TW200526224A - Short form c-Maf transcription factor antagonists for treatment of glaucoma - Google Patents

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200526224 九、發明說明： 【考务明戶斤屬支系好々貝】 發明領域 本發明係關於青光眼(glaucoma)疾病治療藥劑及療法 之領域，特別是隅角開放性青光眼與類固醇誘發性青光眼。 C先前技術3 發明背景 小樑網狀組織(TM)是一種複雜組織，包括内皮細胞、 結締組織細胞外基質，係位於角膜與虹膜間之突出部位， 10可提供正常阻擋功用以維持眼内壓（IOP)。適當的眼内壓為 維持眼球形狀所需，並能提供一種壓力梯度，使水樣液流 至無血管之角膜與晶體。IOP過大，常見於青光眼，對視神 經有害，導致視網膜上神經節細胞及軸突減少，若不治療 會造成視力退化及失明。青光眼是失明常見的元兇之一。 原發性青光眼肇因於眼内液的流動紊亂，其為構造上 或生理上之基本成分。繼發性青光眼的發生係由於眼睛受 傷或損害，或先前存在之疾病。隅角開放性青光眼 (POAG)，又稱為慢性或單純性青光眼，佔所有原發性青光 眼的90%。POAG之特徵在於小樑網狀組織的退化，造成對 2〇於眼睛流出液的阻擋功能異常偏高。此結果使眼内壓増 加，係因眼内液通過高阻擋之屏障所致。某些藥物如強體 松（prednisone)、地基米松（dexamethasone)與氫化 < 體松 (hydrocortisone)已知可藉由增加Ι〇ρ而誘發青光眼。 目前的抗青光眼治療，包括使用水樣液形成阻斷劑或 200526224 葡萄膜鞏膜通路(uveoscleral outflow)強化劑以降低iqp、雷 射小樑成型術（laser trabeculoplasty)或小樑切除術 (trabeculectomy)，其為過濾手術以改善排液。製藥業的抗 青光眼研究已知出現多種不欲之副作用。舉例而言，縮孔 5劑（mitotics)如匹羅卡品（Pilocarpine)會造成視力模糊或其 他負面的視力副作用。系統性地給予碳酸酐酶抑制劑亦會 造成噁心、消化不良、疲勞與代謝性酸中毒。再者，某些 貝它-阻斷劑已逐步被證實與嚴重肺部副作用有關，因其影 響肺部組織之貝它_2受體。仿交感神經作用藥物造成心跳 10過速、心律不整與高血壓。這些負面的副作用會降低病患 順從性或終止治療。 更重要的是，現今的抗青光眼治療並未直接提出其對 於小樑網狀組織、視神經、及視網膜上神經節細胞與軸突 減少之病理傷害，其並未減弱。有鑒於青光眼的重要性， 15及先前治療方法的不適用性，必須有一種治療青光眼的改 善方法，並提出病情發展的潛在成因。 L 明内容】 發明概要 本發明相關於一種治療具有隅角開放性青光眼或類固 20醇誘發性青光眼風險，或已有此症狀之個體之方法。該方 法包含投以該主體有效量之短型c_Maf轉錄因子之拮抗劑 及一可接受載體。 依據本發明，短型c-Maf轉錄因子被認為在經類固醇或 轉型生長因子-β2 (TGFP2)處理之小樑網狀組織(TM)細胞 200526224 中具有被強化的作用，如在青光眼中較正常視神經頭組織 具有較咼含量，以及如在青光眼中較正常TM細胞具有較高 含量。在這些情況下，短型c_Maf轉錄因子之表現代表此因 子在隅角開放性青光眼或類固醇誘發性青光眼發病過程中 5扮演一般或具影響力之角色。本發明方法涉及短型c-Maf 轉錄因子在小樑網狀組織或其他視覺組織中，如視神經頭 組織中之轉錄、表現及/或活性之拮抗機制，以抑制或減緩 青光眼病情。 本發明之拮抗劑會干擾短型c_Maf轉錄因子之轉錄或 10表現。在一實施例中，短型c-Maf轉錄因子之拮抗劑包含一 具cdk2週期素-依賴性激酶抑制活性之嘌呤類似物。該拮抗 劑包含普凡蘭諾(purvalanol) A、普凡蘭諾B、胺基-普凡蘭 諾、歐羅目辛（olomoucine)、N9-異丙基歐羅目辛、羅絲寇 凡丁(roscovitine)、曱氧基-羅絲寇凡丁、其結合物，或其鹽 15 類。 在另一實施例中，短型〇Maf轉錄因子之拮抗劑包含一 具cdk2週期素-依賴性激酶抑制活性之非嘌呤類似物，為靛 玉紅（indirubin)、羥基引朵（oxind〇les)、茚並^比唑 (indenopyrazoles)、吡啶並嘧啶(pyrid〇pyrimidines)、苯胺基 20 喹唑琳（anilinoquinazolines)、胺基噻唑（aminothiazoles)、 黃素 0比口朵（flavopiridols)、staurosporines、paullones、 hymenialdisines、其結合物及其鹽類。 使用短型c-Maf轉錄因子表現或活性之拮抗劑作為保 護或減輕病患受到青光眼疾病傷害之治療試劑，其重點在 200526224 於疾病的發生過程，除了疾病症狀外，以延緩發病過程為 其治療結果。短型c-Maf轉錄因子之拮抗劑係用於治療 POAG或類固醇誘發性青光眼。短型^…肚轉錄因子在青光 眼發病過程中扮演重要角色，而於此所使用之表現或活性 5 抑制劑則為先前未描述過的。 圖式簡單說明 第1圖為短型c-Maf轉錄因子在SGTM2697集合細胞 中表現量之QPCR分析，顯示TGFp2_誘發之基因表現被增 強16倍，與控制組相較。 10 第2圖為短型c-Maf轉錄因子在TM70A細胞中表現量 之QPCR刀析’顯示地塞米松(dexamethasone)-誘發之基因 表現在第1天被增強2.1倍，在第14天被增強3.2倍，與 控制組相較。 第3圖為短型^乂肚轉錄因子在SGT]y[2697(P6)細胞中 15表現量之QPCR分析，分別在普凡蘭諾（purvalanol)存在或 不存在之基礎與TGFpL誘發細胞中。 【實施方式】 較佳實施例之詳細說明 本發明相關於使用短型c-Maf轉錄因子表現或活性之 20抬抗劑以治療青光眼。人類基因體微陣列係與正常人或青 光眼患者之RNA雜交，而在青光眼患者中，短型c_Maf轉 錄因子之基因被增強，與正常細胞相較。

Maf-基因被認為在水晶體與前側發育中扮演相當重要 的角色（Yoshida 等人（1997), /肝如V/5* Sci 38 200526224 (12):2679-83 ; Ogino 等人（1998)，280(5360):115-8 ; Kawauchi 等人（1999)，C/iem 274 (27):19254-60 ; Kim 等人（1999)，尸厂以:7\^/災6'似/4^£/从 96 (7):3781-5;1^1^等 人（2000)，127 (2):307-17 ;Ishibashi 等人(2001)， 5 Mec" Z^v 101 (1-2):155-66 ; Jamieson 等人 2002)，//wm Mo/ 11(1):33-42 ; Reza 等人（1997)，Med 116 (1 -2):61 -73)。c-Maf已知可活化水晶體蛋白基因的表現，其 可被青光眼基因產物Pax6活化(Sakai等人(2001)，iVwddc Ac油 29 (5):1228-37 ;Yoshida 等人(2001)，Cwrr 五γ /?⑼· 10 23 (2):116-9)，且可被自己的基因產物正向自我調節。缺乏 c-Maf之小鼠為微眼症（microphthalmic)，水晶體形成缺陷， 而異種之突變裸鼠則可進行正常的眼球發育（Kim等人 (1999)，Scz· fASA 96(7):3781-5)。 c-Maf為鹼性區域亮氨酸拉鍊型（bzIP)轉錄因子。Maf 15 家族成員在bZIP中心之鹼性區域具有$40%的相似度。 c-Maf具有短型、單表現子（373個胺基酸)與長型、兩段表 現子(403個胺基酸)之兩種形式，但其功能上的獨特性尚不 清楚。短型c-Maf在C-端末端接有蛋胺酸。長型在c-端末 端多出的胺基酸序列為

20 ITEPTRKLEPSVGYATFWKPQHRVLTSVFTK, SEQ ID NO:4。如此所述，術語“短型C-Maf轉錄因子”代表短型 c-Maf轉錄因子之基因，或373個胺基酸之蛋白質產物，其 在基因庫取用編號為AF055376。 美國專利號6,274,338,完整附於參考資料中，Glimcher 200526224 等人揭示人類C-Maf之核酸與蛋白質序列，及其反義 (antisense)分子與C-Maf抗體。美國專利號6,274,338之cMaf 序列位於GenPept之取得編號為#AAE79064。此序列符人 長型c-Maf之序列，除了有少許胺基酸不符合，包含在 5 241-243位置有3個胺基酸被刪去，與基因庫編號 AF055376(短型序列）與基因庫編號AF055376(長型序列）相 較。 避堂οΜα/#奢尽子之潜灰H豆型C-Maf轉錄因子之 拮抗劑包括可降低短型基因轉錄、抑制短型表現或抑制短 10型活性之試劑。尤其是，已發現cdk2週期素-依賴性激酶 抑制物，尤其是嘌呤類似物，會降低調節短型c_Maf轉錄 因子之轉錄。表1提供具有Cdk2活性抑制之短型C-Maf轉 錄因子之拮抗劑。 15 表1短型c-Maf轉錄因子之拮抗劑 抗劑 ^ Cdk2抑制活性之參考文獻， 嘌呤類似物 • - 普凡蘭击（purvalanol)s如 2-(lR-異丙基-2-羥乙基胺 基)-6-(3-氣基苯胺基)-9-異丙 基嘌呤，分子式為 C]9H25C1N60，得自 Sigma-Aldrich，商標名為普凡 蘭諾（purvalanol) A (#P4484，Sigma-Aldrich，St· Louis，MO)，普凡蘭諾 (purvalanol) B，胺基普凡蘭諾 (purvalanol)，化合物 52 (其中 普凡蘭諾（purvalanol) A的異 丙基置換為Η)。 --—J Gray，N.S.等人，Science， 281，533-538 (1998); Chang，Υ· τ 等人，chem. Biol·，6, 361-375 (1999) 0 10 200526224 2-(羥基乙胺)-6-苯胺-9-甲基 嘌呤，分子式為C]5H]8N60， 得自Sigma-Aldrich，商標名 為歐羅目辛（Olomoucine， #00886) ’ 2- (2’-經基乙胺）-6-苯胺-9-甲基嘌呤，分子式為 C17H22N6O ’ 得自 Sigma-Aldrich，商標名為 N9-異丙基歐羅目辛(#10763); CVT-313。 Vesely，J·等人(1994)，Eur· J· Biochem，224, 771-86, 11 ; Brooks, Ε· Ε·等人（1997)，J. Biol· Chem.，272, 29207-11。 6-（苯月安）-2(R)-[[l-(羥基甲基） 丙基]胺基]-9-異丙基嘌呤 -2-(R)-[[9-(l-甲基乙 基)-6-[(苯基甲基)胺基-9H-嘌 呤-2-基]胺基]-1-丁醇，分子式 為 C19H26N60，得自 Sigma-Aldrich，商標名為 rRoscovitine (#R7772)； methoxyroscovitine 0 Wang，D.等人，J· Virol·，75, 7266-7279 (2001) ； McClue, S. J.等人，Int. J· Cancer，102， 463-468 (2002)； Meijer，L·等人（1997)，Eur. J· Biochem·，243, 527-36。 嘌呤類似物N2-(順-2-胺基環 己基)-N6-(3-氣苯基)-9 -乙基 -9H-嘌呤-2,6-二胺，分子式為 C19H24C1N7，得自 Sigma-Aldrich，商標名為 CGP74514 (#C3353)。 Imbach，P.等人，31〇〇1^.]\46(1 Chem. Lett·，9, 91-96(1999); Dreyer，Μ·Κ·等人，J. Med Chem·，44, 524-530 (2001)。 CGP79807，CGP74514 (supra) 之嗓吟類似物，其中Cl置換 為CN，OH移除，環己燒環 上之“鄰”位置為NH2。 Imbach，Ρ·等人，Bioorg· Med. Chem· Lett.，9, 91-96(1999); Dreyer，Μ·Κ·等人，J· Med. Chem.，44, 524-530 (2001) 〇 嗓σ令類似物如06-環己基甲 基胍 NU2058。 Arris，C. E·等人，J. Med. Chem·，43, 2797-2804 (2000)； Davies 等人，Nature Struct. Biol·，9:10, 745-749, 2002。 嘌呤類似物如NU6102。^^ Arris，C. E.等人，J. Med. Chem·，43, 2797-2804 (2000) ; Davies 等人，Nature Struct· Biol·，9:10, 745-749， 2002。 200526224 異戊烯基-腺嘌呤 Vesely，J·等人，（1994) Eur· J· Biochem·，224, 771-86。 非嘌呤試劑 散玉紅，如散玉紅-3’-一月亏， 分子式為c16hun3o2，得自 Sigma-Aldrich，商標名為款玉 紅5-硫酸鹽’ 5-氯-散玉紅 (#C3353)。 Davies，T.G.人，Structure·，9, 389-397 (2001); Marko, D 等人，Br. J· Cancer， 84, 283-289 (2001); Hoessel，R.等人（1999)，Nt· Cell Biol” 1, 60-7 ; PCT/US02/30059，Hellberg 等人，公開於WO 03/027275。 本表攔2所提及之羥基吲哚1 (#Inll8, JMAR Chemical，口引 口朵σ比唾） Porcs-Makkay，M.等人， Tetrahedron 2000, 56, 5893 ； Org. Process Res. Dev. 2000, 4, 10 Nugiel，D.A·等人，J· Med. Chem·，44，1334-1336 (2001) ; Nugiel，D.A·等人，J· Med. Chem., 45, 5224-5232 (2002) ; Yue，E.W·等人，J· Med· Chem·，45, 5233-5248 (2002)。 吡啶（2,3-d)嘧啶-7-酮， Fischer之化合物3 Barvian，M.等人，J· Med.Chem·，43, 4606-4616 (2000) ; Toogood，P.L.等人， Med. Res. Rev., 21, 487-498 (2001) 〇 喹唑琳，如苯胺喹唑琳 Sielecki，T.M.等人，Bioorg. Med. Chem. Lett·，11， 1157-1160 (2001) ; Mettery 等 人，J. Med. Chem. 2003, 46， 222-236 。 °塞0坐，如融合°塞唾，4-丨[(7_ 氧-6,7-二氮-8H-[1，3]嗟 σ坐 [5,4-e]吲哚-8-啶）甲基]胺 基}-]^-(2-0比°定）节續酿胺，具 分子式C2】H]5N5〇3S2，構自 Sigma-Aldrich，商標名 GW8510 (#G7791) 〇 Davis，S. T.等人，Science， 291，134-137 (2001); PCT/US02/30059，Hellberg 等人，公開於WO 03/027275。 12 200526224

Flavopiridol，如 Flavopiridol (L86 8275 ; NCS 649890，國 家癌症研究所，Bethesda，MD) 及其去氯化衍生物。 Carlson，Β· Α·等人（1996)， Cancer Res.，56, 2973-8。 生物鹼，如星形孢菌素 (Staurosporine，#S1016, A.G. Scientific，San Diego, CA)或 UCN-01 (7-羥基星形孢菌 素），國家癌症研究所， Bethesda，MD 〇 Rialet，V·等人(1991)， Anticancer Res, 11, 1581-90 ； Wang, Q·等人（1995)，Cell Growth Differ·，6, 927-36 ; Akiyama，T.等人(1997) Cancer Res·，57，1495-501 ; Kawakami，K·等人（1996) Biochem. Biophys. Res. Commun·, 219, 778-83 0 Paullone，如 9-溴-7,12-二氫-吲哚[3,2-d][l]苄氮雜庚烷 -6(5)-酮，具分子式 C16H11N3O3 ’ 講自 Sigma-Aldrich，商標名 alsterpaullone (#A4847) 〇 Zaharevitz，D.W·等人，Cancer Res·，59, 2566-2569 (1999); Schultz，C·等人，J· Med. Chem·，42, 2909-2919 (1999) ; Zaharevitz，D.W·等人 (1999) Cancer Res·，59， 2566-2569 ； PCT/US02/30059，Hellberg 等人，公開於WO 03/027275。 CGP 41251，一種生物驗。 Begemann，M.等人（1998)， Anticancer Res·, 18, 2275-82; Fab\no 等人，Pharmacol Ther· 1999 May-Jun; 82 (2-3)， 293-301 〇 Hymenialdisine，如 l〇z-hymenialdisine，具分子式 CnH1()Bi*N502，得自 Biochemicals.net，A.G. Scientific 公司分部（San Diego, CA) (H-1150) 〇 Meijer*, L·等人（1999) Chemistry & Biology，7， 51-63 ； PCT/US02/30059，Hellberg 等人，公開於WO 03/027275。 CGP60474，苯胺嘧啶 21 ; WO 095/09853， Zimmermann 等人，1994 年 9 月21日。 Attaby 等人，Ζ· Naturforsch.54b, 788-798 (1999)。 13 200526224 二芳族尿素 Honma, Τ·等人，J· Med. Chem，44, 4628-4640 (2001) ; Honma，Τ·等人，J· Med· Chem，44, 4615-4627 (2001)。 (2R)-2,5-二氫-4-經基-2-[(4-沒基-3-(3-甲基-2-丁基）苯基） 曱基]-3-(4-羥基苯基)-5-氧-2-呋喃羧酸甲酯，具分子式 C24H24O7 ’ 講自 Sigma-Aldrich，商標名 Butyrolactone-I (B7930)。 Kitagawa, M.等人，Oncogene， 8, 2425-2432 (1993)。 AlosineA，商標編號 128125 (Calbiochem，San Diego, CA) Mettey·等人，Λ MM· 2003, 46, 222-236。 更多的cdk2抑制劑描述於美國專利號6,573,044, Gray 專人，Rosania 等人，办尸·77^r·尸(2000) 1〇(2); 215-230,特別是 Fischer，pm. Celltransmissions 19:1，pg3-9, 5 2003，三月，第三節之小分子抑制劑。熟習此技藝者應可 了解到，本發明說明書之試劑可為外消旋混合物 '非鏡像 異構物或對映體，依據其取代基。 雖然其化學性質大不相同，但表一中所列之許多化合 物會與週期素/cdk2錯合體結合處之ATp競爭。例如，由結 10構分析的結果顯示許多嗓呤抑制劑的嗓吟部分會與㈣的 腺不？（adenine)-結合口結合，以阻止真正的配位體進入。 許多cdk2抑制劑具有結構上的相似特徵，具有平面雜環之 環狀系統。 ▲紐型c-Maf轉錄因子拮抗劑之活性試驗包括將待測抬 15抗^與短型c_Maf轉錄因子基因在某一背景下結合，開始 專、彔/、表現過程。若一定量之短型肚轉錄因子出現或 200526224 其活性小於待測物不存在時，表示待測物為短型c-Maf之 才吉抗劑。 授#禮式··拮抗劑可直接投於眼睛（如局部眼藥水或藥 膏；cul-de-sac緩慢釋放裝置或植入於鄰近鞏膜或眼内；眼 5 球四周，結膜，次眼球筋膜（sub-Tenons)，脈絡膜内 (intracameral)，水晶體内（intravitreal)或小管内 (intracanalicular)注射）或使用已知系統性技術(如口服；靜 脈内、皮下或肌内注射；非腸胃，經皮傳遞）。更進一步思 考，本發明之拮抗劑可配置於眼内置入或植入裝置中。脈 10 絡膜内注射可經由角膜進入前房，使得試劑可到達小樑網 狀組織。小管内注射則可進入靜脈收集通道，流出施氏管 或進入施氏管。 主邀，於此所描述之隅角開放性青光眼或類固醇誘發 性青光眼主體，可為有發展成隅角開放性青光眼或類固醇 15 誘發性青光眼之風險，或具有隅角開放性青光眼或類固醇 誘發性青光眼症狀之人體或其他動物體。 配才典;f/# :本發明之拮抗劑可為溶液、懸浮液或乳 液（分散液），在適當眼藥載體中。下列為本發明適當之配方 實施例。 20 重量比例％ c-Maf轉錄因子抑制劑 0.01-5 ； 0.01-2.0 ； 0.5-2.0 羥基丙基曱基纖維素 0.5 氯化鈉 0.8 苯札氯銨(Benzalkonium 0.01% Chloride) EDTA 0.01 200526224

NaOH/HCl qs pH 7.4 純水 qs 100 mL c-Maf轉錄因子拮抗劑 重量比例％ 0.00005-0.5 ； 0.0003-0.3 ； 0.0005-0.03 ； 0.001 磷酸鹽食鹽水 1.0 苯扎氯銨（Benzalkonium 0.01 Chloride) 聚山梨醇酐脂肪酸酯80 0.5 純水 q.s·至 100 % c-Maf轉錄因子拮抗劑 0.001 單鹼基磷酸鈉 0.05 雙驗基鱗酸鈉（無水） 0.15 氣化納 0.75 EDTA二納鹽 0.05 Cremophor EL 0.1 苯扎氯鈹(Benzalkonium 0.01 Chloride) HC1 及/或 NaOH PH7.3-7.4 純水 q.s 至 100% 重量比例％ c-Maf轉錄因子拮抗劑 0.0005 鱗酸鹽食鹽水 1.0 經基丙基-β-環糊精 4.0 純水 q.s·至 100%

5 在另一實施例中，眼藥組成物可配製為提供拮抗劑眼 内濃度為（U-100nM，在另一實施例中，為1-lOnM。每曰 局部組成物投至眼部表面一至四次，依據臨床醫師之判 斷。配方之pH值應為4-9，或4.5-7.4。系統配方應含有約 10至1000 mg之拮抗劑。 16 200526224 10 15 2〇 、“有效量，，指稱oMaf拮抗劑可干擾短型卜歸表現或 活性之劑量。此種干擾可使眼壓降低並減輕鍾之隅角開 放性青光眼或__發性f光眼症狀。此種干擾亦會延 遲或預防主體發展成青光眼之症狀發生。配方之有效量係 依據^齡、髓、性別或青光眼嚴重程度，舉例而言。在 a施例中’錢劑量之拮抗劑局部傳送至眼睛並到達小 樑網狀組織、視賴或視神經頭，因而改善青光眼發病過 程。 精確的藥量係交給臨床醫師判斷，所得之溶液較佳為 每眼一滴溶液，每日—至四次，或依據醫師指示。 ㈣m藥可接受載體係參照那些大部分不合 造成眼睛刺痛之載體，轉需要的話，提供適當之防腐:=!多種均句劑量之本發明一拮抗劑。就眼 共溶劑、關Hi可接受之防腐劑、 讀、穿透度增_、緩衝 液、乳鈉，或水形成切液、無菌㈣ 合。眼樂財植方可將抑_溶解於纽切接受之轉缓==製得。此外，眼藥溶液亦可包含眼藥可接 其甲歸· 助時抑_。純形成劑’如經 基甲基纖維素、經紅 祕咬、或其類似物，可力=曱基纖維素、聚乙稀基 物之滯留性。 σ本發雜成物巾以增進化合 為了製備無菌眼藥膏 適當載體中結合，如礦物油、二Maf拮抗劑係與防腐劑在 ‘ /夜體綿羊油或白礦臘。無菌

17 200526224 眼藥凝膠成分可藉由將c-Maf拮抗劑懸浮於親水性基底中 而得，基底結合如 CARBOPOL®-940 (BF Goodrich， Charlotte，NC)或其類似物，依據其他眼藥配方習知方法。 舉例而言，VISCOAT® (Alcon 實驗室，Inc·，Fort Worth，TX) 5 可使用眼内注射。本發明其他成分可包含穿透度增強劑， 如cremphor與TWEEN® 80(聚氧基乙烯山梨醣單月桂酸 鹽，Sigma Aldrich，St· Louis，MO)，若 c-Maf 拮抗劑較難穿 透眼部。 10 範例1 自人體小樑網狀組織與細胞中抽離出RNA 人體小樑網狀組織(TM)細胞係衍生自捐贈者眼部 (Central Florida Lions Eye and Tissue Bank, Tampa, FL) 5 並 依先前方法培養(Steely 等人（1992)，V/51 15 33 (7):2242-50; Wilson 等人（1993)，Cwr 五γ 12 (9):783-93; Clark 等人（1994)，/ηναί Vi.51 Sc/ 35 (l):281-94; Dickerson 等人（1998)，66 (6):731-8; Wang等人（1992)，Mo/ 7:89-94)。TM細胞係衍生自四種 正常或青光眼細胞株。每一集合(pool)之TM細胞之總RNA 20 係使用TRIZOL®試劑，依據使用說明抽離出（Invitrogen， Carlsbad, CA) 〇 範例2

Affymetrix基因晶片分析 18 200526224

反轉錄、第二股cDNA合成與經放大RNA之生物素_ 標記係依據標準Affymetrix程序進行。人類基因體ui33A 與 U133B GENECHIP@ (Affymetrix，Santa Clara, CA)係經雜 交、清洗並依據標準Affymetrix程序掃描。經雜交之 5 GENECHIP@ 陣列係由 GENE ARRAY、描器（Agilent 科 技，Palo Alto, CA)掃描。初始資料係經收集並使用 Affymetrix微陣列適用軟體分析。 微陣列資料之過濾係使用GENESPRING®軟體(Silicon Genetics，Redwood City，CA)。每一次實驗，資料會藉由除 10以該晶片所有訊號強度之第50個百分區段而標準化。每個 基因的表現比例係經由將經處理或疾病樣本每個基因的標 準化訊號除以控制組的該基因的中間值而得。使用 Cross-Gene Error模組，並設定每一實驗的基準線為一特定 基準值/正比值而計算，選出表現量高於統計背景值之基 15因。在所有貫驗條件下，只有在Affymetrix U133A GENECHIP®被標記為存在/邊緣的基因會被分析 。c-Maf 短 型基因在UmAGENECHIPl只有出現一次，探針編號為 209348—S—at。短型c_Maf在疾病組或經處理條件下表現量 為控制組至少兩倍以上。

範例3 量化PCR 首股cDNA係由總rna，使用亂數六引子與 TAQMAN®反轉錄試劑，依據使用說明（Appiied Biosystems, 20 200526224

Foster City，CA)而得。100 μΐ反應之後再繼續稀釋20倍， 達到有效cDNA濃度為0.5 ng/μΐ。 使用ABI PRISM® 7700序列偵測系統(Applied Biosystems)進行短型c-Maf基因表現的量化即時RT-PCR 5 (QPCRH貞測，如 Shepard 等人(2001)，/肝以，V/s Sci 42 (13):3173-81所描述。用以放大短型c-Maf之引子係 使用 PRIMER EXPRESS®軟體(Applied Biosystems)設計。正 向與逆向引子序列為 TTGGGACTGAATTGCACTAAGATATAA，SEQ ID ΝΟ:1 ， 10 (核酸序列3773-3799)，以及 GCGTTCTAAACAGTTTTGCAATTTT，SEQ ID NO:2，（核 酸序列3823-3847)，以及次要彎曲處（minor groove)結合探 針序列為 CTGCAAGCATATAATACA，SEQ ID NO:3 ，（核 酸序列3801-3818)。6FAM係結合至次要彎曲處結合探針之 15 5’端，作為連接至TAQMAN®探針的上的螢光基團。其他 探針的選擇為JOE™發光基團（Applied Biosystems)或 VICTM螢光基團（Applied Biosystems)。“次要彎曲處結合非 螢光熄滅劑”係結合至探針的3,端，用以熄滅6FAM所發出 的螢光。75-bpc-Maf放大片段之放大係使用IX預形成18S 20 rRNA 引子/探針組（2〇χ 18S MASTER MIX⑧，Applied Biosystems)來標準化 i8SrRNA 量。由 1XTAQMAN® Universal Mix (Applied Biosystems)組成之 c-Maf QPCR， 900 nM引子與100 nM探針濃度，2.5 ng cDNA，最終體積 為50叫。熱循環條件為5(TC，2分鐘，95°C，10分鐘，之 20 200526224 後接續40個循環的95°C，15秒，60°C，1分鐘。相對cDNA 濃度的定量係使用相對標準曲線法決定，描述於PE Biosystem使用手冊#2，ABI PRISM® 7700序列偵測系統， 2001 (Applied Biosystems)。資料分析係使用 SDS 軟體 1.9.1 5 版本(Applied Biosystems)與 MS Excel 97 (Microsoft)。人類 參考用總RNA (Stratagen，La Jolla，CA)係用於產生標準曲 線。QPCR數據係以c-Maf/18S標準化比例之平均值±SEM 表示。 10 範例4 在人體小樑網狀細胞中TGFP2·誘發之c-Maf基因表現

使用量化PCR分析得知，在轉型生長因子β2-誘發形成 之青光眼細胞中，本樣本之短型c-Maf會逐漸地被增強。 短型c-Maf在名為SGTM2697之青光眼小樑網狀細胞中之 15 基因表現，係以如範例2所述之Affymetrix U133A GENECHIP⑧分析。該青光目艮細胞以5 ng/ml轉型生長因子 β2 (TGFp2)處理16個小時以誘發基因表現。短型〇Maf之 表現被判定為增強。c-Maf的增強差異係以如範例3所述之 QPCR方式判定，使用衍生自士TGFp2-處理之SGTM2697 20 細胞 RNA 集合之 cDNA，並使用 Affymetrix GENECHIP⑧ 分析。短型c-Maf會被TGFp2增強16倍，與控制組相較， 如第1圖所示。第1圖的資料係以c-Maf對核糖體18S之 mRNA量之標準化比例表示（中間值：tSEM, n=3)。 200526224 範例5 在人體小樑網狀細胞中地塞米松(dexamethasone)·誘發之 c-Maf基因表現 本範例說明由量化PCR分析得知，在地塞米松誘發形 5 成之青光眼細胞中，短型c-Maf會逐漸地被增強。 短型c-Maf之基因表現係以如範例2所述之Affymetrix m33AGENECHIP@分析，在名為TM70A之青光眼小樑網 狀細胞中進行。該青光眼細胞以l〇-7]V[地塞米松處理1或 14天。短型C-Maf之基因表現被判定為增強。〇Maf的增 10 強差異係以如範例3所述之QPCR方式判定，使用衍生自土 地塞米松-處理之TM70A細胞RNA集合之cDNA，並使用 AffymetrixGENECHIP®分析。短型〇Maf會在第1天被地 塞米松增強2.1倍，在第14天被地塞米松增強3.2倍，與 控制組相較，如第2圖所示。資料係以c_Maf對核糖體18S 15之mRNA量之標準化比例表示（中間值土SEM，n=3)。 範例6 在人體小樑網狀細胞中TGFj32-誘發之C-Maf基因表現被 小分子抑制 本範例e兒明cdk2抑制劑為短型c_Maf基因表現之拮抗 劑。 小分子對於短型c_Maf基因表現抑制之作用係以如範 例2所述之QPCR方法分析，在名為SGTM2697青光眼小 樑網狀細胞（第6代）中進行。該青光眼細胞以5ng/mi轉型 22 200526224 生長因子β2 (ΤΌΡβ2)與e·週期素A抑制劑普凡蘭諾 (Pi^valan0l) A處理丨6個小時以誘發基因表現(Hardcas^ 等人（2002)，An舰 /^v 卿/ Tbja.co/ 42:325-348)。經過 晋凡蘭諾（purvalanol) A處理後，c_Maf基本量下降Μ倍， 如第3圖所示。TGFp2-處理之c—Maf(增強口倍），在普凡 蘭諾（pUrvalan〇l)A共處理條件下會完全被抵銷，如第3 - 圖所不。第3圖之資料係以C-Maf對核糖體18S之mRNA 量之標準化比例表示（中間值±SEM，n=6)。第3圖之y軸具 有0·00至〇 〇3之較低範圍，以及〇 Qg至〇 之較高範圍。 鲁 如前述普凡蘭諾（purvalan〇l)A對於短型C-Maf基因 表現之抑制之支持證據，本發明提供其他週期素依賴性蛋 白激酶2抑制劑，作為短型c_Maf基因表現之拮抗劑。此 種拮抗劑可用於預防或治療試劑，以避免或治療青光眼發 病過程所造成之傷害。 範例7 在青光眼視神經頭組織之短型〇Maf轉錄因子 經由Affymetrix GENECHIP@分析得知短型c_Maf轉錄 因子在青光眼視神經頭組織中具有較高含量。青光眼視神 、、、二碩組織係衍生自四個正常捐贈者或五個患者眼部集合。 視神經頭組織之總RNA以TRIZ0L®試劑（Invitr〇gen)，依據 使用說明抽取。在這些情況下的短型c-Maf表現更代表了 其在青光眼致病過程中扮演一般或重要角色。在眼部組織 中短型c~Maf轉錄因子表現/活性之拮抗作用，係用以抑制 23 200526224 或減輕青光眼之發作，並用以提供視網膜或視神經之神經 保護作用。 於此所提及之參考資料，其提供之範例步驟與詳細内 容皆完整併於參考資料中。 5 熟習此技術領域者，由本發明揭示内容，可了解到可 依此進行實施例之修飾，而不脫離本發明範疇。除了不正 確的實驗方法外，於此所揭示之所有實施例皆可實行。本 發明範疇亦含蓋所有實施例之等效物。本說明書不應以發 明標題而限縮本發明保護之範圍。 10 於此所使用之術語“一”，除非另有所指，皆指稱“一 個”、”至少一個”或“一或多個”。

L圖式簡單說明I 【主要元件符號說明】 24

Claims (1)

1. 200526224 十、申請專利範圍： 1. 一種用以治療個體之隅角開放性青光眼或類固醇誘發性 青光眼的組成物，該組成物包含有一有效量之短型c-Maf 轉錄因子之一拮抗劑以及一可接受載體。 5 2.如申請專利範圍第1項之組成物，其中該治療係用於隅 角開放性青光眼。 3. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該治療係用於類 固醇誘發性青光眼。 4. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該個體處於發展 10 為隅角開放性青光眼或類固醇誘發性青光眼之危險。 5. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該個體具備隅角 開放性青光眼或類固醇誘發性青光眼之症狀。 6. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該短型c-Maf轉 錄因子之拮抗劑干擾c-Maf基因之轉錄作用。 15 7.如申請專利範圍第1項之組成物，其中該短型c-Maf轉 錄因子之拮抗劑包含有一對於cdk2週期素依賴性激酶 具有抑制活性之嗓吟類似物。 8. 如申請專利範圍第7項之組成物，其中該拮抗劑包含有 普凡蘭諾（purvalanol) A、普凡蘭諾B、胺基-普凡蘭諾、 20 歐羅目辛（olomoucine)、N9-異丙基歐羅目辛、羅絲寇凡 丁（roscovitine)、甲氧基-羅絲寇凡丁，其等之組合，或其 等之鹽類。 9. 如申請專利範圍第7項之組成物，其中該拮抗劑包含有 普凡蘭諾（purvalanol) A、普凡蘭諾B，其等之組合， 25 200526224 或其等之鹽類。 10_如申請專利範圍第7項之組成物，其中該拮抗劑包含有 普凡蘭諾（purvalanol) A。 11 ·如申請專利範圍第1項之組成物，其中該短型c-Maf轉 5 錄因子之拮抗劑對於cdk2週期素依賴性激酶具有抑制 活性’並選自於由款玉紅（indirubin)、經基α引嗓 (oxindoles)、節並口比口坐（indenopyrazoles)、口比口定並口密口定 (pyridopyrimidines)、苯胺基喹唑啉(anilin〇quinaz〇lines)、 胺基噻唑（aminothiazoles)、黃素吡哚（flav〇pirid〇ls)、星 _ 10 形孢菌素（staurosP〇rines)、paullones、hymenialdisines、 其等之組合及其等之鹽類所構成的群組中。 12.如申請專利_第丨項之組成物，其中該組成物被製備 成供用於眼球内注射、用於緩釋傳送裝置之植入、或用 於局部、口服或鼻内給藥。 15 13·如申請專利範圍第i項之組成物，其中該組成物被製備 成供用於局部給藥。 26