JP2000513346A

JP2000513346A - 細胞消滅及び壊死による細胞障害を防ぐためのフルピルチンの使用

Info

Publication number: JP2000513346A
Application number: JP10502275A
Authority: JP
Inventors: ペルガンデガブリエレ; エーミュラーヴェルナー; オズボーンネヴィル; ウルリッヒハインツ
Original assignee: アスタメディカアクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 1996-06-27
Filing date: 1997-06-18
Publication date: 2000-10-10
Also published as: DE19625582A1; PT912177E; DE59711240D1; WO1997049398A1; AU3340397A; EP0912177B1; ES2213826T3; EP0912177A1; DK0912177T3; ZA975306B; US6124326A; AR008619A1; ATE258053T1

Abstract

(57)【要約】本発明は、非生理学的に高い細胞死亡率を伴う疾患の予防及び治療のための薬剤を製造するためのフルピルチン又はその塩の使用に関する。その場合、細胞破壊プロセスを伴う臓器疾患、例えば心筋梗塞、ショック腎、ショック肺、老年斑点性変性あるいは機械的影響、熱影響、放射線影響又は毒性影響による外傷の治療が特に重要である。

Description

【発明の詳細な説明】細胞消滅及び壊死による細胞障害を防ぐためのフルピルチンの使用本発明は、非生理学的に高い細胞死亡率を伴う疾患を予防及び治療するための薬剤としてのフルピルチン(Flupirtin)又はその塩の使用に関する。フルピルチンは、広く用いられる公知の中枢作用性非アヘン系鎮痛薬であり、これは、ドイツでは特に、神経痛、損耗に由来する関節疾患での疼痛、頭痛及び術後痛の治療のために認可されている。フルピルチンはその鎮痛効果を、アヘン剤／オピオイド−鎮痛薬とは別の作用機構を介して展開する(Nickel,b.,Postgrad,Med.J.63(Suppl.3)，19(1987); Sze lenyi，I.，Nickel，b.，Borbe，H．O.，Brune K.，Br．J．Pharmacol．143，89 (1989))。電気生理学的実験で、フルピルチンは脊柱上レベルでも、脊柱レベルでも、侵害受容現象に影響を及ぼすことが示された(carisson，K．H.，Jurna，I .，Eur．J．Pharmakol．143，89(1987);Bleyer，H.，Carlsson K．H.，Erkel，H ．J.，Jurna，I.，Eur．J．Pharmacol．151，259(1988);Nickel，B.，Aledter， A.，Postgrad Med．J.63(Suppl.3)41(1987))。良好な鎮痛特性の他に、フルピルチンは筋弛緩特性を有しており、従ってフルピルチンは、筋緊張の治療のために又は筋緊張に由来する疾患の際に使用することができる（ドイツ特許（ＤＥ）第４０２２４４２号明細書）。更に、ラットを用いてのフルピルチンの筋弛緩作用の実験で、フルピルチン− 作用は興奮性アミノ酸Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）を阻害しうることが判明した。このＮＭＤＡ−拮抗作用に基づき、フルピルチンはＮＭＤＡ仲介−中枢神経系疾患の治療のためにも、例えば脳虚血、神経変性性疾患、てんかん発作のために好適である（ドイツ特許（ＤＥ）第４３２７５１６号明細書）。化学的な観点からは、フルピルチンは２−アミノ−３−エトキシカルボニルアミノ−６−（ｐ−フルオル−ベンジルアミノ）−ピリジンが該当する。フルピルチン及びその製剤学的に使用可能な塩の合成は、ドイツ特許（ＤＥ）第１７９５８５８号明細書、ドイツ特許（ＤＥ）第３１３３５１９号明細書及びドイツ特許（ＤＥ）第３４１６６０９号明細書中に記載されている。ところで意外にも、フルピルチンはＢｃｌ−２の発現を高め、並びに壊死プロセスを阻害することが発見された。従って、フルピルチンを、非生理学的に高い細胞死亡率を伴う疾患の治療のために使用する可能性が開かれた。従って殊に、例えば低酸素負荷、機械的負荷、熱負荷、毒負荷又は放射線負荷による局所的代謝障害の最も重い結果としての局所的組織死亡と結びついている疾患を治療することができる。生体では、細胞死亡は２つの異なる経路：細胞消滅又は壊死により生じる。細胞消滅（プログラム細胞死、「細胞自殺」）が細胞破壊の活性プロセスである一方で、壊死は殊に細胞膜の非特異的損傷の結果である。壊死の病理学的特徴は細胞消滅のそれとは異なる。細胞消滅の特徴は、細胞の萎縮、クロマチンの縮合並びに細胞膜の特徴的な隆起である。ＤＮＡレベルでは、エンドヌクレアーゼにより、１８０塩基対の大きさの断片への断片化が起こる（ゲル電気泳動法での特徴的な泳動モデル(Leitermuster)）。細胞は細胞質の成分の放出を伴わずに、膜に囲まれた壊死体へと分解する。これらは、その変性された表面構造により、位置固着マクロファージの特異的レセプターにより、もしくは上皮細胞により迅速に認められて、完全に捕食され、炎症反応は典型的には生じない(Amling et al．１994，Savill，1994，Kerr et al．1994)。細胞消滅に対して、壊死による細胞死の場合には、細胞膜が壊れ、かつ細胞内容物が細胞室外に放出される。このことは、組織障害及び炎症反応をもたらす(s avill，1994，Kerr et al．1994)。細胞破壊は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出に結びついている。ＬＤＨは細胞質酵素及び全ての組織の成分である。臓器損傷の場合に、それは、増加して血漿中に侵入し、かつ多くの病理学的状態で、特に心筋梗塞後に、急性肝炎又は中毒性肝臓損傷の際に増加する。細胞死を生じさせるプロセスの種類及び強さ／期間だけでなく、それが、細胞消滅による障害であるか、又は壊死による障害であるかが重要である；細胞消滅プロセス及び壊死プロセスは、組織中で同時に発生することもありうる(Yoshimu ra et al.1996)。プログラム細胞死（細胞消滅）はＢｃｌ−２、２３９アミノ酸を有する２５ｋＤａの膜タンパク質により阻害されうることが文献から公知である。該タンパク質は、核膜、小胞体の一部及びミトコンドリア膜の内外に位置している。Ｂｃｌ −２の作用メカニズムはまだ、完全には解明されてなく、特に、次の可能なメカニズムが論議されている：ミトコンドリア作用の変調、間接的抗酸化作用、クロマチン−分離の直接的阻害、細胞質ゾルのＣａ²⁺濃度の調整、隔膜によるタンパク質輸送の変調、細胞消滅に起因するタンパク質Ｂａxの阻害による間接的抗細胞消滅作用(Hale et al．1996，Park et al．1996)。薬理実験に基づき、フルピルチンの新規の本発明による作用を詳述する。薬理実験ＢＣＬ−２の発現に対するフルピルチンの影響材料及び方法材料次の試薬を使用した：ポリ−Ｌ−リシン（Ｍ_r＞３０００００）、グリシン（３−[４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド；チアゾリルブルー）［ＭＴＴ］、ダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ／ＨＧ；グルタミン不含グルコース４．５ｇ／ｌ含有する）及びSigm a（St．Louis，MO，USA）の最小必須培地−イーグル［メチオニン、システイン及びＬ−グルタミン不含］(ＭＥＭ)；Biochrom(Berlin)のＬ−グルタミン；ICN- Radiochemicals(Irvine，CA;USA)の[³⁵S]メチオニン／システイン及びSanta Cru z Biotechnology(Santa Cruz，CA，USA)のヒトＢｃｌ−２（マウス中で製造）に対する単クローン性抗体。フルピルチンマレエート［２−アミノ−３−エトキシカルボニルアミノ−６− （４−フルオルベンジルアミノ）−ピリジンマレエート］(Ｍ_r：４２０．４１)( ASTA‐Medica AG)。ｈＮＴニューロン、ｈＮＴニューロン調整媒体及びｈＮＴニューロン抑制媒体(Strata gene，Heidelberg)。ｈＮＴニューロンｈＮＴニューロンを、記載されているように(Youn kin et al.，1993;Pleasure und Lee，1993）培養した。これらを、初めはｈＮＴニューロン−抑制培地中で、一方続く３週間の間、Stratagene社の使用指示に記載されているようにｈＮＴニューロン調整培地中で培養した。ｈＮＴニューロン（４週間後）(Younkin et al.，1993)を、ＮａＣｌ１２０ｍＭ、ＫＣ１５．４ｍＭ、ＣａＣｌ₂１．８ｍＭ、グルコース１５ｍＭ及びHepes[ ｐＨ７．４］２５ｍＭを含有する塩溶液中の様々な濃度のグルタメートを用いて処理した。実験で、塩溶液に付加的にグリシン５０μＭを補充した。細胞を、グルタメートと共に３７℃で３０分間インキュベーションした。インキュベーションの後に塩溶液を除去し、かつグルタミン２ｍＭ、インシュリン１００ｍＵ／ｌ、ペニシリン０．１Ｕ／ｍｌ及びストレプトマイシン０．１Ｕ／ｍｌを含有するＤＭＥＭ／ＨＧと代えた。インキュベーションを更に２４時間継続した。フルピルチンを細胞に、グルタメートを添加する２時間前に添加した。Ｂｃｌ−２の免疫沈降の代謝マーキング及び定量測定ｈＮＴニューロンを、ウシ血清アルブミン１％を補充されたＭＥＭ［メチオニン、システイン及びＬ−グルタミン不含］中で６時間、[³⁵Ｓ]メチオニン／システイン１００μＣｉ／ｍｌの存在下に代謝的にマーキングした。細胞を収穫し、かつＳＤＳ０．４％及びトリクロロ酢酸の存在下に溶解した。抗体結合性材料を、記載されているように（Oltvai et al.，1993;Dole et al.，1994)単クローン性抗Ｂｃｌ−２抗体を用いて免疫沈降させた。生じた免疫沈降物を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル１２．５％を用いてそのタンパク質の大きさにより分け、かつ記載されているように(Castle et al.，1993)更に処理した。オートラジオグラム上のバンドの半定量分析のために、バンドを、積分デンシトメータ(Shimadzu CS-910/C-R１A)を用いて走査した。免疫染色(Immunfaerbung) 細胞を、エチレン−グリコール−ビス(β−アミノエチル−エーテル)Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）０．０２％を含有するメタノールを用いて、 −２０℃で、記載のように(Bachmann et al.，1986)固定した。引き続き、細胞を単クローン性Ｂｃｌ−２[ヒト抗原に対して使用］抗体と一緒にインキュベーションした;免疫複合体を、ＦＩＴＣマーキングされた抗−マウスＩｇを用いて可視にした。結果Ｂｃｌ−２の発現に対するフルピルチンの影響ｈＮＴニューロン中でのＢｃｌ−２の発現を、２つの異なる技術で測定した。一度、Ｂｃｌ−２を微小蛍光法を用いて局限した。未処理か、又はフルピルチン１０μｍで２時間予備処理された細胞を固定し、かつＢｃｌ−２に対する抗体と一緒にインキュベーションした。引き続き、免疫複合体を、微小蛍光鏡を用いて可視にした。フルピルチンで処理された細胞は、対照分に比べて、Ｂｃｌ−２に関して明らかに強められた着色モデルを示す。この観察は、フルピルチンはＢｃｌ−２発現をもたらすということを示している。この推論を更に根拠づけるために、もう１つの方法である代謝マーキングされたＢｃｌ−２の免疫沈降を用いた。ｈＮＴニューロンを[³⁵Ｓ]メチオニン／システインと一緒にインキュベーションした。生じた免疫複合体を単クローン性抗Ｂｃｌ−２抗体を用いて沈降させ、かつタンパク質をその大きさにより分離した。オートラジオグラムで、対照−試料からの抽出物中の２６ｋＤａのＢｃｌ−２タンパク質は、以前からOltvai et al．（1993）により観察された３１ｋＤａのバンドと一緒に可視になる。２６ｋＤａのＢｃｌ−２バンドのこの強度を１００％に等しいとすると、グルタメート１ｍＭと一緒にインキュベーションされた細胞は、Ｂｃｌ−２のかなり低い発現、約８０％を示す。フルピルチン濃度（３及び１０μＭ）が上昇するにつれて、グルタメートを伴うｈＮＴのインキュベーションは、Ｂｃｌ−２の＞６倍上昇をもたらす。壊死に対するフルピルチンの影響材料及び方法皮質神経細胞培養：受精後１６〜１８日の胎児ラットの前脳を使用した。脳皮を除き、かつ分離された皮質細胞（１．５〜２・１０⁶）を、ポリ−Ｄ−リシン０．１ｍｇ／ｍｌで被覆され、引き続き血清含有培地（ダルベッコ変性イーグル培地−ＤＭＥＭ−、Ｌ−グルタミン４ｍＭ、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ／ストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍｌ、ウシ胎児血清１０％添加）でブロックされた３５ｍｍペトリ皿に播いた。一次培養をＤＭＥＭ中で培養したが、これは、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ） −グルコース（６ｇ／ｌ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）及び「ホルモン−培地」１０％（トランスフェリン（１ｍｇ／ｍｌ）、インシュリン（２５０ｍｇ／ｍｌ）、プトレッシン（６・１０^-4 Ｍ）、亜セレン酸ナトリウム（３×１０^-7Ｍ）、プロゲステロン（２・１０^-7Ｍ）及びエストラジオール（１０−¹¹Ｍ）が添加されている）で補充されている。この培養を、ＣＯ₂５％／空気９５％で飽和湿度雰囲気中、３７℃で、この培地中で少なくとも７日間保持した。低酸素状態及び再酸素化：播種後７日目に、皮質ニューロンをＤＭＥＭ１ｇ／ｍｌ（Ｌ−グルタミンを有するグルコース及びペニシリン／ストレプトマイシン含有、「ホルモン−培地」不含）を、無酸素雰囲気（Ｎ９５％／ＣＯ₂５％）中、３７℃で５時間インキュベーションした。再酸素化のために、細胞を酸素正常条件（空気９５％／ＣＯ₂５％）に３時間さらした。フルピルチンを、低酸素状態にする前に培養に添加した。乳酸デヒドロゲナーゼ−アッセイ：細胞障害を、低酸素状態／再酸素化の後の細胞培養−上澄み中での乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）−放出を介して測定した。ＬＤＨ−活性を分光光度法により測定した；ピルベート（０．６ｍＭ）を２５ ℃で、リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）中で、還元されたニコチンアミド−アデノシン−ジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）（０．１８ｍＭ）と一緒に試験されるべき試料（１．５ｍｌ中５０ｍＭ）の存在下にインキュベーションし、かつＮＡＤＨ− 消費を、２分間隔で３４０ｎｍで測定した。結果：壊死プロセスは、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出の高まりと結びついている。第１表から分かるように、細胞を低酸素雰囲気及びそれに続く再酸素化に晒した後では、ＬＤＨ−放出は５０％以上高まる。対照に比べて不充分なＬＤＨ −放出の高まりから認められる（ｐ＜０．０５）ように、フルピルチンでの予備処理により、低酸素状態及びそれに続く再酸索化により引き起こされる壊死は阻害される。第１表ＬＤＨ−放出の増加（対照値：２１．２３±３．１４ｍＵ／ｍｌ／タンパク質ｍｇ）片側ＡＮＯＶＡ試験（Dunnet−試験により実施）＊ｐ＜０．０５フルピルチンは、殊に細胞破壊プロセスを伴う臓器疾患、例えば心筋梗塞、ショック腎、ショック肺、老年斑点性変性又は機械的影響、熱影響、放射線影響又は毒性影響による外傷を治療するための前途有望な薬剤として好適であることを、明らかにこの結果は示している。いくつかのインビトロ及びインビボ−モデルでは、フルピルチンに関して、ＮＭＤＡ−拮抗作用及びそれに関連して神経防護作用が証明されえた。フルピルチンの臨床使用はこれらのデータに基づき、特にＡＩＤＳ−脳障害の場合に考えられる。ＡＩＤＳ−脳障害の発生に関して、感染マクロファージが、特にＮＭＤＡ−拮抗作用性神経毒を放出し、次いでこれが、ＮＭＤＡ−レセプターの刺激を介して神経細胞死をもたらすと議論されている(Lipton 1992)。ＮＭＤＡ−仲介神経毒作用も、ＨＩＶ（ｇｐ１２０）仲介神経毒作用も、フルピルチンにより阻害されうることが細胞培養実験で証明されえた（Perovic et a l．1994）。フルピルチンは、その存在が神経細胞のみに限られていない細胞消滅−抑制蛋白質Ｂｃｌ−２の発現を高めうることは仝く意外であった。Ｂｃｌ−２は、隔膜中、小胞体の一部及びミトコンドリア膜中に局限されている。更に、細胞質酵素である乳酸デヒドロゲナーゼの低減された放出が証明しているように、フルピルチンはインビトロで壊死細胞死も阻害しうることが、同じく意外にも発見された。乳酸デヒドロゲナーゼの増加はヒトの場合には周知のように、細胞破壊プロセスにより、特に心筋梗塞により、急性肝炎又は中毒性肝臓疾患で生じる。フルピルチンは、次の投薬形で公知の方法で予防及び治療のために投与することができる：錠剤、フィルム錠剤、硬質ゼラチンカプセル、軟質ゼラチンカプセル、ペレット、顆粒、糖衣錠、座薬、ミクロカプセル、水性又は油性懸濁液、油性溶液、筋肉内投与するための注射液、静脈内投与するための注射液。薬剤を製造するための好適な塩は、フルピルチンの生理学的に認容可能な塩の全てである。例えば、フルピルチンの水酸化塩、マレイン酸塩、硫酸塩及びグルコン酸塩が該当する。本発明の薬剤中でのフルピルチンの含有量は、０．１ｍｇ〜３０００ｍｇ、有利に１０ｍｇ〜５００ｍｇである。薬剤のいわゆる個別用量は、一日１〜５回、有利に１〜３回で投与することができる。この用量記載は全て、塩基としてのフルピルチンに関している。フルピルチンの塩を使用する場合には、相応してモル重量に換算すべきである。本発明の化合物の薬学的及び製剤学的取り扱いは、慣用の標準法により行う。例えば、フルピルチン及び担持剤及び／又は助剤を撹拌又は均質化により十分に混合し、その際、通常２０〜８０℃、有利に２０〜５０℃の温度で処理する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ネヴィルオズボーンイギリス国オーエックス８１ジェイエスオックスフォードエインスヘムミルストリート 12 (72)発明者ハインツウルリッヒドイツ連邦共和国Ｄ―63843 ニーデルンベルクバイエルンシュトラーセ２

Claims

【特許請求の範囲】１．神経変性疾患を除く、非生理学的に高い細胞死亡率を伴う疾患の治療及び予防のための薬剤を製造するための、作用物質フルピルチン又はその薬剤学的に使用可能な塩の使用。２．細胞破壊プロセスを伴う臓器疾患、例えば心筋梗塞、ショック腎、ショック肺、老年斑点性変性あるいは機械的影響、熱影響、放射線影響又は毒性影響による外傷を治療するための、請求項１に記載の作用物質フルピルチン又はその薬剤学的に使用可能な塩の使用。３．フルピルチン又はその薬剤的に使用可能な塩０．１〜３０００ｇを含有する薬剤を製造するための、請求項１に記載の作用物質フルピルチン又はその薬剤学的に使用可能な塩の使用。