JP2005504768A - アポトーシスに関連した疾患を治療するための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
ホスファチジン酸化合物を投与することによるアポトーシス調節法を記載する。
Description
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2001年8月30日に出願された「アポトーシスに関連した疾患を治療するための方法および組成物」と題した米国仮特許出願番号第60／316,327号、および、2001年8月20日に出願された「アポトーシスに関連した疾患を治療するための方法および組成物」と題した米国仮特許出願番号第60／313,840号の優先権を主張し、その両方の全内容は参照として本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
近年5年間の間、アポトーシスはヒト疾病と関係があるとされることが多くなってきている。アポトーシスにより最終的に多くの制御された分解現象が生じ、これにより膜に包まれた細胞断片が産生され、これは炎症反応を誘発することなく貪食される。分解現象は多くの形態のアポトーシスについて類似しており、核タンパク質のDNAからの再構成および剥ぎ取り、活性化エンドヌクレアーゼによる核DNAの消化、核DNAの縮合、細胞骨格の消化、およびアポトーシス体としばしば称される膜に包まれた細胞断片の形成が含まれる。
【０００３】
アポトーシスは、開始期、決定期、および分解期という3つの期または段階を含むものとして特徴づけることができる。各期には、主にタンパク質相互作用を含む一連のシグナル伝達事象が含まれるが、脂質部分、膜透過性の変化、イオン流入なども含まれる。カスパーゼと称されるシステインに富んだプロテアーゼが、多くの開始経路、決定経路、または分解経路に重要な役割を果たす。また、特異的分解経路を活性化する因子を結果として放出するミトコンドリア膜透過性の変化は、いくつかの形態のアポトーシスにおいて重要な決定的な現象をなす。他の形態のアポトーシスでは、ミトコンドリアは関与していない。
【０００４】
従って、アポトーシスは単一の過程ではない。むしろ、細胞分解に至る、多くの異なる、時には相互に連結したシグナル伝達経路を含むものとして可視化できる。特定の形態のアポトーシスに関与する経路は、過程を開始させる損傷または損傷群（例えば局所虚血、栄養不全など）などの多くの因子に依存している。他の因子には、特定の受容体の活性化または過剰活性化、例えば、腫瘍壊死因子α（TNFα）またはFASリガンドによる「死」受容体の活性化ならびにイオンチャネル型のグルタミン酸受容体（iGluR）の過剰活性化が含まれる。別の決定的な因子は、関与している細胞型である。なぜなら、TNFα受容体活性化後、いわゆるI型およびII型細胞に対して異なるシグナル伝達経路が示されているからである。
【０００５】
単純なレベルでは、BCLファミリーのタンパク質の2つのメンバーがミトコンドリア膜透過性を決定することを判明でき、それ故、ミトコンドリアの関与するような形態のアポトーシスにおいてアポトーシス分解のシグナル伝達を活性化する決定を決定することが判明した（総説についてはJacotot E.ら（1999）Ann N Y Acad Sci 887:18-30を参照されたい）。こうしたタンパク質は一般にBAXおよびBCL−2（またはその親類のBCL−XL）である。BAXは、ミトコンドリア膜を横断する膜巨大孔の開口を促進でき、また、ミトコンドリア膜における孔を直接形成し得る。どちらの作用もミトコンドリア膜透過性を増加でき、ミトコンドリア分解シグナル伝達因子の放出をもたらす。これに対し、BCL−2は巨大孔の開口を遅延し、また膜の孔の形成を妨げ得、これによりミトコンドリア膜不透過性を維持し、アポトーシス分解の確率を減少する。
【０００６】
非疾病状態では、アポトーシス促進シグナルとアポトーシス阻害シグナルのバランスをとる恒常性のレベルが存在する。アポトーシス促進シグナルが過剰であれば、生細胞は死滅し得る。例えば、パーキンソン病では、高レベルのp53およびFasリガンドが神経死に関連している（Tatton,N.Experimental Neurology 166:29）。以前に、Akt（そのリン酸化により細胞生存が促進できるキナーゼ）を脱リン酸化するセラミド活性化ホスファターゼを阻害することにより、ホスファチジン酸は、脂質部分セラミドにより誘導されるアポトーシスを減少し得ることが研究により示唆された（Chalfant CEら（1999）J Biol Chem 274:20313-20317；Kishikawa Kら（1999）J Biol Chem 274:21335-21341）。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
1つの態様において、本発明は、少なくとも一部には、本発明のホスファチジン酸化合物を使用してアポトーシスを調節する方法に関する。
【０００８】
別の態様において、本発明は、被験者におけるアポトーシスに関連した疾患を治療する方法に関する。この方法は、治療有効量の式（I）
（式中、
R1およびR2は、各々独立的に、選択された鎖部分であり；
R3およびR4は、各々独立的に、水素であり、存在せず、またはプロドラッグ部分であり；
Lは、連結部分である）
で示されるホスファチジン酸化合物、およびその薬学的に許容される塩を投与することを含む。
【０００９】
さらなる態様において、本発明はまた、有効量の式（I）のホスファチジン酸化合物を投与することによる、細胞におけるアポトーシスをインビトロで調節する方法に関する。
【００１０】
さらなる態様において、本発明はまた、少なくとも一部には、被験者における神経変性疾患を治療する方法に関する。この方法は、被験者に、神経変性疾患が治療されるように、有効量の式（I）、（II）、または（III）のホスファチジン酸化合物を投与することを含む。
【００１１】
別の態様において、本発明はまた、被験者における眼疾患を治療する方法を含む。この方法は、被験者に、眼疾患が治療されるように、有効量の式（I）、（II）、または（III）のホスファチジン酸化合物を投与することを含む。さらなる態様において、眼疾患は緑内障である。
【００１２】
本発明はまた、少なくとも一部には、被験者に、有効量のホスファチジン酸化合物、例えば式（I）、（II）、または（III）の化合物を投与することによる、被験者におけるアポトーシスに関連した疾患を治療する方法に関する。
【００１３】
本発明はまた、少なくとも一部には、有効量のホスファチジン酸化合物（例えば式（I）、（II）、または（III）の化合物）および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物に関する。
【００１４】
さらに、本発明はまた、少なくとも一部には、パッケージングされた薬学的組成物に関する。パッケージングされた薬学的組成物は、式（I）のホスファチジン酸化合物、または薬学的に許容されるその塩、およびアポトーシス関連状態の治療における前記化合物の使用説明書を含む。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも一部には、ホスファチジン酸が、多くのヒト神経疾患のモデルとして使用される、損傷における抗アポトーシス剤であるという発見に基づく。さらに、また、ホスファチジン酸は、NGFおよび血清（栄養の除去）の突然の除去、ロテノン、およびグルタミン酸により誘導されるアポトーシスを減少させることが発見された。
【００１６】
アポトーシス研究が始まり、多くの特定の疾病状態においてアポトーシスに関与する独特な開始および決定のシグナル伝達経路が判明した。例えばパーキンソン病（PD）では、p53、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）、BAX、およびCsp3の関与するシグナル伝達経路は、疾病の根底にある神経消失の原因となっているようである（de la Monte SMら（1998）Lab Invest 78:401-411；Hartmann Aら（2000）PNAS 97:2875-2880；Tatton NA、(2000) Exp Neurol 166:29-43）。種々の疾病における特定のアポトーシスシグナル伝達要素の関与を決定する原理は、その要素によるシグナル伝達を妨害し、これにより正常細胞機能に対して望ましくない作用を奏功することなく特定のアポトーシス経路の進行を防止できる能力を有する薬理学的薬剤を開発できる可能性に関連する。図1は、多くのアポトーシスおよび抗アポトーシスシグナル伝達経路を要約する。
【００１７】
本発明のホスファチジン酸化合物は、既知の抗アポトーシス性プロパルギルアミン（AAP）とGAPDHの間の相互作用を研究することにより同定した（Boulton AA(1999)Mech Ageing Dev 111:201-209）。モノアミンオキシダーゼB（MAO−B）阻害剤である、（−）−デプレニルに構造的に類似したプロパルギルアミンは、MAO−B阻害とは独立的に、いくつかの形態のアポトーシスを減少できる能力を有する（Tatton WGら（1991）J Neurosc Res 30:666-627；Ansari KSら（1993）J Neurosci 13:4042-4053；Tatton WGら（1996）Neurol 47:S171-S183；Tatton WGら（1993）神経学的疾病におけるモノアミンオキシダーゼ阻害剤（Lieberman A編）ニューヨーク：Raven Press；Tatton WGら（1994）J Neurochem 63:1572-1575）。GAPDH上方制御は、いくつかの形態のアポトーシスシグナル伝達に必須であることが示され（総説については（Tatton WGら（2000）J Neural Transm Suppl 60:77-100）を参照されたい）、AAPはGAPDHに結合し、それを四量体形から二量体形に変換することが示された（Kragten Eら（1998）J Biol Chem 273:5821-5828；Carlile GWら（2000）Mol Pharmacol 57:2-12）。GAPDHの四量体形がアポトーシスシグナル伝達に必要であり得る。なぜなら、AAPにより誘導される二量体形はアポトーシスにシグナルを伝達することができないが、グルコースをピルビン酸に変換（糖分解）する能力は保持しているからである（Carlile GWら（2000）Mol Pharmacol 57:2-12）。
【００１８】
上方制御されたGAPDHは、アポトーシスを誘導し、ミトコンドリア膜透過性の増加のマーカーであるミトコンドリア膜電位（ΔΨM）を減少することが判明した。さらに、p53−GAPDH経路は、BCL−2の新規合成を減少させ、ミトコンドリアにおけるBAXのレベルを増加させることが判明し、これらは共にミトコンドリア膜透過性を増加させ得、ΔΨMを減少させ得、アポトーシス分解のシグナルを伝達するミトコンドリア因子の放出がもたらされ得る。AAPは、アポトーシスによるΔΨMの減少を防ぐことが判明し、これはBCL−2レベルを維持する能力に一致していることが示されている（Wadiaら（1998）J.Neuroscience 18(3):932-947；Tattonら、1996、Neurology、4:s171-183；Tatton WGら（1994）J Neurochem 63:1572-1575）。
【００１９】
免疫共沈降研究を実施して、どのタンパク質がGAPDHと結合するのかを決定した。同定された1つのタンパク質はホスホリパーゼD2（PLD2）であり、これは、スキーム1に示したように、ホスファチジルコリンをホスファチジン酸（PA）とコリンに変換する構成的に活性な酵素である。それ故、PLD2レベルは、ホスファチジン酸レベルを制御すると期待され得、従って、内因性抗アポトーシス経路を調節し得る。
スキーム1
【００２０】
1つの態様において、本発明は、少なくとも一部には、被験者におけるアポトーシスに関連した疾患を治療する方法に関する。この方法は、治療有効量の式（I）
（式中、
R1およびR2は、各々独立的に、選択された鎖部分であり；
R3およびR4は、各々独立的に、水素であり、存在せず、またはプロドラッグ部分であり；
Lは、連結部分である）
で示されるホスファチジン酸化合物、および薬学的に許容されるその塩を投与することを含む。
【００２１】
「鎖部分」という用語は、1〜30個の共有結合的に連結した原子を含む原子の鎖を含む。原子は、ホスファチジン酸がその目的の機能を実施できる、例えばアポトーシスを調節することのできる、水素もしくは1つまたはそれ以上の置換基で置換されていてもよい。鎖部分は、その溶解度または細胞生存度を増強する置換基を含み得る。鎖部分の例には、酸素、硫黄、または窒素などのヘテロ原子を選択的に含む、炭素原子鎖が含まれるがこれに限定されない。別の態様において、鎖部分には、アルキル、アルケニル、アルキニル部分が含まれる。さらなる態様において、鎖部分は脂肪酸鎖である。
【００２２】
「脂肪酸鎖」という用語は、天然および非天然の脂肪酸のアルキル鎖、アルケニル鎖、アルキニル鎖を含む。鎖は、直鎖または分岐鎖であり得る。脂肪酸鎖は飽和または不飽和であり得る。飽和脂肪酸鎖の例には、ミリスチン酸鎖、パルミチン酸鎖、ステアリン酸鎖、アラキジン酸鎖、ベヘン酸鎖、リグノセリン酸鎖、またはセロチン酸鎖が含まれるがこれに限定されない。不飽和脂肪酸鎖の例には、パルミトレイン酸鎖、オレイン酸鎖、バクセン酸鎖、リノール酸鎖、またはアラキドン酸鎖が含まれるがこれに限定されない。
【００２３】
「連結部分」という用語は、ホスファチジン酸化合物がその目的の機能を実施できる、例えばアポトーシスを調節できるように、リン酸基（PO4 −）およびエステル基（−OC＝OR1および−OC＝OR2）を接続できる部分を含む。1つの態様において、連結部分は、アルキル、アルキニル、またはアルキニルである。別の態様において、連結部分は、その目的の機能を実施できるような置換基で置換されていてもよい。さらなる態様において、連結部分はアルキル、例えばn−ブチルである。
【００２４】
「プロドラッグ部分」という用語は、インビボで切断されて、活性化合物を生じ得る部分を含む。プロドラッグ部分は、インビボで酵素によりまたは他の機序により、ホスファチジン酸へと代謝され得る。プロドラッグおよびその使用の例は当技術分野で公知である（例えばBergeら（1977）「Pharmaceutical Salts」、J.Pharm.Sci.66:1-19を参照されたい）。プロドラッグは、インサイチューでホスファチジン酸化合物の最終的な単離および精製の際に、または、精製されたその遊離酸形のホスファチジン酸化合物を適切な誘導体化剤と別々に反応させることにより調製できる。プロドラッグ部分の例には、置換および非置換、分岐または非分岐の低級アルキルホスファチジン酸エステル部分（例えばエチルホスファチジン酸エステル、プロピルホスファチジン酸エステル、ブチルホスファチジン酸エステル、ペンチルホスファチジン酸エステル、シクロペンチルホスファチジン酸エステル、ヘキシルホスファチジン酸エステル、シクロヘキシルホスファチジン酸エステル）、低級アルケニルホスファチジン酸エステル、二低級アルキル−アミノ低級−アルキルホスファチジン酸エステル（例えばジメチルアミノエチルホスファチジン酸エステル）、アシルアミノ低級アルキルホスファチジン酸エステル、アシルオキシ低級アルキルホスファチジン酸エステル（例えばピバロイルオキシメチルホスファチジン酸エステル）、アリールホスファチジン酸エステル（フェニルホスファチジン酸エステル）、アリール−低級アルキルホスファチジン酸エステル（例えばベンジルホスファチジン酸エステル）、置換（例えばメチル、ハロ、またはメトキシ置換基で）アリールおよびアリール−低級アルキルホスファチジン酸エステルなどが含まれる。
【００２５】
さらなる態様において、ホスファチジン酸化合物は、式（II）
（式中、
R1およびR2は、各々独立的に、選択された鎖部分である）
である。
【００２６】
さらに別のさらなる態様において、ホスファチジン酸化合物は、式（III）
（式中、
R1およびR2は、各々独立的に、選択された鎖部分である）
である。
【００２７】
さらなる態様において、R1およびR2の各々は、脂肪酸鎖である。別のさらなる態様において、ホスファチジン酸化合物は、L−α−ホスファチジン酸（1,2−ジアシル−sn−グリセロール−3−リン酸）または薬学的に許容されるその塩である。
【００２８】
ホスファチジン酸化合物の製造は当技術分野で既知であり、Eibl,H.(1980)「 Chemistry and Physics of Lipids」26:405に記載されている。ホスファチジン酸化合物はまた、シグマ−アルドリッチ（Sigma-Aldrich）またはアバンティ ポーラー リピッズ（Avanti Polar Lipids）などの業者から入手し得る。さらに、ホスファチジン酸化合物は、植物供給源および動物供給源から精製してもよい。精製法はPattonら（1982）J.Lipid Res.23:190に記載されている。
【００２９】
「アポトーシスに関連した疾患」という用語は、アポトーシスにより引き起こされたまたは関連した疾病、容態、および疾患を含む。アポトーシスに関連した疾患は、アポトーシス速度の増強または増加（特定の被験者に望まれる速度と比べて）、またはアポトーシス速度の減少（これも特定の被験者に望まれる速度と比べて）に関連し得る。アポトーシスに関連した疾患の例には、眼疾患、神経変性疾患、骨疾患（例えば骨関節症）、ウイルス感染（例えばHIV）、臓器（例えば肺、心臓、肝臓、腎臓、皮膚、眼など）、組織または細胞移植、免疫抑制、変性肝容態、再灌流傷害疾患、筋肉減少（例えば筋ジストロフィー、悪液質）、梗塞、卒中、自己免疫疾患、炎症、筋腫、筋萎縮症、緑内障、全身免疫応答症候群、成人呼吸困難症候群、脳性マラリア、慢性肺炎、肺性サルコイドーシス、腸炎、火傷傷害、タンパク質消失増加により特徴づけられる疾患、慢性腎不全、虚血、および肥大疾患が含まれるがこれに限定されない。さらなる態様において、アポトーシス疾患のアポトーシスは、栄養不全経路、低酸素／虚血経路、ロテノン経路、グルタミン酸経路、および／またはセラミド経路に関連している。さらなる態様において、アポトーシス関連疾患は、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）に関連している。
【００３０】
「〜に関連する」という用語には、アポトーシスが調節されるような、特定の薬剤または経路の下流での、上流での、および直接的な相互作用が含まれる。例えば、特定の疾病はGAPDHに関連し得る。GAPDHに関連した疾病はGAPDHの濃度を変化させ得、従って、アポトーシスを調節し、被験者に悪影響を及ぼす可能性がある。GAPDH（例えばGAPDHの濃度）または他のGAPDH経路のメンバーを調節することにより治療できる疾患も含まれる。GAPDH経路のメンバーの例には、iGluR、JNK、c−JUN、p53、BCL−2、BCL−X、BAD、CREBなどが含まれる。GAPDHに関連したアポトーシス関連疾患の例には、神経変性疾患（例えばパーキンソン病、多発性硬化症、末梢神経障害など）、脳低酸素症、および眼疾患（例えば緑内障）が含まれるがこれに限定されない。
【００３１】
さらなる態様において、本発明は、栄養不全経路アポトーシスに関連したアポトーシス関連疾患の治療法に関する。栄養不全アポトーシスには、NGFおよび血清の突然の除去により引き起こされるアポトーシスが含まれる。栄養不全経路アポトーシスに関連した疾患の例には、神経変性疾患および緑内障が含まれる。調節され得る栄養不全経路に関連した薬剤の例には、例えば、SMアーゼ、セラミド、p53、GAPDH、BCL−2、BCL−X、p21、BAXなどが含まれるがこれに限定されない。
【００３２】
別の態様において、本発明は、アポトーシス関連疾患の治療法に関し、ここでのアポトーシス関連疾患は、セラミド経路アポトーシスに関連している。セラミド経路に関連したアポトーシス関連疾患の例には、神経変性疾患（例えばパーキンソン病）、免疫疾患（例えばHIV）、および網膜色素変性症が含まれるがこれに限定されない。さらなる態様において、本発明のアポトーシス関連疾患は、セラミド経路のみに関連したアポトーシス関連疾患を含まない。セラミド経路アポトーシスに関連した薬剤の例には、ホスファターゼ、Akt、p53、p21、GAPDH、BCL−2、BAX、およびBADが含まれるがこれに限定されない。
【００３３】
別の態様において、本発明は、ロテノン経路アポトーシスに関連したアポトーシス関連疾患に関する。ロテノンは、ミトコンドリア呼吸鎖複合体Iを阻害する。ロテノン経路アポトーシス関連疾患の例は、パーキンソン病である（Beterbetら2000、Nature Neuroscience、3、12、1301-1306）。
【００３４】
さらなる態様において、本発明は、グルタミン酸経路アポトーシスに関連したアポトーシス関連疾患に関する。グルタミン酸経路アポトーシスに関連したアポトーシス関連疾患の例には、神経細胞死に関連した疾患（例えば卒中）、筋萎縮性側策硬化症、および緑内障が含まれるがこれに限定されない。グルタミン酸経路アポトーシスに関連した薬剤の例には、iGluR、p53、GAPDH、BCL−2、BCL−X、およびBAXが含まれるがこれに限定されない。
【００３５】
「眼疾患」という用語には、緑内障、増殖性硝子体網膜症（PVR）、網膜剥離、角膜症、非滲出性年齢関連黄斑変性（乾燥型AMD）、滲出性（湿性）AMD、網膜症（例えば糖尿病性）、網膜色素変性症を含む遺伝性網膜変性（遺伝性および散発性の症例）、アッシャー症候群、白点眼底、スターガールト病、全身性の先天的な代謝異常による網膜変性（例えば、テイ・サックス病、ゴーシェ病、遺伝性毛細管拡張症）、球後視神経炎、レーベルの先天性黒内障、中心または分岐網膜動脈閉塞、中心または分岐静脈閉塞、光受容体変性（例えば、慢性黄斑浮腫に関連した変性、全身性薬物による中毒性網膜症、破裂性網膜剥離、非破裂性網膜剥離など）、角膜実質細胞消失（例えばLasikおよびPPKなどのエキシマレーザー角膜切除術に関連した消失）、結膜細胞の消失、涙腺細胞の消失（例えば、スティーヴンス・ジョンソン症候群、シェーグレン症候群、乾性角結膜炎、放射線療法などの重度のアレルギー反応による消失）、糖尿病性および非糖尿病性動眼神経麻痺における運動神経機能の消失、視野の消失（例えば虚血、腫瘍圧力、および後頭葉の視覚野、視放線、外側膝状体、視索、視交差、および／または視神経の放射能により誘発される傷害による消失）、および、アポトーシスに関連した眼の他の疾病もしくは疾患が含まれる。
【００３６】
さらなる態様において、本発明は、有効量の本発明のホスファチジン酸化合物を被験者に投与することによる、被験者における緑内障を治療する方法に関する。
【００３７】
さらなる態様において、ホスファチジン酸化合物は、アポトーシス関連疾患の既知の治療法と組合わせて投与する。
【００３８】
既知の治療法「〜と組合わせた」という用語は、ホスファチジン酸化合物および既知の治療法の同時投与または治療、最初にホスファチジン酸化合物、次に既知の治療法の投与または治療、および、最初に既知の治療法、次いで第二にホスファチジン酸化合物の投与または治療を含むものとする。特定のアポトーシス関連疾患を治療するための当技術分野で既知の治療的に有用な方法のいずれかを、本発明の方法に使用できる。
【００３９】
非滲出性の年齢に関連した黄斑変性（乾燥型AMD）を治療する既知の方法には、ルテインの投与および亜急性ダイオードレーザー処理が含まれる。滲出性（湿性型）AMDの既知の治療法には、レーザー光凝固および光力学治療が含まれる。例えば糖尿病性網膜症などの網膜症の既知の治療法には、経口血糖降下剤およびレーザー処理（例えば焦点および汎網膜性レーザー光凝固）が含まれる。網膜色素変性症（例えば遺伝性および散発性の両方の症例）、アッシャー症候群、白点眼底、およびスターガールト病などの遺伝性網膜変性の治療の例には、ビタミンAサプリメントの投与、および可能性として将来の遺伝子療法が含まれる。緑内障による視野減少などの視野減少を治療する既知の方法には、線維柱体形成術、虹彩切除術、虹彩切開術、ろ過手術、小柱網を通したまたはぶどう膜路を通した水の流出を増加させる薬物の投与、および、水生成を減少させる薬物の投与が含まれるがこれに限定されない。球後視神経炎を治療する既知の方法の例には、ステロイドの投与が含まれる。中心または分岐網膜動脈閉塞を治療する既知の方法には、抗凝固剤および血塊破壊薬の投与ならびにレーザー処理が含まれる。中心または分岐静脈閉塞は、類似の方法を使用して治療する。慢性黄斑浮腫に関連したものなどの光受容体変性は、一般に、ステロイドの投与により治療する。全身性薬物による中毒性網膜症の治療における、既知の治療法には、薬物の中止が含まれる。破裂性網膜剥離に関連した光受容体変性を治療する既知の方法の例には、剥離の修復が含まれる。非破裂性網膜剥離に関連した光受容体変性を治療する既知の方法には、滲出性剥離（例えば網膜下の新血管網による）の原因を排除することが含まれる。重度のアレルギー反応（例えばスティーヴンス・ジョンソン症候群）における結膜細胞の消失または涙腺細胞の消失を治療する方法は、アレルギー反応を引き起こす薬物の中止またはステロイドの投与が含まれる。虚血、腫瘍圧力、または後頭葉の視覚野、視放線、外側膝状体、視索、視交差、または視神経の放射能により誘発される傷害による消失を治療する既知の方法には、ステロイドまたは血塊破壊薬の投与、および、適切な場合には、腫瘍の除去が含まれる。
【００４０】
さらなる態様において、本発明は、被験者における眼疾患を治療するためのホスファチジン酸化合物の使用法に関する。この方法には、被験者に、有効量のホスファチジン酸化合物、例えば式（I）、（II）、または（III）の化合物を投与することが含まれる。さらなる態様において、この方法には、薬学的に許容される担体の同時投与が含まれる。別のさらなる態様において、被験者はヒト、例えば眼疾患に罹患しているまたは眼疾患に罹患するリスクのあるヒトである。
【００４１】
「神経変性疾患」または「神経変性疾病」という用語には、ニューロンもしくは神経細胞のアポトーシスもしくは変性に関連または関連し得る神経変性疾患および他の神経学的な疾患が含まれる。神経変性疾病の古典的な例には、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ピック病、および筋萎縮性側策硬化症が含まれる。ニューロンまたは神経細胞が変性する他の容態には、網膜色素変性症、小脳変性、進行性上核麻痺、ヤコブ・クロイツフェルト病、糖尿病性および中毒性腎症、外傷性神経損傷、AIDS脳炎、急性播種性脳脊髄炎、卒中、および加齢が含まれる。この用語にはまた、多発性硬化症のような容態も含まれ、ここでのニューロンは脱髄に続いて変性するようである。
【００４２】
さらなる態様において、本発明は、被験者における神経変性疾患を治療するためのホスファチジン酸化合物の使用法に関する。この方法には、被験者に、有効量のホスファチジン酸化合物、例えば式（I）、（II）、または（III）の化合物を投与することが含まれる。さらなる態様において、この方法には、薬学的に許容される担体の同時投与が含まれる。別のさらなる態様において、被験者は、ヒト、例えば神経変性疾患に罹患しているヒトまたは罹患するリスクのあるヒトである。
【００４３】
別の態様において、本発明は、有効量のホスファチジン酸化合物を疾患が治療されるように投与することにより、神経変性疾患を治療する方法に関する。使用し得るホスファチジン酸化合物の例には、式（I）、（II）および（III）の化合物が含まれる。別のさらなる態様において、本発明はまた、有効量のホスファチジン酸化合物（例えば式（I）、（II）、または（III）の化合物）を投与することによる、ニューロン、グリア細胞、オリゴデンドロサイト、シュワン細胞、および神経幹細胞におけるアポトーシスの調節法に関する。細胞は、被験者内または被験者の身体の外であり得る。本発明はまた、これらまたは他の神経細胞のアポトーシスに関連した疾患を治療する方法にも関する。
【００４４】
別の態様において、本発明は、1つまたはそれ以上のアポトーシス調節剤に関連した、アポトーシス関連状態を調節することに関する。アポトーシス調節剤の例は、図1に示した種であるが、アポトーシスの開始期、決定期、および変性期に関与している他の薬剤も含まれる。アポトーシス調節剤の例には、被験者において薬剤の濃度、活性または存在がアポトーシスを調節できる場合の薬剤が含まれる。
【００４５】
「アポトーシス調節剤」という用語には、アポトーシスの調節（例えば阻害、減少、増加、促進）に関与する薬剤が含まれる。アポトーシス調節剤の例には、Fas、TNF RI、DR1、DR2、DR3、DR4、DR5、DR6、FADD、およびRIPなどであるがこれに限定されない死ドメインを含むタンパク質が含まれる。アポトーシス調節剤の他の例には、TNFα、Fasリガンド、TRAIL、bcl−2、p53、BAX、BAD、Akt、CAD、PI3キナーゼ、PPI、およびカスパーゼタンパク質が含まれるがこれに限定されない。アポトーシス調節剤は、可溶性であっても、または膜に結合してもよい（例えば受容体またはリガンド）。
【００４６】
「骨疾患」という用語には、アポトーシスに関連またはアポトーシスにより影響を受ける骨の疾患が含まれる。1つの態様において、骨疾患には、骨形成増強に関連した疾患が含まれる。骨形成増強は、例えば、骨芽細胞がアポトーシスに侵入するのを阻害される場合に生じ得る。別の態様において、骨疾患は、骨形成速度の減少または低速に関連し得る。このような疾患の例には、骨折、骨粗鬆症、および骨関節炎が含まれるがこれに限定されない。
【００４７】
「再灌流傷害疾患」という用語には、低酸素症を引き起こす血流の減少、その後のこの領域への血液の再灌流に関連した疾患が含まれる。このような疾患の例には、動脈閉塞、心筋梗塞、脳梗塞、脊髄／頭部外傷、および凍瘡などが含まれるがこれに限定されない。アポトーシスは、罹患領域への血液の再灌流時に起こり得る。傷害は、例えば、心臓、脳、腎臓、肝臓、脾臓、肺、または精巣に生じ得る。1つの態様において、本発明は、有効量の本発明のホスファチジン酸化合物（例えば式（I）、（II）または（III）の化合物）を投与することにより、被験者における再灌流傷害を治療する方法に関する。さらなる態様において、本発明は、有効量の式（I）、（II）、または（III）の化合物を投与することによる、動脈閉塞、心筋梗塞、脳梗塞、脊髄／頭部外傷、または凍瘡を治療する方法に関する。
【００４８】
肝臓の変性容態もアポトーシス関連疾患として含まれる。アセトアミノフェン、コカイン、エタノール、肝炎、および内毒素は肝細胞においてアポトーシスを誘導することが示された。従って、1つの態様において、本発明は、有効量の本発明のホスファチジン酸化合物（例えば式（I）、（II）、または（III）の化合物）を投与することにより、肝臓変性症状を治療する方法に関する。別の態様において、本発明は、アポトーシスを減少するのに有効な量の本発明のホスファチジン酸化合物を投与することにより、肝臓変性容態を治療する方法に関する（例えば肝細胞、例えば肝実質細胞）。
【００４９】
アポトーシスに関連した筋肉疾患も、アポトーシス関連疾患として含まれる。このような疾患の例には、筋ジストロフィーなどが含まれるがこれに限定されない。1つの態様において、本発明は、有効量のホスファチジン酸化合物（例えば式（I）、（II）または（III）の化合物）を投与することにより、被験者の筋肉細胞におけるアポトーシスを調節（例えば減少または増加）する方法に関する。さらなる態様において、本発明は、筋肉細胞のアポトーシスを減少させるためにホスファチジン酸化合物を使用する方法に関する。筋肉細胞の減少に関連した疾患の例には、筋萎縮症、筋ジストロフィー、および悪液質が含まれる。
【００５０】
1つの態様において、本発明は、卒中、自己免疫疾患、炎症、筋腫、筋萎縮症、全身炎症応答症候群、成人呼吸困難症候群、脳性マラリア、慢性肺炎、肺サルコイドーシス、腸炎、火傷傷害、タンパク質減少の増加を伴う疾患、慢性腎不全、虚血、または肥大疾患を治療するために、アポトーシスを調節するホスファチジン酸化合物を使用する方法に関する。
【００５１】
別の態様において、本発明は、有効量の式（I）、（II）、または（III）のホスファチジン酸化合物を投与することによる、被験者における骨細胞のアポトーシスを減少することにより骨形成を増強する方法に関する。例えば、本発明のホスファチジン酸化合物を使用して、骨形成を増強して、骨折の再形成を促進することができるか、または、骨粗鬆症もしくは骨関節炎を治療することができる。
【００５２】
HIV、化学療法、放射能、または免疫抑制薬療法により引き起こされるような免疫抑制は、種々の細胞型においてアポトーシスを引き起こすことができる。例えば、化学療法は、消化管におけるアポトーシスを誘発することがある。1つの態様において、本発明は、有効量の本発明のホスファチジン酸化合物（例えば式（I）、（II）、または（III）の化合物）を投与することにより、免疫抑制剤により引き起こされるアポトーシスを調節するためにホスファチジン酸化合物を使用する方法に関する。免疫抑制を引き起こし得る薬剤の例には、HIV、化学療法、放射能、および免疫抑制薬療法が含まれるがこれに限定されない。
【００５３】
さらなる態様において、アポトーシス関連疾患はウイルス感染である。ウイルス感染は、感染細胞において、高レベルのアポトーシスを引き起こす場合がある。例えば、HIVウイルスはCD4＋T細胞において高レベルのアポトーシスを生じることがある（Thompson,C.(1995)Trends Cell Bio.5:27）。1つの態様において、本発明は、被験者に有効量のホスファチジン酸化合物（例えば式（I）、（II）、または（III）の化合物）を投与することにより、被験者におけるウイルス感染を処置する方法に関する。
【００５４】
別の態様において、本発明は、アポトーシスが減少するように、被験者に有効量の本発明のホスファチジン酸化合物（例えば式（I）、（II）、または（III）の化合物）を投与することにより、被験者におけるウイルス感染中の細胞のアポトーシスを減少させる方法に関する。さらなる態様において、ウイルス感染はレトロウイルス感染（例えばHIV）または免疫系のウイルス感染である。別の態様において、細胞はCD4＋T細胞である。
【００５５】
「被験者」という用語には、アポトーシス関連疾患に罹患することのできる生物、例えば、哺乳動物（例えば霊長類（例えばサル、ゴリラ、チンパンジー、好都合であるのはヒト）、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イルカ、フェレット、リス）、爬虫類、または魚類、およびそのトランスジェニック種が含まれる。1つの態様において、被験者は、アポトーシス関連疾患に罹患しているか、または罹患するリスクがある。被験者という用語は、アポトーシスが起こり得る生存している生物、例えば哺乳動物を含むものとする。この用語にはまた、前記生物に付着していてもしていなくてもよい、前記に考察した生物の一部が含まれる。例えば、この用語には、別のものに移植するためにある被験者から取り出しておいた臓器が含まれる。
【００５６】
「治療有効量」または「有効量」という用語には、アポトーシス関連疾患の治療において有効である化合物の量が含まれる。治療有効量は、既知の技術を使用することにより、類似の環境下で得られた結果を観察することにより、当業者のような、主治診断医により容易に決定され得る。
【００５７】
「治療した」、「治療している」、または「治療」という用語には、治療すべきアポトーシス関連疾患に関連したまたはこれにより引き起こされた少なくとも1つの症状の消失または軽減が含まれる。例えば、治療は、疾患の1つまたはそれ以上の症状の消失、または疾患の完全な根絶であり得る。
【００５８】
インビトロで培養した細胞はしばしば限界のある寿命を有する。インビトロで細胞のアポトーシスを制限することは、細胞の寿命を延長するのに有用であり得る。遺伝子操作された細胞系は、あるレベルのタンパク質産生後に培養液中で死滅することが多い。アポトーシスの阻害はこれらの細胞系の寿命を延長し得、より多くのタンパク質産生をもたらし得る。例えば、タンパク質が産生されるように遺伝子操作されたされた細胞系は、最終的に、あるレベルのタンパク質発現後に培養条件中で死滅する。従って、1つの態様において、本発明は、有効量の式（I）、（II）、または（III）の化合物を投与することにより、インビトロで細胞のアポトーシスを調節（例えば減少または増加）する方法に関する。さらなる態様において、本発明は、遺伝子操作された細胞におけるアポトーシスを調節するためにホスファチジン酸化合物を使用する方法に関する。
【００５９】
1つの態様において、本発明は、例えば移植のために、例えば臓器、組織および細胞などの生物学的試料を生体外で維持する方法に関する。この方法には、臓器、組織、または細胞が、例えばアポトーシスの阻害により維持されるように、試料を本発明のホスファチジン酸化合物と接触させることを含む。使用し得るホスファチジン酸化合物の例には、式（I）、（II）、または（III）の化合物が含まれる。移植前、移植中、および移植後に、多くの細胞がアポトーシスに入り得、これにより臓器移植の成功する可能性は下がる。1つの態様において、本発明は、宿主における移植中および移植後に、臓器における細胞のアポトーシス速度を調節、例えば減少する方法に関する。移植し得る臓器の例は、心臓、肺、腎臓、皮膚、肝臓などである。
【００６０】
「遺伝子操作された細胞」という用語には、特定のDNA分子、RNA分子、またはタンパク質の産生が推奨または促進される、細胞が含まれる。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞系を、タンパク質用のDNAおよび適切なプロモーターを含むDNA配列でトランスフェクトすることができる。プロモーターの誘導により、所望のタンパク質を産生することができる。
【００６１】
本発明のホスファチジン酸化合物は、任意のアポトーシス関連疾患に使用し得る。アポトーシスについての様々な試験法が存在する。これらの方法を使用して、どのような疾病状態または容態でアポトーシスが起こるかを決定できたり、または、本発明のホスファチジン酸化合物の効力を決定できる。アポトーシスを阻害するホスファチジン酸化合物の能力を評価する1つの方法は、ホスファチジン酸化合物の存在下および非存在下で、細胞にアポトーシスを誘導する（ロテノングルタミン酸、アクチノマイシンD、セラミド、またはTNFαなどの薬剤を用いて）ことが含まれる。
【００６２】
その後、アポトーシスは、当技術分野で既知の様々な技術により細胞死に関与し得る。例えば、DNAゲル電気泳動におけるDNAラダーを使用して、特徴的なDNA切断パターンを示すことができる（Hermanら（1994）Nucleic Acid Research 22:5506）。別の技術は、インサイチューでの切断DNAの末端標識（ISEL）である。アポトーシスはまた、YOYO−1のような蛍光DNA結合色素を使用することにより核クロマチン凝縮を実証することにより同定することができる。さらに、一般的または特定のカスパーゼ阻害剤を使用して、システインプロテアーゼ／カスパーゼ依存度を実証することができる。ミトコンドリア膜電位の減少はまた、指標としても研究でき、エピフルオレッセンス（epifluorescence）顕微鏡またはレーザー共焦点走査顕微鏡を用いたミトコンドリア電位定量色素蛍光画像を使用することにより可視化することができる。
【００６３】
本発明のホスファチジン酸化合物は、投与に適した薬学的組成物に取り込むことができる。このような組成物は、典型的には、ホスファチジン酸分子および薬学的に許容される担体を含む。本明細書に使用したような「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的投与に適合した、任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含むものとする。薬学的に活性な物質用のこのような媒体および薬剤の使用は当技術分野で公知である。任意の慣用的な媒体または薬剤が活性化合物と非適合性でない限り、組成物におけるその使用が考えられる。補助的活性化合物も、組成物に取り込むことができる。
【００６４】
本発明の薬学的組成物は、その目的の投与経路に適合性であるように製剤化される。投与経路の例には、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口、吸入、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与が含まれる。非経口、皮内、または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる：注射用水、食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミンテトラ酢酸；緩衝液、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩、および張度調整剤、例えば塩化ナトリウムもしくはデキストロース。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整できる。非経口製剤は、硝子またはプラスチック製の、アンプル、使い捨てシリンジ、または複数回投与用バイアルに封入することができる。
【００６５】
注射に使用するのに適した薬学的組成物には、無菌水溶液（水溶性の場合）もしくは分散液、および、無菌注射溶液もしくは分散液の即時調製用の無菌粉末が含まれる。静脈内投与においては、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、クレモフォアEL（Cremophor EL）（登録商標）（BASF、パーシッパニー、NJ）、またはリン酸緩衝食塩水（PBS）が含まれる。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易にシリンジが扱える程度に流動性であるべきである。製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から防腐されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持により、界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防御は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成することができる。多くの場合、組成物に、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムなどの等張化剤を含めることが好ましい。注射用組成物の吸収延長は、組成物に、吸収を遅延する薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによりもたらすことができる。
【００６６】
無菌注射溶液は、活性化合物（例えばホスファチジン酸化合物）を必要量、適切な溶媒に、必要であれば前記に列挙した成分の1つまたは組合せと共に取り込み、その後、滅菌ろ過することにより調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒体および前記に列挙したものからの必要な他の成分を含む無菌媒体に取り込むことにより調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、活性成分の粉末と、以前に滅菌ろ過したその溶液からの任意の追加の所望の成分が生じる。
【００６７】
経口組成物には、一般に、不活性希釈剤および食用担体が含まれる。それらはゼラチンカプセルに封入しても錠剤に圧縮してもよい。経口治療薬投与の目的では、活性化合物を賦形剤と共に取り込むことができ、錠剤、トローチ、またはカプセル剤の形で使用できる。経口組成物は、うがい薬として使用する流動担体を使用して調製でき、流動担体中の化合物は、口に適用し、うがいし、吐くまたは嚥下する。薬学的に適合性の結合剤および／またはアジュバント材料も、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチなどは、以下の成分のいずれか、または性質の類似した化合物を含むことができる：結合剤、例えば微結晶セルロース、トラガカントゴム、またはゼラチン；賦形剤、例えばデンプンまたは乳糖、崩壊剤、例えばアルギニン酸、プリモゲル、またはコーンスターチ；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムまたはステロート（Sterotes）；滑沢剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えばショ糖またはサッカリン；または、芳香剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ芳香。
【００６８】
吸入による投与では、化合物は、適切な噴射剤、例えば二酸化炭素などのガスを含む加圧容器またはディスペンサー、またはネブライザーからのエアゾールスプレーの形で送達される。
【００６９】
全身投与はまた、経粘膜または経皮手段により行なわれ得る。経粘膜または経皮投与では、浸透すべき障壁に適切な浸透剤を製剤に使用する。このような浸透剤は一般に当技術分野で既知であり、例えば、経粘膜投与では、洗浄剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻腔スプレーまたは坐剤の使用により達成できる。経皮投与では、活性化合物は、当技術分野で一般に既知のような、外用薬、軟膏、ゲル、またはクリームに製剤化される。
【００７０】
化合物はまた、坐剤（例えばココアバターおよび他のグリセリドなどの慣用的な坐剤基剤を用いて）または直腸送達用の停留浣腸の形で調製できる。
【００７１】
1つの態様において、ホスファチジン酸化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル封入された送達系を含む、徐放製剤などの、生体からの急速な消失から化合物を保護する担体を用いて調製する。生分解性で生体適合性のポリマー、例えば酢酸エチレンビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などを使用できる。このような製剤の調製法は、当業者には明らかであると思われる。材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals社から市販され入手できる。
【００７２】
リポソーム懸濁液（特定の抗原に対する抗体を用いて、特定の細胞に標的化したリポソームを含む）もまた、薬学的に許容される担体として使用できる。これらは、例えば米国特許第4,522,811号に記載のように、当業者に既知の方法に従って調製できる。脂質を用いた送達系は、疎水性薬物を送達できる利点を有する。疎水性薬物のための別の送達系は、米国特許第6,153,217号に記載のような、BioDelivery Sciences Internationalの共キレート送達系である。
【００７３】
フォトターゲット（PHOTOTARGET)（商標）システムに言及すると、網膜の脈管への薬物および／または診断的な画像化色素の光標的化送達は、本発明のホスファチジン酸化合物に関する可能性ある送達機序である。この方法は、薬物または色素を封入した人工リン脂質を含むリポソーム小胞の静脈内投与を含む。標的組織（網膜または脈絡叢血管）の光により送達される短くて強度の低いパルスによる加温により、リポソームが熱破壊され、循環中のリポソームから小さな塊の薬物または色素が放出される。光の強度だけでは、標的化組織または周辺組織に傷害を与えるには不十分である（例えば米国特許第6,248,727号；米国特許第6,140,314号；米国特許第5,935,942号；米国特許第4,891,043号を参照されたい）。
【００７４】
投与し易さおよび用量の均一性のために、単位投与形で経口または非経口組成物を製剤化することが有利である。本明細書に使用したような単位投与形は、治療する被験者の単位用量として適した物理的に別個の単位を意味し；各単位は、必要な薬学的担体と共に、所望の治療効果を生じるように計算された予め決定された量の活性化合物を含む。本発明の単位投与形の詳細は、活性化合物の独特な特徴および達成する具体的な治療効果、および個体の治療のためにこのような活性化合物を配合する技術分野に固有の限界により指示され、これに直接依存する。
【００７５】
このような化合物の毒性および治療効力は、例えばLD50（個体群の50％に致命的な用量）およびED50（個体群の50％において治療的に有効な用量）の決定のために、細胞培養液または実験動物における標準的な薬学的手順により決定できる。毒性作用と治療作用の間の用量比は治療係数であり、LD50／ED50比として表現できる。大きな治療係数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物も使用できるが、罹患していない細胞への傷害の可能性を最小限にし、これにより副作用を最小限にするために、このような化合物を罹患組織部位に標的化する送達系を設計するのに注意を払うべきである。
【００７６】
細胞培養アッセイ法および動物試験から得られたデータは、ヒトに使用する一連の用量を製剤化するのに使用できる。このような化合物の用量は、好ましくは、殆どまたは全く毒性を伴わないED50を含む一連の循環濃度内に存在する。用量は、使用する剤形および使用する投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。本発明の方法に使用する任意の化合物について、治療有効量は、最初に細胞培養アッセイ法から推定できる。細胞培養液中で決定したようなIC50（症状の最大の半分の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環中血漿中濃度範囲を達成する用量を、動物モデルで製剤化できる。このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定できる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定できる。
【００７７】
本発明のホスファチジン酸化合物は、薬学的投与に適した生物学的に適合した形でインビボで被験者に投与して、アポトーシスを調節、例えば阻害する。「インビボで投与に適した生物学的に適合した形」により、あらゆる毒性作用よりもタンパク質の治療作用の方が上回る、投与すべき分子形を意味する。本明細書に記載したような薬剤の投与は、治療有効量の薬剤のみまたは薬学的に許容される担体と組合わせたものを含む、任意の薬学的形態であり得る。
【００７８】
本発明のホスファチジン酸化合物は、1つまたはそれ以上の酸性官能基を含み得、従って、薬学的に許容される塩基と、薬学的に許容される塩を形成できる。これらの場合の「薬学的に許容される塩」という用語は、比較的無毒性の本発明の化合物の無機および有機塩基付加塩を含む。これらの塩は、インサイチューで化合物の最終的な単離および精製の際に、または、その遊離酸形態の精製化合物を、適切な塩基、例えば薬学的に許容される金属陽イオンの水酸化物、カーボネート、もしくはバイカーボネートと、アンモニアと、または、薬学的に許容される有機の一級、二級、もしくは三級アミンと別々に反応させることにより調製できる。代表的アルカリまたはアルカリ土類塩には、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、およびアルミニウム塩などが含まれる。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンには、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどが含まれる。
【００７９】
「薬学的に許容されるエステル」という用語は、比較的無毒性の、本発明のホスファチジン酸化合物のエステル化生成物を意味する。これらのエステルは、インサイチューで化合物の最終的な単離および精製の際に、または、その遊離酸形態の精製化合物またはヒドロキシルを、適切なエステル化剤と別々に反応させることにより調製できる。カルボン酸は、触媒の存在下でアルコールでの処理を介してエステルに変換できる。ヒドロキシルは、ハロゲン化アルカノイルなどのエステル化剤での処理を介してエステルに変換できる。この用語にはまた、生理的条件下で溶媒和できる低級炭化水素基、例えばアルキルエステル、メチル、エチルおよびプロピルエステルが含まれる。（例えばBergeら、前記を参照されたい）。好ましいエステル基は、アセトメトキシエステル基である。
【００８０】
薬学的組成物は、例えばアポトーシス関連疾患を治療するための投与説明書と共に、容器、パック、またはディスペンサーに含めることができる。
【００８１】
「アルキル」という用語には、直鎖アルキル基（例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなど）、分岐鎖アルキル基（イソプロピル、tert−ブチル、イソブチルなど）、シクロアルキル（脂環式）基（シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル）、アルキル置換シクロアルキル基、およびシクロアルキル置換アルキル基を含む、飽和脂肪族基が含まれる。アルキルという用語にはさらに、炭化水素骨格の1つまたはそれ以上の炭素を置換している酸素原子、窒素原子、硫黄原子、またはリン原子をさらに含むことのできる、アルキル基が含まれる。1つの態様において、直鎖または分岐鎖アルキルは、その骨格に10個またはそれ以下の炭素原子（例えば直鎖ではC1〜C10、分岐鎖ではC3〜C10）、より好ましくは6個またはそれ以下を有する。同様に、好ましいシクロアルキルは、その環構造に4〜7炭素原子を有し、より好ましくは環構造に5または6の炭素を有する。
【００８２】
さらに、アルキルという用語には、「非置換アルキル」および「置換アルキル」の両方が含まれ、その後者は、炭化水素骨格の1つまたはそれ以上の炭素上における水素を置換基が置換しているアルキル部分を意味する。このような置換基には、例えば、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル、およびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分が含まれ得る。シクロアルキルは、例えば前記の置換基でさらに置換できる。「アルキルアリール」または「アラルキル」部分は、アリールで置換されたアルキル（例えばフェニルメチル（ベンジル））である。「アルキル」という用語はまた、天然および非天然アミノ酸の側鎖を含む。ハロゲン化アルキル基の例には、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、ペルフルオロメチル、ペルクロロメチル、ペルフルオロエチル、ペルクロロエチルなどが含まれる。
【００８３】
「アリール」という用語には、0〜4個のヘテロ原子を含み得る5員環および6員環単環芳香族基を含む基、例えば、ベンゼン、フェニル、ピロール、フラン、チオフェン、チアゾール、イソチアゾール、イミダゾール、イミダゾリン、トリアゾール、テトラゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、およびピリミジンなどが含まれる。さらに、「アリール」という用語には、多環アリール基、例えば三環、二環、例えばナフタレン、ベンゾキサゾール、ベンゾジオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾイミダゾール、ベンゾチオフェン、メチレンジオキシフェニル、キノリン、イソキノリン、ナフトリジン（napthridine）、インドール、ベンゾフラン、プリン、ベンゾフラン、デアザプリン、イソインドール、インダン、またはインドリジンが含まれる。環構造にヘテロ原子を有するアリール基はまた、「アリールへテロ環」、「ヘテロ環」、「ヘテロアリール」、または「ヘテロ芳香族」とも称され得る。芳香族環は、1つまたはそれ以上の環位置において、前記の置換基で、例えばハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アラルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アラルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル、およびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分で置換できる。アリール基はまた、芳香族ではない脂環またはヘテロ環と縮合または架橋して多環（例えばテトラリン）を形成できる。
【００８４】
「アルケニル」という用語には、前記のアルキルに長さおよび置換の可能性がある点で類似しているが、少なくとも1つの二重結合を含む、不飽和脂肪族基が含まれる。
【００８５】
例えば、「アルケニル」という用語には、直鎖アルケニル基（例えばエテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニルなど）、分岐鎖アルケニル基、シクロアルケニル（脂環式）基（シクリプロペニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロオクテニル）、アルキルもしくはアルケニル置換シクロアルケニル基、およびシクロアルキルもしくはシクロアルケニル置換アルケニル基が含まれる。アルケニルという用語にはさらに、炭化水素骨格の1つまたはそれ以上の炭素を置換している酸素、窒素、硫黄、またはリン原子を含む、アルケニル基が含まれる。ある態様において、直鎖または分岐鎖アルケニル基は、その骨格に6個またはそれ以下の炭素原子を有する（直鎖ではC2〜C6、分岐鎖ではC3〜C6）。同様に、シクロアルケニル基は、その環構造に3〜8炭素原子を有し得、より好ましくは環構造に5または6の炭素を有し得る。C2〜C6という用語には、2〜6の炭素原子を含むアルケニル基が含まれる。
【００８６】
さらに、アルケニルという用語には、「非置換アルケニル」および「置換アルケニル」の両方が含まれ、その後者は、炭化水素骨格の1つまたはそれ以上の炭素上における水素を置換している置換基を有するアルケニル部分を意味する。このような置換基には、例えばアルキル基、アルキニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル、およびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分が含まれ得る。
【００８７】
「アルキニル」という用語には、前記のアルキルに長さおよび置換の可能性がある点で類似しているが、少なくとも1つの三重結合を含む、不飽和脂肪族基が含まれる。
【００８８】
例えば、「アルキニル」という用語には、直鎖アルキニル基（例えばエチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニルなど）、分岐鎖アルキニル基、およびシクロアルキルもしくはシクロアルケニル置換アルキニル基が含まれる。アルキニルという用語には、炭化水素骨格の1つまたはそれ以上の炭素を置換している酸素、窒素、硫黄、またはリン原子を含む、アルキニル基が含まれる。ある態様において、直鎖または分岐鎖アルキニル基は、その骨格に6個またはそれ以下の炭素原子を有する（直鎖ではC2〜C6、分岐鎖ではC3〜C6）。C2〜C6という用語には、2〜6個の炭素原子を含むアルキニル基が含まれる。
【００８９】
さらに、アルキニルという用語には、「非置換アルキニル」および「置換アルキニル」の両方が含まれ、その後者は、炭化水素骨格の1つまたはそれ以上の炭素上における水素を置換している置換基を有するアルキニル部分を意味する。このような置換基には、例えば、アルキル基、アルキニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル、およびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分が含まれ得る。
【００９０】
炭素数を特記しない限り、本明細書に使用したような「低級アルキル」は、前記に定義したような、しかし、その骨格構造に1〜5個の炭素原子を有するアルキル基を意味する。「低級アルケニル」および「低級アルキニル」は、例えば2〜5個の炭素原子の鎖長を有する。
【００９１】
当業者は、単に日常的な実験を用いて、本明細書に記載した特定の手順に対する多くの均等物を認識するか、または確認できると思われる。このような均等物は、本発明の範囲内と考えられ、特許請求の範囲により含まれる。
【００９２】
本発明はさらに、以下の実施例により説明され、これは制限するものとして捉えるべきではない。本出願中に引用した全ての参考文献、特許、および公開された特許出願ならびに図面は参照として本明細書に組み入れられる。
【００９３】
発明の例示
実施例1：NGFおよび血清の除去、セラミド、ロテノン、およびグルタミン酸により開始されるアポトーシスの減少
ホスホリパーゼD2（PLD2）は、ホスファチジルコリンを、ホスファチジン酸（PA）とコリンに変換する。グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）の上方制御は、いくつかの神経性アポトーシスに重要である。多重にトランスフェクトした細胞と初期アポトーシスの細胞の免疫共沈降により、PLD2およびGAPDHは、両方共に通常は細胞ゾルにあるが、これはアポトーシス細胞では核に濃く共局在することが示された。PAは、おそらく、セラミド活性化ホスファターゼによるプロテインキナーゼB（PKB／Akt）脱リン酸化を防ぐことにより、セラミドにより開始されるアポトーシスを減少させることが示された。GAPDH／PLD2結合はPAレベルを減少させ、ホスホイノシタール−3−キナーゼ（PI3K）誘導Aktリン酸化に対抗することにより、ニューロンをアポトーシスに脆弱にする可能性があると仮定された。濃度依存的に、2〜30μMのPAが、NGFおよび血清の除去、セラミド、ロテノン、またはグルタミン酸により開始されるアポトーシスを減少させたが、過酸化物またはアトラクチロシド（atractyloside）により開始されるアポトーシスは減少させなかった。PAは、ある形態のアポトーシスシグナル伝達において初期に起こるミトコンドリア膜電位放散を減少させ、ミトコンドリア膜透過性の増加を指示し得る。PI3Kの薬理学的阻害により、PAの抗アポトーシスおよびPAのミトコンドリア膜電位維持を減少させた。それ故、PAは、一部、Aktリン酸化と脱リン酸化の間のバランスを変化させることにより、セラミドアポトーシス以外のアポトーシスを減少できる。
【００９４】
NGF分化PC12細胞の培養
PC12細胞（ATCC、MD州マナッサス所在）を、10％ウマ血清、5％ウシ胎児血清、2mMのL−グルタミン、50単位／mlのペニシリン、および50μg／mlのストレプトマイシン（血清を含むMEM、M／S）（これらは全てライフ・テクノロジーズ（MD州ロックビル所在）から購入）を含む最小必須培地中で増殖した。細胞を、生存率の予測として無傷の核を計測するために24ウェルプレート（8×104細胞／ウェル）上で、エピフルオレッセンス顕微鏡またはレーザー共焦点走査顕微鏡（LCSM）を用いた画像法のためにポリ−L−リジン処理カバーガラス（1×104細胞／カバーガラス）で、またはタンパク質化学用の100mm皿（1×106細胞／プレート）で増殖した。細胞を、6日間、100ng／mlの7S NGF（アップステート・バイオテック、NY州レークプラシッド所在）を補充したM／S中で分化した。血清およびNGFを含むMEMは、M／S＋Nと略称する（培養および処理のさらなる詳細については（Tattonら、1994、J.Neurochemistry、63:1572-1575；Wadiaら、J.Neuroscience、1998、18:932-947；Carlileら、2000、Molecular Pharmacology、57:2-12）を参照されたい）。
【００９５】
NGF分化PC12細胞におけるアポトーシス開始
血清および NGF の除去：
血清およびNGFを含むMEM中で6日間インキュベートした後、細胞をハンクス平衡塩溶液（HBSS；ライフ・テクノロジーズ、MD州ロックビル所在）中で3回連続的に洗浄して、NGFおよび血清により由来する栄養剤を除去し、その後、対照用の血清およびNGFを含むMEMに、または、血清を含まないMEMに置き換えて、血清およびNGFの除去によるアポトーシスを誘導した。
【００９６】
C2 −セラミド、ロテノン、過酸化物、およびアトラクチロシドへの曝露：
血清およびNGFに6日間曝露した後、血清およびNGFを含むMEM中に維持した培養液を、対照である媒体（HBSS）、または2〜50μMまで濃度の変化するHBSS中のC2−セラミド、2〜50nMまで濃度の変化するHBSS中のロテノン、0.01〜0.25mMのH2O2まで濃度の変化するHBSS中のH2O2、または2〜20mMまで濃度の変化するHBSS中のアトラクチロシドで24時間処理した。
【００９７】
小脳顆粒ニューロンの培養
小脳顆粒ニューロンは、酵素的消化により生後7日目のラットの子から入手し、血清を補充したイーグル基礎培地中に維持した。生存細胞を、ポリ−L−リジンでコーティングした組織培養プラスチックまたはカバーガラス上に500,000細胞／mlの密度で播種した。シトシンアラビノシド（Ara−C）（10μM）を24時間後に加え、グリア増殖を停止した。小脳顆粒ニューロンにおいてアポトーシスを誘導するために、10− 4から10− 6Mのグルタミン酸を、培養液に7日目に加えた。
【００９８】
NGF分化PC12細胞および小脳顆粒ニューロンにおける生存の予測およびアポトーシスのレベル
細胞生存度およびアポトーシス核分解の証拠を示す細胞の比率の両方を、全ての処理について評価した。生存度を推定するために、細胞を、24ウェルプレートに8×104細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を処理の24時間後に収集し、溶解した。無傷な核を、血球計を使用して計測した（処理法および計測法の詳細については（Tattonら、1994、J.Neurochemistry、63:1572-1575；Wadiaら、J.Neuroscience、1998、18:932-947；Carlileら、2000、Molecular Pharmacology、57:2-12）を参照されたい）。
【００９９】
アポトーシスを受けた核を有する細胞の比率を、ポリ−L−リジンで処理したカバーガラス上で増殖した細胞について決定した（密度1×104／カバーガラス）。処理後の種々の時点で、細胞を、DNA結合色素のYOYO−1（Molecular Probes、OR州ユージーン）で染色し、アポトーシスを受けた核の分解のマーカーとしてのクロマチン凝縮を明らかにした（Tattonら、1994、J.Neurochemistry、63:1572-1575；Wadiaら、J.Neuroscience、1998、18:932-947；Carlileら、2000、Molecular Pharmacology、57:2-12を参照されたい）。カバーガラス上の細胞を、PBS中で3回洗浄し、その後、−20℃で30秒間100％メタノールでインキュベートした。その後、メタノールをYOYO−1（PBS中1.5μM）と30分間室温で置換した。3回PBSで洗浄した後、カバーガラス上の細胞をLCSM画像法のためにアクアマウントグール（Aquamount Gurr)（EM Industries、OH州シンシナティ所在）に積載した。クロマチンの凝集したYOYO−1染色核の総数を、各カバーガラスについて25の40倍率の視野で計測し、各視野は、対のランダムに作製したx−y座標により選択した。クロマチンの凝集した核の比率は、各視野における細胞の総数の比率として示した。数値は、各処理および時点について3つのカバーガラスについてプールした。
【０１００】
ミトコンドリア膜電位（ΨM）の測定
生細胞ΔΨ M 測定：
ポリリジンでコーティングしたカバーガラス上の細胞を、100nMのテトラメチルローダミンメチルエステル（TMRM、モレキュラープローブズ、ユージーン、OR）または10μg／mlのJC−1（モレキュラープローブズ、ユージーン、OR）と共にインキュベートし、ΔΨMの推定値を得た。カバーガラスを、ガスおよび温度の制御された循環生細胞チャンバー（Medial Systems Corps.、NY州グリーンベール）に移した。培地中に浸漬した熱電対は、培地温度を37±0.1℃に維持した。TMRM、JC−1、およびクロロメチルエテトラメチルロサミン（CMTMR、モレキュラー・プローブズ、ユージーン、OR）およびJC−1染色細胞は、色素添加の10分後に画像化し、画像を、約20分間の間3分毎に回収した。
【０１０１】
固定細胞ΔΨ M 測定
ポリ−L−リジンでコーティングされた12mmのカバーガラス上におけるNGF分化PC12細胞の処理後に、固定できる電位定量色素のCMTMRを、137nMで15分間37℃で加え、同時に免疫細胞化学を実施した。その後、細胞を、氷冷PB中4％パラホルムアルデヒドで一晩固定する前に、1回、温ダルベッコPBSで濯ぎ、水性封入媒体のアクアマウント（Gallard-Schlesinger Ind.、ニューヨーク州ガーデンシティ）を用いてスライド上に封入した。
【０１０２】
蛍光顕微鏡
画像は、アルゴン−クリプトンレーザーまたは標準的なepi-floresence顕微鏡に連結させたレイカ（Leica） TCS4D共焦点顕微鏡を使用して得た。画像は、焦点の深さを最小限にするために、油浸漬100×1.4N.A.対物レンズを使用して走査または画像化した。CMTMRおよびTMRM処理細胞は、568nmの励起を使用して画像化し、600／30nmのバンドパスフィルターで検出した。JC−1インキュベート細胞を、488nmの励起を使用して画像化し、別々の検出器により観察された530／30nmバンドパスおよび590nmの長いパスフィルターを使用して検出した。画像解像度は、1ピクセルあたり、512×512×8ビットであった。グレースケール画像はタグ付け画像ファイルフォーマットに保存し、ペンティウムIII PC作動ノーザンエクリプス5.0（Pentium III PC runnning Northern Eclipse 5.0）（Empix、Imaging Ltd.、オンタリオ州ミシサーガ）に移して、0〜255のグレーピクセルスケールに従って個々のミトコンドリア強度を測定した。ミトコンドリア電位定量色素蛍光の強度を測定するために、1実験あたり1処理あたり各50〜70個の細胞に由来する20〜40のミトコンドリアからのピクセル強度測定値は、各ミトコンドリア中の2点に3×3ピクセルを配置することにより得られた。蛍光強度値は、ミクロカルオリジン（MicroCal Origin)（MA州ノーサンプトン）でのその後の解析のためにエクセル表計算に自動的に転送した。対のJC−1画像のために、類似のボックスを、590nm画像上に前記のようなミトコンドリア上に配置した。一旦全てのボックスが配置されると、ボックスの分布のマスクを、対応する527nmの画像にコピーし、対の測定値を得た。
【０１０３】
ホスファチジン酸が生存を伸ばし、アポトーシスを減少させ、ミトコンドリア膜電位を維持する能力は、細胞生存度の指標として無傷核を計測し、細胞を、核酸結合色素のYOYO−1で染色することにより核クロマチン（DNA）の凝集した細胞の比率を決定し、それらを蛍光顕微鏡で画像化することによりミトコンドリア電位定量色素蛍光を測定することにより決定した。
【０１０４】
細胞生存度に関するこれらの測定値は、神経細胞死を誘導する種々の薬剤または損傷における具体的な濃度範囲を決定する手段として使用した。その後、生存度の低下がアポトーシスに起因するかどうかを決定した。生存度低下がアポトーシスの結果である場合、アポトーシスがミトコンドリアに関与しているかどうかを、ΔΨM測定によりおよび／またはカスパーゼ阻害剤によるカスパーゼにより決定した。
【０１０５】
ホスファチジン酸は、アポトーシス開始損傷がセラミド、ロテノン、血清およびNGFの除去、またはグルタミン酸であった場合に細胞生存度を増加することが示された。実験の結果を以下の表1に要約する。
【０１０６】
【表１】
【０１０７】
図2A、2B、および2Cは、種々の濃度のC2−セラミド（図2A）、ロテノン（図2B）、および過酸化物（図2C）に曝露した後、（2〜30μMの範囲）の濃度のホスファチジン酸で処理したNGF分化PC12細胞の生存度を示す。図2A、2B、および2Cは、ホスファチジン酸が、10mMの濃度でのC2−セラミド（図2A）およびロテノン（図2B）曝露後の生存度の延長においては効果的であるが、どの濃度のH2O2曝露後でも生存度を変化させない（図2C）ことを示す。ホスファチジン酸は、ロテノン誘導死において少なくともC2セラミド誘導死と同等に効果的である。これは意外である。なぜなら、ホスファチジン酸は、セラミド活性化ホスファターゼを阻害することにより生存度に対して作用するにすぎないと考えられていたからである。それ故、パーキンソン病および卒中を含む多くのアポトーシス依存的疾病への扉を開く。
【０１０８】
図3A、3B、および3Cは、ロテノン曝露（図3A）ならびに血清およびNGF除去（図3B）NGF分化PC12細胞においてホスファチジン酸により誘導される生存度延長を示す。図3A、3B、および3Cはまた、生存率がホスファチジン酸濃度に依存していることを示す。図2Aおよび2Bと同様に、図3Aおよび3Bは、ホスファチジン酸が、10mMで最も効果的であることを示す。図3Cは、ホスファチジン酸濃度を変更しても、細胞の約60％を死滅する0.1mM H2O2に曝露した後には、NGF分化PC12細胞生存度は実質的に延長されないことを示す。
【０１０９】
図4A、4B、4C、および4Dは、ホスファチジン酸が、セラミド（図4Aおよび4B）およびロテノン（図4Cおよび図4D）により開始される両方のアポトーシスにおけるミトコンドリア膜電位（ΔΨM）のアポトーシスに関連した減少を緩和することを示す。2つの異なるミトコンドリア電位定量色素のTMRMおよびCMTMRを研究に使用し、類似の結果を得た。図4Aおよび4Cは、TMRMを使用した結果を示し、図4Bおよび4Dは、色素CMTMRを使用した結果を示す（方法および解析の詳細については、Wadiaら、1998、J.Neuroscience 18:932-947を参照されたい）。所見により、ホスファチジン酸が、多くの形態のアポトーシスシグナル伝達の鍵であるミトコンドリア膜透過性の増加を減少させ、作用がセラミド開始アポトーシスに限定されないことが示唆される。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】いくつかの仮定されたアポトーシスおよび抗アポトーシスシグナル伝達経路の図面を示す。
【図２】C−2セラミド（図2A）、ロテノン（図2B）および過酸化物（図2C）に曝露した後の、ホスファチジン酸で処理したNGF分化PC12細胞（すなわち神経的に分化した細胞）の生存度を示すグラフである。
【図３】ホスファチジン酸で処理したNGF分化PC12細胞の生存度の増加を示す線グラフである。図3Aは、ロテノンに曝露した細胞における結果を示す。図3Bは、血清およびNGFの除去に関連したアポトーシスに対するホスファチジン酸濃度増加の結果を示す。図3Cは、過酸化物誘導アポトーシスに対するホスファチジン酸の影響を示す。
【図４】ホスファチジン酸が、セラミド（図4Aおよび4B）およびロテノン（図4Cおよび4D）により開始される両方のアポトーシスについて、ミトコンドリア膜透過性の増加のマーカーである、アポトーシスに関連したミトコンドリア膜電位（ΔΨM）の減少を減少させることを示す線グラフである。図4Aおよび4Cは、ミトコンドリア電位定量色素TMRMを使用することにより決定した。図4Bおよび4Dは、ミトコンドリア電位定量色素CMTMRを使用することにより得られた。
【０００１】
関連出願
本出願は、2001年8月30日に出願された「アポトーシスに関連した疾患を治療するための方法および組成物」と題した米国仮特許出願番号第60／316,327号、および、2001年8月20日に出願された「アポトーシスに関連した疾患を治療するための方法および組成物」と題した米国仮特許出願番号第60／313,840号の優先権を主張し、その両方の全内容は参照として本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
近年5年間の間、アポトーシスはヒト疾病と関係があるとされることが多くなってきている。アポトーシスにより最終的に多くの制御された分解現象が生じ、これにより膜に包まれた細胞断片が産生され、これは炎症反応を誘発することなく貪食される。分解現象は多くの形態のアポトーシスについて類似しており、核タンパク質のDNAからの再構成および剥ぎ取り、活性化エンドヌクレアーゼによる核DNAの消化、核DNAの縮合、細胞骨格の消化、およびアポトーシス体としばしば称される膜に包まれた細胞断片の形成が含まれる。
【０００３】
アポトーシスは、開始期、決定期、および分解期という3つの期または段階を含むものとして特徴づけることができる。各期には、主にタンパク質相互作用を含む一連のシグナル伝達事象が含まれるが、脂質部分、膜透過性の変化、イオン流入なども含まれる。カスパーゼと称されるシステインに富んだプロテアーゼが、多くの開始経路、決定経路、または分解経路に重要な役割を果たす。また、特異的分解経路を活性化する因子を結果として放出するミトコンドリア膜透過性の変化は、いくつかの形態のアポトーシスにおいて重要な決定的な現象をなす。他の形態のアポトーシスでは、ミトコンドリアは関与していない。
【０００４】
従って、アポトーシスは単一の過程ではない。むしろ、細胞分解に至る、多くの異なる、時には相互に連結したシグナル伝達経路を含むものとして可視化できる。特定の形態のアポトーシスに関与する経路は、過程を開始させる損傷または損傷群（例えば局所虚血、栄養不全など）などの多くの因子に依存している。他の因子には、特定の受容体の活性化または過剰活性化、例えば、腫瘍壊死因子α（TNFα）またはFASリガンドによる「死」受容体の活性化ならびにイオンチャネル型のグルタミン酸受容体（iGluR）の過剰活性化が含まれる。別の決定的な因子は、関与している細胞型である。なぜなら、TNFα受容体活性化後、いわゆるI型およびII型細胞に対して異なるシグナル伝達経路が示されているからである。
【０００５】
単純なレベルでは、BCLファミリーのタンパク質の2つのメンバーがミトコンドリア膜透過性を決定することを判明でき、それ故、ミトコンドリアの関与するような形態のアポトーシスにおいてアポトーシス分解のシグナル伝達を活性化する決定を決定することが判明した（総説についてはJacotot E.ら（1999）Ann N Y Acad Sci 887:18-30を参照されたい）。こうしたタンパク質は一般にBAXおよびBCL−2（またはその親類のBCL−XL）である。BAXは、ミトコンドリア膜を横断する膜巨大孔の開口を促進でき、また、ミトコンドリア膜における孔を直接形成し得る。どちらの作用もミトコンドリア膜透過性を増加でき、ミトコンドリア分解シグナル伝達因子の放出をもたらす。これに対し、BCL−2は巨大孔の開口を遅延し、また膜の孔の形成を妨げ得、これによりミトコンドリア膜不透過性を維持し、アポトーシス分解の確率を減少する。
【０００６】
非疾病状態では、アポトーシス促進シグナルとアポトーシス阻害シグナルのバランスをとる恒常性のレベルが存在する。アポトーシス促進シグナルが過剰であれば、生細胞は死滅し得る。例えば、パーキンソン病では、高レベルのp53およびFasリガンドが神経死に関連している（Tatton,N.Experimental Neurology 166:29）。以前に、Akt（そのリン酸化により細胞生存が促進できるキナーゼ）を脱リン酸化するセラミド活性化ホスファターゼを阻害することにより、ホスファチジン酸は、脂質部分セラミドにより誘導されるアポトーシスを減少し得ることが研究により示唆された（Chalfant CEら（1999）J Biol Chem 274:20313-20317；Kishikawa Kら（1999）J Biol Chem 274:21335-21341）。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
1つの態様において、本発明は、少なくとも一部には、本発明のホスファチジン酸化合物を使用してアポトーシスを調節する方法に関する。
【０００８】
別の態様において、本発明は、被験者におけるアポトーシスに関連した疾患を治療する方法に関する。この方法は、治療有効量の式（I）
R1およびR2は、各々独立的に、選択された鎖部分であり；
R3およびR4は、各々独立的に、水素であり、存在せず、またはプロドラッグ部分であり；
Lは、連結部分である）
で示されるホスファチジン酸化合物、およびその薬学的に許容される塩を投与することを含む。
【０００９】
さらなる態様において、本発明はまた、有効量の式（I）のホスファチジン酸化合物を投与することによる、細胞におけるアポトーシスをインビトロで調節する方法に関する。
【００１０】
さらなる態様において、本発明はまた、少なくとも一部には、被験者における神経変性疾患を治療する方法に関する。この方法は、被験者に、神経変性疾患が治療されるように、有効量の式（I）、（II）、または（III）のホスファチジン酸化合物を投与することを含む。
【００１１】
別の態様において、本発明はまた、被験者における眼疾患を治療する方法を含む。この方法は、被験者に、眼疾患が治療されるように、有効量の式（I）、（II）、または（III）のホスファチジン酸化合物を投与することを含む。さらなる態様において、眼疾患は緑内障である。
【００１２】
本発明はまた、少なくとも一部には、被験者に、有効量のホスファチジン酸化合物、例えば式（I）、（II）、または（III）の化合物を投与することによる、被験者におけるアポトーシスに関連した疾患を治療する方法に関する。
【００１３】
本発明はまた、少なくとも一部には、有効量のホスファチジン酸化合物（例えば式（I）、（II）、または（III）の化合物）および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物に関する。
【００１４】
さらに、本発明はまた、少なくとも一部には、パッケージングされた薬学的組成物に関する。パッケージングされた薬学的組成物は、式（I）のホスファチジン酸化合物、または薬学的に許容されるその塩、およびアポトーシス関連状態の治療における前記化合物の使用説明書を含む。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも一部には、ホスファチジン酸が、多くのヒト神経疾患のモデルとして使用される、損傷における抗アポトーシス剤であるという発見に基づく。さらに、また、ホスファチジン酸は、NGFおよび血清（栄養の除去）の突然の除去、ロテノン、およびグルタミン酸により誘導されるアポトーシスを減少させることが発見された。
【００１６】
アポトーシス研究が始まり、多くの特定の疾病状態においてアポトーシスに関与する独特な開始および決定のシグナル伝達経路が判明した。例えばパーキンソン病（PD）では、p53、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）、BAX、およびCsp3の関与するシグナル伝達経路は、疾病の根底にある神経消失の原因となっているようである（de la Monte SMら（1998）Lab Invest 78:401-411；Hartmann Aら（2000）PNAS 97:2875-2880；Tatton NA、(2000) Exp Neurol 166:29-43）。種々の疾病における特定のアポトーシスシグナル伝達要素の関与を決定する原理は、その要素によるシグナル伝達を妨害し、これにより正常細胞機能に対して望ましくない作用を奏功することなく特定のアポトーシス経路の進行を防止できる能力を有する薬理学的薬剤を開発できる可能性に関連する。図1は、多くのアポトーシスおよび抗アポトーシスシグナル伝達経路を要約する。
【００１７】
本発明のホスファチジン酸化合物は、既知の抗アポトーシス性プロパルギルアミン（AAP）とGAPDHの間の相互作用を研究することにより同定した（Boulton AA(1999)Mech Ageing Dev 111:201-209）。モノアミンオキシダーゼB（MAO−B）阻害剤である、（−）−デプレニルに構造的に類似したプロパルギルアミンは、MAO−B阻害とは独立的に、いくつかの形態のアポトーシスを減少できる能力を有する（Tatton WGら（1991）J Neurosc Res 30:666-627；Ansari KSら（1993）J Neurosci 13:4042-4053；Tatton WGら（1996）Neurol 47:S171-S183；Tatton WGら（1993）神経学的疾病におけるモノアミンオキシダーゼ阻害剤（Lieberman A編）ニューヨーク：Raven Press；Tatton WGら（1994）J Neurochem 63:1572-1575）。GAPDH上方制御は、いくつかの形態のアポトーシスシグナル伝達に必須であることが示され（総説については（Tatton WGら（2000）J Neural Transm Suppl 60:77-100）を参照されたい）、AAPはGAPDHに結合し、それを四量体形から二量体形に変換することが示された（Kragten Eら（1998）J Biol Chem 273:5821-5828；Carlile GWら（2000）Mol Pharmacol 57:2-12）。GAPDHの四量体形がアポトーシスシグナル伝達に必要であり得る。なぜなら、AAPにより誘導される二量体形はアポトーシスにシグナルを伝達することができないが、グルコースをピルビン酸に変換（糖分解）する能力は保持しているからである（Carlile GWら（2000）Mol Pharmacol 57:2-12）。
【００１８】
上方制御されたGAPDHは、アポトーシスを誘導し、ミトコンドリア膜透過性の増加のマーカーであるミトコンドリア膜電位（ΔΨM）を減少することが判明した。さらに、p53−GAPDH経路は、BCL−2の新規合成を減少させ、ミトコンドリアにおけるBAXのレベルを増加させることが判明し、これらは共にミトコンドリア膜透過性を増加させ得、ΔΨMを減少させ得、アポトーシス分解のシグナルを伝達するミトコンドリア因子の放出がもたらされ得る。AAPは、アポトーシスによるΔΨMの減少を防ぐことが判明し、これはBCL−2レベルを維持する能力に一致していることが示されている（Wadiaら（1998）J.Neuroscience 18(3):932-947；Tattonら、1996、Neurology、4:s171-183；Tatton WGら（1994）J Neurochem 63:1572-1575）。
【００１９】
免疫共沈降研究を実施して、どのタンパク質がGAPDHと結合するのかを決定した。同定された1つのタンパク質はホスホリパーゼD2（PLD2）であり、これは、スキーム1に示したように、ホスファチジルコリンをホスファチジン酸（PA）とコリンに変換する構成的に活性な酵素である。それ故、PLD2レベルは、ホスファチジン酸レベルを制御すると期待され得、従って、内因性抗アポトーシス経路を調節し得る。
【００２０】
1つの態様において、本発明は、少なくとも一部には、被験者におけるアポトーシスに関連した疾患を治療する方法に関する。この方法は、治療有効量の式（I）
R1およびR2は、各々独立的に、選択された鎖部分であり；
R3およびR4は、各々独立的に、水素であり、存在せず、またはプロドラッグ部分であり；
Lは、連結部分である）
で示されるホスファチジン酸化合物、および薬学的に許容されるその塩を投与することを含む。
【００２１】
「鎖部分」という用語は、1〜30個の共有結合的に連結した原子を含む原子の鎖を含む。原子は、ホスファチジン酸がその目的の機能を実施できる、例えばアポトーシスを調節することのできる、水素もしくは1つまたはそれ以上の置換基で置換されていてもよい。鎖部分は、その溶解度または細胞生存度を増強する置換基を含み得る。鎖部分の例には、酸素、硫黄、または窒素などのヘテロ原子を選択的に含む、炭素原子鎖が含まれるがこれに限定されない。別の態様において、鎖部分には、アルキル、アルケニル、アルキニル部分が含まれる。さらなる態様において、鎖部分は脂肪酸鎖である。
【００２２】
「脂肪酸鎖」という用語は、天然および非天然の脂肪酸のアルキル鎖、アルケニル鎖、アルキニル鎖を含む。鎖は、直鎖または分岐鎖であり得る。脂肪酸鎖は飽和または不飽和であり得る。飽和脂肪酸鎖の例には、ミリスチン酸鎖、パルミチン酸鎖、ステアリン酸鎖、アラキジン酸鎖、ベヘン酸鎖、リグノセリン酸鎖、またはセロチン酸鎖が含まれるがこれに限定されない。不飽和脂肪酸鎖の例には、パルミトレイン酸鎖、オレイン酸鎖、バクセン酸鎖、リノール酸鎖、またはアラキドン酸鎖が含まれるがこれに限定されない。
【００２３】
「連結部分」という用語は、ホスファチジン酸化合物がその目的の機能を実施できる、例えばアポトーシスを調節できるように、リン酸基（PO4 −）およびエステル基（−OC＝OR1および−OC＝OR2）を接続できる部分を含む。1つの態様において、連結部分は、アルキル、アルキニル、またはアルキニルである。別の態様において、連結部分は、その目的の機能を実施できるような置換基で置換されていてもよい。さらなる態様において、連結部分はアルキル、例えばn−ブチルである。
【００２４】
「プロドラッグ部分」という用語は、インビボで切断されて、活性化合物を生じ得る部分を含む。プロドラッグ部分は、インビボで酵素によりまたは他の機序により、ホスファチジン酸へと代謝され得る。プロドラッグおよびその使用の例は当技術分野で公知である（例えばBergeら（1977）「Pharmaceutical Salts」、J.Pharm.Sci.66:1-19を参照されたい）。プロドラッグは、インサイチューでホスファチジン酸化合物の最終的な単離および精製の際に、または、精製されたその遊離酸形のホスファチジン酸化合物を適切な誘導体化剤と別々に反応させることにより調製できる。プロドラッグ部分の例には、置換および非置換、分岐または非分岐の低級アルキルホスファチジン酸エステル部分（例えばエチルホスファチジン酸エステル、プロピルホスファチジン酸エステル、ブチルホスファチジン酸エステル、ペンチルホスファチジン酸エステル、シクロペンチルホスファチジン酸エステル、ヘキシルホスファチジン酸エステル、シクロヘキシルホスファチジン酸エステル）、低級アルケニルホスファチジン酸エステル、二低級アルキル−アミノ低級−アルキルホスファチジン酸エステル（例えばジメチルアミノエチルホスファチジン酸エステル）、アシルアミノ低級アルキルホスファチジン酸エステル、アシルオキシ低級アルキルホスファチジン酸エステル（例えばピバロイルオキシメチルホスファチジン酸エステル）、アリールホスファチジン酸エステル（フェニルホスファチジン酸エステル）、アリール−低級アルキルホスファチジン酸エステル（例えばベンジルホスファチジン酸エステル）、置換（例えばメチル、ハロ、またはメトキシ置換基で）アリールおよびアリール−低級アルキルホスファチジン酸エステルなどが含まれる。
【００２５】
さらなる態様において、ホスファチジン酸化合物は、式（II）
R1およびR2は、各々独立的に、選択された鎖部分である）
である。
【００２６】
さらに別のさらなる態様において、ホスファチジン酸化合物は、式（III）
R1およびR2は、各々独立的に、選択された鎖部分である）
である。
【００２７】
さらなる態様において、R1およびR2の各々は、脂肪酸鎖である。別のさらなる態様において、ホスファチジン酸化合物は、L−α−ホスファチジン酸（1,2−ジアシル−sn−グリセロール−3−リン酸）または薬学的に許容されるその塩である。
【００２８】
ホスファチジン酸化合物の製造は当技術分野で既知であり、Eibl,H.(1980)「 Chemistry and Physics of Lipids」26:405に記載されている。ホスファチジン酸化合物はまた、シグマ−アルドリッチ（Sigma-Aldrich）またはアバンティ ポーラー リピッズ（Avanti Polar Lipids）などの業者から入手し得る。さらに、ホスファチジン酸化合物は、植物供給源および動物供給源から精製してもよい。精製法はPattonら（1982）J.Lipid Res.23:190に記載されている。
【００２９】
「アポトーシスに関連した疾患」という用語は、アポトーシスにより引き起こされたまたは関連した疾病、容態、および疾患を含む。アポトーシスに関連した疾患は、アポトーシス速度の増強または増加（特定の被験者に望まれる速度と比べて）、またはアポトーシス速度の減少（これも特定の被験者に望まれる速度と比べて）に関連し得る。アポトーシスに関連した疾患の例には、眼疾患、神経変性疾患、骨疾患（例えば骨関節症）、ウイルス感染（例えばHIV）、臓器（例えば肺、心臓、肝臓、腎臓、皮膚、眼など）、組織または細胞移植、免疫抑制、変性肝容態、再灌流傷害疾患、筋肉減少（例えば筋ジストロフィー、悪液質）、梗塞、卒中、自己免疫疾患、炎症、筋腫、筋萎縮症、緑内障、全身免疫応答症候群、成人呼吸困難症候群、脳性マラリア、慢性肺炎、肺性サルコイドーシス、腸炎、火傷傷害、タンパク質消失増加により特徴づけられる疾患、慢性腎不全、虚血、および肥大疾患が含まれるがこれに限定されない。さらなる態様において、アポトーシス疾患のアポトーシスは、栄養不全経路、低酸素／虚血経路、ロテノン経路、グルタミン酸経路、および／またはセラミド経路に関連している。さらなる態様において、アポトーシス関連疾患は、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）に関連している。
【００３０】
「〜に関連する」という用語には、アポトーシスが調節されるような、特定の薬剤または経路の下流での、上流での、および直接的な相互作用が含まれる。例えば、特定の疾病はGAPDHに関連し得る。GAPDHに関連した疾病はGAPDHの濃度を変化させ得、従って、アポトーシスを調節し、被験者に悪影響を及ぼす可能性がある。GAPDH（例えばGAPDHの濃度）または他のGAPDH経路のメンバーを調節することにより治療できる疾患も含まれる。GAPDH経路のメンバーの例には、iGluR、JNK、c−JUN、p53、BCL−2、BCL−X、BAD、CREBなどが含まれる。GAPDHに関連したアポトーシス関連疾患の例には、神経変性疾患（例えばパーキンソン病、多発性硬化症、末梢神経障害など）、脳低酸素症、および眼疾患（例えば緑内障）が含まれるがこれに限定されない。
【００３１】
さらなる態様において、本発明は、栄養不全経路アポトーシスに関連したアポトーシス関連疾患の治療法に関する。栄養不全アポトーシスには、NGFおよび血清の突然の除去により引き起こされるアポトーシスが含まれる。栄養不全経路アポトーシスに関連した疾患の例には、神経変性疾患および緑内障が含まれる。調節され得る栄養不全経路に関連した薬剤の例には、例えば、SMアーゼ、セラミド、p53、GAPDH、BCL−2、BCL−X、p21、BAXなどが含まれるがこれに限定されない。
【００３２】
別の態様において、本発明は、アポトーシス関連疾患の治療法に関し、ここでのアポトーシス関連疾患は、セラミド経路アポトーシスに関連している。セラミド経路に関連したアポトーシス関連疾患の例には、神経変性疾患（例えばパーキンソン病）、免疫疾患（例えばHIV）、および網膜色素変性症が含まれるがこれに限定されない。さらなる態様において、本発明のアポトーシス関連疾患は、セラミド経路のみに関連したアポトーシス関連疾患を含まない。セラミド経路アポトーシスに関連した薬剤の例には、ホスファターゼ、Akt、p53、p21、GAPDH、BCL−2、BAX、およびBADが含まれるがこれに限定されない。
【００３３】
別の態様において、本発明は、ロテノン経路アポトーシスに関連したアポトーシス関連疾患に関する。ロテノンは、ミトコンドリア呼吸鎖複合体Iを阻害する。ロテノン経路アポトーシス関連疾患の例は、パーキンソン病である（Beterbetら2000、Nature Neuroscience、3、12、1301-1306）。
【００３４】
さらなる態様において、本発明は、グルタミン酸経路アポトーシスに関連したアポトーシス関連疾患に関する。グルタミン酸経路アポトーシスに関連したアポトーシス関連疾患の例には、神経細胞死に関連した疾患（例えば卒中）、筋萎縮性側策硬化症、および緑内障が含まれるがこれに限定されない。グルタミン酸経路アポトーシスに関連した薬剤の例には、iGluR、p53、GAPDH、BCL−2、BCL−X、およびBAXが含まれるがこれに限定されない。
【００３５】
「眼疾患」という用語には、緑内障、増殖性硝子体網膜症（PVR）、網膜剥離、角膜症、非滲出性年齢関連黄斑変性（乾燥型AMD）、滲出性（湿性）AMD、網膜症（例えば糖尿病性）、網膜色素変性症を含む遺伝性網膜変性（遺伝性および散発性の症例）、アッシャー症候群、白点眼底、スターガールト病、全身性の先天的な代謝異常による網膜変性（例えば、テイ・サックス病、ゴーシェ病、遺伝性毛細管拡張症）、球後視神経炎、レーベルの先天性黒内障、中心または分岐網膜動脈閉塞、中心または分岐静脈閉塞、光受容体変性（例えば、慢性黄斑浮腫に関連した変性、全身性薬物による中毒性網膜症、破裂性網膜剥離、非破裂性網膜剥離など）、角膜実質細胞消失（例えばLasikおよびPPKなどのエキシマレーザー角膜切除術に関連した消失）、結膜細胞の消失、涙腺細胞の消失（例えば、スティーヴンス・ジョンソン症候群、シェーグレン症候群、乾性角結膜炎、放射線療法などの重度のアレルギー反応による消失）、糖尿病性および非糖尿病性動眼神経麻痺における運動神経機能の消失、視野の消失（例えば虚血、腫瘍圧力、および後頭葉の視覚野、視放線、外側膝状体、視索、視交差、および／または視神経の放射能により誘発される傷害による消失）、および、アポトーシスに関連した眼の他の疾病もしくは疾患が含まれる。
【００３６】
さらなる態様において、本発明は、有効量の本発明のホスファチジン酸化合物を被験者に投与することによる、被験者における緑内障を治療する方法に関する。
【００３７】
さらなる態様において、ホスファチジン酸化合物は、アポトーシス関連疾患の既知の治療法と組合わせて投与する。
【００３８】
既知の治療法「〜と組合わせた」という用語は、ホスファチジン酸化合物および既知の治療法の同時投与または治療、最初にホスファチジン酸化合物、次に既知の治療法の投与または治療、および、最初に既知の治療法、次いで第二にホスファチジン酸化合物の投与または治療を含むものとする。特定のアポトーシス関連疾患を治療するための当技術分野で既知の治療的に有用な方法のいずれかを、本発明の方法に使用できる。
【００３９】
非滲出性の年齢に関連した黄斑変性（乾燥型AMD）を治療する既知の方法には、ルテインの投与および亜急性ダイオードレーザー処理が含まれる。滲出性（湿性型）AMDの既知の治療法には、レーザー光凝固および光力学治療が含まれる。例えば糖尿病性網膜症などの網膜症の既知の治療法には、経口血糖降下剤およびレーザー処理（例えば焦点および汎網膜性レーザー光凝固）が含まれる。網膜色素変性症（例えば遺伝性および散発性の両方の症例）、アッシャー症候群、白点眼底、およびスターガールト病などの遺伝性網膜変性の治療の例には、ビタミンAサプリメントの投与、および可能性として将来の遺伝子療法が含まれる。緑内障による視野減少などの視野減少を治療する既知の方法には、線維柱体形成術、虹彩切除術、虹彩切開術、ろ過手術、小柱網を通したまたはぶどう膜路を通した水の流出を増加させる薬物の投与、および、水生成を減少させる薬物の投与が含まれるがこれに限定されない。球後視神経炎を治療する既知の方法の例には、ステロイドの投与が含まれる。中心または分岐網膜動脈閉塞を治療する既知の方法には、抗凝固剤および血塊破壊薬の投与ならびにレーザー処理が含まれる。中心または分岐静脈閉塞は、類似の方法を使用して治療する。慢性黄斑浮腫に関連したものなどの光受容体変性は、一般に、ステロイドの投与により治療する。全身性薬物による中毒性網膜症の治療における、既知の治療法には、薬物の中止が含まれる。破裂性網膜剥離に関連した光受容体変性を治療する既知の方法の例には、剥離の修復が含まれる。非破裂性網膜剥離に関連した光受容体変性を治療する既知の方法には、滲出性剥離（例えば網膜下の新血管網による）の原因を排除することが含まれる。重度のアレルギー反応（例えばスティーヴンス・ジョンソン症候群）における結膜細胞の消失または涙腺細胞の消失を治療する方法は、アレルギー反応を引き起こす薬物の中止またはステロイドの投与が含まれる。虚血、腫瘍圧力、または後頭葉の視覚野、視放線、外側膝状体、視索、視交差、または視神経の放射能により誘発される傷害による消失を治療する既知の方法には、ステロイドまたは血塊破壊薬の投与、および、適切な場合には、腫瘍の除去が含まれる。
【００４０】
さらなる態様において、本発明は、被験者における眼疾患を治療するためのホスファチジン酸化合物の使用法に関する。この方法には、被験者に、有効量のホスファチジン酸化合物、例えば式（I）、（II）、または（III）の化合物を投与することが含まれる。さらなる態様において、この方法には、薬学的に許容される担体の同時投与が含まれる。別のさらなる態様において、被験者はヒト、例えば眼疾患に罹患しているまたは眼疾患に罹患するリスクのあるヒトである。
【００４１】
「神経変性疾患」または「神経変性疾病」という用語には、ニューロンもしくは神経細胞のアポトーシスもしくは変性に関連または関連し得る神経変性疾患および他の神経学的な疾患が含まれる。神経変性疾病の古典的な例には、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ピック病、および筋萎縮性側策硬化症が含まれる。ニューロンまたは神経細胞が変性する他の容態には、網膜色素変性症、小脳変性、進行性上核麻痺、ヤコブ・クロイツフェルト病、糖尿病性および中毒性腎症、外傷性神経損傷、AIDS脳炎、急性播種性脳脊髄炎、卒中、および加齢が含まれる。この用語にはまた、多発性硬化症のような容態も含まれ、ここでのニューロンは脱髄に続いて変性するようである。
【００４２】
さらなる態様において、本発明は、被験者における神経変性疾患を治療するためのホスファチジン酸化合物の使用法に関する。この方法には、被験者に、有効量のホスファチジン酸化合物、例えば式（I）、（II）、または（III）の化合物を投与することが含まれる。さらなる態様において、この方法には、薬学的に許容される担体の同時投与が含まれる。別のさらなる態様において、被験者は、ヒト、例えば神経変性疾患に罹患しているヒトまたは罹患するリスクのあるヒトである。
【００４３】
別の態様において、本発明は、有効量のホスファチジン酸化合物を疾患が治療されるように投与することにより、神経変性疾患を治療する方法に関する。使用し得るホスファチジン酸化合物の例には、式（I）、（II）および（III）の化合物が含まれる。別のさらなる態様において、本発明はまた、有効量のホスファチジン酸化合物（例えば式（I）、（II）、または（III）の化合物）を投与することによる、ニューロン、グリア細胞、オリゴデンドロサイト、シュワン細胞、および神経幹細胞におけるアポトーシスの調節法に関する。細胞は、被験者内または被験者の身体の外であり得る。本発明はまた、これらまたは他の神経細胞のアポトーシスに関連した疾患を治療する方法にも関する。
【００４４】
別の態様において、本発明は、1つまたはそれ以上のアポトーシス調節剤に関連した、アポトーシス関連状態を調節することに関する。アポトーシス調節剤の例は、図1に示した種であるが、アポトーシスの開始期、決定期、および変性期に関与している他の薬剤も含まれる。アポトーシス調節剤の例には、被験者において薬剤の濃度、活性または存在がアポトーシスを調節できる場合の薬剤が含まれる。
【００４５】
「アポトーシス調節剤」という用語には、アポトーシスの調節（例えば阻害、減少、増加、促進）に関与する薬剤が含まれる。アポトーシス調節剤の例には、Fas、TNF RI、DR1、DR2、DR3、DR4、DR5、DR6、FADD、およびRIPなどであるがこれに限定されない死ドメインを含むタンパク質が含まれる。アポトーシス調節剤の他の例には、TNFα、Fasリガンド、TRAIL、bcl−2、p53、BAX、BAD、Akt、CAD、PI3キナーゼ、PPI、およびカスパーゼタンパク質が含まれるがこれに限定されない。アポトーシス調節剤は、可溶性であっても、または膜に結合してもよい（例えば受容体またはリガンド）。
【００４６】
「骨疾患」という用語には、アポトーシスに関連またはアポトーシスにより影響を受ける骨の疾患が含まれる。1つの態様において、骨疾患には、骨形成増強に関連した疾患が含まれる。骨形成増強は、例えば、骨芽細胞がアポトーシスに侵入するのを阻害される場合に生じ得る。別の態様において、骨疾患は、骨形成速度の減少または低速に関連し得る。このような疾患の例には、骨折、骨粗鬆症、および骨関節炎が含まれるがこれに限定されない。
【００４７】
「再灌流傷害疾患」という用語には、低酸素症を引き起こす血流の減少、その後のこの領域への血液の再灌流に関連した疾患が含まれる。このような疾患の例には、動脈閉塞、心筋梗塞、脳梗塞、脊髄／頭部外傷、および凍瘡などが含まれるがこれに限定されない。アポトーシスは、罹患領域への血液の再灌流時に起こり得る。傷害は、例えば、心臓、脳、腎臓、肝臓、脾臓、肺、または精巣に生じ得る。1つの態様において、本発明は、有効量の本発明のホスファチジン酸化合物（例えば式（I）、（II）または（III）の化合物）を投与することにより、被験者における再灌流傷害を治療する方法に関する。さらなる態様において、本発明は、有効量の式（I）、（II）、または（III）の化合物を投与することによる、動脈閉塞、心筋梗塞、脳梗塞、脊髄／頭部外傷、または凍瘡を治療する方法に関する。
【００４８】
肝臓の変性容態もアポトーシス関連疾患として含まれる。アセトアミノフェン、コカイン、エタノール、肝炎、および内毒素は肝細胞においてアポトーシスを誘導することが示された。従って、1つの態様において、本発明は、有効量の本発明のホスファチジン酸化合物（例えば式（I）、（II）、または（III）の化合物）を投与することにより、肝臓変性症状を治療する方法に関する。別の態様において、本発明は、アポトーシスを減少するのに有効な量の本発明のホスファチジン酸化合物を投与することにより、肝臓変性容態を治療する方法に関する（例えば肝細胞、例えば肝実質細胞）。
【００４９】
アポトーシスに関連した筋肉疾患も、アポトーシス関連疾患として含まれる。このような疾患の例には、筋ジストロフィーなどが含まれるがこれに限定されない。1つの態様において、本発明は、有効量のホスファチジン酸化合物（例えば式（I）、（II）または（III）の化合物）を投与することにより、被験者の筋肉細胞におけるアポトーシスを調節（例えば減少または増加）する方法に関する。さらなる態様において、本発明は、筋肉細胞のアポトーシスを減少させるためにホスファチジン酸化合物を使用する方法に関する。筋肉細胞の減少に関連した疾患の例には、筋萎縮症、筋ジストロフィー、および悪液質が含まれる。
【００５０】
1つの態様において、本発明は、卒中、自己免疫疾患、炎症、筋腫、筋萎縮症、全身炎症応答症候群、成人呼吸困難症候群、脳性マラリア、慢性肺炎、肺サルコイドーシス、腸炎、火傷傷害、タンパク質減少の増加を伴う疾患、慢性腎不全、虚血、または肥大疾患を治療するために、アポトーシスを調節するホスファチジン酸化合物を使用する方法に関する。
【００５１】
別の態様において、本発明は、有効量の式（I）、（II）、または（III）のホスファチジン酸化合物を投与することによる、被験者における骨細胞のアポトーシスを減少することにより骨形成を増強する方法に関する。例えば、本発明のホスファチジン酸化合物を使用して、骨形成を増強して、骨折の再形成を促進することができるか、または、骨粗鬆症もしくは骨関節炎を治療することができる。
【００５２】
HIV、化学療法、放射能、または免疫抑制薬療法により引き起こされるような免疫抑制は、種々の細胞型においてアポトーシスを引き起こすことができる。例えば、化学療法は、消化管におけるアポトーシスを誘発することがある。1つの態様において、本発明は、有効量の本発明のホスファチジン酸化合物（例えば式（I）、（II）、または（III）の化合物）を投与することにより、免疫抑制剤により引き起こされるアポトーシスを調節するためにホスファチジン酸化合物を使用する方法に関する。免疫抑制を引き起こし得る薬剤の例には、HIV、化学療法、放射能、および免疫抑制薬療法が含まれるがこれに限定されない。
【００５３】
さらなる態様において、アポトーシス関連疾患はウイルス感染である。ウイルス感染は、感染細胞において、高レベルのアポトーシスを引き起こす場合がある。例えば、HIVウイルスはCD4＋T細胞において高レベルのアポトーシスを生じることがある（Thompson,C.(1995)Trends Cell Bio.5:27）。1つの態様において、本発明は、被験者に有効量のホスファチジン酸化合物（例えば式（I）、（II）、または（III）の化合物）を投与することにより、被験者におけるウイルス感染を処置する方法に関する。
【００５４】
別の態様において、本発明は、アポトーシスが減少するように、被験者に有効量の本発明のホスファチジン酸化合物（例えば式（I）、（II）、または（III）の化合物）を投与することにより、被験者におけるウイルス感染中の細胞のアポトーシスを減少させる方法に関する。さらなる態様において、ウイルス感染はレトロウイルス感染（例えばHIV）または免疫系のウイルス感染である。別の態様において、細胞はCD4＋T細胞である。
【００５５】
「被験者」という用語には、アポトーシス関連疾患に罹患することのできる生物、例えば、哺乳動物（例えば霊長類（例えばサル、ゴリラ、チンパンジー、好都合であるのはヒト）、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イルカ、フェレット、リス）、爬虫類、または魚類、およびそのトランスジェニック種が含まれる。1つの態様において、被験者は、アポトーシス関連疾患に罹患しているか、または罹患するリスクがある。被験者という用語は、アポトーシスが起こり得る生存している生物、例えば哺乳動物を含むものとする。この用語にはまた、前記生物に付着していてもしていなくてもよい、前記に考察した生物の一部が含まれる。例えば、この用語には、別のものに移植するためにある被験者から取り出しておいた臓器が含まれる。
【００５６】
「治療有効量」または「有効量」という用語には、アポトーシス関連疾患の治療において有効である化合物の量が含まれる。治療有効量は、既知の技術を使用することにより、類似の環境下で得られた結果を観察することにより、当業者のような、主治診断医により容易に決定され得る。
【００５７】
「治療した」、「治療している」、または「治療」という用語には、治療すべきアポトーシス関連疾患に関連したまたはこれにより引き起こされた少なくとも1つの症状の消失または軽減が含まれる。例えば、治療は、疾患の1つまたはそれ以上の症状の消失、または疾患の完全な根絶であり得る。
【００５８】
インビトロで培養した細胞はしばしば限界のある寿命を有する。インビトロで細胞のアポトーシスを制限することは、細胞の寿命を延長するのに有用であり得る。遺伝子操作された細胞系は、あるレベルのタンパク質産生後に培養液中で死滅することが多い。アポトーシスの阻害はこれらの細胞系の寿命を延長し得、より多くのタンパク質産生をもたらし得る。例えば、タンパク質が産生されるように遺伝子操作されたされた細胞系は、最終的に、あるレベルのタンパク質発現後に培養条件中で死滅する。従って、1つの態様において、本発明は、有効量の式（I）、（II）、または（III）の化合物を投与することにより、インビトロで細胞のアポトーシスを調節（例えば減少または増加）する方法に関する。さらなる態様において、本発明は、遺伝子操作された細胞におけるアポトーシスを調節するためにホスファチジン酸化合物を使用する方法に関する。
【００５９】
1つの態様において、本発明は、例えば移植のために、例えば臓器、組織および細胞などの生物学的試料を生体外で維持する方法に関する。この方法には、臓器、組織、または細胞が、例えばアポトーシスの阻害により維持されるように、試料を本発明のホスファチジン酸化合物と接触させることを含む。使用し得るホスファチジン酸化合物の例には、式（I）、（II）、または（III）の化合物が含まれる。移植前、移植中、および移植後に、多くの細胞がアポトーシスに入り得、これにより臓器移植の成功する可能性は下がる。1つの態様において、本発明は、宿主における移植中および移植後に、臓器における細胞のアポトーシス速度を調節、例えば減少する方法に関する。移植し得る臓器の例は、心臓、肺、腎臓、皮膚、肝臓などである。
【００６０】
「遺伝子操作された細胞」という用語には、特定のDNA分子、RNA分子、またはタンパク質の産生が推奨または促進される、細胞が含まれる。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞系を、タンパク質用のDNAおよび適切なプロモーターを含むDNA配列でトランスフェクトすることができる。プロモーターの誘導により、所望のタンパク質を産生することができる。
【００６１】
本発明のホスファチジン酸化合物は、任意のアポトーシス関連疾患に使用し得る。アポトーシスについての様々な試験法が存在する。これらの方法を使用して、どのような疾病状態または容態でアポトーシスが起こるかを決定できたり、または、本発明のホスファチジン酸化合物の効力を決定できる。アポトーシスを阻害するホスファチジン酸化合物の能力を評価する1つの方法は、ホスファチジン酸化合物の存在下および非存在下で、細胞にアポトーシスを誘導する（ロテノングルタミン酸、アクチノマイシンD、セラミド、またはTNFαなどの薬剤を用いて）ことが含まれる。
【００６２】
その後、アポトーシスは、当技術分野で既知の様々な技術により細胞死に関与し得る。例えば、DNAゲル電気泳動におけるDNAラダーを使用して、特徴的なDNA切断パターンを示すことができる（Hermanら（1994）Nucleic Acid Research 22:5506）。別の技術は、インサイチューでの切断DNAの末端標識（ISEL）である。アポトーシスはまた、YOYO−1のような蛍光DNA結合色素を使用することにより核クロマチン凝縮を実証することにより同定することができる。さらに、一般的または特定のカスパーゼ阻害剤を使用して、システインプロテアーゼ／カスパーゼ依存度を実証することができる。ミトコンドリア膜電位の減少はまた、指標としても研究でき、エピフルオレッセンス（epifluorescence）顕微鏡またはレーザー共焦点走査顕微鏡を用いたミトコンドリア電位定量色素蛍光画像を使用することにより可視化することができる。
【００６３】
本発明のホスファチジン酸化合物は、投与に適した薬学的組成物に取り込むことができる。このような組成物は、典型的には、ホスファチジン酸分子および薬学的に許容される担体を含む。本明細書に使用したような「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的投与に適合した、任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含むものとする。薬学的に活性な物質用のこのような媒体および薬剤の使用は当技術分野で公知である。任意の慣用的な媒体または薬剤が活性化合物と非適合性でない限り、組成物におけるその使用が考えられる。補助的活性化合物も、組成物に取り込むことができる。
【００６４】
本発明の薬学的組成物は、その目的の投与経路に適合性であるように製剤化される。投与経路の例には、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口、吸入、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与が含まれる。非経口、皮内、または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる：注射用水、食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミンテトラ酢酸；緩衝液、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩、および張度調整剤、例えば塩化ナトリウムもしくはデキストロース。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整できる。非経口製剤は、硝子またはプラスチック製の、アンプル、使い捨てシリンジ、または複数回投与用バイアルに封入することができる。
【００６５】
注射に使用するのに適した薬学的組成物には、無菌水溶液（水溶性の場合）もしくは分散液、および、無菌注射溶液もしくは分散液の即時調製用の無菌粉末が含まれる。静脈内投与においては、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、クレモフォアEL（Cremophor EL）（登録商標）（BASF、パーシッパニー、NJ）、またはリン酸緩衝食塩水（PBS）が含まれる。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易にシリンジが扱える程度に流動性であるべきである。製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から防腐されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持により、界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防御は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成することができる。多くの場合、組成物に、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムなどの等張化剤を含めることが好ましい。注射用組成物の吸収延長は、組成物に、吸収を遅延する薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによりもたらすことができる。
【００６６】
無菌注射溶液は、活性化合物（例えばホスファチジン酸化合物）を必要量、適切な溶媒に、必要であれば前記に列挙した成分の1つまたは組合せと共に取り込み、その後、滅菌ろ過することにより調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒体および前記に列挙したものからの必要な他の成分を含む無菌媒体に取り込むことにより調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、活性成分の粉末と、以前に滅菌ろ過したその溶液からの任意の追加の所望の成分が生じる。
【００６７】
経口組成物には、一般に、不活性希釈剤および食用担体が含まれる。それらはゼラチンカプセルに封入しても錠剤に圧縮してもよい。経口治療薬投与の目的では、活性化合物を賦形剤と共に取り込むことができ、錠剤、トローチ、またはカプセル剤の形で使用できる。経口組成物は、うがい薬として使用する流動担体を使用して調製でき、流動担体中の化合物は、口に適用し、うがいし、吐くまたは嚥下する。薬学的に適合性の結合剤および／またはアジュバント材料も、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチなどは、以下の成分のいずれか、または性質の類似した化合物を含むことができる：結合剤、例えば微結晶セルロース、トラガカントゴム、またはゼラチン；賦形剤、例えばデンプンまたは乳糖、崩壊剤、例えばアルギニン酸、プリモゲル、またはコーンスターチ；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムまたはステロート（Sterotes）；滑沢剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えばショ糖またはサッカリン；または、芳香剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ芳香。
【００６８】
吸入による投与では、化合物は、適切な噴射剤、例えば二酸化炭素などのガスを含む加圧容器またはディスペンサー、またはネブライザーからのエアゾールスプレーの形で送達される。
【００６９】
全身投与はまた、経粘膜または経皮手段により行なわれ得る。経粘膜または経皮投与では、浸透すべき障壁に適切な浸透剤を製剤に使用する。このような浸透剤は一般に当技術分野で既知であり、例えば、経粘膜投与では、洗浄剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻腔スプレーまたは坐剤の使用により達成できる。経皮投与では、活性化合物は、当技術分野で一般に既知のような、外用薬、軟膏、ゲル、またはクリームに製剤化される。
【００７０】
化合物はまた、坐剤（例えばココアバターおよび他のグリセリドなどの慣用的な坐剤基剤を用いて）または直腸送達用の停留浣腸の形で調製できる。
【００７１】
1つの態様において、ホスファチジン酸化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル封入された送達系を含む、徐放製剤などの、生体からの急速な消失から化合物を保護する担体を用いて調製する。生分解性で生体適合性のポリマー、例えば酢酸エチレンビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などを使用できる。このような製剤の調製法は、当業者には明らかであると思われる。材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals社から市販され入手できる。
【００７２】
リポソーム懸濁液（特定の抗原に対する抗体を用いて、特定の細胞に標的化したリポソームを含む）もまた、薬学的に許容される担体として使用できる。これらは、例えば米国特許第4,522,811号に記載のように、当業者に既知の方法に従って調製できる。脂質を用いた送達系は、疎水性薬物を送達できる利点を有する。疎水性薬物のための別の送達系は、米国特許第6,153,217号に記載のような、BioDelivery Sciences Internationalの共キレート送達系である。
【００７３】
フォトターゲット（PHOTOTARGET)（商標）システムに言及すると、網膜の脈管への薬物および／または診断的な画像化色素の光標的化送達は、本発明のホスファチジン酸化合物に関する可能性ある送達機序である。この方法は、薬物または色素を封入した人工リン脂質を含むリポソーム小胞の静脈内投与を含む。標的組織（網膜または脈絡叢血管）の光により送達される短くて強度の低いパルスによる加温により、リポソームが熱破壊され、循環中のリポソームから小さな塊の薬物または色素が放出される。光の強度だけでは、標的化組織または周辺組織に傷害を与えるには不十分である（例えば米国特許第6,248,727号；米国特許第6,140,314号；米国特許第5,935,942号；米国特許第4,891,043号を参照されたい）。
【００７４】
投与し易さおよび用量の均一性のために、単位投与形で経口または非経口組成物を製剤化することが有利である。本明細書に使用したような単位投与形は、治療する被験者の単位用量として適した物理的に別個の単位を意味し；各単位は、必要な薬学的担体と共に、所望の治療効果を生じるように計算された予め決定された量の活性化合物を含む。本発明の単位投与形の詳細は、活性化合物の独特な特徴および達成する具体的な治療効果、および個体の治療のためにこのような活性化合物を配合する技術分野に固有の限界により指示され、これに直接依存する。
【００７５】
このような化合物の毒性および治療効力は、例えばLD50（個体群の50％に致命的な用量）およびED50（個体群の50％において治療的に有効な用量）の決定のために、細胞培養液または実験動物における標準的な薬学的手順により決定できる。毒性作用と治療作用の間の用量比は治療係数であり、LD50／ED50比として表現できる。大きな治療係数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物も使用できるが、罹患していない細胞への傷害の可能性を最小限にし、これにより副作用を最小限にするために、このような化合物を罹患組織部位に標的化する送達系を設計するのに注意を払うべきである。
【００７６】
細胞培養アッセイ法および動物試験から得られたデータは、ヒトに使用する一連の用量を製剤化するのに使用できる。このような化合物の用量は、好ましくは、殆どまたは全く毒性を伴わないED50を含む一連の循環濃度内に存在する。用量は、使用する剤形および使用する投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。本発明の方法に使用する任意の化合物について、治療有効量は、最初に細胞培養アッセイ法から推定できる。細胞培養液中で決定したようなIC50（症状の最大の半分の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環中血漿中濃度範囲を達成する用量を、動物モデルで製剤化できる。このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定できる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定できる。
【００７７】
本発明のホスファチジン酸化合物は、薬学的投与に適した生物学的に適合した形でインビボで被験者に投与して、アポトーシスを調節、例えば阻害する。「インビボで投与に適した生物学的に適合した形」により、あらゆる毒性作用よりもタンパク質の治療作用の方が上回る、投与すべき分子形を意味する。本明細書に記載したような薬剤の投与は、治療有効量の薬剤のみまたは薬学的に許容される担体と組合わせたものを含む、任意の薬学的形態であり得る。
【００７８】
本発明のホスファチジン酸化合物は、1つまたはそれ以上の酸性官能基を含み得、従って、薬学的に許容される塩基と、薬学的に許容される塩を形成できる。これらの場合の「薬学的に許容される塩」という用語は、比較的無毒性の本発明の化合物の無機および有機塩基付加塩を含む。これらの塩は、インサイチューで化合物の最終的な単離および精製の際に、または、その遊離酸形態の精製化合物を、適切な塩基、例えば薬学的に許容される金属陽イオンの水酸化物、カーボネート、もしくはバイカーボネートと、アンモニアと、または、薬学的に許容される有機の一級、二級、もしくは三級アミンと別々に反応させることにより調製できる。代表的アルカリまたはアルカリ土類塩には、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、およびアルミニウム塩などが含まれる。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンには、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどが含まれる。
【００７９】
「薬学的に許容されるエステル」という用語は、比較的無毒性の、本発明のホスファチジン酸化合物のエステル化生成物を意味する。これらのエステルは、インサイチューで化合物の最終的な単離および精製の際に、または、その遊離酸形態の精製化合物またはヒドロキシルを、適切なエステル化剤と別々に反応させることにより調製できる。カルボン酸は、触媒の存在下でアルコールでの処理を介してエステルに変換できる。ヒドロキシルは、ハロゲン化アルカノイルなどのエステル化剤での処理を介してエステルに変換できる。この用語にはまた、生理的条件下で溶媒和できる低級炭化水素基、例えばアルキルエステル、メチル、エチルおよびプロピルエステルが含まれる。（例えばBergeら、前記を参照されたい）。好ましいエステル基は、アセトメトキシエステル基である。
【００８０】
薬学的組成物は、例えばアポトーシス関連疾患を治療するための投与説明書と共に、容器、パック、またはディスペンサーに含めることができる。
【００８１】
「アルキル」という用語には、直鎖アルキル基（例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなど）、分岐鎖アルキル基（イソプロピル、tert−ブチル、イソブチルなど）、シクロアルキル（脂環式）基（シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル）、アルキル置換シクロアルキル基、およびシクロアルキル置換アルキル基を含む、飽和脂肪族基が含まれる。アルキルという用語にはさらに、炭化水素骨格の1つまたはそれ以上の炭素を置換している酸素原子、窒素原子、硫黄原子、またはリン原子をさらに含むことのできる、アルキル基が含まれる。1つの態様において、直鎖または分岐鎖アルキルは、その骨格に10個またはそれ以下の炭素原子（例えば直鎖ではC1〜C10、分岐鎖ではC3〜C10）、より好ましくは6個またはそれ以下を有する。同様に、好ましいシクロアルキルは、その環構造に4〜7炭素原子を有し、より好ましくは環構造に5または6の炭素を有する。
【００８２】
さらに、アルキルという用語には、「非置換アルキル」および「置換アルキル」の両方が含まれ、その後者は、炭化水素骨格の1つまたはそれ以上の炭素上における水素を置換基が置換しているアルキル部分を意味する。このような置換基には、例えば、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル、およびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分が含まれ得る。シクロアルキルは、例えば前記の置換基でさらに置換できる。「アルキルアリール」または「アラルキル」部分は、アリールで置換されたアルキル（例えばフェニルメチル（ベンジル））である。「アルキル」という用語はまた、天然および非天然アミノ酸の側鎖を含む。ハロゲン化アルキル基の例には、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、ペルフルオロメチル、ペルクロロメチル、ペルフルオロエチル、ペルクロロエチルなどが含まれる。
【００８３】
「アリール」という用語には、0〜4個のヘテロ原子を含み得る5員環および6員環単環芳香族基を含む基、例えば、ベンゼン、フェニル、ピロール、フラン、チオフェン、チアゾール、イソチアゾール、イミダゾール、イミダゾリン、トリアゾール、テトラゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、およびピリミジンなどが含まれる。さらに、「アリール」という用語には、多環アリール基、例えば三環、二環、例えばナフタレン、ベンゾキサゾール、ベンゾジオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾイミダゾール、ベンゾチオフェン、メチレンジオキシフェニル、キノリン、イソキノリン、ナフトリジン（napthridine）、インドール、ベンゾフラン、プリン、ベンゾフラン、デアザプリン、イソインドール、インダン、またはインドリジンが含まれる。環構造にヘテロ原子を有するアリール基はまた、「アリールへテロ環」、「ヘテロ環」、「ヘテロアリール」、または「ヘテロ芳香族」とも称され得る。芳香族環は、1つまたはそれ以上の環位置において、前記の置換基で、例えばハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アラルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アラルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル、およびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分で置換できる。アリール基はまた、芳香族ではない脂環またはヘテロ環と縮合または架橋して多環（例えばテトラリン）を形成できる。
【００８４】
「アルケニル」という用語には、前記のアルキルに長さおよび置換の可能性がある点で類似しているが、少なくとも1つの二重結合を含む、不飽和脂肪族基が含まれる。
【００８５】
例えば、「アルケニル」という用語には、直鎖アルケニル基（例えばエテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニルなど）、分岐鎖アルケニル基、シクロアルケニル（脂環式）基（シクリプロペニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロオクテニル）、アルキルもしくはアルケニル置換シクロアルケニル基、およびシクロアルキルもしくはシクロアルケニル置換アルケニル基が含まれる。アルケニルという用語にはさらに、炭化水素骨格の1つまたはそれ以上の炭素を置換している酸素、窒素、硫黄、またはリン原子を含む、アルケニル基が含まれる。ある態様において、直鎖または分岐鎖アルケニル基は、その骨格に6個またはそれ以下の炭素原子を有する（直鎖ではC2〜C6、分岐鎖ではC3〜C6）。同様に、シクロアルケニル基は、その環構造に3〜8炭素原子を有し得、より好ましくは環構造に5または6の炭素を有し得る。C2〜C6という用語には、2〜6の炭素原子を含むアルケニル基が含まれる。
【００８６】
さらに、アルケニルという用語には、「非置換アルケニル」および「置換アルケニル」の両方が含まれ、その後者は、炭化水素骨格の1つまたはそれ以上の炭素上における水素を置換している置換基を有するアルケニル部分を意味する。このような置換基には、例えばアルキル基、アルキニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル、およびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分が含まれ得る。
【００８７】
「アルキニル」という用語には、前記のアルキルに長さおよび置換の可能性がある点で類似しているが、少なくとも1つの三重結合を含む、不飽和脂肪族基が含まれる。
【００８８】
例えば、「アルキニル」という用語には、直鎖アルキニル基（例えばエチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニルなど）、分岐鎖アルキニル基、およびシクロアルキルもしくはシクロアルケニル置換アルキニル基が含まれる。アルキニルという用語には、炭化水素骨格の1つまたはそれ以上の炭素を置換している酸素、窒素、硫黄、またはリン原子を含む、アルキニル基が含まれる。ある態様において、直鎖または分岐鎖アルキニル基は、その骨格に6個またはそれ以下の炭素原子を有する（直鎖ではC2〜C6、分岐鎖ではC3〜C6）。C2〜C6という用語には、2〜6個の炭素原子を含むアルキニル基が含まれる。
【００８９】
さらに、アルキニルという用語には、「非置換アルキニル」および「置換アルキニル」の両方が含まれ、その後者は、炭化水素骨格の1つまたはそれ以上の炭素上における水素を置換している置換基を有するアルキニル部分を意味する。このような置換基には、例えば、アルキル基、アルキニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル、およびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分が含まれ得る。
【００９０】
炭素数を特記しない限り、本明細書に使用したような「低級アルキル」は、前記に定義したような、しかし、その骨格構造に1〜5個の炭素原子を有するアルキル基を意味する。「低級アルケニル」および「低級アルキニル」は、例えば2〜5個の炭素原子の鎖長を有する。
【００９１】
当業者は、単に日常的な実験を用いて、本明細書に記載した特定の手順に対する多くの均等物を認識するか、または確認できると思われる。このような均等物は、本発明の範囲内と考えられ、特許請求の範囲により含まれる。
【００９２】
本発明はさらに、以下の実施例により説明され、これは制限するものとして捉えるべきではない。本出願中に引用した全ての参考文献、特許、および公開された特許出願ならびに図面は参照として本明細書に組み入れられる。
【００９３】
発明の例示
実施例1：NGFおよび血清の除去、セラミド、ロテノン、およびグルタミン酸により開始されるアポトーシスの減少
ホスホリパーゼD2（PLD2）は、ホスファチジルコリンを、ホスファチジン酸（PA）とコリンに変換する。グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）の上方制御は、いくつかの神経性アポトーシスに重要である。多重にトランスフェクトした細胞と初期アポトーシスの細胞の免疫共沈降により、PLD2およびGAPDHは、両方共に通常は細胞ゾルにあるが、これはアポトーシス細胞では核に濃く共局在することが示された。PAは、おそらく、セラミド活性化ホスファターゼによるプロテインキナーゼB（PKB／Akt）脱リン酸化を防ぐことにより、セラミドにより開始されるアポトーシスを減少させることが示された。GAPDH／PLD2結合はPAレベルを減少させ、ホスホイノシタール−3−キナーゼ（PI3K）誘導Aktリン酸化に対抗することにより、ニューロンをアポトーシスに脆弱にする可能性があると仮定された。濃度依存的に、2〜30μMのPAが、NGFおよび血清の除去、セラミド、ロテノン、またはグルタミン酸により開始されるアポトーシスを減少させたが、過酸化物またはアトラクチロシド（atractyloside）により開始されるアポトーシスは減少させなかった。PAは、ある形態のアポトーシスシグナル伝達において初期に起こるミトコンドリア膜電位放散を減少させ、ミトコンドリア膜透過性の増加を指示し得る。PI3Kの薬理学的阻害により、PAの抗アポトーシスおよびPAのミトコンドリア膜電位維持を減少させた。それ故、PAは、一部、Aktリン酸化と脱リン酸化の間のバランスを変化させることにより、セラミドアポトーシス以外のアポトーシスを減少できる。
【００９４】
NGF分化PC12細胞の培養
PC12細胞（ATCC、MD州マナッサス所在）を、10％ウマ血清、5％ウシ胎児血清、2mMのL−グルタミン、50単位／mlのペニシリン、および50μg／mlのストレプトマイシン（血清を含むMEM、M／S）（これらは全てライフ・テクノロジーズ（MD州ロックビル所在）から購入）を含む最小必須培地中で増殖した。細胞を、生存率の予測として無傷の核を計測するために24ウェルプレート（8×104細胞／ウェル）上で、エピフルオレッセンス顕微鏡またはレーザー共焦点走査顕微鏡（LCSM）を用いた画像法のためにポリ−L−リジン処理カバーガラス（1×104細胞／カバーガラス）で、またはタンパク質化学用の100mm皿（1×106細胞／プレート）で増殖した。細胞を、6日間、100ng／mlの7S NGF（アップステート・バイオテック、NY州レークプラシッド所在）を補充したM／S中で分化した。血清およびNGFを含むMEMは、M／S＋Nと略称する（培養および処理のさらなる詳細については（Tattonら、1994、J.Neurochemistry、63:1572-1575；Wadiaら、J.Neuroscience、1998、18:932-947；Carlileら、2000、Molecular Pharmacology、57:2-12）を参照されたい）。
【００９５】
NGF分化PC12細胞におけるアポトーシス開始
血清および NGF の除去：
血清およびNGFを含むMEM中で6日間インキュベートした後、細胞をハンクス平衡塩溶液（HBSS；ライフ・テクノロジーズ、MD州ロックビル所在）中で3回連続的に洗浄して、NGFおよび血清により由来する栄養剤を除去し、その後、対照用の血清およびNGFを含むMEMに、または、血清を含まないMEMに置き換えて、血清およびNGFの除去によるアポトーシスを誘導した。
【００９６】
C2 −セラミド、ロテノン、過酸化物、およびアトラクチロシドへの曝露：
血清およびNGFに6日間曝露した後、血清およびNGFを含むMEM中に維持した培養液を、対照である媒体（HBSS）、または2〜50μMまで濃度の変化するHBSS中のC2−セラミド、2〜50nMまで濃度の変化するHBSS中のロテノン、0.01〜0.25mMのH2O2まで濃度の変化するHBSS中のH2O2、または2〜20mMまで濃度の変化するHBSS中のアトラクチロシドで24時間処理した。
【００９７】
小脳顆粒ニューロンの培養
小脳顆粒ニューロンは、酵素的消化により生後7日目のラットの子から入手し、血清を補充したイーグル基礎培地中に維持した。生存細胞を、ポリ−L−リジンでコーティングした組織培養プラスチックまたはカバーガラス上に500,000細胞／mlの密度で播種した。シトシンアラビノシド（Ara−C）（10μM）を24時間後に加え、グリア増殖を停止した。小脳顆粒ニューロンにおいてアポトーシスを誘導するために、10− 4から10− 6Mのグルタミン酸を、培養液に7日目に加えた。
【００９８】
NGF分化PC12細胞および小脳顆粒ニューロンにおける生存の予測およびアポトーシスのレベル
細胞生存度およびアポトーシス核分解の証拠を示す細胞の比率の両方を、全ての処理について評価した。生存度を推定するために、細胞を、24ウェルプレートに8×104細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を処理の24時間後に収集し、溶解した。無傷な核を、血球計を使用して計測した（処理法および計測法の詳細については（Tattonら、1994、J.Neurochemistry、63:1572-1575；Wadiaら、J.Neuroscience、1998、18:932-947；Carlileら、2000、Molecular Pharmacology、57:2-12）を参照されたい）。
【００９９】
アポトーシスを受けた核を有する細胞の比率を、ポリ−L−リジンで処理したカバーガラス上で増殖した細胞について決定した（密度1×104／カバーガラス）。処理後の種々の時点で、細胞を、DNA結合色素のYOYO−1（Molecular Probes、OR州ユージーン）で染色し、アポトーシスを受けた核の分解のマーカーとしてのクロマチン凝縮を明らかにした（Tattonら、1994、J.Neurochemistry、63:1572-1575；Wadiaら、J.Neuroscience、1998、18:932-947；Carlileら、2000、Molecular Pharmacology、57:2-12を参照されたい）。カバーガラス上の細胞を、PBS中で3回洗浄し、その後、−20℃で30秒間100％メタノールでインキュベートした。その後、メタノールをYOYO−1（PBS中1.5μM）と30分間室温で置換した。3回PBSで洗浄した後、カバーガラス上の細胞をLCSM画像法のためにアクアマウントグール（Aquamount Gurr)（EM Industries、OH州シンシナティ所在）に積載した。クロマチンの凝集したYOYO−1染色核の総数を、各カバーガラスについて25の40倍率の視野で計測し、各視野は、対のランダムに作製したx−y座標により選択した。クロマチンの凝集した核の比率は、各視野における細胞の総数の比率として示した。数値は、各処理および時点について3つのカバーガラスについてプールした。
【０１００】
ミトコンドリア膜電位（ΨM）の測定
生細胞ΔΨ M 測定：
ポリリジンでコーティングしたカバーガラス上の細胞を、100nMのテトラメチルローダミンメチルエステル（TMRM、モレキュラープローブズ、ユージーン、OR）または10μg／mlのJC−1（モレキュラープローブズ、ユージーン、OR）と共にインキュベートし、ΔΨMの推定値を得た。カバーガラスを、ガスおよび温度の制御された循環生細胞チャンバー（Medial Systems Corps.、NY州グリーンベール）に移した。培地中に浸漬した熱電対は、培地温度を37±0.1℃に維持した。TMRM、JC−1、およびクロロメチルエテトラメチルロサミン（CMTMR、モレキュラー・プローブズ、ユージーン、OR）およびJC−1染色細胞は、色素添加の10分後に画像化し、画像を、約20分間の間3分毎に回収した。
【０１０１】
固定細胞ΔΨ M 測定
ポリ−L−リジンでコーティングされた12mmのカバーガラス上におけるNGF分化PC12細胞の処理後に、固定できる電位定量色素のCMTMRを、137nMで15分間37℃で加え、同時に免疫細胞化学を実施した。その後、細胞を、氷冷PB中4％パラホルムアルデヒドで一晩固定する前に、1回、温ダルベッコPBSで濯ぎ、水性封入媒体のアクアマウント（Gallard-Schlesinger Ind.、ニューヨーク州ガーデンシティ）を用いてスライド上に封入した。
【０１０２】
蛍光顕微鏡
画像は、アルゴン−クリプトンレーザーまたは標準的なepi-floresence顕微鏡に連結させたレイカ（Leica） TCS4D共焦点顕微鏡を使用して得た。画像は、焦点の深さを最小限にするために、油浸漬100×1.4N.A.対物レンズを使用して走査または画像化した。CMTMRおよびTMRM処理細胞は、568nmの励起を使用して画像化し、600／30nmのバンドパスフィルターで検出した。JC−1インキュベート細胞を、488nmの励起を使用して画像化し、別々の検出器により観察された530／30nmバンドパスおよび590nmの長いパスフィルターを使用して検出した。画像解像度は、1ピクセルあたり、512×512×8ビットであった。グレースケール画像はタグ付け画像ファイルフォーマットに保存し、ペンティウムIII PC作動ノーザンエクリプス5.0（Pentium III PC runnning Northern Eclipse 5.0）（Empix、Imaging Ltd.、オンタリオ州ミシサーガ）に移して、0〜255のグレーピクセルスケールに従って個々のミトコンドリア強度を測定した。ミトコンドリア電位定量色素蛍光の強度を測定するために、1実験あたり1処理あたり各50〜70個の細胞に由来する20〜40のミトコンドリアからのピクセル強度測定値は、各ミトコンドリア中の2点に3×3ピクセルを配置することにより得られた。蛍光強度値は、ミクロカルオリジン（MicroCal Origin)（MA州ノーサンプトン）でのその後の解析のためにエクセル表計算に自動的に転送した。対のJC−1画像のために、類似のボックスを、590nm画像上に前記のようなミトコンドリア上に配置した。一旦全てのボックスが配置されると、ボックスの分布のマスクを、対応する527nmの画像にコピーし、対の測定値を得た。
【０１０３】
ホスファチジン酸が生存を伸ばし、アポトーシスを減少させ、ミトコンドリア膜電位を維持する能力は、細胞生存度の指標として無傷核を計測し、細胞を、核酸結合色素のYOYO−1で染色することにより核クロマチン（DNA）の凝集した細胞の比率を決定し、それらを蛍光顕微鏡で画像化することによりミトコンドリア電位定量色素蛍光を測定することにより決定した。
【０１０４】
細胞生存度に関するこれらの測定値は、神経細胞死を誘導する種々の薬剤または損傷における具体的な濃度範囲を決定する手段として使用した。その後、生存度の低下がアポトーシスに起因するかどうかを決定した。生存度低下がアポトーシスの結果である場合、アポトーシスがミトコンドリアに関与しているかどうかを、ΔΨM測定によりおよび／またはカスパーゼ阻害剤によるカスパーゼにより決定した。
【０１０５】
ホスファチジン酸は、アポトーシス開始損傷がセラミド、ロテノン、血清およびNGFの除去、またはグルタミン酸であった場合に細胞生存度を増加することが示された。実験の結果を以下の表1に要約する。
【０１０６】
【表１】
図2A、2B、および2Cは、種々の濃度のC2−セラミド（図2A）、ロテノン（図2B）、および過酸化物（図2C）に曝露した後、（2〜30μMの範囲）の濃度のホスファチジン酸で処理したNGF分化PC12細胞の生存度を示す。図2A、2B、および2Cは、ホスファチジン酸が、10mMの濃度でのC2−セラミド（図2A）およびロテノン（図2B）曝露後の生存度の延長においては効果的であるが、どの濃度のH2O2曝露後でも生存度を変化させない（図2C）ことを示す。ホスファチジン酸は、ロテノン誘導死において少なくともC2セラミド誘導死と同等に効果的である。これは意外である。なぜなら、ホスファチジン酸は、セラミド活性化ホスファターゼを阻害することにより生存度に対して作用するにすぎないと考えられていたからである。それ故、パーキンソン病および卒中を含む多くのアポトーシス依存的疾病への扉を開く。
【０１０８】
図3A、3B、および3Cは、ロテノン曝露（図3A）ならびに血清およびNGF除去（図3B）NGF分化PC12細胞においてホスファチジン酸により誘導される生存度延長を示す。図3A、3B、および3Cはまた、生存率がホスファチジン酸濃度に依存していることを示す。図2Aおよび2Bと同様に、図3Aおよび3Bは、ホスファチジン酸が、10mMで最も効果的であることを示す。図3Cは、ホスファチジン酸濃度を変更しても、細胞の約60％を死滅する0.1mM H2O2に曝露した後には、NGF分化PC12細胞生存度は実質的に延長されないことを示す。
【０１０９】
図4A、4B、4C、および4Dは、ホスファチジン酸が、セラミド（図4Aおよび4B）およびロテノン（図4Cおよび図4D）により開始される両方のアポトーシスにおけるミトコンドリア膜電位（ΔΨM）のアポトーシスに関連した減少を緩和することを示す。2つの異なるミトコンドリア電位定量色素のTMRMおよびCMTMRを研究に使用し、類似の結果を得た。図4Aおよび4Cは、TMRMを使用した結果を示し、図4Bおよび4Dは、色素CMTMRを使用した結果を示す（方法および解析の詳細については、Wadiaら、1998、J.Neuroscience 18:932-947を参照されたい）。所見により、ホスファチジン酸が、多くの形態のアポトーシスシグナル伝達の鍵であるミトコンドリア膜透過性の増加を減少させ、作用がセラミド開始アポトーシスに限定されないことが示唆される。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】いくつかの仮定されたアポトーシスおよび抗アポトーシスシグナル伝達経路の図面を示す。
【図２】C−2セラミド（図2A）、ロテノン（図2B）および過酸化物（図2C）に曝露した後の、ホスファチジン酸で処理したNGF分化PC12細胞（すなわち神経的に分化した細胞）の生存度を示すグラフである。
【図３】ホスファチジン酸で処理したNGF分化PC12細胞の生存度の増加を示す線グラフである。図3Aは、ロテノンに曝露した細胞における結果を示す。図3Bは、血清およびNGFの除去に関連したアポトーシスに対するホスファチジン酸濃度増加の結果を示す。図3Cは、過酸化物誘導アポトーシスに対するホスファチジン酸の影響を示す。
【図４】ホスファチジン酸が、セラミド（図4Aおよび4B）およびロテノン（図4Cおよび4D）により開始される両方のアポトーシスについて、ミトコンドリア膜透過性の増加のマーカーである、アポトーシスに関連したミトコンドリア膜電位（ΔΨM）の減少を減少させることを示す線グラフである。図4Aおよび4Cは、ミトコンドリア電位定量色素TMRMを使用することにより決定した。図4Bおよび4Dは、ミトコンドリア電位定量色素CMTMRを使用することにより得られた。
Claims (80)
- 被験者におけるアポトーシスに関連した疾患を治療する方法であって、アポトーシスに関連した疾患が治療されるように、治療有効量のホスファチジン酸化合物を投与することを含み、ホスファチジン酸化合物が、下記の式（I）
（式中、
R1およびR2が、各々独立的に、選択された鎖部分であり；
R3およびR4が、各々独立的に、水素であり、存在せず、またはプロドラッグ部分であり；
Lが、連結部分である）
および薬学的に許容されるその塩である、前記方法。 - ホスファチジン酸化合物が、下記の式（II）
である、請求項1記載の方法。 - ホスファチジン酸が、下記の式（III）
である、請求項2記載の方法。 - R1が6〜20原子の鎖である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- R1が脂肪酸鎖である、請求項4記載の方法。
- R1が飽和している、請求項5記載の方法。
- R1がミリスチン酸鎖、パルミチン酸鎖、ステアリン酸鎖、アラキドン酸鎖、ベヘン酸鎖、リグノセリン酸鎖、またはセロチン酸鎖である、請求項6記載の方法。
- R1が不飽和である、請求項5記載の方法。
- R1が、パルミトレイン酸鎖、オレイン酸鎖、バクセン酸鎖、リノール酸鎖、またはアラキドン酸鎖である、請求項8記載の方法。
- R2が、6〜20原子の鎖である、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
- R2が脂肪酸鎖である、請求項10記載の方法。
- R2が飽和している、請求項11記載の方法。
- R2が、ミリスチン酸鎖、パルミチン酸鎖、ステアリン酸鎖、アラキン酸鎖、ベヘン酸鎖、リグノセリン酸鎖、またはセロチン酸鎖である、請求項12記載の方法。
- R2が不飽和である、請求項11記載の方法。
- R2が、パルミトレイン酸鎖、オレイン酸鎖、バクセン酸鎖、リノール酸鎖、またはアラキドン酸鎖である、請求項14記載の方法。
- アポトーシスに関連した疾患がGAPDHに関連している、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
- アポトーシスに関連した疾患が、栄養不全経路アポトーシスに関連している、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
- アポトーシスに関連した疾患が神経変性疾患または緑内障である、請求項17記載の方法。
- アポトーシスに関連した疾患が、セラミド経路アポトーシスに関連している、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
- アポトーシスに関連した疾患が、神経変性疾患、免疫疾患、または網膜色素変性症である、請求項19記載の方法。
- アポトーシスに関連した疾患がパーキンソン病である、請求項20記載の方法。
- アポトーシスに関連した疾患がロテノン経路アポトーシスに関連している、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- アポトーシスに関連した疾患がパーキンソン病である、請求項22記載の方法。
- アポトーシスに関連した疾患が、グルタミン酸経路アポトーシスに関連している、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
- アポトーシスに関連した疾患が、神経細胞死に関連している、請求項24記載の方法。
- アポトーシスに関連した疾患が、卒中、筋萎縮性側索硬化症、または緑内障である、請求項24記載の方法。
- アポトーシスに関連した疾患が神経変性疾患である、請求項1記載の方法。
- 神経変性疾患が、ニューロン、グリア細胞、稀突起膠細胞、シュワン細胞、または神経幹細胞で生じる、請求項27記載の方法。
- 神経変性疾患が、アルツハイマー病、ハンチントン病、ピック病、筋萎縮性側索硬化症、網膜色素変性症、小脳変性、末梢神経障害、進行性上核麻痺、またはヤコブ・クロイツフェルト病である、請求項18、20、または27のいずれか一項の方法。
- 神経変性疾患がパーキンソン病である、請求項18、20、または27のいずれか一項記載の方法。
- アポトーシスに関連した疾患が眼疾患である、請求項1記載の方法。
- 眼疾患が、非滲出性の年齢に関連した筋変性、滲出性の年齢に関連した筋変性、網膜症、網膜変性、網膜色素変性症、アッシャー症候群、白点眼底、スターガールト病、テイ・サックス病、ゴーシェ病、遺伝性末梢血管拡張、緑内障、球後視神経炎、レーベルの先天性黒内障、中心または分岐の網膜動脈閉塞、中心または分岐の静脈閉塞、光受容体変性、角膜実質細胞消失、結膜細胞消失、涙腺細胞、スティーヴンス・ジョンソン症候群、シェーグレン症候群、乾性角結膜炎、運動神経機能消失、または視野の消失からなる群より選択される、請求項31記載の方法。
- アポトーシスに関連した疾患が、骨疾患、ウイルス疾患、移植、免疫抑制、変性肝容態、再灌流傷害疾患、動脈塞栓、心筋梗塞、脳梗塞、脊髄外傷、頭部外傷、凍瘡、筋肉減少、筋ジストロフィー、梗塞、卒中、自己免疫疾患、炎症、筋腫、筋萎縮症、全身炎症応答症候群、成人呼吸困難症候群、脳性マラリア、慢性肺炎、肺サルコイド症、腸炎、火傷傷害、タンパク質消失の増加する疾患、慢性腎不全、虚血、または肥大疾患である、請求項1記載の方法。
- 被験者が哺乳動物である、請求項1〜33のいずれか一項記載の方法。
- 哺乳動物がヒトである、請求項34記載の方法。
- 被験者が、アポトーシスに関連した疾患に罹患している、請求項1または35記載の方法。
- 薬学的に許容される担体を投与することをさらに含む、請求項1〜36のいずれか一項記載の方法。
- 薬学的に許容される担体が、神経系または脳脊髄液に直接投与するに許容される、請求項37記載の方法。
- ホスファチジン酸化合物を、アポトーシスに関連した疾患の治療の別の方法と組み合わせて投与することをさらに含む、請求項1〜38のいずれか一項記載の方法。
- 有効量のホスファチジン酸化合物をアポトーシスが調節されるように投与することを含む、細胞におけるアポトーシスをインビトロで調節する方法であって、ホスファチジン酸化合物が、式（I）
（式中、
R1およびR2が、各々独立的に、選択された鎖部分であり；
R3およびR4が、各々独立的に、水素であり、存在せず、またはプロドラッグ部分であり；
Lが連結部分である）
およびその薬学的に許容される塩である、前記方法。 - 細胞が遺伝子操作された細胞である、請求項40記載の方法。
- ホスファチジン酸化合物、もしくは薬学的に許容されるその塩、およびアポトーシスに関連した容態の治療用の前記化合物の使用説明書を含む、パッケージングされた薬学的組成物であって、ホスファチジン酸化合物が、式（I）
（式中、
R1およびR2が、各々独立的に、選択された鎖部分であり；
R3およびR4が、各々独立的に、水素であり、存在せず、またはプロドラッグ部分であり；
Lが連結部分である）
およびその薬学的に許容される塩である、前記薬学的組成物。 - 被験者における神経変性疾患を治療する方法であって、前記被験者に、神経変性疾患が治療されるように有効量のホスファチジン酸化合物を投与することを含み、ホスファチジン酸化合物が、式（I）
（式中、
R1およびR2が、各々独立的に、選択された鎖部分であり；
R3およびR4が、各々独立的に、水素であり、存在せず、またはプロドラッグ部分であり；
Lが連結部分である）
およびその薬学的に許容される塩である、前記方法。 - 神経変性疾患が、アルツハイマー病、ハンチントン病、ピック病、筋萎縮性側策硬化症、網膜色素変性症、脳変性、末梢神経障害、進行性上核麻痺、またはヤコブ・クロイツフェルト病からなる群より選択される、請求項43記載の方法。
- 神経変性疾患がパーキンソン病である、請求項43記載の方法。
- 神経変性疾患が多発性硬化症である、請求項43記載の方法。
- 被験者がヒトである、請求項43〜46のいずれか一項記載の方法。
- 被験者が神経変性疾患に罹患している、請求項43または47記載の方法。
- 薬学的に許容される担体を投与することをさらに含む、請求項43〜48記載の方法。
- 被験者における眼疾患を治療する方法であって、被験者に、眼疾患が治療されるように有効量のホスファチジン酸化合物を投与することを含み、前記ホスファチジン酸化合物が、式（I）
（式中、
R1およびR2が、各々独立的に、選択された鎖部分であり；
R3およびR4が、各々独立的に、水素であり、存在せず、またはプロドラッグ部分であり；
Lが連結部分である）
およびその薬学的に許容される塩である、前記方法。 - ホスファチジン酸化合物を、眼疾患を治療する補足的方法と組合わせて投与することをさらに含む、請求項50記載の方法。
- 眼疾患が緑内障である、請求項50または51記載の方法。
- 補足的方法が、線維柱体形成術、虹彩切除術、虹彩切開、ろ過手術、または既知の緑内障治療剤である、請求項52記載の方法。
- 眼疾患が非滲出性の年齢に関連した黄斑変性である、請求項50または51記載の方法。
- 補足的方法が、ルーテンまたは亜急性ダイオードレーザー処理である、請求項54記載の方法。
- 眼疾患が、滲出性の年齢に関連した黄斑変性である、請求項50または51記載の方法。
- 補足的方法が、レーザー光凝固または光力学的療法である、請求項56記載の方法。
- 眼疾患が網膜症である、請求項50または51記載の方法。
- 補足的方法が、血糖降下薬の投与、レーザー処理、または毒性薬物の中止である、請求項58記載の方法。
- 眼疾患が網膜色素変性症、アッシャー症候群、白点眼底、またはスターガールト病である、請求項50または51記載の方法。
- 補足的方法が、ビタミンAまたは核酸の投与である、請求項60記載の方法。
- 眼疾患が、テイ・サックス病、角膜実質細胞消失、涙腺細胞消失、動眼神経麻痺、ゴーシェ病、レーバー先天性黒内障、または遺伝性末梢血管拡張である、請求項50または51記載の方法。
- 眼疾患が球後視神経炎または光受容体変性である、請求項50または51記載の方法。
- 補足的方法が、ステロイドの投与である、請求項63記載の方法。
- 眼疾患が、中心または分岐の網膜動脈または静脈閉塞である、請求項50または51記載の方法。
- 補足的方法がレーザー処理または抗凝固剤もしくは血塊破壊剤の投与である、請求項65記載の方法。
- 眼疾患が光受容体変性である、請求項50または51記載の方法。
- 補足的処理が剥離を修復するか、または剥離の原因を治療することである、請求項67記載の方法。
- 眼疾患が、結膜細胞または涙腺細胞の減少である、請求項50または51記載の方法。
- 補足的治療がステロイドの投与を含む、請求項69記載の方法。
- 眼疾患が視野の減少である、請求項50または51記載の方法。
- 補足的治療が、ステロイドまたは血塊破壊薬の投与を含む、請求項71記載の方法。
- 前記被験者がヒトである、請求項50〜72記載の方法。
- 被験者におけるアポトーシスに関連した疾患を治療する方法であって、前記被験者に、ミトコンドリア膜電位が維持されるように有効量のホスファチジン酸化合物を投与することを含み、ホスファチジン酸化合物が、式（I）
（式中、
R1およびR2が、各々独立的に、選択された鎖部分であり；
R3およびR4が、各々独立的に、水素であり、存在せず、またはプロドラッグ部分であり；
Lが連結部分である）
およびその薬学的に許容される塩である、前記方法。 - アポトーシスに関連した疾患が神経変性疾患である、請求項74記載の方法。
- アポトーシスに関連した疾患が眼疾患である、請求項74記載の方法。
- 前記被験者がヒトである、請求項74記載の方法。
- 有効量のホスファチジン酸化合物および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物であって、ホスファチジン酸化合物が、式（I）
（式中、
R1およびR2が、各々独立的に、選択された鎖部分であり；
R3およびR4が、各々独立的に、水素であり、存在せず、またはプロドラッグ部分であり；
Lが連結部分である）
およびその薬学的に許容される塩である、前記薬学的組成物。 - 有効量が神経変性疾患を治療するのに有効である、請求項78記載の薬学的組成物。
- 有効量が眼疾患を治療するのに有効である、請求項78記載の薬学的組成物。
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