WO2004047868A1 - Limキナーゼ阻害作用を有する化合物を有効成分とする緑内障治療剤 - Google Patents

Limキナーゼ阻害作用を有する化合物を有効成分とする緑内障治療剤 Download PDF

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lys
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lim kinase
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Hiroko Hizaki
Naruhiro Ishida
Takeshi Matsugi
Hideaki Hara
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Santen Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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Definitions

  • Glaucoma treatment agent containing a compound having LIM kinase inhibitory activity as active ingredient
  • the present invention relates to a therapeutic agent for glaucoma comprising a compound having a LIM kinase inhibitory activity or a salt thereof as an active ingredient.
  • Glaucoma is an intractable eye disease that can cause blindness due to increased intraocular pressure due to various etiologies and damage to internal tissues of the eye (retinal, optic nerve, etc.).
  • intraocular pressure lowering therapy is common, and typical examples thereof include drug therapy, laser therapy, and surgical therapy.
  • sympathomimetics nonselective stimulants such as Epinefuri emissions, alpha 2 agonists such as Aburakuro two gin
  • sympatholytic timolol, base non-placement Russia Ichiru, carteolol, Betakiso one / 3 blockers such as benzoyl hydrochloride, ⁇ , blockers such as bunazosin hydrochloride, ⁇ 3 blockers such as nipradilol), parasympathomimetics (such as pilocarpine), carbonic anhydrase inhibitors (such as acetazolamide)
  • Drugs such as prostaglandins (isopropyl unoprostone, rattanobrost, trapoprost, pimatoprost, etc.) have been used, but research and development toward the development of more useful compounds is continuing.
  • LIM kinase is a serine leonine kinase having two LIM domains and one PDZ domain on the ⁇ -terminal side and a protein kinase domain on the C-terminal side.
  • LIM kinases subtypes such as LIMK1 and LIMK2 are known, and the Rac-PAK pathway, Rh-ROCK pathway, Cdc42-MRCK pathway, etc. These LIM kinases are activated along with the activation of, which controls the remodeling of the actin cytoskeleton, which controls cell morphology, through the phosphorylation of the actin depolymerizing factor, cofilin.
  • LIM kinase is present in cultured human fibrillar trabeculae cells
  • Mol. Cell. Biol. ,, 774 -783 (2002) describes a newly designed LIM kinase inhibitor based on the amino acid sequence of cofilin as Mela-Ala-Ser-Gly-Vatro Ala-Val-Ser-Asp-Gly-Val.
  • glaucoma is a disease caused by various etiologies, and research and development of a glaucoma therapeutic agent having a new mechanism of action is desired.
  • the present inventors have conducted intensive studies to find a therapeutic agent for glaucoma having a new mechanism of action, and as a result, a compound having LIM kinase inhibitory activity promotes actin depolymerization of trabecular meshwork cells, The inventors have found that the intraocular pressure is lowered, and completed the present invention.
  • the present invention can be suitably used for treatment of eye diseases accompanied by increased intraocular pressure and prevention thereof.
  • the present invention relates to a therapeutic agent for glaucoma comprising a compound having a LIM kinase inhibitory activity or a salt thereof as an active ingredient.
  • the compound having LIM kinase inhibitory activity in the present invention is LIM kinase.
  • LIM kinase Means a compound that inhibits the activity of the enzyme or a compound that inhibits the phosphorylation of cofilin. Examples include compounds that inhibit the activity of LIMK1 or LIMK2. Specifically, Met-Ala-Ser-Gly-Val-Ala-Ala described in Mol. Cell. Biol., 22, 774-783 (2002).
  • Cyano 3 (3,4 dihydroxy phenyl) thioacrylamide (AG 213, compound 3), Ber., 44, 3502-3505 (1912) 3 — (3,4 dihydroxy phenyl) 1 1 (2,4-Dihydroxyphenyl) prodone [Butein, arsenic compound 4], Molecular Pharmacology 45 (4), 673-683 (1994).
  • 1-cyano-1N— (3— (2—cyano-1-3-1 (3,4—dihydroxyphenyl) -acryloylamino) propyl) —3— (3,4dihydroxyphenyl) acrylylamide [AG 537 Compound 5], J. Pharm. Soc.
  • the compound having the LIM kinase inhibitory activity of the present invention may be in the form of a salt. You may take it. For example, salts with inorganic acids such as hydrochloric acid and nitric acid; salts with organic acids such as oxalic acid, succinic acid, and acetic acid; salts with alkali metals such as sodium and potassium; and alkaline earth metals such as calcium. Salt.
  • inorganic acids such as hydrochloric acid and nitric acid
  • salts with organic acids such as oxalic acid, succinic acid, and acetic acid
  • salts with alkali metals such as sodium and potassium
  • alkaline earth metals such as calcium.
  • the compound having LIM kinase inhibitory activity in the present invention may be in the form of a hydrate or a solvate.
  • Glaucoma in the present invention includes primary open-angle glaucoma, normal-tension glaucoma, hyperaqueous glaucoma, ocular hypertension, acute angle-closure glaucoma, chronic angle-closure glaucoma, mixed glaucoma, and stelloid glaucoma.
  • amyloid glaucoma neovascular glaucoma, malignant glaucoma, capsular glaucoma of the lens, plateau iris syndrome, and the like.
  • the present inventors have found that inhibition of LIM kinase inhibits phosphorylation of cofilin and promotes actin depolymerization of trabecular meshwork cells. Subsequently, the following tests were performed based on the hypothesis that aqueous outflow from the trabecular meshwork outflow channel increased and intraocular pressure decreased. First, the presence or absence of expression of LIM kinase in porcine trabecular meshwork was examined. Next, it was examined whether or not a compound having an LIM kinase inhibitory effect promotes actin depolymerization in cultured porcine trabecular meshwork cells.
  • the present invention is characterized in that a compound having an LIM kinase inhibitory action is found to exhibit an intraocular pressure lowering action, and the mechanism of action has been clarified, and is limited by the chemical structure of the compound having an LIM kinase inhibitory action. Not something. Also, the strength of the intraocular pressure lowering effect does not affect the usefulness of the present invention.
  • the compound having LIM kinase inhibitory activity can be administered orally or parenterally, and examples of the dosage form include tablets, capsules, granules, powders, eye drops, eye ointments, injections, etc. Particularly, eye drops and injections are preferable.
  • eye drops include isotonic agents such as sodium chloride and concentrated glycerin, buffers such as sodium phosphate and sodium acetate, polyoxyethylene Use surfactants such as monoolate, polyoxyl stearate 40, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, etc., stabilizers such as sodium citrate and sodium edetate, and preservatives such as benzalkonium chloride and paraben as required. And Can be prepared.
  • isotonic agents such as sodium chloride and concentrated glycerin
  • buffers such as sodium phosphate and sodium acetate
  • polyoxyethylene Use surfactants such as monoolate, polyoxyl stearate 40, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, etc.
  • stabilizers such as sodium citrate and sodium edetate
  • preservatives such as benzalkonium chloride and paraben as required.
  • benzalkonium chloride and paraben as required.
  • PH may be in the range acceptable for ophthalmic preparations, and preferably in the range of pH 4 to 8.
  • the dose can be appropriately selected depending on the age, symptoms, etc., and in the case of eye drops, it is preferably 0.001 to 10% (wZv), preferably Q.001 to 1% (w / v). V) can be instilled once or several times a day.
  • the compound having an LIM kinase inhibitory action according to the present invention can be used in combination with another therapeutic agent for glaucoma.
  • FIG. 1 is a diagram showing the expression of LIMK1 in bush trabecular meshwork tissue.
  • Lane 1 is an electrophoretic diagram of the molecular weight and the numerical value on the left indicates the electrophoretic position of the molecular weight marker.
  • FIG. 2 shows the expression of LIMK2 in porcine trabecular meshwork.
  • Lane 1 is an electrophoretic diagram of the molecular weight marker 1, and the numerical value on the left indicates the electrophoretic position of the molecular weight marker.
  • FIG. 3 is a fluorescence micrograph showing the degree of actin stress fiber formation when the cultured trabecular meshwork cells were treated with a LIM kinase inhibitor. The formation of actin stress fibers is hardly confirmed.
  • FIG. 4 is a fluorescence micrograph showing the degree of actin stress fiber formation when cultured porcine trabecular meshwork cells were not treated with a LIM kinase inhibitor (control). The formation of actin stress fibers can be confirmed.
  • FIG. 5 is a graph showing the time course of intraocular pressure of each administration group when Compound 1 was used as a LIM kinase inhibitor.
  • the intraocular pressure is shown as a change from the initial intraocular pressure.
  • ⁇ indicates the LIM kinase inhibitor administration group, and ⁇ indicates the control group.
  • Figure 6 shows each dose when Compound 5 was used as a LIM kinase inhibitor.
  • It is a graph which shows the time-dependent change of the intraocular pressure of a group.
  • the intraocular pressure is shown as a change from the initial intraocular pressure.
  • the image indicates the LIM kinase inhibitor administration group, and the symbol ⁇ indicates the control group.
  • FIG. 7 is a graph showing the time-dependent change in the pressure of each administration group when Compound 6 was used as a LIM kinase inhibitor.
  • the intraocular pressure is shown as a change from the initial intraocular pressure.
  • Deception indicates the LIM kinase inhibitor administration group, and ⁇ indicates the control group.
  • the compound having LIM kinase inhibitory activity according to the present invention may be met-Ala-Ser-Gly-Val-Ala-Val-Ser-Asp-Gly-Val-Ile-Lys-Val-Phe-Asn-Arg-Gln
  • a general formulation example of an eye drop using -I 1 e-Lys-I 1 e-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys (Compound 1) is shown below. Shown in Eye drops (in 100 mL)
  • Remuli sample bath was added to the trabecular meshwork removed from the eye. After adding the buffer, the tissue was homogenized to prepare a homogenate of trabecular meshwork tissue.
  • Figure 1 shows the results of the LIMK1 expression confirmation test in porcine trabecular meshwork.
  • Figure 2 shows the results of the LIMK2 expression confirmation test in porcine trabecular meshwork.
  • LIMK1 and LIMK2 have a molecular weight of about 70 kDa as disclosed in J. Biol. Chem., 270. 31321-31330 (1995) and Oncogene, ⁇ , 701-710 (1995).
  • a band indicated by an arrow
  • LIM kinases LIMK1 and LIMK2 were expressed in porcine trabecular meshwork tissue.
  • LIM kinase inhibitors compounds having LIM kinase inhibitory activity
  • LIM kinase inhibitors Met-Ala-Ser-Gly-Vatro Ala-Va-Ser-Asp-Gly-Va lie-Lys-Vatro Phe-Asn-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys (Compound 1) was used.
  • the LIM kinase inhibitors were dissolved in phosphate buffer, concentration of 2 X 1 0 - was prepared 4 M of LIM kinase inhibitor solution.
  • the culture was terminated one hour after the addition of lysophosphatidic acid, and the cultured butter trabecular meshwork cells were cultured according to the method of Rao et al. Described in I0VS., ⁇ , 1029-1037 (2001). After performing actin staining, the fluorescence microscope image was photographed.
  • actin depolymerization was promoted based on the degree of actin stress fiber formation observed to promote actin polymerization.
  • Fig. 3 shows actin stress fiber staining of cultured porcine trabeculae cells treated with LIM kinase inhibitor
  • Fig. 4 shows actin stress fiber staining of cultured porcine trabeculae cells during control. Images are shown as test results.
  • actin stress fiber formation was hardly observed in cultured porcine trabecular meshwork cells treated with the LIM kinase inhibitor, and actin stressor culture was observed in cultured trabecular meshwork cells during control. Remarkable formation of was observed.
  • reaction product was fractionated by SSD-PAGE using a 12.5% polyacrylamide gel.
  • the inhibitory effect of the test compound was calculated according to the following formula by comparing the band concentration with no test compound added (control).
  • LIM kinase inhibitor a compound having LIM kinase inhibitory activity (hereinafter referred to as a LIM kinase inhibitor) to the anterior chamber of Japanese White Heron.
  • Compound 1, compound 5 and compound 6 were used as LIM kinase inhibitors.
  • the LIM kinase inhibitor was dissolved in the base to adjust the pH to near neutral, and a LIM kinase inhibitor solution having a desired concentration shown in Table 1 below was prepared.
  • the intraocular pressure was measured three times each, and the average value was used as the result.
  • the experimental animals used were Japanese white egrets (strain: ⁇ , gender: male). Five groups were used in the LIM kinase inhibitor solution-administered group, and five or six groups were used in the control group. .
  • FIG 5 shows the results of the intraocular pressure lowering test of Compound 1
  • Figure 6 shows the results of Compound 5
  • Figure 7 shows the results of the test of Compound 6 for the reduction of intraocular pressure.
  • the intraocular pressure indicates a change value from the initial intraocular pressure. From the above results, it was clarified that L ⁇ kinase inhibitor lowers intraocular pressure. Based on the results of the pharmacological tests 1 to 4, based on the background art, inhibition of LIM kinase inhibits cofilin phosphorylation, promotes actin depolymerization of trabecular meshwork cells, and increases trabecular meshwork. It became theoretically clear that aqueous humor outflow from the outflow route increased and intraocular pressure decreased. Industrial applicability
  • a therapeutic agent for glaucoma comprising a compound having a LIM kinase inhibitory activity or a salt thereof as an active ingredient.

Abstract

本発明は、新たな作用機序を有する緑内障治療剤を見いだすことを課題とする。LIMキナーゼ阻害作用を有する化合物は、線維柱帯細胞のアクチン脱重合を促進し、眼圧を下降させる。したがって、LIMキナーゼ阻害作用を有する化合物は緑内障治療剤として非常に有用である。

Description

明 細 書
L IMキナーゼ阻害作用を有する化合物を有効成分とする 緑内障治療剤 技術分野
本発明は L IMキナーゼ阻害作用を有する化合物またはその塩を有効成 分とする緑内障治療剤に関するものである。 背景技術
緑内障は、 種々 の病因によ り 眼圧が上昇し、 眼球の内部組織 （網 膜、 視神経等） が障害を受ける こ とで失明に至る危険性のある難治 性の眼疾患である。 緑内障の治療方法と しては、 眼圧下降療法が一 般的であ り 、 その代表的なもの と して薬物療法、 レーザー治療法、 手術療法等がある。
薬物療法には、 交感神経刺激薬 （ェピネフリ ン等の非選択性刺激薬、 アブラクロ二ジン等の α 2刺激薬）、 交感神経遮断薬 （チモロール、 べフ ノ ロ一ル、 カルテオロール、 ベタキソ一ル等の /3遮断薬、 塩酸ブナゾシ ン等の α ,遮断薬、 二プラジロール等の α ι3遮断薬）、 副交感神経作動薬 (ピロカルピン等）、 炭酸脱水酵素阻害薬 （ァセ夕ゾラミ ド等）、 プロス タグランジン類 （イソプロピルウノプロス トン、 ラタノブロス ト、 トラ ポプロス ト、 ピマ トプロス ト等） などの薬物が使用されているが、 より 有用な化合物の開発に向けての研究開発が続けられている。
L I Mキナ一ゼは、 Ν末端側に二つの L IM ドメイ ンと一つの PDZ ドメイ ンを、 C末端側にプロテイ ンキナーゼドメイ ンを有するセリ ン ス レオ ニンキナーゼである。 L IMキナーゼとしては、 L IMK1、 L IMK2等のサブタ イブが知られており、 Rac-PAK経路、 Rh o- ROCK経路、 Cdc 42-MRCK経路等 の活性化に伴い、 これらの LIMキナーゼが活性化され、 ァクチン脱重合 因子であるコフィ リ ンのリ ン酸化を介して、 細胞の形態を支配するァク チン細胞骨格の再構築を制御していると考えられている。 また、 この LIM キナーゼは、 遺伝病であるウイ リ アムス症候群の発症や癌細胞の浸潤、 転移等に深く関与していると考えられている （実験医学 Vol. 1 7、 No. 1 4 (増刊）、 1 7 7 4 ~ 1 7 8 0頁 （ 1 9 9 9年） および第 6 0回 日 本癌学会総会記事、 演題番号 3 9 5、 1 6 4頁 （ 2 0 0 1年） 参照）。
ところで、 I0VS, , 11, 1029- 1037 (2001)には LIMキナーゼが培養ヒ ト線 維柱帯細胞 に存在する こ と が開示 さ れてお り 、 ま た Mol. Cell. Biol. , , 774-783 (2002)には、 コフィ リ ンのアミ ノ酸配列に基づき新に 設計された LIMキナーゼ阻害剤として、 Me卜 Ala- Ser- Gly- Va卜 Ala-Val -Ser-Asp-Gly-Val-I le-Lys-Val-Phe-Asn-Arg-Gln-I le-Lys-I le-Trp-Phe -Gin- Asn- Arg-Arg-Met- Lys- Trp-Lys-Lysが開示されている。 しかし、 そ の具体的な疾患に対する用途は全く開示され いない。
また、 欧州特許第 322738 号明細書、 Ber. , 44, 3502-3505 (1912)、 Molecular Pharmacology 45 (4), 673-683 (1994) , J. Pharm. So Japan, 76, 1448-1449 (1956) お よ び Pharmaceutical Research, 16(1), 117-122 (1999)には、 L IMキナーゼ阻害作用を有すると予測される化合 物、 すなわち、 2— （ 3， 4—ジヒ ドロキシベンジリデン） マロノニ ト リル [ AG 18]、 2—シァノ一 3— ( 3 , 4—ジヒ ドロキシフエニル） チ ォアク リルアミ ド [AG 213]、 3 - ( 3 , 4—ジヒ ドロキシフエニル） 一 1 — ( 2， 4ージヒ ドロキシフエニル） プロべノ ン [ Bu t e i n]、 2—シァ ノ ー N— ( 3— （ 2—シァノ一 3— ( 3， 4ージヒ ドロキシフエニル） ーァク リ ロイルァミ ノ） プロピル） 一 3— ( 3， 4ージヒ ドロキシフエ ニル） アク リルアミ ド [AG 537]、 3—ヒ ドロキシー 1 ーメ トキシ一 9， 1 0—ジォキソー 9 , 1 0—ジヒ ドロアン トラセン一 2—カルボアルデ ヒ ド [DamnacanthaU、 3 - ( 6， 7—ジメ トキシキナゾリ ン一 4ーィル ァミノ） フエノール （WHI -P 1 80) 等の化合物が記載されている。
一方、 I 0VS.， 41 , 6 19-623 (2000)および I 0VS. , 1 6, 47 - 53 (1 977)に は、 線維柱帯細胞のァクチン脱重合を促進させることができれば、 線維 柱帯流出経路からの房水流出が促進されて、 眼圧が下降することが示唆 されている。
しかしながら、 いずれの文献にも、 L IM キナーゼ阻害作用と眼疾患の 関係、 また、 L IM キナーゼ阻害作用を有する化合物の眼科用途、 線維柱 帯細胞に対する作用、 緑内障の治療効果等に関する記載は一切なされて レ ない。 発明の開示
既に数多く の緑内障治療剤が医療の現場で使用されている。 しか し、 緑内障は種々の病因によ り発症する疾病である為、 新たな作用 機序を有する緑内障治療剤の研究開発が望まれている。
本発明者らは、 新たな作用機序を有する緑内障治療剤を見出す為に鋭 意研究を重ねた結果、 L IM キナーゼ阻害作用を有する化合物が、 線維柱 帯細胞のァクチン脱重合を促進し、 眼圧を下降させることを見出し、 本 発明を完成させた。
本発明は眼圧上昇を伴う眼疾患の治療やそれらの予防に好適に用いる ことができる。
LIMキナーゼ阻害作用を有する化合物は、 線維柱帯細胞におけるァク チン脱重合を促進し、 眼圧下降作用を示す。 したがって、 LIMキナーゼ 阻害作用を有する化合物は緑内障治療剤として非常に有用である。 本発明は L IMキナーゼ阻害作用を有する化合物またはその塩を有効成 分とする緑内障治療剤に関するものである。
本発明における L IMキナーゼ阻害作用を有する化合物とは、 L IMキナ —ゼの活性を阻害する化合物またはコフィ リ ンのリ ン酸化を抑制する化 合物を意味する。 例えば、 LIMK1 または LIMK2 の活性を阻害する化合物 が挙げられ、 具体的には、 Mol. Cell. Biol.， 22, 774-783 (2002)に記載の Met-Ala-Ser-Gly-Val-Ala-Val-Ser-Asp-Gly-Val-Ile-Lys-Val-Phe-Asn- Arg-Gln-I 1 e-Lys-I 1 e-Tr -Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Me t-Lys-Trp-Lys-Lys [S3 Peptide、化合物 1 ]、欧州特許第 322738号明細書に記載の 2 — ( 3 , 4 ージヒ ドロキシベンジリデン） マロノ二ト リル [AG 18、 化合物 2 ] お よび 2 —シァノ ー 3 — ( 3， 4 —ジヒ ドロキシフエニル） チォアク リル アミ ド [AG 213、化合物 3 ]、Ber.， 44, 3502- 3505 (1912)に記載の 3 — ( 3 , 4 ージヒ ドロキシ 7ェニル） 一 1 一 （ 2 , 4 —ジヒ ドロキシフエニル） プ ロ ぺ ノ ン [ Butein 、 ヒ 合 物 4 ] 、 Molecular Pharmacology 45 (4), 673-683 (1994)に記載の ？ 一シァノ 一 N— （ 3 — （ 2 —シァノ 一 3 一 （ 3 , 4 —ジヒ ドロキシフエニル） 一ァク リ ロイルァミ ノ） プロピル） — 3 — （ 3， 4 ージヒ ドロキシフエニル） アク リルアミ ド [AG 537、 化 合物 5 ]、 J. Pharm. Soc. Japan, 76, 1448-1449 (1956)に記載の 3 —ヒ ドロキ シー 1 —メ トキシ一 9， 1 0 —ジォキソ一 9 , 1 0 —ジヒ ドロアン トラ セ ン一 2 —力ルポアルデヒ ド [ Damnacanthal、 化合物 6 ]、 並びに Pharmaceutical Research, 16 (1), 117- 122 (1999)に記載の 3 — ( 6 , 7 - ジメ トキシキナゾリ ン— 4 一ィルァミ ノ） フエノール [WHI - P 180、 化合 物 7 ] 等の化合物、 好ましく は、 Met-Ala-Ser-Gly- Va卜 Ala-Va卜 Ser - Asp-Gly-Val-I le-Lys-Val-Phe-Asn-Arg-Gln-I 1 e-Lys-I 1 e-Trp-Phe-Gl n- Asn-Arg-Arg-Me t-Lys-Trp-Lys-Lys, 2 —シァノ — N - ( 3 - ( 2 -シァ ノー 3 — ( 3 , 4 ージヒ ドロキシフエニル） ーァク リ ロイルァミ ノ） プ 口ピル） 一 3 — ( 3， 4 —ジヒ ドロキシフエニル） アク リルアミ ドおよ ぴ 3 —ヒ ドロキシー 1 ーメ トキシー 9， 1 0 —ジォキソー 9 , 1 0 —ジ ヒ ドロアン トラセン— 2 —力ルポアルデヒ ドが例示される。
本発明における LIMキナ一ゼ阻害作用を有する化合物は、 塩の形態を とっていてもよい。 例えば、 塩酸、 硝酸等の無機酸との塩ゃシユウ酸、 コハク酸、 酢酸等の有機酸との塩、 また、 ナトリウム、 カリウム等のァ ルカリ金属との塩やカルシウム等のアルカリ土類金属との塩を挙げるこ とができる。
さらに、 本発明における LIMキナーゼ阻害作用を有する化合物は、 水 和物または溶媒和物の形態をとつていてもよい。
本発明における緑内障とは、原発性開放隅角緑内障、正常眼圧緑内障、 房水産生過多緑内障、 高眼圧症、 急性閉塞隅角緑内障、 慢性閉塞隅角綠 内障、 混合型緑内障、 ステロイ ド緑内障、 アミロイ ド緑内障、 血管新生 緑内障、 悪性緑内障、 水晶体の嚢性緑内障、 台地状虹彩シンドローム (plateau iris syndrome) 等を含む。
後述の薬理試験の項で詳細に説明するが、 本発明者等は、 LIM キナー ゼを阻害すれば、 コフィ リ ンのリン酸化が抑制されて、 線維柱帯細胞の ァクチン脱重合が促進され、 それに引き続き線維柱帯流出経路からの房 水流出が増大して、 眼圧が下降するとの仮説に基づき、 以下の試験を行 つた。 まず、 ブタ線維柱帯組織における LIMキナーゼの発現の有無を検 討し、 次いで、 LIM キナーゼ阻害作用を有する化合物が、 培養ブタ線維 柱帯細胞におけるァクチン脱重合を促進するか否かについて検討した。 その結果、ブタ線維柱帯組織に LIMキナーゼが発現していること、また、 LIM キナ一ゼ阻害作用を有する化合物が培養ブタ線維柱帯細胞において ァクチン脱重合を促進させることを見出した。 また、 欧州特許第 322738 号明細書、 Ber. , 44, 3502-3505 (1912)、 Molecular Pharmacology 45(4), 673 - 683 (1994)、 J. Pharm. Soc. Japan, 76, 1448-1449 (1956)および Pharmaceutical Research, 16 (1), 117-122 (1999)に記載された化合 物、 すなわち、 2 — （ 3 , 4 —ジヒドロキシベンジリデン） マロノニト リル [ AG 18]、 2 —シァノー 3 — ( 3 , 4 —ジヒ ドロキシフエニル） チ ォアクリルアミ ド [ AG 213]、 3 — ( 3 , 4 —ジヒ ドロキシフエニル） ― W
1 - ( 2 , 4—ジヒ ドロキシフエニル） プロべノン [Butein]、 2—シァ ノー N— ( 3 — （ 2—シァノ一 3— ( 3 , 4—ジヒ ドロキシフエニル） —ァクリロイルァミノ） プロピル） 一 3— ( 3， 4ージヒドロキシフエ ニル） アクリルアミ ド [ AG 537]、 3—ヒドロキシ— 1 ーメ トキシ— 9 , 1 0—ジォキソー 9., 1 0—ジヒドロアントラセン— 2—力ルポアルデ ヒ ド [Danmacanthal]、 3— （ 6 , 7—ジメ トキシキナゾリ ン一 4—ィル ァミノ） フエノール [WHI- P 180] が LIMキナーゼ阻害作用を有すること を確認した。 さらに、 LIM キナーゼ阻害作用を有する化合物が、 実際に 眼圧を下降させるか否かを確認する為に、 LIM キナーゼ阻害作用を有す る化合物を日本白色ゥサギの前房内に投与し、 眼圧の変化について検討 した。 その結果、 LIM キナーゼ阻害作用を有する化合物が日本白色ゥサ ギの眼圧を顕著に下降させることを見出し、 本発明を完成させた。
本発明は、 LIM キナーゼ阻害作用を有する化合物が、 眼圧下降作用を 示すことを見出し、 その作用機序を明らかとした点に特徴があり、 LIM キナーゼ阻害作用を有する化合物の化学構造に制約されるものではない。 また、 眼圧下降効果の強弱も本発明の有用性に影響を与えるものではな い。
LIM キナーゼ阻害作用を有する化合物は、 経口でも、 非経口でも投与 することができ、 その投与剤型としては、 錠剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 散剤、 点眼剤、 眼軟膏、 注射剤等が挙げられ、 特に点眼剤、 注射剤が好 ましい。
これらは汎用されている技術を用いて製剤化することができ、 例えば 点眼剤は、 塩化ナトリウム、 濃グリセリン等の等張化剤、 リン酸ナトリ ゥム、 酢酸ナトリウム等の緩衝剤、 ポリオキシエチレンモノォレート、 ステアリン酸ポリオキシル 4 0、 ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の 界面活性剤、 クェン酸ナトリウム、 ェデト酸ナトリウム等の安定化剤、 塩化ベンザルコニゥム、 パラベン等の防腐剤などを必要に応じて使用し て、 調製することができる。
P Hは眼科製剤に許容される範囲であればよく、 p H 4〜 8の範囲が 好ましい。
投与量は、年齢、症状等により適宜選択できるが、点眼剤の場合には、 0. 0 0 0 1〜 1 0 % (wZ v )、 好ましくは、 Q . 0 0 1〜 1 % (w / V ) のものを 1 日 1回または数回に分けて点眼することができる。
また、 本発明に係る LIMキナーゼ阻害作用を有する化合物は、 他の緑 内障治療剤と併用することもできる。 図面の簡単な説明
図 1 は、 ブ夕線維柱帯組織における LIMK1の発現を示す図である。 尚、 レーン 1 は分子量マ一力一の泳動図であ り 、 その左の数値は、 分子量マーカ一の泳動位置を示す。
図 2 は、 ブタ線維柱帯組織における LIMK2の発現を示す図である。 尚、 レーン 1 は分子量マーカ一の泳動図であり、 その左の数値は、 分子量マ一カーの泳動位置を示す。
図 3は、 培養ブ夕線維柱帯細胞を L IMキナーゼ阻害剤で処理した時の ァクチンス トレスファイバーの形成度合いを示す蛍光顕微鏡像写真であ る。 ァクチンス トレスファイバ一の形成はほとんど確認できない。
図 4は、 培養ブタ線維柱帯細胞を LIMキナーゼ阻害剤で処理しない時 (コントロ一ル） のァクチンス トレスファイバ一の形成度合いを示す蛍 光顕微鏡像写真である。 ァクチンストレスファイバーの形成が確認でき る。
図 5は、 LIMキナーゼ阻害剤として、 化合物 1 を使用した時の各投与 群の眼圧の経時変化を示すグラフである。 眼圧は初期眼圧からの変化値 で示す。 鬭は LIMキナーゼ阻害剤投与群、 〇はコントロール群を示す。 図 6は、 LIMキナーゼ阻害剤として、 化合物 5を使用した時の各投与 群の眼圧の経時変化を示すグラフである。 眼圧は初期眼圧からの変化値 で示す。 画は LIMキナーゼ阻害剤投与群、 〇はコントロール群を示す。 図 7は、 LIMキナーゼ阻害剤として、 化合物 6を使用した時の各投与 群の ί艮圧の経時変化を示すグラフである。 眼圧は初期眼圧からの変化値 で示す。 騙は LIMキナーゼ阻害剤投与群、 〇はコントロール群を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下に製剤例および薬理試験の結果を示すが、 これらの実施例は、 本 発明をよりよく理解するためのものであり、 本発明の範囲を限定するも のではない。
[製剤例]
本発明 における LIM キナーゼ阻害作用 を有する化合物 と して Me t-Ala-Ser-Gly-Val-Ala-Val-Ser-Asp-Gly-Val-I le-Lys-Val-Phe-Asn- Arg-Gln-I 1 e-Lys-I 1 e-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Me t-Lys-Trp-Lys-Lys (化合物 1 ) を用いた点眼剤の一般的な製剤例を以下に示す。 点眼剤 （ 1 0 0 m L中）
化合物 1 1 0 mg
生理食塩水 適量
[薬理試験]
1 . 線維柱帯における LIMキナーゼ （LIMK1および LIMK2) 発現確認試 験
ブタ線維柱帯組織を使用して、 線維柱帯組織における LIMキナーゼの 発現の有無を検討した。 '
1 ) 試験方法
( 1 ) ブ夕眼 （ 1 0眼） より摘出した線維柱帯組織にレムリサンプルバ ッファーを加えた後、 同組織をホモジナイズし、 線維柱帯組織のホモジ ネートを作成した。
( 2 ) Nature, 1, 680- 685 (1970)に記載の Laemmli の方法に準じて、 1 0 %ポリアクリルアミ ドゲルを使用し、 線維柱帯組織のホモジネートを S D S— P A G Eにより分画した。
( 3 ) S D S— P AG Eにより分画された線維柱帯組織のホモジネート を P V D F膜 （ポリビニリデンジフルオリ ド膜） に転写し、 抗 LIMK1抗 体を使用してウエスタンブロッテイ ングを行い、 LIMK1 の発現を確認し た。
( 4 ) 抗 LIMK1抗体を抗 LIMK2抗体に代え、 他は上記 （ 1 ) 〜 （ 3 ) と 同じ方法で試験し、 LIMK2の発現を確認した。
2 ) 結果および考察
図 1 にブタ線維柱帯組織における LIMK1 発現確認試験の結果を、 図
2にブタ線維柱帯組織における LIMK2 発現確認試験の結果をそれぞれ 示す。
LIMK1および LIMK2の分子量は約 7 0 k D aであることが、 J.Biol. Chem.， 270. 31321-31330 (1995)および Oncogene, ϋ, 701-710 (1995) に開示されている。 図 1および図 2には、 分子量が約 7 0 k D a付近に 抗原抗体反応によるバンド （矢印で示すもの） が観察された。 したがつ て、 ブタ線維柱帯組織において、 LIMキナーゼ （LIMK1および LIMK2) が発現していることが確認された。
2. LIMキナーゼ阻害作用を有する化合物 （以下、 LIMキナーゼ阻害剤と する） による線維柱帯細胞のァクチン脱重合確認試験
LIM キナーゼ阻害剤の線維柱帯に対する作用を確認するために、 培養 ブタ線維柱帯細胞を LIMキナーゼ阻害剤で処理した時の培養ブ夕線維柱 帯細胞のァクチン脱重合作用を検討した。 尚、 LIM キナーゼ阻害剤とし ては、 Met- Ala-Ser-Gly- Va卜 Ala- Val-Ser- Asp-Gly-Va卜 lie- Lys- Va卜 Phe-Asn-Arg-Gln-I le-Lys-I le-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp- Lys-Lys (化合物 1 ) を使用した。
1 ) LIMキナーゼ阻害剤溶液の調製
LIMキナーゼ阻害剤をリン酸緩衝液に溶解して、濃度が 2 X 1 0 - 4Mの LIMキナーゼ阻害剤溶液を調製した。
2 ) 試験方法
( 1 ) ブタ線維柱帯組織より得た初代培養ブタ線維柱帯細胞を Ham' s F - 10 培地に懸濁させて、 3 X 1 04c ell/cm2 となるようコラーゲンタイ プ 1 コートチャンパ一スライ ドに播種し、 5 %二酸化炭素雰囲気下、 3 7 °Cで約 1 日培養した。
( 2 ) Chariot (登録商標） Kit を用いて、 L IMキナーゼ阻害剤濃度が 2 X I 0 -5Mとなるように LIMキナーゼ阻害剤溶液おょぴ Ham' s F- 10 培 地を培養ブタ線維柱帯細胞に添加し、先と同様の条件で培養を継続した。 ( 3 ) LIMキナーゼ阻害剤溶液の添加 1時間後に最終濃度が LIMキナー ゼ阻害剤 1 X 1 0—5M、 リゾフォスファチジン酸 l O jwMとなるように リゾフォスファチジン酸含有 Ham' s F-10を累積添加し、 先と同様の条 件で培養を継続した。
( 4 ) リゾフォスファチジン酸の添加 1時間後に培養を終了し、 培養ブ タ線維柱帯細胞を I0VS. , ϋ, 1029- 1037 (2001)に記載の Rao等の方法に準 じて、 F—ァクチン染色を行った後、 蛍光顕微鏡像を写真撮影した。
( 5 ) LIM キナーゼ阻害剤溶液をリン酸緩衝液 （最終濃度 0. 5 %) に 代え、 他は上記 （ 1 ) ~ (4 ) と同じ方法で試験したものをコントロー レとした。
尚、 ァクチン脱重合が促進するか否かは、 ァクチン重合が促進す る と観察されるァクチンス ト レスフ ァイバ一の形成度合いを基準に 判断した。
3 ) 結果および考察 図 3 には、 LIM キナーゼ阻害剤で処理した培養ブタ線維柱帯細胞のァ クチンス ト レスファイバー染色像を、 図 4には、 コン トロール時の培養 ブタ線維柱帯細胞のァクチンス ト レスファイバ一染色像を試験結果とし て示す。
図 3 よ り、 LIMキナーゼ阻害剤で処理した培養ブタ線維柱帯細胞には、 ァクチンス ト レスフアイパーの形成はほとんどみられず 、 コンロ —ル時 の培養ブ夕線維柱帯細胞にはァクチンス ト レスファィパ一の顕著な形成 が観察された。
このことから、 LIMキナーゼを阻害することで、 培養ブタ線維柱帯細 胞において、 ァクチン脱重合が促進されていることが確 ii、 cf レた o
3 . LIMキナーゼ阻害作用確認試験
欧州特許第 322738号明細書に記載の 2 — ( 3， 4 ― ンヒ ド ロキシペン ジリデン） マロノ二 ト リル [ AG 18、 化合物 2 ] および 2一シァノ一 3 —
( 3， 4 ージヒ ドロキシフエニル） チォアク リルァ 5 ド [AG 213 、 化合 物 3 ]、 Ber. , 44, 3502-3505 (1912)に記載の 3 — （ 3 ， 4 —ジヒ ドロキシ フエニル）一 1 一（ 2， 4 ージヒ ドロキシフエニル）プロべノ ン [Butein、 化合物 4 ]、 Molecular Pharmacology 45 (4) , 673- 683 (1994)に記載の 2 ― シァノ ー Ν— （ 3 — ( 2—シァノ ー 3 — ( 3， 4 ージヒ ドロキシフエ二 ル） ーァク リ ロイルァミ ノ） プロピル） - 3 - ( 3， 4 —ジヒ ドロキシ フ エ ニ ル ） ア ク リ ル ア ミ ド [ AG 537 、 化 合 物 5 ] 、 J. Pharni. Soc. Japan, 76, 1448-1449 (1956)に記載の 3—ヒ ドロキシー 1 一 メ トキシ一 9， 1 0 —ジォキソ一 9 , 1 0 —ジヒ ドロアン トラセン一 2 一力ルポアルデヒ ド [Damnacanthal、 化合物 6 ]、 並びに Pharmaceutical Research, 16 (1), 117- 122 (1999)に記載の 3 — （ 6， 7 —ジメ トキシキナ ゾリ ン— 4 —ィルァミ ノ） フエノ一ル [WHI-P 180、 化合物 7 ] の LIM キナーゼ阻害作用を検討した。
1 ) 被験化合物溶液の調製
1 上記の各化合物を 1 ~ 1 0 0 Mとなるように 1 %ジメチルスルホキ シ ド含有 ト リスバッファ一に溶解し、 被験化合物溶液を調製した。
2 ) 試験方法
( 1 ) 5 0 mM ト リス （ヒ ドロキシメチル） ァミ ノメタン、 I mMェチ レングリ コールビス （ 2 —アミ ノエチルエーテル） 四酢酸、 0 . 3 %ポ リオキシエチレン（Π)ラウリルエーテル、 0. 1 % 2 —メルカプトエタ ノール、 1 5 mM 塩化マグネシウム、 I O O Mアデノシン三リ ン酸、 5 mM )3 —グリセ口一ルリ ン酸、 0 . 2 m M オルトパナジン酸 （V) ナ ト リ ウム、 1 2 n g LIMK1 (Upstate Biotechnology, #14-457)、 1 μ. gコフィ リ ン 2 (Upstate Biotechnology, #12-454) および被験化合物 溶液を含む反応液 （ 5 0 /i L) を 3 0 、 1 0分間反応させた。 反応は レム リ サンプルバッ フ ァーを 5 0 (l l 添加する こ とによ り終了させ、 4でで静置した。
( 2 ) Nature, IVL 680- 685 (1970)に記載の Laemmli の方法に準じて、 1 2 . 5 %ポリ アク リルアミ ドゲルを使用し、 反応生成物を S D S — P A G Eによ り分画した。
( 3 ) S D S — P A G Eによ り分画された反応生成物を P VD F膜 （ポ リ ビニリデンジフルオリ ド膜） に転写し、 抗リ ン酸化コフィ リ ン抗体を 使用してウエスタンプロッティ ングを行い、 高感度ケミルミネッセンス 法 （ ECL法） により リ ン酸化コフィ リ ンのバン ドを検出した。
( 4 ) リ ン酸化コフィ リ ン量のパン ド濃度をデンシトメ一夕一で定量し た。
( 5 ) 被験化合物の阻害作用 （LIM キナーゼ活性阻害率） は被験化合物 非添加時 （コン トロール） のバン ド濃度との比較によ り次式に従って算 出した。
LIMキナーゼ活性阻害率 （％)
= 1 0 0 — （被験化合物添加時のバン ド濃度） / (コン トロール時のバ ンド濃度） X 1 0 0
3 ) 結果および考察
化合物 2 ~ 7のいずれの化合物も 1 ~ 1 0 0 Mの範囲で、 LIM キナ —ゼ阻害作用を有することが確認された。
. 眼圧下降効果試験
日本白色ゥサギの前房内に LIMキナーゼ阻害作用を有する化合物 （以 下、 LIMキナーゼ阻害剤とする） を投与することで、 LIMキナーゼ阻害剤 の眼圧下降効果を検討した。 LIM キナーゼ阻害剤としては、 化合物 1、 化合物 5および化合物 6を使用した。
1 ) L IMキナ一ゼ阻害剤溶液の調製
LIMキナーゼ阻害剤を基剤に溶解して pHを中性付近に調整し、下記表 1 に示す所望の濃度の LIMキナーゼ阻害剤溶液を調製した。
表 1
Figure imgf000014_0001
2 ) 投与および測定方法
( 1 ) LIM キナーゼ阻害剤溶液の投与直前に 0. 4 %塩酸ォキシブプロ 力イン点眼液 （商品名 ： べノキシール 0. 4 %液） をゥサギの両眼に一 滴ずつ点眼して局所麻酔し、 眼圧を測定した。 また、 この眼圧を初期眼
3 圧とした。
( 2 ) LIM キナーゼ阻害剤溶液 （ 2 0 ^ 1 ) をゥサギの片眼に前房内投 与した （対側眼は無処置）。
( 3 ) LIM キナーゼ阻害剤溶液の前房内投与の 2時間および 4時間後に 0. 4 %塩酸ォキシブプロ力イン点眼液（商品名：べノキシール 0. 4 % 液） をゥサギの両眼に一滴ずつ点眼して局所麻酔し、 眼圧を測定した。 ( 4 ) LIMキナーゼ阻害剤溶液を基剤のみに代え、 他は上記 （ 1 ) ~ ( 3 ) と同じ方法で試験をした。 これをコント'ロールとした。
尚、眼圧は各 3回測定し、その平均値を結果とした。 また実験動物は、 日本白色ゥサギ （系統 ： Π、 性別 ： 雄性） を使用し、 LIM キナーゼ阻害 剤溶液投与群においては、 一群 5匹を、 コントロール群においては、 一 群 5あるいは 6匹を使用した。
3 ) 結果と考察
図 5 に化合物 1の、 図 6に化合物 5の、 図 7 に化合物 6の眼圧下降効 果試験の結果を示す。 眼圧は初期眼圧からの変化値を示す。 以上の結果 から L ΙΜキナーゼ阻害剤が、 眼圧を下降させることが明らかとなった。 以上、 薬理試験 1. 〜4. の結果おょぴ背景技術より、 LIMキナーゼ を阻害すると、 コフィ リンのリン酸化が抑制されて、 線維柱帯細胞のァ クチン脱重合が促進され、 線維柱帯流出経路からの房水流出が増加し、 眼圧が下降することが理論的に明らかとなつた。 産業上の利用可能性
—本発明によ り、 LIMキナーゼ阻害作用を有する化合物またはその塩 を有効成分とする緑内障治療剤が提供される。
4

Claims

請求の範囲
1. LIM キナーゼ阻害作用を有する化合物またはその塩を有効 成分とする緑内障治療剤。
· 2. LIMキナーゼ阻害作用を有する化合物が Met-Ala- Ser
-Gly-Val-Ala-Val-Ser-Asp-Gly-Val-I le-Lys-Val-Phe-Asn-Arg-Gln-I le -Lys-I le-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Me t-Lys-Trp-Lys-Lys の ア ミ ノ酸 配列で表されるペプチド、
2—シァノ ー N— （ 3— ( 2—シァノ ー 3 — ( 3 , 4—ジヒ ドロキシフエニル） ーァク リ ロイルァミノ） プロピル） — 3 — ( 3， 4ージヒ ドロキシフエニル） アク リルアミ ドおよび 3 —ヒ ドロキシ一 1 —メ トキシー 9 , 1 0—ジォキソー 9 , 1 0—ジヒ ドロア ン トラセン一 2 —カルボアルデヒ ドからなる群よ り選択される化合物ま たはそれらの塩である請求項 1記載の緑内障治療剤。
3. LIM キナーゼ阻害作用を有する化合物またはその塩を患者 に有効量投与することからなる緑内障の治療方法。
4. LIMキナーゼ阻害作用を有する化合物が Met -Ala- Ser -Gly-Val-Ala-Val-Ser-Asp-Gly-Yal-I le-Lys-Val-Phe-Asn-Arg-Gln-I le -Lys-I le-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Me t-Lys-Trp-Lys-Lys のア ミ ノ酸 配列で表されるペプチド、 2—シァノ — N— ( 3— （ 2—シァノ ー 3 — ( 3 , 4ージヒ ドロキシフエニル) ーァク リ ロイルァミ ノ） プロピル） 一 3 — ( 3， 4ージヒ ドロキシフエニル） アク リルアミ ドおよび 3—ヒ ドロキシー 1 —メ トキシー 9 , 1 0 —ジォキソ一 9 , 1 0—ジヒ ドロア ン トラセン一 2—力ルポアルデヒ ドからなる群より選択される化合物ま たはそれらの塩である請求項 3記載の緑内障の治療方法。
5. 緑内障治療剤を製造するための LIMキナーゼ阻害作用を有 する化合物またはその塩の使用。
6. LIMキナーゼ阻害作用を有する化合物が Met- Ala-Ser -Gly-Val-Al a-Val-Ser-As -Gly-Val-I le-Lys-Val-Phe-Asn-Arg-Gln-I le -Lys-I le-Trp-Phe-G ln-Asn-Arg-Arg-Me t-Lys-Trp-Lys-Lys の ア ミ ノ 酸 配列で表されるペプチド、 2—シァノ一N— （ 3— ( 2—シァノ ー 3 — ( 3 , 4—ジヒ ドロキシフエニル） 一ァク リ ロイルァミノ） プロピル） — 3 — （ 3 , 4—ジヒ ドロキシフエニル） アク リルアミ ドおよび 3 —ヒ ドロキシー 1 ーメ トキシー 9 , 1 0—ジォキソ一 9， 1 0—ジヒ ドロア ン トラセン一 2 —力ルポアルデヒ ドからなる群よ り選択される化合物ま たはそれらの塩である請求項 5記載の使用。
6
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