KR20050036195A

KR20050036195A - 신규한 망막병증 치료제 조성물

Info

Publication number: KR20050036195A
Application number: KR1020030071812A
Authority: KR
Inventors: 고재영; 윤영희; 유민희; 노경민; 현해정; 이주영
Original assignee: 고재영; 윤영희
Priority date: 2003-10-15
Filing date: 2003-10-15
Publication date: 2005-04-20
Also published as: WO2005037277A1

Abstract

본 발명은 망막병증 치료용 릴루졸(riluzole) 및 그 벤조티아졸계 유사화합물에 관한 것이다.

릴루졸은 내피 세포 배양에서 혈관 내피세포 증식인자(VEGF)에 의한 내피 세포의 증식을 효과적으로 억제할 뿐만 아니라 미숙아 망막병증의 쥐 모델에서도 비정상적인 혈관의 형성을 억제하므로 당뇨 망막병증, 망막 동정맥 폐색증, 미숙아 망막병증 등 허혈성 또는 증식성 망막병증에 적용될 수 있으며, 이는 기존에 이미 다른 치료 용도로 사람에게 적용이 되어왔고 미국 식품의약품안전청(FDA) 승인을 받아 그 안정성이 입증되어 있는 릴루졸을 신생 혈관 증식성 망막병증의 치료 용도에 제공하는 것이다.

Description

신규한 망막병증 치료제 조성물{A novel use of riluzole for treating retinopathy}

본 발명은 망막병증(retinopathy) 치료용 릴루졸 및 그 벤조티아졸계 유사화합물에 관한 것이다.

당뇨 망막병증을 비롯하여 망막 동정맥 폐색증, 미숙아 망막병증 등의 허혈성 망막병증은 빈도나 심각성에 있어서 가장 중요한 실명 원인 중의 하나이다. 이 경우 망막 혈관 폐색에 따라 이차적으로 생기는 비정상적 신생 혈관 증식이 주요 기전이고, 이러한 신생 혈관의 증식은 혈관 내피세포 증식인자(VEGF)가 증가됨에 따라 유도되는 것으로 알려져 있으므로 이 과정에 대한 효과적인 처치가 절실하다. 비정상적인 신생 혈관의 형성은 유리체로의 출혈, 망막 박리와 실명을 유발한다. 이들 질환에 대한 현재의 치료는 비정상적인 신생 혈관의 증식을 억제하기 위하여 레이저로 시술하거나 유리체 절제술을 통하여 제거하는 것이 주이다. 그러나 레이저 처치나 수술적 치료에도 불구하고, 망막병증은 계속 진행되어 실명을 유발할 수도 있다. 따라서 이러한 당뇨 망막병증의 높은 발병률을 해소할 수 있는 새로운 효과적인 약제의 개발이 요구되고 있다.

허헐성 망막병증에서 새로운 혈관의 성장을 자극하는 주요 요인인 VEGF는 저산소 상태에서 여러 망막 세포에서 생산되며, 혈관 내피 세포에 있는 타이로신 키나아제 수용체인 Flk-1 와 KDR에 작용한다. 현재까지 그 기전에 대하여 명확히 발견되지는 않았지만 당뇨 망막병증과 미숙아 망막병증에서도 VEGF가 상위 조절된다는 것은 이미 알려진 바 있으며, 상대적 저산소증(미숙아 망막병증)과 고인슐린혈증(당뇨 망막병증)과 같은 고혈당증에서도 비슷한 기전이 발현되는 것으로 생각된다. VEGF가 증가함에 따라, 망막 혈관 내피 세포는 증식하여 신생 혈관을 형성한다. 그러나 신생 혈관은 매우 연약하기 때문에 혈관에서 삼출과 출혈이 생길 수 있다.

Flk-1 과 KDR과 같은 VEGF 수용체들의 하위 신호전달 경로 중, PKC는 혈관 내피 세포의 증식을 매개하는 중요한 요인으로 작용한다. 따라서, PKC의 억제는 망막병증에서 혈관 내피 세포의 증식을 저해하기 위한 적절한 방법으로 응용될 수 있다. 그러나, PKC들은 세포 내에서 정상적 신호전달에서도 필수적이기 때문에, PKC의 총체적 억제는 세포에 악영향을 미칠 수 있다.

최근 연구에서 프로테인 키나아제 씨 베타 투(PKC-βII)가 내피 세포에서 VEGF 효과를 매개하는 주요 인자라는 것이 밝혀졌다. 따라서 망막세포에서는 주로 PKC-βII가 발현되므로, PKC-βII를 선택적으로 억제하면 다른 종류의 PKC에 영향을 미치지 않고 내피 세포의 증식을 효과적으로 억제할 수 있을 것이다. 세포 배양 실험과 동물 실험에 의하면 선택적 PKC-βII 억제제인 LY333531이 혈관 내피 세포의 증식을 억제하는 것이 밝혀졌고, 이의 임상 실험이 진행되고 있다.

벤조티아졸(benzthiazole)계 화합물인 릴루졸(riluzole)은 글루타머테르직

(glutamatergic) 수송에 억제 효과가 있다는 것이 알려져 왔으며, 이러한 릴루졸의 세포외 독성 억제 효과는 여러 병적상태에서 신경 세포 죽음에 대한 보호 작용을 제공할 수 있음을 의미한다. 이에 따라 1990년대, 릴루졸은 신경 위축성 경화증 (amyotrophic lateral sclerosis :ALS) 치료제로서 FDA승인을 받아 임상적으로 널리 사용되고 있다.

릴루졸에 관하여는 여러 종류의 선행 특허기술이 알려져 있는데, 예를 들면 릴루졸을 아드레노류코디스트로피(adrenoleukodystrophy) 치료용도에 제공하는 EP1299102, 릴루졸을 AIDS 관련성 신경 이상의 치료용도에 제공하는 GR3035957T, 릴루졸을 청각 외상(acoustic traumas) 치료용도에 제공하는 US2002004516, 릴루졸을 복합 경화증(multiple sclerosis) 치료용도에 제공하는 WO0195907 등을 들 수 있다.

그러나 릴루졸을 망막병증(retinopathy) 치료용도에 제공한 선행 기술은 공지된 바 없으며, 본 발명자들은 ALS 치료 약제인 릴루졸이 PKC의 억제 효과가 있으며, 이것이 배양된 내피 세포에서 VEGF에 의한 세포 증식을 억제하고 쥐의 미성숙성 망막병증 모델에서 비정상적인 신생혈관의 증식을 억제한다는 것을 실험을 통해 밝혔다.

따라서, 본 발명의 목적은 릴루졸 및 그 벤조티아졸계 유사화합물을 허혈성 또는 증식성 망막병증 치료제로 제공하는 것이다.

혈관 내피세포 증식인자(VEGF)에 의한 제대 정맥 내피세포 및 망막 혈관 내피세포 증식과, PKC 활성인자인 PMA에 의한 망막 혈관 내피세포 증식을 저해하며, 제대 정맥 내피세포 배양에서 프로테인 키나아제 씨(PKC)의 인산화를 억제하고, 미숙아 망막병증의 쥐 모델 실험에서 비정상적 혈관 생성을 억제하는 릴루졸의 효능를 확인하여, 릴루졸 및 그 유사화합물을 망막병증 치료 용도로 제공코자 함으로써 본 발명의 기술적 과제는 달성되었다.

본 발명은 허혈성 또는 증식성 망막병증 치료용 릴루졸(riluzole) 및 그 벤조티아졸계 유사화합물에 관한 것이다.

릴루졸의 벤조티아졸계 유사 화합물은 하기 화학식 1과 같다.

상기 화학식 1에서 R₁은 수소, C1-C10 알킬, C1-C10 아실, C3-C8 사이클로알킬 또는 C1-C4 알킬페닐이며, R₂은 수소, C1-C10 알킬, C1-C10 아실, C3-C8 사이클로알킬 또는 C1-C4 알킬페닐이다. R₃ 및 R₄는 서로 같거나 다른 것으로, 수소, 할로겐, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시, 하이드록시, 트리플루오로메틸, 니트로이거나 또는 서로 함께 메틸렌디옥시를 형성한다.

릴루졸 등의 약효를 극대화하기 위하여 유리 형태의 릴루졸 외에, 각종 염 및 산 배합물을 포함하는 다양한 제약학적 제형이 가능하다.

제약학적으로 허용되는 염은 염산염, 인산염, 질산염, 황산염 등 무기산의 부가염, 아세테이트, 옥살레이트, 숙시네이트, 푸마레이트, 말레이트, 벤조에이트, 프로피오네이트, 살리실레이트, 메탄설포네이트, 티오필린아세테이트, 페놀프탈리네이트, 이세티오네이트, β-히드록시나프토에이트 등 유기산의 부가염, 그리고 그 치환된 유도체를 대상으로 한다.

본 발명에 의한 릴루졸을 이용한 경구투여로써 정제나 환제, 과립제 외에 분말 및 이들을 포함하는 캡슐제가 가능하며, 비경구 투여로써 액상, 점액상, 분무성 점안제, 비강내 분무제, 함포제, 좌제, 및 각종 주사제 (근육내, 피하, 및 혈관내)가 가능하며, 이상의 투여방법을 위해 제약학적으로 허용하는 각종 첨가물을 포함시킬 수 있다.

이들 약제의 효과를 극대화하기 위한 복용량 및 투여방법은 의사 등이 치료대상의 연령과 체중, 체질, 각종 병력 등의 상태를 고려하여 적합하게 결정할 수 있다.

본 발명은 혈관 내피세포 증식인자(VEGF)에 의한 제대 정맥 내피세포 및 망막 혈관 내피세포 증식에서 릴루졸의 저해 효과를 확인하는 단계; PMA에 의한 망막 혈관 내피세포 증식에서 릴루졸의 저해 효과를 확인하는 단계; 제대 정맥 내피세포 배양에서 릴루졸의 프로테인 키나아제 씨(PKC)의 인산화 억제 효과를 확인하는 단계; 및 미숙아 망막병증의 쥐 모델 실험에서 릴루졸의 비정상적 혈관 생성 억제 효과를 확인하는 단계로 이루어진다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: VEGF에 의한 제대 정맥 내피세포 및 망막 혈관 내피세포 증식에서 릴루졸의 저해 효과

사람 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)와 소의 망막 혈관 내피 세포(REC)는 피브로넥틴 (fibronectin)으로 도말한 세포 배양 용기(NUNC사 제품)를 사용하여 세포를 내피 세포 성장 배지(EGM, Clonetics사 제품)와 같이 배양하였다. 분주 5일에서 9일 사이에 실험을 실시하였다. 망막 혈관 내피 세포(REC)는 처음 분주 시 10% 소의 태아 혈청이 첨가된 EGM에 키웠고, 분주 후 1일째 EGM으로 바꾸었다.

EGM에서 세포가 30% 정도 자라게 되면 배양된 세포들은 내피 세포 기본 배지(EBM)로 바꾼 다음, 100 ng/ml VEGF를 첨가한 샘플, VEGF 처리 후 릴루졸 0.1μM을 첨가한 샘플, VEGF 처리 후 릴루졸 1μM을 첨가한 샘플, VEGF 처리 후 릴루졸 10μM을 첨가한 샘플, VEGF 처리 후 기존에 알려져있는 전체 PKC 억제제인 GF109203X 5μM를 첨가한 샘플, 아무것도 첨가하지 않은 샘플(control) 등으로 나누어 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 4일간 키웠다. 4일 후, 세포는 인산 완충 용액(PBS)으로 3번 씻은 다음, 4% 파라포름 알데하이드로 고정했다. 그런 다음, 헥스트 33258(Hoechst 33258)으로 5분간 반응시킨 후 다시 PBS로 씻어 주고 형광 현미경으로 관찰하였다. 핵은 24 웰(well) 세포 배양 용기에서 한 웰(well) 당, 무작위로 4곳 이상 관찰하였고(현미경 배율 200배) 배양된 세포의 수는 헥스트 33258로 염색한 핵을 계수함으로써 측정하였다.

사람 제대 정맥 내피 세포(HUVEC) 배양에서, 100 ng/ml VEGF에 4일간 노출된 혈관 내피 세포들은 대조군보다 3배 정도 증가하였다. 도 1a는 대조군, 도 1b는 100 ng/ml VEGF를 처리한 사진이다. HUVEC에서 VEGF에 의한 증식은 릴루졸 0.1, 1, 10 μM 또는 GF109203X 5μM을 첨가함에 따라 유의성 있게 억제되었다. 도 1c는 릴루졸 10 μM을 처리한 사진이다. 도 1d는 각 샘플에서 핵의 수적 증가를 그래프로 나타낸 것이며 유의성은 스튜던트 티 검증법으로 검증되었다. 도 1d에서 **는 0.01 이하 대조군에 대한 유의성, #는 0.05 이하 VEGF를 처리한 세포에 대한 유의성, ##는 0.01 이하 VEGF를 처리한 세포에 대한 유의성을 나타낸다.

소의 망막 내피 세포(REC) 배양에서도 100 ng/ml VEGF에 4일간 노출된 망막 혈관 내피 세포들은 대조군보다 2.5배 정도 증가하였다. 도 2a는 대조군, 도 2b는

100 ng/ml VEGF를 처리한 사진이다. 또한 REC에서 VEGF에 의한 증식은 릴루졸 0.1, 1, 10μM 또는 GF109203X 5μM을 첨가함에 따라 유의성 있게 억제되었다. 도 2c는 릴루졸 10μM을 처리한 사진이다. 도 2d는 각 샘플에서 핵의 수적 증가를 그래프로 나타낸 것이며 유의성은 스튜던트 티 검증법으로 검증되었다. 도 2d에서 **는 0.01 이하인 대조군에 대한 유의성, #는 0.05 이하 VEGF를 처리한 세포에 대한 유의성, ##는 0.01 이하 VEGF를 처리한 세포에 대한 유의성을 나타낸다.

실시예 2: PMA에 의한 망막 혈관 내피세포 증식에서 릴루졸의 저해 효과

PKC는 다기능성 단백질 키나아제이다. 전형적인 PKC의 이성질체는 PKC-α,β,γ이고 이들은 칼슘과 인지질에 의하여 활성화된다. VEGF는 VEGF 수용체인 Flk-1과 KDR을 경유하여 PKC를 활성화 시킨다. PKC-βII는 VEGF에 의한 내피 세포의 증식을 매개한다고 알려져있다.

PKC의 활성이 VEGF에 의한 망막 혈관 내피 세포의 증식에서 중요한 신호 전달이 될 수 있으므로, PKC 활성자인 PMA를 이용하여 상기 실시예 1과 같은 방법으로 실험하였다. 즉, 내피 세포 기본 배지(EBM)에서 REC에 20 nM PMA를 첨가한 샘플, PMA 처리 후 릴루졸 0.1μM을 첨가한 샘플, PMA 처리 후 릴루졸 1μM을 첨가한 샘플, PMA 처리 후 릴루졸 10μM을 첨가한 샘플, 아무것도 첨가하지 않은 샘플(control) 등으로 나누어 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 4일간 키웠다. 4일 후, 세포는 인산 완충 용액(PBS)으로 3번 씻은 다음, 4% 파라포름 알데하이드로 고정했다. 그런 다음, 헥스트 33258 (Hoechst 33258)으로 5분간 반응시킨 후 다시 PBS로 씻어 주고 형광 현미경으로 관찰하였다. 핵은 24 웰(well) 세포 배양 용기에서 한 웰(well) 당, 무작위로 4곳 이상 관찰하였고(현미경 배율 200배) 배양된 세포의 수는 헥스트 33258로 염색한 핵을 계수함으로써 측정하였다.

측정 결과, 망막 혈관 내피 세포(REC)에 20 nM PMA를 처리한 것은 100 ng/ml VEGF를 처리한 것과 비슷한 정도로 대조군에 비하여 현저한 세포 수 증식을 보였다. 도 3a는 대조군, 도 3b는 20 nM PMA를 처리한 사진이다. 릴루졸을 첨가한 경우 PMA에 의한 혈관 내피 세포 증식을 유의성 있게 억제하였다. 도 3c는 릴루졸 10μM를 처리한 사진이다. 도 3d는 각 샘플의 핵의 수적 증가를 그래프로 나타낸 것이며 유의성은 스튜던트 티 검증법으로 검증되었다. 도 3d에서 *는 대조군에 대한 0.05 이하의 유의성, #는 0.05 이하 PMA를 처리한 세포에 대한 유의성, ##는 0.01 이하 PMA를 처리한 세포에 대한 유의성을 나타낸다.

실시예 3: 제대 정맥 내피세포 배양에서 릴루졸의 PKC 인산화 억제 효과

HUVEC 배양에서 릴루졸의 프로테인 키나아제 씨(PKC) 인산화 (phosphorylation) 저해 효과를 알아보기 위하여 웨스턴 블러팅(Western blotting)과 면역 침강법(Immunoprecipitation)을 실시하였다.

동량의 단백질을 6%~8% SDS-PAGE에서 전기 영동으로 분리한 후, PVDF 막으로 옮겼다. 막은 4℃에서 항 인산 판 PKC항체(anti-phospho-PKC_pan -antibody), phospho-Flk-1항체에 반응시킨 후 ECL을 이용하여 확인하였다. 그 결과는 도 4a에 나타내었다. 이에 따르면 릴루졸이 VEGF에 의한 PKC의 인산화를 억제하는 것을 알 수 있다.도 4a에서 그래프는 PKC의 인산화 정도를 광밀도계(optical densimetry)로 측정하여 나타낸 것이며 VEGF를 21시간 동안 노출시킨 후 측정하였다. 유의성은 스튜던트 티 검증법으로 검증되었으며, *는 대조군에 대한 0.05 이하의 유의성, #는 0.05 이하 VEGF를 처리한 세포에 대한 유의성, ##는 0.01 이하 VEGF를 처리한 세포에 대한 유의성을 나타낸다.

한편, VEGF와 릴루졸 처리 21시간 후 면역 침강법을 실시하였다. 같은 양의 단백질이 되도록 만든 후, 같은 양의 항체 (PKC-α, βI, βII, γ)를 각각 넣어 4℃에서 하루 밤 동안 반응시켰다. 다음날 아가로오즈 G(PKC-βI를 반응시킨 시료)와 아가로오즈 A(PKC-α,βII, γ를 반응시킨 시료들)를 넣어 3시간 이상 흔들어 주었다. 그 후 3번 씻어주고, 2배의 샘플 완충액(sample buffer)을 넣어 5분간 끓였다. 이를 8% SDS-PAGE에서 전기 영동으로 분리한 후, PVDF 막으로 옮겼다. 막은 4℃ 에서 항 인산 판 PKC항체(anti-phospho-PKCpan antibody)에 넣어 하룻밤 동안 반응시킨 후, ECL을 이용하여 확인하였다.

그 결과는 도 4b에 나타내었는데, 이에 따르면 릴루졸 첨가 시 PKC-βII의 인산화가 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있다.

상기의 결과로부터, 릴루졸은 PKC-βI과 PKC-βII에 의한 PKC의 인산화를 억제하며 이때 VEGF 수용체 (receptor)인 Flk-1의 인산화의 변화는 일어나지 않음을 알 수 있다.

실시예 4: 미숙아 망막병증의 쥐 모델 실험

새끼 쥐를 태어난 후 5일에서 12일까지 산소 농도가 75±5%인 방에서 어미와 같이 키운 후, 12일에서 17일까지 이들을 정상 산소 농도의 방에서 키움으로써 미숙아 망막병증 모델을 만들었다. 대조군 새끼 쥐는 5일에서 17일까지 정상 산소 농도 방에서 키웠다. 정확한 산소 농도를 측정하기 위하여, 허드슨 산소 측정기 (Hudson Oxygen Analyzer, Hudson Ventronics사 제품)를 이용하여 하루에 2번 관찰하였다. SD(Sprague-Dawley) 쥐는 찰스 리버 실험실로부터 얻었다.

미숙아 망막병증 쥐 모델에서의 릴루졸의 효과를 실험하기 위하여 상기와 같은 방법으로 망막병증을 유도한 후, 비정상적 망막 혈관 형성 정도를 측정하였다. 즉, 5% DMSO가 포함된 생리 식염수에 녹인 릴루졸을 생후 12일에서 17일 동안 10mg/kg의 양으로 매일 1회씩 복강 내 주사를 했다. 대조군은 5% DMSO 가 포함된 생리 식염수를 같은 양, 같은 방법으로 주사했다.

모든 쥐는 80mg/kg의 케타민과 15mg/kg의 자일라진을 복강내 주사하여 심마취를 시켰다. 그 후, 흉강을 열어서 좌심실에 플루오레스세인 이소티오시아네이트 (fluorescein isothhiocyanate)로 표기된 덱스트란 (분자량이 2,000,000. 시그마 제품) 20mg/ml을 0.5ml 주사하였다. 15분 후 눈을 분리하고 이를 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde) 고정액에서 고정하였다. 망막은 고정된 눈으로부터 현미경을 보면서 분리하였고, 슬라이드 글라스에 펼쳐 놓은 후 형광 현미경 하에서 관찰하였다.

망막 혈관을 형광 현미경으로 관찰한 결과, 정상 산소에서 키운 새끼 쥐에게 생리 식염수를 주사한 경우(도 5a 참조) 또는 정상 산소에서 키운 새끼 쥐에게 릴루졸을 주사한 경우(도 5b 참조)는 비정상적 망막 혈관 형성이 없고 혈관의 왜곡과 실타래 모양 (tufts)의 혈관형성이 거의 나타나지 않았으며 정상적인 혈관의 모양을 나타내었다. 반면, 고농도의 산소에서 키운 새끼 쥐에게 생리 식염수를 주사한 경우는 많은 비정상적 혈관 신생 즉, 많은 실타래 모양(tufts)의 혈관 형성, 중심 혈관의 위축과 증가된 혈관 왜곡이 관찰되었다(도 5c, 5d, 5e 참조). 도 5d는 40배 배율, 도 5e는 200배 배율로 관찰한 것이다. 한편, 고농도의 산소에서 키운 새끼 쥐이게 릴루졸을 주사한 경우는 릴루졸을 처리하지 않은 실험군에 비하여 비정상적인 혈관 신생이 현저히 감소하였으며 중심 혈관들의 위축 또한 줄어들었다(도 5f, 5g, 5h 참조). 도 5g는 40배 배율, 도 5h는 200배 배율이다.

상기 결과를 망막병증 점수 체계(Retinopathy Scoring System)에 의하여 나타내었다. 망막병증 점수 체계는 미성숙성 망막병증의 국제적 분류(ICROP)를 위한 측정 시스템이다. 점수 체계는 하기 표 1에 나타내었다. 성숙의 정도는 미숙아 망막병증의 국제적 분류(ICROP)와 같이 3부분으로 나누어서 측정하였다. 질병의 진행 정도는 미숙아 망막병증의 국제적 분류(ICROP)와 같이 망막 주위의 거리와 clock hours에 의해 수치화 시켰다.

	0	1	2	3	4
혈관 생장	완전함	불완전	불완전	불완전
실타래 모양의 혈관	없음	적음, <3clock hours	3~5clock hours	6~8clock hours	9~12clock hours
망막 외 신혈관 형성	없음	약함 <3clock hours	중간 3~6clock hours	심함 >6clock hours
중심 혈관 위축	없음	약함	중간	심함
혈관 왜곡	없음	약함 <3clock hours	중간 3~6clock hours	심함 >6clock hours

각 샘플군의 망막병증의 정도를 망막병증 점수 체계(Retinopathy Scoring System, 표 1 참조)를 이용하여 수치화 한 결과는 표 2와 같다.

	혈관 생장	실타래 모양의 혈관	망막 외 신혈관 형성	중심 혈관 위축	혈관 왜곡
정상산소+생리식염수	0	0.57	0	0.07	0.57
정상산소+릴루졸	0	0.64	0	0	0.82
고농도산소+생리식염수	0.8	1.65	2.15	1.9	2.25
고농도산소+릴루졸	0.11	1.11	1.06	1	1.56

정상 산소 농도에서 길러진 대조군의 평균 점수가 1.19 (생리적 식염수 주사), 1.46 (릴루졸 주사) 인데 반하여, 고농도의 산소에서 길러진 후 생리적 식염수로 처치된 군의 점수는 8.75 였다. 한편, 고농도의 산소에서 길러진 후 릴루졸로 처리된 군의 점수는 4.84 였다. 이러한 결과에 따르면 같은 조건에서 길러졌으나 릴루졸을 처리할 경우 망막병증의 정도가 생리적 식염수로 처리된 군에 비하여 약 50% 정도 감소되는 것을 알 수 있다(도 5i 참조).

또한 망막병증의 정량화를 위하여 쥐를 치사량의 주사로 죽인 다음, 안구를 분리했다. 이를 액체 질소에 얼린 후 냉동 절편기에서 시신경과 평행하고 각막에 수직이 되도록 8㎛ 두께로 잘랐다. 절편은 4% 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde)에 고정시킨 후, 헤마톡실린과 에오진(H&E) 염색을 했고, 현미경 하에서 망막 내의 한계 막에 형성된 혈관의 핵 수를 측정하였다. 각 눈 당 50㎛ 이상의 간격을 두어 최소 8개의 절편을 만들었다. 망막병증의 정량화를 위하여, 내부 한계 막의 유리체면까지 형성된 혈관 세포 핵의 수를 현미경 하에서 측정하였다.

비정상적 혈관의 형성은 8㎛ 두께의 절편을 H&E 염색 한 후, 내부 한계 막의 유리체면에 존재하는 혈관 세포의 핵 수를 측정함으로써 정량화 하였다. 이는 내부 한계 막 위의 유리체면에 혈관 세포의 핵이 존재한다면, 새로운 혈관의 형성으로 간주할 수 있기 때문이다. 그 결과, 대조군들(생리적 식염수 처리군과 릴루졸 처리군)은 혈관 세포 핵의 증가가 5개 미만이다. 그러나 고농도의 산소에서 길러진 미숙아 망막병증 군(생리적 식염수 처리군)은 80개 이상으로 증가했다. 고농도의 산소에 노출된 후, 릴루졸 주사를 받은 군은 혈관 세포 핵의 수가 20개 정도로 크게 감소되었다. 도 6g에 상기 결과를 그래프로 나타내었다. 실험동물수는 28마리이며, 유의성은 아노바 검증법으로 검증하였고, **와 ##는 0.01 이하 유의성을 나타낸다.

도 6a~6f는 이를 사진으로 보여준 그림이다. 정상 산소 농도에서 키운 새끼 쥐에게 생리적 식염수를 처리한 후 헤마톡실린과 에오진으로 염색한 망막 사진(도 6a 참조) 또는 정상 산소 농도에서 키운 새끼 쥐에게 릴루졸을 처리한 후 헤마톡실린과 에오진으로 염색한 망막 사진(도 6b 참조)에서는 내부 한계 막의 유리체 면에 혈관 세포의 핵이 거의 발견되지 않는다. 반면, 고농도의 산소에서 키운 새끼 쥐에게 생리적 식염수를 처리한 후 헤마톡실린과 에오진으로 염색한 망막 사진에서는 내부 한계 막의 유리체 면에 혈관 내피 세포의 핵이 현저히 증가됨을 볼 수 있다(도 6c, 6d 참조). 도 6c는 저배율, 도 6d는 고배율의 사진이다. 한편, 고농도의 산소에서 키운 새끼 쥐에게 릴루졸을 처리한 후 헤마톡실린과 에오진으로 염색한 망막 사진에서는 핵이 많이 감소됨을 알 수 있다(도 6e, 6f 참조). 도 6e는 저배율, 도 6f는 고배율의 사진이다.

상기 실시예에 의하여, 릴루졸이 내피 세포 배양에서 VEGF에 의한 내피 세포의 증식을 효과적으로 억제할 뿐만 아니라, 미숙아 망막병증의 쥐 모델에서도 비정상적인 혈관의 형성을 억제한다는 것을 확인하였다. 이는 릴루졸이 PKC의 억제제로서 작용하기 때문에, 사람에 있어서 당뇨 망막병증, 망막 동정맥 폐색증, 미숙아 망막병증 등 허혈성, 또는 증식성 망막병증에도 효과가 있음을 제시한다. 한편, PKC가 다양한 조직에서 정상적 기능에 중요한 역할을 하고 있기 때문에, PKC 억제제들의 부작용은 중요한 문제로 대두되는데, 릴루졸은 미국의 식품의약품안전청 (FDA) 승인을 받은 약이며 이미 사람에게 적용이 되어왔기 때문에 그 안정성이 입증되어 있어, 신생 혈관 증식성 망막병증의 강력한 치료제로 이용될 수 있다.

본 발명은 망막병증 치료용 릴루졸(riluzole) 및 그 벤조티아졸계 유사화합물에 관한 것으로, 릴루졸은 내피 세포 배양에서 혈관 내피세포 증식인자(VEGF)에 의한 내피 세포의 증식을 효과적으로 억제할 뿐만 아니라 미숙아 망막병증의 쥐 모델에서도 비정상적인 혈관의 형성을 억제하므로 당뇨 망막병증, 망막 동정맥 폐색증, 미숙아 망막병증 등 허혈성 또는 증식성 망막병증에 적용될 수 있어 이는 의약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1a는 사람 제대 정맥 내피 세포(HUVEC) 배양에서 아무것도 처리하지 않은 대조군의 사진이다.

도 1b는 HUVEC에서 100 ng/ml VEGF를 처리한 사진이다.

도 1c는 HUVEC에서 100 ng/ml VEGF 및 릴루졸 10 μM을 처리한 사진이다.

도 1d는 각 샘플에서 핵의 수적 증가를 그래프로 나타낸 것이다.

도 2a는 소의 망막 내피 세포(REC) 배양에서 아무것도 처리하지 않은 대조군의 사진이다.

도 2b는 REC에서 100 ng/ml VEGF를 처리한 사진이다.

도 2c는 REC에서 100 ng/ml VEGF 및 릴루졸 10 μM을 처리한 사진이다.

도 2d는 각 샘플에서 핵의 수적 증가를 그래프로 나타낸 것이다.

도 3a는 망막 혈관 내피 세포(REC)에 아무것도 처리하지 않은 대조군의 사진이다.

도 3b는 REC에 20 nM PMA를 처리한 사진이다.

도 3c는 REC에 20 nM PMA 및 릴루졸 10μM를 처리한 사진이다.

도 3d는 각 샘플의 핵의 수적 증가를 그래프로 나타낸 것이다.

도 4a는 릴루졸이 VEGF에 의해 PKC의 인산화를 억제하는 것을 웨스턴 블러팅으로 실험한 결과를 나타낸 것이다.

도 4b는 릴루졸이 VEGF에 의해 PKC의 인산화를 억제하는 것을 면역침강법으로 실험한 결과를 나타낸 것이다.

도 5a는 정상 산소에서 키운 새끼 쥐에게 생리 식염수를 주사한 후 망막 혈관을 형광 현미경으로 관찰한 사진이다.

도 5b는 정상 산소에서 키운 새끼 쥐에게 릴루졸을 주사한 후 망막 혈관을 형광 현미경으로 관찰한 사진이다.

도 5c는 고농도의 산소에서 키운 새끼 쥐에게 생리 식염수를 주사한 후 망막 혈관을 형광 현미경으로 관찰한 사진이다.

도 5d는 고농도의 산소에서 키운 새끼 쥐에게 생리 식염수를 주사한 후 망막 혈관을 형광 현미경으로 40배 배율로 관찰한 사진이다.

도 5e는 고농도의 산소에서 키운 새끼 쥐에게 생리 식염수를 주사한 후 망막 혈관을 형광 현미경으로 200배 배율로 관찰한 사진이다.

도 5f는 고농도의 산소에서 키운 새끼 쥐에게 릴루졸을 주사한 후 망막 혈관을 형광 현미경으로 관찰한 사진이다.

도 5g는 고농도의 산소에서 키운 새끼 쥐에게 릴루졸을 주사한 후 망막 혈관을 형광 현미경으로 40배 배율로 관찰한 사진이다.

도 5h는 고농도의 산소에서 키운 새끼 쥐에게 릴루졸을 주사한 후 망막 혈관을 형광 현미경으로 200배 배율로 관찰한 사진이다.

도 5i는 망막 병증 점수 체계에 따라 점수화시킨 그래프이다.

도 6a는 정상 산소 농도에서 키운 새끼 쥐에게 생리적 식염수를 처리한 후 헤마톡실린과 에오진으로 염색한 망막 사진이다.

도 6b는 정상 산소 농도에서 키운 새끼 쥐에게 릴루졸을 처리한 후 헤마톡실린과 에오진으로 염색한 쥐의 망막 사진이다.

도 6c는 고농도의 산소에서 키운 새끼 쥐에게 생리적 식염수를 처리한 후 헤마톡실린과 에오진으로 염색한 저배율의 망막 사진이다.

도 6d는 고농도의 산소에서 키운 새끼 쥐에게 생리적 식염수를 처리한 후 헤마톡실린과 에오진으로 염색한 고배율의 망막 사진이다.

도 6e는 고농도의 산소에서 키운 새끼 쥐에게 릴루졸을 처리한 후 헤마톡실린과 에오진으로 염색한 저배율의 망막 사진이다.

도 6f는 고농도의 산소에서 키운 새끼 쥐에게 릴루졸을 처리한 후 헤마톡실린과 에오진으로 염색한 고배율의 망막 사진이다.

도 6g는 각 샘플의 혈관 세포의 핵 수를 그래프로 나타낸 것이다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 망막병증(retinopathy) 치료용 조성물.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서 R₁은 수소, C1-C10 알킬, C1-C10 아실, C3-C8 사이클로알킬 또는C1-C4 알킬페닐이며, R₂은 수소, C1-C10 알킬, C1-C10 아실, C3-C8 사이클로알킬 또는 C1-C4 알킬페닐이다. R₃ 및 R₄는 서로 같거나 다른 것으로, 수소, 할로겐, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시, 하이드록시, 트리플루오로메틸, 니트로이거나 또는 서로 함께 메틸렌디옥시를 형성한다.
제 1항에 있어서, 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는 릴루졸(riluzole)임을 특징으로 하는 망막병증(retinopathy) 치료용 조성물.

[화학식 2]
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 염산염, 인산염, 질산염, 황산염 등 무기산의 부가염, 아세테이트, 옥살레이트, 숙시네이트, 푸마레이트, 말레이트, 벤조에이트, 프로피오네이트, 살리실레이트, 메탄설포네이트, 티오필린아세테이트, 페놀프탈리네이트, 이세티오네이트, β-히드록시나프토에이트 등 유기산의 부가염, 그리고 그 치환된 유도체 등 제약학적으로 허용되는 염을 함께 포함하는 것을 특징으로 하는

망막병증(retinopathy) 치료용 조성물.