために使用される一方、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を比較するために使用される。他の適切なプログラムは、例えば、Ｎｅｅｄｌｅ，Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ，ＷａｔｅｒまたはＭａｔｃｈｅｒの一連のバイオインフォマティクスプログラムであるＥＭＢＯＳＳの一部であり、またＥｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔ
ｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）からｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ．で利用可能である。
ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ（ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ ＸまたはＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）、ＭＵＳＣＬＥなど、当技術分野で公知の方法を使用して配列アライメントを行い得る。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド参照配列とアライメントを行う単一ポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的配列内の異なる領域は、それら自体のパーセント配列同一性をそれぞれ有し得る。パーセント配列同一性値が小数点以下第１位に丸められることに留意されたい。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３および８０．１４は、８０．１に丸められる一方、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８および８０．１９は、８０．２に丸められる。長さの値が常に整数であることも留意されたい。
特定の態様において、第２のアミノ酸配列（または核酸配列）に対する第１のアミノ酸配列（または核酸配列）のパーセンテージ同一性「％ＩＤ」は、％ＩＤ＝１００ｘ（Ｙ／Ｚ）（式中、Ｙは、第１および第２の配列のアライメントにおいて同一であるマッチとしてスコア化されるアミノ酸残基（または核酸塩基）の数（目視検査または特定の配列アライメントプログラムによりアライメントを行う場合）であり、Ｚは、第２の配列中の残基の総数である）として計算される。第１の配列の長さが第２の配列よりも長い場合、第２の配列に対する第１の配列のパーセント同一性は、第１の配列に対する第２の配列のパーセント同一性よりも高くなる。
当業者にとって当然のことながら、パーセント配列同一性の計算のための配列アライメントの生成は、一次配列データにより独占的に運転される２成分配列－配列比較に限定されない。当然のことながら、構造データ（例えば、結晶学タンパク質構造）、機能データ（例えば、突然変異の位置）または系統発生学的データなどの異なる種類のソースからのデータと配列データを統合することにより、配列アライメントを生成させ得る。複数配列アラインメントを生成させるために異なる種類のデータを統合する適切なプログラムは、Ｔ－Ｃｏｆｆｅｅであり、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇで利用可能であり、あるいは例えばＥＢＩから利用可能である。当然のことながら、パーセント配列同一性を計算するために使用される最終アライメントは、自動または手動の何れかで精選され得る。
免疫反応：「免疫反応」という用語は、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、食作用性細胞、顆粒球、および侵入病原体のヒト身体、病原体に感染した細胞または組織、癌細胞または自己免疫もしくは病的炎症の場合には正常なヒト細胞もしくは組織への選択的な損傷、その破壊またはそれからの排出を生じさせる、上記の細胞または肝臓により産生される可溶性巨大分子（抗体、サイトカインおよび補体を含む）の作用を指す。一部の場合、脂質構成要素および封入治療薬を含むナノ粒子の投与は、免疫反応を引き起こし得、これは、（ｉ）封入治療薬（例えば、ｍＲＮＡ）、（ｉｉ）このような封入治療薬の発現産物（例えば、ｍＲＮＡによりコードされるポリペプチド）、（ｉｉｉ）ナノ粒子の脂質構成要素または（ｉｖ）それらの組み合わせにより引き起こされ得る。
炎症反応：「炎症反応」は、特異的および非特異的な防御系を含む免疫反応を指す。特異的な防御系反応は、抗原に対する特異的な免疫系反応である。特異的な防御系反応の例としては、抗体反応が挙げられる。非特異的な防御系反応は、一般に免疫記憶不可能である白血球、例えばマクロファージ、好酸球および好中球が介在する炎症反応である。いくつかの態様において、免疫反応は、炎症性サイトカインの分泌を含み、その結果、炎症性サイトカインレベルが上昇する。
炎症性サイトカイン：「炎症性サイトカイン」という用語は、炎症反応において上昇するサイトカインを指す。炎症性サイトカインの例としては、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、ＧＲＯαとしても知られるＣＸＣＬ１（ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１、インターフェロン－γ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターフェロンγ誘導性タンパク質１０（ＩＰ－１０）または顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）が挙げられる。炎症性サイトカインという用語は、当技術分野で公知の炎症反応に関連する他のサイトカイン、例えばインターロイキン－１（ＩＬ－１）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１３（Ｉｌ－１３）、インターフェロンα（ＩＦＮ－α）なども含む。
インビトロ：本明細書中で使用される場合、「インビトロ」という用語は、生物（例えば、動物、植物または微生物）内ではなく、人工環境において、例えば試験管または反応容器中において、細胞培養中にペトリ皿などにおいて起こる事象を指す。
インビボ：本明細書中で使用される場合、「インビボ」という用語は、生物（例えば、動物、植物もしくは微生物またはその細胞もしくは組織）内で起こる事象を指す。
挿入および欠失変異体：「挿入変異体」は、ポリペプチドに対して言及する場合、ネイティブまたは出発配列中の特定の位置のアミノ酸の直接隣に１つ以上のアミノ酸が挿入されるものである。アミノ酸に対して「直接隣」とは、アミノ酸のアルファ－カルボキシまたはアルファ－アミノ官能基の何れかに連結されることを意味する。「欠失変異体」は、ポリペプチドに対して言及する場合、ネイティブまたは出発アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸が除去されるものである。通常、欠失変異体は、分子の特定の領域で１つ以上のアミノ酸欠失を有する。
インタクト：本明細書中で使用される場合、ポリペプチドとの関連で、「インタクト」という用語は、野生型タンパク質に対応するアミノ酸を保持することを意味し、例えば野生型アミノ酸が突然変異していないかまたは置換されていない。逆に、核酸との関連で、「インタクト」という用語は、野生型核酸に対応する核酸塩基を保持することを意味し、例えば野生型核酸塩基が突然変異していないかまたは置換されていない。
イオン化可能アミノ脂質：「イオン化可能アミノ脂質」という用語は、１、２、３つまたはそれを超える脂肪酸または脂肪アルキル鎖およびｐＨ滴定可能なアミノ頭部基（例えば、アルキルアミノまたはジアルキルアミノ頭部基）を有する脂質を含む。イオン化可能アミノ脂質は、一般的には、アミノ頭部基のｐＫａを下回るｐＨではプロトン化されており（すなわち正荷電）、ｐＫａを上回るｐＨでは実質的に荷電していない。このようなイオン化可能アミノ脂質としては、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）および（１３Ｚ，１６５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニドコサ－１３－１６－ジエン－１－アミン（Ｌ６０８）が挙げられるが限定されない。
単離される：本明細書中で使用される場合、「単離される」という用語は、（天然であれまたは実験の設定であれ）連結されていた構成要素の少なくとも一部から分離されている物質または実体を指す。単離された物質（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）は、それらが単離された物質に対して様々なレベルの純度を有し得る。単離された物質および／または実体は、それらが最初に連結されていた他の構成要素の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％またはそれを超える割合から分離され得る。いくつかの実施形態において、単離された物質は、約８０％超、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約９９％超の純度である。本明細書中で使用される場合、物質は、それが実質的に他の構成要素不含である場合、「純粋」である。
実質的に単離される：「実質的に単離される」は、化合物が、それが形成されたかまたは検出された環境から実質的に分離されることを意味する。部分的分離は、例えば、本開示の化合物に富む組成物を含み得る。実質的な分離は、本開示の化合物またはその塩の少なくとも約５０重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％、少なくとも約９５重量％、少なくとも約９７重量％または少なくとも約９９重量％を含有する組成物を含み得る。
「単離」される、本明細書中で開示されるポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、細胞または任意の組成物は、天然では見られない形態であるポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、細胞または組成物である。単離されるポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチドまたは組成物は、もはやそれらが天然でみられる形態でない程度まで精製されているものを含む。いくつかの態様において、単離されるポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチドまたは組成物は、実質的に純粋である。
異性体：本明細書中で使用される場合、「異性体」という用語は、本発明の何れかの化合物のあらゆる互変異性体、立体異性体、エナンチオマーまたはジアステレオマーを意味する。本発明の化合物が１つ以上の不斉中心および／または二重結合を有し得、したがって立体異性体、例えば二重結合異性体（すなわち幾何Ｅ／Ｚ異性体）またはジアステレオマー（例えば、エナンチオマー（すなわち（＋）または（－））またはシス／トランス異性体）として存在することが認識される。本発明によれば、本明細書中で示される化学構造およびしたがって本発明の化合物は、対応する立体異性体の全て、すなわちステレオメリックに純粋な形態の両方（例えば、幾何的に純粋であるか、エナンチオマーの面で純粋であるか、またはジアステレオマーの面で純粋である）およびエナンチオマーおよび立体異性体混合物、例えばラセミ体の両方を包含する。本発明の化合物のエナンチオマーおよび立体異性体混合物は、一般的に、キラル相ガスクロマトグラフィー、キラル相高性能液体クロマトグラフィー、キラル塩錯体として化合物を結晶化することまたはキラル溶媒中で化合物を結晶化することなどの一般的に周知の方法によりそれらの構成要素のエナンチオマーまたは立体異性体に分割され得る。エナンチオマーおよび立体異性体はまた、周知の非対称合成方法により、ステレオメリックにまたはエナンチオマーの面で純粋な中間体、試薬および触媒から得られ得る。
リンカー：本明細書中で使用される場合、「リンカー」は、原子、例えば１０～１，０００の原子の基を指し、炭素、アミノ、アルキルアミノ、酸素、硫黄、スルホキシド、スルホニル、カルボニルおよびイミンなどであるが限定されない原子または基から構成され得る。リンカーは、第１の末端の核酸塩基または糖部分の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドに、および第２の末端でペイロード、例えば検出可能な薬剤または治療薬に連結され得る。リンカーは、核酸配列への組み込みを妨害しないような十分な長さのものであり得る。リンカーは、任意の有用な目的のために、本明細書中に記載のような、例えばポリヌクレオチドマルチマー（例えば、２つ以上のキメラポリヌクレオチド分子またはＩＶＴポリヌクレオチドの連結を通じて）またはポリヌクレオチド複合物を形成させるために、ならびにペイロードを投与するために使用され得る。リンカーに組み込み得る化学基の例としては、本明細書中に記載のような、それぞれが任意選択により置換され得るアルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリールまたはヘテロシクリルが挙げられるが限定されない。リンカーの例としては、不飽和アルカン、ポリエチレングリコール（例えば、エチレンまたはプロピレングリコール単量体の単位、例えばジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコールまたはテトラエチレングリコール）およびデキストランポリマーおよびその誘導体が挙げられるが限定されない。他の例としては、還元基または光分解を使用して切断され得るリンカー内の切断可能な部分、例えばジスルフィド結合（－Ｓ－Ｓ－）またはアゾ結合（－Ｎ＝Ｎ－）が挙げられるが限定されない。選択的に切断可能な結合の非限定例としては、例えばトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）または他の還元剤、および／または光分解の使用により切断され得るアミド結合、ならびに例えば酸性または塩基性加水分解により切断され得るエステル結合が挙げられる。
投与方法：本明細書中で使用される場合、「投与方法」は、静脈内、筋肉内、皮内、皮下または組成物を対象に送達する他の方法を含み得る。投与方法は、特異的な領域または身体の系への送達を標的に向ける（例えば、特異的に送達する）ために選択され得る。
修飾される：本明細書中で使用される場合、「修飾される」は、本発明の分子の状態または構造の変化を指す。化学的、構造的および機能的を含む多くの方法で分子を修飾し得る。いくつかの実施形態において、本発明のｍＲＮＡ分子は、例えば、それが天然リボヌクレオチドＡ、Ｕ、ＧおよびＣに関連するため、非天然ヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドの導入により修飾される。キャップ構造などの非標準ヌクレオチドは、それらがＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕリボヌクレオチドの化学構造と異なるにもかかわらず、「修飾されている」とみなされない。
粘液：本明細書中で使用される場合、「粘液」は、粘性があり、ムチン糖タンパク質を含む天然物質を指す。
ナノ粒子組成物：本明細書中で使用される場合、「ナノ粒子組成物」は、１つ以上の脂質を含む組成物である。ナノ粒子組成物は、一般的にはマイクロメートルまたはそれより小さい桁のサイズであり、脂質二重層を含み得る。ナノ粒子組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム（例えば、脂質小胞）およびリポプレックスを包含する。例えば、ナノ粒子組成物は、直径が５００ｎｍ以下の脂質二重層を有するリポソームであり得る。
天然：本明細書中で使用される場合、「天然」は、人工的な補助なく、天然に存在することを意味する。
非ヒト脊椎動物：本明細書中で使用される場合、「非ヒト脊椎動物」は、野生および飼育される種を含め、ホモサピエンスを除く全ての脊椎動物を含む。非ヒト脊椎動物の例としては、哺乳動物、例えばアルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、ウシ、シカ、イヌ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ウマ、ラマ、ラバ、ブタ、ウサギ、トナカイ、ヒツジ、水牛およびヤクが挙げられるが限定されない。
核酸配列：「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」または「ポリヌクレオチド配列」という用語は、交換可能に使用され、連続的な核酸配列を指す。この配列は、１本鎖または２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの何れか、例えばｍＲＮＡであり得る。
「核酸」という用語は、その最も広い意味において、ヌクレオチドのポリマーを含むあらゆる化合物および／または物質を含む。これらのポリマーは、ポリヌクレオチドと呼ばれることが多い。本発明の代表的な核酸またはポリヌクレオチドとしては、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（β－Ｄ－リボ立体配置を有するＬＮＡ、α－Ｌ－リボ立体配置を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’－アミノ官能基を有する２’－アミノ－ＬＮＡおよび２’－アミノ官能基を有する２’－アミノ－α－ＬＮＡを含むＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）もしくはハイブリッドまたはそれらの組み合わせが挙げられるが限定されない。
「コードするヌクレオチド配列」という句は、ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ分子）コード配列を指す。コード配列は、核酸が投与される個体または哺乳動物の細胞において発現を指示可能なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む制御エレメントに操作可能に連結される開始および終結シグナルをさらに含み得る。コード配列は、シグナルペプチドをコードする配列をさらに含み得る。
オフターゲット：本明細書中で使用される場合、「オフターゲット」は、あらゆる１つ以上の標的、遺伝子または細胞転写物におけるあらゆる意図しない影響を指す。
オープンリーディングフレーム：本明細書中で使用される場合、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、ある読み枠における終止コドンを含有しない配列を指す。
操作可能に連結される：本明細書中で使用される場合、「操作可能に連結される」という句は、２つ以上の、分子、コンストラクト、転写物、実体、部分などの間の機能的連結を指す。
任意選択により置換される：本明細書中で「任意選択により置換されるＸ」（例えば、任意選択により置換されるアルキル）の形態の句は、「Ｘ（式中、Ｘは、任意選択により置換される」（例えば、「アルキル（式中、このアルキルは、任意選択により置換される」）と均等であるものとする。特性「Ｘ」（例えば、アルキル）自体が任意選択であることを意味するものではない。
部分：本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチドの「部分」または「領域」は、ポリヌクレオチドの全長未満のポリヌクレオチドの何れかの部分として定義される。
患者：本明細書中で使用される場合、「患者」は、処置を求め得るかまたは処置を必要とする、処置を要する、処置を受けている、処置を受けるであろう対象、または特定の疾患もしくは状態に対して熟練した専門家によるケア下にある対象を指す。
薬学的に許容可能な：「薬学的に許容可能な」という句は、本明細書中において、合理的なベネフィット／リスク比と釣り合った、過剰な毒性、刺激、アレルギー性反応または他の問題もしくは合併症がなく、ヒトおよび動物の組織と接触させる際の使用に適切である、健全な医学的判断の範囲内にある化合物、物質、組成物および／または剤型を指すために使用される。
薬学的に許容可能な賦形剤：「薬学的に許容可能な賦形剤」という句は、本明細書中で使用される場合、本明細書中に記載の化合物以外（例えば、活性化合物を懸濁可能または溶解可能なビヒクル）であり、患者において実質的に無毒性および非炎症性である特性を有する任意の成分を指す。賦形剤としては、例えば、抗付着剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング、圧縮補助剤、崩壊剤、色素（色）、皮膚軟化剤、乳化剤、注入剤（希釈剤）、フィルム形成剤またはコーティング、香味剤、香料、流動促進剤（流動促進物質）、滑沢剤、保存剤、印刷インク、吸着剤、懸濁化または分散剤、甘味料および水和の水が挙げられ得る。代表的な賦形剤としては、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣおよびキシリトールが挙げられるが限定されない。
薬学的に許容可能な塩：本開示は、本明細書中に記載の化合物の薬学的に許容可能な塩も含む。本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容可能な塩」は、開示される化合物の誘導体を指し、ここで、既存の酸または塩基部分をその塩形態に変換することによって（例えば、遊離塩基性基を適切な有機酸と反応させることによって）親化合物が修飾される。薬学的に許容可能な塩の例としては、アミンなどの塩基性残基の鉱酸または有機酸塩、カルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機塩などが挙げられるが限定されない。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギニン酸塩、アスコルビン酸塩、アルパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、カンホレート、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトネート、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、硫酸ラウリル、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデンカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびに無毒性アンモニウム、四級アンモニウムおよびアミンカチオン、例えばアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含むが限定されないものが挙げられる。本開示の薬学的に許容可能な塩としては、例えば、無毒性無機または有機酸から形成される親化合物の従来の無毒性塩が挙げられる。本開示の薬学的に許容可能な塩は、従来の化学的方法によって塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成され得る。一般に、このような塩は、水中または有機溶媒中またはその２つの混合物中で化学量論的な量の適切な塩基または酸とこれらの化合物の遊離酸または塩基形態を反応させることによって調製され得、一般にエーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリルなどの非水性媒体が使用される。適切な塩の一覧は、それぞれがその全体において参照により本明細書中に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．１４１８，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ，Ｐ．Ｈ．ＳｔａｈｌおよびＣ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８およびＢｅｒｇｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，１－１９（１９７７）で見出される。
薬学的に許容可能な溶媒和物：「薬学的に許容可能な溶媒和物」という用語は、本明細書中で使用される場合、適切な溶媒の分子が結晶格子で組み込まれる本発明の化合物を意味する。適切な溶媒は、投与される投与量で生理学的に許容される。例えば、溶媒和物は、有機溶媒、水またはその混合物を含む溶液からの結晶化、再結晶化または沈殿によって調製され得る。適切な溶媒の例は、エタノール、水（例えば、一、二および三水和物）、Ｎ－メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３－ジメチル－３，４，５，６－テトラヒドロ－２－（１Ｈ）－ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２－ピロリドン、安息香酸ベンジルなどである。水が溶媒である場合、溶媒和物は、「水和物」と呼ばれる。
薬物動態：本明細書中で使用される場合、「薬物動態」は、分子または化合物の何れか１つ以上の特性を指すが、それは、これが生きている生物に投与される物質の運命の決定に関連するからである。薬物動態は、吸収度および吸収速度、分布、代謝および排泄を含むいくつかの領域に分けられる。これは、一般にＡＤＭＥと呼ばれる：（Ａ）吸収は、物質が血液循環に入る過程であり、（Ｄ）分布は、体液および身体の組織全体にわたる物質の分散または播種であり、（Ｍ）代謝（または生体内変換）は、娘代謝産物への親化合物の不可逆的な変換であり、（Ｅ）排泄（または排除）は、身体からの物質の排出を指す。稀な場合において、いくつかの薬物は、不可逆的に身体組織に蓄積する。
物理化学：本明細書中で使用される場合、「物理化学」は、物理学および／または化学的な特性を意味するかまたはこれらに関連する。
ポリヌクレオチド：「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書中で使用される場合、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、その類似体またはこれらの混合物を含む、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマーを指す。この用語は、分子の一次構造を指す。したがって、この用語は、３本、２本および１本鎖デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）ならびに３本、２本および１本鎖リボ核酸（「ＲＮＡ」）を含む。これは、例えば、アルキル化により、および／またはキャッピングにより修飾されたおよび未修飾形態のポリヌクレオチドも含む。より具体的には、「ポリヌクレオチド」という用語は、（２－デオキシ－Ｄ－リボースを含有する）ポリデオキシリボヌクレオチド、（Ｄ－リボースを含有する）ポリリボヌクレオチド、スプライシングされているかまたはスプライシングされていないかにかかわらず、例えばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｍＲＮＡを含むもの、プリンまたはピリミジン塩基のＮ－またはＣ－グリコシドであるポリヌクレオチドのあらゆる他のタイプおよびノームクレオチディック骨格、例えばポリアミド（例えば、ペプチド核酸「ＰＮＡ」）およびポリモルホリノポリマーを含有する他のポリマーおよび他の合成配列特異的な核酸ポリマーを含むが、ただし、ポリマーは、ＤＮＡおよびＲＮＡにおいて見出されるものなど、塩基対形成および塩基スタッキングを可能にする立体配置において核酸塩基を含有するものとする。特定の態様において、本ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを含む。他の態様において、ｍＲＮＡは、合成ｍＲＮＡである。いくつかの態様において、合成ｍＲＮＡは、少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。いくつかの態様において、特定のクラスの全ての核酸塩基は、非天然核酸塩基で置き換えられている（例えば、本明細書中で開示されるポリヌクレオチド中の全ウリジンが非天然核酸塩基、例えば５－メトキシウリジンで置き換えられ得る）。いくつかの態様において、本ポリヌクレオチド（例えば、合成ＲＮＡまたは合成ＤＮＡ）は、合成ＤＮＡの場合には天然核酸塩基、すなわちＡ（アデノシン）、Ｇ（グアノシン）、Ｃ（シチジン）およびＴ（チミジン）のみを含むか、または合成ＲＮＡの場合にはＡ、Ｃ、ＧおよびＵ（ウリジン）を含む。
当業者にとって当然のことながら、本明細書中で開示されるコドンマップ中のＴ塩基は、ＤＮＡ中に存在する一方、Ｔ塩基、対応するＲＮＡにおいてＵ塩基により置き換えられる。例えば、例としてベクターまたはインビトロ翻訳（ＩＶＴ）鋳型などのＤＮＡ形態の本明細書中で開示されるコドン－ヌクレオチド配列は、その対応する転写されたｍＲＮＡにおいてＵ塩基として転写されるそのＴ塩基を有する。この点において、コドン最適化ＤＮＡ配列（Ｔを含む）およびそれらの対応するｍＲＮＡ配列（Ｕを含む）の両方は、本発明のコドン最適化ヌクレオチド配列とみなされる。当業者は、均等なコドンマップが１つ以上の塩基を非天然塩基で置き換えることによって作製され得ることも理解するであろう
。したがって、例えば、ＴＴＣコドン（ＤＮＡマップ）は、ＵＵＣコドン（ＲＮＡマップ）に対応し、これは、同じくΨΨＣコドン（Ｕがシュードウリジンで置き換えられているＲＮＡマップ）に対応する。
標準的なＡ－ＴおよびＧ－Ｃ塩基対は、水素結合の形成を可能にする条件下において、チミジンのＮ３－ＨおよびＣ４－オキシと、アデノシンのそれぞれＮ１およびＣ６－ＮＨ２との間で、およびシチジンのＣ２－オキシ、Ｎ３およびＣ４－ＮＨ２と、グアノシンのそれぞれＣ２－ＮＨ２、Ｎ’-ＨおよびＣ６－オキシとの間で生じる。したがって、例え
ば、グアノシン（２－アミノ－６－オキシ－９－β－Ｄ－リボフラノシル－プリン）は、イソグアノシン（２－オキシ－６－アミノ－９－β－Ｄ－リボフラノシル－プリン）を形成させるために修飾され得る。このような修飾の結果、シトシンと標準的な塩基対をもはや有効に形成しないヌクレオシド塩基が生じる。しかし、イソシトシン（１－β－Ｄ－リボフラノシル－２－アミノ－４－オキシ－ピリミジン－）を形成させるためのシトシン（１－β－Ｄ－リボフラノシル－２－オキシ－４－アミノ－ピリミジン）の修飾の結果、グアノシンと効果的に塩基対形成がないが、イソグアノシンと塩基対を形成する修飾ヌクレオチドが生じる（Ｃｏｌｌｉｎｓらに対する米国特許第５，６８１，７０２号明細書）。イソシトシンは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）から入手可能であり、イソシチジンは、Ｓｗｉｔｚｅｒら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：１０４８９－１０４９６およびそこで引用される参考文献により記載される方法によって調製され得、２’－デオキシ－５－メチル－イソシチジンは、Ｔｏｒら、１９９３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：４４６１－４４６７およびそこで引用される参考文献の方法によって調製され得、イソグアニンヌクレオチドは、Ｓｗｉｔｚｅｒら、１９９３、上出およびＭａｎｔｓｃｈら、１９９３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５９３－５６０１に記載の方法を用いて、またはＣｏｌｌｉｎｓらに対する米国特許第５，７８０，６１０号明細書に記載の方法により調製され得る。他の非天然塩基対は、２，６－ジアミノピリミジンおよびその補完する（１－メチルピラゾロ－［４，３］ピリミジン－５，７－（４Ｈ，６Ｈ）－ジオンの合成に対するＰｉｃｃｉｒｉｌｌｉら、１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４３：３３－３７に記載の方法によって合成され得る。ユニークな塩基対を形成する他のこのような修飾ヌクレオチド単位が公知であり、例えばＬｅａｃｈら（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：３６７５－３６８３およびＳｗｉｔｚｅｒら、上出に記載のものなどである。
ポリペプチド：「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、あらゆる長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書中で交換可能に使用される。ポリマーは、修飾アミノ酸を含み得る。この用語は、天然にまたは介入、例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは修飾、例えば標識成分との抱合反応などにより修飾されているアミノ酸ポリマーも包含する。また、例えば、アミノ酸の１つ以上の類似体（例えば、ホモシステイン、オルニチン、ｐ－アセチルフェニルアラニン、Ｄ－アミノ酸およびクレアチンなどの非天然アミノ酸を含む）ならびに当技術分野で公知の他の修飾を含有するポリペプチドもこの定義に含まれる。
この用語は、本明細書中で使用される場合、あらゆるサイズ、構造または機能のタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを指す。ポリペプチドとしては、コードされるポリヌクレオチド産物、天然のポリペプチド、合成ポリペプチド、相同体、オルソログ、パラログ、断片および他の均等物、前述のものの変異体および類似体が挙げられる。ポリペプチドはモノマーであり得るか、または２量体、３量体もしくは４量体などの多分子複合体であり得る。これらは、１本鎖または多鎖ポリペプチドも含み得る。最も一般的には、ジスルフィド結合が多鎖ポリペプチド中で見出される。ポリペプチドという用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然のアミノ酸の人工的な化学類似体であるアミノ酸ポリマー
にも適用され得る。いくつかの実施形態において、「ペプチド」は、５０アミノ酸長以下、例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸長であり得る。
ポリペプチド変異体：本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド変異体」という用語は、アミノ酸配列がネイティブまたは参照配列と異なる分子を指す。アミノ酸配列変異体は、ネイティブまたは参照配列と比較した場合、アミノ酸配列内の特定の位置に置換、欠失および／または挿入を保持し得る。通常、変異体は、ネイティブまたは参照配列に対して、少なくとも約５０％の同一性、少なくとも約６０％の同一性、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９９％の同一性を保持する。いくつかの実施形態において、これらは、ネイティブまたは参照配列と少なくとも約８０％または少なくとも約９０％同一である。
単位薬物あたりのポリペプチド（ＰＵＤ）：本明細書中で使用される場合、ＰＵＤまたは単位薬物あたりの生成物は、体液または組織中で測定される場合、１日総投与量、通常、生成物（ポリペプチドなど）１ｍｇ、ｐｇ、ｋｇの分割部分として定義され、通常、例えば体液中での測定により除されるｐｍｏｌ／ｍＬ、ｍｍｏｌ／ｍＬなどの濃度で通常定義される。
予防する：本明細書中で使用される場合、「予防する」という用語は、感染、疾患、障害および／もしくは状態の部分的もしくは完全な発症遅延、特定の感染、疾患、障害および／もしくは状態の１つ以上の徴候もしくは症状、特性もしくは臨床症状の部分的もしくは完全な発症遅延、特定の感染、疾患、障害および／もしくは状態の１つ以上の徴候もしくは症状、特性もしくは出現の部分的もしくは完全な発症遅延、感染、特定の疾患、障害および／もしくは状態からの部分的もしくは完全な進行遅延、ならびに／または感染、疾患、障害および／もしくは状態に関連する病態発生リスクの低下を指す。
増殖：本明細書中で使用される場合、「増殖」という用語は、増えるか、拡大するかもしくは増加するか、または急速に増えるか、拡大するかもしくは増加することを引き起こすことを意味する。「増殖的」は、増殖能を有することを意味する。「抗増殖」は、増殖特性を無効にするかまたはこれに不適切な特性を有することを意味する。
予防：本明細書中で使用される場合、「予防」は、疾患の広がりを防ぐために使用される治療薬または一連の行動を指す。
予防法：本明細書中で使用される場合、「予防法」は、健康を維持し、疾患の拡大を防ぐためにとられる手段を指す。「免疫予防」は、疾患の拡大を防ぐために能動的または受動的免疫を生じさせるための手段を指す。
タンパク質切断部位：本明細書中で使用される場合、「タンパク質切断部位」は、アミノ酸鎖の切断調節が化学的、酵素的または光化学的手段によって達成され得る部位を指す。
タンパク質切断シグナル：本明細書中で使用される場合、「タンパク質切断シグナル」は、切断のためのポリペプチドに対する印を与えるかまたはそれをマークする少なくとも１つのアミノ酸を指す。
関心のあるタンパク質：本明細書中で使用される場合、「関心のあるタンパク質」または「所望のタンパク質」という用語は、本明細書中で提供されるものならびにその断片、
突然変異体、変異体および改変物を含む。
近位：本明細書中で使用される場合、「近位」という用語は、中心または関心のある点もしくは領域のより近くに位置することを意味する。
シュードウリジン：本明細書中で使用される場合、シュードウリジン（Ψ）は、ヌクレオシドウリジンのＣ－グリコシド異性体を指す。「シュードウリジン類似体」は、シュードウリジンのあらゆる修飾物、変異体、アイソフォームまたは誘導体である。例えば、シュードウリジン類似体としては、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、１－プロピニル－シュードウリジン、１－タウリノメチル－シュードウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－シュードウリジン、１－メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）、１－メチル－４－チオ－シュードウリジン（ｍ１ｓ４Ψ）、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、３－メチル－シュードウリジン（ｍ３Ψ）、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ３Ψ）および２’－Ｏ－メチル－シュードウリジン（Ψｍ）が挙げられるが限定されない。
精製：本明細書中で使用される場合、「精製する」、「精製される」、「精製」は、実質的に純粋にするか、または不要な構成要素、物質汚染、混合もしくは不備から離されるようになることを意味する。
参照核酸配列：「参照核酸配列」、または「参照核酸」、または「参照ヌクレオチド配列」、または「参照配列」という用語は、配列最適化され得る出発核酸配列（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ配列）を指す。いくつかの実施形態において、参照核酸配列は、野生型核酸配列、それらの断片または変異体である。いくつかの実施形態において、参照核酸配列は、既に配列最適化された核酸配列である。
塩：いくつかの態様において、本明細書中で開示される腫瘍内送達のための本医薬組成物は、それらの脂質構成物のいくつかの塩を含む。「塩」という用語は、何れかのアニオンおよびカチオン錯体を含む。アニオンの非限定例としては、無機および有機アニオン、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、シュウ酸（例えば、ヘミシュウ酸）、リン酸、ホスホン酸、リン酸水素、リン酸二水素、酸化物、炭酸、重炭酸、硝酸、亜硝酸、ニトリド、亜硫酸水素、スルフィド、亜硫酸、重硫酸、硫酸、チオ硫酸、硫酸水素、ホウ酸、ギ酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、アクリル酸、ポリアクリル酸、フマル酸、マレイン酸、イタコン酸、グリコール酸、グルコン酸、リンゴ酸、マンデル酸、チグリン酸、アスコルビン酸、サリチル酸、ポメタクリル酸、過塩素酸、塩素酸、亜塩素酸、次亜塩素酸、臭素酸、次亜臭素酸、ヨウ素酸、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、ヒ酸、亜ヒ酸、クロム酸、二クロム酸、シアン化物、シアン酸、チオシアン酸、水酸化物、過酸化物、過マンガン酸およびこれらの混合物が挙げられる。
試料：本明細書中で使用される場合、「試料」または「生体試料」という用語は、その組織、細胞または構成要素部分（例えば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜帯血液、尿、膣液および精液を含むが限定されない体液）のサブセットを指す。試料としては、生物全体または例えば血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚の外部の部分、呼吸器、腸および泌尿生殖器、涙、唾液、乳汁、血液細胞、腫瘍、臓器を含むが限定されない、その組織、細胞もしくは構成要素のパーツのサブセットまたはその一片もしくは一部から調製されるホモジネート、溶解液または抽出物がさらに挙げられ得る。試料は、タンパク質または核酸分子などの細胞構成要素を含有し得る培地、例えば栄養ブロスまたはゲルなどをさらに指す。
シグナル配列：本明細書中で使用される場合、「シグナル配列」、「シグナルペプチド」および「輸送ペプチド」という句は、交換可能に使用され、ある種の細胞小器官、細胞区画へのタンパク質の輸送もしくは局在化または細胞外輸送を指示し得る配列を指す。この用語は、シグナル配列ポリペプチドおよびシグナル配列をコードする核酸配列の両方を包含する。したがって、核酸との関連で、シグナル配列への言及は、実際にシグナル配列ポリペプチドをコードする核酸配列を指す。
シグナル伝達経路：「シグナル伝達経路」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達に寄与する様々なシグナル伝達分子間の生化学的関係を指す。本明細書中で使用される場合、「細胞表面受容体」という句は、例えば、シグナルおよび細胞の形質膜を横断するこのようなシグナルの伝達を受容可能な分子および分子複合体を含む。
類似度：本明細書中で使用される場合、「類似度」という用語は、ポリマー分子間、例えばポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的な関係性を指す。ポリマー分子の、ある別のものに対するパーセント類似度の計算は、パーセント類似度の計算が当技術分野で理解されるような保存的置換を考慮することを除き、パーセント同一性の計算と同じように行われ得る。
単回単位用量：本明細書中で使用される場合、「単回単位用量」は、１回の投与／１つの時間／１つの経路／１つの接触点で投与される、すなわち単回投与事象である任意の治療薬の用量である。
分割用量：本明細書中で使用される場合、「分割用量」は、１回の単位用量または１日総投与量を２回以上の投与に分けることである。
特異的な送達：本明細書中で使用される場合、「特異的な送達」、「特異的に送達」または「特異的に送達する」という用語は、オフターゲット組織（例えば、哺乳動物脾臓）と比較した場合の、関心のある標的組織（例えば、哺乳動物肝臓）へのナノ粒子による、より多くの（例えば、少なくとも１．５倍多い、少なくとも２倍多い、少なくとも３倍多い、少なくとも４倍多い、少なくとも５倍多い、少なくとも６倍多い、少なくとも７倍多い、少なくとも８倍多い、少なくとも９倍多い、少なくとも１０倍多い）ポリヌクレオチドの送達を意味する。特定の組織へのナノ粒子の送達のレベルは、ある組織の重量に対するその組織において産生されるタンパク質の量を比較するか、ある組織の重量に対するその組織中のポリヌクレオチドの量を比較するか、ある組織中の総タンパク質の量に対するその組織中で産生されるタンパク質の量を比較するか、またはある組織中の総ポリヌクレオチドの量に対するその組織中のポリヌクレオチドの量を比較することによって測定され得る。例えば、腎血管標的化のために、ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドの全身投与後に肝臓または脾臓に送達されるものと比較して組織１ｇあたり１．５、２倍、３倍、５倍、１０倍、１５倍または２０倍多いポリヌクレオチドが腎臓に送達されるとき、肝臓および脾臓と比較して哺乳動物腎臓に特異的に提供される。ナノ粒子が標的組織に特異的に送達する能力は、処置される対象において決定される必要はなく、動物モデル（例えば、ラットモデル）などの代理物において決定され得ることが理解されるであろう。
安定な：本明細書中で使用される場合、「安定な」は、反応混合物から、および有効な治療薬に処方可能ないくつかの場合において、有用な純度までの単離を乗り切るのに十分に頑強な化合物を指す。
安定化：本明細書中で使用される場合、「安定化する」、「安定化させる」、「安定化領域」という用語は、安定にされるかまたは安定になることを意味する。
立体異性体：本明細書中で使用される場合、「立体異性体」という用語は、全ての可能な異なる異性体および立体構造形態を指し、化合物（例えば、本明細書中に記載の何れかの式の化合物）は、特に全ての可能な立体化学的および立体構造的な異性体形態、基本的な分子構造の全てのジアステレオマー、エナンチオマーおよび／またはコンフォーマーを保持し得る。一部の本発明の化合物は、異なる互変異性形態で存在し得、後者は、全て本発明の範囲内に含まれる。
対象：「対象」、または「個体」、または「動物」、または「患者」、または「哺乳動物」は、診断、予後または治療が所望されるあらゆる対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象としては、ヒト、飼育動物、家畜、動物園の動物、スポーツ用の動物、ペット動物、例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、乳牛など、霊長類、例えば類人猿、サル、オランウータンおよびチンパンジーなど、イヌ科、例えばイヌおよびオオカミなど、ネコ科、例えばネコ、ライオンおよびトラなど、ウマ類、例えばウマ、ロバおよびシマウマなど、クマ、食用動物、例えばウシ、ブタおよびヒツジなど、有蹄動物、例えばシカおよびキリンなど、げっ歯類、例えばマウス、ラット、ハムスターおよびモルモットなどが挙げられるが限定されない。特定の実施形態において、哺乳動物は、ヒト対象である。他の実施形態において、対象は、ヒト患者である。特定の実施形態において、対象は、処置を必要とするヒト患者である。
実質的に：本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、関心のある特徴または特性の全体的なまたはほぼ全範囲または程度を発揮する定性的条件を指す。生物学的分野の当業者は、生物学的および化学的現象が完了に到りかつ／もしくは完全になるまで進行するか、または絶対的な結果を達成もしくは回避することが、たとえあったとしても極めて稀であることを理解されるであろう。したがって、本明細書中で使用される「実質的に」という用語は、多くの生物学的および化学的特徴に特有の完全性の潜在的欠如を表現するために用いられる。
実質的に等しい：本明細書で使用される場合、それが用量間の時間差に関するとき、この用語は、プラス／マイナス２％を意味する。
実質的に同時に：本明細書で使用される場合、それが複数回の投与に関するとき、この用語は、２秒以内を意味する。
罹患している：疾患、障害および／または状態に「罹患している」個体は、疾患、障害および／または状態の１つ以上の徴候または症状を有すると診断されているか、またはそのような症状を呈している。
罹患しやすい：疾患、障害および／または状態に「罹患しやすい」個体は、疾患、障害および／または状態の徴候または症状を有すると診断されていないか、および／または疾患、障害、および／または状態の徴候または症状を呈していないが、疾患またはその兆候または症状を発症する傾向を有する。一部の実施形態において、疾患、障害および／または状態（例えば、癌）に罹患しやすい個体は、以下の１つ以上を特徴とし得る：（１）疾患、障害および／または状態の発症に関連する遺伝子突然変異、（２）疾患、障害および／または状態の発症に関連する遺伝子多型、（３）疾患、障害および／または状態に関連するタンパク質および／または核酸の発現および／または活性の増大および／または低減、（４）疾患、障害および／または状態の発症に関連する習慣および／または生活様式、（５）疾患、障害および／または状態の家族歴、ならびに（６）疾患、障害および／または状態の発症に関連する微生物への曝露および／または感染。一部の実施形態において、疾患、障害および／または状態に罹患しやすい個体は、疾患、障害および／または状態を発症する。一部の実施形態では、疾患、障害および／または状態に罹患しやすい個体は、疾患、障害および／または状態を発症しない。
持続放出：本明細書中で使用される場合、「持続放出」という用語は、特定の時間にわたり放出速度が一定である医薬組成物または化合物放出プロフィールを指す。
合成：「合成」という用語は、人の手により生成、調製および／または製造されることを意味する。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたは他の分子の合成は、化学的または酵素的の何れでもあり得る。
標的細胞：本明細書中で使用される場合、「標的細胞」は、任意の１つ以上の関心のある細胞を指す。細胞は、インビトロ、インビボ、インシトゥまたは生物の組織もしくは臓器で見出され得る。生物は、動物、例えば哺乳動物、ヒト、対象または患者であり得る。
標的組織：本明細書中で使用される場合、「標的組織」は、ポリヌクレオチドの送達の結果、所望の生物学的および／または薬理学的効果が生じる関心のある何れかの１つ以上の組織タイプを指す。関心のある標的組織の例としては、特異的な組織、臓器および系またはその群が挙げられる。特定の適用において、標的組織は、腎臓、肺、脾臓、血管における血管内皮（例えば、冠動脈内または大腿動脈内）または腫瘍組織（例えば、腫瘍内注射を介したもの）であり得る。「オフターゲット組織」は、コードされるタンパク質の発現の結果、所望の生物学的および／または薬理学的効果を生じさせない任意の１つ以上の組織タイプを指す。特定の適用において、オフターゲット組織としては、肝臓および脾臓が挙げられ得る。
オフターゲット問題における治療薬の存在は、（ｉ）拡散を介したまたは血流を通じた投与部位から末梢組織または遠位オフターゲット組織（例えば、肝臓）へのポリヌクレオチドの漏出（例えば、特定の組織でポリペプチドを発現させることが意図されるポリヌクレオチドが肝臓に到達し、ポリペプチドが肝臓で発現される）、または（ｉｉ）拡散を介したまたは血流を通じた末梢組織または遠位オフターゲット組織（例えば、肝臓）への、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの投与後のポリペプチドの漏出（例えば、ポリヌクレオチドが標的組織でポリペプチドを発現させ、ポリペプチドが末梢組織に拡散する）の結果であり得る。
標的指向化配列：本明細書中で使用される場合、「標的指向化配列」という句は、タンパク質またはポリペプチドの輸送または局在化を指示し得る配列を指す。
末端：本明細書中で使用される場合、１つまたは複数の「末端」という用語は、ポリペプチドに言及する場合、ペプチドまたはポリペプチドの端部を指す。このような端部は、ペプチドまたはポリペプチドの最初または最後の部位のみに限定されず、末端領域のさらなるアミノ酸を含み得る。本発明のポリペプチドに基づく分子は、Ｎ末端（遊離アミノ基（ＮＨ２）があるアミノ酸が最後にある）およびＣ末端（遊離カルボキシル基（ＣＯＯＨ）があるアミノ酸が最後にある）の両方を有することを特徴とし得る。本発明のタンパク質は、一部の場合、ジスルフィド結合によりまたは非共有力により一緒にされる複数のポリペプチド鎖で構成される（マルチマー、オリゴマー）。これらの種類のタンパク質は、複数のＮおよびＣ末端を有し得る。あるいは、ポリペプチドの末端は、該当し得る場合、有機複合物などの非ポリペプチドに基づく部分によってそれらが開始または終結するように修飾され得る。
治療薬：「治療薬」という用語は、対象に投与された場合、治療、診断および／もしくは予防効果を有し、かつ／または所望の生物学的および／もしくは薬理効果を誘発する薬剤を指す。例えば、いくつかの実施形態において、リラキシンポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、治療薬であり得る。他の実施形態において、治療薬は、治療用タンパク質であり得る。
治療的有効量：本明細書中で使用される場合、「治療的有効量」という用語は、感染、疾患、障害および／もしくは状態に罹患しているか、または罹患しやすい対象に投与される場合、感染、疾患、障害および／または状態の徴候または症状を処置し、改善し、感染、疾患、障害および／または状態の発症を診断し、予防し、かつ／または遅延させるのに十分である、送達しようとする薬剤（例えば、核酸、薬物、治療薬、診断薬、予防薬など）の量を意味する。
治療的に有効な成果：本明細書中で使用される場合、「治療的に有効な成果」という用語は、感染、疾患、障害および／もしくは状態に罹患しているか、または罹患しやすい対象において、感染、疾患、障害および／または状態の徴候または症状を処置し、改善し、感染、疾患、障害および／または状態の発症を診断し、予防し、かつ／または遅延させるのに十分な成果を意味する。
１日総投与量：本明細書中で使用される場合、「１日総投与量」は、２４時間内に投与または処方される量である。１日総投与量は、単回単位用量または分割用量として投与され得る。
転写因子：本明細書中で使用される場合、「転写因子」という用語は、例えば、転写の活性化または抑制により、ＤＮＡからＲＮＡへの転写を制御するＤＮＡ結合タンパク質を指す。一部の転写因子は、転写制御のみをもたらし、他の因子は、他のタンパク質と協同して作用する。一部の転写因子は、特定の条件下で転写の活性化および抑制の両方を行い得る。一般に、転写因子は、標的遺伝子の制御領域において、特異的なコンセンサス配列と非常によく類似した１つまたは複数の特異的な標的配列と結合する。転写因子は、標的遺伝子のみまたは他の分子との複合体における標的遺伝子の転写を調節し得る。
転写：本明細書中で使用される場合、「転写」という用語は、ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ鋳型または配列）からｍＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ配列または鋳型）を生成させる方法を指す。
トランスフェクション：本明細書中で使用される場合、「トランスフェクション」は、細胞へのポリヌクレオチドの導入を指し、そこで、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが発現される（例えば、ｍＲＮＡ）か、またはポリペプチドが細胞機能を調整する（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）。本明細書中で使用される場合、核酸配列の「発現」は、ポリペプチドまたはタンパク質へのポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の翻訳および／またはポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾を指す。
処置する、処置、治療：本明細書中で使用される場合、「処置する」、「処置」または「治療」という用語は、疾患の１つ以上の徴候または症状または特性の部分的または完全な軽減、緩和、改善、解放、発症遅延、進行阻害、重症度軽減および／または発症率低下を指す。例えば、心疾患を「処置する」は、疾患に関連する徴候または症状を軽減し、患者の寿命を延長させ（生存率を上昇させ）、疾患の重症度を軽減し、疾患発症を防ぐかまたは遅延させることなどを指し得る。疾患、障害および／もしくは状態の徴候を示さない対象に、かつ／または疾患、障害および／もしくは状態に関連する病態を進行させるリスクを低下させるために疾患、障害および／もしくは状態の早期の徴候のみを示す対象に処
置を行い得る。
未修飾：本明細書中で使用される場合、「未修飾」は、ある方法で変化させられる前のあらゆる物質、化合物または分子を指す。未修飾は、常にではないが、生体分子の野生型またはネイティブ型を指し得る。分子に対して、一連の修飾が行われ得、それにより各修飾分子が続く修飾に対する「未修飾」出発分子となり得る。
ウラシル：ウラシルは、ＲＮＡの核酸における４種類の核酸塩基の１つであり、Ｕという文字により表される。ウラシルは、ヌクレオシドウリジンを生じさせるためにβ－Ｎ１－グリコシド結合を介してリボース環またはより具体的にはリボフラノースに連結され得る。ヌクレオシドウリジンはまた、その核酸塩基の１文字コード、すなわちＵによって一般的に略される。したがって、本開示との関連で、ポリヌクレオチド配列中のモノマーがＵである場合、このようなＵは、「ウラシル」または「ウリジン」として交換可能に名付けられる。
ウリジン含量：「ウリジン含量」または「ウラシル含量」という用語は、交換可能であり、特定の核酸配列中に存在するウラシルまたはウリジンの量を指す。ウリジン含量またはウラシル含量は、絶対値（配列中のウリジンまたはウラシルの総数）または相対値（核酸配列中の核酸塩基の総数に対する存在するウリジンまたはウラシルパーセンテージ）として表され得る。
ウリジン修飾配列：「ウリジン修飾配列」という用語は、異なる全体的もしくは局所的なウリジン含量（より高いかもしくはより低いウリジン含量）を有するか、または候補核酸配列のウリジン含量および／もしくはウリジンパターンに対して異なるウリジンパターン（例えば、勾配分布もしくはクラスター形成）を有する配列最適化核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ配列）を指す。本開示の含量において、「ウリジン修飾配列」および「ウラシル修飾配列」という用語は、均等であり、交換可能とみなされる。
「高ウリジンコドン」は、２または３つのウリジンを含むコドンとして定義され、「低ウリジンコドン」は、１つのウリジンを含むコドンとして定義され、「ウリジンなしコドン」は、ウリジンが全くないコドンである。いくつかの実施形態において、ウリジン修飾配列は、低ウリジンコドンでの高ウリジンコドンの置換、ウリジンなしコドンでの高ウリジンコドンの置換、高ウリジンコドンでの低ウリジンコドンの置換、ウリジンなしコドンでの低ウリジンコドンの置換、低ウリジンコドンでのウリジンなしコドンの置換、高ウリジンコドンでのウリジンなしコドンの置換およびそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、高ウリジンコドンは、別の高ウリジンコドンで置き換えられ得る。いくつかの実施形態において、低ウリジンコドンは、別の低ウリジンコドンで置き換えられ得る。いくつかの実施形態において、ウリジンなしコドンは、別のウリジンなしコドンで置き換えられ得る。ウリジン修飾配列は、ウリジン富化またはウリジン希薄化であり得る。
ウリジン富化：本明細書中で使用される場合、「ウリジン富化」という用語および文法的な変形物は、対応する候補核酸配列のウリジン含量に対する配列最適化核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ配列）中のウリジン含量（絶対値でまたはパーセンテージ値として表される）の上昇を指す。ウリジン富化は、候補核酸配列中のコドンを、含有するウリジン核酸塩基がより少ない同義コドンで置換することにより実行され得る。ウリジン富化は、網羅的（すなわち候補核酸配列の全長に対する）または局所的（すなわち候補核酸配列のサブ配列または領域に対する）であり得る。
ウリジン希薄化：本明細書中で使用される場合、「ウリジン希薄化」という用語および
文法的な変形物は、対応する候補核酸配列のウリジン含量に対する配列最適化核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ配列）中のウリジン含量（絶対値でまたはパーセンテージ値として表される）の低下を指す。ウリジン希薄化は、候補核酸配列中のコドンを、含有するウリジン核酸塩基がより少ない同義コドンで置換することにより実行され得る。ウリジン希薄化は、網羅的（すなわち候補核酸配列の全長に対する）または局所的（すなわち候補核酸配列のサブ配列または領域に対する）であり得る。
変異体：本開示中で使用される場合の変異体という用語は、ネイティブまたは出発配列（例えば、野生型配列）中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去されており、異なるアミノ酸が同じ位置でその代わりに挿入されている天然変異体（例えば、多型、アイソフォームなど）および人工的変異体の両方を指す。これらの変異体は、「置換変異体」と言われ得る。置換は、単一であり得、分子中の１つのアミノ酸のみが置換されているか、またはそれらが複数であり得、２つ以上のアミノ酸が同じ分子中で置換されているものであり得る。アミノ酸が挿入されるかまたは欠失している場合、得られる変異体は、それぞれ「挿入変異体」または「欠失変異体」である。
均等物および範囲
当業者は、通常の実験のみを用いて、本明細書中に記載の本発明による具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識または確認し得るであろう。本発明の範囲は、以上の記載に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲に記載のとおりである。
特許請求の範囲において、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」などの冠詞は、反対の意味が記載されているかまたは文脈から別段の解釈が明らかとならない限り、１つまたは２つ以上を意味し得る。群の１つ以上のメンバー間に「または」を含む請求項または記載は、反対の意味が記載されているかまたは文脈から別段の解釈が明らかとならない限り、その群のメンバーの１つ、２つ以上または全てがある製品また工程に存在するか、それで使用されるか、またはそうでなければそれに関連している場合に満たされるとみなされる。本発明は、その群のメンバーの厳密に１つがある製品または工程に存在するか、それで使用されるか、またはそうでなければそれに関連している実施形態を包含する。本発明は、その群のメンバーの２つ以上または全てがある製品または工程に存在するか、使用されるか、またはそうでなければそれに関連している実施形態を含む。
また、「含む」という用語は、非限定的であるものとし、さらなる要素またはステップの包含を可能にするが、それが必要なわけではない。したがって、「含む」という用語が本明細書中で使用される場合、「から構成される」という用語も包含および開示される。
範囲が与えられている場合、終点の値も含まれる。さらに、別段の指示がない限りまたは文脈および当業者の理解から別段の解釈が明らかとならない限り、範囲として表される値は、本発明の様々な実施形態において記載される範囲内の任意の具体的な値またはサブ範囲を、文脈からの明らかな別段の指示がない限り、この範囲の下限の単位の１／１０まで想定し得ることを理解されたい。
さらに、先行技術内に含まれる本発明の任意の特定の実施形態は、請求項の何れか１つ以上から明示的に除外され得ることを理解されたい。このような実施形態は、当業者にとって公知であるとみなされるため、その排除が本明細書に明示的に記載されていない場合でも、これらは除外され得る。本発明の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、何れかの核酸またはそれによりコードされるタンパク質、何れかの作製方法、何れかの使用方法など）は、あらゆる理由のために、先行技術の存在に関連するか否かにかかわらず、何れか１つ以上の請求項から除外され得る。
引用する全てのソース、例えば本明細書で引用される参考文献、刊行物、データベース、データベースエントリおよび技術は、引用の際に明示されていなくても参照により本明細書に組み込まれる。引用されるソースおよび本願の記載に矛盾が生じる場合、本願の記載が優先されるものとする。
セクションおよび表の見出しは、限定を意図するものではない。
実施例１：ポリヌクレオチドの作製
本開示によれば、ポリヌクレオチドおよびまたはその一部もしくは領域の作製は、その内容がその全体において参照により本明細書中に組み込まれる「Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ」という名称の国際公開第２０１４／１５２０２７号パンフレットで教示される方法を利用して達成され得る。
精製方法としては、それぞれがその全体において参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第２０１４／１５２０３０号パンフレットおよび同第２０１４／１５２０３１号パンフレットで教示されるものが挙げられ得る。
本ポリヌクレオチドの検出および特徴を調べる方法は、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第２０１４／１４４０３９号パンフレットで教示されるように行われ得る。
本開示のポリヌクレオチドの特徴評価は、ポリヌクレオチドマッピング、逆転写酵素シーケンシング、電荷分布分析およびＲＮＡ不純物検出からなる群から選択される手順を使用して達成され得、特徴評価は、ＲＮＡ転写物配列の決定、ＲＮＡ転写物純度の決定またはＲＮＡ転写物の電荷不均質性の決定を含む。このような方法は、例えば、それぞれの内容がその全体において参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第２０１４／１４４７１１号パンフレットおよび同第２０１４／１４４７６７号パンフレットで教示される。
実施例２：キメラポリヌクレオチド合成
導入
本開示によれば、三リン酸化学を使用してキメラポリヌクレオチドの２つの領域または部分を連結またはライゲーションし得る。
この方法によれば、５’一リン酸塩および末端３’ｄｅｓＯＨまたはブロックドＯＨを用いて１００ヌクレオチド以下の第１の領域または部分を化学的に合成する。領域が８０ヌクレオチドより長い場合、これは、ライゲーションのための２本の鎖として合成し得る。
第１の領域または部分がインビトロ転写（ＩＶＴ）を使用して非位置的修飾領域または部分として合成される場合、５’一リン酸塩の変換とその後の３’末端キャップ付加とが続き得る。
一リン酸塩保護基は、当技術分野で公知のものの何れかから選択され得る。
化学合成またはＩＶＴ法の何れかを使用してキメラポリヌクレオチドの第２の領域または第２の部分を合成し得る。ＩＶＴ法は、修飾キャップとともにプライマーを利用し得るＲＮＡポリメラーゼを含み得る。あるいは、最長１３０ヌクレオチドのキャップを化学的
に合成し、ＩＶＴ領域または部分にカップリングさせ得る。
ライゲーション法について、ＤＮＡ Ｔ４リガーゼでのライゲーションとそれに続くＤＮＡｓｅでの処理とにより、コンカテマー形成が容易に回避されるはずであることに留意されたい。
キメラポリヌクレオチド全体がリン酸－糖骨格とともに作製される必要はない。領域または部分の１つがポリペプチドをコードする場合、このような領域または部分がリン酸－糖骨格を含むことが好ましい。
次に、任意の公知のクリックケミストリー、オルトクリックケミストリー、ソルリンクまたは当業者にとって公知の他のバイオコンジュゲート化学を使用してライゲーションを行う。
合成経路
キメラポリヌクレオチドは、一連の出発セグメントを使用して作製される。このようなセグメントとしては、次のものが挙げられる：
（ａ）正常な３’ＯＨを含むキャップ付加および保護された５’セグメント（ＳＥＧ．１）
（ｂ）ポリペプチドのコード領域を含み得、正常な３’ＯＨを含む５’三リン酸セグメント（ＳＥＧ．２）
（ｃ）コーディセピンを含むかまたは３’ＯＨを含まないキメラポリヌクレオチドの３’末端（例えば、テール）に対する５’一リン酸セグメント（ＳＥＧ．３）。
合成（化学的またはＩＶＴ）後、セグメント３（ＳＥＧ．３）をコーディセピンで処理し、次いでピロホスファターゼで処理して５’一リン酸を生成させる。
次に、ＲＮＡリガーゼを使用してセグメント２（ＳＥＧ．２）をＳＥＧ．３にライゲーションする。次に、ライゲーションしたポリヌクレオチドを精製し、ピロホスファターゼで処理して、二リン酸エステルを切断する。次に、処理したＳＥＧ．２－ＳＥＧ．３コンストラクトを精製し、ＳＥＧ．１を５’末端にライゲーションする。キメラポリヌクレオチドのさらなる精製ステップを行い得る。
キメラポリヌクレオチドがポリペプチドをコードする場合、ライゲーションされたかまたは連結されたセグメントは、５’ＵＴＲ（ＳＥＧ．１）、オープンリーディングフレームまたはＯＲＦ（ＳＥＧ．２）および３’ＵＴＲ＋ポリＡ（ＳＥＧ．３）として表され得る。
各ステップの収率は、９０～９５％程度となり得る。
実施例３：ｃＤＮＡ産生のためのＰＣＲ
ｃＤＮＡの調製のためのＰＣＲ手段は、Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）によって２ｘＫＡＰＡ ＨＩＦＩ（商標）ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘを使用して行われる。この系は、２ｘＫＡＰＡ ＲｅａｄｙＭｉｘ１２．５μＬ；フォワードプライマー（１０μＭ）０．７５μＬ；リバースプライマー（１０μＭ）０．７５μＬ；鋳型ｃＤＮＡ約１００ｎｇを含み、ｄＨ２Ｏで２５．０μＬに希釈する。反応条件は、９５℃で５分間および９８℃で２０秒、次いで５８℃で１５秒、次いで７２℃で４５秒を２５サイクル、次に７２℃で５分間、その後、最後まで４℃である。
製造者の説明書に従い、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＰＣＲ Ｍ
ｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して反応物をクリーンアップする（最大５μｇ）。反応物が多いほど、大容量の製品を使用したクリーンアップが必要である。クリーンアップ後、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）を使用してｃＤＮＡを定量し、アガロースゲル電気泳動によって分析して、ｃＤＮＡが予想サイズであることを確認する。次に、インビトロ転写反応に進める前にｃＤＮＡをシーケンシング分析に提出する。
実施例４：インビトロ転写（ＩＶＴ）
インビトロ転写反応により、均一に修飾されたポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドが生成する。このような均一に修飾されたポリヌクレオチドは、本開示のポリヌクレオチドの領域または部分を含み得る。投入するヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）ミックスは天然および非天然ＮＴＰを使用して社内で作製する。
典型的なインビトロ転写反応は、次のもの：
１．鋳型ｃＤＮＡ １．０μｇ
２．１０ｘ転写緩衝液（４００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１９０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭスペルミジン）２．０μＬ
３．カスタムＮＴＰ（各２５ｍＭ）７．２μＬ
４．ＲＮａｓｅ阻害剤 ２０Ｕ
５．Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ ３０００Ｕ
６．ｄＨ２Ｏ ２０．０μＬまで
を含み、７．３７℃で３時間～５時間温置する。
粗製ＩＶＴミックスを翌日のクリーンアップのために４℃で一晩保管し得る。次に、１ＵのＲＮａｓｅ不含ＤＮａｓｅを使用して元の鋳型を消化する。３７℃で１５分間温置後、製造者の説明書に従い、ＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）キット（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を使用してｍＲＮＡを精製する。このキットは、５００μｇまでのＲＮＡを精製し得る。クリーンアップ後、ＮａｎｏＤｒｏｐを使用してＲＮＡを定量し、アガロースゲル電気泳動により分析し、ＲＮＡが適正なサイズであることおよびＲＮＡ分解が起こっていないことを確認する。
実施例５：酵素によるキャップ付加
ポリヌクレオチドのキャップ付加は、次のように行い、混合物にはＩＶＴ ＲＮＡ６０μｇ～１８０μｇおよびｄＨ２Ｏ最大７２μＬが含まれる。この混合物を６５℃で５分間温置して、ＲＮＡを変性させ、次いで直ちに氷に移す。
このプロトコールは、１０ｘキャップ付加緩衝液（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭ ＫＣｌ、１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）（１０．０μＬ）；２０ｍＭ
ＧＴＰ（５．０μＬ）；２０ｍＭ Ｓ－アデノシルメチオニン（２．５μＬ）；ＲＮａｓｅ阻害剤（１００Ｕ）；２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（４００Ｕ）；ワクシニアキャップ付加酵素（グアニリルトランスフェラーゼ）（４０Ｕ）；ｄＨ２Ｏ（２８μＬまで）の混合；および３７℃で６０μｇ ＲＮＡの場合には３０分間または１８０μｇのＲＮＡの場合には２時間の温置を含む。
次に、製造者の説明書に従い、ＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）Ｋｉｔ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を使用してポリヌクレオチドを精製する。クリーンアップ後、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用してＲＮＡを定量し、アガロースゲル電気泳動により分析して、ＲＮＡが適正なサイズであることおよびＲＮＡ分解が起こっていないことを確認する。逆転写－ＰＣＲを行ってシーケンシングのためにｃＤＮＡを生成させることにより、ＲＮＡ産物もシーケンシングし得る。
実施例６：ポリＡテール付加反応
ｃＤＮＡ中にポリ－Ｔがない場合、最終産物をクリーニングする前にポリＡテール付加反応を行わなければならない。これは、キャップ付加ＩＶＴ ＲＮＡ（１００μＬ）；ＲＮａｓｅ阻害剤（２０Ｕ）；１０ｘテール付加緩衝液（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２）（１２．０μＬ）；２０ｍＭ ＡＴＰ（６．０μＬ）；ポリＡポリメラーゼ（２０Ｕ）；ｄＨ２Ｏ １２３．５μＬまでを混合し、３７℃で３０分間温置することによって行われる。ポリＡテールが既に転写物にある場合、テール付加反応を省略し、ＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）キット（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）でのクリーンアップに直接進み得る（５００μｇまで）。ポリＡポリメラーゼは、好ましくは、酵母において発現された組み換え酵素である。
ポリＡテール付加反応の処理能力または完全性は、必ずしも正確なサイズのポリＡテールを生じさせ得るわけではないことを理解すべきである。したがって、およそ４０～２００ヌクレオチド、例えば約４０、５０、６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１５０～１６５、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４または１６５ヌクレオチドのポリＡテールは、本発明の範囲内である。
実施例７：天然５’キャップおよび５’キャップ類似体
次の化学ＲＮＡキャップ類似体を使用してインビトロ－転写反応中に同時にポリヌクレオチドの５’－キャップ付加を達成して、製造者のプロトコールに従って５’－グアノシンキャップ構造を生成させ得る：３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ［ＡＲＣＡキャップ］；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。ワクシニアウイルスキャップ付加酵素を使用して転写後に修飾ＲＮＡの５’－キャップ付加を完了し、「キャップ０」構造を生成させ得る：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。ワクシニアウイルスキャップ付加酵素および２’－Ｏメチル－トランスフェラーゼの両方を使用してキャップ１構造を生成させ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ－２’－Ｏ－メチルを生成させ得る。キャップ１構造からキャップ２構造を生成させ、続いて２’－Ｏメチル－トランスフェラーゼを使用して５’末端から３番目のヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル化を行い得る。キャップ２構造からキャップ３構造を生成させ、続いて２’－Ｏメチル－トランスフェラーゼを用いて５’末端から４番目のヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル化を行い得る。酵素は、好ましくは、組み換えソース由来である。
哺乳動物細胞にトランスフェクションされる場合、修飾ｍＲＮＡの安定性は、１２～１８時間または１８時間超であり、例えば２４、３６、４８、６０、７２時間または７２時間超である。
実施例８：キャップ付加アッセイ
Ａ．タンパク質発現アッセイ
本明細書中で教示されるキャップの何れかを含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを等濃度で細胞にトランスフェクションし得る。トランスフェクションから６、１２、２４および３６時間後、培地に分泌されるタンパク質の量をＥＬＩＳＡによってアッセイし得る。培地中により高いタンパク質レベルを分泌させる合成ポリヌクレオチドは、より高い翻訳能があるキャップ構造がある合成ポリヌクレオチドに対応する。
Ｂ．純度分析合成
変性アガロース尿素ゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析を使用して、本明細書中で教示されるキャップの何れかを含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを純度について比較し得る。電気泳動による１本の固定されたバンドがあるポリヌクレオチドは、複数のバンドまたは引きずったバンドがあるポリヌクレオチドと比較してより高い純度の産物に対応する。単一ＨＰＬＣピークがある合成ポリヌクレオチドもより高い純度の産物に対応する。より高い効率でのキャップ付加反応により、より高純度のポリヌクレオチド集団がもたらされ得る。
Ｃ．サイトカイン分析
本明細書中で教示されるキャップの何れかを含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを複数濃度で細胞にトランスフェクションし得る。トランスフェクションから６、１２、２４および３６時間後、培地に分泌されるＴＮＦ－アルファおよびＩＦＮ－ベータなどの炎症促進性サイトカインの量をＥＬＩＳＡによってアッセイし得る。培地へのより高レベルの炎症促進性サイトカインの分泌を引き起こすポリヌクレオチドは、免疫を活性化するキャップ構造を含有するポリヌクレオチドに対応する。
Ｄ．キャップ付加反応効率
ヌクレアーゼ処理後、ＬＣ－ＭＳにより、本明細書中で教示されるキャップの何れかを含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをキャップ付加反応効率について分析し得る。キャプ付きポリヌクレオチドのヌクレアーゼ処理により、ＬＣ－ＭＳにより検出可能な遊離ヌクレオチドおよびキャップ付加５’－５－三リン酸キャップ構造の混合物が生じる。ＬＣ－ＭＳスペクトルにおけるキャップ付き生成物の量は、反応からの総ポリヌクレオチドのパーセントとして表され得、キャップ付加反応効率に対応する。キャップ付加反応効率がより高いキャップ構造は、ＬＣ－ＭＳにより、より多量のキャップ付き産物を有する。
実施例９：修飾ＲＮＡまたはＲＴ ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動
個々のポリヌクレオチド（２０μＬ体積中２００～４００ｎｇ）または逆転写ＰＣＲ産物（２００～４００ｎｇ）を非変性１．２％アガロースＥ－Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）上のウェルに載せ、製造者のプロトコールに従って１２～１５分間泳動を行う。
実施例１０：Ｎａｎｏｄｒｏｐ修飾ＲＮＡ定量およびＵＶスペクトルデータ
化学合成またはインビトロ転写反応からの各ポリヌクレオチドの収率を定量するために、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＵＶ吸収読み取りに対してＴＥ緩衝液中の修飾ポリヌクレオチド（１μＬ）を使用する。
実施例１１：リピドイドを用いた修飾ｍＲＮＡの処方
細胞への付加前に設定した比率でリピドイドとポリヌクレオチドとを混合することにより、インビトロ実験のためにポリヌクレオチドを処方する。インビボ処方は、全身の循環を促進するためのさらなる成分の付加を必要とし得る。これらのリピドイドがインビボ実験に適切な粒子を形成させる能力を試験するために、出発点としてｓｉＲＮＡ－リピドイド処方物に対して使用される標準的な処方工程を使用し得る。粒子の形成後、ポリヌクレオチドを添加し、複合体と統合可能であるようにする。標準的な色素排除アッセイを使用して封入効率を決定する。
実施例１２：機能的リラキシンタンパク質のリラキシンｍＲＮＡ産生
実施例１～１１に記載のようにリラキシンｍＲＮＡ変異体を合成したが、血中の半減期がより長いコンストラクトを作製することが目標である。野生型リラキシンは、２つのペプチド：Ａ鎖およびＢ鎖からなり、５３のアミノ酸を含有する。ヒト血清アルブミン、１
０８のアミノ酸を標的とするヒト免疫グロブリンＩｇＧの可変軽鎖分画（カッパ）（ＶＬｋ）を合成し、野生型リラキシンのＡ鎖に付加した（図１）。
ＥＸＰ１２９３ｆ細胞における３つの独立したトランスフェクション実験およびＲＸＦＰ１－発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞におけるｃＡＭＰアッセイを行った（図２）。活性アッセイのインビトロの証拠から、ＶＬｋ－ｈＲＬＮ２ ｍＲＮＡが機能的リラキシンタンパク質を産生させることが明らかになった。興味深いことに、野生型リラキシンと比較して、インビトロでＶＬｋ融合タンパク質の活性がより低い（およそ５０％）ことが分かった。試験した全てのｍＲＮＡが同様に特異的な活性を有するＶＬｋ－ｈＲＬＮ２タンパク質を生じさせた。
ＶＬｋ－ｈＲＬＮ２融合タンパク質も、マウスでのインビボ恥骨間靭帯伸長（ＩＬＥ）アッセイにおいて機能タンパク質を生成させることが示された。エストラジオール刺激ＣＤ１雌マウスにＶＬｋ－ｈＲＬＮ２融合タンパク質の単回ＩＶボーラス（０．５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。２４時間後、マウスを解剖し、恥骨間靭帯を測定した。図６で示されるように、恥骨間靭帯測定は、陰性対照群と比較して、試験した変異体全てにおいて顕著に高かった。
実施例１３：リラキシンｍＲＮＡインビボ実験：自然発症高血圧ラット
自然発症高血圧ラットを使用してインビボでのＶＬｋ－ｈＲＬＮ２コンストラクトの効果を試験した。最初にラットに遠隔測定装置を埋め込んだ。ベースライン循環リラキシンレベルを決定するために血液を回収した。試験時間全体にわたり、心拍および血圧を連続的に監視した（収縮期および拡張期動脈血圧を１０分毎に１０秒間測定した）。ラットを４つの群（Ｎ＝ラット８匹／群）に分けた：ｍｏ５Ｕ－コンストラクト１、ｍｏ５Ｕ－野生型、ｍ１ΨＬｕｃおよびｒｈＲＬＮ２。最初の３つの群には７日間あけて３回のＩＶ点滴を行った。ｒｈＲＬＮ２の第４の群には皮下ポンプ留置を行い、固定速度で１４日間の点滴期間にわたりｒｈＲＬＮ２を投与した。点滴前に全ラットから血液を回収し、次いで点滴後６時間、１２時間、１日、２日、４日および６日に回収した（ＩＶ群の場合、次の「プレ」用量測定は、第７日であり、ＩＶ用量投与前であった）。
ＩＶ注射を行った自然発症高血圧ラットにおいて、ＶＬｋ－ｈＲＬＮ２ ｍＲＮＡが、活性が持続する機能タンパク質を産生させることが示された。図３Ａで示される心拍データから、リラキシンＶＬｋ融合タンパク質は、インビボで野生型リラキシンと比較して作用が弱かったことが示される。示されるデータは、動物の操作時間を除いて昼間および夜間毎に平均をとる（平均＋／－ＳＤ）（Ｎ＝ラット８匹／群）。心拍データは、ラットにおいてトラフ（昼間）とピーク（夜間）との間で変動する。拡張期動脈圧データ（図３Ｂ）からも、ＶＬｋ融合タンパク質がインビボで活性を持続させたことが明らかになった。作用がより弱いにもかかわらず、半減期がより長いことにより、活性化合物に対して治療効果をもたらし得る。
自然発症高血圧ラット中の循環リラキシンタンパク質レベルも測定した（図４）。ＷＫＹラットには、化合物１８含有ナノ粒子中のＶＬｋ融合タンパク質をコードするＲＮＡ、コンストラクト１（配列番号５）の単回ボーラス、０．５ｍｇ／ｋｇ注射を行った。血漿試料においてヒトＲＬＮ２タンパク質ＥＬＩＳＡを行い、ラットモデルにおいてＶＬｋ融合タンパク質血中レベルが野生型リラキシンよりも高いことが分かった（図７）。
実施例１４：リラキシンｍＲＮＡインビボ実験：カニクイザル
カニクイザルにおけるリラキシンの循環タンパク質レベルも調べた。ＩＶ点滴または皮下注射を使用して２群のカニクイザル（Ｎ＝未処理雄サル５匹／群）を試験した。ＩＶ群には、４週間にわたり隔週において、１時間の点滴で化合物１８含有脂質ナノ粒子中の０
．５ｍｇ／ｋｇのリラキシン－２ ｍＲＮＡ（ＶＬｋ融合タンパク質、コンストラクト１、配列番号１のＲＮＡ）を与えた。５ｍＬ／ｋｇの体積に対して０．１ｍｇ／ｍＬの用量濃度。皮下群には、コルチコステロイドとともに同時処方された化合物１８含有脂質ナノ粒子中のリラキシン２ ｍＲＮＡ（ＶＬｋ融合タンパク質、配列番号１のＲＮＡ）を与えた。用量体積は、０．５ｍＬ／ｋｇであり、用量濃度は、１．０ｍｇ／ｍＬであった。
リラキシンの循環レベルは、点滴後最長６日間にわたり、ＩＶ注射カニクイザルにおける標的濃度を上回ることが分かった（図５）。第１４日に全ての対象でベースラインに戻ったことに留意されたい。しかし、再投与によって低いタンパク質薬物動態が生じることが示された（図９）。
さらなる試験において、カニクイザルにおける２つの異なる脂質ナノ粒子処方物を用いた反復ＩＶ投与の効果も調べた。この実験において、２つの異なる脂質ナノ粒子中で配列番号１のＲＮＡを処方した：１つは、化合物１８を含有し、他方は、化合物４０３を含有した。対象に０．５ｍｇ／ｋｇの何れかの処方物を４週間にわたり隔週で与えた。次に、ヒトリラキシン－２ ＥＬＩＳＡを使用して血漿試料をアッセイし、結果を図１０で示す。さらに、上記の試験からの血漿を使用してｂＤＮＡアッセイにより明らかになるように、配列番号５のＲＮＡの循環ｍＲＮＡレベルが１回目、２回目および３回目の投与で同様であることが分かった（図１１）。
実施例１５：リラキシンｍＲＮＡインビボ実験：マウス
マウスに対して（配列番号２のＶＬｋ融合タンパク質をコードする）リラキシン－２ ｍＲＮＡをＩＶ注射し、点滴後の異なる時間点で循環リラキシンの濃度を測定した。リラキシン－２ ｍＲＮＡ（ＶＬｋ融合タンパク質、コンストラクト１）は、最長８日間にわたり、標的濃度を上回るリラキシンの濃度を発現させることが分かった（図８）。
配列
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具体的な実施形態の先行する記載は、他者が、当技術分野の技術内の知識を適用することにより、本発明の全般的な概念から逸脱することなく、不要な実験なしでこのような具体的な実施形態などの様々な適用のために容易に改変しかつ／または適合させ得る本発明の全般的な性質を完全に明らかにする。したがって、このような適合形態および改変形態は、本明細書中で与えられる教示および指針に基づき、開示される実施形態の均等物の意
味および範囲内にあるものとする。本明細書中の用語または用語法は、説明を目的とするものであり、限定ではなく、本願の用語法または用語は、本教示および指針に照らして当業者により解釈されるべきであることを理解されたい。本発明の広がりおよび範囲は、上記の代表的な実施形態の何れによっても限定されるべきものではなく、以下の特許請求の範囲およびそれらの均等物によってのみ定められるべきものである。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾が生じた場合、定義を含めて本明細書が優先する。

Claims (12)

  1. 配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であって、前記ＯＲＦは配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、ｍＲＮＡ。
  2. 前記ＯＲＦは、配列番号５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載のｍＲＮＡ。
  3. 前記ＯＲＦは、配列番号５に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する、請求項１に記載のｍＲＮＡ。
  4. 前記ＯＲＦは、配列番号５に１００％同一である、請求項１に記載のｍＲＮＡ。
  5. 前記ｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学的修飾を含む、請求項１～４の何れか一項に記載のｍＲＮＡ。
  6. 前記化学的修飾は、シュードウリジン、１－メチルシュードウリジン、１－エチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジンおよび２’－Ｏ－メチルウリジンから選択される、請求項５に記載のｍＲＮＡ。
  7. 前記化学的修飾は、Ｎ１－メチルシュードウリジンである、請求項５に記載のｍＲＮＡ。
  8. 前記ｍＲＮＡは、Ｃａｐ１である５’末端キャップを含む、請求項１～７の何れか一項に記載のｍＲＮＡ。
  9. 前記ｍＲＮＡは、８０～１２０残基長のポリＡテールを含む、請求項１～８の何れか一項に記載のｍＲＮＡ。
  10. 請求項１～９の何れか一項に記載のｍＲＮＡを含む医薬組成物。
  11. 脂質ナノ粒子として製剤化される、請求項１０に記載の医薬組成物。
  12. 心不全を治療する方法において使用するための、請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
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