JP2009544734A - 目の障害の予防および処置のための内皮分化遺伝子ファミリー３（ｅｄｇ−３、ｓ１ｐ３）レセプターのアンタゴニスト - Google Patents

Abstract

Ｓ１Ｐ３（Ｅｄｇ−３）レセプターのアンタゴニストが、ＣＴＧＦ蓄積を含む目の障害における結合組織成長因子のレセプター信号伝達の下方制御および下流の低減された産生の方法におけるＳｍａｄ信号伝達の減衰のために提供される。不適切なＣＴＧＦ蓄積蓄積を含む目の障害は、高眼圧、緑内障、緑内障網膜症、眼神経症、黄斑変性、糖尿病性網膜症、脈絡膜新生血管、増殖性硝子体網膜症、および目創傷治癒を例えば含む。このような障害は、本発明のアンタゴニストを投与することによって処置される。

Description

（関連出願への相互参照）
本出願は、米国特許法第１１９条の下、２００６年７月２５日に出願された米国仮特許出願第６０／８３３，０８０号に基づく優先権を主張しており、その全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。

（発明の技術分野）
本発明は、ＣＴＧＦ蓄積を含む目の障害における結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）のレセプター信号伝達の下方制御および下流の低減された産生のための内皮分化遺伝子サブファミリー３レセプターの減衰のための組成物の分野に関する。

（発明の背景）
大部分の目の障害は、細胞増殖、生存、移動、分化、および血管新生を含む細胞プロセスと関連している。ＣＴＧＦは、これら細胞プロセスにおける中心メディエーターであると考えられる分泌サイトカインである。特に、ＣＴＧＦは、コラーゲンＩおよびフィブロネクチンの増加した堆積により細胞外マトリックスを増加させることが知られている。ＣＴＧＦの過剰発現は、細胞外マトリックス成分の過剰蓄積が存在する、強皮症、線維増殖性疾患、および瘢痕のような症状における主要な原因因子と関係している。

小柱網（ＴＭ）の領域における細胞外マトリックス材料の過剰蓄積は、緑内障の特定の形態の証明であり；このような増加は、水流出に対する抵抗性の増加、そしてそれ故、眼内圧（ＩＯＰ）の上昇に至ると考えられている。特許文献１として２００３年１１月１３日に公開され、そしてＡｌｃｏｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された、Ｆｌｅｅｎｏｒらによる国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０１２５２１は、正常ＴＭ細胞に対し、緑内障ＴＭ細胞におけるＣＴＧＦ ｍＲＮＡの高められた存在を記載している。従って、ＣＴＧＦは、小柱網細胞による細胞外マトリックス産生において役割を果たしていると考えられている。

小柱網（ＴＭ）は、内皮細胞、結合組織、および角膜と虹彩との間に所定の角度で位置し、正常ＩＯＰを維持するために必要な正常な抵抗性を提供する細胞外マトリックスを含む複合組織である。適切なＩＯＰは、目の形状を維持するため、および無血管の角膜およびレンズに房水の流れを可能にする圧力勾配を提供するために必要である。過剰のＩＯＰは、緑内障に共通して存在し、目の神経に有害な影響を有し、網膜神経節細胞および軸策の損失に至り、そして処置されない場合、進行性の視覚損失および失明を生じる。緑内障は、世界的な失明の主要原因の１つである。

原発性緑内障は、解剖学的、生化学的または生理学的基盤を有する房水の流れにおける障害から生じる。第２の緑内障は、目に対する障害もしくは外傷または前から存在する疾患の結果として生じる。原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）はまた、米国におけるすべての原発性緑内障の９０％を占める慢性または単純緑内障として知られる。ＰＯＡＧは、ＴＭにおける病理学的変化によって特徴付けられ、目からの流体排水に対して異常に高い抵抗を生じる。このような抵抗の結果は、ＩＯＰにおける増加である。

プレドニソン、デキサメタソン、およびヒドロコルチソンのような特定の薬物は、ＩＯＰを増加することによって緑内障を誘導することが知られている。さらに、投与の様式がＩＯＰに影響するようである。例えば、デキサメタソンの眼科投与は、全身投与よりもＩＯＰの増加をもたらす。ステロイドの投与に起因する緑内障は、ステロイド誘導性緑内障と称される。

現在の抗緑内障治療は、房水形成を抑制するためか、または水流出を増大するための薬剤の使用、および水排出を改善するためのレーザーによる小柱網形成術、もしくは小柱網切除術のような外科的手順によって、ＩＯＰを低くする。薬学的抗緑内障アプローチは、種々の所望されない副作用を示した。例えば、ピロカルピンのような縮瞳薬は、視覚のかすみ、およびその他の望ましくない局所的副作用を引き起こし得る。全身に投与された炭素アンヒドラーゼインヒビターは、吐き気、消化不良、疲労、および代謝性アシドーシスを引き起こし得る。さらに、特定のβ−ブロッカーは、肺組織中のβ−２レセプターに対するそれらの影響に帰因し得る肺の副作用と関連付けられてきた。α２−アゴニストは、頻脈、不整脈および高血圧を引き起こし得る。このような望ましくない副作用は、低下した患者応諾または治療の終了に至り得る。

２００５年１０月２０日に公開され、本明細書によって本明細書中に参考として援用されるＦｌｅｅｎｏｒらによる特許文献２は、ヒト小柱網細胞における基底ＣＴＧＦ発現およびＴＧＦβ２誘導性ＣＴＧＦ発現の両方に対する阻害活性を有するＧＳＫ−３およびＣＤＫインヒビターを提供する。

黄斑変性は、高鋭敏視覚の役割を果たす斑と称される中央網膜の部分における光レセプターの損失である。斑の変性は、網膜色素上皮と血管脈絡膜との間の膜にある細胞外マトリックス成分の異常堆積と関連している。この岩屑様物質は、ドルーゼンと称される。ドルーゼンは、検眼鏡の目の検査で観察される。正常な目は、ドルーゼンのない斑を有し得るが、ドルーゼンは、網膜周縁には豊富であり得る。斑視覚の任意の損失の非存在下での斑中の軟ドルーゼンの存在は、ＡＭＤの初期ステージと考えられる。

脈絡膜新生血管は、その他の目の障害に加え、黄斑変性で共通して生じ、そして脈絡膜内皮細胞の増殖、細胞外マトリックスの過剰産生、および線維血管網膜下膜の形成をともなう。網膜色素上皮細胞増殖および血管新生因子の産生は、脈絡膜新生血管に影響するようである。

糖尿病性網膜症は、毛細血管基底膜の厚化、および毛細血管の血管周囲細胞と内皮細胞との間の接触の欠如に帰因して糖尿病により惹起される眼の障害である。血管周囲細胞の損失は、毛細血管の漏れを増加し、そして血液−網膜障壁の破壊に至る。

増殖性硝子体網膜症は、硝子体膜内および網膜の表面上の細胞膜および線維膜の細胞増殖に関連する。網膜色素上皮細胞増殖および移動は、この眼の障害と共通している。増殖性硝子体網膜症に付随する膜は、Ｉ、ＩＩ、およびＩＶ型コラーゲンおよびフィブロネクチンのような細胞外マトリックス成分を含み、そして漸次線維性になる。

目創傷治癒障害は、炎症性細胞の活性化、成長因子およびサイトカインの放出、目の細胞の増殖および分化、増加した毛細血管透過性、基底膜マトリックス組成の改変、細胞外マトリックスの増加した堆積、線維症、新生血管形成、および組織再モデル化を経由して重篤な目組織損傷に至り得る。

国際公開第０３／０９２５８４号パンフレット 米国特許出願公開第２００５／０２３４０７５号明細書

上記で引用された目の障害、特に小柱網への病理学的損傷および細胞外マトリックスの過剰産生に帰因する損傷の重要性を考慮して、その進行の原因に焦点を向ける、これら目の障害を処置する改良された方法を有することが望ましい。

本明細書中で用いられる略語は以下を含む：
ＡＣ アデニルシクラーゼ
ＡＰ−１ アクチベータープロテイン１転写因子
ＣＴＧＦ 結合組織成長因子
ＤＧ ジアシルグリセロール
Ｅｄｇ３ 内皮分化因子サブファミリー３レセプター、Ｓ１Ｐ３を参照のこと
ＥＲＫ 細胞外−シグナル−調節キナーゼ
Ｇ_{１２／１３}、Ｇ_ｑ／１１、Ｇ_ｉ グアニンヌクレオチド−結合タンパク質のサブクラス
ＩＯＰ 眼内圧
ＩＰ３ イノシトール三リン酸
ＬＰＡ リソホスファチジン酸
ＰＡＩ−１ プラスミノゲンアクチベーターインヒビター１
ＰＫＣ プロテインキナーゼＣ
ＰＬＣ ホスホリパーゼＣ
ＰＬＤ ホスホリパーゼＤ
Ｒａｆ プロテインキナーゼｒａｆ−１
Ｒａｓ 小ＧＴＰ−結合タンパク質
Ｒｈｏ 小ＧＴＰ−結合タンパク質
Ｓ１Ｐ スフィンゴシン−１−ホスフェート
Ｓ１Ｐ３またはＳ１ＰＲ３ スフィンゴシン−１−ホスフェートレセプター３
Ｓｍａｄ−１、−２、−３ レセプター調節Ｓｍａｄ転写因子
Ｓｍａｄ−４ 共通パートナー（Ｃｏ−）Ｓｍａｄ転写因子
ＴＧＦβ トランスフォーミング成長因子β
ＴＧＦβＲ、ＴβＲＩ、ＴβＲＩＩ トランスフォーミング成長因子βレセプター、−Ｉ型レセプター、−ＩＩ型レセプター
（発明の要旨）
本発明は、当該技術分野における上に記載される問題を取り扱い、そしてＳ１Ｐ−３レセプターのアンタゴニストを提供することによって、被験体の目におけるＳｍａｄシグナル伝達を減衰するための方法を提供する。被験体の目におけるＳｍａｄシグナル伝達を減衰する方法は、この被験体に、有効量の内皮分化遺伝子サブファミリー３レセプターのアンタゴニストまたはその薬学的に受容可能な塩、および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物を投与する工程を包含する。被験体の目におけるＳｍａｄシグナル伝達はそれによって減衰される。被験体は、Ｓｍａｄシグナル伝達に関連する目の障害を有し得、不適切な結合組織成長因子蓄積を生じるか、またはこのような目の障害を発症するリスクにあり得る。このＳｍａｄシグナル伝達に関連する目の障害は、例えば、高眼圧、緑内障、緑内障網膜症、眼神経症、黄斑変性、糖尿病性網膜症、脈絡膜新生血管、増殖性硝子体網膜症、および目創傷治癒であり得る。

内皮分化遺伝子サブファミリー３レセプターのアンタゴニストは、このレセプターに結合する天然のリガンドを減少させる。このアゴニストは、このレセプターの天然のリガンド、スフィンゴシン−１−ホスフェートのアナログを含み得る。このアゴニストは、置換チアゾリジン、置換チアジナン、または後に引用されるような構造ＩＩＩを有するＳ１Ｐアナログであり得る。上記アンタゴニストは、スラミンのようなポリスルホン化ナフチルウレア、Ｓ１Ｐ３レセプターに対して結合親和性および特異性を有する抗体、それらの生物学的に活性なフラグメント、または上記レセプターに対して結合親和性および特異性を有するペプチドまたは擬似ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）であり得る。

本発明の別の実施形態は、不適切な結合組織成長因子蓄積に関連するＳｍａｄシグナル伝達に関連する目の障害を処置する必要のある被験体において、この障害を処置する方法である。この方法は、この被験体に、有効量の内皮分化遺伝子サブファミリー３レセプターのアンタゴニストまたはその薬学的に受容可能な塩、および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物を投与する工程を包含する。

本発明の１つの実施形態では、被験体における緑内障を処置する方法が提供される。この方法は、上記被験体に、有効量の内皮分化遺伝子サブファミリー３レセプターのアンタゴニストまたはその薬学的に受容可能な塩、および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物を投与する工程を包含し、ここで、緑内障がそれによって処置される。

本発明の別の実施形態では、被験体において、緑内障網膜症、眼神経症、黄斑変性、糖尿病性網膜症、脈絡膜新生血管、増殖性硝子体網膜症または目創傷治癒を処置する方法が提供される。この方法は、被験体に、有効量の内皮分化遺伝子サブファミリー３レセプターのアンタゴニストまたは薬学的に受容可能なその塩、および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物を投与する工程を包含する。緑内障網膜症、眼神経症、黄斑変性、糖尿病性網膜症、脈絡膜新生血管、増殖性硝子体網膜症または目創傷治癒は、それによって処置される。

図１は、Ｓ１ＰおよびＳｍａｄを含み、そしてＴＧＦ−βおよびＳｍａｄ；Ｓ１Ｐ−１、−２、−３、Ｓ１Ｐレセプター；ＴＧＦβＲ、ＴＧＦ−βＲ、ＴＧＦ−βレセプタータイプ１および２を含むシグナル伝達を示す概略を提供する（Ｘｉｎら、ＪＢＣ、第２７９（３４）巻：３５２５５〜３５２６２、２００４；Ｂｏｌｍら、Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２１巻：４７３〜４８２、２００２；Ｔａｋｕｗａ、Ｙ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．、第１５８２巻：１１２〜１２０、２００２；Ｐｙｎｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ，第３４９巻：３８５〜４０２、２０００；およびＸｕら、Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ．、第２５巻：８４９〜８５４、２００４から改作された）。 図２Ａおよび図２Ｂ。ヒト小柱網細胞培養を、種々の量の内因性ＥｄｇレセプターアゴニストＳ１Ｐの存在下（図２Ａ）または種々の量のＳ１Ｐの構造的アナログであるＦＴＹ７２０の存在下（図２Ｂ）でのＥｄｇ３レセプターサブタイプアンタゴニストＣＡＹ１０４４４を用いて（白丸）、または用いずに（黒丸）で処理した。２４時間後、分泌されたＰＡＩ−１タンパク質のレベルを、次いで、実施例２で引用されるような処理培養からの上清液アリコートのＥＬＩＳＡによって決定した。

（発明の詳細な説明）
Ｓ１Ｐ−３（Ｅｄｇ−３）レセプターは、ＬＰＡまたはＳ１Ｐのいずれかが内因性リガンドであるＧ−プロテイン連結レセプターのファミリーに属する。ＬＰＡは、Ｅｄｇ−２、−４、および−７レセプターに対するリガンドであり、そしてＳ１Ｐは、Ｅｄｇ−１、−３、−５、−６、および−８レセプターに対するリガンドである。これらＥｄｇレセプターは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（Ｃｈｕｎら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ、第５４巻：２６５〜２６９、２００２）によってＳ１Ｐレセプターに改名された。従って、本明細書で用いられるとき、用語「Ｅｄｇレセプター」は、用語「Ｓ１Ｐレセプター」と同義語である。図１は、Ｓ１Ｐレセプターと調節標的Ｓｍａｄとの間の、そしてＴＧＦ−βレセプターと同じ調節標的Ｓｍａｄとの間のシグナル伝達関係の概略を提供する。Ｓｍａｄは、リン酸化反応によって活性化され、そしてＳｍａｄ４との複合体は、核に侵入するヘテロマー複合体を生じ、そこで、この複合体は、その他の転写因子と一緒に、ＣＴＧＦをコードする遺伝子の転写のような遺伝子転写を活性化する。

顕著により高いレベルのＴＧＦβ２アイソフォームが、「正常」な目と比較して、緑内障のヒトの目から収集された房水で見出された（Ｔｒｉｐａｔｈｉら、Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ、第５９（６）巻：７２３〜７２７、１９９４；Ｉｎａｔａｎｉら、Ｇｒａｅｆｅｓ Ａｒｃｈ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、第２３９（２）巻：１０９〜１１３、２００１；Ｐｉｃｈｔら、Ｇｒａｅｆｅｓ Ａｒｃｈ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、第２３９（３）巻：１９９〜２０７、２００１；Ｏｃｈｉａｉら、Ｊｐｎ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、第４６（３）巻：２４９〜２５３、２００２）。さらに、ＴＧＦβ２は、灌流ヒト腹側セグメントモデルにおいてＩＯＰの実質的増加を惹起し得る（Ｆｌｅｅｎｏｒら、Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ、第４７（１）巻：２２６〜２３４、２００６）。従って、ＴＦＧβ、特にＴＦＧβ２は、緑内障のようなＩＯＰ関連障害において原因となる役割を有するように見える。

Ｓ１Ｐ−３レセプターは、腎臓メサンギウム細胞中のＳｍａｄシグナル伝達経路を活性化するようである（Ｘｉｎら、Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、第１４７巻：１６４〜１７４、２００６）。さらに、Ｓｍａｄタンパク質は、（図１によって示されるような）ＴＧＦ−βのスーパーファミリーを含むＴＧＦスーパーファミリーのメンバーによって活性化される通常のシグナル伝達経路を媒介することが知られている。従って、Ｓｍａｄタンパク質シグナル伝達のＳ１Ｐで誘導される活性化は、ＴＧＦβによって調節されることが知られるいくつかの細胞応答と類似しているようである。さらに、ＴＧＦβおよびＳ１Ｐの両方は、緑内障プロセスで鍵となる役割を果たすように見えるタンパク質である（２００３年１１月１３日に国際公開第ＷＯ０３／０９２５８４号パンフレットとして公開された国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０１２５２１号）、ＣＴＧＦの発現を増加することが知られている（Ｘｉｎら、２００４上述、Ｋａｔｓｕｍａら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、第５７９巻：２５７６〜２５８２、２００５）。

ＴＧＦβ３／Ｓ１Ｐ３シグナル伝達経路の選択的調節が所望される。なぜなら、ＴＧＦβは、組織におけるポジティブな役割およびネガティブな役割を有しているからである。ポジティブな役割は、例えば、抗炎症剤としての、免疫抑制剤としての、およびＴ細胞の移動およびホーミングのプロモーターとしてのＴＧＦβを含む。このような選択的調節が本明細書で提供される。

本発明者らは、本明細書で、Ｓｍａｄレセプターを介する低減されたシグナル伝達を生じる目のＳ１Ｐ３レセプターに対するアンタゴニストを提供し、それによって下流のＣＴＧＦ蓄積を低減する。本明細書で提供されるようなＳｍａｄ下流経路の調節は、ＴＧＦβシグナル伝達のネガティブな局面の低減をもたらし、その一方、ＴＧＦβのポジティブなシグナル伝達効果は実質的に影響されないで残す。本発明の別の実施形態は、Ｓ１Ｐ３レセプター結合に拮抗する方法を提供し、それによって、Ｓｍａｄタンパク質シグナル伝達が不適切な結合組織成長因子蓄積を生じる目の障害の処置のために、Ｓ１Ｐ３下流のシグナル伝達カスケードを妨害し、そして特にＳｍａｄシグナル伝達を妨害する。

内皮分化遺伝子スーパーファミリー３レセプター（ＥＤＧ−３、Ｓ１Ｐ−３）のアンタゴニスト：Ｓ１Ｐ−３レセプターのアンタゴニストは、Ｓ１Ｐ−３レセプターとその天然のリガンドＳ１Ｐとの間の結合親和性または特異性を減衰する作用剤を含む。このアンタゴニストは、Ｓ１Ｐアナログであり得る。アンタゴニストは、置換されたチアゾリジン、特にアルキル置換チアゾリジンもしくはアリールアルキル置換チアゾリジン、置換されたチアジナン、特にアルキル置換チアジナン、スラミン（ヘキサナトリウム塩として最も一般的に入手可能）のようなポリスルホン化ナフチルウレア、または後に引用されるような構造ＩＩＩを有するＳ１Ｐアナログ；Ｓ１Ｐ−３レセプターに対する結合特異性および親和性を有する抗体、その生物学的に活性な抗体フラグメント、ペプチドもしくは擬似ペプチド；またはアンタゴニストの薬学的に受容可能な塩であり得る。本明細書で示されるアンタゴニスト作用剤は、ラセミ混合物、ジアステレオマーまたはエナンチオマーであり得る。

「アンタゴニストの薬学的に受容可能な塩」は、Ｓ１Ｐ−３レセプターアンタゴニスト活性を保持し、そしてヒト身体によって受容可能であるアンタゴニストの塩である。これら塩は、酸の塩または塩基の塩であり得る。なぜなら、本明細書におけるアンタゴニストは、アミノ置換基またはカルボキシ置換基を有し得るからである。

置換チアゾリジンは構造Ｉを有する：

式中、Ｒ_１はＣ_６−Ｃ_１３アルキル、またはアルキル置換アリールであり、ここでこの置換はＣ_５−Ｃ_９アルキルである。本発明の１つの実施形態では、上記アンタゴニストは構造Ｉを有し、ここでＲ_１はＣ_１０アルキルまたはＣ_１１アルキル、（２−アルキルチアゾリジン−４−カルボン酸であり、ここでこのアルキルはＣ_１０またはＣ_１１である）である。Ｒ_１がＣ_１１アルキルであるとき、上記アンタゴニストは、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）から市販され入手可能なＣＡＹ１０４４４である。本発明の別の実施形態では、上記アンタゴニストは構造Ｉを有し、ここでＲ_１はアルキル置換フェニルであり、そしてこのフェニル環上の置換はｍ−またはｐ−Ｃ_７−アルキル、すなわち、（２−（ｍ−またはｐ−ヘプチルフェニル）チアゾリジン−４−カルボン酸）である。

本発明の１つの実施形態では、Ｓ１Ｐ３のアンタゴニストは構造ＩＩを有する：

式中、Ｒ_２はＣ_９−Ｃ_１３アルキルである。

本発明の別の実施形態では、Ｓ１Ｐ３のアンタゴニストは構造ＩＩＩを有する：

式中、Ｒ_３はｏ−またはｍ−Ｃ_５−Ｃ_８アルキルであり；そしてＲ_４はホスフェート、ホスフェートアナログ、ホスホネート、またはスルフェートである。本明細書で用いられるとき、「ホスフェートアナログ」は、例えば、用語ホスホロ−チオエート、−ジチオエート、−セレノエート、−ジセレノエート、−アニロチオエート、−アニリデート、−アミデート、またはホウ素ホスフェートを含む。

Ｓ１Ｐ３シグナル伝達で活性であるさらなる化合物は、本明細書中に参考として援用される、２００５年１０月６日に公開されたＬｙｎｃｈらによる米国特許出願公開第２００５／０２２２４２２号明細書、およびＫｏｉｄｅら、Ｊ．Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ、第４５巻：４６２９〜４６３８、２００２に記載されている。

Ｓ１Ｐ３レセプターのさらなるアンタゴニストを同定するためのアッセイは、候補アンタゴニスト、Ｓ１Ｐ、Ｓ１Ｐ３レセプターおよび活性化されたＳ１Ｐ３レセプターに対する活性を有するキナーゼを組み合わせること、および得られたリン酸化Ｓ１Ｐ３レセプターの量を測定することを包含し得る競合結合アッセイを用いる。その結果は、候補アンタゴニストの非存在下での同じアッセイから得られたリン酸化Ｓ１Ｐ３レセプターの量と比較される。候補アンタゴニストは、リン酸化されたＳ１Ｐ３レセプターのレベルがこの候補アンタゴニストが存在しない場合よりも低いとき、アンタゴニスト活性を有する。さらなるアッセイは、候補アンタゴニストによるレセプター特異的抗体結合の阻害、候補アンタゴニストによるＣＴＧＦｍＲＮＡの減少した蓄積、または候補アンタゴニストによるＣＴＧＦタンパク質の減少した蓄積のためのアッセイを含む。先に参考として援用された２００５年１０月６日に公開されたＬｙｎｃｈらによる米国特許出願公開番号第２００５／０２２２４２２号明細書は、ヒトＳ１Ｐレセプターへの擬似Ｓ１ＰのＳ１Ｐ活性を測定するためのＧＴＰ結合アッセイを記載している。

置換チアゾリジンおよび置換チアジナンは、当該技術分野で公知の方法、例えば、Ｋｏｉｄｅら（Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ、第４５巻：４６２９〜４６３８、２００２）によって記載される方法を用いて合成される。先に参考として援用された２００５年１０月６日に公開されたＬｙｎｃｈらによる米国特許出願公開第２００５／０２２２４２２号明細書は、構造ＩＩＩを有するＳ１Ｐアナログの合成を記載している。

Ｓ１Ｐ３レセプターに対する結合特異性および親和性を有する抗体は、市販され入手可能であり、例えば、マウスモノクローナル抗体は、ＧＥＮＥＴＥＸ、Ｉｎｃ．（カタログ番号ＧＴＸ１２２５４、Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ）から入手可能であり、スフィンゴリピドレセプターＥｄｇ３／Ｓ１Ｐ３に対するウサギポリクローナル抗体は、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｉｎｃ．（カタログ番号ＮＬＳ１０３１、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ）から入手可能であり、そしてＥＤＧ−３ＣＴ抗体は、Ｅｘａｌｐｈａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ）から入手可能である。ＥＤＧ−３ＣＴは、ヒトＳ１Ｐ３レセプターの特有のＣ−末端ペプチドに対する結合親和性および特異性を有する。

Ｓ１Ｐ−３レセプターの拮抗作用およびＣＴＧＦ蓄積の得られた阻害はまた、目の障害における改善を観察することによりヒトまたは哺乳動物において推察される。例えば、年齢による黄斑変性においては、視覚損失の遅延または逆転は、ＣＴＧＦ蓄積の阻害、そして緑内障患者においては低下した眼内圧力を示し、そして緑内障を発症するリスクにある患者における症状の徴候の遅延または予防は、ＣＴＧＦ蓄積の阻害を示す。

本発明のアンタゴニストは、ＣＴＧＦ蓄積または活性が不適切である目の障害を処置するための、例えば、先に本明細書に参考として援用され、２００５年１０月２０日に公開されたＦｌｅｅｎｏｒらによる米国特許出願公開第２００５／０２３４０７５号明細書によって記載される作用剤のようなその他の作用剤と組み合わせて用いられ得る。

投与の様式：上記アンタゴニストは、当業者に周知の技法を用いて、目に直接（例えば、局所的な目のための滴または軟膏；結膜嚢中の、もしくは強膜（経強膜）に隣接して移植されるか、もしくは目内の遅延放出デバイス；眼周囲、結膜、トノン腔下、前房内、硝子体内、網膜下、後部眼球、もしくは小管内注入）、または全身的に（例えば：経口；静脈内、皮下または筋肉内注入；非経口的、皮膚送達）送達され得る。本発明のアンタゴニストは、網膜ペレット、眼内挿入物、カテーテル、座剤または多孔性、非多孔性、またはゼラチン粘着性材料を含む移植デバイスのような配置デバイス中で処方され得ることがさらに企図される。前房内注入は、角膜から前眼房までであり得、上記作用剤が小柱網に到達することを可能にする。小管内注入は、シュレム管を排水する静脈コレクターチャンネル中、またはシュレム管中であり得る。

被験体：目の障害または目の障害を発症するリスクにあるための処置を必要とする被験体は、ＣＴＧＦの不適切な蓄積をともなうＳｍａｄ活性化に付随する症状を有するか、それを有するリスクにあるヒトまたはその他の哺乳動物である。このような目の障害は、例えば、高血圧、緑内障、黄斑変性、糖尿病網膜症、脈絡膜新生血管、増殖性硝子体網膜症、目創傷治癒、および過剰の瘢痕を有する、内皮細胞増殖、または線維増殖を有する症状を含み得る。このような障害と関連する目の構造は、網膜、脈絡膜、レンズ、角膜、小柱網、杆体、網膜錐体、神経節、斑、虹彩、強膜、水房、毛様体、視神経円板、乳頭、または窩を例えば含み得る。

処方物および投薬量：薬学的処方物は、水、緩衝液、生理食塩水、グリシン、ヒアルロン酸、マンニトールなどのような生理学的に受容可能な眼科学的キャリア媒体と混合された、本明細書中に示されるようなアンタゴニストまたはその塩を、９９重量％まで含む。本発明の局面によって具現化される可能な処方物の例は以下のようである。

さらなる実施形態では、眼科学的組成物は、処方されて約０．１〜１００ナノモル濃度（ｎＭ）または、さらなる実施形態では１〜１０ｎＭのアンタゴニストの眼内濃度を提供する。局所組成物は、熟練臨床医の慣用の分別に従って、１日あたり１〜４回、目の表面に送達される。この処方物のｐＨは、４〜９、または４．５〜７．４であるべきである。全身処方物は、約１０〜１０００ｍｇのアンタゴニストを含み得る。

「有効量」は、Ｓ１Ｐ−３レセプターとＳｍａｄとの間の結合を破壊し得るＳ１Ｐ−３レセプターの量をいう。このような破壊は、低下したＳｍａｄ活性、低下したＣＴＧＦ遺伝子転写、低下したＣＴＧＦタンパク質蓄積、そして結果として生じる被験体における目の障害における症状の低下に至る。このような破壊は、本明細書中に呈示されるような目の障害を発症するリスクにある被験体における症状の徴候を遅延または予防する。有効量の処方物は、例えば、被験体の年齢、人種、および性、または目の状態の重篤度のような因子に依存し得る。１つの実施形態では、上記アンタゴニストは、目に局所的に送達され、そして小柱網、網膜または視神経乳頭に治療用量で到達し、それによって、目の疾患プロセスを改善する。

受容可能なキャリア：眼科学的に受容可能なキャリアは、多くとも、目の炎症をほとんど引き起こさないか、または引き起こさないようなキャリアをいい、必要であれば、適切な保存を提供し、そして均一な投薬量で１つ以上の本発明のＳ１Ｐ−３アンタゴニストを送達する。眼科学的な送達のために、Ｓ１Ｐ−３アンタゴニストは、眼科学的に受容可能な保存剤、共溶媒、界面活性剤、増粘剤、透過促進剤、緩衝液、塩化ナトリウム、または水と合わせられ得、水性滅菌眼科学的懸濁液または溶液を形成する。眼科学的溶液処方物は、上記アンタゴニストを、生理学的に受容可能な等張水性緩衝液中に溶解することによって調製され得る。さらに、上記眼科学的溶液は、眼科学的に受容可能な界面活性剤を含み得、上記アンタゴニストの溶解を支援する。ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどのような粘度構築剤が、本発明の組成物に添加され得、上記化合物の保持を改善する。

滅菌眼科学的軟膏処方物を調製するために、上記Ｓ１Ｐ−３アンタゴニストは、鉱油、液体ラノリン、または白色ワセリンのような適切なビヒクル中に保存剤と合わされる。滅菌眼科学的ゲル処方物は、上記Ｓ１Ｐ−３アンタゴニストを、例えば、ＣＡＲＢＯＰＯＬ−９４０（登録商標）（ＢＦ Ｇｏｏｄｒｉｃｈ、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ、ＮＣ）などの組み合わせから調製された親水性ベース中に、その他の眼科学的処方物のために当該技術分野で公知の方法に従って懸濁させることにより調製され得る。ＶＩＳＣＯＡＴ（登録商標）（Ａｌｃｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ、ＴＸ）は、例えば眼内注入のために用いられ得る。本発明のその他の組成物は、Ｓ１Ｐ−３アンタゴニストが目の中に浸透性が乏しい場合、クレモフォールおよびＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）のような浸透促進剤を含み得る。

キット：本発明の実施形態は、細胞におけるＳ１Ｐ３レセプターシグナル伝達を減衰するためのアンタゴニストを含むキットを提供する。このキットは、閉じた区画中に本発明のアンタゴニストを含む１つ以上の容器、薬学的に受容可能なキャリア、そして必要に応じて使用のための印刷された指示書を含む。

（実施例１）
Ｓ１Ｐ−刺激性ＣＴＧＦ遺伝子発現の阻害
培養されたヒト小柱網細胞におけるＣＴＧＦ遺伝子発現に対するＥｄｇ３レセプターの影響は、以下のように決定され得る。形質転換または非形質転換ヒトＴＭ細胞培養（Ｐａｎｇら、Ｃｕｒｒ Ｅｙｅ Ｒｅｓ、第１３巻：５１〜６３、１９９４；Ｓｔｅｅｌｙら、Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ、第３３巻：２２４２〜２２５０、１９９２；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｕｒｒ Ｅｙｅ Ｒｅｓ、第１２巻：７８３〜７９３、１９９３；Ｓｔａｍｅｒら、Ｃｕｒｒ Ｅｙｅ Ｒｅｓ、第１４巻：６１１〜６１７、１９９５）は、特定の期間、刺激量のスフィンゴシン−１−ホスフェート（Ｓ１Ｐ）を用いて、または用いないで、そしてＥｄｇ３レセプターアンタゴニスト用いて、または用いないで、処理される。別個の培養物がまた、コントロールとして供するために用いられた必要な希釈ビヒクルで処理される。総ＲＮＡが、次いで、ＴＭ細胞から、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ９６を用い、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ）の指示書に従って単離される。

細胞処理後のＣＴＧＦの識別的発現は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｉｍ（登録商標）７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、本質的に先に記載されるように（Ｓｈｅｐａｒｄら、ＩＯＶＳ、第４２巻：３１３７、２００１）、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）により確認される。ＣＴＧＦ増幅のためのプライマーは、７６−ｂｐアンプリコンを生成するために、（本明細書中に参考として援用される）２００５年１０月２０日に公開されたＦｌｅｅｎｏｒらによる米国特許出願公開第２００５０２３４０７５号明細書、２００４年１０月８日に出願された米国特許出願第１０／５１０，５８５号に示されるようなＧｅｎｂａｎｋ受託番号＃ＮＭ ００１９０１．１の隣接するエキソンにアニールするよう、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて設計された。ＣＴＧＦの増幅は、６９−ｂｐアンプリコンを生成するために、Ｆｌｅｅｎｏｒらによる米国特許出願公開第２００５０２３４０７５号明細書（上述）に記載されるように、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号＃Ｘ０３２０５）に設計されたプライマーを用いて、１８ＳリボソームＲＮＡ発現に正規化される。ＣＴＧＦ ＱＲＴ−ＰＣＲは、４０ｎＭ １８Ｓまたは９００ｎＭ ＣＴＧＦプライマー；１００ｎＭ １８Ｓプローブまたは１００ｎＭ ＣＴＧＦ；５ｕｌ ＲＮＡ；１×ＭｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅおよびＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｍｉｘ（ＡＢＩ）；および１×ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍｉｘ（ＡＢＩ）からなる５０ｕｌの最終容量中の１８Ｓプライマー／プローブセットと多重で実施される。熱サイクリング条件は、４８℃３０分間および９５℃１０分間からなり、次いで９５℃１５秒間および６０℃１分間での４０サイクルが続く。データ分析は、ＳＤＳソフトウェアバージョン１．９．１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＭＳ Ｅｘｃｅｌ ２００２（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）で実施される。相対的ＲＮＡ濃度の定量は、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃２に記載されるようにδδＣｔ法を用いて行われる。増幅された産物のレベルは、四連ＱＲＴ−ＰＣＲアッセイの平均±ＳＥＭとして表現される。データ分析は、ＳＤＳソフトウェアバージョン１．９．１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＭＳ Ｅｘｃｅｌ ９７（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）で実施される。

（実施例２）
細胞外マトリックス関連タンパク質の発現におけるＳ１Ｐ−刺激性変化の阻害
培養されたヒト小柱網細胞における細胞外マトリックス関連タンパク質の発現に対するＥｄｇ３レセプターの影響は、以下のように決定され得る。ヒトＴＭ細胞培養物は、複製群および／または実験群および／またはコントロール群に分割され、次いで、それらに希釈ビヒクル（コントロールとして）および／またはＳ１Ｐ（刺激作用因子として）および／またはＥｄｇ３レセプターアンタゴニストを含むコントロール溶液または実験溶液が添加される。フィブロネクチン、プラスミノゲンアクチベーターインヒビター（ＰＡＩ−１）、コラーゲン、フィブリリン、ビトロネクチン、ラミニン、トロンポスポンジンＩ、プロテオグリカン、またはインテグリンのような細胞外マトリックス関連タンパク質のレベルが、次いで、標準的な酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により各細胞培養群で測定される。このようなアッセイは、当業者に周知であり、そして特異的タンパク質の検出のためのマーカーとして抗体または抗原に結合した酵素を利用する高感度イムノアッセイである。これらの手段により、種々の細胞外マトリックス関連タンパク質のレベルが、次いで、実験溶液の効果を決定するために群間で比較され得る。

処理されたヒトＴＭ細胞培養からの上清液中のＰＡＩ−１レベルに対するＥｄｇ３レセプター拮抗作用の効果の例は、図２Ａおよび図２Ｂに示される。これらの研究のために、ヒトＴＭ細胞培養物を、種々の量の内因性ＥｄｇレセプターアゴニストＳ１Ｐの存在下、および／または種々の量のＳ１Ｐの構造的アナログである、ＦＴＹ７２０の存在下で、Ｅｄｇ３サブタイプアンタゴニストＣＡＹ１０４４４を用いて、または用いずに処理した。２４時間後、分泌されたＰＡＩ−１タンパク質のレベルを、次いで、処理された培養物からの上清液アリコートのＥＬＩＳＡによって決定した。これらのデータから、両方のアゴニストの効果が、ＣＡＹ１０４４４によって潜在的かつ効果的に拮抗されたことは明らかである（データは平均およびＳＥＭを表す）。

本明細書で引用される参考文献は、それらが、本明細書中に示されるものを補充する例示の手続きまたはその他の詳細を提供する程度まで、参考として詳細に援用される。

当業者は、本開示を考慮して、本明細書に開示される実施形態の自明な改変が、本発明の思想および範囲から逸脱することなくなされ得ることを認識する。本明細書中に開示されるすべての実施形態は、本開示を考慮して過度の実験を要することなくなされ、そして履行され得る。本発明の全範囲は、本開示およびその等価な実施形態に設定される。本明細書は、本発明が権利を与えられる保護の全範囲を過度に狭めると解釈されるべきではない。

本明細書で用いられる場合、そしてそうでないことが示されない限り、単数形は、「１つ」、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味すると解釈される。

Claims (35)

1. 被験体の目の中のＳｍａｄシグナル伝達を減衰する方法であって：
   該被験体に、
   有効量の内皮分化遺伝子サブファミリー３レセプターのアンタゴニストまたはその薬学的に受容可能な塩；および
   薬学的に受容可能なキャリア
   を含む組成物を含む組成物を投与する工程を包含し、それによって、該被験体の目の中のＳｍａｄシグナル伝達が減衰される、方法。
2. 前記被験体が、不適切な結合組織成長因子蓄積をともなうＳｍａｄシグナル伝達に関連する目の障害を有する、請求項１に記載の方法。
3. 前記被験体が、結合組織成長因子の不適切な蓄積をともなうＳｍａｄシグナル伝達に関連する目の障害を発症するリスクにある、請求項１に記載の方法。
4. 前記Ｓｍａｄシグナル伝達に関連する目の障害が、高眼圧、緑内障、緑内障網膜症、眼神経症、黄斑変性、糖尿病性網膜症、脈絡膜新生血管、増殖性硝子体網膜症または目創傷治癒である、請求項２に記載の方法。
5. 前記アンタゴニストが、スフィンゴシン−１−ホスフェートアナログである、請求項１に記載の方法。
6. 前記アンタゴニストが、置換チアゾリジンである、請求項１に記載の方法。
7. 前記アンタゴニストが、置換チアジナンである、請求項１に記載の方法。
8. 前記アンタゴニストが、構造Ｉ：
   

   

   （式中、Ｒ_１はＣ_６−Ｃ_１３アルキル、またはアルキル置換アリールであって、該アリール置換はＣ_５−Ｃ_９アルキルである）を有する、請求項１に記載の方法。
9. Ｒ_１が、Ｃ_１０またはＣ_１１アルキルである、請求項８に記載の方法。
10. Ｒ_１が、アルキル置換フェニルであり、そして該置換がｍ−またはｐ−Ｃ_７−アルキルである、請求項８に記載の方法。
11. 前記アンタゴニストが、構造ＩＩ：
    

    

    （式中、Ｒ_２がＣ_９−Ｃ_１３アルキルである）を有する、請求項１に記載の方法。
12. 前記アンタゴニストが、ポリスルホン化ナフチルウレアである、請求項１に記載の方法。
13. 前記アンタゴニストが、構造ＩＩＩ：
    

    

    （式中：
    Ｒ_３はｏ−またはｍ−Ｃ_５−Ｃ_８アルキルであり；そして
    Ｒ_４はホスフェート、ホスフェートアナログ、ホスホネート、またはスルフェートである）を有する、請求項１に記載の方法。
14. 前記アンタゴニストが、前記レセプターに対する結合親和性および特異性を有する抗体またはその生物学的に活性なフラグメントである、請求項１に記載の方法。
15. 前記アンタゴニストが、前記レセプターに対する結合親和性および特異性を有するペプチドまたは擬似ペプチドである、請求項１に記載の方法。
16. 前記組成物が、局所投与、前房内投与、硝子体内投与、経強膜投与、またはインプラント経路を経由して、投与される、請求項１に記載の方法。
17. 前記組成物中のアンタゴニストの濃度が、０．０１％〜２％である、請求項１に記載の方法。
18. 不適切な結合組織成長因子蓄積にともなうＳｍａｄシグナル伝達に関連する目の障害を処置する必要のある被験体において、該障害を処置する方法であって：
    該被験体に、
    有効量の内皮分化遺伝子サブファミリー３レセプターのアンタゴニストまたはその薬学的に受容可能な塩；および
    薬学的に受容可能なキャリア
    を含む組成物を投与する工程を包含し、それによって、該Ｓｍａｄシグナル伝達に関連する目の障害が処置される、方法。
19. 前記被験体が、高眼圧または緑内障を有する、請求項１８に記載の方法。
20. 前記被験体が、高眼圧または緑内障を発症するリスクにある、請求項１８に記載の方法。
21. 前記アンタゴニストが、スフィンゴシン−１−ホスフェートアナログである、請求項１８に記載の方法。
22. 前記アンタゴニストが、置換チアゾリジンである、請求項１８に記載の方法。
23. 前記アンタゴニストが、置換チアジナンである、請求項１８に記載の方法。
24. 前記アンタゴニストが、構造Ｉ：
    

    

    （式中：Ｒ_１がＣ_６−Ｃ_１３アルキル、またはアルキル置換アリールであって、該アリール置換がＣ_５−Ｃ_９アルキルである）を有する、請求項１８に記載の方法。
25. Ｒ_１が、Ｃ_１０またはＣ_１１アルキルである、請求項２４に記載の方法。
26. Ｒ_１が、アルキル置換フェニルであり、そして該置換がｍ−またはｐ−Ｃ_７−アルキルである、請求項２４に記載の方法。
27. 前記アンタゴニストが、構造ＩＩ：
    

    

    ここで、Ｒ_２がＣ_９−Ｃ_１３アルキルである、を有する、請求項１８に記載の方法。
28. 前記アンタゴニストが、ポリスルホン化ナフチルウレアである、請求項１８に記載の方法。
29. 前記アンタゴニストが、構造ＩＩＩ：
    

    

    （式中：
    Ｒ_３はｏ−またはｍ−Ｃ_５−Ｃ_８アルキルであり；そして
    Ｒ_４がホスフェート、ホスフェートアナログ、ホスホネート、またはスルフェートである）を有する、請求項１８に記載の方法。
30. 前記アンタゴニストが、前記レセプターに対する結合親和性および特異性を有する抗体またはその生物学的に活性なフラグメントである、請求項１８に記載の方法。
31. 前記アンタゴニストが、前記レセプターに対する結合親和性および特異性を有するペプチドまたは擬似ペプチドである、請求項１８に記載の方法。
32. 前記組成物が、局所投与、前房内投与、硝子体内投与、経強膜投与、またはインプラント経路を経由して、投与される、請求項１８に記載の方法。
33. 前記組成物中のアンタゴニストの濃度が、０．０１％〜２％である、請求項１８に記載の方法。
34. 被験体における緑内障を処置する方法であって：
    該被験体に、
    有効量の内皮分化遺伝子サブファミリー３レセプターのアンタゴニストまたはその薬学的に受容可能な塩；および
    薬学的に受容可能なキャリア
    を含む組成物を投与する工程を包含し、それによって、該緑内障が処置される、方法。
35. 被験体における緑内障網膜症、眼神経症、黄斑変性、糖尿病性網膜症、脈絡膜新生血管、増殖性硝子体網膜症、または目創傷治癒を処置する方法であって：
    該被験体に、
    有効量の内皮分化遺伝子サブファミリー３レセプターのアンタゴニストまたはその薬学的に受容可能な塩；および
    薬学的に受容可能なキャリア
    を含む組成物を投与する工程を包含し、それによって、該緑内障網膜症、眼神経症、黄斑変性、糖尿病性網膜症、脈絡膜新生血管、増殖性硝子体網膜症、または目創傷治癒が処置される、方法。

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