KR20090033886A

KR20090033886A - 안 질환의 예방 및 치료를 위한 내피 분화 유전자 서브패밀리 3 (ｅｄｇ-3, ｓ1ｐ3) 수용체의 길항제

Info

Publication number: KR20090033886A
Application number: KR1020097002077A
Authority: KR
Inventors: 데브라 엘. 플리너; 앨런 알. 쉐퍼드; 이옥-호우 팽
Original assignee: 알콘 리서치, 리미티드
Priority date: 2006-07-25
Filing date: 2007-07-25
Publication date: 2009-04-06
Also published as: US20080025973A1; MX2009000907A; ZA200900316B; EP2068856A2; AU2007279311A1; US20100183629A1; WO2008014338A3; CA2657480A1; BRPI0714593A2; WO2008014338A2; JP2009544734A; CN101505744A

Abstract

S1P3(Edg-3) 수용체의 길항제가 결합조직 성장인자(CTGF) 축적을 수반하는 안 질환에서 수용체 신호전달의 하향 조절 및 하류의 CTGF의 생산을 감소시키는 방법에 Smad 신호전달을 약화시키기 위해 제공된다. 부적절한 CTGF 축적을 수반하는 안 질환에는 예컨대, 고안압증, 녹내장, 녹내장성 망막병증, 시각신경병증, 황반변성, 당뇨망막병증, 맥락막 혈관신생, 증식 유리체망막병증 및 눈 상처치유가 포함된다. 이러한 질환들은 본 발명의 길항제를 투여함으로써 치료된다.

Description

안 질환의 예방 및 치료를 위한 내피 분화 유전자 서브패밀리 3 (ＥＤＧ-3, Ｓ1Ｐ3) 수용체의 길항제{ANTAGONISTS OF ENDOTHELIAL DIFFERENTIATION GENE SUBFAMILY 3 (EDG-3, S1P3) RECEPTORS FOR PREVENTION AND TREATMENT OF OCULAR DISORDERS}

본 출원은 35 U.S.C§119하에 2006년 7월 25일에 제출되고 본 명세서에 모든 내용이 참고로 인용되는 미국 가 특허 출원 제 60/833,080호를 우선권으로 주장한다.

본 발명은 결합조직 성장인자(CTGF) 축적을 수반하는 안 질환에서 수용체 신호전달의 하향 조절과 하류의 CTGF의 생산 감소를 목적으로 하는 내피 분화 유전자 서브패밀리 3 수용체의 약화를 위한 조성물 분야에 관련한 것이다.

대부분의 안 질환은 세포증식, 생존, 이동, 분화 및 혈관형성을 포함하는 세포 과정과 관련된다. CTGF는 이러한 세포 과정에서 중심 매개체일 것으로 여겨지는 분비 사이토카인이다. 특히, CTGF는 콜라겐Ⅰ과 섬유결합소(fibronectin)의 침전 증가를 통하여 세포외기질의 생산을 증가시키는 것으로 알려져 있다. CTGF의 과발현은 피부경화증(scleroderma), 섬유증식성 질환(fibroproliferative disease), 그리고 세포외기질 성분의 과축적이 있는 흉터 형성과 같은 상태의 주요 원인 요소로 서 연루된다.

잔기둥그물(trabecular meshwork; TM) 부위에서 세포외기질 물질의 과축적은 특정 형태의 녹내장의 특징이고, 그러한 증가는 방수배출에 대한 저항 증가를 유도함으로써 안압(IOP)의 상승을 유도한다고 여겨진다. Fleenor 등에 의한 WO 03/092584로 2003년 11월 13일 공개되고, 알콘사(Alcon, Inc.)에 양도된 국제특허출원(International Patent Application) 제 PCT/US2003/012521호에는 정상 TM 세포와 비교하여 녹내장성 TM 세포에서 CTGF mRNA의 존재가 증가된 것으로 기술되었다. 따라서, CTGF는 잔기둥그물 세포에 의해서 세포외기질 생산에 관여하는 것으로 보인다.

잔기둥그물(TM)은 내피세포, 결합조직, 그리고 각막과 홍채 사이의 각에 위치하는 세포외기질을 포함하며 정상 안압의 유지를 위해 필요한 정상 저항을 제공하는 복합 조직이다. 적절한 안압은 눈의 모양을 유지하고 안방수가 무혈관 각막 및 수정체로 흐르도록 압력차를 제공하는데 필요하다. 일반적으로 녹내장에서 나타나는 과도한 안압은 시신경에 해로운 영향을 주고, 망막신경절세포와 축삭의 손상을 이끌며, 만약 치료되지 않으면 점진적으로 시력상실 및 실명으로 이어진다. 세계적으로 녹내장은 실명의 주요한 원인의 하나이다.

원발녹내장은 해부학적, 생화학적 또는 생리학적 기본을 이루는 안방수 흐름의 장애에 의한 결과이다. 속발녹내장은 눈의 손상이나 외상 또는 이미 존재하는 질병의 결과로 발생한다. 만성 또는 단순 녹내장으로도 알려진 원발개방각 녹내장(POAG)은 미국에서 모든 원발녹내장의 90 퍼센트를 차지한다. POAG는 눈으로부터 액 배출에 대해 비정상적으로 높은 저항을 가져오는 TM에서의 병리학적 변화가 특징이다. 이러한 저항의 결과는 안압의 증가이다.

프레드니손, 덱사메타손 및 하이드로코르티손과 같은 특정 약제들은 안압을 증가시킴으로서 녹내장을 유도한다고 알려져 있다. 더욱이, 투여 방식이 안압에 영향을 주는 것으로 보인다. 예를 들어, 덱사메타손의 점안투여는 전신투여했을 때보다 더 높은 안압의 증가를 이끈다. 스테로이드의 투여로 발생한 녹내장은 스테로이드-유도 녹내장이라고 한다.

현재 항 녹내장 요법들은 액 배출의 증가를 위한 레이저 섬유주성형술 또는 섬유주절제술과 같은 외과적 처치뿐만 아니라, 안방수 형성을 억제하거나 방수 배출을 유도하는 약물을 사용함으로써 안압을 낮춘다. 약제학적 항 녹내장의 접근은 여러가지 바람직하지 않은 부작용을 나타내어 왔다. 예를 들어, 필로카핀과 같은 축동제는 시야의 흐려짐과 다른 부정적인 국소적 부작용을 유도할 수 있다. 전신적으로 투여된 탄산탈수효소 저해제는 구역, 소화불량, 피로 및 대사산증을 일으킬 수 있다. 또한, 특정 베타-차단제들은 폐조직에서 그들이 베타-2 수용체에 미치는 효과에 기인할 수 있는 폐의 부작용과 관련이 있다. 알파2-작용제는 빠른맥, 부정맥 및 고혈압을 일으킬 수 있다. 이런 부정적인 부작용들은 환자의 순응성 감소 또는 요법의 종료를 초래할 수 있다.

본 명세서에 참고로 인용되는, Fleenor등에 의한 2005년 10월20일 공개된 미국 특허 출원 제 2005/0234075호는, 사람의 잔기둥그물 세포에서 기본적인 CTGF 발현과 TGFβ2-유도 CTGF 발현 모두에 대하여 저해 활성을 갖는 GSK-3와 CDK 저해제 를 제공한다.

황반변성은 고-시력(high-acuity vision)을 가능하게 하는 황반이라는 망막 중심부분의 광수용체의 상실이다. 황반의 변성은 망막색소상피와 혈관맥락막 사이의 막에서 세포외기질 성분의 비정상적인 축적과 관련된다. 이 부스러기같은 물질을 드루젠(drugen)이라고 한다. 드루젠은 안저안구검사에서 발견된다. 정상적인 눈은 황반에 드루젠이 없을 것이나, 망막 주변부에는 드루젠이 풍부할 수 있다. 황반 시력의 어떤 상실도 없을 때 황반에 부드러운 드루젠의 존재는 AMD의 초기 단계로 간주된다.

맥락막 혈관신생은 일반적으로 다른 안 질환들뿐만 아니라 황반변성에서도 발생하고, 맥락막 내피세포의 증식, 세포외기질의 과잉생산, 그리고 섬유혈관 망막하 점막의 형성과 관련된다. 망막색소 상피세포의 증식과 혈관형성인자의 생산은 맥락막 혈관신생에 영향을 미치는 것으로 보인다.

당뇨망막병증은 모세혈관 기저막의 비대와 모세혈관에서 혈관주위세포(pericyte)와 내피세포 사이의 접촉 부족으로 인해 당뇨병에서 발생하는 안 질환이다. 혈관주위세포의 손실은 모세혈관의 누출을 증가시키고 혈액-망막 장막의 파괴를 유도한다.

증식 유리체망막병증은 유리체막 내와 망막의 표면에서 세포막 및 섬유성 막의 세포 증식과 관련이 있다. 망막색소 상피세포의 증식과 이동은 이러한 안 질환에서 일반적이다. 증식 유리체망막병증과 관련된 막은 콜라겐 타입Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅳ, 그리고 섬유결합소와 같은 세포외기질 성분을 포함하고, 점차 섬유성으로 된다.

상처치유장애는 염증세포의 활성화, 성장인자와 사이토카인의 방출, 안 세포의 증식 및 분화, 모세혈관 투과성 증가, 기저막 기질 조성의 변화, 세포외기질의 침전 증가, 섬유화, 혈관신생 및 조직 재형성을 통해 심각한 안 조직 손상을 유도할 수 있다.

상기 언급된 안 질환의 중요성, 특히 잔기둥그물의 병리학적 손상과 세포외기질의 과잉 생산에 의한 손상 면에서, 그것이 진행되는 근본적인 원인을 다루는 안 질환의 개선된 치료 방법을 제공하는 것이 바람직하다.

본원에 사용된 약자는 다음과 같다.:

AC 아데닐릴 사이클라제

AP-1 활성 단백질 1 전사 인자

CTGF 결합조직 성장인자

DG 디아실글리세롤

Edg3 내피 분화 유전자 서브패밀리 3 수용체, SIP3 참조.

ERK 세포외-신호-조절 키나제

G₁₂ _/13,G_q _/11,G_i 구아닌 뉴클레오티드-결합 단백질의 서브클래스

IOP 안압

IP3 이노시톨 트리포스페이트

LPA 리소포스파티드산(Lysophosphatidic acid)

PAI-1 플라스미노겐 활성제 저해제 1

PKC 단백질 키나제 C

PLC 포스포리파제 C

PLD 포스포리파제 D

Raf 단백질 키나제 raf-1

Ras 작은 GTP-결합 단백질

Rho 작은 GTP-결합 단백질

S1P 스핑고신-1-포스페이트

S1P3 또는 S1PR3 스핑고신-1-포스페이트 수용체 3

Smad-1, -2, -3 수용체 조절 Smad 전사인자

Smad-4 공통의 파트너(Co-) Smad 전사인자

TGFβ 전환성장인자β

TGFβR, TβRⅠ, TβRⅡ 전환성장인자β 수용체, -수용체 타입Ⅰ, -수용체 타입Ⅱ

발명의 요약

본 발명은 당 기술분야에서 상기 언급된 문제를 다루고, S1P-3 수용체의 길항제를 제공함으로써 대상의 눈에서 Smad 신호전달을 약화시키기 위한 방법을 제공한다. 대상의 눈에서 Smad 신호전달을 약화시키는 방법은 유효량의 내피 분화 유전자 서브패밀리 3 수용체 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함한다. 그에 따라 대상 의 눈에서 Smad 신호전달이 약화된다. 대상은 부적절한 결합조직 성장인자 축적으로 귀착하는 Smad 신호전달-관련 안 질환을 가지거나, 그러한 안 질환으로 발전될 위험에 있을 수 있다. Smad 신호전달-관련 안 질환은 예를 들면, 고안압증, 녹내장, 녹내장성 망막병증, 시신경병증, 황반변성, 당뇨망막병증, 맥락막 혈관신생, 증식 유리체망막병증 또는 눈 상처치유일 수 있다.

내피 분화 유전자 서브패밀리 3 수용체의 길항제는 수용체에 대한 천연 리간드의 결합을 감소시킨다. 길항제는 수용체의 천연 리간드의 유사체인 스핑고신-1-포스페이트를 포함할 수 있다. 길항제는 이후 언급되는 바와 같이 치환된 티아졸리딘, 치환된 티아지난 또는 구조 Ⅲ을 갖는 S1P 유사체일 수 있다. 길항제는 수라민(suramin)과 같은 폴리설폰화 나프틸우레아, S1P3 수용체에 결합 친화성 및 특이성이 있는 항체, 그의 생물학적 활성 단편, 또는 수용체에 결합 친화성 및 특이성이 있는 펩티드나 펩티드 모방체(peptidomimetic)일 수 있다.

본 발명의 다른 구체적인 예는 치료가 필요한 대상에서 부적절한 결합조직 성장인자의 축적과 관련된 Smad 신호전달-관련 안 질환을 치료하는 방법이다. 상기 방법은 유효량의 내피 분화 유전자 서브패밀리 3 수용체의 길항제 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함한다. 그에 따라 Smad 신호전달-관련 안 질환이 치료된다.

본 발명의 하나의 구체적인 예로 대상에서 녹내장의 치료 방법이 제공된다. 상기 방법은 유효량의 내피 분화 유전자 서브패밀리 3 수용체의 길항제 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대 상에 투여하는 것을 포함하며, 그에 의해 녹내장이 치료된다.

본 발명의 다른 구체적인 예로 대상에서 녹내장성 망막병증, 시신경병증, 황반변성, 당뇨망막병증, 맥락막 혈관신생, 증식 유리체망막병증 또는 눈 상처치유의 치료 방법이 제공된다. 상기 방법은 유효량의 내피 분화 유전자 서브패밀리 3 수용체의 길항제 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함한다. 그에 따라 녹내장성 망막병증, 시신경병증, 황반변성, 당뇨망막병증, 맥락막 혈관신생, 증식 유리체망막병증 또는 눈 상처치유가 치료된다.

도 1은 S1P 및 Smad가 관여하고, TGF-β 및 Smad; S1P-1, -2, -3, S1P 수용체; TGFβR, TGF-β 수용체 타입 1 및 2를 포함하는 신호전달을 보여주는 도면을 제공한다(Xin 등, JBC, Vol. 279(34):35255-35262, 2004; Blom 등, Matrix Biology, Vol. 21:473-482, 2002; Takuwa, Y., Biochim Biophys Acta ., Vol. 1582:112-120, 2002; Pyne 등, Biochem J, Vol. 349:385-402, 2000; 및 Xu 등, Acta Pharmacol Sin ., Vol. 25:849-854, 2004로부터 변형시킴).

도 2A 및 2B. 인간 잔기둥그물 세포 배양물을 다양한 양의 내인성 Edg 수용체 작용제 S1P의 존재하(도 2A) 또는 S1P와 구조적 유사체인 FTY720의 다양한 양의 존재하(도 2B)에서, Edg3 수용체 서브타입 길항제 CAY10444로 처리하거나(빈 원) 또는 처리하지 않았다(채워진 원). 24시간 후, 분비된 PAI-1 단백질의 수준을 실험예2에 언급된 바와 같이 처리된 배양물로부터 얻은 상층액 일부를 ELISA로 결정하 였다.

S1P-3(Edg-3) 수용체는 LPA 또는 S1P가 내인성 리간드인 G-단백질 결합 수용체 패밀리에 속한다. LPA는 Edg-2, -4 및 -7에 대한 리간드이고, S1P는 Edg-1, -3, -5, -6 및 -8 수용체에 대한 리간드이다. Edg 수용체는 국제약리학연합(International Union of pharmacology)에 의해 S1P 수용체로 개명되었다(Chun 등, Pharmacol Rev, Vol. 54:265-269, 2002). 따라서, 본원에 사용된, "Edg 수용체"라는 용어는 "S1P 수용체"라는 용어와 같은 뜻이다. 도 1은 S1P 수용체와 그 조절 표적 Smad 사이, 그리고 TGFβ 수용체와 동일 조절 표적 Smad 사이의 신호전달 관계에 대한 개략도를 제공한다. Smad는 포스포릴화에 의해 활성화되고, Smad4와 복합체를 형성하여 핵으로 들어가는 헤테로머성 복합체를 만들며, 그 복합체는 다른 전사요소와 함께 CTGF를 코딩하는 유전자의 전사와 같은 유전자 전사를 활성화시킨다.

현저하게 높은 수준의 TGFβ2 아이소폼이 "정상의" 눈과 비교하여 녹내장이 있는 인간의 눈으로부터 수집된 안방수에서 발견된다(Tripathi 등, Exp Eye Res, Vol. 59(6):723-727, 1994; Inatani 등, Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, Vol,239(2):109-113, 2001; Ochiai 등, Jpn J Ophthalmol, Vol. 46(3):249-253, 2002). 더욱이 TGFβ2는 관류된 인간 전안부 모델에서 안압의 잠재적인 증가를 유발할 수 있다(Fleenor 등, Invest Ophthalmol Vis Sci, Vol. 47(1):226-234,2006). 따라서, TGFβ, 특히 TGFβ2는 녹내장과 같은 질환과 관련한 IOP에서 원인이 되는 역할을 하는 것으로 보인다.

S1P-3 수용체는 신장 혈관사이 세포에서 Smad 신호전달 경로를 활성화시키는 것으로 여겨진다(Xin 등, Br J Pharmacol Vol. 147:164-174, 2006). 또한, Smad 단백질은 TGF-β의 것을 포함하는 TGF 수퍼패밀리(superfamily)의 멤버에 의해 활성화되는 일반적인 신호전달 경로를 매개하는 것으로 알려져 있다(도 1에서 나타냄). 따라서, Smad 단백질 신호전달의 S1P-3-유도 활성은 TGFβ에 의해 조절되는 것으로 알려진 몇몇 세포 반응을 모방하는 것으로 보인다. 더욱이, TGFβ와 S1P는 모두 녹내장 과정에서 핵심적인 것으로 보이는(Fleenor 등에 의한 WO 03/092584로 2003년 11월 13일 공개되고, 알콘사(Alcon, Inc.)에 양도된 국제특허출원 제 PCT/US2003/012521호) 단백질인 CTGF의 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있다(Xin 등, 2004 Id., Katsuma 등, FEBS Letters, Vol.579:2576-2583, 2005).

TGFβ가 조직에서 부정적인 역할뿐만 아니라 긍정적인 역할도 하기 때문에 TGFβ/S1P3 신호전달 경로의 선택적인 조절이 바람직하다. 긍정적인 역할은, 예컨대, 항염증제, 면역억제제, T 세포의 이동과 귀환 촉진제로서의 TGFβ를 포함한다. 이러한 선택적 조절이 본원에서 제공된다.

본 발명자들은 본원에서 Smad 수용체를 통한 신호전달의 감소와 이에 따른 하류 CTGF 축적 감소를 가져오는 안구의 S1P3 수용체에 대한 길항제를 제공한다. 본원에서 제공된 Smad 하류 경로의 조절은 TGFβ 신호전달의 부정적인 면은 감소되도록 하는 반면, TGFβ의 긍정적인 신호전달 영향에 실질적으로 영향이 없도록 남겨둔다. 본 발명의 다른 구체적인 예는 S1P3 수용체 결합에 대항하고, 그에 의하여 S1P 하류의 신호전달 캐스케이드를 방해하며, 특히 Smad 단백질 신호전달이 부적절한 결합조직 성장인자의 축적을 유발하는 안 질환의 치료를 위하여 Smad 신호전달을 방해하는 방법을 제공한다.

내피 분화 유전자 서브패밀리 3 수용체( EDG -3, S1P -3)의 길항제:

S1P-3 수용체의 길항제는 S1P-3 수용체와 그것의 천연 리간드인 S1P사이의 결합 친화성 또는 특이성을 약화시키는 제제를 포함한다. 그 길항제는 S1P 유사체일 수 있다. 길항제는 치환된 티아졸리딘, 특히 알킬-치환된 티아졸리딘 또는 아릴알킬-치환된 티아졸리딘, 치환된 티아지난, 특히 알킬-치환된 티아지난, 수라민과 같은 폴리설폰화 나프틸우레아(대부분 일반적으로 헥사소듐 염으로써 이용가능함), 또는 아래에서 언급한 구조Ⅲ을 갖는 S1P 유사체; S1P3 수용체에 결합 특이성 및 친화성이 있는 항체, 그의 생물학적 활성 항체 단편, 펩티드 또는 펩티드 모방체; 또는 길항제의 약제학적으로 허용되는 염일 수 있다. 여기서 언급된 길항제 제제는 라세미 혼합물, 부분입체이성질체 또는 거울상 이성질체일 수 있다.

"길항제의 약제학적으로 허용되는 염"은 S1P3 수용체의 길항 활성을 보유하는 길항제의 염이고 인체에 허용되는 것이다. 여기에서 길항제는 아미노 또는 카복시 치환기를 가질 수 있기 때문에 염은 산 또는 염기성일 수 있다.

치환된 티아졸리딘은 구조Ⅰ을 갖는다:

상기 식에서,

R₁은 C₆-C₁₃알킬, 또는 알킬-치환된 아릴이고 상기 치환체는 C₅-C₉알킬이다.

본 발명의 하나의 구체적인 예에서, 길항제는 구조Ⅰ을 갖고, 여기에서 R₁은 C₁₀알킬 또는 C₁₁알킬(2-알킬티아졸리딘-4-카복실산, 여기서 상기 알킬은 C₁₀ 또는 C₁₁임)이다. R₁이 C₁₁ 알킬일때, 길항제는 Cayman Chemical(Ann Arbor, Michigan)에서 상업적으로 입수가능한 CAY10444이다. 본 발명의 다른 구체적인 예에서, 길항제는 구조Ⅰ을 갖고, 여기서 R₁은 알킬-치환된 페닐이고, 페닐 고리 상의 치환체는 m- 또는 p- C₇ 알킬(즉, 2-(m- 또는 p-헵틸페닐)티아졸리딘-4-카복실산)이다.

본 발명의 하나의 구체적인 예에서, S1P3의 길항제는 구조Ⅱ를 갖는다:

상기 식에서,

R₂는 C₉-C₁₃알킬이다.

본 발명의 다른 구체적인 예에서, S1P3의 길항제는 구조Ⅲ을 갖는다:

상기 식에서,

R₃는 o- 또는 m- C₅-C₈알킬이고;R₄는 포스페이트, 포스페이트 유사체, 포스포네이트 또는 설페이트이다. 여기서 사용되는 "포스페이트 유사체"는 예컨대, 포스포로-티오에이트, -디티오에이트, -셀레노에이트, -디셀레노에이트, -아닐로티오에이트, -아닐리데이트, -아미데이트, 또는 보론 포스페이트를 포함한다.

S1P3 신호전달에 활성적인 추가적인 화합물들은 본원에 참조로 인용된 Lynch 등에 의한 2005년 10월 6일 공개된 미국 특허출원 공개 제 2005/0222422호, 및 Koide 등에 의한 문헌 [J Med Chem, Vol.45:4629-4638, 2002]에 기술되어 있다.

S1P3 수용체의 추가적인 길항제를 확인하기 위한 분석은 길항제 후보물질, S1P, S1P3 수용체 및 활성화된 S1P3 수용체에 활성을 갖는 키나제를 혼합하고, 얻어진 포스포릴화 S1P3 수용체의 양을 측정하는 단계를 포함할 수 있는 경쟁 결합 분석을 이용한다. 결과를 동일하나 길항제 후보물질 없이 수행한 분석에서 얻어진 포스포릴화 S1P3의 양과 비교한다. 길항제 후보물질은 포스포릴화 S1P3 수용체의 수준이 후보물질이 존재하지 않을 때에 비하여 낮은 경우 길항제 활성을 갖는다. 추가적인 분석은 길항제 후보물질에 의한 수용체 특이 항체 결합의 저해, 길항제 후보물질에 의한 CTGF mRNA 축적의 감소, 또는 길항제 후보물질에 의한 CTGF 단백질 축적의 감소와 같은 분석을 포함할 수 있다. 앞서 참고로 인용된 Lynch 등에 의한 2005년 10월 6일 공개된 미국 특허출원 공개 제 2005/0222422호는 인간 S1P 수용체에 대한 S1P 모방체의 S1P 활성을 측정하는 GTP 결합 분석을 기술하고 있다.

치환된 티아졸리딘 및 치환된 티아지난은 당해 기술분야에서 공지된 방법, 예를 들면 Koide 등에 의해 기술된 방법(J Med Chem, Vol. 45:4629-4638, 2002)을 사용하여 합성된다. 앞서 참조로 인용된 Lynch 등에 의한 2005년 10월 6일 공개된 미국 특허출원 공개 제 2005/0222422호는 구조Ⅲ을 갖는 S1P 유사체의 합성을 기술한다.

S1P3 수용체에 대하여 결합 특이성 및 친화성을 갖는 항체들은 상업적으로 입수가능하며, 예를 들면 마우스의 단일클론 항체는 GENETEX, Inc.(카타로그 번호 GTX12254, San Antonio, TX)로부터 입수할 수 있고, 스핑고리피드 수용체 Edg3/S1P3에 대한 토끼의 다클론성 항체는 Novos Biologics Inc.(카타로그 번호 NLS 1031, Littleton, CO)로부터 입수할 수 있으며, EDG-3 CT 항체는 Exalpha Biologicals Inc.(Watertown, MA)로부터 입수할 수 있다. EDG-3 CT는 인간 S1P3 수용체의 독특한 C-말단 펩티드에 대해 결합 친화성 및 특이성을 가진다.

S1P-3 수용체에 대한 길항작용과 결과적인 CTGF 축적의 저해는 또한 인간이나 포유동물에서 안 질환의 개선이 관찰됨으로써 추론된다. 예를 들어, 연령-관련 황반변성에서 시력 상실의 감소와 반전은 CTGF 축적의 저해를 나타내고, 녹내장 환자의 경우 녹내장으로 발전될 위험에 있는 대상에서 낮아진 안압 및 증상 발병의 지연이나 예방은 CTGF 축적의 저해를 나타낸다.

본 발명의 길항제는 예를 들면, 본원에서 앞서 참고로 인용된 Lynch 등에 의한 2005년 10월 6일 공개된 미국 특허출원 공개 제 2005/0222422호에 의해 기술된 제제와 같이 CTGF 축적이나 활성이 부적절한 경우 안 질환의 치료를 위한 다른 제제와 함께 배합하여 사용될 수도 있다.

투여 방식:

길항제는 눈에 직접적으로 전달되거나(예를 들면: 국소용 점안제 또는 연고; 쿨-데-삭(cul-de-sac)중 또는 공막(sclera, (transscleral))에 인접하여 삽입되거나 또는 안구내의 서방출형 장치; 눈주위(periocular), 결막(conjunctival), 서브-테논(sub-Tenons), 앞방내(intracameral), 유리체강내(intravitreal), 망막하(sub-retinal), 눈뒤(retrobulbar) 또는 소관내(intracanalicular) 주사) 또는 당업자들에게 잘 공지되어 있는 기술을 사용하여 전신적(예를 들면: 경구; 정맥내, 피하 또는 근육내 주사; 비경구, 피부 전달)으로 전달될 수 있다. 본 발명의 길항제는 망막 펠렛(retinal pellet), 안내 삽입물(intraocular insert), 카테터, 좌제와 같은 플레이스먼트 장치(placement device) 또는 다공성, 비다공성 또는 젤라틴성 물질을 포함하는 임플란트 장치에서 제형화될 수 있다는 것을 추가적으로 생각할 수 있다. 앞방내(Intracameral) 주사는 각막을 통과하여 전방(anterior chamber)내로 주어져 제제를 잔기둥그물에 다다르게 할 수 있다. 소관내 주사는 정맥 집결관 배농 쉴렘 관(venous collector channels draining Schlemm's canal) 또는 쉴렘 관내로 행해질 수 있다.

대상:

안 질환 치료가 필요하거나 안 질환으로 발전될 위험이 있는 대상은 CTGF의 부적절한 축적을 수반하는 Smad 활성과 관련되는 상태를 가지거나 그러한 위험이 있는 인간 또는 다른 포유동물이다. 이러한 안 질환은, 예를 들면 고혈압, 녹내장, 황반변성, 당뇨망막병증, 맥락막 혈관신생, 증식 유리체망막병증, 눈 상처치유 및 과도한 흉터형성, 내피세포 증식 또는 섬유증식(fibroproliferation)을 수반하는 상태를 포함할 수 있다. 이러한 질환과 관련 있는 안구 구조체는 예컨대 망막, 맥락막, 수정체, 각막, 잔기둥그물, 로드, 추체, 갱글리아, 황반, 홍채, 공막, 안구방(aqueous chamber), 유리체방(vitreous chamber), 모양체(ciliary body), 시각신경유두(optic disc), 유두(papilla) 또는 망막중심오목(fovea)을 포함할 수 있다.

제형 및 투여량:

약제학적 제형은 물, 버퍼, 염수, 글리신, 히알루론산, 만니톨 등과 같은 생리학적으로 허용되는 눈의 담체 매질과 혼합된 본원에 언급된 길항제 또는 그의 염을 99% 중량 이하로 포함한다. 본 발명의 관점에서 구체적으로 가능한 제형의 예는 다음과 같다.

화합물	양(중량%)
S1P-3 수용체 길항제	99 이하; 0.1-99; 0.1-50; 0.5-10.0; 0.01-5.0; 0.01-2.0; 0.02-2.0; 0.1-1.0; 0.5-2.0
하이드록시프로필메틸셀룰로스	0.5
소듐 클로라이드	.8
벤잘코늄 클로라이드	0.01
EDTA	0.01
NaOH/HCl	qs pH 7.4
정제수	qs 100mL

화합물	양(중량%)
S1P-3 수용체 길항제	99 이하; 0.1-99; 0.1-50; 0.5-10.0; 0.01-5.0; 0.01-2.0; 0.02-2.0; 0.1-1.0; 0.5-2.0; 0.00005-0.5; 0.0003-0.3; 0.0005-0.03; 0.001
포스페이트 버퍼 염수	1.0
벤잘코늄 클로라이드	0.01
폴리소르베이트 80	0.5
정제수	q.s.100%

화합물	양(중량%)
S1P-3 수용체 길항제	99 이하; 0.1-99; 0.1-50; 0.5-10.0; 0.01-5.0; 0.01-2.0; 0.02-2.0; 0.1-1.0; 0.5-2.0; 0.001
일염기성 소듐 포스페이트	0.05
이염기성 소듐 포스페이트 (무수)	0.15
소듐 클로라이드	0.75
다이소듐 EDTA	0.05
크레모포르 EL(Cremophor EL)	0.1
벤잘코늄 클로라이드	0.01
HCl 및/또는 NaOH	pH 7.3-7.4
정제수	q.s.100%

화합물	양(중량%)
S1P-3 수용체 길항제	99 이하; 0.1-99; 0.1-50; 0.5-10.0; 0.01-5.0; 0.01-2.0; 0.02-2.0; 0.1-1.0; 0.5-2.0; 0.0005
포스페이트 버퍼 염수	1.0
하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린	4.0
정제수	q.s.100%

추가적인 구체적 예로, 안과용 조성물은 길항제를 약 0.1-100 나노몰(nM) 또는, 더욱 구체적으로 1-10nM의 안내 농도를 제공하도록 제형화된다. 국소용 조성물은 숙련된 임상의의 통상적인 판단에 따라서 하루에 1회 내지 4회 안구 표면에 전달된다. 제형의 pH는 4-9, 또는 4.5 내지 7.4이어야 한다. 전신용 제형은 양 10 내지 1000mg의 길항제를 포함할 수 있다.

"유효량"은 S1P-3 수용체와 Smad 간의 결합을 방해할 수 있는 S1P-3 수용체 길항제의 양을 말한다. 이러한 방해는 대상에서 낮아진 Smad 활성, 낮아진 CTGF 유전자 전사, 낮아진 CTGF 단백질 축적 및 안 질환 증상의 결과적인 감소를 유도한다. 이러한 방해는 본원에서 언급하는 안 질환으로 발전 될 위험에 있는 대상에서 증상의 발병을 지연시키거나 예방한다. 제형의 유효량은 예를 들어, 대상의 연령, 인종 및 성별과 같은 요소 또는 안구 상태의 심각도에 따라 달라질 수 있다. 하나의 구체적인 예로, 길항제는 눈에 국소적으로 전달되어 치료용량으로 잔기둥그물, 망막 또는 시신경유두에 도달하고, 그에 의해 안 질환 진행이 개선된다.

허용되는 담체 :

안구에 허용되는 담체는 기껏해야 안구에 자극이 거의 없거나 전혀 없고, 필요하다면 적절한 보존성을 제공하며, 균질한 투여량으로 하나 또는 그 이상의 본 발명의 S1P-3 길항제를 전달하는 담체를 의미한다. 안구 전달을 위하여, S1P-3 길항제를 안과적으로 허용되는 방부제, 공동용매, 계면활성제, 점도 증강제, 침투 증강제, 버퍼, 소듐 클로라이드 또는 물과 배합하여, 수성, 멸균 안용 현탁액 또는 용액을 형성할 수 있다. 안용 용액제 제형은 길항제를 생리학적으로 허용되는 등장 수성 버퍼에 용해시켜 제조할 수 있다. 추가적으로, 안용 용액제는 길항제가 녹는 것을 돕기 위하여 안구에 허용되는 계면활성제를 포함할 수 있다. 하이드록시메틸셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 점도 증강제가 화합물의 유지력을 증가시키기 위하여 본 발명의 조성물에 첨가될 수 있다.

멸균 안연고 제형을 제조하기 위하여, S1P-3 길항제를 미네랄 오일, 액체 라놀린 또는 백색 바셀린(petrolatum)과 같은 적절한 비히클에서 방부제와 혼합할 수 있다. 멸균 안용 젤 제형은 친수성 염기중에서 S1P-3 길항제를 현탁시켜 만들 수 있는데, 친수성 염기는 다른 안용 제형에 대한 기술분야에서 공지된 방법에 의해 예를 들어, CARBOPOL^®-940(BF Goodrich, Charlotte, NC) 등의 혼합으로 만들어진다. 예컨대, VISCOAT^®(Alcon Laboratories, Inc., Fort Worth, TX)가 안내 주사에 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 조성물은 S1P-3 길항제가 눈에 침투가 잘 되지 않을 경우, 크레머포르 및 TWEEN^®80(폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, Sigma Aldrich, St. Louis, MO)과 같은 침투증진제를 포함할 수 있다.

키트 :

본 발명의 구체적인 예는 세포에서 S1P3 수용체 신호전달을 약화시키기 위한 길항제를 포함하는 키트를 제공한다. 그 키트는 엄중 밀폐된 상태로 본 발명의 길항제, 약제학적으로 허용되는 담체 및 선택적으로, 인쇄된 사용 설명서를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함한다.

실시예 1

S1P -자극 CTGF 유전자 발현의 저해

배양된 인간 잔기둥그물 세포에서 Edg3 수용체 길항작용이 CTGF 유전자 발현에 미치는 영향을 다음과 같이 결정할 수 있었다. 형질전환되거나 또는 형질전환되지 않은 인간 TM 세포 배양물((Pang 등, Curr Eye Res, Vol. 13:51-63, 1994; Steely 등, Invest Ophthalmol Vis Sci, Vol. 33:2242-2250, 1992; Wilson 등, Curr Eye Res, Vol. 12:783-793, 1993; Stamer 등, Curr Eye Res, Vol. 14:611-617, 1995)을 일정 기간 동안 자극량의 스핑고신-1-포스페이트 (S1P)로 처리하거나 처리하지 않았고, 또한 Edg3수용체 길항제로 처리하거나 처리하지 않았다. 분리된 배양물을 필요한 희석된 비히클(들)로 처리하여 대조군으로 사용하였다. 다음으로, 제조자의 지시에 따라서 Qiagen RNeasy 96 시스템(Qiagen)를 사용하여 TM 세포로부터 전체 RNA를 분리하였다.

세포 처리 후에 CTGF의 구별되는 발현을 실질적으로 앞서 기술한 대로(Shepard 등, IVOS, Vol. 42:3173, 2001) ABI Prism^® 7700 서열 검출 시스템(Applied Biosystems)을 사용한 정량적 실시간 RT-PCR(QRT-PCR)로 확인하였다. CTGF 증폭을 위한 프라이머는 프라이머 발현 소프트웨어(Primer Express software; Applied Biosystems)를 사용하여 디자인하였고, Fleenor 등에 의한 2004년 10월 8일 출원된 미국특허출원 제10/510,585호로서 2005년 10월 20일 공개된 미국 특허 출원 제20050234075호(본 명세서에서 참조로 인용됨)에서 언급한 Genbank accession # NM 001901.1의 인접 엑손에 아닐링하여 76-bp의 앰플리콘을 만들었다. CTGF의 증폭은 Fleenor등에 의한 공개된 미국 특허 출원 제 20050234075호에서 언급된 대로 18S 리보솜 RNA 유전자(GenBank accession #X03205)에 대해 디자인한 프라이머를 사용하여 18S rRNA 발현을 표준화하여, 69-bp 앰플리콘을 만들었다. CTGF QRT-PCR은 40nM 18S 또는 900nM CTGF 프라이머; 100nM 18S 프로브 또는 100nM CTGF; 5㎕ RNA; 1X Multiscribe와 RNase 저해제 혼합물 (ABI); 및 1X TaqMan^® Universal 혼합물 (ABI)로 구성된 50㎕ 최종 부피로 18S 프라이머/프로브 세트와 혼합하여 수행하였다. 온도 순환 조건은 48℃에서 30분 그리고 95℃에서 10분, 이후 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분의 40회 순환으로 구성하였다. 데이터 분석은 SDS 스프트웨어 버전 1.9.1 (Applied Biosystems)과 MS Excel 2002 (Microsoft)를 사용하여 수행하였다. 상대적인 RNA 농도의 정량은 PE Biosystems User Bulletin #2에 기술된 바와 같이 델타 델타 Ct 방법을 사용하였다. 증폭산물의 수준은 4중 QRT-PCR 분석의 평균값±SEM으로서 나타내었다. 데이터 분석은 SDS 스프트웨어 버전 1.9.1 (Applied Biosystems)과 MS Excel 97 (Microsoft)를 사용하여 수행한다.

실시예 2

세포외기질 -관련 단백질의 발현에서 S1P -자극 변화의 저해

Edg3 수용체의 길항작용이 배양된 인간 잔기둥그물 세포에서 세포외기질-관련 단백질의 발현에 미치는 영향을 다음과 같이 결정하였다. 인간 TM세포 배양물을 반복 그룹 및/또는 실험 그룹 및/또는 대조군 그룹으로 나누고, 대조용액이나 희석된 비히클(들)을 포함하는 실험 용액(대조군으로서) 및/또는 S1P (자극제로서) 및/또는 Edg3 수용체 길항제를 첨가하였다. 피브로넥틴, 플라스미노겐 활성제 저해제Ⅰ (PAI-Ⅰ), 콜라겐, 피브릴린, 비트로넥틴, 라미닌, 트롬보스폰딘Ⅰ, 프로테오글리칸 또는 인테그린과 같은 세포외기질-관련 단백질의 수준을 표준 효소면역측정법(ELISA)으로 각 세포 배양군에서 측정하였다. 이러한 분석은 당업자들에게 잘 공지되어 있고, 특정 단백질의 검출을 위한 마커로서 항체 또는 항원과 결합하는 효소를 사용하는 민감한 면역분석법이다. 이러한 의미에서, 실험 용액에 미치는 영향을 결정하기 위하여 다양한 세포외기질-관련 단백질 수준의 그룹간 비교가 가능하다.

처리된 인간 TM 세포 배양물로부터 얻어진 상층액에서 Edg3 수용체 길항작용이 PAI-1의 수준에 미치는 영향의 예를 도 2A 및 도 2B에 나타내었다. 본 연구를 위하여, 인간 TM 세포 배양물을 다양한 양의 내인성 Edg 수용체 작용제 S1P의 존재하 및/또는 S1P와 구조적 유사체인 FTY720의 다양한 양의 존재하에서, Edg3 수용체 서브타입 길항제 CAY10444로 처리하거나 또는 처리하지 않았다. 24시간 후, 분비된 PAI-1 단백질의 수준을 처리된 배양물로부터 얻은 상층액 일부로 ELISA를 하여 결정하였다. 이러한 데이터로부터 두 작용제의 효과가 강력하면서 효과적으로 CAY10444에 의해 길항되는 것이 명백하였다(데이터는 평균과 SEM으로 나타내었다).

본원에 언급된 참조문헌은 대표적인 과정 또는 다른 상세한 보충 사항들을 제공하는 정도로 특별하게 참고로 인용되었다.

당업자라면, 본원에 개시된 것에 비추어 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서 본원에 기재된 구체예의 자명한 변형이 행해질 수 있다는 것을 인지할 것이다. 본원에 개시된 모든 구체 예는 개시내용에 비추어 볼 때 과도한 실험을 거치지 않고 만들거나 수행될 수 있다. 본 발명의 전체 보호범위는 개시 내용 및 그 균등 구체예들을 포함한다. 본 명세서는 본 발명의 전체 보호범위를 좁히는 것으로 해석되지 않아야 한다.

달리 언급이 없는 한, 단수는 "하나의", "적어도 하나의" 또는 "하나 이상의"를 의미한다.

Claims

유효량의 내피 분화 유전자 서브패밀리 3 수용체의 길항제 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염; 및

약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상에 투여하고, 이에 의해 대상의 눈에서 Smad 신호전달을 약화시키는 것을 포함하는, 대상의 눈에서 Smad 신호전달을 약화시키는 방법.
제1항에 있어서, 대상이 부적절한 결합조직 성장인자 축적을 수반한 Smad 신호전달 관련 안 질환을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 대상이 부적절한 결합조직 성장인자의 축적을 수반한 Smad 신호전달 관련 안 질환으로 발전될 위험이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, Smad 신호전달 관련 안 질환이 고안압증, 녹내장, 녹내장성 망막병증, 시각신경병증, 황반변성, 당뇨망막병증, 맥락막 혈관신생, 증식 유리체망막병증 또는 눈 상처치유인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 길항제가 스핑고신-1-포스페이트 유사체인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 길항제가 치환된 티아졸리딘인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 길항제가 치환된 티아지난인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 갈항제가 구조 I을 갖는 것을 특징으로 하는 방법:

상기 식에서,

R₁은 C₆-C₁₃알킬, 또는 알킬-치환된 아릴이고, 여기에서 아릴 치환체는 C₅-C₉알킬이다.
제8항에 있어서, R₁이 C₁₀ 또는 C₁₁알킬인 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, R₁이 알킬-치환된 페닐이고, 여기에서 치환체는 m- 또는 p- C₇알킬인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 길항제가 구조 II를 갖는 것을 특징으로 하는 방법:

상기 식에서,

R₂는 C₉-C₁₃알킬이다.
제1항에 있어서, 길항제가 폴리설폰화 나프틸우레아인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 길항제가 구조 III을 갖는 것을 특징으로 하는 방법:

상기 식에서,

R₃는 o- 또는 m- C₅-C₈알킬이고;

R₄는 포스페이트, 포스페이트 유사체, 포스포네이트 또는 설페이트이다.
제1항에 있어서, 길항제가 수용체에 결합 친화성 및 특이성이 있는 항체 또 는 그의 생물학적 활성 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 길항제가 수용체에 결합 친화성 및 특이성이 있는 펩티드 또는 펩티드 모방체(peptidomimetic)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 조성물이 국소적, 전방내, 유리체내, 경공막 또는 삽입 경로를 통해 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 조성물 내 길항제의 농도가 0.01% 내지 2%인 것을 특징으로 하는 방법.
유효량의 내피 분화 유전자 서브패밀리 3 수용체의 길항제 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염; 및

약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상에 투여하고, 이에 의해 Smad 신호전달 관련 안 질환이 치료되는 것을 포함하는, 치료가 필요한 대상에서 부적절한 결합조직 성장인자 축적과 관련된 Smad 신호전달 관련 안 질환을 치료하는 방법.
제18항에 있어서, 대상이 고안압증 또는 녹내장을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 대상이 고안압증 또는 녹내장으로 발전할 위험이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 길항제가 스핑고신-1-포스페이트 유사체인 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 길항제가 치환된 티아졸리딘인 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 길항제가 치환된 티아지난인 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서 길항제가 구조 I을 갖는 것을 특징으로 하는 방법:

상기 식에서,

R₁은 C₆-C₁₃알킬, 또는 알킬-치환된 아릴이고, 여기에서 아릴 치환체는 C₅-C₉알킬이다.
제24항에 있어서, R₁이 C₁₀ 또는 C₁₁알킬인 것을 특징으로 하는 방법.
제24항에 있어서, R₁이 알킬-치환된 페닐이고, 여기에서 치환체는 m- 또는 p- C₇알킬인 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 길항제가 구조 II를 갖는 것을 특징으로 하는 방법:

상기 식에서,

R₂는C₉-C₁₃알킬이다.
제18항에 있어서, 길항제가 폴리설폰화 나프틸우레아인 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 길항제가 구조 III을 갖는 것을 특징으로 하는 방법:

상기 식에서,

R₃는 o- 또는 m- C₅-C₈알킬이고;

R₄는 포스페이트, 포스페이트 유사체, 포스포네이트 또는 설페이트이다.
제18항에 있어서, 길항제가 수용체에 결합 친화력과 특이성이 있는 항체 또는 그의 생물학적 활성 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 길항제가 수용체에 친화성 및 특이성이 있는 펩티드 또는 펩티드 모방체인 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 조성물이 국소적, 전방내, 유리체내, 경공막 또는 삽입 경로를 통해 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 조성물내 길항제의 농도가 0.01% 내지 2%인 것을 특징으로 하는 방법.
유효량의 내피 분화 유전자 서브패밀리 3 수용체의 길항제 또는 약제학적으로 허용되는 그의 염; 및

약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상에 투여하고, 이에 의 해 녹내장이 치료되는 것을 포함하는, 대상에서 녹내장을 치료하는 방법.
유효량의 내피 분화 유전자 서브패밀리 3 수용체의 길항제 또는 약제학적으로 허용되는 그의 염; 및

약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상에 투여하고, 이에 의해 녹내장성 망막병증, 시각신경병증, 황반변성, 당뇨망막병증, 맥락막 혈관신생, 증식 유리체망막병증 또는 눈 상처치유가 치료되는 것을 포함하는, 대상에서 녹내장성 망막병증, 시각신경병증, 황반변성, 당뇨망막병증, 맥락막혈관신생, 증식 유리체망막병증 또는 눈 상처치유를 치료하는 방법.