MXPA06007062A - Antagonistas cdk2 como antagonistas del factor de transcripcion c-maf de forma corta para el tratamiento de glaucoma. - Google Patents

Abstract

La version de forma corta del factor de transcripcion c-Maf se sobre-regula en celulas de malla trabecular tratadas con el factor beta2 de crecimiento transformante, y se presente en niveles elevados en celulas de malla trabecular glaucomatosas contra normal y en tejido principal del nervio optico glaucomatoso contra normal. La expresion del factor de transcripcion c-Maf de forma corta bajo estas condiciones indica un papel causal o ejecutador para el factor en patogenesis de glaucoma primario de angulo abierto o inducido por esteroides. El antagonismo de la expresion y/o actividad del factor de transcripcion c-Maf de forma corta en la malla trabecular u otro tejido ocular se proporciona para inhibir o aliviar patogenesis de glaucoma. Los antagonistas incluyen inhibidores de cinasa 2 dependientes de ciclina.

Description

ANTAGONISTAS CDK2 COMO ANTAGONISTAS DEL FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN C-MAF DE FORMA CORTA PARA EL TRATAMIENTO DE GLAUCOMA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona al campo de agentes profilácticos y terapéuticos para glaucoma, particularmente para glaucoma primario de ángulo abierto y glaucoma inducido por esteroides.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La malla trabecular (TM) es un tejido complejo que incluye células endoteliales, tejido conectivo y matriz extracelular ubicado en el ángulo entre la córnea y el iris que proporciona la resistencia normal requerida para mantener una presión intraocular (IOP) . Una presión intraocular adecuada es necesaria para mantener la forma del ojo y para proporcionar un gradiente de presión que permita el flujo de humor acuoso a la córnea avascular y el cristalino. La IOP excesiva, presente normalmente en glaucoma, tiene efectos nocivos en el nervio óptico, conduce a pérdida de células y axones del ganglio retinal, y resulta en pérdida visual progresiva y ceguera si no se trata. El glaucoma es una de las causas principales de ceguera alrededor del mundo. Los glaucomas primarios resultan de disturbios en el flujo del fluido intraocular que tiene una base anatómica o fisiológica. Los glaucomas secundarios ocurren como un resultado de daño o trauma en el ojo o una enfermedad preexistente. El glaucoma primario de ángulo abierto (POAG) , conocido también como glaucoma crónico o simple, representa el noventa por ciento de todos los glaucomas primarios . El POAG se caracteriza por la degeneración de la malla trabecular, resultando en resistencia anormalmente elevada de secreción de fluido a partir del ojo. Una consecuencia de tal resistencia es un incremento en la IOP que se requiere para conducir el fluido normalmente producido por el ojo a través de la resistencia incrementada. Se conocen ciertos fármacos tales como prednisona, dexametasona e hidrocortisona que inducen glaucoma incrementando la IOP. Además, el modo de administración parece afectar la IOP. Por ejemplo, la administración oftálmica de dexametasona conduce a incrementos mayores en IOP que la administración sistémica. El glaucoma que resulta de la administración de esteroides se llama glaucoma inducido por esteroides . Terapias anti-glaucoma actuales incluyen disminuir la IOP por el uso de supresores de la formación de humor acuoso o agentes que mejoran la descarga uveosclerótica, trabeculoplastía por láser o trabeculectomía la cual es una cirugía por filtración que mejora la secreción. Los métodos anti-glaucoma farmacéuticos han exhibido varios efectos secundarios indeseables. Por ejemplo, los mióticos tales como pilocarpina pueden provocar borrosidad de visión y otros efectos secundarios visuales negativos . Los inhibidores de anhidrasa carbónica sistémicamente administrados pueden provocar también náusea, dispepsia, fatiga y acidosis metabólica. Además, ciertos bloqueadores beta han llegado a asociarse cada vez más con serios efectos secundarios pulmonares atribuibles a sus efectos en los receptores beta-2 en el tejido pulmonar. Los simpatomiméticos provocan taquicardia, arritmia e hipertensión. Tales efectos secundarios negativos pueden conducir al acatamiento disminuido del paciente o a la terminación de la terapia. Más notablemente, las terapias anti-glaucoma actuales no centran directamente el daño patológico a la malla trabecular, el nervio óptico y la pérdida de células y axones del ganglio retinal, el cual continúa constante. En vista de la importancia del glaucoma, y las incompetencias de los métodos anteriores de tratamiento, sería deseable tener un método mejorado para tratar glaucoma que centraría las causas subyacentes de su progreso.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a un método de tratamiento para glaucoma primario de ángulo abierto o glaucoma inducido por esteroides en un sujeto con riesgo para desarrollar glaucoma primario de ángulo abierto o glaucoma inducido por esteroides o que tiene síntomas del mismo. El método comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición que comprende un antagonista del factor de transcripción c-Maf de forma corta y un portador aceptable. De acuerdo a la presente invención, la versión de forma corta del factor de transcripción c-Maf ha sido identificada como sobre-regulada en células de malla trabecular (TM) , tratadas con el factor ß2 de crecimiento transformante (TGF/32) y tratadas con esteroides, cuando se presenta en niveles elevados en tejido principal del nervio óptico glaucomatoso contra normal, y cuando se presenta en niveles elevados en células TM glaucomatosas contra normales. La expresión del factor de transcripción c-Maf de forma corta bajo estas condiciones indica un papel causal o ejecutador para el factor en patogénesis de glaucoma primario de ángulo abierto e inducido por esteroides. Los métodos de la presente invención implican el antagonismo de la transcripción, expresión y/o actividad del factor de transcripción c-Maf de forma corta en la malla trabecular u otro tejido ocular, tal como el tejido principal del nervio óptico, de manera que inhibe o alivia la patogénesis del glaucoma. El antagonista de la presente invención interfiere con la transcripción o la expresión del factor de transcripción c-Maf de forma corta. En una modalidad, el antagonista del factor de transcripción c-Maf de forma corta comprende un análogo de purina que tiene actividad inhibidora para cinasa dependiente de cdk2 ciclina. El antagonista puede comprender purvalanol A, purvalanol B, amino-purvalanol, olomoucina, N9-isopropilolmoucina, roscovitina, metoxi-roscovitina, combinaciones de los mismos, o sales de los mismos, por ejemplo. De acuerdo a otra modalidad, el antagonista que tiene actividad inhibidora para la cinasa dependiente de cdk2 ciclina no se basa en la purina y es una indirubina, un oxindol, un indenopirazol , una piridopirimidina, una anilinoquinazolina, un aminotiazol, un flavopiridol , una estaurosporina, una paulona, una himenialdisina, combinaciones de los mismos y sales de los mismos, por ejemplo. El uso de antagonistas de la expresión o actividad de la forma corta de c-Maf como agentes terapéuticos que protegen o rescatan a pacientes del daño provocado por el proceso de enfermedad de glaucoma dirige el progreso de la enfermedad además de los síntomas de la enfermedad, es decir, el proceso patogénico se altera como un resultado del tratamiento. Los antagonistas de expresión o actividad de c-Maf de forma corta son útiles para el tratamiento de POAG y glaucoma inducido por esteroides. La identificación del factor de transcripción c-Maf de forma corta como un-participante en la patogénesis de glaucoma y el uso de inhibidores de expresión o actividad como se presenta en la presente no se ha descrito previamente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS FIGURA 1. El análisis QPCR de la expresión c-Maf de forma corta en células agrupadas SGTM2697 demuestra la expresión genética inducida por TGF/32 sobre-regulada 16 veces cuando se compara con el control . FIGURA 2. El análisis QPCR de la expresión c-Maf de forma corta en células TM70A demuestra la expresión genética inducida por dexametasona sobre-regulada 2.1 veces en el día uno y 3.2 veces en el día 14 cuando se compara con el control . FIGURA 3. El análisis QPCR de la expresión c-Maf de forma corta en células SGTM2697 (P6) en la presencia y ausencia de purvalanolA para células básales e inducidas por TGF;d2.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona al uso de agentes que antagonizan la expresión y/o la actividad del factor de transcripción c-Maf de forma corta para el tratamiento de glaucoma. Las microdisposiciones del genoma humano se hibridizaron a ARN normal y glaucomatoso y el gen del factor de transcripción c-Maf de forma corta se sobre-reguló en las células de glaucoma cuando se compara con las células normales. Se han identificado genes relacionados con Maf como participantes importantes en el cristalino y el desarrollo de segmento anterior (Yoshida, et al . (1991) , Invest Opthalmol Vis Sci 38(12): 2679-83; Ogino et al . (1998), Science (280(5360): 115-8; Kawauchi, et al . (1999), J Biol Chem 2 '4 (27) : 19254-60; Kim, et al . (1999), Proc Nati Acad Sci USA 96 (1) : 3781-5; Ring, et al . (2000), Development 127(2): 307-17; Ishibashi et al . (2001), Mech Dev 101(1-2): 155-66; Jamieson, et al . (2002), Hum Mol Genet 11(1): 33-42; Reza, et al . (2002), Mech Dev 116(1-2): 61-73) . c-Maf ha demostrado que activa la expresión genética del cristalino, se activa por el producto genético de glaucoma Pax6 (Sakai, et al . (2001), Nucleic Acids Res 29(5): 1228-37; Yoshida, et al . (2001) Curr Eye Res 23(2): 116-9), y se auto-regula positivamente por su propio producto genético. Los ratones que carecen de c-Maf son micro-oftálmicos con formación defectuosa de cristalino, mientras que los mutantes nulos heterocigotos experimentan desarrollo ocular relativamente normal (Kim, et al. (1999) , Proc Nati Acad Sci USA 96(7) :3781-5) . c-Maf es un factor de transcripción de cierre de leucina de región básica (bZIP) . Los miembros de la familia Maf tienen <40% de homología en el dominio básico de sus motivos de bZIP. Existen formas cortas de exón sencillo (373 aminoácidos) y largas de dos exones (403 aminoácidos) del c-Maf, pero su diferencia funcional permanece desconocida. La forma corta de los extremos c-Maf con una metionina en el término C. La secuencia de aminoácido terminal de carboxi adicional para la forma larga es ITEPTRKLEPSVGYATFWKPQHRVLTSVFTK, SEC. DE IDENT . NO.: 4. Como se utiliza en la presente, el término "factor de transcripción c-Maf de forma corta" significa el gen que codifica el factor de transcripción c-Maf de forma corta o el producto de protelna de 373 aminoácidos de la secuencia de proteína depositada bajo el No. de Acceso Gen Bank AF055376. La Patente Norteamericana No. 6,274,338 para Glimcher et al . , la descripción total de la cual se incorpora en la presente para referencia, describe la información de la secuencia del ácido nucleico y la secuencia de la proteína para c-Maf humano, así como moléculas antisentido y anticuerpos anti-cMaf. La secuencia del cMaf de la Patente Norteamericana .6,274,338 se ubica en GenPept como el acceso # AAE79064. Esta secuencia iguala la forma larga de c-Maf con la excepción de varias incompatibilidades del aminoácido, incluyendo una eliminación de 3 aminoácidos en los aminoácidos 241-243 cuando se compara con la secuencia de proteína contenida en GenBank números AF055376 (secuencia de forma corta y AF055377 (secuencia de forma larga) . Antagonistas del factor de transcripción c-Maf de forma corta : Los antagonistas del factor de transcripción c-Maf de forma corta incluyen agentes que disminuyen la transcripción del gen de forma corta, inhiben la expresión de forma corta o inhiben la actividad de forma corta por ejemplo. En particular, se ha encontrado que los inhibidores de cinasa dependiente de cdk2 ciclina, particularmente análogos de purina, des-regulan la transcripción del factor de transcripción c-Maf de forma corta. La Tabla 1 proporciona una lista de antagonistas del factor de transcripción c-Maf de forma corta que tiene actividad inhibidora para cdk2.

Tabla 1. Antagonistas del Factor de Transcripción c-Maf de Forma Corta Se describen agentes inhibidores cdk2 adicionales en la Patente Norteamericana No. 6,573,044 para Gray et al . , Rosania et al . , Exp . Opin . Ther. Patents (2000) 10(2); 215-230, en particular, la sección 3 a inhibidores de molécula pequeña, Fischer, P.M., Cell transmissions 19:1, página 3-9, Marzo, 2003. Alguien con experiencia en la técnica a la luz de la presente especificación apreciará que los agentes pueden ser una mezcla racémica, o cualquier diastereómero o enantiómero, de acuerdo a los sustituyentes. A pesar de su variedad química, muchos de los compuestos de la Tabla 1 compiten con ATP para el sitio de unión en el complejo ciclina/cdk2. Por ejemplo, los resultados del análisis estructural han demostrado que la porción de purina de muchos de los inhibidores de purina se une a la cavidad de unión de adenina del cdk2 , evitando la unión de su ligando real. Un sistema de anillo heterocíclico plano parece ser una característica estructural común para muchos inhibidores cdk2. Un ensayo para un antagonista del- factor de transcripción c-Maf de forma corta comprende combinar un antagonista candidato con el gen del factor de transcripción c-Maf en un entorno que permita que ocurra la transcripción y la expresión. Una cantidad del factor de transcripción c-Maf presente o una cantidad menor que aquella en la ausencia del antagonista candidato indican que el antagonista candidato es, de hecho, un antagonista de c-Maf. Modo de administración : El antagonista puede suministrarse directamente al ojo (por ejemplo: gotas oculares tópicas o ungüentos; dispositivos de liberación lenta en fondo de saco o implantados adyacentes a la esclerosis o dentro del ojo; inyecciones periocular, conjuntival, sub-tenones, intracameral, intravítrea o intracanalicular) o sistémicamente (por ejemplo; oralmente; inyecciones intravenosa, subcutánea o intramuscular; parenteralmente, suministro dérmico) utilizando técnicas bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Se contempla además que los antagonistas de la invención pueden formularse en inserción intraocular o dispositivos de implante. La inyección intracameral puede ser a través de la córnea dentro de la cámara anterior que permite al agente alcanzar la malla trabecular. La inyección intracanalicular puede ser dentro de los canales recolectores venosos que drenan el canal Schlemm o dentro del canal Schlemm. Sujeto : Un sujeto tratado para glaucoma primario de ángulo abierto o para glaucoma inducido por esteroides como se describe en la presente puede ser un ser humano u otro animal con riesgo de desarrollar glaucoma primario de ángulo abierto o glaucoma inducido por esteroides o que tiene síntomas de glaucoma primario de ángulo abierto o glaucoma inducido por esteroides . Formulaciones y Dosis : Los antagonistas de la presente invención pueden administrarse como soluciones, suspensiones o emulsiones (dispersiones) en un portador oftálmico adecuado. Los siguientes son ejemplos de posibles formulaciones representadas por esta invención.

Cantidad en peso % Inhibidor del factor de trascripción c :-Maf 0.01-5; 0.01-2.0; 0.5-2.0 Hidroxipropilmetilcelulosa 0.5 Cloruro de sodio .8 Cloruro de benzalconio 0.01% EDTA 0.01 NaOH/HCI es pH 7.4 Agua Purificada cs l OO ml Cantidad en peso % Antagonista de trascripción c-Maf 0.00005-0.5;0.0003-0.3;0.0005-0.03;0.0001 Solución Salina Regulada con Fosfato 1.0 Cloruro de Benzalconio 0.01 Polisorbato 80 0.5 Agua Purificada c.s. a 100% Antagonista de trascripción c-Maf 0.001 Fosfato de sodio monobásico 0.05 Cantidad en peso % Fosfato de sodio dibásico 0.15 (anhidro) Cloruro de sodio 0.75 EDTA disódico 0.05 Cremophor EL 0.1 Cloruro de Benzalconio 0.01 HCl y/o NaOH pH 7.3-7.4 Agua purificada es. a 100% Cantidad en peso % Antagonista de trascripción c-Maf 0.0005 Solución salina regulada con fosfato 1.0 Hidroxipropil-ß-ciclodextrina 4.0 Agua purificada c.s. a 100% En una modalidad adicional, ' las composiciones oftálmicas se formulan para proporcionar una concentración intraocular de aproximadamente 0.1-100 nanomolar (Nm) o, en una modalidad adicional, 1-10 nM del antagonista. Las composiciones tópicas se suministran a la superficie del ojo una a cuatro veces por día de acuerdo al criterio de rutina del especialista clínico experimentado. El pH de la formulación debe ser 4-9 ó 4.5 a 7.4. Las formulaciones sistémicas pueden contener aproximadamente 10 a 1000 mg del antagonista . Una "cantidad efectiva" se refiere a esa cantidad del antagonista c-Maf que es capaz de interrumpir la expresión o actividad de c-Maf de forma corta. Tal interrupción conduce a la presión intraocular disminuida, y a la reducción de síntomas de glaucoma en un sujeto que exhibe síntomas de glaucoma primario de ángulo abierto o glaucoma inducido por esteroides. Tal interrupción retrasa o evita el inicio de síntomas en un sujeto con riesgo de desarrollar glaucoma. La cantidad efectiva de una formulación puede depender de factores tales como la edad, la raza, el sexo del sujeto, o la severidad del glaucoma, por ejemplo. En una modalidad, el antagonista se suministra tópicamente al ojo y alcanza la malla trabecular, la retina o la cabeza del nervio óptico en una dosis terapéutica por lo que mejora el proceso de enfermedad de glaucoma. Aunque el régimen preciso se deja al criterio del especialista clínico, la solución o soluciones resultantes se administran de preferencia colocando una gota de cada una de la o las soluciones en cada ojo una a cuatro veces al día, o como se indica por el especialista clínico. Portadores Aceptables : Un portador farmacéuticamente aceptable se refiere a aquellos portadores que provocan como máximo, poca o ninguna irritación ocular, proporcionan preservación adecuada si es necesaria, y suministran uno o más antagonistas c-Maf de la presente invención en una dosis homogénea. Para suministro oftálmico, un inhibidor de transcripción c-Maf puede combinarse con conservadores oftalmológicamente aceptables, co-solventes, agentes tensioactivos, mejoradores de viscosidad, mejoradores de penetración, tampones, cloruro de sodio o agua para formar una suspensión o suspensión oftálmica estéril, acuosa. Las formulaciones de solución oftálmica pueden prepararse disolviendo el inhibidor en un tampón acuoso isotónico fisiológicamente aceptable. Además, la solución oftálmica puede incluir un agente tensioactivo oftalmológicamente aceptable para ayudar a disolver el inhibidor. Los agentes de construcción de viscosidad, tales como hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, metilcelulosa, polivinilpirrolidona o similares, pueden agregarse a las composiciones de la presente invención para mejorar la retención del compuesto. Con el fin de preparar una formulación de ungüento oftálmico estéril, el antagonista c-Maf se combina con un conservador en un vehículo apropiado, tal como un aceite mineral, lanolina líquida, o petrolato blanco. Las formulaciones de gel oftálmico estéril pueden prepararse al suspender el antagonista c-Maf en una base hidrofílica preparada a partir de la combinación de, por ejemplo, CARBOPOL®-940 (BF Goodrich, Charlotte, NC) , o similares, de acuerdo a los métodos conocidos en la técnica para otras formulaciones oftálmicas. VISCOAT® (Alcon Laboratorios, Inc., Fort Worth, TX) puede utilizarse para inyección intraocular, por ejemplo. Otras composiciones de la presente invención pueden contener agentes mejoradores de penetración tales como cremefor y TWEEN® 80 (monolaurato de polioxietilen sorbitán, Sigma Aldrich, St . Louis, MO) , en el caso de que los antagonistas c-Maf sean menos penetrantes en el ojo.

Ej emplo 1 Aislamiento de ARN a partir del Tejido de Malla Trabecular y las Células Se derivaron células de malla trabecular humana (TM) a partir de ojos donados (Central Florida Lions Eye and Tissue Bank, Tampa, FL) y se cultivaron como se describe previamente (Steely, et al . (1992), Invest Ophthalmol Vis Sci 33(7): 2242-50; Wilson, et al . (1993 ) Curr Eye Res 12(9): 783-93; Clark, et al . (1994), Invest Ophthalmol Vis Sci 35(1): 281-94; Dickerson, et al . (1998), Exp Eye Res 66(6): 731-8; Wang, et al . (2001), Mol Vis 1 : 89-94). Las células se derivaron a partir de grupos de cuatro cada uno, ya sea de líneas celulares normales o de glaucoma. El ARN total se aisló a partir de células TM de cada grupo que utilizando el reactivo TRIZOL® de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Carisbad, CA) .

Ej emplo 2 Análisis Affymetrix GeneChip La transcripción inversa, la síntesis de ADNc de la segunda hebra y el etiquetado con biotina del ARN amplificado se llevaron a cabo de acuerdo a los protocolos estándares Affymetrix. Se hibridizaron, se lavaron y se analizaron el genoma humano U133A y U133B de GENECHIPS® (Affymetrix, Santa Clara, CA) de acuerdo con los protocolos estándares Affymetrix. Las disposiciones de GENECHIPS® hibridizadas se analizaron con un explorador GENEARRAY® (Agilent Tecnologies, Palo Alto, CA.) . Los datos originales se recolectaron y se analizaron utilizando software Affymetrix Microarray Suite. Se realizó el filtrado de datos de microdisposición utilizando software GENSPRING® (Silicon Genetics, Redwood City, CA) . Para cada experimento, se normalizaron datos por chip dividiendo cada medición por el 50° percentil de todas las mediciones de intensidad de señal para ese chip. La relación de expresión para cada gen se calculó dividiendo la señal normalizada por gen en la muestra tratada o afectada por el término medio para ese gen en la muestra control para cada experimento. Los genes se seleccionaron para un nivel de expresión sobre el antecedente estadístico utilizando el Modelo de Error de Gene Cruzado y fijando la referencia igual al único valor base/proporcional para cada experimento. Sólo genes que se indicaron como presente/marginal en el Affymetrix U133A GENECHIP® en todas las condiciones experimentales se consideraron para análisis. El gen de forma corta c-Maf se representa sólo una vez en GENECHIP® U133A como el conjunto de sonda 209348-s-at. Se expresó c-Maf de forma corta al menos dos veces más elevado en la enfermedad o las condiciones tratadas contra control .

Ejemplo 3 PCR Cuantitativo Se generó el ADNc de primera hebra a partir de 1 µg del ARN total utilizando hexámeros aleatorios y reactivos de Transcripción Inversa TAQMAN® de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA) . Se diluyó la reacción de 100 µl diluida 20 veces para lograr una concentración de ADNc efectiva de 0.5 ng/µl . Se realizó la medición de la expresión del gen c- Maf de forma corta por RT-PCR en tiempo real, cuantitativa (QPCR) utilizando un Sistema de Detección de Secuencia ABI PRISM® 7700 (Applied Biosystems) esencialmente como se describe en Shepard, et al . (2001) Invest Ophthalmol Vis Sci 42(13) .- 3173-81. Los cebadores para la amplificación de c-Maf específicos de forma corta (Genbank Acceso #AF055376) se diseñaron utilizando el software PRIMER EXPRESS® (Applied Biosystems) . Las secuencias cebadoras delanteras e inversas fueron TTGGGACTGAATTGCACTAAGATATAA, SEC. DE IDENT. NO.: 1, (nucleótidos 3773-3799) y GCGTTCTAAACAGTTTTGCAATTTT, SEC. DE IDENT. NO.: 2, (nucleótidos 3823-3847), y la secuencia de sonda de unión de muesca menor fue CTGCAAGCATATAATACA, SEC. DE IDENT. NO.: 3, (nucleótidos 3801-3818). Se unió 6FAM al extremo 5' de la sonda de unión de muesca menor y se refiere al tipo de fluoróforo unido a la sonda TAQMAN®. Otras elecciones para el fluoróforo fueron el Fluoróforo JOE™ (Applied Biosystems) o fluoróforo VIC™ (Applied Biosystems) . El "Extinguidor No Fluorescente de Unión de Muesca Menor" se unió al extremo 3' de la sonda y se utilizó para extinguir la florescencia de 6FAM. La amplificación del amplicón cMaf de 75 pb se normalizó a niveles de ARNr 18S utilizando un conjunto de cebador/sonda de ARNr 18S pre-desarrollado IX (20X 18S MASTER MIX®; Applied Biosystems) . El QPCR c-Maf consistió de la Mezcla Universal IX TAQMAN® (Applied Biosystems) , 900 nM de cebador y 100 nM de concentraciones de sonda y 2.5 ng de ADNc en un volumen final de 50 µl . Las condiciones de ciclizacion térmica consistieron de 50 °C, 2 minutos, 95°C, 10 minutos seguidas por 40 ciclos a 95°C, 15 segundos, 60 °C, 1 minuto. La cuantificación de las concentraciones de ADNc relativas se hizo utilizando el método de curva estándar relativo como se describe en PE Biosystems User Boletín No. 2, ABI PRISM® 7700 Sequence Detection System, 2001 (Applied Biosystems) . Se realizó el análisis de datos con el software SDS versión 1.9.1 (Applied Biosystems) y MS Excel 97 (Microsoft) . Se utilizó el ARN total de referencia humana (Stratagene, La Jolla, CA) generando la curva estándar. Se presentan datos de QPCR como ± SEM promedio de la relación normalizada de c-Maf/18S.

Ejemplo 4 Expresión Genética c-Maf Inducida para TGF/32 en Células de Malla Trabecular El presente ejemplo demuestra que la forma corta de c-Maf se sobre-reguló de modo diferente en células glaucomatosas inducidas por beta 2 del factor de crecimiento transformante utilizando análisis de PCR cuantitativo. Se analizó el gen c-Maf de forma corta utilizando el análisis Affymetrix U133A GENECHIP® descrito en el Ejemplo 2 de un grupo de células de malla trabecular glaucomatosas designadas SGTM2697. Las células glaucomatosas se trataron durante 16 horas con 5 ng/ml del factor beta 2 de crecimiento transformante (TGF/32) para la inducción de la expresión genética. La expresión genética de la forma corta de c-Maf se identificó como sobre-regulada. La verificación de la sobre-regulación c-Maf se realizó por QPCR como se describe en el Ejemplo 3 utilizando ADNc derivado del ARN de célula SGTM2697 tratado con TGF/32 ± agrupado utilizado para el análisis Affymetrix GENECHIP®. Se sobre-reguló c-Maf de forma corta 16 veces por TGF/32 comparado al control como se muestra en la FIGURA 1. Los datos de la FIGURA 1 se presentan como la relación normalizada de c-Maf a los niveles de ARNm 18S ribosomales (SEM ± promedio, n=3) .

Ej emplo 5 Expresión del Gen c-Maf Inducida por Dexametasona en Células de Malla Trabecular El presente ejemplo demuestra que la forma de c-Maf se sobre-reguló de modo diferente en células glaucomatosas inducidas por dexametasona utilizando análisis de PCR cuantitativo. Se analizó la expresión genética c-Maf de forma corta utilizando el análisis Affymetrix U133A GENECHIP® descrito en el Ejemplo 2 para células de malla trabecular designada TM70A. Las células se trataron 1 día o 14 días con 10_7M de dexametasona (Dex) . La expresión genética de la forma corta de c-Maf se identificó cuando se sobre-regula. La verificación de la sobre-regulación de c-Maf se realizó por QPCR como se describe en el Ejemplo 3 utilizando el ADNc derivado del ARN de célula TM70A tratado con Dex ± utilizado para el análisis Afrymetrix GENECHIP®. Se sobre-reguló c-Maf de forma corta 2.1 veces en el día uno y 3.2 veces el día 14 del tratamiento con Dex comparado al control como se muestra en la FIGURA 2. Se presentan datos como la relación normalizada de c-Maf a los niveles de ARNm 18S ribosomales (SEM ± promedio, n = 3) .

Ejemplo 6 Inhibición de Molécula Pequeña de la Expresión del Gen c-Maf de Forma Corta Inducido por TGF/32 y Basal en las Células de Malla Trabecular El presente ejemplo demuestra que un inhibidor cdk2 es un antagonista de la expresión del gen c-Maf de forma corta . El efecto de inhibición de la molécula pequeña en la expresión del gen-Maf de forma corta se analizó por análisis QPCR como se describe en el Ejemplo 2 en células de malla trabecular glaucomatosas (Pasaje 6) designadas SGTM2697. Las células se trataron con o sin 5 ng/ml de TGF/32 y el purvalanol A inhibidor de cdk2/ciclina A durante 16 horas (Hardscastle, et al . (2002) Annu Rev Pharmacol Toxicol 42:325-348) . Se des-regularon los niveles de c-Maf básales 2.6 veces por tratamiento con purvalanol A como se muestra en la FIGURA 3. Se suprimió completamente c-Maf tratado con TGF/32 (sobre-regulado 17 veces) por co-tratamiento con purvalanol A como se muestra en la FIGURA 3. Los datos de la FIGURA 3 se presentan como la relación normalizada de c-Maf a los niveles de ARNm 18S ribosomales (SEM ± promedio, n=6) . El eje y de la FIGURA 3 tiene una escala inferior de 0.00 a 0.03 y una escala superior de 0.08 a 0.48. Como se sostiene por la inhibición de purvalanol A de la expresión del gen c-Maf de forma corta establecida anteriormente, la presente invención proporciona además inhibidores de cinasa 2 dependientes de ciclina como se describe en la presente para uso como antagonistas de expresión de la forma corta de c-Maf. Tales antagonistas son útiles como agentes profilácticos o terapéuticos para protegerse del, o tratar el daño provocado por el proceso de enfermedad de glaucoma.

Ejemplo 7 Factor de Transcripción c-Maf de Forma Corta en Tejido Principal de Nervio Óptico Glaucomatoso La versión de forma corta del factor de transcripción c-Maf se presenta en niveles elevados en el tejido principal del nervio óptico glaucomatoso contra normal utilizando el análisis de microdisposición Affymetrix GENECHIP®. Se derivó el tejido principal del nervio óptico a partir de grupos de cuatro o cinco ojos donados glaucomatosos . El ARN total se aisló del tejido principal del nervio óptico utilizando el reactivo TRIZOL® de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Invitrogen) . La expresión de c-Maf de forma corta en estas condiciones indica además un papel causal o ejecutador en la parte del factor en patogénesis de glaucoma. El antagonismo de la expresión y/o la actividad del factor de transcripción c-Maf de forma corta dentro del tejido ocular se proporciona para inhibir o aliviar patogénesis de glaucoma y para proporcionar neuroprotección para la retina y el nervio óptico. Las referencias citadas en la presente, en la medida que se proporcionan procedimientos ejemplares u otros detalles suplementarios a aquellos establecidos en la presente, se incorporan específicamente para referencia. Aquellos con experiencia en la técnica a la luz de la presente descripción, apreciarán que modificaciones obvias de las modalidades descritas en la presente pueden hacerse sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Todas las modalidades descritas en la presente pueden hacerse y ejecutarse sin experimentación indebida a la luz de la presente descripción. El alcance total de la invención se expone en la descripción y las modalidades equivalentes de la misma. La especificación no debe interpretarse que limita indebidamente el alcance total de protección al cual la presente invención se intitula. Como se utiliza en la presente y a menos que se indique de otro modo, los términos "un" y "uno" se toman para significar "uno" , "al menos uno" o "uno o más" .

Claims (34)

1. REIVINDICACIONES 1. El uso de una cantidad efectiva de una composición que comprende un antagonista del factor de transcripción c-Maf de forma corta en donde el antagonista tiene actividad inhibidora para cinasa dependiente de cdk2 ciclina y se selecciona a partir de oxindoles, piridopirimidinas, anilinoquinazolinas, flavopiridoles, olomuocina, N9-isopropilolomoucina, combinaciones de los mismos y sales de los mismos, y un portador aceptable en la preparación de un medicamento para el tratamiento de glaucoma primario de ángulo abierto o glaucoma inducido por esteroides en un suj eto .
2. 2. El uso de la reivindicación 1, en donde el medicamento es para el tratamiento de glaucoma primario de ángulo abierto.
3. 3. El uso de la reivindicación 1, en donde el medicamento es para el tratamiento de glaucoma inducido por esteroides .
4. 4. El uso de la reivindicación 1, en donde el sujeto está en riesgo de desarrollar - glaucoma primario de ángulo abierto o glaucoma inducido por esteroides.
5. 5. El uso de la reivindicación 1, en donde el sujeto tiene síntomas de glaucoma primario de ángulo abierto o glaucoma inducido por esteroides .
6. 6. El uso de la reivindicación 1, en donde el antagonista del factor de transcripción c-Maf de forma corta interfiere con la transcripción del gen c-Maf.
7. 7. El uso de la reivindicación 1, en donde el medicamento se prepara para inyección intraocular, para implante de un dispositivo de suministro de liberación lenta, o para administración tópica, oral o intranasal.
8. 8. El uso de la reivindicación 1, en donde el medicamento se prepara para administración tópica.
9. 9. El uso de una cantidad efectiva de un inhibidor de cinasa dependiente de cdk2 ciclina y un portador aceptable en la preparación de una composición para la inhibición del factor de transcripción c-Maf de forma corta en un sujeto.
10. 10. El uso de la reivindicación 9, en donde el inhibidor de la cinasa dependiente de cdk2 ciclina interfiere con la transcripción del gen c-Maf.
11. 11. El uso de la reivindicación 9, en donde el inhibidor de cinasa dependiente de cdk2 ciclina es un análogo de purina .
12. 12. El uso de la reivindicación 11, en donde el inhibidor comprende purvalanol A, purvalanol B, amino-purvalanol, olomoucina, N9-isopropilolomoucina, roscovitina, metoxi-roscovitina, combinaciones de los mismos o sales de los mismos .
13. 13. El uso de la reivindicación 11, en donde el inhibidor comprende purvalanol A, purvalanol B, combinaciones de los mismos o sales de los mismos.
14. 14. El uso de la reivindicación 11, en donde el inhibidor comprende purvalanol A.
15. 15. El uso de la reivindicación 9, en donde el inhibidor de cinasa dependiente de cdk2 ciclina se selecciona a partir del grupo que consiste de indirubínas, oxindoles, indenopirazoles, piridopirimidinas, anilinoquinazolinas, aminotiazoles, flavopiridoles, estaurosporinas, paulona's, himenialdisinas, combinaciones de las mismas y sales de las mismas.
16. 16. El uso de la reivindicación 9, en donde la composición se prepara para inyección intraocular, para implante de un dispositivo de suministro de liberación lenta, o para administración tópica, oral o intranasal.
17. 17. El uso de la reivindicación 9, en donde la composición se prepara para administración tópica.
18. 18. Una composición para el tratamiento de glaucoma primario de ángulo abierto o glaucoma inducido por esteroides en un sujeto, la composición comprende una cantidad efectiva de una composición que comprende un antagonista del factor de transcripción c-Maf de forma corta en donde el antagonista tiene actividad inhibidora para cinasa dependiente de cdk2 ciclina y se selecciona a partir de oxindoles, piridopirimidinas, anilinoquinazolinas, flavopiridoles, olomoucina, N9-isopropilolomoucina, combinaciones de los mismos y sales de los mismos, y un portador aceptable.
19. 19. La composición de la reivindicación 18, en donde el tratamiento es para glaucoma primario de ángulo abierto.
20. 20. La composición de la reivindicación 18, en donde el tratamiento es para glaucoma inducido por esteroides .
21. 21. La composición de la reivindicación 18, en donde el sujeto está en riesgo de desarrollar glaucoma primario de ángulo abierto o glaucoma inducido por esteroides .
22. 22. La composición de la reivindicación 18, en donde el sujeto tiene síntomas de glaucoma primario de ángulo abierto o glaucoma inducido por esteroides.
23. 23. La composición de la reivindicación 18, en donde el antagonista del factor de transcripción c-Maf de forma corta interfiere con la transcripción del gen c-Maf.
24. 24. La composición de la reivindicación 18, en donde la composición se prepara para inyección intraocular, para implante de un dispositivo de suministro de liberación lenta, o para administración tópica, oral o intranasal.
25. 25. La composición de la reivindicación 18, en donde la composición se prepara para administración tópica.
26. 26. Una composición para la inhibición del factor de transcripción c-Maf de forma corta en un sujeto, la composición comprende una cantidad efectiva de un inhibidor de cinasa dependiente de cdk2 ciclina y un portador aceptable .
27. 27. La composición de la reivindicación 26, en donde el inhibidor de cinasa dependiente de cdk2 ciclina interfiere con la transcripción del gen c-Maf.
28. 28. La composición de la reivindicación 26, en donde el inhibidor de cinasa dependiente de cdk2 ciclina es un análogo de purina.
29. 29. La composición de la reivindicación 28, en donde el inhibidor comprende purvalanol A, purvalanol B, amino-purvalanol, olomoucina, N9-isopropilolomoucina, roscovitina, metoxi-roscovitina, combinaciones de los mismos o sales de los mismos .
30. 30. La composición de la reivindicación 28, en donde el inhibidor comprende purvalanol A, purvalanol B, combinaciones de los mismos o sales de los mismos.
31. 31. La composición de la reivindicación 28, en donde el inhibidor comprende purvalanol A.
32. 32. La composición de la reivindicación 26, en donde el inhibidor de cinasa dependiente de cdk2 ciclina se selecciona a partir del grupo que consiste de indirubinas, oxindoles, indenopirazoles, piridopirimidinas, anilinoquinazolinas, aminotiazoles, flavopiridoles, estaurosporinas, paulonas, himenialdisinas, combinaciones de los mismos y sales de los mismos.
33. 33. La composición de la reivindicación 26, en donde la composición se prepara para inyección intraocular, para implante de un dispositivo de suministro de liberación lenta, o para administración tópica, oral o intranasal.
34. 34. La composición de la reivindicación 26, en donde la composición se prepara para administración tópica. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La versión de forma corta del factor de transcripción c-Maf se sobre-regula en células de malla trabecular tratadas con el factor beta2 de crecimiento transformante, y se presenta en niveles elevados en células de malla trabecular glaucomatosas contra normal y en tejido principal del nervio óptico glaucomatoso contra normal . La expresión del factor de transcripción c-Maf de forma corta bajo estas condiciones indica un papel causal o ejecutador para el factor en patogénesis de glaucoma primario de ángulo abierto o inducido por esteroides. El antagonismo de la expresión y/o actividad del factor de transcripción c-Maf de forma corta en la malla trabecular u otro tejido ocular se proporciona para inhibir o aliviar patogénesis de glaucoma. Los antagonistas incluyen inhibidores de cinasa 2 dependientes de ciclina. niveles de c-Maf/18S mRNA niveles de c-Maf/18S mRNA (Ave ±SEM, n=3) (Ave ±SEM, n=3) N3