JP2005213159A - 血管新生阻害剤及び血管退縮剤 - Google Patents

Abstract

【課題】 新規な血管新生阻害剤及び血管退縮剤を提供する。
【解決手段】 血管新生阻害剤及び血管退縮剤の有効成分として、Ｎ−β−アラニル−５−Ｓ−グルタチオニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、β−アラニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、５−Ｓ−システイニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン等の３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体又はその薬学的に許容される塩を含有させる。
【選択図】 なし

Description

本発明は、血管新生阻害剤及び血管退縮剤に関する。また、本発明は、血管新生阻害物質のスクリーニング方法に関する。

血管の形成過程は、胎生初期での「脈管形成（vasculogenesis)」と、同後期での「血管新生（angiogenesis）」の二段階に分類される（W. Risau, Nature, 386 : 671-674 (1997) ; D. Hanahan, Science, 277 : 48-50 (1997)）。ここで、「血管新生」とは、特に既存の血管から新しい血管ネットワーク、すなわち新生血管が形成される現象のことをいう。

脈管形成及び血管新生の両過程に対するレセプター型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の関与が示唆されている。脈管形成では、血管内皮増殖因子（vascular endothelial growth factor；ＶＥＧＦ）とそれに対する特異的な細胞膜上受容体（ＶＥＧＦ−Ｒ１，ＶＥＧＦ−Ｒ２）が重要な役割を果たしていることが、ノックアウトマウスの実験より証明されている（F. Shalaby等, Nature, 376 : 62-66 (1995））。また、血管新生では、ＲＴＫタイプの細胞膜上受容体、「Ｔｉｅ」の関与が想定されている。ＴｉｅにはＴｉｅ−１とＴｉｅ−２とが存在するが、マウスを用いたノックアウト実験で脈管形成不全による致死を誘発することから、Ｔｉｅ−１とＴｉｅ−２の両分子ともに血管形成における必須の因子であると考えられている（T. N. Sato等, Nature, 376 : 70-74 (1995) ; M. C. Puri等, EMBO J., 14 : 5884-5891 (1995)）。

アンギオポエチン−１（Ａｎｇ−１）はＴｉｅ−２との結合を介して血管内皮細胞に働きかけ、ＶＥＧＦにより構築された幼若血管をより成熟な血管へと分化誘導することが知れており、アンギオポエチン−１の過剰発現動物を用いた実験では、血管が巨大化し、血管数が増え、血管の分岐が多くなることが観察されている（C. Suri等, Science, 282 : 468-471 (1998)）。

アンギオポエチン−２（Ａｎｇ−２）はＡｎｇ−１/Ｔｉｅ−２系での生理的な阻害物質であると考えられており、Ａｎｇ−１と競合的に働き、脈管形成、形態維持等を制御していると考えられている（P. C. Maisonpierre等, Science, 277 : 55-60 (1997)）。
以上のように、健康な血管の恒常性を維持するためには複数の因子が関わるため、１つの因子の過剰な働きにより、血管の病的増殖、形態異常等が生じる。

血管新生は、生体における種々の生理的及び病的状態で認められる。
生理的状態における血管新生は、黄体形成、胎盤形成等の際に認められる。一方、病的状態における血管新生は、炎症、創傷治癒、腫瘍の増殖等で認められており、眼科領域においては、例えば、糖尿病性網膜症、後水晶体線維増殖症、角膜移植に伴う血管新生、緑内症、眼腫瘍、トラコーマ等で、皮膚科領域においては、例えば、乾せん、化膿性肉芽腫等で、小児科領域においては、例えば、血管腫、線維性血管腫等で、外科領域においては、例えば、肥大性はん痕、肉芽等で、内科領域においては、例えば、リューマチ性関節炎、浮腫性硬化症等で、心臓疾患においては、例えば、アテローム性動脈硬化症等で毛細血管の病的増加が認められる。特に、糖尿病性網膜症及びトラコーマにおける異常な血管新生の増加は、多くの人々を失明に追いやり、また、リウマチ性関節炎においては、関節での異常な血管新生が関節中の軟骨の破壊を起こし、多くの人を悩ましている。

また、血管新生は、各種炎症性疾患（リウマチ性関節炎、乾癬等）、眼科領域における各種疾患（糖尿病網膜症、未熟児網膜症、老人性黄斑変性、網膜静脈閉塞症、後水晶体線維増殖症、角膜移植に伴う血管新生、緑内障、眼腫瘍等）、各種腫瘍等の発症や進行に深く関与している。特に、角膜疾患においては、Stevens-Johnson症候群及びその類縁疾患、眼類天庖瘡及びその類縁疾患、アルカリ、酸、界面活性剤、各種溶媒、揮発性ガス、その他細胞毒性を示す種々の薬剤等による角膜腐蝕、トラコーマ、ウイルス感染、フリクテン性角膜炎等の疾患、角膜移植、ソフトコンタクトレンズ長期装着等により、角膜に血管が新生されることが知られている。元来、血管の存在しない透明な組織である角膜、眼房、水晶体、硝子体における血管新生は、著しい視力障害を生じるので、日常生活に支障をきたす重大な問題である。

血管新生が関与する疾患には現在十分な治療方法がなく、特に糖尿病性網膜症においては、外科的治療法を実施しない限り、新生された血管の退縮は見られず、新生された血管からの出血による視力障害が問題となっている。
このため、近年、血管新生が関与する疾患に対する予防又は治療薬として、血管新生阻害作用を有する物質の開発が注目されている。

これまでに開発された血管新生阻害物質は次のように分類することができる。
（１）血管内皮細胞増殖阻害作用を有する物質：フマギリン（fumagillin），ＴＮＰ−４７０（糸状菌産生物フマギリンのアナログ）（非特許文献１，特許文献１参照）
（２）血管内皮細胞の管腔形成阻害作用を有する物質：Cochlioquinone A1（非特許文献２参照）
（３）血管内皮細胞の走化性阻害作用を有する物質（特許文献２参照）
（４）マトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用を有する物質：ＭＭＩ２７０（非特許文献３参照）
（５）プラスミノーゲンアクチベーター阻害作用を有する物質：プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１（ＰＡＩ−１）（非特許文献４参照）
（６）レセプター型チロシンキナーゼ阻害作用を有する物質：PKC412（非特許文献５参照）

しかしながら、これらの血管新生阻害物質は、活性が不十分であったり、毒性等の副作用を有していたりするため、血管新生が関与する疾患の予防又は治療薬としては満足のいくものではなく、優れた血管新生阻害作用を有する物質の開発が望まれている。特に、眼科領域では常に視機能の保持を念頭において薬剤を使用しなければならず、他の眼組織に悪影響を与えない安全な薬剤の開発が期待される。

眼科領域においては、角膜移植手術の際の同種移植片拒絶に、角膜の血管新生が関与していることが知られていることから（Jpn. J. Ophthalmol., 38 (3), 311-316 (1994)）、角膜移植後に血管新生の阻害を行えば、移植片の拒絶を抑制することが出来ると考えられている。新生血管を伴う眼疾患のインターフェロンαによる治療の可能性は、加齢性黄斑変性症（Fung, W. E., J. ophthalmol., 112, 349 (1991)）、血管新生緑内障（Miller, J.W.等, ophthalmology, 100, 9, (1992)）、糖尿病網膜症（Wakelee-Lynch, J. and Banks, P., Diabetes Care, 15, 300, (1992)）等で示唆されているが、その実際の有用性については未だ不明である。

一方、Ｎ−β−アラニル−５−Ｓ−グルタチオニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（５−Ｓ−ＧＡＤ）は公知の物質であり（特許文献３）、５−Ｓ−ＧＡＤが抗腫瘍作用（特許文献３，４）、アポトーシス誘導作用（特許文献５）、破骨細胞形成阻害作用（特許文献５）等を有することが知られている。
イングバー(Ingber) D等，「ネイチャー(Nature)」，1990年，第348巻，第6301号，p.555-557 ジュング(Jung) HJ等，「バイオオーガニック アンド メディシナル ケミストリー(Bioorganic & Medicinal Chemistry)」，2003年，第11巻，第22号，p.4743-4747 ナカムラ(Nakamura) ES等，「キャンサー サイエンス(Cancer Science)」，2004年，第95巻，第1号，p.25-31 ペン(Penn) JS等，「インベスティゲイティブ オフタルモロジー アンド ビジュアル サイエンス(Investigative Ophthalmology and Visual Science)」，2003年，第44巻，p.5423-5429 オザキ(Ozaki) H等，「アメリカン ジャーナル オブ パソロジー(American Journal of Pathology)」，2000年，第156巻，第2号，p.697-707 特開平１−２７９８２８号公報 特開２００３−２６６９６号公報 特開平８−３３７５９４号公報 特開２００１−２１３７９９号公報 特開２００１−２２６２８３号公報

本発明は、新規な血管新生阻害剤及び血管退縮剤を提供することを目的とする。また、本発明は、新規な血管新生阻害物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明は以下の血管新生阻害剤、血管退縮剤及び血管新生阻害物質のスクリーニング方法を提供する。
（１）次式（I）：

［式中、Ｒ^１は水素原子又は任意のアミノ酸残基を表し、Ｒ^２は水素原子又は次式（II）：

［式中、Ｒ^３は水素原子又は任意のアミノ酸残基を表し、Ｒ^４は水酸基又は任意のアミノ酸残基を表し、ｎは１又は２を表す。］
で表される基を表す。但し、Ｒ^１及びＲ^２のいずれか一方が水素原子である場合、他方は水素原子ではない。］
で表される３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する血管新生阻害剤。

（２）前記３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体が、Ｎ−β−アラニル−５−Ｓ−グルタチオニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、β−アラニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン又は５−Ｓ−システイニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンである前記（１）記載の血管新生阻害剤。
（３）眼用血管新生阻害剤である前記（１）又は（２）記載の血管新生阻害剤。
（４）角膜用血管新生阻害剤である前記（３）記載の血管新生阻害剤。

（５）次式（I）：

［式中、Ｒ^１は水素原子又は任意のアミノ酸残基を表し、Ｒ^２は水素原子又は次式（II）：

［式中、Ｒ^３は水素原子又は任意のアミノ酸残基を表し、Ｒ^４は水酸基又は任意のアミノ酸残基を表し、ｎは１又は２を表す。］
で表される基を表す。但し、Ｒ^１及びＲ^２のいずれか一方が水素原子である場合、他方は水素原子ではない。］
で表される３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する血管退縮剤。

（６）前記３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体が、Ｎ−β−アラニル−５−Ｓ−グルタチオニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、β−アラニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン又は５−Ｓ−システイニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンである前記（５）記載の血管退縮剤。
（７）眼用血管退縮剤である前記（５）又は（６）記載の血管退縮剤。
（８）角膜用血管退縮剤である前記（７）記載の血管退縮剤。

（９）下記工程（ａ）及び（ｂ）を含む、Ｎ−β−アラニル−５−Ｓ−グルタチオニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン様血管新生阻害物質のスクリーニング方法。
（ａ）試験物質が、血管退縮作用、血管内皮細胞増殖阻害作用、血管内皮細胞の管腔形成阻害作用、血管内皮細胞の走化性阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用、プラスミノーゲンアクチベーター阻害作用及びレセプター型チロシンキナーゼ阻害作用を有するか否かを判別する工程
（ｂ）血管退縮作用を有し、かつ血管内皮細胞増殖阻害作用、血管内皮細胞の管腔形成阻害作用、血管内皮細胞の走化性阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用、プラスミノーゲンアクチベーター阻害作用及びレセプター型チロシンキナーゼ阻害作用を有しない物質をスクリーニングする工程

本発明によって提供される血管新生阻害剤及び血管退縮剤は、従来の血管新生阻害剤とは別のメカニズムに基づき血管新生を阻害することができる。
すなわち、従来の血管新生阻害剤は、血管内皮細胞増殖阻害作用、血管内皮細胞の管腔形成阻害作用、血管内皮細胞の走化性阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用、プラスミノーゲンアクチベーター阻害作用、レセプター型チロシンキナーゼ阻害作用等の作用のうち１種類又は２種類以上の作用に基づき血管新生阻害作用を発揮する。これに対して、本発明の血管新生阻害剤及び血管退縮剤は、血管内皮細胞増殖阻害作用、血管内皮細胞の管腔形成阻害作用、血管内皮細胞の走化性阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用、プラスミノーゲンアクチベーター阻害作用及びレセプター型チロシンキナーゼ阻害作用のいずれの作用も有しないにも関わらず、血管退縮作用に基づき血管新生を阻害することができる。したがって、本発明の血管新生阻害剤及び血管退縮剤は、血管内皮細胞の増殖を過度に抑制することによって生じる創傷治癒の遅延等を惹起するおそれがなく、長期投与可能である。

Ｒ^１、Ｒ^３又はＲ^４で表される任意のアミノ酸残基には、いかなる種類のアミノ酸残基も含まれ、Ｒ^１、Ｒ^３又はＲ^４で表されるアミノ酸残基としては、例えば、α−アミノ酸残基、β−アミノ酸残基、γ−アミノ酸残基、中性アミノ酸（グリシン、バリン、ロイシン等のモノアミノモノカルボン酸）残基、酸性アミノ酸（グルタミン酸、アスパラギン酸等のモノアミノジカルボン酸）残基、塩基性アミノ酸（アルギニン、フェニルアラニン等のジアミノモノカルボン酸）残基等が挙げられる。なお、Ｒ^１、Ｒ^３又はＲ^４で表される任意のアミノ酸残基の結合様式はアミド結合である。

Ｒ^１で表されるアミノ酸残基は、好ましくはβ−アラニン残基であり、Ｒ^３で表されるアミノ酸残基は、好ましくはグルタミン酸残基であり、Ｒ^４で表されるアミノ酸残基は、好ましくはグリシン残基であり、ｎは好ましくは１である。

式（I）で表される３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体（化合物（I））は、好ましくは、Ｎ−β−アラニル−５−Ｓ−グルタチオニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（５−Ｓ−ＧＡＤ）、β−アラニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（β−ＡＤ）又は５−Ｓ−システイニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（５−Ｓ−ＣＤ）である。なお、化合物（I）が５−Ｓ−ＧＡＤである場合、Ｒ^１はβ−アラニン残基、Ｒ^２は式（II）で表される基、Ｒ^３はグルタミン残基、Ｒ^４はグリシン残基、ｎは１であり、化合物（I）がβ−ＡＤである場合、Ｒ^１はβ−アラニン残基、Ｒ^２は水素原子であり、化合物（I）が５−Ｓ−ＣＤである場合、Ｒ^１は水素原子、Ｒ^２は式（II）で表される基、Ｒ^３は水素原子、Ｒ^４は水酸基、ｎは１である。

化合物（I）には不斉炭素が存在するが、それらの不斉炭素の立体配置は特に限定されず、Ｓ−又はＲ−配置のいずれであってもよい。化合物（I）が１又は２個以上の不斉炭素に基づく異性体として存在する場合、化合物（I）は、立体化学的に純粋な形態の任意の異性体（光学異性体、ジアステレオ異性体等）であってもよいし、任意の異性体の混合物、ラセミ体等であってもよい。

化合物（I）の薬学的に許容される塩としては、例えば、酸付加塩、塩基付加塩、アミノ酸付加塩等が挙げられる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、乳酸塩等の有機酸塩等が挙げられ、塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、メチルアミン塩、トリエチルアミン塩等のアミン塩が挙げられ、アミノ酸付加塩としては、例えば、グリシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等の付加塩が挙げられる。

５−Ｓ−ＧＡＤ、β−ＡＤ、５−Ｓ−ＣＤ等に代表される化合物（I）は、特開平８−３３７５９４号公報、特開２００１−２１３７９９、特開２００１−２２６２８３、Leem JY等, J Biol Chem, 271, 13573-13577 (1996)、Ito S等, J Med Chem, 124, 673-677 (1981)、Natori S., Molecular Mechanisms of Immune Responses in Insects. London, Chapman＆Hall, 245-260 (1998)等に記載された公知の製造方法に準じて製造することができる。

化合物（I）は、例えば、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（Dopa）を出発原料とし、アミノ酸の縮合合成法、酵素処理法、液相ペプチド合成法等を利用して製造することができる。

化合物（I）の具体的製造方法は次の通りである。
任意のアミノ酸のアミノ基をｔ−ブトキシカルボニル基（Boc基）で保護するとともに、当該アミノ酸のカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）で活性エステル化した後、Dopaと反応させることにより、Ｒ_１が任意のアミノ酸であり、Ｒ_２が水素原子である化合物（I）を製造することができる。反応混合物からの化合物（I）の精製は、例えば、反応混合物に１Ｎ塩酸を添加し、酸性条件下、酢酸エチルを用いて抽出処理を行った後、酢酸エチル層を減圧下で濃縮して析出する結晶を回収し、ＨＰＬＣ処理することにより行うことができる。

また、Ｒ_１が任意のアミノ酸であり、Ｒ_２が水素原子である化合物（I）を次式（III）：

［式中、Ｒ^３、Ｒ^４及びｎは前記と同義である。］
で表される化合物（III）とともにリン酸緩衝液に溶解し、チロシナーゼで処理することにより、Ｒ^１が任意のアミノ酸であり、Ｒ^２が式（II）で表される基である化合物（I)を製造することができる。反応液からの化合物（I）の精製は、ＨＰＬＣ処理することにより行うことができる。

また、Dopaを化合物（III）とともにリン酸緩衝液に溶解し、チロシナーゼで処理することにより、Ｒ^１が水素原子であり、Ｒ^２が式（II）で表される基である化合物（I)を製造することができる。反応液からの化合物（I）の精製は、ＨＰＬＣ処理することにより行うことができる。

化合物（III）は、次式（IV）：

［式中、ｎは前記と同義である。］
で表される化合物（IV）（例えば、システイン、ホモシステイン）のアミノ基及びカルボキシル基に任意のアミノ酸をアミド結合させることにより製造することができる。

５−Ｓ−ＧＡＤは、センチニクバエの成虫に傷を与えて飼育した後に体液を採取するか、ホモジネート化して原料とし、これをイオンカラムクロマトグラフィー及び逆相ＨＰＬＣにより分離・分画処理し、抗菌活性を有する画分を採取することにより得ることもできる。

化合物（I）は、血管新生阻害作用及び血管退縮作用を有する。化合物（I）は、血管退縮作用に基づいて血管を退縮させ、血管新生を阻害することができる。但し、化合物（I）による血管新生阻害作用は、血管退縮作用に基づく作用に限定されるわけではない。

化合物（I）は、血管内皮細胞増殖阻害作用、血管内皮細胞の管腔形成阻害作用、血管内皮細胞の走化性阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用、プラスミノーゲンアクチベーター阻害作用及びレセプター型チロシンキナーゼ阻害作用のいずれの作用も有しないにも関わらず、血管退縮作用に基づき血管新生を阻害することができる。したがって、化合物（I）は、血管内皮細胞の増殖を過度に抑制することによって生じる創傷治癒の遅延等を惹起するおそれがなく、長期投与可能である。

本発明の血管新生阻害剤及び血管退縮剤は、化合物（I）のみから構成されていてもよいが、通常は、医薬上許容される１種以上の担体及び／又は添加剤とともに常法に従って製剤化される。製剤化する場合、化合物（I）の配合量は適宜調節することができる。

医薬上許容される担体としては、例えば、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等が挙げられる。

製剤化に際して使用される添加剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、緩衝剤、抗酸化剤、防腐剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、溶解剤、安定化剤等が挙げられ、これらの添加剤は製剤の投与単位形態等に応じて適宜選択することができる。

投与経路及び投与剤形は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましい。投与経路の一般例としては、経口投与の他、脳内、腹腔内、口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内及び静脈内等の非経口投与が挙げられ、投与剤形の一般例としては、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、噴霧剤、リポソーム剤、乳剤、座剤、注射剤、点眼剤、軟膏、テープ剤等が挙げられる。

本発明の血管新生阻害剤及び血管退縮剤が、血管新生阻害作用及び血管退縮作用を発揮することができる組織は特に限定されるものではないが、眼、特に角膜において優れた血管新生阻害作用及び血管退縮作用を発揮することができる。

角膜を含む眼への投与は、例えば、本発明の血管新生阻害剤及び血管退縮剤を注射剤とし、角膜、硝子体等の患部組織又はその隣接組織中に細い注射針で直接注入することにより行うことができる。また、ポンプ等を用いて眼内潅流液として投与することができる。また、本発明の血管新生阻害剤及び血管退縮剤をコンタクトレンズの成分として予め含浸させておくことにより、角膜を含む眼への投与を行うことができる。

強膜は、脊椎動物の眼周囲の大部分を包囲している、高度に規則化したコラーゲン網目組織からなる薄い無血管性の層である。強膜は無血管性であるので、そこに注射しても、本質的に出血の危険性はなく、注射剤は眼からすぐに失われることがない。したがって、強膜を天然の薬剤貯蔵場所として利用することができる。また、強膜を天然の薬剤貯蔵場所として利用することにより、下層の組織への薬剤供給が可能となる。

本発明の血管新生阻害剤及び血管退縮剤は、例えば、徐放性ポリマーのペレット又はマイクロカプセルに取り込ませて徐放剤とし、当該徐放剤を治療すべき組織中に外科的に移植することができる。徐放性ポリマーとしては、例えば、エチレンビニルアセテート、ポリヒドロメタクリレート、ポリアクリルアマイド、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、乳酸ポリマー、乳酸・グリコール酸コポリマー等が挙げられるが、これらのうち、生分解性ポリマーである乳酸ポリマー、乳酸・グリコール酸コポリマー等が好ましい。徐放剤の使用にあたり参照することができる事例としては、インサート剤やインプラント剤の使用（米国特許第４,８６３,４５７号）がある。これらは眼上又は眼内へ長期にわたって薬剤を放出する。インサート剤とは、結膜層上といった眼上に差し込まれた器材であり、これは一般に活性化合物を含有するポリマーマトリックスからなる。徐放剤を強膜中に移植した場合、徐放剤から放出された本発明の血管新生阻害剤及び血管退縮剤は強膜を通って眼内に拡散することができる。

本発明の血管新生阻害剤及び血管退縮剤は、ヒトを含む哺乳動物に投与することができる。本発明の血管新生阻害剤又は血管退縮剤の投与量は患者の年齢、性別、体重、症状、及び投与経路などの条件に応じて適宜増減されるべきであるが、一般的には、成人一日あたり０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇの範囲であり、好ましくは１０〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲であり、特に好ましくは５０〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。上記投与量の薬剤は、毎日投与してもよいし、数日間隔で投与してもよく、例えば１〜４日毎に投与することができる。なお、本発明の血管新生阻害剤又は血管退縮剤を他の薬剤と併用することもでき、その場合の投与量も上記と同様である。

本発明の血管新生阻害剤及び血管退縮剤は、血管新生が関与する疾患、例えば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性症、血管新生緑内障、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、翼状片、ルベオーシス、角膜新生血管症等の眼疾患、固形腫瘍、血管腫、腫瘍の増殖・転移等の癌疾患の予防又は治療剤として使用することができる。

本発明のスクリーニング方法において、試験物質が、血管退縮作用、血管内皮細胞増殖阻害作用、血管内皮細胞の管腔形成阻害作用、血管内皮細胞の走化性阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用、プラスミノーゲンアクチベーター阻害作用及びレセプター型チロシンキナーゼ阻害作用を有するか否かは、in vitro系又はin vivo系の公知の方法により判別することができる。in vitro系の方法においては、例えば、ヒト、ウシ、マウス、ラット等由来の血管内皮細胞（例えば、ヒト臍帯静脈内皮細胞、ウシ大動脈内皮細胞、マウス脳内皮細胞、ラット肝類洞内皮細胞）、所望のレセプターを発現している細胞（例えば、所望のレセプター遺伝子を有する発現ベクターを導入した宿主細胞）の膜画分を使用することができる。また、in vivo系の方法においては、モデル動物として、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス等の哺乳動物を使用することができる。

本発明のスクリーニング方法において、試験物質が例えば血管数、血管の太さ、血管の長さ等を減少させることができるとき、試験物質が血管退縮作用を有すると判別することができる。

本発明のスクリーニング方法において、試験物質の濃度が通常１０μＭ以下、好ましくは５０μＭ以下、さらに好ましくは１００μＭ以下であれば血管内皮細胞の増殖を阻害しないとき、試験物質が血管内皮細胞増殖阻害作用を有しないと判別することができる。

本発明のスクリーニング方法において、試験物質の濃度が通常１０μＭ以下、好ましくは５０μＭ以下、さらに好ましくは１００μＭ以下であれば血管内皮細胞の管腔形成を阻害しないとき、試験物質が血管内皮細胞の管腔形成阻害作用を有しないと判別することができる。

本発明のスクリーニング方法において、試験物質の濃度が通常１０μＭ以下、好ましくは５０μＭ以下、さらに好ましくは１００μＭ以下であれば血管内皮細胞の走化性を５０％以上阻害しないとき、試験物質が血管内皮細胞の走化性阻害作用を有しないと判別することができる。

本発明のスクリーニング方法において、試験物質の濃度が通常１０μＭ以下、好ましくは５０μＭ以下、さらに好ましくは１００μＭ以下であればマトリックスメタロプロテアーゼ活性を阻害しないとき、試験物質がマトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用を有しないと判別することができる。なお、「マトリックスメタロプロテアーゼ」には、血管新生に関係する限り、いかなる種類のマトリックスメタロプロテアーゼも含まれ、例えば、基底膜を分解するゼラチナーゼ群（ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９）、これらを活性化するＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１４等が含まれる。

本発明のスクリーニング方法において、試験物質の濃度が通常１０μＭ以下、好ましくは５０μＭ以下、さらに好ましくは１００μＭ以下であればプラスミノーゲンアクチベーター活性を阻害しないとき、試験物質がプラスミノーゲンアクチベーター阻害作用を有しないと判別することができる。

本発明のスクリーニング方法において、試験物質の濃度が通常１０μｇ／ｍＬ以下、好ましくは５０μｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは１００μｇ／ｍＬ以下であればレセプター型チロシンキナーゼ活性を５０％以上阻害しないとき、試験物質がレセプター型チロシンキナーゼ阻害作用を有しないと判別することができる。なお、「レセプター型チロシンキナーゼ」には、血管新生に関係する限り、いかなる種類のレセプター型チロシンキナーゼも含まれ、例えば、ＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体（Ｆｌｔ−１、Ｆｌｋ−１）、ＰＤＧＦ受容体等が含まれる。

本発明のスクリーニング方法では、血管退縮作用を有し、かつ血管内皮細胞増殖阻害作用、血管内皮細胞の管腔形成阻害作用、血管内皮細胞の走化性阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用、プラスミノーゲンアクチベーター阻害作用及びレセプター型チロシンキナーゼ阻害作用を有しない物質を、Ｎ−β−アラニル−５−Ｓ−グルタチオニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン様血管新生阻害物質としてスクリーニングすることができる。なお、「Ｎ−β−アラニル−５−Ｓ−グルタチオニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン様血管新生阻害物質（５−Ｓ−ＧＡＤ様血管新生阻害物質）」とは、５−Ｓ−ＧＡＤと同様に、血管内皮細胞増殖阻害作用、血管内皮細胞の管腔形成阻害作用、血管内皮細胞の走化性阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用、プラスミノーゲンアクチベーター阻害作用及びレセプター型チロシンキナーゼ阻害作用のいずれの作用も有しないにも関わらず、血管退縮作用に基づき血管新生を阻害することができる物質である。５−Ｓ−ＧＡＤ様血管新生阻害物質は、血管内皮細胞の増殖を過度に抑制することによって生じる創傷治癒の遅延等を惹起するおそれがないので、長期投与可能である。

〔実施例１〕
実施例１は、公知文献（Nakamura M, Katsuki Y, Shibutani Y, Oikawa T. Dienogest, a synthetic steroid, suppresses both embryonic and tumor-cell-induced angiogenesis. Eur J Pharmacol. 386, 33-40 (1999)）を参考にして行った。

ゼラチンコートした２４穴プレートにＨＵＶＥＣ（human umbilical vein endothelial cells：正常ヒト臍帯静脈内皮細胞）（１０^３細胞／ウェル）を撒き、３７℃、５％ＣＯ_２で４時間培養した。ＨＵＶＥＣの培養には、complete medium（ＭＣＤＢ１３１（Sigma社製），１０％ウシ胎児血清（fetal bovine serum），１％抗生物質（10,000 U/ml ペニシリン及び10,000μg/ml ストレプトマイシンの混合液（GIBCO社製）），１０μｇ／ｍＬ内皮細胞成長サプリメント（endothelial cell growth supplement）（Upstate Biotechnology社製），１０ｎｇ／ｍＬ上皮細胞増殖因子（epidermal growth factor），１０μｇ／ｍＬヘパリン）を用いた。その後、５−Ｓ−ＧＡＤ（０μＭ，０．０１μＭ，０．１μＭ，１μＭ，１０μＭ，１００μＭ）を添加し、さらに３７℃、５％ＣＯ_２で７２時間培養した。培養後、ＨＵＶＥＣをトリプシン処理して剥がし、コールターカウンター法により細胞数を測定した。結果を図１（ａ）に示す。

ウシ胎児血清の濃度を１％にしたcomplete mediumを用いて、上記と同様にＨＵＶＥＣを培養し、コールターカウンター法により細胞数を測定した。結果を図２に示す。

ゼラチンコートした９６穴プレートにＨＵＶＥＣ（１０^４細胞／ウェル）を撒き、３７℃、５％ＣＯ_２で４時間培養した。その後、５−Ｓ−ＧＡＤ（０μＭ，０．０１μＭ，０．１μＭ，１μＭ，１０μＭ，１００μＭ）を添加し、さらに３７℃、５％ＣＯ_２で７２時間培養した。培養後、ＭＴＴ法によりミトコンドリア代謝活性を測定した。結果を図１（ｂ）に示す。
図１及び図２に示すように、５−Ｓ−ＧＡＤは、１００μＭ以下の濃度において、ＨＵＶＥＣの増殖に影響を与えなかった。

〔実施例２〕
実施例２は、公知文献（Oikawa T, Sasaki M, Inose M, Shimamura M, Kuboki H, Hirano S, Kumagai H, Ishizuka M, Takeuchi T. Effects of cytogenin, a novel microbial product, on embryonic and tumor cell-induced angiogenic responses in vivo. Anticancer Res. 17, 1881-1886 (1997)）を参考にして行った。

２４穴プレートに、４℃下、マトリゲル（Matrigel）（Becton Dickinson Labware社製）を２ｍｇ／０．２ｍＬ／ウェルで加え、３７℃で３０分間放置した。各ウェルにＨＵＶＥＣ（７．５×１０^４細胞／１ｍＬ／ウェル）及び５−Ｓ−ＧＡＤ（０μＭ，１μＭ，１０μＭ，１００μＭ）を添加し、３７℃で１８時間培養した後、位相差顕微鏡で観察した。

通常、一定視野内の管腔の長さの合計を計算及び比較するが、ここでは、顕著な阻害効果が見られなかったため、写真のみを図３に示す。なお、図３中、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、それぞれ５−Ｓ−ＧＡＤの濃度が０μＭ、１μＭ、１０μＭ及び１００μＭである場合の結果を示す。
図３に示すように、５−Ｓ−ＧＡＤは、１００μＭ以下の濃度において、ＨＵＶＥＣの管腔形成を阻害しなかった。

〔実施例３〕
実施例３は、公知文献（Nakamura M, Katsuki Y, Shibutani Y, Oikawa T. Dienogest, a synthetic steroid, suppresses both embryonic and tumor-cell-induced angiogenesis. Eur J Pharmacol. 386, 33-40 (1999)）を参考にして行った。

ゼラチンコートした３５ｍｍのディッシュ（IWAKI社製）に、９×１０^５細胞/ディッシュとなるように、complete mediumに懸濁したＨＵＶＥＣを２ｍＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間培養した。次いで、ＭＣＤＢ１３１（Sigma社製）に０．１％ウシ血清アルブミン（bovine serum albumin）、１０μｇ／ｍＬ内皮細胞成長サプリメント（endothelial cell growth supplement）（Upstate Biotechnology社製）、１０μｇ／ｍＬヘパリン及び５−Ｓ−ＧＡＤ（０μＭ，０．０１μＭ，０．１μＭ，１μＭ，１０μＭ，１００μＭ）を添加した培地を加え、３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間培養した。

培養上清を回収して、遠心し、その遠心上清のプラスミノーゲンアクチベーター活性（ｍＵ／１０^４細胞)を測定した。結果を図４（ａ）に示す。
また、ディッシュに接着した細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（phosphate-buffered saline）で２回洗浄後、０．５ｍＬの０．５％ Triton X-100を含むリン酸緩衝生理食塩水で細胞を溶解し、得られた抽出物のプラスミノーゲンアクチベーター活性（ｍＵ／μｇタンパク質)を測定した。結果を図４（ｂ）に示す。

プラスミノーゲンアクチベーター活性は、ウシプラスミノーゲン（bovine plasminogen）及びＨ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐ−ニトロアニリド（nitroanilide）を含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に、サンプルを加えて、３７℃でインキュベーションし、４０５ｎｍにおける吸光度に基づいて遊離したｐ−ニトロアニリドを測定することにより定量した。
図４に示すように、５−Ｓ−ＧＡＤは、１００μＭ以下の濃度において、プラスミノーゲンアクチベーター活性を阻害しなかった。

〔実施例４〕
実施例４は、公知文献（Nakamura M, Katsuki Y, Shibutani Y, Oikawa T. Dienogest, a synthetic steroid, suppresses both embryonic and tumor-cell-induced angiogenesis. Eur J Pharmacol. 386, 33-40 (1999)）を参考にして行った。

ゼラチンコートした３５ｍｍのディッシュに、９×１０^５細胞／ディッシュとなるように、complete mediumに懸濁したＨＵＶＥＣを２ｍＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間培養した。その後、ＭＣＤＢ１３１（Sigma社製）に０．１％ウシ血清アルブミン、１０μg／ｍＬ 内皮細胞成長サプリメント（endothelial cell growth supplement）（Upstate Biotechnology社製）、１０μｇ／ｍＬヘパリン及び５−Ｓ−ＧＡＤ（０μＭ，０．０１μＭ，０．１μＭ，１μＭ，１０μＭ，１００μＭ）を添加した培地を加え、１８時間培養した。

培養上清を回収して、遠心し、その上清のＭＭＰ−２活性及びＭＭＰ−９活性をゼラチンザイモグラフィー（gelatin-zymography）法により解析した。ゼラチンザイモグラフィー法は、コラーゲンの変性物であるゼラチンが多くのＭＭＰの基質であることを利用し、ＭＭＰの活性を検出する方法である。ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動ゲルにゼラチンを混ぜ、ＭＭＰを含むサンプルをこのゲルで分離した後、酵素反応を行うと、ＭＭＰは分子の大きさによってゲルの中を決まった距離だけ移動した後、その場に留まってゼラチンを分解する。したがって、反応後、ゲルをタンパク質染色剤で染色すると、ＭＭＰが存在する部分だけ染まらずに透明なゲルとなり、ＭＭＰの活性が検出される。結果を図５に示す。

図５に示すように、５−Ｓ−ＧＡＤの濃度が０〜１００μＭのとき、ＭＭＰ−２前駆体を示すバンドが観察された。すなわち、５−Ｓ−ＧＡＤは、１００μＭ以下の濃度において、ＭＭＰ−２活性を阻害しなかった。
なお、図５に示すように、５−Ｓ−ＧＡＤの濃度に関わらず、ＭＭＰ−９前駆体を示すバンドは観察されなかった。

〔実施例５〕
実施例５は、公知文献（Oikawa T, Murakami K, Sano M, Shibata J, Wierzba K, Yamada Y. A potential use of a synthetic retinoid TAC-101 as an orally active agent that blocks angiogenesis in liver metastases of human stomach cancer cells. Jpn J Cancer Res., 92, 1225-1234 (2001)）を参考にして行った。

３５ｍｍの培養ディッシュ（IWAKI社製）にＨＵＶＥＣ（４．５×１０^５細胞／ｍＬ，２ｍＬ)を撒き、２４時間培養した。次いで、ＭＣＤＢ１３１（Sigma社製）に０．１％ ウシ血清アルブミン、１０μｇ／ｍＬ内皮細胞成長サプリメント、１０μｇ／ｍＬヘパリン及び５−Ｓ−ＧＡＤ（０μＭ，０．０１μＭ，０．１μＭ，１μＭ）を添加した培地を加え、２時間培養した。カミソリの刃でディッシュの細胞の一部を掻き取り、ＭＣＤＢ１３１（Sigma社製）に０．１％ウシ血清アルブミン、１０μｇ／ｍＬ内皮細胞成長サプリメント（endothelial cell growth supplement）（Upstate Biotechnology社製）、１０μｇ／ｍＬヘパリン及び５−Ｓ−ＧＡＤ（０μＭ，０．０１μＭ，０．１μＭ，１μＭ）を添加した培地で、さらに１６時間培養した。細胞を固定し、ギムザ染色した後、掻き取った部分に遊走してきた細胞の数をカウントし、対照（５−Ｓ−ＧＡＤ濃度：０μＭ）に対する比率（％）を求めた。結果を図６に示す。
図６に示すように、５−Ｓ−ＧＡＤは、１μＭ以下の濃度において、ＨＵＶＥＣの走化性（遊走性）を阻害しなかった。

〔実施例６〕
実施例６は、公知文献（Fukazawa H, Li PM, Mizuno S, Uehara Y. Method for simultaneous detection of protein kinase A, protein kinase C, protein tyrosine kinase, and calmodulin-dependent protein kinase activities. Anal Biochem., 212, 106-110 (1993)）を参考にして行った。

ｖ−ｓｒｃ癌遺伝子を発現させたマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞を低張バッファー（１ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４），５ｍＭ ＭｇＣｌ_２，２５μｇ／ｍＬ アンチパイン（antipain），ロイペプチン（leupeptin），ペプスタチンＡ（pepstatin A））に懸濁し、氷上に１０分間放置した。ボルテックスミキサーにより、１分間撹拌し、細胞溶解液を調製した。細胞溶解液を、５００×ｇで５分間、４℃で遠心し、遠心上清を脱核画分として回収した。脱核画分に適当量の試薬を加え、タンパク質濃度１ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、１ｍＭ ＮａＦ、２０μＭ ｃＡＭＰ、１００μＭ ＣａＣｌ_２とした。ＤＭＳＯに溶解した５−Ｓ−ＧＡＤ（０．１μｇ／ｍＬ，１μｇ／ｍＬ，１０μｇ／ｍＬ，１００μｇ／ｍＬ）（３μＬ）と脱核画分（２２μＬ）とを混ぜて、氷上に１０分間放置した。５μＬの[γ-^３２Ｐ]ＡＴＰ（１０μＣｉ，７５μＭ）を加えて反応を開始し、２５℃で２０分間放置した。４×ＳＤＳ-ＰＡＧＥサンプルバッファー（１０μl）を加えて、反応を止めた。

サンプルを９％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理した後、オートラジオグラフィー解析を行った。結果を図７（ａ）に示す。
また、チロシン特異的なリン酸化を検出するために、ゲルを１Ｎ ＮａＯＨで５５℃、２時間処理し、１０％酢酸−５％イソプロパノールで中和した後、オートラジオグラフィー解析を行った。結果を図７（ｂ）に示す。

図７中、「ＰＫＡ」はプロテインキナーゼＡ、「ＰＫＣ」はプロテインキナーゼＣ、「ｅＥＦ−２Ｋ」は、ｅＥＦ−２キナーゼ（真核生物延長因子２キナーゼ；カルモジュリン依存性プロテインキナーゼIII）、「ＰＴＫ」はチロシンキナーゼの位置を示す。なお、図７において、バンドの消失が活性阻害を表す。

図７に示すように、５−Ｓ−ＧＡＤの濃度が０〜１０μＭのとき、ＰＫＡ活性、ＰＫＣ活性、ｅＥＦ−２Ｋ活性、ＰＴＫ活性を示すバンドが観察された。すなわち、５−Ｓ−ＧＡＤは、１０μＭ以下の濃度において、ＰＫＡ活性、ＰＫＣ活性、ｅＥＦ−２Ｋ活性、ＰＴＫ活性を阻害しなかった。

〔実施例７〕
実施例７は、公知文献（Hanai N, Nores G, Torres-Mendez C, Hakomori S. Modified ganglioside as a possible modulator of transmembrane signaling mechanism through growth factor receptors: a preliminary note. Biochem Biophys Res Commun, 147, 127-134 (1987) ; Bertics PJ, Gill GN. Self-phosphorylation enhances the protein-tyrosine kinase activity of the epidermal growth factor receptor. J Biol Chem, 260, 14642-14647 (1985)）を参考にして行った。

Ａ４３１（human epidermoid carcinoma）細胞より膜画分を調製した。１５μＬの反応液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４），５ｍＭ ＭｎＣｌ_２，タンパク質量１０μｇの膜画分，２μｇ／ｍＬ ＥＧＦ，１ｍｇ／ｍＬ アンジオテンシン（angiotensin）II）に、５−Ｓ−ＧＡＤ（１μｇ／ｍＬ，１０μｇ／ｍＬ，１００μｇ／ｍＬ）又はＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤ＡＧ１４７８（０．００１，０．１μｇ／ｍＬ）を加え、２５℃で３０分間放置した。５μＬの[γ-^３２Ｐ]ＡＴＰ（５μＣｉ／ａｓｓａｙ；１μＭ）を加えて反応を開始し、０℃で１５分間放置した。氷冷した２０％トリクロロ酢酸で反応を止め、その上清をＰ８１セルロースペーパー（Whatmann）にスポットした。洗浄後、放射活性をシンチレーションカウンターにて測定した。結果を図８に示す。
図８に示すように、５−Ｓ−ＧＡＤは、１μＭ以下の濃度において、ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ活性を阻害しなかった。

〔実施例８〕
実施例８は、公知文献(Sawano A, Takahashi T, Yamaguchi S, Shibuya M. The phosphorylated 1169-tyrosine containing region of flt-1 kinase (VEGFR-1) is a major binding site for PLCgamma. Biochem Biophys Res Commun., 238, 487-491 (1997))を参考にして行った。

ＶＥＧＦレセプター（Ｆｌｔ−１）を過剰発現したＴｎ５細胞の膜画分（タンパク質量２μｇ）を、５−Ｓ−ＧＡＤ（１０μｇ／ｍＬ，１００μｇ／ｍＬ）又はＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤ＳＵ４９８４（１μｇ／ｍＬ，１０μｇ／ｍＬ）を加えたkinase assay緩衝液中（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），０．１％ Triton X-100，１０ｍＭ ＭｎＣｌ_２，２ｍＭ ＭｇＣｌ_２，１ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＮａＦ，０．１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４，１０μＭ [γ-^３２Ｐ]ＡＴＰ(２．５μＣｉ)）、２５℃で１０分間インキュベーションした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを加えて煮沸し、反応を止めた。

サンプルを７．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理した後、オートラジオグラフィー解析した。結果を図９（ａ）に示す。
また、チロシン特異的なリン酸化を検出するために、ゲルを１Ｍ ＮａＯＨを用いて５５℃で２時間処理し、１０％酢酸−５％イソプロパノールで中和した後、オートラジオグラフィー解析した。結果を図９（ｂ）に示す。
なお、図９において、バンドの消失がＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ活性の阻害を表す。

図９に示すように、５−Ｓ−ＧＡＤの濃度が１０μＭのとき、ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ活性を示すバンドが観察された。すなわち、５−Ｓ−ＧＡＤは、１０μＭ以下の濃度において、ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ活性を阻害しなかった。

〔実施例９〕
日本在来白色家兎（体重２〜２．３ｋｇ：船橋農場）雌の大腿部筋肉に筋弛緩剤のセラクタール（Bayer社製）と塩酸ケタミン（三共社製）の混合液（１：７）を約１．５ｍＬ注射し、全身麻酔を行った。両角膜表面麻酔剤（ベノキシール：参天製薬社製）を滴眼後、手術用顕微鏡下で２％硝酸銀液に浸した直径８ｍｍの濾紙（アドバンテック東洋社製）を角膜中央部に１分間塗布し、ゴルフ刃を用いて硝酸銀塗布部の角膜上皮細胞を剥離し、角膜実質面を露出させ、硝酸銀濾紙を１分３０秒間角膜実質面上に塗布した。塗布後直ちに１０ｍＬの生理食塩水で洗浄した。次いで、直ちにエッペンドルフ製マイクロピペットを用いて両角膜に５−Ｓ−ＧＡＤ（５−Ｓ−ＧＡＤ投与群）又は生理食塩水（対照群）を各５０μＬ点眼し、その後、感染予防のため結膜嚢内にタリビット眼軟膏（参天製薬社製）を投与した。翌日から２週間、各群の両角膜にそれぞれ５−Ｓ−ＧＡＤ又は生理食塩水各５０μＬを１日４回点眼した。

各群における２週間後の状態を図１０に示す。図１０中、「５−Ｓ−ＧＡＤ（−）」は対照群の結果を、「５−Ｓ−ＧＡＤ（＋）」は５−Ｓ−ＧＡＤ投与群の結果を示す。
図１０に示すように、対照群においては、角膜の外縁から角膜上皮細胞剥離部分に向かう血管が新生されたが、５−Ｓ−ＧＡＤ投与群においては、このような血管は新生されなかった。

新生血管モデル兎の作製７日前に５−Ｓ−ＧＡＤ又は生理食塩水を両角膜に１日４回各５０μＬ点眼した後、上記方法により新生血管モデル兎を作製し、コーワ社製スリットランプを用いて血管新生を経時的に観察した。その際、各群の検体眼における新生血管数をカウントし、次の要領でスコア化した。

１個の検体眼のスコア＝２Ｘ＋Ｙ
Ｘ：角膜の外縁から角膜上皮細胞剥離部分に至る血管数
Ｙ：角膜の外縁から角膜上皮細胞剥離部分に至らない血管数（但し、角膜の外縁から角膜の中心までの距離の１／４以上の長さを有する血管を対象とした。）
各群における１週間後及び３週間後のスコアを表１に示す。

表１に示すように、硝酸銀刺激後１週間目では両群のスコアに顕著な差は見られないが、硝酸銀刺激後３週間目では両群のスコアに顕著な差が見られた。このことから、５−Ｓ−ＧＡＤの投与により、既存の血管の退縮が促進されることが示された。

なお、５−Ｓ−ＧＡＤ投与の有無と、１週間から３週間までのスコア変化との間に相関があるかどうかを検定した。この検定での帰無仮説は、「５−Ｓ−ＧＡＤの投与と、硝酸銀刺激後１週間から３週間までのスコア変化とは独立な関係である」である。

イエーツの補正を行った場合のχ^２値は57.0904311となる。これが自由度１のχ^２分布に従うことを用いて検定するとχ²(1, 0.05)＝3.841となる。なお、χ²(1, 0.05)は、自由度１、有意水準５％のχ^２値である。
イエーツの補正を行った場合のχ^２値はχ²(1, 0.05)よりも大きいので、帰無仮説は棄却され、その結果、「５−Ｓ−ＧＡＤの投与と、硝酸銀刺激後１週間から３週間までのスコア変化とには相関関係がある」が成立した。

〔実施例１０〕
以下のようにしてマウス背部皮下（DAS：Dorsal Air Sac）法を行った。
ミリポアーリング（Millipore）の両面にミリポアーフィルター（pore size：０．４５μｍ, Millipore）を貼付したチャンバーに腫瘍細胞（Ｓ１８０；Sarcoma 180 tumor cell line) ０．１５ｍＬ(２×１０^７細胞／チャンバー）を注入した。麻酔したマウス（１５週令の雌ＩＣＲマウス）の尾根部より背部皮下に注射器で空気を注入した。皮膚を切開して空気注入部の頭側にチャンバーを挿入、挿入部位を閉じた。チャンバー移植１，２，３，４日目に、サイトゲニン（cytogenin）（１００ｍｇ／ｋｇ体重）又は５−Ｓ−ＧＡＤ（１２．５，５０，２００ｍｇ／ｋｇ体重）をｉ．ｐ．投与した。チャンバー移植５日目に麻酔したマウスの背部を、チャンバーを中心に切開し、皮膚を剥離した。皮膚側のチャンバー接触部分にリングと同型のゴムパッキンを置いた。３ｍｍ以上の長さを示す新生血管数を実体顕微鏡で測定した。結果を図１１に示す。

図１１に示すように、５−Ｓ−ＧＡＤの投与により、新生血管数が減少した。
また、図１２に示すように、５−Ｓ−ＧＡＤの投与により、既存の血管が細くなった。なお、図１２（ａ）はＰＢＳ処理、（ｂ）はサイトゲニン処理、（ｃ）は５−Ｓ−ＧＡＤ（２００ｍｇ／ｋｇ)処理、（ｄ）は５−Ｓ−ＧＡＤ（５０ｍｇ／ｋｇ）処理を表す。

〔実施例１１〕
以下のようにして鶏胚漿尿膜（ＣＡＭ）法を行った。
Ethylene-vinyl acetate copolymer 40で処理した５日目の鶏胚漿尿膜を、様々な用量（０．１，１，１０，１００μｇ／ｅｇｇ）の５−Ｓ−ＧＡＤで処理し、３７℃に加湿した孵卵器でインキュベーションした。２日目に適量の２０％脂肪乳濁液を漿尿膜に注入し、血管網を観察した。血管がない領域が直径３ｍｍ以上のとき、血管新生阻害効果があると評価した。３９個の検体について血管新生阻害効果の有無を評価し、血管新生が阻害された検体の割合を算出した。結果を図１３に示す。

図１３（ａ）に示すように、５−Ｓ−ＧＡＤは、鶏胚における血管新生を阻害した。また、図１３（ｂ）に示すように、５−Ｓ−ＧＡＤによる血管新生阻害は用量依存的であった。

（ａ）は、５−Ｓ−ＧＡＤの存在下でＨＵＶＥＣを培養した後、細胞数をコールターカウンター法により測定した結果を示す図であり、（ｂ）は、５−Ｓ−ＧＡＤの存在下でＨＵＶＥＣを培養した後、ミトコンドリア代謝活性をＭＴＴ法により測定した結果を示す図である。 ５−Ｓ−ＧＡＤの存在下でＨＵＶＥＣを培養した後、細胞数をコールターカウンター法により測定した結果を示す図である。 ５−Ｓ−ＧＡＤの存在下でＨＵＶＥＣを培養した後、管腔形成を観察した結果を示す図である。 （ａ）は、５−Ｓ−ＧＡＤの存在下でＨＵＶＥＣを培養した後、細胞外プラスミノーゲンアクチベーター活性を測定した結果を示す図であり、（ｂ）は、５−Ｓ−ＧＡＤの存在下でＨＵＶＥＣを培養した後、細胞付着性プラスミノーゲンアクチベーター活性を測定した結果を示す図である。 ５−Ｓ−ＧＡＤの存在下でＨＵＶＥＣを培養した後、ＭＭＰ−２前駆体及びＭＭＰ−９前駆体を検出した結果を示す図である。 ５−Ｓ−ＧＡＤの存在下でＨＵＶＥＣを培養した後、細胞走化性を測定した結果を示す図である。 細胞溶解液を５−Ｓ−ＧＡＤで処理した後、ＰＫＡ活性、ＰＫＣ活性、ｅＥＦ−２Ｋ活性及びＰＴＫ活性を検出した結果を示す図である。 膜画分を５−Ｓ−ＧＡＤで処理した後、ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ活性を測定した結果を示す図である。 膜画分を５−Ｓ−ＧＡＤで処理した後、ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ活性を検出した結果を示す図である。 兎の角膜上皮細胞を剥離し、硝酸銀で刺激した後、５−Ｓ−ＧＡＤ投与群又は対照群において、角膜の外縁から角膜上皮細胞剥離部分に向かう血管の新生を観察した結果を示す図である。 マウス背部皮下法により５−Ｓ−ＧＡＤ投与後の新生血管数を測定した結果を示す図である。 ５−Ｓ−ＧＡＤ投与後の既存の血管の状態（太さ）を示す図である。 （ａ）は、鶏胚漿尿膜法により５−Ｓ−ＧＡＤ処理後の血管の状態を観察した結果を示す図であり、（ｂ）は同法により血管新生阻害効果の有無を評価した結果を示す図である。

Claims (9)

1. 次式（I）：
   
   ［式中、Ｒ^１は水素原子又は任意のアミノ酸残基を表し、Ｒ^２は水素原子又は次式（II）：
   
   ［式中、Ｒ^３は水素原子又は任意のアミノ酸残基を表し、Ｒ^４は水酸基又は任意のアミノ酸残基を表し、ｎは１又は２を表す。］
   で表される基を表す。但し、Ｒ^１及びＲ^２のいずれか一方が水素原子である場合、他方は水素原子ではない。］
   で表される３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する血管新生阻害剤。
2. 前記３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体が、Ｎ−β−アラニル−５−Ｓ−グルタチオニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、β−アラニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン又は５−Ｓ−システイニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンである請求項１記載の血管新生阻害剤。
3. 眼用血管新生阻害剤である請求項１又は２記載の血管新生阻害剤。
4. 角膜用血管新生阻害剤である請求項３記載の血管新生阻害剤。
5. 次式（I）：
   
   ［式中、Ｒ^１は水素原子又は任意のアミノ酸残基を表し、Ｒ^２は水素原子又は次式（II）：
   
   ［式中、Ｒ^３は水素原子又は任意のアミノ酸残基を表し、Ｒ^４は水酸基又は任意のアミノ酸残基を表し、ｎは１又は２を表す。］
   で表される基を表す。但し、Ｒ^１及びＲ^２のいずれか一方が水素原子である場合、他方は水素原子ではない。］
   で表される３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する血管退縮剤。
6. 前記３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体が、Ｎ−β−アラニル−５−Ｓ−グルタチオニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、β−アラニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン又は５−Ｓ−システイニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンである請求項５記載の血管退縮剤。
7. 眼用血管退縮剤である請求項５又は６記載の血管退縮剤。
8. 角膜用血管退縮剤である請求項７記載の血管退縮剤。
9. 下記工程（ａ）及び（ｂ）を含む、Ｎ−β−アラニル−５−Ｓ−グルタチオニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン様血管新生阻害物質のスクリーニング方法。
   （ａ）試験物質が、血管退縮作用、血管内皮細胞増殖阻害作用、血管内皮細胞の管腔形成阻害作用、血管内皮細胞の走化性阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用、プラスミノーゲンアクチベーター阻害作用及びレセプター型チロシンキナーゼ阻害作用を有するか否かを判別する工程
   （ｂ）血管退縮作用を有し、かつ血管内皮細胞増殖阻害作用、血管内皮細胞の管腔形成阻害作用、血管内皮細胞の走化性阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用、プラスミノーゲンアクチベーター阻害作用及びレセプター型チロシンキナーゼ阻害作用を有しない物質をスクリーニングする工程