DE60128540T2 - Verwendung von relaxin zur behandlung von durch gefässverengung bedingten erkrankungen - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft das Gebiet jener Erkrankungen, die mit Gefäßverengung in Zusammenhang stehen, und insbesondere die Verwendung von Relaxin zur Behandlung von Erkrankungen, die mit Gefäßverengung in Zusammenhang stehen.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Gefäßverengung, oder die Verringerung der Querschnittsfläche des Lumens kleiner Blutgefäße, ist ein potentiell tödlicher Zustand, der bei einer Reihe von Pathologien auftritt und entweder auf Vasospasmus, unzureichende Gefäßerweiterung, Verdickung der Gefäßwand oder auf die Ansammlung von den Durchfluss einschränkendem Material an der Innenwandoberfläche oder innerhalb der Wand selbst zurückzuführen ist. Gefäßverengung ist ein bedeutender Faktor bei verschiedenen hypertonischen Gefäßerkrankungen, sowie bei Leiden, die auf solche Erkrankungen zurückgehen, unter anderem etwa progressive allgemeine Atherogenese, Myokardinfarkt, Schlaganfall, Hypertonie, Glaukom, Migraine, Ischämie und Diabetes mellitus.
  • Hyptertonie, die durch Nierenerkrankungen ausgelöst wird, ist im Allgemeinen entweder das Resultat einer Veränderung des Natrium- und Flüssigkeits-Haushalts der Nieren, die zu einer Volumenvergrößerung oder einer Veränderung der Nierensekretion vasoaktiver Materialien führt, was zu einer systemischen oder lokalen Veränderung des Ateriolentonus führt. Die Hauptunterteilungen von renaler Hypertonie sind renovaskuläre Hypertonie und parenchymale Nierenhypertonie.
  • Hypertonische Gefäßerkrankungen werden im Moment mit Arzneimitteln, wie z.B. Diuretika; antiadrenergische Mittel; Vasodilatatoren; Calciumeintritts-Blockern; Hemmern von angiotensinumwandelndem Enzym ("angiotensin converting enzyme", ACE) (ACE-Hemmer); Angiotensin-Rezeptor-Antagonisten; sowie Wachstumsfaktoren behandelt.
  • Das Ausmaß der ischämischen myokardialen Verletzung, die durch Koronargefäß-Okklusion entsteht, kann durch die Bereitstellung eines kollateralen Blutflusses zum Myokard und den Subendokardschichten des Herzens gemildert werden. Charney et al., Am. Heart J. 126, 937-945 (1993). Im Moment ist die therapeutische Angiogenese auf die Förderung der Entwicklung supplementärer kollateraler Zellen als Mittel zum Erhalt der Herzfunktion nach einem ischämischen Vorfall ausgerichtet. Losordo et al., Circulation 98, 2800-2804 (1998); Patel et al., Human Gene Therapy 10, 1331-1348 (1999); und Henry, British Med. J. 318, 1536-1539 (1999). Von der kollateralen Gefäßbildung und dem erhöhten Blutfluss aufgrund von Gefäßneubildung und Gefäßerweiterung von sowohl neuen als auch bereits bestehenden Blutgefäßen wurde gezeigt, dass sie gewisse Aspekte der Herzfunktion erhalten. Zwei Mittel, die bei der therapeutischen Angiogenese bei Tiermodellen chronischer Myokard-Ischämie verwendet wurden, sind der vaskuläre Endothelzellwachstumsfaktor (VEGF), der ein angiogener und gefäßerweiternder Wachstumsfaktor ist, sowie der "angiogenic Protein basic fibroblast growth factor (bFGF)". Harada et al., J. Clin. Invest. 94, 623-630 (1994) ; Lopez et al., Cardiovasc. Res. 40, 272-281 (1998) und Unger et al., Am. J. Physiol. 266, H1588-H1595 (1994). Es wurden jedoch negative Konsequenzen, wie z.B. Hypotonie, Tachykardie und verringertes Herzminutenvolumen, beobachtet, wenn VEGF an Patienten verabreicht wurde. Yang et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 284, 103-110 (1998).
  • Um das Profil der Nebenwirkungen der systemischen VEGF- und FGF-Verabreichung zu minimieren, gehen die jetzigen Ansätze der Induktion einer Revaskularisierung und einer erneuten Sauerstoffanreicherung in Richtung einer direkten Myokard- oder Perikardinjektion nackter DNA für VEGF oder von VEGF oder direkt von bFGF-Protein. Dies erfordert invasive Verfahren, die oftmals eine Thorakotomie umfassen. Ein sicheres, nicht toxisches, nichtinvasives Verfahren zur Förderung der Expression von angiogenem Wachstumsfaktor und eine darauf folgende Zunahme der kollateralen Gefäßentwicklung könnte eine enorme Wirkung haben.
  • Relaxin (RLX) ist ein Protein mit einem geringen Molekulargewicht von etwa 6.000 Da, das zur Insulin-Wachstumsfaktor-Familie gehört und das während der Lutealpha se des Menstruationszyklus und während der Gestation bei Frauen zirkuliert. Es wird bei Männern auch von der Prostata produziert. RLX ist auch ein Schwangerschaftshormon bei Ratten. Bei beiden Spezies gehen die zirkulierenden Mengen auf den Gelbkörper zurück. Relaxin besteht aus zwei Peptidketten, die als A und B bezeichnet werden und die über Disulfidbindungen mit einer inneren Disulfidschleife in der A-Kette auf eine Art gebunden sind, die analog zu jener von Insulin ist.
  • In Anbetracht der bestehenden Probleme, die mit hypertonischer Gefäßerkrankung assoziiert sind, ist es klar, dass es nach dem Stand der Technik einen Bedarf für zusätzliche Mittel zur Behandlung von hypertonischer Gefäßerkrankung gibt. Die vorliegende Erfindung zielt auf diesen Bedarf ab und stellt auch damit zusammenhängende Vorteile bereit.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt die medizinische Verwendung des Einsatzes von Relaxin zur Behandlung von pulmonaler Hyptertonie bereit, wie sie in den Ansprüchen dargelegt ist. Die Formulierung kann durch Injektion oder durch Retard-Verabreichungsmodi verabreicht werden, und zwar über eine Zeitspanne und in Mengen, die wirksam sind, um pulmonale Hypertonie zu behandeln. Relaxin kann eine Steigerung der Gefäßerweiterung und eine Steigerung der Neovaskularisierung bewirken (d.h. um die Angiogenese zu stimulieren, zu erhöhen oder zu fördern) oder beides, wodurch die Störung oder die Symptome der Störung gemildert wird/werden.
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Reduktion von pulmonaler Hypertonie bereit, das allgemein die Verabreichung einer Formulierung umfasst, die eine Menge an Relaxin umfasst.
  • Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist die Tatsache, dass das Sicherheitsprofil von Relaxin bei Menschen höher ist als bei anderen Mitteln, wie z.B. VEGF und FGF.
  • Ein weiterer Vorteil der Verwendung von Relaxin zur Behandlung von hypertonischen Gefäßerkrankungen ist die Tatsache, dass es sowohl bei Männern als auch bei Frauen wirksam ist.
  • Ein weiteres Ziel der Erfindung ist ein Verfahren, durch das therapeutisch wirksame Mengen an Relaxin wiederholt einem Patienten über eine gewisse Zeitspanne verabreicht werden, um ein vorteilhaftes therapeutisches Resultat zu erzielen.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die wiederholte oder im Wesentlichen kontinuierliche Verabreichung von Relaxin über eine Zeitspanne, um therapeutische Blutspiegel von Relaxin über Zeitspannen beizubehalten, die ausreichen, um therapeutische Resultate zu erzielen.
  • Ein Merkmal der Erfindung sind injizierbare und Retard-Formulierungen von Relaxin, die im Verfahren der Erfindung von Nutzen sind, worin die Formulierung einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und eine therapeutisch wirksame Menge an Relaxin umfasst.
  • Diese und andere Ziele, Vorteile und Merkmale der Erfindung sind für den Fachmann nach Lektüre der Details der Erfindung, wie sie nachstehend ausführlicher beschrieben sind, klar erkenntlich.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die 1A-D zeigen die Wirkung einer Langzeit-Infusion von gereinigtem Schweine-RLX, rekombinantem menschlichem Relaxin (rhRLX) oder eines Vehikels auf den mittleren Arteriendruck (A), die Glomerulusfiltrationsrate (B), den effektiven Nieren-Plasmafluss (C) und den effektiven Nieren-Gefäßwiderstand (D). Die Zahlen in Klammern geben die Anzahl der getesteten Ratten an. * p < 0,05 bezogen auf Grundlinie und Vehikel.
  • Die 2A-D zeigen die Wirkung einer 5-Tage-Verabreichung von rhRLX an Ratten, die einer Sham-Ovariektomie unterzogen wurden und Ratten, die einer Ovariektomie unterzogen wurden: (A) mittlerer Arteriendruck, (B) Giomerulusfiltrationsrate, (C) effektiver Nieren-Plasmafluss und (D) effektiver Nieren-Gefäßwiderstand. Die Zahlen in Klammern geben die Anzahl der untersuchten Ratten an. * p < 0,05 bezogen auf die Grundlinie.
  • Die 3A-D zeigen Graphen, welche die Wirkung einer 5-Tage-Infusion von entweder rhRLX (4 μg/Std.) oder eines Vehikels (Zeitkontrolle) auf MAP (Tafel A), GFR (B), ERPF (C) oder ERVR (D) bei bei Bewusstsein befindlichen männlichen Ratten darstellen. * p < 0,05 bezogen auf die Grundlinie.
  • Die 4A-D zeigen Graphen, welche die Wirkung des spezifischen ETB-Rezeptor-Antagonisten, RES-701-1, auf MAP (Tafel A), GFR (B), ERPF (C) und ERVR (D) bei Ratten zeigt, denen für 5 Tage entweder rhRLX (4 μg/Std.) oder ein Vehikel verabreicht wurde. +p < 0,05 Relaxin-Grundlinie bezogen auf Vehikel-Grundlinie. * p < 0,05 RES-701-1 bezogen auf die Grundlinie.
  • 5 zeigt einen Graph, der eine quantitative Echtzeit-RT-PCR-Analyse der Expression der Ratten-VEGF164- und VEGF120-Isoformen und des Ratten-bFGF im Periinfarkt-Bereich bei Rattenherzen nach einem Myokardinfarkt darstellt.
  • 6 zeigt einen Graph, der eine quantitative Echtzeit-RT-PCR der menschlichen VEGF165- und VEGF121-Isoformen und des menschlichen bFGF nach einer Relaxin-Behandlung in vitro darstellt.
  • 7 zeigt einen Graph, der die Wirkung der chronischen Verabreichung von Relaxin auf den rechtsventrikulären Druck (RVP) bei Ratten darstellt, die bei Bedingungen von Normoxie (Luft) oder Hypoxie gehalten wurden.
  • Die 8A und 8B sind Graphen, welche die Wirkungen von Relaxin auf die VEGF- und bFGF-mRNA-Expression bei Wundzellen darstellen. 8A zeigt die Expression von Transkripten der 164-Aminosäure- und 120-Aminosäure-Isoformen von VEGF. 8B zeigt die Steigerung der Expression von bFGF in Wundzellen.
  • 9 zeigt einen Graph, der die Wirkung von Relaxin auf die VEGF-(165- und 121-Aminosäure-Isoformen) und die bFGF-mRNA-Expression in THP-1-Zellen darstellt.
  • 10 zeigt einen Graph, der die Veränderung des diastolischen Blutdrucks gegenüber der Grundlinie über eine Zeitspanne von 26 Wochen bei Menschen darstellt, die mit 25 μg/kg/Tag Relaxin (schwarze Dreiecke) behandelt wurden, oder bei Placebo-Menschen (weiße Quadrate) für eine Zeitspanne von 24 Wochen.
  • 11 zeigt einen Graph, der die Veränderung des systolischen Blutdrucks gegenüber der Grundlinie über eine Zeitspanne von 26 Wochen bei Menschen darstellt, die mit 25 μg/kg/Tag Relaxin (schwarze Dreiecke) behandelt wurden, oder bei Placebo-Menschen für eine Zeitspanne von 24 Wochen.
  • 12 zeigt einen Graph, der die prognostizierte Kreatinin-Clearance über der Zeit bei Menschen darstellt, die mit 10 μg/kg/Tag Relaxin behandelt wurden.
  • 13 zeigt einen Graph, der die prognostizierte Kreatinin-Clearance über der Zeit bei Menschen darstellt, die mit 25 μg/kg/Tag Relaxin behandelt wurden.
  • 14 zeigt einen Graph, der die myogene Reaktivität kleiner Nierenarterien darstellt.
  • 15 zeigt einen Graph, der die myogene Reaktivität kleiner Mesenterialarterien darstellt.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Bevor die vorliegende Erfindung beschrieben wird, ist anzumerken, dass diese Erfindung nicht auf spezielle beschriebene Ausführungsformen beschränkt ist, da diese natürlich variieren können. Es ist ebenfalls anzumerken, dass die hierin verwendete Terminologie lediglich dem Zweck der Beschreibung bestimmter Ausführungsformen dient und nicht als Einschränkung anzusehen ist, da der Umfang der vorliegenden Erfindung nur durch die im Anhang befindlichen Ansprüche eingeschränkt wird.
  • Falls nicht anders definiert, haben alle technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke, die hierin verwendet werden, dieselbe Bedeutung, wie sie im Allgemeinen von einem Fachmann, auf den sich diese Erfindung bezieht, verstanden wird. Obwohl beliebige Verfahren und Materialien, die den hierin beschriebenen ähneln oder diesen entsprechen, bei der Durchführung oder dem Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden nun die bevorzugten Verfahren und Materialien beschrieben.
  • Es ist anzumerken, dass, wie hierin und in den im Anhang befindlichen Ansprüchen verwendet, die Singularformen "ein", "eine" und "der/die/das" auch die Pluralbegriffe umfassen, es sei denn, aus dem Kontext geht klar und deutlich etwas anderes hervor. Daher umfasst z.B. ein Verweis auf "eine Erkrankung" auch mehrere solche Erkrankungen, und ein Verweis auf "das Verfahren" umfasst einen Verweis auf ein oder mehrere Verfahren und Äquivalente davon, die dem Fachmann bekannt sind, etc.
  • Die hierin diskutierten Veröffentlichungen werden lediglich wegen ihrer Offenbarung vor dem Einreichdatum der vorliegenden Erfindung bereitgestellt. Nichts hierin ist als Eingeständnis zu verstehen, dass die vorliegende Erfindung aufgrund früherer Erfindung ("prior invention") nicht rechtmäßig vor einer solchen Veröffentlichung zu datieren ist. Weiters können sich die bereitgestellten Veröffentlichungsdaten von den tatsächlichen Veröffentlichungsdaten unterscheiden, die mitunter unabhängig voneinander zu belegen sind.
  • Definitionen
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Relaxin" auf biologisch aktives (hierin auch als "pharmazeutisch aktives" bezeichnet) Relaxin aus rekombinanten oder nativen Quellen sowie auf Relaxin-Varianten, wie z.B. Aminosäure-Sequenzvarianten. Natürlich vorkommendes, biologisch aktives Relaxin kann von menschlichen, murinen (d.h. Ratten oder Mäusen), Schweine- oder anderen Säugetier-Quellen stammen. Der Ausdruck "Relaxin" umfasst menschliches H1-Preprorelaxin, Prorelaxin und Relaxin; sowie H2-Preprorelaxin, Prorelaxin und Relaxin; und rekombinantes menschliches Relaxin. Ebenfalls inkludiert ist auch Relaxin, das modifiziert wurde, um in vivo die Halbwertszeit zu erhöhen, z.B. PEGyliertes Relaxin (d.h. Relaxin, das an ein Polyethylenglykol konjugiert wurde) und dergleichen. Der Ausdruck umfasst auch Relaxin, das A- und B-Ketten mit N- und/oder C-terminalen Trunkierungen umfasst. Im Allgemeinen kann bei H2-Relaxin die A-Kette von A(1-24) zu A(10-24) variiert werden und die B-Kette von B(-1-33) zu B(10-22); und bei H1-Relaxin kann die A-Kette von A(1-24) zu A(10-24) und die B-Kette von B(1-32) zu B(10-22) variiert werden. Ebenfalls im Umfang des Ausdrucks "Relaxin" enthalten sind andere Insertionen, Substitutionen oder Deletionen eines oder mehrerer Aminosäure-Reste, Glykosylierungsvarianten, unglykosyliertes Relaxin, organische oder anorganische Salze, kovalent modifizierte Derivate von Relaxin, Preprorelaxin und Prorelaxin. Auch im Ausdruck enthalten ist ein Relaxin-Analogon mit einer Aminosäuresequenz, die sich von einer Wildtyp-Sequenz (z.B. natürlich vorkommend) unterscheidet, unter anderem, jedoch nicht beschränkt auf Relaxin-Analoga, die im US-Patent Nr. 5.811.395 offenbart sind. Mögliche Modifikationen bei Relaxin-Aminosäureresten umfassen die Acetylierung, die Formylierung oder einen ähnlichen Schutz freier Aminogruppen, umfassend den N-Terminus, die Amidierung von C-terminalen Gruppen oder die Bildung von Estern von Hydroxyl- oder Carboxyl-Gruppen, z.B. die Modifikation des Tryptophan-(Trp-)Rests an B2 durch die Addition einer Formylgruppe. Die Formylgruppe ist ein typisches Beispiel für eine leicht entfernbare Schutzgruppe. Andere mögliche Modifikationen umfassen die Substitution einer oder mehrerer der natürlichen Aminosäuren in den B- und/oder A-Ketten durch eine andere Aminosäure (unter anderem die D-Form einer natürlichen Aminosäure), beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf die Substitution der Met-Gruppierung an B24 durch Norleucin (Nle), Valin (Val), Alanin (Ala), Glycin (Gly), Serin (Ser) oder Homoserin (HomoSer). Andere mögliche Modifikationen umfassen die Deletion einer natürlichen Aminosäure aus der Kette oder die Addition einer oder mehrerer zusätzlicher Aminosäuren zur Kette. Zusätzliche Modifikationen umfassen Aminosäuresubstitutionen an den B/C- und C/A-Verbindungsstellen von Prorelaxin, wobei die Modifikationen die Spaltung der C-Kette von Prorelaxin erleichtern; sowie Relaxin-Varianten, die ein nicht natürlich vorkommendes C-Peptid umfassen, z.B. wie im US-Patent Nr. 5.759.807 beschrieben. Ebenfalls im Ausdruck "Relaxin" enthalten sind Fusionspolypeptide, die Relaxin und ein heterologes Polypeptid umfassen. Ein heterologer Polypeptid-Fusionspartner (z.B. ein Nicht-Relaxin-Polypeptid) kann C-terminal oder N-terminal zum Relaxin-Abschnitt des Fusionsproteins liegen. Heterologe Polypeptide umfassen immunologisch detektierbare Polypeptide (z.B. "Epitop-Markierungen"); Polypeptide, die in der Lage sind, ein detektierbares Signal zu erzeugen (z.B. grün fluoreszierendes Protein, Enzyme, wie z.B. alkalische Phosphatase, und andere, die nach dem Stand der Technik bekannt sind); therapeutische Polypeptide, unter anderem, jedoch nicht beschränkt auf Zytokine, Chemokine und Wachstumsfaktoren. All diese Variationen oder Veränderungen in der Struktur des Relaxin-Moleküls, die zu Varianten führen, sind im Umfang dieser Erfindung inkludiert, so lange die funktionelle (biologische) Aktivität des Relaxins beibehalten wird. Vorzugsweise ist jegliche Modifikation der Relaxin-Aminosäure-Sequenz oder -Struktur eine, durch die ihre Immunogenität in dem mit der Relaxin-Variante behandelten Individuum nicht erhöht wird. Diese Varianten von Relaxin mit der beschriebenen funktionellen Aktivität können unter Verwendung der oben erwählten In-vitro- und In-vivo-Tests leicht identifiziert werden.
  • Wie hierin verwendet, betreffen die Ausdrücke "isoliert" und "im Wesentlichen gereinigt", hierin austauschbar verwendet, bei Verwendung im Kontext von "isoliertem Relaxin" ein Relaxin-Polypeptid, das sich in einer Umgebung befindet, die sich von jener, in der das Relaxin-Polypeptid natürlich vorkommt, unterscheidet. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "im Wesentlichen gereinigt" auf ein Relaxin-Polypeptid, das aus seiner natürlichen Umgebung entfernt ist und zumindest zu 60 % frei, vorzugsweise zu 75 % frei, besonders bevorzugt zu 90 % frei, von anderen Komponenten ist, mit denen es natürlich assoziiert ist.
  • Die Ausdrücke "wirksame Menge" und "therapeutische Menge" und dergleichen werden hierin als Synonyme verwendet, um eine Relaxin-Formulierung zu beschreiben, die ausreicht, um eine Erkrankung zu behandeln, die mit Gefäßverengung in Zusammenhang steht. Der Ausdruck "wirksame Menge" beschreibt eine Dosierung, die ausreicht, um eine Behandlung für den behandelten Krankheitszustand bereitzustellen, d.h. eine Erkrankung, die mit Gefäßerweiterung in Verbindung steht. Im Allgemeinen ist eine wirksame Menge an Relaxin eine, die wirksam ist, um die Gefäßerweiterung zu erhöhen und/oder um die Neovaskularisierung zu steigern. Der Ausdruck "erhöhen" wird hierin als Synonym zu "stimulieren" und "fördern" verwendet. Die Beispiele stellen einen allgemeinen Leitfaden für wirksame Mengen, die bei Ratten verwendet wurden, dar. Es ist einem Fachmann leicht möglich, wirksame Mengen für die Verwendung für menschliche Individuen zu bestimmen, und zwar unter Verwendung des Leitfadens in den Beispielen. Im Allgemeinen beträgt eine Dosis von etwa 0,1 bis 500 μg/kg Körpergewicht pro Tag, etwa 6,0 bis 200 μg/kg, oder etwa 12,0 bis 100 μg/kg. Für die Verabreichung an eine Person mit 70 kg würde der Dosierungsbereich bei etwa 7,0 μg bis 3,5 mg pro Tag liegen, etwa 42,0 μg bis 2,1 mg pro Tag oder etwa 84,0 bis 700 μg pro Tag. In einigen Ausführungsformen liegt eine wirksame Dosis für die Verabreichung an einen Menschen bei von etwa 5 μg/kg Körpergewicht/Tag bis etwa 50 μg/kg Körpergewicht/Tag oder von etwa 10 μg/kg Körpergewicht/Tag bis etwa 25 μg/kg Körpergewicht/Tag. Die Menge an verabreichtem Relaxin hängt natürlich von der Größe, dem Geschlecht und dem Gewicht des Individuums ab sowie vom Schweregrad der Erkrankung oder des Zustands, der Art und des Verabreichungsschemas, der Wahrscheinlichkeit des Wiederauftretens der Erkrankung und des Urteils des verschreibenden Arztes.
  • Die Ausdrücke "Subjekt" oder "Individuum" oder "Patient", hierin synonym verwendet, beziehen sich auf ein beliebiges Subjekt, insbesondere ein Säugetier-Subjekt, bei dem eine Diagnose oder Therapie gewünscht wird, insbesondere Menschen. Andere Subjekte können Rinder, Hunde, Katzen, Meerschweinchen, Kaninchen, Ratten, Mäuse, Pferde etc. umfassen. Ein bevorzugtes Individuum ist ein Mensch, der einer Behandlung einer Krankheit bedarf, die mit Gefäßverengung in Verbindung steht, insbesondere einer Nierenerkrankung und eines ischämischen Leidens.
  • Die Ausdrücke "Behandlung", "behandeln", "Therapie" und dergleichen werden hierin verwendet, um sich allgemein auf die Erzielung einer gewünschten therapeutischen, pharmakologischen oder physiologischen Wirkung zu beziehen. Die Wirkung kann prophylaktisch sein, wobei sie eine Erkrankung oder ein Symptom davon vollständig oder partiell verhindert und/oder sie kann therapeutisch sein, wobei sie eine partielle oder vollständige Heilung für eine Erkrankung und/oder eine Nebenwirkung darstellen, die der Erkrankung zuzuschreiben ist. "Behandlung", wie hierin verwendet, umfasst eine beliebige Behandlung einer Erkrankung bei einem Säugetier, z.B. einem Menschen, und umfasst: (a) das Vermeiden des Auftretens der Erkrankung bei einem Subjekt, das eine Prädisposition für die Erkrankung aufweisen kann, diese jedoch bei ihm noch nicht diagnostiziert wurde; (b) das Inhibieren der Erkrankung, d.h. das Anhalten ihrer Entwicklung; und (c) das Mildern der Erkrankung, d.h. das Hervorrufen eines Rückgangs der Erkrankung.
  • Überblick über die Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine medizinische Verwendung unter Einsatz von Relaxin zur Behandlung von polmonaler Hypertonie bereit, wie in den Ansprüchen dargelegt ist. Relaxinformulierungen der Erfindung können sowohl zu einer Verstärkung der Gefäßerweiterung als auch zu einer Verstärkung der Bildung neuer Blutgefäße führen. Weiters wurde überraschenderweise herausgefunden, dass Relaxin, ein Schwangerschaftshormon, die Gefäßerweiterung und die Neovaskularisierung sowohl bei Männern als auch bei Frauen fördern kann.
  • VERFAHREN ZUR BEHANDLUNG VON ERKRANKUNGEN, DIE MIT GEFÄßVERENGUNG IN VERBINDUNG STEHEN
  • Die vorliegende Erfindung stellt medizinische Verwendungen in Zusammenhang mit der Behandlung von Erkrankungen bereit, die mit Gefäßverengung in Zusammenhang stehen. Die hierin offenbarte Verwendung umfasst allgemein die Verabreichung einer pharmazeutischen Formulierung an ein Individuum, das diese benötigt, umfassend ein pharmazeutisch aktives Relaxin in einer Menge, die wirksam ist, um die pulmonale Hypertonie zu behandeln. Eine wirksame Menge an Relaxin ist eine, die wirksam ist, um Hypertonie zu reduzieren. Verabreichungsarten, Mengen des verabreichten Relaxins und Relaxin-Formulierungen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung werden nachstehend beschrieben.
  • Eine wirksame Menge an Relaxin ist eine, die bei der Behandlung von pulmonaler Hypertonie wirksam ist. Ob die Erkrankung behandelt wurde, wird durch Messung eines oder mehrerer diagnostischer Parameter bestimmt, der/die für den Krankheitsverlauf im Vergleich zu einer geeigneten Kontrollgruppe als maßgeblich angesehen wird/werden. Im Fall eines Tierexperiments ist eine "geeignete Kontrolle" ein Tier, das nicht mit Relaxin behandelt wurde oder das mit der pharmazeutischen Formulierung ohne Relaxin behandelt wurde. Im Fall eines menschlichen Subjekts kann eine "geeignete Kontrolle" ein Individuum vor der Behandlung sein oder ein Mensch (z.B. eine dem Alter nach übereingestimmte oder ähnliche Kontrolle) sein, die mit einem Placebo behandelt wurde. Verfahren zur Untersuchung, ob die pulmonale Hypertonie behandelt wurde, sind nach dem Stand der Technik bekannt und werden in zahlreichen Veröffentlichungen beschrieben, unter anderem z.B. Peripheral Vascular Diseases, Young et al. (Hrsg.), Mosby-Year Book, Inc. St. Louis, MO (1996). Zusätzliche Verfahren werden hierin nachstehend beschrieben.
  • In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung die Verwendung von Relaxin zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von pulmonaler Hypertonie bereit, umfassend die Verabreichung einer pharmazeutischen Formulierung an einen Pa tienten, der diese benötigt, wobei diese ein pharmazeutisch aktives Relaxin in einer Menge umfasst, die wirksam ist, um Hypertonie zu reduzieren.
  • Die Verabreichung einer wirksamen Menge eines pharmazeutisch aktiven Relaxins an ein Individuum, das dieses benötigt, erhöht die Nieren-Gefäßerweiterung um zumindest etwa 10 %, zumindest etwa 20 %, zumindest etwa 30 %, zumindest etwa 50 % oder zumindest etwa 75 %, oder mehr im Vergleich zu einer geeigneten Kontrollgruppe. Parameter und Methoden für eine Untersuchung, ob die Nieren-Gefäßerweiterung nach einer Verabreichung von Relaxin verstärkt ist, sind nach dem Stand der Technik bekannt und umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf das Messen einer oder mehrerer der folgenden Parameter: effektiver Nieren-Gefäßwiderstand (ERVR); Glomerulusfiltrationsrate (GFR); mittlerer Arteriendruck (MAP); effektiver Nieren-Plasmafluss (ERPF); Hämatocrit; Plasma-Osmolalität und Plasma-Natriumkonzentration. Die Verabreichung von Relaxin führt zu einem oder mehreren der folgenden Zustände: (1) einer Erhöhung der GFR- und ERPF-Werte; (2) einer Verringerung von ERVR; (3) einer Verringerung des Hämatokrits; (4) einer Verringerung der Plasma-Osmolalität; (5) einer Verringerung der Plasma-Natriumkonzentration und (6) einer Verringerung des Serum-Kreatinins. Eine Verringerung von Hämatokrit, Plasma-Osmolalität und Plasma-Natriumkonzentration deuten auf eine allgemeine Gefäßerweiterung hin, was zu einer Erhöhung des Blutvolumens führt und zu einer daraus resultierenden Verdünnung der Anzahl der roten Blutkörperchen und der Natriumkonzentration. Verfahren zum Messen dieser Parameter sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt und werden in den Beispielen 1, 2 und 9 beschrieben.
  • In manchen Ausführungsformen werden Verfahren zur Behandlung von pulmonaler Hypertonie bereitgestellt. Beispiel 5 stellt Daten bereit, die zeigen, dass die Verabreichung von Relaxin, z.B. durch Infusion über eine ausgedehnte Zeitspanne, das Fortschreiten von pulmonaler Hypertonie inhibiert, wie durch eine Inhibierung der Kollagenablagerung in der Gefäßwand sowie durch die verbessernde Wirkung auf kompensatorische rechtsventrikuläre Hypertrophie gezeigt wird. Die Verabreichung einer wirksamen Menge eines pharmazeutisch aktiven Relaxins an ein Individuum, das dieses benötigt, reduziert pulmonale Hypertonie um zumindest etwa 2 %, zumindest etwa 5 %, zumindest etwa 10 %, zumindest etwa 20 %, zumindest etwa 30 %, zumindest etwa 50 %, zumindest etwa 75 %, oder mehr im Vergleich zu einer geeigneten Kontrollgruppe. Ob die Verabreichung von Relaxin pulmonale Hypertonie reduziert, kann unter Anwendung eines beliebigen Verfahrens, das nach dem Stand der Technik bekannt ist, bestimmt werden, unter anderem, jedoch nicht beschränkt auf das Messen des rechtsventrikulären Drucks (RVP). Daher sind die Verfahren wirksam, um den rechtsventrikulären Druck um zumindest etwa 2 %, zumindest etwa 5 %, zumindest etwa 10 %, zumindest etwa 20 %, zumindest etwa 30 % oder zumindest etwa 50 % oder mehr im Vergleich zu einer geeigneten Kontrollgruppe zu reduzieren.
  • Die Verabreichung von Relaxin im hypoxischen Rattenmodell von pulmonaler Hypertonie, das in Beispiel 5 beschrieben wurde, führte zu einer verringerten extrazellulären Matrix-(ECM-)Synthese in der Gefäßwand. Daher werden in einigen Ausführungsformen Verfahren zur Reduktion der ECM-Ablagerung in der Gefäßwand um zumindest etwa 2 %, zumindest etwa 5 %, zumindest etwa 10 %, zumindest etwa 20 %, zumindest etwa 30 % oder zumindest etwa 50 % oder mehr im Vergleich zu einer geeigneten Kontrollgruppe bereitgestellt.
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind für die Behandlung eines Individuums geeignet, bei dem eine Erkrankung diagnostiziert wurde, die mit Gefäßverengung in Verbindung steht, eines Individuums, bei dem eine Erkrankung vermutet wird, die mit Gefäßverengung in Verbindung steht, eines Individuums, das bekanntermaßen für die Entwicklung einer Erkrankung, die in Verbindung mit Gefäßverengung steht, anfällig ist und bei dem die Wahrscheinlichkeit dafür besteht, oder eines Individuums, bei dem die Wahrscheinlichkeit eines Wiederauftretens einer zuvor bereits behandelten Erkrankung besteht, die in Verbindung mit Gefäßverengung steht.
  • Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen, die in Verbindung mit Gefäßverengung stehen, können durch die Verabreichung von Relaxin in Kombination mit einem bekannten gefäßerweiternden Mittel und/oder bekannten angiogenen Verbindungen verstärkt werden.
  • RELAXIN-FORMULIERUNGEN
  • Relaxin-Formulierungen, die zur Verwendung in der Erfindung geeignet sind, sind pharmazeutische Formulierungen, die eine therapeutisch wirksame Menge eines pharmazeutisch aktiven Relaxins sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen. Die Formulierung ist vorzugsweise injizierbar und besonders bevorzugt für eine intravenösen Injektion geschaffen.
  • Es kann in den Verfahren der vorliegenden Erfindung jede bekannte Relaxin-Formulierung verwendet werden, vorausgesetzt, das Relaxin ist pharmazeutisch aktiv. "Pharmazeutisch aktives" Relaxin ist eine Form von Relaxin, die bei Verabreichung an ein Individuum zu einer verstärkten Gefäßerweiterung und/oder einer verstärkten Angiogenese führt.
  • Relaxin kann als Polypeptid oder als Polynucleotid, das eine Sequenz umfasst, die für Relaxin kodiert, verabreicht werden. Relaxin, das für die Verwendung in den Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet ist, kann aus natürlichen Quellen isoliert werden, chemisch oder enzymatisch synthetisiert werden oder unter Anwendung von Standard-Rekombinationsverfahren produziert werden, die nach dem Stand der Technik bekannt sind. Beispiele für Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Relaxin sind in verschiedenen Veröffentlichungen zu finden, unter anderem z.B. US-Patent Nr. 4.835.251 ; 5.326.694 ; 5.320.953 ; 5.464.756 und 5.759.807 .
  • Zur Verwendung geeignetes Relaxin umfasst, ist jedoch nicht beschränkt auf menschliches Relaxin, rekombinantes menschliches Relaxin, Relaxin, das von nicht menschlichen Säugetieren stammt, wie z.B. Schweine-Relaxin, und eine beliebige der Relaxin-Varianten, die nach dem Stand der Technik bekannt sind. Relaxin, pharmazeutisch aktive Relaxin-Varianten und pharmazeutische Formulierungen, die Relaxin umfassen, sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt. Siehe z.B. US-Patente Nr. 5.451.572 ; 5.811.395 ; 5.945.402 ; 5.166.191 und 5.759.807 , die Relaxin-Formulierungen und die Produktion von Relaxin betreffen. Im Allgemeinen ist rekombinantes menschliches Relaxin (rhRLX) in der Aminosäuresequenz mit dem natürlich auftretenden Produkt des menschlichen H2-Gens identisch, das aus einer A-Kette von 24 Aminosäuren und einer B-Kette von 29 Aminosäuren besteht.
  • Relaxin kann einem Individuum in Form eines Polynucleotids verabreicht werden, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für Relaxin kodiert. Für Relaxin kodierende Nucleotidsequenzen sind nach dem Stand der Technik bekannt, wobei beliebige davon in den hierin beschriebenen Verfahren verwendet werden können. Siehe z.B. die GenBank-Zugriffsnr. AF135824; AF076971; NM_006911 und NM_005059. Die Relaxin-Polynucleotide und -Polypeptide der vorliegenden Erfindung können durch ein Genanlieferungsvehikel in eine Zelle eingeführt werden. Im Allgemeinen können Genanlieferungsvehikel entweder für Polypeptide oder für Polynucleotide kodieren, wie z.B. Antisense oder Ribozyme. Das Genanlieferungsvehikel kann viralen oder nichtviralen Ursprungs sein (siehe allgemein Jolly, Cancer Gene Therapy 1, 51-64 (1994); Kimura, Human Gene Therapy 5, 845-852 (1994); Connelly, Human Gene Therapy 1, 185-193 (1995) und Kaplitt, Nature Genetics 6, 148-153 (1994)). Gentherapievehikel zur Anlieferung von Konstrukten, die eine kodierende Sequenz eines Polynucleotids der Erfindung umfassen, können entweder lokal oder systemisch verabreicht werden. Diese Konstrukte können virale oder nicht virale Vektoransätze verwenden. Die Expression solcher kodierender Sequenzen kann unter Verwendung endogener Säugetier- oder heterologer Promotoren induziert werden. Die Expression der kodierenden Sequenz kann entweder konstitutiv oder reguliert erfolgen.
  • Die vorliegende Erfindung kann rekombinante Retroviren verwenden, die konstruiert wurden, um ein ausgewähltes Nucleinsäuremolekül von Interesse in sich zu tragen oder zu exprimieren. Retrovirus-Vektoren, die verwendet werden können, umfassen jene, die in EP 415.731 ; WO 90/07936 ; WO 94/03622 ; WO 93/25698 ; WO 93/25234 ; U.S.-Patent Nr. 5.219.740 ; WO 93/11230 ; WO 93/10218 ; Vile und Hart, Cancer Res. 53, 3860-3864 (1993); Vile und Hart, Cancer Res. 53, 962-967 (1993); Ram et al., Cancer Res. 53, 83-88 (1993); Takamiya et al., J. Neurosci. Res. 33, 493-503 (1992); Baba et al., J. Neurosurg. 79, 729-735 (1993); U.S.-Patent Nr. 4.777.127 und EP 345.242 beschrieben werden.
  • Verpackungszelllinien, die für die Verwendung mit den oben beschriebenen retroviralen Vektorkonstrukten geeignet sind, können leicht hergestellt werden (siehe PCT-Veröffentlichungen WO 95/30763 und WO 92/05266 ) und verwendet werden, um produzierende Zelllinien (auch Vektorzelllinien) zur Produktion von rekombinanten Vektorpartikeln herzustellen. Innerhalb der besonders bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden Verpackungszelllinien aus menschlichen (wie z.B. HT1080-Zellen) oder Nerz-Mutterzellen produziert, wodurch eine Produktion von rekombinanten Retroviren ermöglicht wird, welche die Inaktivierung in menschlichem Serum überleben kann.
  • Genanlieferungsvehikel der vorliegenden Erfindung können auch Parvoviren, wie z.B. adenoassoziierte Virus-(AAV-)Vektoren, verwenden. Repräsentative Beispiele umfassen die AAV-Vektoren, die von Srivastava in WO 93/09239 , Samulski et al., J. Vir. 63, 3822-3828 (1989); Mendelson et al., Virol. 166, 154-165 (1988) und Flotte et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10613-10617 (1993) offenbart wurden.
  • Ebenfalls von Interesse sind adenovirale Vektoren, z.B. die von Berkner, Biotechniques 6, 616-627 (1988); Rosenfeld et al., Science 252, 431-434 (1991); WO 93/19191 ; Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 215-219 (1994); Kass-Eisler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11498-11502 (1993); WO 94/12649 ; WO 93/03769 ; WO 93/19191 ; WO 94/28938 ; WO 95/11984 und WO 95/00655 beschriebenen.
  • Andere Genanlierungsvehikel und -verfahren können auch verwendet werden, unter anderem polykationische kondensierte DNA, die an abgetöteten Adenovirus alleine gebunden oder ungebunden ist, z.B. Curiel, Hum. Gene Ther. 3, 147-154 (1992); Iigandengebundene DNA, siehe z.B. Wu, J. Biol. Chem. 264, 16985-16987 (1989); eukaryotische Zellanlieferungsvehikel-Zellen; die Ablagerung von photopolymerisierten Hydrogelmaterialien; eine tragbare Gentransfer-Partikelkanone, wie im U.S.-Patent Nr. 5.149.655 beschrieben; ionisierende Strahlung, wie in U.S.-Patent Nr. 5.206.152 und in WO 92/11033 beschrieben; Nucleinladungsneutralisierung oder Fusion mit Zellmembranen. Zusätzliche Ansätze werden in Philip, Mol. Cell Biol. 14, 2411-2418 (1994), und in Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 1581-1585 (1994), beschrieben.
  • Es kann auch nackte DNA verwendet werden. Beispiele für Verfahren zur Einführung nackter DNA werden in WO 90/11092 und im U.S.-Patent Nr. 5.580.859 beschrieben. Die Aufnahmeeffizienz kann unter Verwendung biologisch abbaubarer Latexperlen verbessert werden. Mit DNA überzogene Latexperlen werden nach der Endozytose-Initiation von den Perlen effizient in Zellen transportiert. Das Verfahren kann durch die Behandlung der Perlen weiter verbessert werden, um die Hydrophobie zu erhöhen und dadurch die Zerstörung des Endosoms und die Freisetzung der DNA in das Zytoplasma zu erleichtern. Liposomen, die als Genanlieferungsvehikel fungieren können, werden im U.S.-Patent Nr. 5.422.120 , PCT-Nr. WO 95/13796 , WO 94/23697 und WO 91/14445 und EP-Nr. 524.968 beschrieben.
  • Eine weitere nichtvirale Anlieferung, die sich zur Verwendung eignet, umfasst mechanische Anlieferungssysteme, wie z.B. den in Woffendin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 11581-11585 (1994), beschriebenen Ansatz. Weiters kann die kodierende Sequenz und das Expressionsprodukt derselben durch die Ablagerung von photopolymerisierten Hydrogelmaterialien angeliefert werden. Andere herkömmliche Verfahren zur Genanlieferung, die für die Anlieferung der kodierenden Sequenz verwendet werden können, umfassen z.B. die Verwendung einer tragbaren Gentransfer-Partikelkanone, wie im U.S.-Patent Nr. 5.149.655 beschrieben; die Verwendung von ionisierender Strahlung zur Aktivierung des transferierten Gens, wie im U.S.-Patent Nr. 5.206.152 und PCT-Nr. WO 92/11033 beschrieben.
  • Im Allgemeinen kann eine tägliche Dosis Relaxin bei etwa 0,1 bis 500 μg/kg, etwa 6,0 bis 200 μg/kg oder etwa 12 bis 100 μg/kg Körpergewicht pro Tag liegen. In einigen Ausführungsformen ist es wünschenswert, eine Serumkonzentration von Relaxin zu erhalten, die bei oder über etwa 1,0 ng/ml, etwa 0,5 bis etwa 50 ng/ml oder etwa 1 bis etwa 20 ng/ml liegt. Für die Verabreichung an eine Person mit 70 kg kann eine Dosierung im Bereich von etwa 2 μg bis etwa 2 mg pro Tag, etwa 10 μg bis 500 μg pro Tag oder etwa 50 μg bis etwa 100 μg pro Tag liegen. Die Menge an verabreichtem Relaxin hängt natürlich vom Individuum und dem Schweregrad der Erkrankung ab sowie von der Art und dem Verabreichungsschema und dem Urteil des verschreibenden Arztes.
  • Bei der Verwendung von Relaxin zur Behandlung von Erkrankungen, die in Verbindung mit pulmonaler Hypertonie stehen, kann jeder beliebige pharmazeutisch annehmbare Verabreichungsmodus verwendet werden. Relaxin kann entweder alleine oder in Kombination mit anderen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten verabreicht werden, umfassend feste, halbfeste, flüssige oder Aerosol-Dosierungsformen, wie z.B. Tabletten, Kapseln, Pulver, Flüssigkeiten, Gele, Suspensionen, Suppositorien, Aerosole oder dergleichen. Relaxin kann auch in Dosierungsformen mit verzögerter oder kontrollierter Freisetzung verabreicht werden (z.B. unter Verwendung eines langsam freisetzenden bioerodierbaren Anlieferungssystems), umfassend Depot-Injektionen, Osmotische Pumpen (wie z.B. das Alzet-Implantat, das von Alza hergestellt wird), Pillen, transdermale und transkutane (unter anderem Elektrotransport-) Pflaster und dergleichen zur verlängerten Verabreichung mit einer vorherbestimmten Rate, vorzugsweise in Einheitsdosierungsformen, die sich für eine einzelne Verabreichung präziser Dosierungen eignen. Die Zusammensetzungen umfassen typischerweise einen herkömmlichen pharmazeutischen Träger oder Exzipienten und Relaxin. Zusätzlich dazu können diese Zusammensetzungen andere aktive Mittel umfassen (z.B. andere angiogene Mittel, andere die Gefäßerweiterung fördernde Mittel), Träger, Hilfsstoffe etc. Im Allgemeinen enthält die pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzung, in Abhängigkeit vom vorgesehenen Verabreichungsmodus, etwa 0,1 Gew.-% bis 90 Gew.-%, etwa 0,5 Gew.-% bis 50 Gew.-% oder etwa 1 Gew.-% bis etwa 25 Gew.-% Relaxin, wobei es sich bei dem Rest um geeignete pharmazeutische Exzipienten, Träger etc. handelt. Aktuelle Verfahren zur Herstellung solcher Dosierungsformen sind bekannt oder für den Fachmann ersichtlich; siehe z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Esston, PA, 15. Auflage (1995). Die Formulierungen von menschlichem Relaxin, die im U.S.-Patent Nr. 5.451.572 beschrieben werden, stellen nicht einschränkende Beispiele geeigneter Formulierungen dar, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
  • Die parenterale Verabreichung ist im Allgemeinen durch eine Injektion charakterisiert, entweder subkutan, intradermal, intramuskulär oder intravenös oder subkutan. Stoffe können in herkömmlichen Formen hergestellt werden, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, feste Formen, die sich zur Lösung oder Suspension in einer Flüssigkeit vor der Injektion eigenen, oder als Emulsionen. Geeignete Exzipienten sind z.B. Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol und dergleichen. Zusätzlich dazu können die zu verabreichenden pharmazeutischen Zusammensetzungen auch geringe Mengen an nichttoxischen Hilfsstoffen enthalten, wie z.B. Benetzungsmittel oder Emulgatoren, pH-Puffermittel, Löslichkeitsverstärker und dergleichen, wie z.B. Natriumacetat, Sorbitanmonolaureat, Triethanolaminoleat, Cyclodextrine und dergleichen.
  • Der Prozentsatz an Relaxin, der in solchen parenteralen Zusammensetzungen enthalten ist, ist hochgradig von ihrer spezifischen Natur sowie vom Bedarf des jeweiligen Individuums abhängig. Prozentsätze des Wirkstoffs von 0,01 % bis 10 % in Lösung sind verwendbar und sind höher, wenn die Zusammensetzung ein Feststoff ist, der anschließend auf die oben genannten Prozentsätze verdünnt wird. Im Allgemeinen umfasst die Zusammensetzung 0,2-2 % des Relaxins in Lösung.
  • Die parenterale Verabreichung kann die Implantation eines Systems mit langsamer Freisetzung oder einer Retard-Freisetzung verwenden, so dass eine konstante Dosierungsmenge beibehalten wird. Verschiedene Matrices (z.B. Polymere, hydrophile Gele und dergleichen) zur Steuerung der Retard-Freisetzung und zur progressiven Verringerung der Freisetzungsgeschwindigkeit von Wirkstoffen, wie z.B. Relaxin, sind nach dem Stand der Technik bekannt. Siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 3.845.770 (beschreibt elementare osmotische Pumpen); die U.S.-Patente Nr. 3.995.651 , 4.034.756 und 4.111.202 (beschreiben osmotische Miniaturpumpen); die U.S.-Patente Nr. 4.320.759 und 4.449.983 (beschreiben osmotische Multikammersysteme, die als osmotische Push-Pull- und Push-Melt-Pumpen bezeichnet werden); und U.S.-Patent Nr. 5.023.088 (beschreibt osmotische Pumpen, die auf die zeitlich abgestimmte Abgabe verschiedener Dosierungseinheiten ausgerichtet sind).
  • Arzneimittel-Freisetzungsvorrichtungen, die zur Verwendung bei der Verabreichung von Relaxin nach den Verfahren der Erfindung geeignet sind, können auf einem beliebigen einer Reihe von Operationsmodi basieren. Die Arzneimittel-Freisetzungsvorrichtung kann z.B. auf einem Diffusionssystem, einem Konvektionssystem oder einem erodierbaren System basieren (z.B. einem erosionsbasierten System). Die Arzneimittel-Freisetzungsvorrichtung kann z.B. eine osmotische Pumpe, eine elektroosmotische Pumpe, eine Dampfdruckpumpe oder eine osmotisch berstende Matrix sein, z.B. in Fällen, in denen das Arzneimittel in ein Polymer inkorporiert ist und das Polymer für die Freisetzung der Arzneimittelformulierung zeitgleich mit dem Abbau eines arzneimittelgesättigten Polymermaterials (z.B. eines biologisch abbaubaren, arzneimittelgesättigten Polymermaterials) sorgt. In anderen Ausführungsformen basiert die Arzneimittel-Freisetzungsvorrichtung auf einem Elektrodiffusionssystem, einer elektrolytischen Pumpe, einer Sprudelpumpe, einer piezoelektrischen Pumpe, einem hydrolytischen System etc.
  • Arzneimittel-Freisetzungsvorrichtungen, die auf einer mechanischen oder einer elektromechanischen Infusionspumpe basieren, sind auch zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet. Beispiele solcher Vorrichtungen umfassen jene, die z.B. im U.S.-Patent Nr. 4.692.147 ; 4.360.019 ; 4.487.603 ; 4.360.019 ; 4.725.852 und dergleichen beschrieben sind. Im Allgemeinen können die vorliegenden Behandlungsmethoden unter Verwendung beliebiger einer Reihe wiederauffüllbarer, nicht austauschbarer Pumpensysteme erreicht werden. Osmotische Pumpen wurden in der Literatur ausführlich beschrieben. Siehe z.B. WO 97/27840 und U.S.-Patent Nr. 5.985.305 und 5.728.396 .
  • Relaxin kann über eine Zeitspanne von Stunden, Tagen, Wochen oder Monaten verabreicht werden, in Abhängigkeit von mehreren Faktoren, umfassend den Schweregrad der behandelten Erkrankung, die Tatsache, ob ein Wiederauftreten der Erkrankung als wahrscheinlich angesehen wird, etc. Die Verabreichung kann konstant sein, z.B. eine konstante Infusion über eine Zeitspanne von Stunden, Tagen, Wochen, Monaten, etc. Alternativ dazu kann die Verabreichung intermittierend erfolgen, z.B. kann Relaxin einmal pro Tag über eine Zeitspanne von Tagen, einmal pro Stunde über eine Zeitspanne von Stunden oder nach einem beliebigen anderen solchen Plan, der als geeignet angesehen wird, verabreicht werden.
  • Relaxin-Formulierungen können auch dem Atemtrakt als nasales oder pulmonales Inhalations-Aerosol oder als Lösung für einen Zerstäuber oder als mikrofeines Pulver zur Insufflation, alleine oder in Kombination mit einem trägen Träger, wie z.B. Lactose, oder mit anderen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten verabreicht werden. In einem solchen Fall können die Partikel der Formulierung vorteilhafterweise einen Durchmesser von weniger als 50 Mikrometer, vorzugsweise weniger als 10 Mikrometer aufweisen.
  • BEISPIELE
  • Die folgenden Beispiele werden dargelegt, um dem Fachmann eine vollständige Offenbarung und Beschreibung bereitzustellen, wie die vorliegende Erfindung herzustellen und zu verwenden ist, und sind nicht als Einschränkung des Umfangs dessen zu sehen, was die Erfinder als ihre Erfindung ansehen; ebensowenig sind sie dahingehend zu verstehen, dass die nachstehenden Beispiele alle oder die einzigen durchgeführten Experimente darstellen. Es wurden Anstrengungen unternommen, um im Hinblick auf die verwendeten Zahlen (z.B. Mengen, Temperatur etc.) Genauigkeit sicherzustellen, es sollten jedoch einige experimentelle Fehler und Abweichungen in Betracht gezogen werden. Falls nicht anders angegeben, sind die Teile als Gewichtsteile angegeben, das Molekulargewicht ist das gewichtsmittlere Molekulargewicht, die Temperatur ist in Grad Celsius angegeben, und der Druck liegt bei oder nahe Atmosphärendruck.
  • Beispiel 1: Relaxin ist ein starkes Nierengefäßerweiterungsmittel bei Ratten, die bei Bewusstsein sind (nicht Teil der beanspruchten Erfindung)
  • Materialien und Verfahren
  • Vorbereitung der Tiere
  • Weibliche Long-Evans Ratten im Alter von 10-14 Wochen wurden bei Harlan Sprague-Dawley (Frederick, MD) zugekauft. Sie wurden mit PROLAB-RMH-2000-Nahrung gefüttert, die 0,48 % Natrium enthielt (PME Feeds Inc., St. Louis, MO), und es wurde ihnen Wasser ad libitum zur Verfügung gestellt. Um die Ratten für experimentelle Verfahren vorzubereiten, wurden sie mehrere Stunden lang in einem Plexiglas-Käfig (Braintree Scientific Co., Braintree, MA) trainiert, und zwar zu zumindest fünf verschiedenen Zeitpunkten vor dem chirurgischen Eingriff. Diese Käfige boten ausreichend Platz zum Putzen des Gesichts und der Vorderpfoten, während sie die Ratten am Umdrehen hinderten. Dadurch wurden genau getimte Urin- und Blutproben aus den chronisch implantierten Blasen- bzw. vaskularen Kathetern ermöglicht. Ratten, die sich nicht an den Käfig gewöhnen konnten, wurden aus der Studie ausgeschlossen (< 1 %). Alle Vorgänge mit Tieren erhielten die Zustimmung des Institutional Animal Care and Use Committee des Magee-Women's Research Institute.
  • Die Details der chirurgischen Verfahren wurden bereits beschrieben. Siehe z.B. Conrad, Kidney Int. 26, 24-29 (1984); und Danielson und Conrad, J. Clin. Invest. 96, 482-490 (1995). Kurz gesagt wurden unter Verwendung von Ketamin- (6,0 mg/100 g Körpergewicht) und Pentobarbitalnatrium-Anästhesie (2,1 mg/100 g Körpergewicht) Tygon-Katheter in die Bauchaorta und in die untere Hohlvene über die Oberschenkelarterie bzw. -vene implantiert. Der Blasenkatheter, eine silasticüberzogene Edelstahlkanüle, wurde unter Verwendung einer Tabaksbeutelnaht in die Harnblase eingenäht und durch die ventrale Bauchwand exteriorisiert. Dieser Katheter wurde anschließend verschlossen, was es dem Tier ermöglichte, durch die Harnröhre zu urinieren, während es in seinem Käfig saß. Bei den Tieren, die einer Ovariektomie unterzogen wurden, und den Tieren, die einer Sham-Ovariektomie unterzogen wurden, wurden die Eierstücke zuerst abgebunden und anschließend entfernt oder bzw. durch eine kleine Inzision in der lateralen Bauchwand unmittelbar nach der Insertion der vaskulären und der Blasen-Katheter kurz manipuliert. Alle chirurgischen Eingriffe wurden unter Anwendung aseptischer Verfahren durchgeführt. Vor den Experimenten wurde zumindest eine 7-tägige Erholungsphase ermöglicht.
  • Zur chronischen Infusion von Relaxin wurde eine osmotische Minipumpe unter Atheranästhesie subkutan (s.c.) in den Rücken des Tiers insertiert. Nach dem Rasieren und Säubern der Haut mit Alkohol und Betadin wurde eine kleine Inzision gemacht, und die Minipumpe, die entweder rekombinantes menschliches Relaxin (rhRLX), gereinigtes Schweine-Relaxin (RLX) oder ein Vehikel enthielt, wurde insertiert. Anschließend wurde die Inzision mit chirurgischen Klammern geschlossen. Die osmotischen Minipumpen der Modelle 2001 und 2ML1 (Alza Co., Palo Alto, CA) wurden für das gereinigte Schweine-RLX bzw. für rhRLX verwendet.
  • Einfluss einer chronischen Infusion an gereinigtem Schweine-RLX, rhRLX oder Vehikel auf die Nierenfunktion bei gesunden Rattenweibchen. Am Anfang jedes Experiments und direkt nach dem Öffnen des arteriellen Katheters und vor der Infusion von Flüssigkeiten wurden 100 μl Blut in ein heparinisiertes Röhrchen abgenommen. Nach der Zentrifugierung zur Trennung der Blutzellen vom Plasma wurde Letzteres bis zum Osmolalitätstest bei -20 °C gefroren. Anschließend wurden drei 30-Minuten-Grundlinie-Urinproben mit Halbierungspunkt-Blutproben und kontinuierlicher Aufnahme von MAP hergestellt, und zwar zu ein oder zwei Zeitpunkten, die zumindest 48 Stunden auseinander lagen, um Kontroll-MAP, -GFR, -ERPF- und -ERVR (MAP/ERPF) genau zu messen. Der Hämatokrit wurde bei diesen Halbierungspunkt-Blutproben ebenfalls routinemäßig gemessen. Die Nieren-Clearance-Werte von IN und PAH wurde verwendet, um GFR bzw. ERPF zu untersuchen. Der Oberschenkelarterienkatheter wurde an einen Statham-Druckwandler (Gould P23 ID, Statham Instruments, Hato Rey, PR) und einen Gould-Universal-Amplifier zur Messung von MAP angeschlossen, das auf einem Gould-5900-Serie-Signalconditioner-Käfig-und-TA11-Schreiber dargestellt wurde. Als nächstes wurde eine osmotische Minipumpe, die ge reinigtes Schweine-RLX (4 μg/Stunde; n = 7 Ratten), rhRLX (4 μg/Stunde; n = 5) oder Vehikel (n = 4) enthielt, implantiert. MAP, GFR, ERPF und ERVR wurden an den Tagen 2 und 5 der Infusion und 5-12 Tage nach der Verarmung der 7-Tage-Minipumpe untersucht. Details zu den Verfahren der Erfinder zur Untersuchung von GFR und ERPF bei chronisch instrumentierten und bei Bewusstsein befindlichen Ratten, umfassend die Messung von IN und PAH sowohl im Plasma als auch im Urin, wurden bereits veröffentlicht. Conrad, Kidney Int. 26, 24-29 (1984); und Danielson und Conrad, J. Clin. Invest. 96, 482-490 (1995). Es wurden zirkulierende Relaxinkonzentrationen von 20-40 ng/ml bei Ratten am 12.-14. Trächtigkeitstag gemessen. Sherwood et al., Endocrinol. 107, 691-698 (1980). Eine Infusionsrate von 4 μg/Stunde bei gereinigtem Schweine-RLX oder rhRLX wäre zu erwarten, um Plasmamengen von 20-40 ng/ml zu produzieren.
  • Einfluss einer chronischen Infusion von rhRLX auf die Nierenfunktion bei Ratten, die Ovariektomie unterzogen wurden oder Ratten, die Sham-Ovariektomie unterzogen wurden. Sechs Rattenweibchen wurden entweder Ovariektomie oder Sham-Ovariektomie unterzogen, und zwar sofort nach der Implantation von vaskularen und Blasen-Kathetern. Sieben Tage später wurden die Nierenfunktion und MAP vor der Insertion von osmotischen Minipumpen untersucht, die rhRLX enthielten. An Tag 5 der Relaxin-Infusion (4 μg/Stunde) wurden erneut die Nierenfunktion und MAP bestimmt.
  • Akute Infusion von L-NAME oder Angiotensin 11 während einer chronischen Infusion von gereinigtem Schweine-RLX. Zumindest 7 Tage nach der Implantation der vaskulären und der Blasen-Katheter wurden osmotische Minipumpen, die entweder Schweine-RLX (4 μg/Stunde) oder Vehikel (Ringer-Lösung) enthielten, in gesunde Rattenweibchen (n = 7 bzw. 6 Ratten) implantiert. Die Nierenfunktion und MAP wurden an Tag 5 der Relaxin-Infusion gemessen (drei 30-Minuten-Urin- und Halbierungspunkt-Blutproben). Als nächstes wurde eine Infusion von L-NAME (2 μg/Minute, ein substratkompetitiver Inhibitor von NO-Synthase) intravenös (i.v.) mittels Infusionspumpe (Modell 200, KD Scientific, Boston, MA) verabreicht. Vier 1-Stunde-Urinproben mit Halbierungspunkt-Blutproben wurden zur Untersuchung von GFR, ERPF und ERVR während der L-NAME-Verabreichung abgenommen. Es wurden identische Verfahren bei zusätzlichen Tieren durchgeführt, denen chronisch Schweine-RLX (n = 5) oder Vehikel (n = 5) verabreicht wurde, außer dass ANG II (3 ng/Minute) anstatt L-NAME infundiert wurde. Schließlich wurde am Tag 5 der Schweine-RLX-Infusion weiteren vier, dem Alter nach abgestimmten Kontrollratten Ringer-Lösung anstatt von entweder L-NAME oder ANG II verabreicht.
  • Stoffwechselkäfig-Studien. Sechs Ratten wurden einzeln in Nalgene-Stoffwechselkäfigen (Nagetier-Stoffwechselkäfige für 150-300-g-Ratten, VWR Scientific) untergebracht. Wasser und Nahrung wurden ad libitum bereitgestellt. Nach 5-7 Tagen Gewöhnung wurden zwei 24-Stunden-Grundlinien-Urinproben erhalten. Anschließend wurde eine osmotische Minipumpe, die gereinigtes Schweine-RLX enthielt, implantiert (4 μg/Stunde). Zusätzliche 24-Stunden-Urinabnahmen wurden an den Tagen 2 und 5 der Relaxin-Infusion und an den Tagen 4, 12 und 25 nach Entleerung der 7-Tage-Minipumpe durchgeführt. Nahrungs- und Wasseraufnahme sowie die Urinflussrate wurden mit gravimetrischem Verfahren gemessen. Die Urinausscheidung von Natrium, cGMP und NOx wurde ebenfalls bestimmt. Bei den Messungen, die während der zwei Grundlinienabnahmen durchgeführt wurden, wurde der Mittelwert bestimmt, so wie auch bei den Messungen, die während der drei Post-Relaxin-Abnahmen durchgeführt wurden.
  • Analyseverfahren. Die Plasma-Osmolalität wurde unter Verwendung eines Gefrierpunktserniedrigungs-Osmometer-Instruments (Modell 3MO, Advanced Instruments, Needham Heights, MA) gemessen. Plasma- und Urin-IN und -PAH wurden mittels Standardverfahren gemessen. Die Urin-Natriumkonzentration wurde mittels innenselektiver Elektroden gemessen (Natrium-Kalium-Chemistry-Module, Beckman Instruments, Inc., Brea, CA). Urin-cGMP wurde mittels spezifischer Radioimmuntests bestimmt, wie zuvor beschrieben. Conrad und Vernier, Am. J. Physiol. 257, R847-R853 (1989). Urin-NOx wurde durch Reduktion von Nitrat zu Nitrit gemessen, wobei Letzteres durch die Griess-Reaktion bestimmt wurde, die ein kolorimetrisches Produkt erzeugt, das bei 540 nm gemessen wird (kolorimetrisches Nitrat/Nitrit-Testkit, Cayman Chemical, Ann Arbor, MI).
  • Ein Milliliter Blut wurde von den Ratten erhalten, denen rhRLX 5 Tage lang am Ende der Nierenfunktionsmessungen verabreicht wurde. Die Mengen an rhRLX im Serum wurden anschließend in einem quantitativen Sandwich-Immuntest gemessen. Unemori et al., J. Clin. Invest. 98, 2739-2745 (1996). Kurz gesagt wurden Wells einer 96-Well-Mikrotiter-Platte (Maxisorp Immunomodules, Nunc, Inc., Naperville, IL) über Nacht mit affinitätsgereinigtem polyklonalem Anti-rhRLX-Kaninchen-Antikörper überzogen. Die Sera wurden in phosphatgepufferter Salzlösung, enthaltend Tween 20, Thimerosal, Rinderserumalbumin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) und normales Ziegen-IgG (Organon Teknika-Cappel, Durham, NC), verdünnt, und es wurden 100 μl zu jeweils 2 Wells hinzugefügt. Nach einer Übernacht-Inkubation bei 4 °C wurden die Wells gewaschen und es wurden 100 μl affinitätsgereinigte, peroxidasekonjugierte, polyklonale Anti-rhRLX-Kaninchen-Antikörper zu jedem Well hinzugefügt. Nach einer geeigneten Inkubationsperiode bei Raumtemperatur wurden die Wells erneut gewaschen, und es wurden 100 μl einer Tetramethylbenzidin-Lösung zu jedem Well hinzugefügt. Nach der Farbentwicklung wurde die Reaktion gestoppt, die Extinktion wurde bei 450/630 nm gemessen und die Relaxin-Konzentrationen in den Sera wurden durch Dateneingabe in ein logistisches Vier-Parameter-Kurvenanpassungsprogramm bestimmt. Der Test wurde zur Verwendung mit murinem Serum validiert, zeigt keine detektierbare Kreuzreaktivität mit natürlichem murinem Relaxin und besitzt eine niedrigere Nachweisgrenze bei 20 pg/ml.
  • Herstellung von Arzneimitteln. PAH und IN wurden am Morgen des Experiments unter Verwendung von Ringer-Lösung als Verdünnungsmittel frisch hergestellt. Inulin, charakteristischerweise bei Umgebungstemperatur unlöslich, wurde für die Infusion durch Erhitzen einer 15-ml-Aliquote vorbereitet, und zwar in einem kochenden Wasserbad für eine Zeitspanne von 10 Minuten. Bei Verdünnung in Ringer-Lösung und Mischung mit PAH blieb es während des Experiments in der Lösung. L-NAME (Sigma Chemical, St. Louis, MO) wurde innerhalb einer Stunde vor der Verwendung auch in Ringer-Lösung vorbereitet. ANG II (5-ILE AII oder Hypertensin II; Sigma Chemical, St. Louis, MO) wurde aus einer Stammlösung in 5 % Dextrose hergestellt (100 μg/ml), die in aliquoten Teilen bei -20 °C gefroren war. Endverdünnungen wurden in Ringer-Lösung unmittelbar vor der Infusion hergestellt. Für eine chronische Infusion über eine osmotische Minipumpe wurde rhRLX (Connetics, Palo Alto, CA) aus einer 1,5-mg/ml-Stammlösung in 20 nM Natriumacetat, pH 5,0, hergestellt und dementsprechend im selben Puffer verdünnt, und das lyophilisierte gereinigte Schweine-RLX (Sherwood und O'Byrne, Arch. Biochem. Biophys. 160, 185-196 (1974)) wurde in Ringer-Lösung gelöst. Zur akuten Infusion wurde das lyophilisierte, gereinigte Schweine-RLX täglich unmittelbar vor der Verwendung in Ringer-Lösung, enthaltend 0,01 % Rattenalbumin, hergestellt (Cappel Research Products, Durham, NC).
  • Statistische Analyse. Statistische Analysen wurden im Wesentlichen wie beschrieben durchgeführt. Zar, Biostatistical Analysis, Prentice Hall, NJ (1984). Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die meisten Daten wurden unter Verwendung von Repeated-Messures-Mischmodellen analysiert, wobei die Behandlungsgruppe und die Zeit als festgesetzte Effekte angenommen werden. Falls signifikante Hauptwirkungen oder Wechselwirkungen beobachtet wurden, so wurde der Dunnett-Test verwendet, um die Mittelwerte der kleinsten Quadrate für die Grundlinienwerte mit allen darauf folgenden Zeitpunkten zu vergleichen. Mittelwerte der kleinsten Quadrate für Ratten, denen Vehikel, rekombinantes menschliches und gereinigtes Schweine-RLX verabreicht wurde, wurden unter Verwendung des Scheffe-Verfahrens für mehrfache Vergleiche verglichen. Für Tabelle 5 (siehe unten) wurde eine einfaktorielle Repeated-Measures-ANOVA verwendet, und die Gruppenmittelwerte wurden mittels orthogonaler Kontraste verglichen. Ein p-Wert von < 0,05 wurde als signifikant angesehen.
  • Resultate
  • Chronische Infusion von rhRLX, gereinigtem Schweine-RLX oder Vehikel (1A-D) Die Zeitsteuerungsexperimente unter Verwendung entweder des Vehikels für rhRLX (20 nM Natriumacetat, pH 5,0, n = 2 Ratten) oder des Vehikels für Schweine-RLX (Ringer-Lösung, n = 2 Ratten) zeigten eine relative Stabilität von MAP, GFR, ERPF und ERVR über die Zwei-Wochen- oder eine derartige Untersuchungszeitspanne (p = NS durch ANOVA). Da die mit den zwei verschiedenen Vehikelpräparaten erhaltenen Resultate vergleichbar waren, wurden sie kombiniert. Während die chronische Infusion von gereinigtem Schweine-RLX mit 4 μg/Stunde MAP nicht signifikant veränderte, gab es einen markanten Anstieg bei GFR und ERPF, sowie eine reziproke Reduktion von ERVR sowohl an Tag 2 als auch an Tag 5 der Verabreichung (p < 0,05 bezogen auf Grundlinie und Vehikel). Ähnliche Resultate wurden für rhRLX erhalten, außer dass eine Signifikanz nicht bis zu Tag 5 der Infusion erreicht wurde.
  • Chronische Infusion von rhRLX bei Ratten, die Ovariektomie unterzogen wurden und Ratten, die Sham-Ovariektomie unterzogen wurden (2A-D). Der starke Anstieg bei GFR und ERPF sowie der Rückgang bei ERVR, der an Tag 5 der Relaxin-Infusion beobachtet wurde, waren bei den Ratten, die Ovariektomie unterzogen wurden und den Ratten, die Sham-Ovariektomie unterzogen wurden, vergleichbar (p = NS).
  • Akute Infusion von L-NAME oder ANG II während der chronischen Infusion von gereinigtem Schweine-RLX. Die Nieren-Gefäßerweiterung und die Hyperfiltration bei den relaxinbehandelten Ratten, die an Tag 5 der Infusion beobachtet wurde, wurde durch die NO-Synthase-Inhibierung, wie in Tabelle 1 gezeigt, vollständig aufgehoben. Tabelle 1 zeigt die Wirkung von L-NAME auf den mittleren Arteriendruck (MAP) und die Funktion bei Ratten, die bei Bewusstsein sind, denen Schweine-RLX oder Ringer-Lösung (Vehikel) für eine Zeitspanne von 5 Tagen verabreicht wurde. MAP, GFR, ERPF und ERVR wurden zum Zeitpunkt Null (Grundlinie) und 60, 120, 180 und 240 Minuten nach Verabreichung von L-NAME und entweder RLX oder nur Vehikel gemessen. Die Werte stellen Mittelwerte ± SEM dar. L-NAME (Nω-Nitro-L-Argininmethylester) wurde bei 2 μg/Minute intravenös infundiert, und Relaxin wurde mit 4 μg/Stunde über eine osmotische Minipumpe subkutan verabreicht. In den RLX- und den Vehikel-Gruppen waren 7 bzw. 6 Ratten. Ein Sternchen bezeichnet p < 0,05; das Symbol H bezeichnet p < 0,05 bei RLX bezogen auf Vehikel. Tabelle 1
    Grundlinie 60 min 120 min 180 min 240 min
    MAP
    RLX 120 ± 2 135 ± 5*✝ 136 ± 4*✝ 136 ± 4*✝ 139 ± 4*✝
    Vehikel 117 ± 4 122 ± 4 126 ± 4 129 ± 4* 129 ± 3*
    GFR
    RLX 3050 ± 95✝ 2776 ± 142 2653 ± 207 2498 ± 113* 2392 ± 50*
    Vehikel 2383 ± 72 2419 ± 170 2153 ± 122 2350 ± 63 2250 ± 88
    ERPF
    RLX 10245 ± 260✝ 7520 ± 481* 7030 ± 419* 6530 ± 270* 5973 ± 195*
    Vehikel 7241 ± 350 7301 ± 385 6452 ± 216* 6595 + 507* 6187 ± 317*
    ERVR
    RLX 6,96 ± 0,23✝ 11,00 ± 0,57* 11,87 ± 0,76* 12,92 ± 0,66* 14,13 ± 0,47*
    Vehikel 10,48 ± 0,29 10,53 ± 0,58 12,28 ± 0,58 12,46 ± 0,92 12,64 ± 0,73
  • Um die Möglichkeit zu minimieren, dass die Konvergenz der Nierenfunktion bei den mit Relaxin und Vehikel infundierten Ratten, die durch L-NAME hervorgerufen wurde, lediglich eine Konsequenz einer nicht spezifischen Nieren-Gefäßverengung war, wurde das Paradigma des Experiments unter Verwendung eines anderen gefäßverengenden Stoffes, ANG II, wiederholt. Anstatt einer Konvergenz war bei ERPF und ERVR eine sogar noch stärkere Divergenz während der akuten Infusion von Angiotensin II zu sehen, wie in Tabelle 2 dargestellt wird. Die Werte stellen Mittelwerte ± SEM dar. Relaxin, RLX; Angiotensin II, ANG II. ANG II wurde mit 3 ng/Min. i.v. infundiert, und RLX wurde mit 4 μg/Stunde über eine osmotische Minipumpe s.c. verabreicht. In den RLX- und den Vehikel-Gruppen waren je 5 Ratten. * p < 0,05 bezogen auf Grundlinie; Hp < 0,05 RLX bezogen auf Vehikel. Tabelle 2
    Grundlinie 60 min 120 min 180 min 240 min
    MAP
    RLX 111 ± 3 130 ± 5* 142 ± 4* 143 ± 5* 146 ± 6*
    Vehikel 112 ± 5 131 ± 8 140 ± 9 144 ± 9* 145 ± 9*
    GFR
    RLX 2929 ± 120✝ 2980 ± 219✝ 2653 ± 169✝ 2578 ± 169 2763 ± 155✝
    Vehikel 2252 ± 63 2339 ± 123 2091 ± 127 2297 ± 59 1934 ± 67
    ERPF
    RLX 10364 ± 411✝ 8926 ± 478✝ 9646 ± 772✝ 7738 ± 386*✝ 7698 ± 592*✝
    Vehikel 7213 ± 487 5689 ± 453* 5127 ± 369* 4493 ± 468* 4053 ± 118*
    ERVR
    RLX 6,23 ± 0,41✝ 8,88 ± 0,66*✝ 9,24 ± 1,03*✝ 11,52 ± 0,84*✝ 11,84 ± 1,08*✝
    Vehikel 9,03 ± 0,54 14,07 ± 1,69 16,59 ± 1,76* 20,53 ± 2,31* 21,81 ± 1,56*
  • Daher wurden diese Resultate diametral jenen gegenübergestellt, die unter Verwendung von L-NAME erhalten wurden. L-NAME produziert einen signifikant stärkeren Anstieg bei MAP und ERVR und eine Reduktion bei GRF und ERPF bei den relaxinbehandelten im Vergleich zu den vehikelinfundierten Ratten (p < 0,05 bei ANOVA). Im Gegensatz dazu war der Prozentsatz des Anstiegs bei MAP und die Reduktion von GFR, die durch ANG II hervorgerufen wurde, bei den RLX-behandelten und den vehikelinfundierten Ratten vergleichbar, wohingegen der Prozentsatz des Anstiegs bei ERVR und eine Reduktion in ERPF bei den Ratten, die Relaxin chronisch verabreicht bekommen hatten (p < 0,001 bezogen auf Vehikel durch ANOVA), deutlich abgeschwächt war. Einer anderen Gruppe Ratten, die chronisch mit Schweine-RLX behandelt wurde, wurde Ringer-Lösung anstelle von L-NAME oder ANG II verabreicht, und diese diente daher als Kontrollgruppe. Weder MAP noch ein beliebiger der Nieren-Parameter war während der ungefähr 6 Stunden der Vehikelinfusion durchgehend verändert, wie in Tabelle 3 gezeigt wird. Die Werte stellen Mittelwerte ± SEM dar. Relaxin, RLX. n = 4 Ratten. Ringer-Lösung wurde mit derselben Fließgeschwin digkeit wie L-NAME (Tabelle 1) oder ANG II (Tabelle 2) infundiert, 12,5 μl/Min. RLX wurde mit 4 μg/Stunde über eine osmotische Minipumpe s.c. infundiert. Tabelle 3
    Grundlinie 60 min 120 min 180 min 240 min
    MAP
    RLX 119 ± 2 123 ± 3 121+4 122 ± 4 121 ± 4
    GFR
    RLX 2997 ± 98 3008 ± 243 3086 ± 143 3077 ± 127 3223 ± 121
    ERPF
    RLX 12.927 ± 804 12,630 ± 1140 12,347 ± 1303 12,353 ± 1266 12,090 ± 439
    ERVR
    RLX 5,93 ± 0,35 6,19 ± 0,48 6,40 ± 0,64 6,52 ± 0,68 6,53 ± 0,24
  • Hämatokrit- und Plasma-Osmolalität. Bei den gesunden Rattenweibchen, die chronisch entweder gereinigtes Schweine- oder rhRLX für die Studie der Nierenfunktion erhalten hatten, zeigten sowohl der Hämatokrit als auch die Plasma-Osmolalität signifikante Abnahmen an Tag 2 (p < 0,05). Die Resultate werden in Tabelle 4 gezeigt. Die Daten stellen Mittelwerte ± SEM dar. rhRLX, rekombinantes menschliches Relaxin. RLX wurde mit 4 μg/Stunde über eine osmotische Minipumpe s.c. infundiert. In den Schweine-RLX-, Vehikel- und rhRLX-Gruppen waren zum Zeitpunkt der Grundlinie sowie an Tag 2 und 5 der Behandlung 7, 4 bzw. 5 Ratten. Während der Post-RLX-Zeitspanne wurden in den Schweine-RLX-, Vehikel- und rhRLX-Gruppen 6, 2 und 2 Ratten untersucht. Zwei der Ratten in der Vehikelgruppe erhielten Ringer-Lösung (Vehikel für Schweine-RLX), und zwei erhielten 20 mM Natriumacetat, pH 5,0 (Vehikel für rhRLX). Die Resultate unterschieden sich nicht, und daher wurden die Daten kombiniert. * p < 0,05 bezogen auf Grundlinie; Hp < 0,05 RLX bezogen auf Vehikel. Tabelle 4
    Grundlinie Tag 2 Tag 5 Tage 5-12 nach RLX. Unterschied zwischen Grundlinie und Tag 5
    Hämatokrit (%)
    Schweine-RLX 42 ± 1 39 ± 1* 37 ± 1*✝ 40 ± 1 -4 ± 1✝
    Vehikel 40 ± 3 39 ± 1 40 ± 1 41 +2 ± 3
    rhRLX 39 ± 0 37 ± 1* 37 ± 1*✝ 40 -2 ± 1✝
    Plasma-Osmolalität (mOsm/kg H2O)
    Schiweine-RLX 301 ± 2 289 ± 2*✝ 287 ± 2*✝ 299 ± 2 -14 ± 3✝
    Vehikel 298 ± 3 297 ± 2 299 ± 3 299 0 ± 2
    rhRLX 299 ± 2 291 ± 3*✝ 286 ± 2*✝ 302 -12 ± 2✝
  • Harnausscheidung von cGMP und NOx. Die 24-Std.-Harnausscheidung von cGMP und NOx wurden durch chronische Infusion von Schweine-RLX mit 4 μg/Std. nicht signifikant beeinflusst (p = NS durch ANOVA). Bei denselben Tieren waren die Harn-Natriumausscheidung und die Wasseraufnahme an den Tagen 2 bzw. 5 der Relaxin-Infusion signifikant erhöht (p < 0,05 bezogen auf Grundlinie und Post-RLX). Die Resultate werden in Tabelle 5 dargestellt. Die Daten stellen Mittelwerte ± SEM dar. Relaxin, RLX; NOx, Nitrat + Nitrit; zyklisches Guanosin-3',5'-monophosphat, cGMP. n = 6 Ratten. RLX wurde mit 4 μg/Stunde über eine osmotische Minipumpe s.c. infundiert. * p < 0,05 bezogen auf Grundlinie und Post-RLX. Tabelle 5
    Grundlinie Tag 2 Tag 5 Tage 448 nach RLX
    Nahrungsaufnahme (g) 13,2 ± 1,0 15,5 ± 1,5 16,7 ± 1,0 15,3 ± 0,5
    Wasseraufnahme (ml) 19,1 ± 2,7 20,1 ± 3,4 23,6 ± 3,3* 19,1 ± 2,6
    Harnabgabe (ml/24 Std.) 9,1 ± 1,7 11,4 ± 2,2 8,8 ± 0,9 9,1 ± 1,1
    Harn-Natriumausscheidung μÄqu./24 Std.) 438,8 ± 34,4 800,2 ± 77,2* 477,8 ± 57,9 480,69 ± 54,4
    Harn-cGMP-Ausscheidung (nMol/24 Std.) 32,2 ± 1,9 26,5 ± 2,5 28,6 ± 3,8 32,7 ± 3,8
    Harn-N0X Ausscheidung (μMol/24 Std.). 4,8 ± 0,5 6,0 ± 1,0 5,9 ± 0,7 6,1 ± 0,9
  • Serum-Relaxin. Bei 17 der Ratten maßen die Erfinder die Serumkonzentration des rhRLX, das über eine osmotische Minipumpe 5 Tage lang mit 4 μg/Std. infundiert wurde. Der Mittelwert ± SEM lag bei 28,1 ± 4,8 ng/ml.
  • Beispiel 2: Auswirkung des Geschlechts sowie von Endothelin auf die Nierengefäßerweiterung und durch Relaxin induzierte Hyperfiltration bei Ratten, die bei Bewusstsein waren (nicht Teil der beanspruchten Erfindung)
  • Verfahren
  • Vorbereitung der Tiere. Weibliche und männliche Long-Evans-Ratten im Alter von 10-14 Wochen wurden verwendet. Jene Tiere, die an der University of New Mexico untersucht wurden, wurden von Harlan Sprague-Dawley (Indianapolis, IN) zugekauft und mit PROLAB-RMH-2500-Nahrung gefüttert, die 0,40 % Natrium enthielt (PME Feeds Inc., St. Louis, MO). Die am Magee Women's Research Institute untersuchen Ratten wurden bei Harlan Sprague-Dawley (Frederick, MD) zugekauft und mit PRO-LAB-RMH-2000-Nahrung gefüttert, die 0,48 % Natrium enthielt (PME Feeds Inc., St. Louis, MO). Die Ratten wurden in einem 12-Stunden-Licht-Dunkel-Zyklus gehalten, und zwar in Tierhaltungseinrichtungen, welche die vollständige Zustimmung der Association for Assessment and Accreditation of Laborstory Animal Care erhalten hatten. Alle Experimente erhielten die Zustimmung des Institutional Animal Care and Use Committee der University of New Mexico School of Medicine oder des Magee-Women's Research Institute.
  • Vor der chirurgischen Vorbereitung wurden die Ratten über eine Zeitspanne von 5 Tagen an Plexiglas-Versuchskäfige gewöhnt (Braintree Scientific Co., Braintree, MA). Die ersten beiden Training-Perioden waren kurz – etwa jeweils 1-2 Stunden. Für die letzten drei Abschnitte wurde die Zeit verlängert, um der Dauer der Versuchsvorschriften zu entsprechen. Die Käfige ermöglichten den Ratten das Putzen des Gesichts und der Vorderpfoten, hinderten sie jedoch am Umdrehen, wodurch genau getimte Urinproben abgenommen werden konnten (siehe unten). Ratten, die sich nicht an den Experiment-Käfig gewöhnen konnten, wurden aus der Studie ausgeschlossen (< 5%).
  • Die chirurgischen Verfahren wurden bereits ausführlich beschrieben. Conrad, Kidney Int. 26, 24-29 (1984); Conrad und Colpoys, J. Clin. Invest. 77, 236-245 (1986); Danielson und Conrad, J. Clin. Invest. 96, 482-490 (1995) und Danielson und Conrad, Circ. Res. 79, 1161-1166 (1996). Kurz gesagt wurden die Ratten unter Verwendung von Ketamin (6,0 mg/100 g BW intramuskulär (i.m.)) und Natriumpentobarbital (2,1 mg/100 g BW intraperitoneal (i.p.)) unter Vollnarkose und mittels aseptischer Verfahren mit Tygon-Kathetern (0,015 Zoll ID und 0,030 Zoll CD, Norton Performance Plastics, Akron OH) vorbereitet, wobei diese in die Bauchaorta und in die untere Hohlvene über die Oberschenkelarterie bzw. -vene implantiert wurden. Die Katheter wurden subkutan getunnelt und zwischen den Schulterblättern exteriorisiert. Nachdem sie mit einem 1:1-Gemisch aus Natriumheparin (1000 U/ml) und 50 % Dextrose gefüllt wurden, wurden die Katheter mit Edelstahlstiften verschlossen. Anschließend wurde die Harnblase durch eine abdominale Inzision freigelegt und ein Edelstahlkatheter mit einem Silastic-Überzug mit Flanschen wurde durch eine kleine Inzision an der Basis in die Blase insertiert und mit einer Tabaksbeutelnaht befestigt. Der Blasenkatheter wurde durch Muskelschichten und die Haut der ventralen Bauchwand exteriorisiert und mit einem entfernbaren, silasticüberzogenen Stift verschlossen, der es der Ratte ermöglichte, normal durch die Harnröhre zu urinieren, während sie in ihrem Käfig saß. Nach dem chirurgischen Eingriff wurden die Ratten in ihre Käfige zurückgebracht, und es wurde ihnen während der ersten 2 Erholungstage nach dem chirurgischen Eingriff 5 % Dextrose in Wasser zur zusätzlichen Hydratation und Ernährung bereitgestellt. Es wurde ihnen eine Erholungsperiode von sieben bis 10 Tagen gegeben, während der die Ratten erneut an den Experiment-Käfig gewöhnt wurden.
  • Versuchsvorschrift – männliche Ratten. Nachdem sie im Versuchsäfig platziert worden waren, wurde eine 100-μl-Blutprobe aus dem Arterienkatheter in ein heparinisiertes Röhrchen abgenommen, und zwar zur Messung der Grundlinien-Plasma-Osmolalität, der Natriumkonzentration und des Hämatokrits vor der Verabreichung von Flüssigkeit. Dieser Katheter wurden anschließend an einen Statham-Druckwandler (Gould P23 ID) und einen Gould-Universal-Amplifier zur Messung des mittleren Arteriendrucks (MAP) angeschlossen, der auf einem Gould-5900-Serie-Signalconditioner-Käfig-und-TA11-Schreiber dargestellt wurde. Als nächstes wurde ein Inulin-Bolus (IN, 0,2 ml einer 20-%-Stammlösung/100 g BW) und p-Aminohippurat (PAH, 0,1 ml einer 2-%-Arbeitslösung/ 100 g BW) über einen Zeitraum von 1 Minute in den Venenkatheter gefüllt, gefolgt von einer konstanten Infusion der zwei Reagenzien mit einer Rate von 0,5 mg/Minute pro 100 g BW bzw. 0,1 mg/Minute pro 100 g BW). Die Fließgeschwindigkeit lag bei 19 μl/Minute und wurde mit einer Modell-200-Spritzenpumpe (kd Scientific, Boston MA) bereitgestellt. Schließlich wurde der Stift im Blasenkatheter entfernt, und Letzterer wurde mit einem kurzen Stück eines Polyethylenschlauchs verlängert, um die Abnahme von Harn zu erleichtern.
  • Nach einer Äquilibrierungszeitspanne von 60 Minuten wurden drei 30-Minuten-Urinabnahmen mit Halbierungspunkt-Blutproben erhalten, um die Nieren-Clearance-Werte von IN und PAH zu bestimmen, die Messungen der Glomerulusfiltrationsrate (GFR) bzw. des effektiven Nieren-Blutflusses (ERPF) bereitstellen. Das Verfahren der Harnabnahme hat sich als verlässlich erwiesen. Conrad und Colpoys, J. Clin. Invest. 77, 236-245 (1986); Danielson und Conrad, J. Clin. Invest. 96, 482-490 (1995) und Danielson und Conrad, Circ. Res. 79, 1161-1166 (1996). Tatsächlich lagen die Ausscheidungsraten von IN und PAH nach dem Erreichen des Fließgleichgewichtszustands in dieser Studie bei 91 ± 3 und 100 ± 4 % ihrer jeweiligen Infusionen. Nach dem Messen des mittleren Grundlinien-Arteriendrucks und der Nierenfunktion wurde eine osmotische Minimpumpe (Modell 2ML1, Alza Co., Palo Alto CA), die entweder rekombinantes menschliches Relaxin (rhRLX; n = 12 Ratten) oder Vehikel (n = 7) enthielt, subkutan am Rücken implantiert, und zwar unter Verwendung einer leichten Äther-Narkose. Die Infusionsrate von rhRLX lag bei 4 μg/Stunde, eine Rate, die Serummengen erzeugt, die mit jenen weiblicher Ratten bei halber Trächtigkeit vergleichbar sind, wo der effektive Nieren-Plasmafluss und die Glomerulusfiltrationsrate während der Trächtigkeit dieser Spezies ihr Maximum erreicht haben (siehe Resultate, unten). Fünf Tage später wurden der mittlere Arteriendruck (MAP), die Glome rulusfiltrationsrate (GFR), der effektive Nierenplasmafluss (ERPF) und andere Parameter erneut wie oben beschrieben untersucht. Zu dieser Zeit lagen die Exkretionsraten von IN und PAH bei 91 ± 3 und 98 ± 2 % ihrer jeweiligen Infusionsraten. Am Ende des Experiments wurden 1,0 ml Blut zur Bestimmung des Serum-rhRLX abgenommen.
  • Versuchsvorschrift– weibliche Ratten. Nach der Erholung von den chirurgischen Eingriffen wurde eine osmotische Minipumpe (Modell 2ML1, Alza Co., Palo Alto, CA), die entweder rekombinantes menschliches Relaxin (rhRLX; n = 9 Ratten) oder Vehikel (n = 8) enthielt, subkutan am Rücken implantiert, und zwar unter Verwendung einer leichten Äther-Narkose. Die Infusionsrate von rhRLX lag bei 4 μg/Stunde. An Tag 5 der rhRLX- oder der Vehikel-Verabreichung wurden Experimente durchgeführt. MAP und die Nierenfunktion wurden wie oben beschrieben gemessen.
  • Nach einer Äquilibrierungszeitspanne von 60 Minuten wurden drei 30-Minuten-Urinabnahmen mit Halbierungspunkt-Blutproben erhalten, um die Grundlinien-Nieren-Clearance-Werte von IN und PAH zu bestimmen. Das Verfahren der Harnabnahme erwies sich erneut als verlässlich. Nach dem Erreichen des Fließgleichgewichtszustands lagen die Ausscheidungsgeschwindigkeiten von IN und PAH der Grundlinie bei 99 ± 3 und 100 ± 2 % ihrer jeweiligen Infusionen bei jenen Ratten, denen rhRLX verabreicht wurde, und bei 100 ± 2 und 99 ± 2 % bei jenen, denen das Vehikel verabreicht wurde. Nach der Bestimmung des Grundlinien-MAP und der Nierenfunktion wurde mit einer Infusion von RES-701-1, einem selektiven Endothelin-Typ-B-(ETB)-Rezeptor-Antagonisten (Conrad et al., Am. J. Physiol. 272, F767-F776 (1999); und Tanaka et al., Mol. Pharmacol. 45, 724-730 (1994)), begonnen, und zwar mit einer Rate von 10 μg/Minute (Durchflussgeschwindigkeit von 12 μg/Minute) durch den Venenkatheter. Als nächstes wurden sechs 40-Minuten-Nieren-Clearance-Werte durch eine Infusion des RES-701-1 erhalten. Die durchschnittlichen Wiederfindungsraten waren sowohl bei IN als auch bei PAH im Urin mit den oben beschriebenen vergleichbar, d.h. > 95 % der Infusionsraten. Am Ende des Experiments wurde 1,0 ml Blut zur Bestimmung des Serum-rhRLX abgenommen.
  • Bei drei zusätzlichen Ratten, die jeweils rhRLX oder Vehikel verabreicht bekommen hatten, wurden, wie oben beschrieben, identische Versuchsvorgänge angewandt, mit Ausnahme, dass das Vehikel für RES-701-1 anstelle von RES-701-1 infundiert wurde.
  • Analyseverfahren. Die Inulinkonzentration im Plasma und im Urin wurde durch das Anthronverfahren gemessen, und PAH wurde durch das von Smith modifizierte Verfahren von Bratton und Marshall bestimmt. Dieses Verfahren wird von Conrad, Kidney Int. 26, 24-29 (1984), und in den darin zitierten Verweisen beschrieben. Plasma-Natrium wurde mit einem Kodak-Ektachem-Instrument (Rochester, NY) gemessen. Die Plasma-Osmolalität wurde mittels Gefrierpunktserniedrigung (Advanced Osmometer, Modell 3MO, Advanced Instruments, Needham Heights MA) bestimmt. Alle Urin- und Plasma-Proben von MWRI wurden kodiert und zur Analyse von IN, PAH, Natrium und Osmolalität (durch L.A.D.) an UNM gesendet. Das rhRLX im Serum wurde unter Verwendung eines quantitativen Sandwich-Immuntests, erneut auf Blind-Test-Art, gemessen. Danielson et al., J. Clin. Invest. 103, 525-533 (1999).
  • Herstellung von Arzneimitteln. PAH (p-Aminohippurat) (Merck und Co., Inc., West Point, PA) und IN (Inulin) (Cypros Pharmaceutical Corp., Carlsbad, CA) wurden am Morgen des Experiments unter Verwendung von Ringer-Lösung als Verdünnungsmittel hergestellt. IN, charakteristischerweise bei Raumtemperatur unlöslich, wurde zur Infusion durch Erhitzen der Stamm-Aliquoten in einem kochenden Wasserbad für eine Zeitspanne von 5-10 Minuten vorbereitet, bis es sich gelöst hatte. Sobald es gelöst und mit PAH und Ringer-Lösung vermischt war, blieb IN während des Experiments in Lösung. Das rhRLX lag in einer Konzentration von 1,5 mg/ml in 20 mM Natriumacetat (pH 5,0) vor. Das rhRLX wurde mit zusätzlichen 20 mM Natriumacetat zur Instillation in die osmotischen Minipumpen verdünnt, oder der 20-mM-Natriumacetatpuffer wurde alleine als Vehikel verabreicht. Die Durchflussgeschwindigkeit der osmotischen Minipumpen lag bei etwa 10 μl/Stunde. Der ET-Rezeptor-Antagonist RES-701-1 – ein selektiver ETB-Rezeptor-Subtyp-Antagonist, der aus der Nährlösung von Streptomyces sp. gereinigt wurde – wurde bei 37 °C in einer verdünnten 0,02-%- Natriumcarbonatlösung, enthaltend 5 % Dextrose, hergestellt. Conrad et al., Am. J. Physiol. 272, F767-F776 (1999); und Tanaka et al., Mol. Pharmacol. 45, 724-730 (1994).
  • Statistische Analyse. Es gab eine Gesamtanzahl von 12 männlichen Ratten, denen rhRLX verabreicht wurde, und 7, denen das Vehikel verabreicht wurde. Fünf der Ratten, die rhRLX erhielten, und 3, die das Vehikel erhielten, wurden in einem Labor unabhängig von den übrigen Ratten in den zwei Gruppen untersucht, die von einer zweiten Laborgruppe untersucht wurden. Die Daten, die von den zwei Laboratorien erhalten wurden, waren vergleichbar und wurden daher kombiniert. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Von MAP und der Nierenfunktion, gemessen während der drei Nieren-Clearance-Perioden, wurde für jedes Experiment ein Durchschnittswert errechnet. Die an der Grundlinie und nach 5 Tagen rhRLX- oder Vehikel-Infusion erhaltenen Resultate wurden durch gepaarten t-Tests verglichen (3A-D). In Tabelle 6 verwendeten die Erfinder gepaarte t-Tests. Ein p-Wert von < 0,05 wurde als signifikant angenommen.
  • Es gab eine Gesamtanzahl von 11 weiblichen Ratten, denen rhRLX verabreicht wurde, und 10, denen das Vehikel verabreicht wurde. Fünf in jeder Gruppe wurden in einem Labor untersucht; die übrigen Ratten in den zwei Gruppen wurden in einem zweiten Labor untersucht. Die Daten, die von den zwei Laboratorien erhalten wurden, waren vergleichbar und wurden daher kombiniert. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Von MAP und der Nierenfunktion, gemessen während der drei Grundlinien-Nieren-Clearance-Perioden, wurde ein Durchschnittswert errechnet. Für die aus den 6 Nieren-Clearance-Perioden während der Infusion von RES-701-1 oder seines Vehikels erhaltenen Daten wurde ebenso ein Durchschnittswert errechnet. Es wurde die zweifaktorielle Repeated-Messures-Analyse der Varianz verwendet, um die in 4A-D dargestellten Daten zu analysieren. Wurden signifikante Hauptwirkungen oder Wechselwirkungen beobachtet, so wurden die Gruppen-Mittelwerte durch das Verfahren der Kontraste verglichen (SuperANOVA, Abacus Con cepts, Inc., Berkeley, CA). In Tabelle 7 verwendeten die Erfinder nicht gepaarte t-Tests. Ein p-Wert von < 0,05 wurde erneut als signifikant angenommen.
  • Resultate
  • Männliche Ratten. Die Resultate für MAP und die Nierenfunktion werden in den 3A-D dargestellt. Die chronische Verabreichung von rhRLX beeinflusste MAP nicht signifikant. Im Gegensatz dazu führte das Hormon zu einem signifikanten Anstieg von sowohl GFR als auch ERPF, während es den effektiven Nieren-Gefäßwiderstand (ERVR) reduzierte. Die Vehikel-Zeitsteuerungsstudien zeigten eine Stabilität sowohl von MAP als auch der Nierenfunktion. Tabelle 6
    Rattengruppe HCT(%) Posm (mOsm/kg H2O) PNa+ (mÄqu./l)
    Vehikel (n = 7 Ratten) -1,8 ± 1,3 0,9 ± 1,4 0,6 ± 0,7
    rhRLX (n = 11 Ratten) -5,0 ± 0,6* -10,9 ± 1,4* -5,3 ± 0,4*
  • Tabelle 6 zeigt die Daten für Hämatokrit, Plasma-Osmolalität und die Natriumkonzentration. Die dargestellten Werte sind: HCT, Hämatokrit; Posm, Plasma-Osmolalität; PNa+, Plasma-Natriumkonzentration. Die Daten stellen die Abweichung von der Grundlinie dar und werden als Mittelwerte ± SEM angegeben. Werte, die mit einem Stern markiert sind, geben p < 0,05 an. Diese Variablen waren in den Vehikel-Zeitsteuerungs-Experimenten relativ konstant. Bei jenen Ratten, die jedoch rhRLX 5 Tage lang erhielten, gab es einen signifikanten Rückgang bei allen drei Parametern.
  • Relaxin war bei keiner der Ratten, denen Vehikel verabreicht wurde (n = 7) detektierbar. Bei jenen, denen rhRLX verabreicht wurde, lag die durchschnittliche Konzentration bei 12,3 ± 0,7 ng/ml (n = 12).
  • Weibliche Ratten. 4A-D zeigen die Resultate unter Verwendung des spezifischen ETB-Rezeptor-Antagonisten, RES-701-1. Bei der Grundlinie waren sowohl GFR als auch ERPF signifikant erhöht, und ERVR war auf reziproke Art und Weise bei jenen Ratten, denen rhRLX 5 Tage lang verabreicht wurde, im Vergleich zur Vehikelinfusion um 20-30 % reduziert. Der MAP war nicht signifikant beeinflusst.
  • Die Verabreichung von RES-701-1 hatte keine signifikante Wirkung auf MAP und die Nierenfunktion bei den vehikelbehandelten Ratten, obwohl ERVR zu einer Erhöhung tendierte. Im Gegensatz dazu reduzierte RES-701-1 sowohl GFR als auch ERPF und erhöhte MAP und ERVR bei den mit rhRLX behandelten Ratten (alle p < 0,05 bezogen auf Grundlinie). Während der Infusion des ETB-Rezeptor-Antagonisten konvergierten GFR, ERPF und ERVR in den zwei Rattengruppen am Ende der zweiten Nieren-Clearance-Periode. Tabelle 7
    MAP MAP GFR GFR ERPF ERPF ERVR ERVR
    B V B V B V B V
    Vehikel n = 3 Ratten 113 ± 4 113 ± 6 2189 ± 108 2308 ± 26 6550 ± 206 7885 ± 668 10,36 ± 0,54 9,47 ± 0,70
    rhRLX n = 3 Ratten 112 ± 7 115 ± 8 3082 ± 31* 3112 ± 138* 11220 ± 138* 10464 ± 382* 6,67 ± 0,56* 6,97 ± 0,62*
  • Tabelle 7 zeigt die Daten der rhRLX- oder vehikelbehandelten Ratten, denen das Vehikel für RES-701-1 anstatt des Antagonisten verabreicht wurde (Zeitsteuerung). Die Werte werden als Mittelwerte ± SEM angegeben. B, Grundlinie; V, Vehikel für RES-701-1. * p < 0,05 rhRLX bezogen auf Vehikel (für rhRLX). An der Grundlinie waren GFR und ERPF erhöht, und ERVR war bei den Ratten, denen rhRLX 5 Tage lang verabreicht wurde, im Vergleich zu den Grundlinienwerten, die bei den Ratten beobachtet wurden, die das Vehikel anstatt rhRLX erhielten (alle p < 0,05), reduziert. Diese Unterschiede wurden während der Verabreichung des Vehikels für RES-701-1 beibehalten und zeigten eine Stabilität der Nierenfunktion während der 240-Minuten-Infusionsperiode.
  • An Tag 5 der rhRLX-Verabreichung lag die mittlere Serumkonzentration bei 16,6 ± 1,5 ng/ml. Serum-rhRLX wurde bei keiner der Ratten detektiert, denen das Vehikel anstatt rhRLX verabreicht wurde, außer (unerklärlicherweise) bei einem Tier mit einem Wert von 0,84 ng/ml.
  • Beispiel 3: Systemische Relaxin-Verabreichung stimuliert die angiogene/gefäßerweiternde Zytokin-Expression und die Gefäßbildung in einem Ratten-Myokardinfarkt-Modell (nicht Teil der beanspruchten Erfindung)
  • Es wurden weibliche Sprague-Dawley-Ratten, etwa 12 Wochen alt, verwendet. Die Ratten wurden durch intraperitoneale (i.p.) Injektion mit bis zu 1 ml/kg Ketamin/Medetomidin (6:4) anästhetisiert. Nach der Exteriorisierung des Herzens wurde die linke Koronararterie in der Nähe ihres Ursprungs mit einer Seidennaht abgebunden. Bei Kontrolltieren mit Sham-Eingriffen wurde die Naht oberflächlich in den Muskel platziert, der neben der Koronararterie liegt. EKGs nach dem Schließen wurden auf die S-T-Segment-Erhöhung bei LCAL-Tieren beobachtet, um das Resultat der Ligation zu bestätigen. Unmittelbar nach dem chirurgischen Eingriff am Herzen wurde eine geprimte osmotische Minipumpe, die Relaxin oder Vehikel enthielt (20 mM Acetat, pH 5,0), aspetisch in eine subkutane (s.c.) Tasche auf der dorsalen interskapulären Region implantiert. Das Vehikel oder Relaxin (0,1 mg/kg/Tag) wurde als kontinuierliche s.c.-Infusion 7 oder 21 Tage lang angeliefert, und zwar entweder an Sham- oder LCAL-Ratten. Die Tiere wurden an Tag 7 oder 21 getötet und die Periinfarkt-Regionen vor der Narbe im linken Ventrikel oder äquivalente Stellen bei Sham-Eingriff-Tieren wurden entnommen.
  • Das Linke-Koronarartieren-Ligations-(LCAL-) Modell myokardialer Ischämie bei Ratten (Selye et al., Angiology 11, 398-407 (1960)) führte zu einem tiefgehenden akuten Schaden, der bis zu 50 % der linken freien Ventrikelwand umfasste. Nach der systemischen Relaxin-Behandlung unter Verwendung von rhRLX wurde Gewebe-RNA an den Tagen 7 und 21 nach dem Infarkt auf anhaltende Veränderungen bezüglich VEGF und bFGF untersucht. Zellen in den unmittelbaren Randbereichen, die den Infarkt umgeben, wurden getestet, um die angiogene Zytokin-Expression unter Ver wendung der quantitativen RT-PCR-Analyse zu untersuchen. Oligonucleotid-Primer und TaqMan-Sonden, gezeigt in Tabelle 8, wurden von BioSource International Inc. (Camarillo, CA) oder PE Applied Biosystems zugekauft zur Verwendung mit dem ABI-Prism7-7700-Sequenzdetektionssystem (quantitative PCR) (PE Applied Biosystems). Tabelle 8
    Figure 00430001
  • Oligonucleotide wurden für Ratten- oder menschlichen bFGF, menschliche VEGF-165-Aminosäuren- oder 121-Aminosäuren-Isoformen und ihre jeweiligen Ratten-Homologe kreiert (VEGF164 und VEGF120) sowie für menschlichen HGF (zur Verwendung mit dem PE-Applied-Biosystems-"GeneAmp-PCR-System 9600"). Ratten- und menschliche GAPDH-Primer und -Sonden wurden von BioSource International Inc. bzw. PE Applied Biosystems zugekauft. Gewebeproben und Monoschicht-Zellen wurden in RNA-STAT-60 suspendiert (Tel-Test, Inc., Friendswood, TX) und den Angaben des Verkäufers gemäß verarbeitet. Die Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) wurde entweder unter Verwendung von Ratten- oder menschlicher Gesamt-RNA als Matrize durchgeführt. 150 ng der Gesamt-RNA wurden zur Analyse der VEGF-, bFGF- und HGF-mRNA-Expression verwendet; 10 ng der Gesamt-RNA wurden zur GAPDH-mRNA-Expression verwendet. Reagenzien für die Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) wurden von PE Biosystems (Foster City, CA) zugekauft.
  • Die Resultate werden in 5 gezeigt. RNA wurde aus den Periinfarkt-Regionen von Rattenherzen nach LCAL oder einem analogen Bereich von Sham-Herzen extrahiert. Die Tiere wurden entweder mit Vehikel oder mit Relaxin (0,1 mg/kg/Tag) behandelt, und zwar entweder 7 Tage oder 21 Tage vor ihrer Tötung. Primer/Sonden-Sets wurden verwendet, um ein RT-PCR-Produkt zu erzeugen, das für den Ratten-VEGF 164aa-(-Aminosäuren-) und 120aa-Isoformen sowie für Ratten bFGF spezifisch ist. VEGF- und bFGF-Expressionsmengen werden im Verhältnis zu den GAPDH-Transkriptmengen graphisch dargestellt. Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM angegeben, worin n = 3 pro Behandlungsgruppe ist; + gibt signifikante Unterschiede zu Sham an; * p < 0,05 bezogen auf vehikelbehandelte Infarktgruppe; 1 p < 0,05 bezogen auf Shams, und zwar durch den Student-Newman-Keuls-Test.
  • Diese Resultate zeigen, dass die mRNA-Mengen von sowohl VEGF120 als auch bFGF in den Infarkträndern bei Tieren 7 Tage nach dem Infarkt signifikant (p < 0,05) erhöht waren im Vergleich zu einem analogen Bereich aus Herzen, die einem Sham-Eingriff unterzogen wurden. An Tag 21 blieben die VEGF120- und die bFGF-mRNA-Mengen in den Periinfarktbereichen im Vergleich zu den Shams erhöht (p < 0,05).
  • Unerwarteterweise unterschied sich die Menge der VEGF164-mRNA-Expression aus Periinfarktgewebe nicht signifikant von der Sham-Gruppe, und zwar zu keinem der Zeitpunkte. Absolute Grundwerte der VEGF164-mRNA-Transkripte waren, pro Mikrogramm Gesamt-RNA, etwa 10fach höher als jene von entweder der VEGF120-Isoform oder jene von bFGF bei Herzen, die einem chirurgischen Sham-Eingriff unterzogen wurden.
  • Die systemische Relaxin-Verabreichung an Tiere mit einem Infarkt führte zu einer signifikanten 2fachen Zunahme der Periinfarkt-bFGF-Expression, und zwar sowohl an den Tagen 7 als auch 21 im Vergleich zu den Herzen mit einem Infarkt, die mit Vehikel behandelt wurden (p < 0,05). An Tag 7 wurden keine Veränderungen der relativen Expression der beiden VEG-Isoformen in den Periinfarktregionen nach der Relaxinbehandlung im Vergleich zu den mit Vehikel behandelten Herzen beobachtet. An Tag 21 jedoch zeigten relative Mengen der VEGF164- und der VEGF120-Transkripte bei den relaxinbehandelten Herzen eine Tendenz zu einem Anstieg im Vergleich zu den vehikelbehandelten Herzen. Die Relaxinverabreichung an Tiere, die einem Sham-Eingriff unterzogen wurden, zeigte keine Auswirkung auf die VEGF- oder die bFGF-mRNA-Expression.
  • Eine immunhistochemische Analyse des Periinfarktbereichs des Herzens wurde wie folgt durchgeführt. Es wurden Schnitte von in Paraffin eingebetteten Herzen in 3 Ebenen erhalten. Die Schnitte wurden mit H&E gefärbt, um die Neovaskularisierung zu untersuchen. Objektträger der Herzschnitte wurden in Xylol entparaffiniert und mit Ethanol gewaschen. Die Objektträger wurden anschließend in sterilem, zweimal destilliertem Wasser gespült, bevor mit der Antigen-Gewinnung fortgefahren wurde, wie vom Antikörper-Verkäufer vorgeschlagen wurde (Biogenex). Die Schnitte wurden 30 Minuten lang in 1,5-%igem normalem Ziegen-Blockierungsserum (Biogenex, San Ramon, CA) inkubiert und drei Mal 5 Minuten lang jeweils mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die Schnitte vor dem Waschen mit PBS mit einem monoklonalen Antikörper gegen VEGF (VEGF-C1) oder einem polyklonalen Antikörper gegen bFGF (FGF-2-147) (beide mit 5 μg/ml) inkubiert. Primäre und sekundäre Anti-Ziegen- oder Anti-Kaninchen-Antikörper wurden von Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) zugekauft. Die Schnitte wurden anschließend in Multilink, einem biotinylierten Ziegen-Anti-Immunglobulin zur Verwendung mit Maus-, Kaninchen-, Meerschweinchen- und Ratten-Primär-Antikörpern (Biogenex), 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von zweimaligem Waschen von jeweils 10 Minuten mit PBS. Die Schnitte wurden mit peroxidasekonjugiertem Streptavidin 20 Minuten lang markiert, bevor sie schlussendlich zweimal 5 Minuten lang mit PBS gewaschen und luftgetrocknet wurden. Die Tiere wurden entweder 7 oder 21 Tage lang vor der Tötung entweder mit Vehikel oder mit Relaxin (0,1 mg/kg/Tag) behandelt. Die Schnitte wurden entlang einer Achse erhalten, die in der Mitte zwischen der Apex und dem unteren Teil des Herzens lag. Die Schnitte wurden anschließend mit einem Antikörper gegen Ratten-bFGF gefärbt.
  • Die Resultate zeigen, dass bFGF als diffuse Färbung der Cardiomyozyten bei jenen Herzen detektierbar war, die einem Sham-Eingriff unterzogen wurden. Nach dem Infarkt war die bFGF-Färbung in den Periinfarktregionen intensiviert, und zwar sowohl an Tag 7 als auch an Tag 21. Nach der Relaxinbehandlung war die bFGF-Färbung an den Infarkt-Rändern intensiviert. Bei einer Blind-Bewertung zeigten relaxinbehandelte Herzen sowohl nach 7 als auch nach 21 Tagen eine intensivere Periinfarkt-bFGF-Färbung als vehikelbehandelte Herzen, wobei die maximale Färbungsintensität an Tag 7 nach der Behandlung mit Relaxin auftrat. Sowohl Cardiomyozyten, die durch Co-Lokalisierung mit Desmin identifiziert wurden, als auch Fibroblasten, gefärbt mit Vimentin, zeigten eine verstärkte bFGF-Expression.
  • Schnitte des linken Ventrikels von Ratten, die einem Sham-Eingriff unterzogen wurden, zeigten eine homogene diffuse Färbung für das VEGF-Protein in Cardiomyozyten, ähnlich der Färbung für bFGF. Nach dem Infarkt kam es zu einer intensiven VEGF-Färbung in den Periinfarktregionen an den Tagen 7 und 21, und zwar sowohl bei Myozyten als auch bei Fibroblasten. Es wurden keine Unterschiede in der Intensität der VEGF-Färbung zwischen den relaxin- und den vehikelbehandelten Herzen durch dieses Verfahren detektiert.
  • Die Anzahl der Venolen, Arteriolen und Kapillaren in den Infarkt- und Periinfarkt-Bereichen des linken Ventrikels wurde durch Zählen einzelner Gefäße mit H-&-E-(Hämatoxylin-und-Eosin-) gefärbten Schnitten bestimmt. Die Anzahl der Venolen, Arteriolen und Kapillaren wurde durch Zählen im Bereich des Infarkts bestimmt sowie in den linken und rechten Übergangsflächen zwischen der vom Infarkt betroffenen freien Wand und dem lebensfähigen Myocardium. Die Quantifizierung der Venolen und Arteriolen wurde als Gesamtanzahl an Gefäßen im gesamten Bereich in jedem von 3 H-&-E-gefärbten Querschnitten des Herzens erhalten, d.h. apikal, basal und in der Mitte zwischen den apikalen und basalen Ebenen. Die Quantifizierung wurde von einem Histopathologen durchgeführt, und zwar im Rahmen eines Blindversuchs der Behandlungsgruppen. Die Venolen umfassten die beobachteten Zunahme der Anzahl an kollateralen Gefäßen nach dem Infarkt. Alle Venen, die in sehr trockenen Gebieten gezählt wurden, wurden summiert, um die Gefäßanzahl pro Ebene zu ergeben. Drei Ebenen (apikal, basal und in der Mitte liegend) wurden für jedes Tier summiert, um die Gesamtanzahl an Venen zu ergeben. N = 4-5 Tiere pro Behandlungsgruppe. Die systemische Relaxinverabreichung war mit einer Zunahme der Anzahl an Venolen assoziiert, die an Tag 7 von 113 ± 28 in der Infarktregion in der Acetatgruppe bis 163 ± 8 in der ähnlichen Region in der Relaxingruppe vorhanden war. Diese Zunahme war an Tag 21 (p < 0,05) signifikant, da die Gefäßanzahl von 156 ± 15 in der Acetatgruppe auf 209 ± 13 in der Relaxingruppe anstieg. Relaxinverabreichung änderte die Anzahl der Gefäße in einem analogen Bereich des linken Ventrikels nach einem Sham-Eingriff nicht.
  • Um die Reaktion der Herzzellen auf Relaxin näher zu charakterisieren, wurden Primärkulturen menschlicher fötaler Herzzellen auf die Fähigkeit, 32P-Relaxin zu binden, untersucht. Menschliche Primär-Herzzellen wurden von Clonetics-BioWhittaker (San Diego, CA) zugekauft. Die Zellen stammten von zwei 19 Wochen alten und einem 20 Wochen alten männlichen Fötus. Die Zellen wurden in Smooth Muscle Basal Medium (SmBM), ergänzt mit bFGF, EGF, Insulin, Gentamycin, Amphoteracin B und 5 % Fötalem Kälberserum, gezüchtet, wie vom Verkäufer vorgeschrieben (Medien und Ergänzungen von Clonetics), und zwar bei 37 °C, 5 % CO2. Herzzellen wurden in 35- mm-Wells geimpft, und zwar mit 2,5 × 105 Zellen pro Well 24 Stunden vor dem kompetitiven Bindungstest. Anschließend wurde die vollständige und die spezifische Bindung gemessen. Der Prozentsatz der spezifischen Bindung wurde als (vollständige Bindung – unspezifische Bindung) ÷ (vollständige Bindung) × 100 berechnet. Menschliche fötale Herzzellen (erhalten von drei Spendern, 19 bis 20 Wochen alt) in Kultur wurden mit 100 μM 32P-markiertem Relaxin 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit oder ohne 1000fachen Überschuss an unmarkiertem Relaxin behandelt. Die Bindung an neonatale Ratten-Herzzellen wird zum Vergleich bereitgestellt. Jede Spenderkultur wurde dreifach untersucht. Speziell wurde eine verdrängbare Bindung im Bereich von 40 % bis 55 % bei menschlichen Herzzellen von mehreren fötalen Spendern (19 und 20 Wochen Gestationalalter) gezeigt. Die Färbung der Monoschicht der fötalen Herzzellen zeigte eine Färbung von 100 % für Vimentin. Etwa 10-20 % der Zellen wurden sowohl mit Desmin als auch mit Vimentin gefärbt, was auf den Erwerb eines differenzierten myocytenartigen Phänotyps bei einem Teil der Zellen hindeutete.
  • Um zu bestimmen, ob die Wirkungen von Relaxin, die bei den Ratten beobachtet wurden, auch bei menschlichen Zellen festzustellen waren, wurde Gesamt-RNA aus Herzzellen nach Behandlung von Zellen mit 1, 10 und 100 ng/ml Relaxin über eine Zeitspanne von 24 Stunden extrahiert. Die Resultate sind in 6 dargestellt. Menschliche Herzzellen wurden 24 Stunden lang entweder ohne oder mit Relaxin behandelt (1-100 ng/ml). Unbehandelte Zellen wurden für dieselbe 24-Stunden-Periode unter hypoxischen (2 % O2) Bedingungen inkubiert. Unter Verwendung von 150 ng der vollständigen RNA für menschliche VEGF- und bFGF-Transkripte und 10 ng der vollständigen RNA für GAPDH-Transkripte wurden Primer/Sonden-Sets verwendet, um RT-PCR-Produkte für menschliche VEGF-165aa- und -121aa-Isoformen und menschliches bFGF zu erzeugen. Die Daten wurden unter Verwendung der Sequence-Detector-v1.6.3-Software analysiert (Applied Biosystems/PE). Die VEGF- und bFGF-Expressionsmengen werden im Verhältnis zu den GAPDH-Transkriptmengen graphisch dargestellt. Die Daten werden als Mittelwerte ± SEM angegeben, wobei n = 3 pro Behandlungsgruppe ist; * p < 0,05; Student-Newman-Keuls-Test. Relaxin induzierte dosisabhängige Zunahmen der Expression der Transkripte von VEGF165, VEGF121 und bFGF, wie in 6 dargestellt. VEGF165- und VEGF121-mRNA zeigte maximale 2,3fache und 3fache Steigerungen der Expression gegenüber unbehandelten Kontrollen bei 100 ng/ml Dosen an Relaxin (p < 0,05). bFGF-Expression zeigte bei 100 ng/ml Dosis (p < 0,05) ebenso eine dosisabhängige Zunahme, die ein Maximum erreichte, das 2,2fach über der Grundlinie lag. Die absoluten Grundlinienwerte der bFGF-mRNA-Transkripte, die von diesen Zellen exprimiert wurden, waren etwa 2fach höher als jene von sowohl den VEGF121- oder den VEGF165-Isoformen. Gesamt-RNA aus Zellen, die unter hypoxischen Bedingungen inkubiert wurden, wurde als positive Kontrolle für die Stimulierung der VEGF-Isoformen analysiert. Wie prognostiziert, stiegen die mRNA-Transkriptmengen für beide VEGF-Isoformen nach 24 Stunden Hypoxie, wie in 6 dargestellt, um 220 % über die Werte der unbehandelten Kontrolle an. Die bFGF-Expression wurde nicht durch Hypoxie induziert. Die Transkripte für menschlichen HGF, einen anderen starken angiogenen Faktor (Morishita et al., Hypertension 33, 1379-1384 (1999)), zeigten keinen Unterschied bei der Expression zwischen unbehandelten und relaxinbehandelten Zellen. Relaxin hatte keine Wirkung auf die Zellproliferation, wie anhand der 3H-Thymidin-Aufnahme untersucht wurde, auf die zelluläre Morphologie oder auf Desmin- oder Vimentinfärbungsmuster.
  • In Einklang mit RT-PCR-Daten stimulierte Relaxin eine kleine, jedoch signifikante dosisbezogene Zunahme der Mengen an VEGF-Protein, die von menschlichen Herzzellen sekretiert wurden. Die Zellen wurden in 35-mm-Wells mit 2,5 × 105 Zellen pro Well beimpft, und zwar 24 Stunden vor der Behandlung mit Relaxin. Die Zellen wurden zwei Mal mit SmBM gewaschen (keine Ergänzungen) und 2 Stunden lang mit SmBM-Behandlungsmedium (enthaltend 400 pg/ml bFGF, Gentamycin, Amphoteracin B und 2 % fötales Kälberserum) bei 37 °C, 5 % CO2, inkubiert. Anschließend wurde das Medium mit SmBM-Behandlungsmedium ohne Relaxin oder mit Konzentrationen von Relaxin von 0,1 ng/ml bis 100 ng/ml ersetzt. Anschließend wurden die Zellen 24 Stunden-lang (37 °C, 5 % CO2) inkubiert. Relaxin stimulierte in allen Dosen signifikante dosisbezogene Zunahmen der VEGF-Sekretion, wobei die maximale Induktion bei der 100-ng/ml-Dosis bei 155 % über den Kontrollwerten lag.
  • Menschliche Herzzellenkulturen, unbehandelt oder 24 Stunden mit 1, 10 und 100 ng/ml Relaxin behandelt, wurden mittels Immunzytochemie auf VEGF- und die bFGF-Proteinexpression analysiert. Menschliche Herzzellen wurden in Zwei-Kammer-Objektträgern mit 150.000 Zellen pro Kammer beimpft, und zwar 24 Stunden vor der Behandlung mit Relaxin. Die Zellen wurden ohne oder mit 10 oder 100 ng/ml Relaxin 24 Stunden lang inkubiert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und mit darauf folgender Behandlung mit 4 % Paraformaldehyd 10 Minuten lang, mit eiskaltem Aceton 1 Minute lang und mit eiskaltem Methanol 1 Minute lang fixiert vor dem Lufttrocknen. Anschließend wurden die Objektträger, wie für die Rattenherz-Schnitte beschrieben, verarbeitet, und zwar mit der zusätzlichen Verwendung monoklonaler Antikörper gegen Vimentin oder Desmin (Santa Cruz Biotechnology). Zellen, die auf die bFGF-Expression analysiert wurden, wurden unter Verwendung der Vorschriften des Vector-Laborstories-"Vectastain-Elite-ABC"-Sets (Vector Labs.) gefärbt, wobei die einzige Abweichung von der Standard-Arbeitsvorschrift ein 1-Stunden- anstatt eines 30-Minuten-Primär-Antikörper-Schritts war. Unbehandelte Zellen wurden diffus und gleichmäßig auf bFGF gefärbt. Beinahe 100 % aller Zellen wiesen bei der bFGF-Expression nach der Behandlung mit 10 und 100 ng/ml Relaxin für eine Zeitspanne von 24 Stunden eine intensivere Färbung auf.
  • Beispiel 4: Systemische Verabreichung von rhRLX stimuliert die ischämische Wundheilung bei Ratten (nicht Teil der beanspruchten Erfindung)
  • Die Wirkung von rhRLX auf die normale und die ischämische Wundheilung in den zwei Rattenmodellen der dermalen Wundheilung wurde evaluiert. RhRLX in Vehikel oder das Vehikel alleine wurden durch subkutane Infusion an Sprague-Dawley-Ratten verabreicht, und zwar unter Verwendung einer implantierten osmotischen ALZET7-Pumpe (Alza Corp., Mountain View, CA).
  • Im ersten Modell wurden Hunt-Schilling-Wundkammern subkutan entweder an der Schulter- oder der Hüftregion implantiert. Die Flüssigkeit und die Zellen, die in jeder Wundkammer enthalten waren, wurden an Tag 18 zur Analyse des VEGF-Proteins und der mRNA gesammelt. Das VEGF-Protein wurde detektiert und unter Verwen dung von ELISA gemessen. Für VEGF kodierende mRNA wurde unter Verwendung von Northern Blotting und RT-PCR detektiert. Das Granulationsgewebe innerhalb der Wundkammern wurde zur histologischen und immunhistochemischen Evaluierung gesammelt.
  • Im zweiten Modell wurde eine standardisierte, ischämische, H-förmige doppellappige Wunde in der Rückenregion erzeugt. Der Bereich der Oberflächen-Nekrose wurde an Tag 14 und Tag 21 gemessen.
  • Im Wundkammer-Modell kam es bei VEGF- und bFGF-mRNA zu Zunahmen um 31 % bzw. 59 % bei den rhRLX-behandelten Ratten im Vergleich zu den vehikelbehandelten Ratten, sowohl in der Schulter- als auch in der Hüftregion. Die Menge des Granulationsgewebes (Vehikel, 182 mg; rhRLX, 255 mg; p < 0,05), die Anzahl der Kapillaren und die Menge der extrazellulären Matrix-Ablagerung innerhalb der Wundkammern in der Hüfregion wurden alle durch die rhRLX-Behandlung erhöht. Es gab eine geringe oder keine Wirkung der rhRLX-Behandlung auf das Gewebegewicht (Vehikel, 261 mg; rhRLX, 283 mg) oder das histologische Erscheinungsbild des Gewebes aus den Wundkammern in der Schulterregion.
  • Bei dem ischämischen, H-förmigen Lappenmodell reduzierte die rhRLX-Behandlung den nekrotischen Oberflächenbereich in der Lappenregion im Vergleich zur Vehikelbehandlung (Vehikel, 195 mm2, rhRLX, 123 mm2).
  • Diese Resultate zeigen, dass die systemische Verabreichung von rhRLX die Wundheilung in ischämischen Regionen durch ihre pro-angiogenen und gefäßerweiternden Eigenschaften stimuliert.
  • Beispiel 5: Relaxin reduziert hypoxieinduzierte pulmonale Hypertonie Arbeitsvorschriften
  • Tiere und Reagenzien
  • Ausgezüchtete 6 Wochen alte Sprague-Dawley-Ratten, 200-220 g Körpergewicht, wurden von Hilltop Laborstories, Scottdale, PA, erhalten. Rekombinantes menschliches Relaxin (rhRlx) (5,0 mg/ml in 20 mM Natriumacetat, pH 5,0) und Vehikel (20 mM Acetat, pH 5,0) wurden von der Connetics Corporation (Palo Alto, CA) bereitgestellt. Osmotische Minipumpen wurden von Alza Corporation (Modell 2002, Alza Corp., Palo Alto, CA) zugekauft.
  • Gruppen und Herstellung von Infusionspumpen
  • Osmotische Minipumpen wurden gefüllt, um rhRlx mit 0,24 mg/kg/Tag (wenig rhRlx), 0,05 mg/kg/Tag rRlx (viel rhRlx) oder nur Vehikel zuzuführen. Die osmotischen Pumpen wurden subkutan in Ratten insertiert, und zwar unter Verwendung einer Kombination aus einer Ketamin- und Xylazin-Anästhesie. Der Bereich um den Nacken wurde rasiert, mit Alkohol gereinigt, und es wurde eine kleine Inzision zur Insertion der Pumpe vorgenommen. Die Inzision wurde mit chirurgischen Klammern geschlossen. Nachdem die Tiere voll bei Bewusstsein waren, wurden sie nach dem Zufallsprinzip entweder einem Aussetzen gegenüber Hypoxie oder Raumluft zugeteilt. Die Ratten wurden, wie später beschrieben, entweder Luft oder Hypoxie ausgesetzt. Es gab drei Gruppen von Ratten, die der Luft ausgesetzt wurden: vehikelbehandelt (veh-Luft), 0,05 mg/kg/Tag rhRlx (wenig rhRlx-Luft) und 0,24 mg/kg/Tag rhRlx (viel rhRlx-Luft). Es gab drei Gruppen, die Hypoxie ausgesetzt wurden: vehikelbehandelt (veh-hyp), 0,05 mg/kg/Tag rhRlx (wenig rhRlx-hyp) und 0,24 mg/kg/Tag rhRlx (viel rhRlx-hyp).
  • Hypoxische Aussetzung und hämodynamische Messungen
  • Ratten wurden bei Umgebungsdruck (Kerr et al. (1987)) 10 Tage lang Hypoxie (10 % 02, 90 % N2) ausgesetzt, die Kontrollgruppen wurden im selben Raum Raumtemperatur ausgesetzt. Den hypoxischen Tieren wurde Standard-Ratten-Futter und Wasser gefüttert. Dem Alter nach übereingestimmte Kontrollgruppen wurden dem Gewicht nach übereingestimmt, indem ihnen jene Futtermenge gegeben wurde, die von den Ratten in den hypoxischen Gruppen konsumiert wurde. Am Ende der Testperiode wurde der mittlere rechtsventrikuläre Druck (RVP) bei Ratten gemessen, die mit einer intraperitonealen Injektion mit 50 mg/kg Pentobarbitalnatrium anästhetisiert wurden. Die Pfortader wurde anschließend für die Hämatokrit-Messung (Hct) und die Abnahme der Blutproben aufgeschnitten, und das Verhältnis des rechten Ventrikels zum linken Ventrikel plus Septum wurde gemessen [RV/(LV+S)] (Kerr et al. (1987)). Um die Wirkung der akuten Verabreichung von rhRlx auf den Druck der Lungenarterie zu bestimmen, wurden vier Ratten, die 10 Tage lang hypoxisch gehalten wurden, anästhetisiert, wie zuvor beschrieben, und der RVP wurde 1 Stunde lang nach der Verabreichung einer Bolusdosis von 2 μg rhRlx in 0,2 ml Gesamtvolumen, gefolgt von einer Infusion von 2 μg rhRlx in 0,2 ml, verabreicht über eine Zeitspanne von 10 Minuten, beobachtet.
  • Biochemische Tests
  • Der Lungenarterienstamm und die rechten und linken extrapulmonalen Verzweigungen wurden en bloc entfernt, vom umliegenden Gewebe gereinigt und gewogen. Die linke Lunge wurde entfernt, und die gesamte Hilusarterie wurde vom Parenchym abgetrennt und gewogen (Tozzi et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 149, 1316-1326 (1994)). Die Segmente wurden hydrolysiert, und die Gesamtmenge an Hydroxyprolin und Protein wurde bestimmt (Poiani et al., Circ. Res. 66, 968-978 (1990)). Etwa 3 cm3 des gesamten Bluts wurden zentrifugiert, das Serum wurde abgesaugt, und die Probe wurde zur Bestimmung der rRlx-Mengen mittels ELISA-Test bei -20 °C eingefroren.
  • Zellkultur
  • Aorta-Adventitia-Fibroblasten normaler erwachsener Sprague/Dawley-Ratten wurden durch vorsichtiges Abtrennen der Adventitia aus dem Medium explantiert sowie durch Züchten von 1-mm3-Stücken in Dulbeccos Modifiziertem Eagles-Medium (DMEM), plus 10 % fötalem Rinder-Kalbserum. Waren die Kulturen konfluent, so wurden die Fibroblasten mit Trypsin dispergiert und vor der Verwendung in Experi menten einmal überimpft. Die Fibroblasten wurden mit 105 Zellen/cm2 in DMEM + 10 FBS in 48-Well-Platten für Experimente beimpft und auf Kollagen- und Fibronektin-Expression getestet, wie zuvor beschrieben (Unemori et al., J. Clin. Invest. 98, 2739-2745 (1996)). Kurz gesagt wurden die Fibroblasten mit 1 ng/ml rekombinantem menschlichem transformierendem Wachstumsfaktor β (TGF-β) (R & D Systems, Minneapolis, MN) in DMEM, ergänzt mit 0,2 % Lactalbumin-Hydrolysat für eine Zeitspanne von 24 Stunden inkubiert, um die extrazelluläre Matrixproduktion zu stimulieren. Die Hälfte der Kulturen wurde gleichzeitig ebenso mit 10 ng/ml rhRlx behandelt. Die Proteine wurden biosynthetisch mit 3H-Prolin (25 μCi/ml) (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) in Gegenwart von Ascorbat (50 μg/ml) und β-Aminopropionitril (80 μg/ml) markiert, und die konditionierten Medien wurden 24 Stunden später gesammelt. Die Medien wurden auf SDS-PAGE Elektrophorese unterzogen, und die Dichte der Kollagen- und Fibronectin-Bande wurde durch densitometrisches Scannen unter Verwendung eines digitalen Bildgebungssystems bestimmt (Alpha Innotech Corp, San Leandro, CA).
  • Relaxin-ELISA
  • Die Mengen an Relaxin im Serum wurden in einem quantitativen Sandwich-Immuntest gemessen, wie zuvor beschrieben (Unemori et al., J. Clin. Invest. 98, 2739-2745 (1996)). Der Test wurde zur Verwendung mit Rattenserum validiert, zeigt keine detektierbare Kreuzreaktivität mit Rattenrelaxin und besitzt einr niedrigere Nachweisgrenze von 20 pg/ml.
  • Statistik
  • Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Es wurde eine Analyse unter Verwendung von Einweg-ANOVA durchgeführt, gefolgt von einem mehrfachen Tukey-Kramer-Vergleichstest unter Verwendung der GraphPad-InstatJ-Software und von ANOVA mit Repeated Messures (SAS).
  • Resultate
  • Tiere
  • Das Überleben betrug 100 % in allen Gruppen. Die Körpergewichte der hypoxischen und der Kontrollgruppen unterschieden sich an 10 Tagen statistisch nicht voneinander, wie in Tabelle 9 dargestellt ist. Tabelle 9
    Gruppe n Körpergewicht, Gramm rRlx-Serumspiegel, ng/ml
    Veh-hyp 15 240 ± 2 0
    1 mg-hyp 15 242 ± 32 3,2 ± 0,4
    5 mg-hyp 10 246 ± 3 11,5 ± 2,5
    Veh-Luft 15 244 ± 3 0
    1 mg-Luft 15 246 ± 2 2,9 ± 1,0
    5 mg-Luft 10 249 ± 4 9,9 ± 2,8
  • Die Serumspiegel von rhRlx an Tag 10 des Aussetzens gegenüber entweder Hypoxie oder Normoxie betrugen 3,2 ± 0,4 ng/ml (wenig rhRlx-Luft), 11,5 ± 2,5 ng/ml (viel rhRlx-Luft), 2,9 ± 1,0 ng/ml (wenig rhRlx-hyp), 9,9 ± 1,0 ng/ml (viel rhRlx-hyp). Die Werte waren in den hohen rhRlx-Gruppen im Vergleich zu den Gruppen mit wenig rhRlx signifikant höher (p < 0,05, n = 8-16), und die Luft- und Hyp-Gruppen unterschieden sich nicht signifikant voneinander. Die erhaltenen Serumspiegel ähnelten jenen Mengen, die bei Ratten in der frühen Trächtigkeit beobachtet wurden (Sherwood, Relaxin in The Physiology of Reproduction, E. Knobil und J.D. Neill (Hrsg.), Rauen Press (1994)).
  • Hämodynamik
  • Nach 10 Tagen Hypoxie war der mittlere RVP bei der Veh-Hyp-Gruppe signifikant höher als bei der Veh-Luft-Gruppe. Die chronische Verabreichung von rhRlx verringerte den RVP sowohl bei niedrigen (p < 0,05) als auch bei hohen (p < 0,01) Dosen im Vergleich zur Veh-Hyp-Gruppe, wie in 7 dargestellt. Der mittlere RVP unterschied sich bei den Luft-Gruppen nicht signifikant. RV/(LV+S) war bei der Veh-Hyp-Gruppe im Vergleich zu der Veh-Luft-Gruppe signifikant höher. Sowohl bei wenig rhRlx-hyp (p < 0,05) als auch bei viel rhRlx-hyp (p < 0,01) zeigten sich RV/(LV+S)-Verhältnisse, die im Vergleich zu der Veh-Hyp-Gruppe signifikant reduziert waren.
  • RV/(LV+S) war bei allen Luft-Gruppen ähnlich. Hct war unter den Hyp-Gruppen oder unter den Luft-Gruppen nicht signifikant unterschiedlich; es waren jedoch alle Hyp-Gruppen signifikant höher als die Luft-Gruppen, wie zuvor beschrieben (Barer et al., J. Physiol. (Lond.) 336, 27-38 (1983)).
  • Hydroxyprolin- und Protein-Gehalt der Lungenarterien Der Kollagen-Gehalt wurde in Mikrogramm Hydroxyprolin pro Standardlänge des Gefäßes untersucht, wie in Tabelle 10 angegeben. Tabelle 10
    Gruppe Hydroxyprolin Hydroxyprolin Protein Protein n
    μg/Gefäß μg/Gefäß mg/Gefäß mg/Gefäß
    MPA Hilus MPA Hilus
    Veh-hyp 101,8 ± 1,9 48,4 ± 3,1 3,7 ± 0,2 1,8 ± 0,8 5
    1 mg-hyp 95,2 ± 3,6 41,0 ± 3,3 2,3 ± 0,2 0,90 ± 0,2 5
    5 mg-hyp 86,6 ± 6,0*1↑ 37,0 ± 5,0*↑ 2,0 ± 0,4* 0,75 ± 0,8* 5
    Veh-Luft 82,8 ± 4,0 35,8 ± 1,4 3,1 ± 0,3 0,94 ± 0,1 5
    1 mg-Luft 76,4 ± 4,0 38,0 ± 2,3 2,6 ± 0,2 0,78 ± 0,3 5
    5 mg-Luft 75,2 ± 4,0 33,5 ± 1,5 2,5 ± 0,3 1,1 ± 0,1 5
    • * p ≤ 0,05 im Vergleich zu Veh-Hyp; ↑ p ≥ 0,05 im Vergleich zu Veh-Luft. MPA ist die Haupt-Stammlungenarterie.
  • Der Hydroxyprolin-Gehalt der Haupt-Lungenarterien (MPA) und der Hilusgefäße in den Gruppen, die Luft ausgesetzt waren, unterschied sich nicht signifikant voneinander. Der Hydroxyprolin-Gehalt der MPA und der Hilusgefäße von Ratten in der Veh-Hyp-Gruppe war gegenüber jenen der Veh-Luft-Gruppe signifikant erhöht. Der Hydroxyprolin-Gehalt der MPA und der Hilusgefäße in der wenig hrRlx-hyp-Gruppe war im Vergleich zur veh-hyp-Gruppe leicht verringert, die viel rhRlx-hyp-Gruppe zeigte jedoch signifikant weniger Hydroxyprolin-Gehalt als die veh-hyp-Gruppe (p < 0,05). Die Protein-Gehalte der MPA und der Hilusgefäße nach der Behandlung mit der hohen Dosis an rhRlx waren im Vergleich zur veh-hyp-Gruppe ebenfalls signifikant reduziert (p < 0,05).
  • Kollagen- und Fibronectin-Etablexpression von Adventitia-Fibroblasten Ratten-Aorta-Adventitia-Fibroblasten exprimierten konstitutiv interstitielle Kollagene sowie Fibronectin. Die Behandlung mit TGF-β (20 ng/ml) erhöhte die Expression von Kollagenen auf 484 ± 67 % der Kontrollmengen. Die Addition von rhRlx (10 ng/ml) inhibierte TGF-β-induzierte Kollagen-Überexpression um 21 ± 5 % (p < 0,05). Die Fibronectin-Expression war nach einer TGF-β-Behandlung ebenfalls auf 360 ± 5 % der Kontrollmengen erhöht. Die Relaxinbehandlung verringerte die TGF-β-induzierte Überexpression um 28 ± 6 % (p < 0,05).
  • Beispiel 6: Relaxin induziert die Vaskulärendothel-Wachstumsfaktor-Expression und die Angiogenese selektiv an Wundstellen (nicht Teil der beanspruchten Erfindung)
  • Materialien und Verfahren
  • Reagenzien. Rekombinantes menschliches Relaxin wurde von Genentech, Inc. (Chargen-Nr. M3RD211, 1,5 mg/ml in 10 mM Citrat, pH 5,0) oder von Connetics Corporation (Charge 63601, 1,5 mg/ml in 10 mM Acetat, pH 5,5) hergestellt. Citrat- bzw. Acetatpuffer wurden als Vehikelkontrolle in Experimenten verwendet. Rekombinanter menschlicher VEGF wurde von R & D Systems (Minneapolis, MN) zugekauft.
  • Matrigel-Test. Tiere wurden von Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN) zugekauft und entsprechend den NIH-Richtlinien untergebracht. Die Arbeitsvorschriften entsprachen den institutionellen Richtlinien. Matrigel (Collaborative Biomedical, Redford, MA) wurde mit Relaxin in einer Endkonzentration von 100 ng/ml vermischt, oder es wurde mit demselben Volumen Citratpuffer auf Eis vermischt. 100 ml wurden subkutan in die Flanke weiblicher Swiss-Webster-Mäuse injiziert. Nach 11 Tagen wurden die Matrigel-Stifte entnommen, fixiert und mit H & E (Hämatoxylin und Eosin) zur Untersuchung auf neues Blutgefäßwachstum im Inneren gefärbt. Das Gefäßwachstum wurde auf einer Skala von 0-5 bewertet: 0 = keine Infiltration; 1 = geringe Infiltration; 2 = 3-5 Zellschichten, die nur die Ränder des Stifts infiltrieren; 3 = 5-10 Zellschichten, die Ränder mit einigen Bereichen mit tieferer Infiltration infiltrieren; < 25 % des Stifts infiltriert; 4 = Viele Bereiche tiefer zellulärer Infiltration; 25-50 % des Stifts infiltriert; 5 = 50-100 % des Stifts infiltriert. Endothelzellen migrieren vorzugsweise in die Basalmembranmatrix.
  • Hunt-Schilling-Wundkammer-Test. Edelstahl-Netzzylinder (0,9 cm × 3,4 cm), die mit Silikongummi-Stiften an beiden Enden ausgestattet waren, wurden vor der Implantation autoklaviert. Die Kammern wurden in zwei separate subkutane Taschen ("Stelle 1" an der Schulter und "Stelle 2" an der Hüfte) auf dem Rücken von Sprague-Dawley-Ratten implantiert. Zur selben Zeit wurden osmotische Pumpen in eine subkutane Tasche implantiert, die sich an einer Stelle befand, die distal zu jener der Kammern angeordnet ist. Nach 18 Tagen wurden die Kammern vorsichtig frei vom Interstitium abgetrennt, und die Flüssigkeit wurde unter Verwendung einer 18-Gange-Nadel durch die Silikonstifte am Ende des Zylinders abgesaugt und sofort auf Eis gelegt. Die in der Flüssigkeit suspendierten Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert, und die Zellen und die Flüssigkeit wurden getrennt. Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von RNAzol (Tel-Test, Inc., Friendswood, TX) den Angaben des Verkäufers gemäß geerntet. Die Flüssigkeit wurde sofort gefroren und zu einem späteren Zeitpunkt auf den Zytokin-Gehalt getestet.
  • RT-PCR-Analyse. Oligonucleotid-Primer (siehe Tabelle 8, oben) wurden geschaffen, um Ratten- und menschliche VEGF-Transkripte (die Primer unterschieden nicht zwi schen Isoformen) sowie jene des konstitutiven Gens, Glyceraldehyd-6-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) zu amplifizieren, und zwar unter Verwendung des PE-Applied-Biosystems-GeneAmp-PCR-9600-Systems. Die Primer wurden von BioSource International (Camarillo, CA) zugekauft und unter Anwendung von Agarose-Gelelektrophorese visualisiert.
  • Sense- und Antisense-Primer zur Verwendung mit dem Echtzeit-RT-PCR-ABI-Prism-7700-Sequenzdetektionssystems wurden unter Verwendung der PrimerExpress-Software Version 1.0 (PE Applied Biosystems Inc.) geschaffen. Ratten- und spezifische menschliche Primer/Sonden-Reihen umfassten jene für GAPDH, bFGF, die VEGF-164-aa- oder 120-aa-Ratten-Isoformen sowie ihre jeweiligen menschlichen Homologe (VEGF 165 und VEGF 121). Spezifische ABI-PRISM-Primer/Sonden wurden von BioSource International Inc. oder PE Applied Biosystems zugekauft.
  • RT-PCR wurde mit 150 ng zur Analyse der VEGF- und bFGF-mRNA-Expression durchgeführt. Zehn Nanogramm der Gesamt-RNA wurden zur GAPDH-mRNA-Expression verwendet. PCR-Produkte, die das ABI-Prism-7700-Sequenzdetektionssystem (alle Reaktionen in einem Gesamtvolumen von 50 ml) verwendeten, wurden unter Verwendung von Primer/Sonden-Annealing-Temperaturen von 58 °C und 35 Zyklen PCR erzeugt. Daten wurden unter Verwendung der Sequence-Detector-v1.6.3-Software analysiert (Applied Biosystems/PE).
  • 3H-Thymidin-Aufnahme. Endothelzellen stammten von Explantatkulturen der menschlichen neonatalen Vorhaut und der Ratten-Aorta. Menschliche Primär-Endothelzellen aus der Nabelschnurvene, Aorta und Lunge wurden von der Clonetics-Bio-Whittaker Corporation (San Diego, CA) zugekauft und den Angaben des Verkäufers gemäß kultiviert. Die 3H-Thymidin-Aufnahme wurde, wie zuvor beschrieben, in serumfreiem Medium durchgeführt. Unemori et al., Exp. Cell Res. 21, 166-171 (1994)).
  • Zellkultur. THP-1-Zellen wurden von der American Type Culture Collection (ATCC-Nr. TIB202) erhalten und in Iscove-Medium gezüchtet, das mit 10 % fötalem Rinderserum und 2 mM L-Glutamin ergänzt war. Für Experimente wurden THP-1-Zellen mit 5 × 105 Zellen/ml in 24-Well-Platten kultiviert, behandelt, und sie wurden mehrere Male bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die konditionierten Medien und Zellen gesammelt, und die Zellen wurden durch Zentrifugierung bei 500 g über eine Zeitspanne von 5 Minuten entfernt. Die Medien wurden bis zum Testen bei -80 °C gelagert.
  • ELISA. Das VEGF-Protein wurde in einem ELISA-Set quantifiziert, das von R & D Systems (Minneapolis, MN) zugekauft wurde. Die untere Empfindlichkeitsgrenze des Tests lag bei 10 pg/ml.
  • Statistische Analyse. Gruppenvergleiche wurden unter Verwendung von Varianzanalyse und des Student-Newman-Keuls-Verfahrens für mehrfache Vergleiche durchgeführt. Paarweise Vergleiche wurden unter Verwendung des gepaarten t-Tests durchgeführt.
  • Resultate
  • Relaxin stimuliert die Angiogenese in vivo. Die Fähigkeit von Relaxin, in vivo neues Blutgefäßwachstum zu induzieren, wurde im murinen Matrigel-System zur Untersuchung der Angiogenese getestet. Passaniti et al., Lab. Invest. 67, 519-528 (1992). Relaxin wurde vor der subkutanen Injektion mit dem Matrigel in einer Endkonzentration von 100 ng/ml vermischt. Nach 10 Tagen wurden die Matrigel-Stifte entnommen, für die Histologie weiterbearbeitet, und es wurden H-&-E-Schnitte auf das Gefäß-Wachstum im Inneren blindbewertet. Matrigel-Stifte, die nur das Vehikel enthielten (Citrat- oder Acetatpuffer) wiesen ein gewisses Ausmaß an Infiltration der Zellen auf, was die Fähigkeit des Matrigels alleine zur Stimulierung einer leichten Entzündungsreaktion und des darauf folgenden Gefäß-Wachstums im Inneren widerspiegelt. Die Gefäße wurden morphologisch als tubuläre Strukturen identifiziert, die rote Blutkörperchen enthielten. Die durchschnittliche Bewertung der Kontroll-Stifte lag auf einer Skala von 0-5 bei 2-3. In drei separaten Studien induzierte Relaxin signifikant mehr Gefäß-Wachstum im Inneren als es das Vehikel alleine tat (p < 0,05 bezogen auf Vehikel-Kontrolle). Rekombinanter menschlicher VEGF (1 ng/ml), der als positive Kontrolle zur Angiogenese in dem Test verwendet wurde, bestätigte die Fähigkeit der Endothelzellen, bei Mischung mit dem Matrigel und subkutaner Injektion auf einen angiogenen Stimulus zu reagieren.
  • Anschließend wurde Relaxin auf die Fähigkeit getestet, direkt eine Proliferation der Endothelzellen zu induzieren. Das Potential einer mitogenen Wirkung von Relaxin wurde auf menschlichen Primär-Nabelschnurvenen-, Aorta-, Vorhaut- und Lungenendothelzellen sowie auf Ratten-Aorta-Endothelzellen getestet. Relaxin veränderte die 3H-Thymidin-Aufnahme in keinem der getesteten Endothel-Zelltypen, im Gegensatz zu 10-%-Serum, das als positive Kontrolle in diesen Tests verwendet wurde. Veränderungen bei anderen Aspekten des Endothelzellphänotyps, von denen angenommen wird, sie würden mit der Angiogenese korrelieren, wurden ebenfalls getestet. Relaxin zeigte laut Bewertung durch SDS-PAGE von 3H-Prolin-markierten zellulären Proteinen keine Wirkung auf die Kollagen-Expression oder auf Metalloproteinase oder den Gewebeinhibitor der Metallproteinase-1-Sekretion, wie durch Gelatine-Zymographie untersucht wurde. Relaxin zeigte bei Zucht auf einem Typ-I-Kollagen- oder Matrigel-Substrat keine Wirkung auf die Fähigkeit von Endothelzellen, das Substrat anzugreifen oder Röhrenstrukturen (d.h. In-vitro-Kapillaren) zu bilden, ebenso wenig induzierte es in vitro Chemotaxis. Weiters konnte eine Bindung von 32P-markiertem Relaxin an Endothelzellen nicht detektiert werden. Daher hatte Relaxin keine sichtbare direkte Auswirkung auf Endothelzellen.
  • Relaxin stimuliert die angiogene Zytokin-Expression in vivo.
  • Relaxin wurde unter Verwendung osmotischer Pumpen systemisch an Ratten verabreicht. Um die Fähigkeit von Relaxin zur Modulation der Expression angiogener Zytokine an Wundstellen zu untersuchen, wurden Hunt-Schilling-Wundkammern zur Sammlung von Flüssigkeit und Entzündungszellen verwendet. Die Wundkammern wurden subkutan an zwei Stellen, an der Schulter und an der Hüfte, implantiert, und zwar distal zu der Stelle der Pumpen-Implantation. Flüssigkeit und Zellen wurden an einem Punkt (18 Tage) während der Heilungsperiode gesammelt, als bekannt war, dass die endogene angiogene Aktivität und die zelluläre Quelle, Makrophagen, vor handen waren. Die Gesamt-RNA wurde aus den Wundzellen entnommen und mittels RT-PCR auf VEGF-Transkripte analysiert. Bei der Analyse auf einem Agarose-Gel gab es zwei unterschiedliche Banden, umfassend die amplifizierten Produkte, entsprechend der 121aa- und 164aa-Isoformen von VEGF. Die Expression beider Isoformen schien bei relaxinbehandelten Tieren verstärkt zu sein.
  • Quantitative Echtzeit-RT-PCR wurde anschließend zur Analyse der Expression der zwei Isoformen von VEGF verwendet. Ein Übermaß der Transkripte wurde auf die Expression des konstitutiven Gens, GAPDH, normalisiert (8a). Die Expression der Transkripte sowohl der VEGF-164- als auch der VEGF-120-Isoformen bei Kontrolltieren war in den Hüft-Wundkammern höher als bei jenen an der Schulter, erreichte jedoch keine statistische Signifikanz (p = 0,056 bzw. 0,078). Relaxinverabreichung regulierte die Expression von VEGF-164-mRNA in der weiter vorne platzierten Wundkammer (p < 0,01) nach oben und wurde mit einem Trend zu einer Erhöhung in jener Kammer assoziiert, die an der Hüfte platziert war. VEGF-120-mRNA zeigte auch Tendenzen zu Anstiegen an beiden Stellen nach Relaxinverabreichung. Eine ähnliche Analyse wurde für bFGF-mRNA-Mengen in Wundzellen durchgeführt (8b). Die Grundlinien-Expression von bFGF-mRNA-Transkripten war in der Wundkammer an der Hüfte signifikant höher als an der Schulter, in Einklang mit der endogenen Stimulierung durch die im Vergleich dazu hypoxische Umgebung der hinteren Dermis. Relaxin induzierte eine signifikante Hinaufregulierung von bFGF-Transkripten in Wundzellen sowohl von Schulter- als auch von Hüft-Kammern (beide p < 0,05).
  • Ansässige Makrophagen und Immunzellen von anderen Nicht-Wundquellen wurden ebenfalls aus vehikel- und relaxinbehandelten Ratten entnommen und mittels RT-PCR auf VEGF-Expression getestet. Alveolare Makrophagen oder Milzzellen zeigten kein detektierbares oder ein geringes Ausmaß an VEGF-Expression, das nach der Relaxinbehandlung keine Hinaufregulierung zeigte.
  • Relaxin induziert eine schnelle Hinaufregulierung von VEGF-mRNA in THP-1-Zellen. Da Makrophagen die Entzündungszellen sind, die hauptsächlich für die angiogene Reaktion verantwortlich sind, die während der Heilung auftritt, wurde eine Monozy ten/Makrophagen-Zelllinie (THP-1), von der zuvor gezeigt wurde, dass sie Relaxin mit hoher Affinität bindet (Parsell et al., J. Biol. Chem. 271, 27936-27941 (1996)), auf die Relaxin-Induzierbarkeit von VEGF und bFGF getestet. THP-1-Zellen wurden in vitro gezüchtet, mit Relaxin (100 ng/ml) 3 Stunden lang behandelt und auf VEGF- und bFGF-mRNA-Induktion getestet. Transkripte für VEGF wurden durch die Relaxinbehandlung spezifisch hinaufreguliert (9). Um zu bestimmen, ob die beobachtete Zunahme der VEGF-mRNA nach einer kurzzeitigen Relaxinbehandlung durch eine Erhöhung von sekretiertem VEGF-Protein widergespiegelt wurde, wurden THP-1-Zellen 24 Stunden lang mit Relaxin (0,01-100 ng/ml) behandelt, die konditionierten Medien wurden gesammelt, und der VEGF-Gehalt in den Medien wurde durch ELISA quantifiziert. Relaxin induzierte die VEGF-Protein-Sekretion auf dosisabhängige Art und Weise, auf etwa 150 %, wobei eine Schwellenwert-Relaxinkonzentration von 0,2-1,0 ng/ml für die Stimulierung erforderlich ist. Relaxin führte zu keinen beobachtbaren morphologischen Veränderungen, wie z.B. einer Haftung am Kunststoff oder einer Aggregation, ebensowenig beeinflusste es die 3H-Thymidin-Aufnahme oder die Metalloproteinase-Expressionsmuster.
  • Beispiel 7: Wirkung von Relaxin auf normale und verminderte Wundheilung bei Ratten (nicht Teil der beanspruchten Erfindung)
  • Um die Wirkung einer rhRlx-Behandlung auf die Granulationsgewebe-Bildung bei normalen und ischämischen Wunden zu untersuchen, wurden Hunt-Schilling-Wundkammern subkutan entweder in der Schulter- oder in der stärker hypoxischen Hüft-Region weiblicher Sprague-Dawley-Ratten implantiert (Charles River Laborstories, MA). Die Wundkammern, feine Edelstahl-Netzzylinder, die mit Silikon mit medizinischem Reinheitsgrad verschlossen waren, stellten einen definierten Totraum für die Granulationsgewebe-Bildung bereit. RhRlx oder Vehikel wurde kontinuierlich über eine subkutan implantierte Alzet-Pumpe verabreicht. An Tag 18 nach dem chirurgischen Eingriff wurde das Granulationsgewebe, das in den Kammern enthalten war, entnommen. Das mittlere Nassgewicht des Granulationsgewebes (n = 6), das in den Wundkammern der Hüftregion enthalten war, war geringer als jenes in den Wundkammern aus der Schulterregion, was wahrscheinlich auf die stärker ischämische Natur der hinteren Stelle zurückzuführen ist. Die systemische Verabreichung von rhRlx war mit einer signifikanten Zunahme des Gewichts des Granulationsgewebes in den Wundkammern in der Hüftregion verbunden (p < 0,05), jedoch nicht an der Schulter. Die Zunahme des Granulationsgewebes in den Kammern in der Hüftregion wurde von einer Zunahme der bFGF- und der VEGF-Expression in Wundzellen und einer Zunahme der neuen Blutgefäßbildung begleitet. Diese Resultate zeigen, dass die rhRlx-Behandlung durch Stimulierung der Angiogenese durch die Induktion von VEGF und bFGF in Wundzellen selektiv die Granulationsgewebe-Bildung bei ischämischen Wunden verstärkt.
  • Um zu bestimmen, ob rhRlx die Heilung in diesem Modell der verminderten Heilung verbessern würde, wurden standardisierte Wunden voller Dicke (1,5 cm × 1,5 cm) auf dem Rücken von db/db-Mäusen erzeugt (Jackson Laborstories, Bar Harbor, ME). Die Mäuse wurden kontinuierlich 21 Tage lang mit rhRlx behandelt, und zwar über eine subkutan implantierte Alzet-Pumpe mit einer Dosis von entweder 0,1 mg/kg/Tag oder 0,2 mg/kg/Tag. Die Wundbereiche wurden im Verlauf der Studie gemessen. Die Heilung wird als Wundbereich an Tag 14 im Verhältnis zu der ursprünglichen Größe der Wunde an Tag 0 angegeben und wird folgendermaßen gemessen: % der ursprünglichen Wundfläche = [Fläche an Tag 14/Fläche an Tag 0] × 100. Die systemische Verabreichung von rhRlx in einer Dosis von 0,2 mg/kg/Tag verbesserte die Schließung der Wunde im Vergleich zu jener der Tiere, die 14 Tage lang mit Vehikel behandelt wurden, signifikant. Die Schließung der Wunde wurde als "% der ursprünglichen Wundfläche" ausgedrückt. Es gab 8-20 Tiere pro Gruppe. Die Schließung der Wunde lag bei 91,4 % in der Kontrollgruppe gegenüber 64 % in der relaxinbehandelten Gruppe (p < 0,05 durch Student-Newman-Kuels-Test). Die Unterschiede im Ausmaß der Wundheilung waren unter den Vehikel-Kontrolltieren und bei der niedrig dosierten rhRlx-Behandlung sowie bei den PDGF-behandelten Mäusen (5 μg/Wunde/Tag 5 Tage lang) gering.
  • An Tag 21 nach dem chirurgischen Eingriff wurden auch die Wunden herausgetrennt und vor der Einbettung in Paraffin in Formalin fixiert. Schnitte aus der Mitte der Wunde wurden mit Masson-Trichrom gefärbt und von zwei Forschern evaluiert. Wunden, die mit rhRlx behandelt wurden, waren mit einem dicken, zellulären und vaskulären Granulationsgewebe bedeckt. Wunden, die mit Vehikel behandelt wurden, zeigten eine sehr dünne Schicht an Granulationsgewebe und geringe Angiogenese. Eine Ansammlung von Entzündungszellen war an den Wundrändern vorhanden.
  • Neovaskularisierung ist eine Schlüsselkomponente der Granulationsgewebe-Bildung. Die Bildung neuer Blutgefäße wird durch eine Reihe von Wachstumsfaktoren stimuliert, unter anderem bFGF und VEGF. Vor kurzem demonstrierten die Erfinder die Fähigkeit von Relaxin, sowohl VEGF als auch bFGF in THP-a, einer Zelllinie mit Monozyten-Abstammung, und zwar in vitro und bei ischämischen Wundstellen in vivo zu induzieren. Die immunhistochemische Färbung des mittleren Abschnitts der Wunden voller Dicke unter Verwendung polyklonaler Antikörper gegen das von-Willebrand-Faktor-VIII-verwandte Antigen wurde verwendet, um neue Blutgefäße in den Wunden zu identifizieren. Die Verabreichung von rhRlx war mit einer stärkeren positiven Färbung in den Wunden rhRlx-behandelter Mäuse im Vergleich zu den Wunden vehikel-behandelter Mäuse assoziiert.
  • Im dritten Tiermodell wurde eine ischämische Standard-Wunde (H-förmig, 8 cm lang und 2 cm breit) in der Rückenregion der Ratten erzeugt. Perforierende Verzweigungen der Zentralvene wurden eingeschnitten, um sicherzustellen, dass die Wunde ischämisch war. Die resultierende Wunde war somit ischämisch, jedoch nicht vollständig nekrotisch. An Tag 14 und Tag 21 wurde die Oberflächennekrose gemessen. RhRlx-Behandlung (0,2 mg/kg über eine Minipumpe) reduzierte die Oberflächennekrose-Fläche in der Lappenregion im Vergleich zur Vehikelbehandlung (an Tag 14: Vehikel 195 mm2, rhRlx 123 mm2; an Tag 21 Vehikel 180 mm2, rhRlx 103 mm2). Immunhistochemische Färbung auf NO-Synthase zeigt, dass systemische Behandlung mit rhRlx die Expression von NO-Synthase auf vaskulärem Endothel verstärkt.
  • Beispiel 8: Relaxin verstärkt die Nierenfunktion bei cyclosporinbehandelten Ratten (nicht Teil der beanspruchten Erfindung)
  • Cyclosporin A (CsA) wird als Immunsuppressor verwendet, um das Auftreten einer Abstoßung des Transplantats bei Transplantationspatienten zu verhindern oder zu reduzieren. Ein signifikanter Nachteil für seine Verwendung ist jedoch, dass Nephrotoxizität mit seiner Anwendung über längere Zeitspannen assoziiert wird. Es wurden Studien durchgeführt, um zu bestimmen, ob Relaxin die nachteiligen Wirkungen von CsA auf die Nierenfunktion verbessern könnte.
  • Weibliche Sprague-Dawley-Ratten, 10-12 Wochen alt (Körpergewicht 250 g), wurden mit CsA 30 mg/kg/Tag durch oral verabreichte künstliche Sonderernährung (Tag 0-10) behandelt. Relaxin (rhRlx) wurde über subkutane Pumpen in einer Dosis von entweder 0,1 mg/kg/Tag oder 0,5 mg/kg/Tag 10 Tage lang (Tag 0-10) verabreicht. An Tag B2 (Grundlinie), Tag 4 und Tag 9 wurden alle Raten in Stoffwechselkäfige gesetzt. Es wurde die 24-Stunden-Urinmenge gemessen, um die Urinflussrate unter Verwendung der folgenden Formel zu berechnen: Urinflussrate = 24-Stunden-Urinmenge/1440 Minuten/Körpergewicht
  • Blut und Urin wurden zur Kreatininmessung gesammelt, um die GFR unter Verwendung der folgenden Formel zu berechnen: Kreatinin-Clearance = Urin-Kreatinin in der 24-Stunden-Menge/Serum-Kreatinin pro 1440 Minuten
  • Die Urinflussrate bei CsA-behandelten Ratten und die GFR (Glomerulusfiltrationsrate) bei CsA-behandelten Ratten wurden gemessen, und die Resultate zeigten, dass eine CsA-Behandlung die Nierenfunktion verringert. Die Resultate der Relaxinbehandlung normaler und CsA-behandelter Tiere werden nachstehend in den Tabellen 11 und 12 dargestellt. In diesem System erhöhte eine systemische Behandlung normaler Ratten mit rhRlx (0,5 mg/kg) verstärkte bis zu Tag 5 sowohl die Urinfluss rate als auch die Kreatinin-Clearance (168 % und 147 % im Vergleich zur Grundlinie). CsA-Behandlung alleine verringerte die Urinflussrate und die Kreatinin-Clearance sowohl an Tag 5 als auch an Tag 10 signifikant im Vergleich zur Grundlinie, und zwar um 30-35 % (p < 0,05). Die Urinflussrate und die Kreatinin-Clearance bei Tieren, die sowohl mit CsA als auch mit rhRlx behandelt wurden, und zwar entweder in einer Dosis von 0,1 mg/kg oder 0,5 mg/kg, waren im Vergleich zu jenen von Tieren, die nur mit CsA alleine behandelt wurden, signifikant verbessert. Tabelle 11 Urinfluss
    Behandlungsgruppen Tag 5 Tag 10
    Normal 1,0 1,0
    Normal + 0,5 mg/kg rlx 1,68 ± 0,02* 1,42 ± 0,01*
    CsA 0,69 ± 0,04* 0,85 ± 0,04*
    CsA + 0,1 mg/kg rlx 1,21 ± 0,36** 1,59 ± 0,41**
    CsA + 0,5 mg/kg rlx 1,27 ± 0,16** 1,067 ± 0,11**
    • * p < 0,05 bezogen auf normale Gruppe
    • ** p < 0,05 bezogen auf CsA-Gruppe
    Tabelle 12 GFR
    Behandlungsgruppen Tag 5 Tag 10
    Normal 1,0 1,0
    Normal + 0,5 mg/kg rlx 1,47 ± 0,08* 1,50 ± 0,09*
    CsA 0,77 ± 0,07* 1,49 ± 0,18**
    CsA + 0,1 mg/kg rlx 0,99 ± 0,15** 1,39 ± 0,13**
    CsA + 0,5 mg/kg rlx 1,231 ± 0,15**
    • * p < 0,05 bezogen auf normale Gruppe
    • ** p < 0,05 bezogen auf CsA-Gruppe
  • Die Daten zeigen, dass Relaxin die Nierenfunktion bei CsA-behandelten Tieren signifikant verbessert.
  • Beispiel 9: Relaxin verringert den Blutdruck und verbessert die Nierenfunktion bei Menschen (nicht Teil der beanspruchten Erfindung)
  • Es wurde ein klinischer Versuch mit menschlichen Individuen durchgeführt, Alter 18 bis 70 Jahre. Die Individuen wurden für eine Zeitspanne von 24 Wochen mit entweder 10 μg Relaxin/kg Körpergewicht/Tag (Minimum von 36 Individuen), 25 μg Relaxin/kg Körpergewicht/Tag (Minimum von 72 Individuen) oder Placebo (Minimum von 72 Individuen) behandelt. Die Verabreichung erfolgte durch eine kontinuierliche subkutane Infusion unter Verwendung einer Pumpe. Bei dem Relaxin handelte es sich um rekombinantes menschliches Relaxin (rhRlx). Zu verschiedenen Zeitpunkten wurde der diastolische Blutdruck, der systolische Blutdruck und die Kreatinin-Clearance (als Maß der Nierenfunktion) gemessen. Die Kreatinin-Clearance wurde unter Verwendung der folgenden Formeln berechnet:
    • Bei Frauen: Kreatinin-Clearance = ((140 – Alter) × Gewicht (kg)/72 × Serum-Kreatinin (mg/dl)) × 0,85
    • Bei Männern: Kreatinin-Clearance = (140 – Alter) × Gewicht (kg)/72 × Serum-Kreatinin (mg/dl)
  • Die Änderung jedes gemessenen Parameters wurde berechnet (Wert in Woche x – Wert in Woche 0). Die Resultate werden in den 10-13 dargestellt. Die Resultate zeigen, dass die Behandlung mit der 25-μg/kg/Tag-Dosis an rhRLXN den diastolischen und systolischen Druck signifikant reduzierte, und zwar von etwa Woche 2 bis zu Woche 24. Der Schwellenwert zur Erzielung dieser Wirkung lag bei über 10 μg rhRLXN/kg/Tag. Die Resultate zeigen weiters, dass Behandlungen sowohl mit 10 μg rhRLXN/kg/Tag als auch mit 25 μg rhRLXN/kg/Tag zu einer Verbesserung der Nierenfunktion führten, was anhand einer Erhöhung der Kreatinin-Clearance gemessen wurde. Dieses letztere Resultat deutet auf eine Erhöhung des Blutflusses hin. Zusammen zeigen die Daten, dass die Behandlung mit mehr als 10 μg rhRLXN/kg Kör pergewicht/Tag wirksam ist, um das Herzminutenvolumen zu erhöhen. Die Tatsache einer Reduktion des Cardiac Afterload (wie durch die Verringerung des mittleren Arteriendrucks gezeigt) ohne Verschlechterung der Nierenfunktion zeigt, dass es eine gleichzeitige Erhöhung des Herzminutenvolumens als Resultat der Behandlung gab.
  • Beispiel 10: Relaxin reduziert die myogene Reaktivität isolierter, kleiner Nierenarterien (nicht Teil der beanspruchten Erfindung)
  • Die myogene Reaktivität ist ein dynamisches und komplexes integratives Gefäßverhalten, das in kleinen Nierenarterien unter Verwendung eines unter Druck stehenden Arteriographen untersucht werden kann. Der äquivalente Tonus wurde zuerst in allen Gefäßen erreicht, und zwar durch Zusammenziehen derselben auf 75 % ihres Grundlinien-Durchmessers bei 60 mmHg unter Verwendung des adrenergischen Agonisten Phenylephrin. Als nächstes wurden die Arterien, die mit einem anfänglichen Druck von 20 mm Hg begannen, einer schnellen Erhöhung des transmuralen Drucks von 20-mmHg-Zunahmen bei Fehlen des Flusses unterzogen. 14 zeigt, dass, wenn weiblichen Ratten 5 Tage lang rhRLX verabreicht wurde, kleine Nierenarterien, die aus diesen Tieren isoliert wurden, ex vivo eine reduzierte myogene Reaktivität aufweisen. Gefäße, die aus relaxinbehandelten Ratten isoliert wurden, zeigten eine größere Zunahme des Durchmessers von der Grundlinie weg im Vergleich zu jenen, die aus vehikelbehandelten Ratten isoliert wurden. Diese Daten zeigen, dass rhRLX-Behandlung in vivo bei schneller Zunahme des Drucks die Gefäßverengung der Nierengefäße verringert. Diese abgeschwächte myogene Reaktivität nach der rhRLX-Behandlung nicht trächtiger Ratten imitiert eine Trächtigkeit (RE Gandley, KP Conrad, MK McLaughlin, Am J. Physiol Integrative Corp Physiol 280, R1-R7, 2001). Weiters kann diese abgeschwächte myogene Reaktivität, wie während der Trächtigkeit, durch Zusatz von Stickstoffoxid-Inhibitoren zum Gefäßbad umgekehrt werden. Außerdem zeigt 15, dass weibliche Ratten, die eine chronische Verabreichung von rhRLX erhielten, ebenfalls reduzierte myogene Reaktivität der kleinen Mesenterialarterien aufweisen. Das heißt, die Wirkung von rhRLX trifft nicht nur auf- die Nierenvaskulatur zu. SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00700001
    Figure 00710001
    Figure 00720001
    Figure 00730001
    Figure 00740001

Claims (6)

  1. Verwendung von Relaxin für die Herstellung eines Medikaments zur Erhöhung der Gefäßerweiterung zur Behandlung von pulmonaler Hypertonie.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Relaxin rekombinant ist.
  3. Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Relaxin in einer Menge in einem Bereich von etwa 0,1 bis 500 μg/kg Körpergewicht eines Patienten verabreicht wird.
  4. Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die Formulierung täglich über eine Zeitspanne verabreicht wird, die lange genug ist, um eine therapeutische Wirkung bei einem Patienten zu erzielen.
  5. Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin es sich bei der Formulierung um eine injizierbare Formulierung handelt.
  6. Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Relaxin einem Patienten in einer vorherbestimmten Menge verabreicht wird, um eine Serumkonzentration von Relaxin von etwa 0,5 bis 50 ng/ml beizubehalten, und die Verabreichung über eine Zeitspanne fortgesetzt wird, die lange genug ist, um renale Hypertonie oder pulmonale Hypertonie bei dem Patienten zu behandeln.
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