ES2213826T3 - Utilizacion de flupirtin para la terapia y la profilaxis de infarto de miocardio, riñon conmocionado y pulmon conmocionado. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION TRATA DE LA UTILIZACION DE FLUPIRTINA O DE SUS SALES PARA LA PREPARACION DE UN MEDICAMENTO PARA LA PREVENCION Y TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES, QUE SE ACOMPAÑAN CON UNA ELEVADA TASA DE MORTALIDAD CELULAR DE ORIGEN NO FISIOLOGICO. ES POR TANTO ESPECIALMENTE IMPORTANTE EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES DE ORGANOS CON PROCESOS DE ALTERACIONES CELULARES COMO EL INFARTO DE MIOCARDIO, LA NEFROPATIA DE SHOCK, LA NEUMOPATIA DE SHOCK, LA DEGENERACION MACULAR SENIL O LESIONES A CAUSA DE INFLUENCIAS MECANICAS, TERMICAS, RADIACTIVAS O TOXICAS.

Description

Utilización de flupirtin para la terapia y la profilaxis de infarto de miocardio, riñón conmocionado y pulmón conmocionado.

El invento se refiere a la utilización de flupirtin o sus sales como medicamentos destinados a la profilaxis y la terapia de infarto de miocardio, riñón conmocionado y pulmón conmocionado.

El flupirtin es un conocido analgésico no opiáceo, activo sobre el sistema central, ya introducido, que en Alemania está admitido, entre otras indicaciones, para la terapia de dolores nerviosos, dolores en el caso de enfermedades articulares debidas al desgaste, dolores de cabeza y dolores postoperatorios.

Sus efectos analgésicos los desarrolla el flupirtin a través de otros mecanismos de efecto distintos de los de los analgésicos opiáceos / opiodies (Nickel, B. Postgrad, Med. J. 63 (suplemento 3), 19 (1987); Szelenyi, I., Nickel, B., Borbe, H. O., Brune K., Br. J. Pharmacol. 143, 89 (1989)). En investigaciones electrofisiológicas se puso de manifiesto que el flupirtin es capaz de intervenir en el plano tanto supraespinal como también espinal en el suceso nociceptivo (Carlsson, K. H., Jurna, I., Eur. J. Pharmacol. 143, 89 (1987); Bleyer, H., Carlsson K. H., Erkel, H. J., Jurna, I., Eur. J. Pharmacol. 151, 259 (1988); Nickel, B., Aledter, A., Postgrad, Med. J. 63 (suplemento 3) 41 (1987)).

Junto a unas buenas propiedades analgésicas, el flupirtin dispone de propiedades relajadoras de los músculos, de manera tal que el flupirtin se puede emplear también para el tratamiento de tensiones musculares o en el caso de enfermedades, que se basan en tensiones musculares (documento de patente alemana DE 40 22 442).

Además, en el curso de investigaciones del efecto relajador muscular del flupirtin en una rata, se encontró que el efecto del flupirtin se puede inhibir mediante el aminoácido excitatorio N-metil-D-aspartato (NMDA). A causa de este efecto antagonista del NMDA, el flupirtin es apropiado también para el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central (SNC) mediadas por el NMDA, tales como por ejemplo una isquemia cerebral, enfermedades neurodegenerativas y ataques epilépticos (documento DE 43 27 516).

Considerado desde el punto de vista químico, en el caso del flupirtin se trata de la 2-amino-3-etoxicarbonil-amino-6-(p-fluoro-bencilamino)piridina.

La síntesis del flupirtin y de sus sales utilizables farmacéuticamente se describe en los documentos de patentes DE 17 95 858, DE 31 33 519 y DE 34 16 609.

De modo sorprendente, se ha encontrado por fin que el flupirtin está en situación de aumentar la expresión de Bcl-2 así como de inhibir procesos necróticos.

Con ello se abre la posibilidad de emplear el flupirtin para el tratamiento de enfermedades que van acompañadas con una tasa de muerte celular anti-fisiológicamente alta.

En particular, se pueden tratar con ello enfermedades, que van acompañadas por una muerte tisular local como consecuencia más grave de un trastorno local del metabolismo, por ejemplo a causa de una carga hipóxica, mecánica, térmica, tóxica o con radiaciones.

En el organismo, la muerte celular puede efectuarse por dos vías diferentes: por apoptosis o por necrosis.

Mientras que la apoptosis (muerte celular programada, = "suicidio de células") constituye un proceso activo de la destrucción de las células, la necrosis es consecuencia de un daño inespecífico, en particular de la membrana celular.

Las características patológicas de la necrosis difieren de las de la apoptosis. La apoptosis está caracterizada por una contracción de la célula, una condensación de la cromatina así como divertículos característicos de la membrana celular. En el plano del ADN, se efectúa mediante las endonucleasas una fragmentación en fragmentos con un tamaño de 180 pares de bases (modelo de conductor característico en la electroforesis en gel). La célula se desintegra, sin liberar constituyentes del citoplasma, en cuerpos de apoptosis rodeados por membranas. Éstos son rápidamente reconocidos por su estructura superficial mejorada de receptores específicos de macrófagos o células epiteliales, que se sitúan en ciertos sitios, y son fagocitados completamente, típicamente no se presenta una reacción de inflamación (Amling y colaboradores 1994, Savill, 1994, Kerr y colaboradores, 1994).

Al contrario que en la apoptosis, en el caso de la muerte celular causada por necrosis se destruye la membrana plasmática y el contenido de las células se pone en libertad dentro del espacio extracelular. Esto conduce a daños tisulares y a reacciones inflamatorias (Savill, 1994, Kerr y colaboradores, 1994). La destrucción celular está vinculada con la liberación de la lactato deshidrogenasa (LDH). La LDH es una enzima citoplasmática y forma parte constituyente de todos los tejidos. En el caso de daños para órganos, ella puede pasar de modo multiplicado al plasma y está aumentada en muchos estados patológicos, entre otros después de un infarto de miocardio, en el caso de una hepatitis aguda o de daños hepáticos tóxicos.

No solamente son decisivos el tipo y la intensidad así como la duración del proceso que produce la muerte celular para establecer si se llega a un daño por apoptosis o necrosis; pueden aparecer procesos necróticos y apoptóticos también simultáneamente en un tejido (Yoshimura y colaboradores 1996).

A partir de la bibliografía es conocido que la muerte celular programada (apoptosis) puede ser inhibida por la Bcl-2, que es una proteína situada en las membranas con un tamaño de 25 kDa y que tiene 239 aminoácidos. La proteína está localizada en la membrana nuclear, en partes del retículo endoplasmático y en las membranas mitocondriales externas e internas. El mecanismo de efectos de la Bcl-2 todavía no ha sido explicado completamente; entre otros, se discuten los siguientes mecanismos posibles: modulación de la función mitocondrial, efecto anti-oxidante indirecto, evitación directa del desdoblamiento de cromatina, regulación de la concentración citosólica de Ca^{2+}, modulación de transporte de proteínas a través de la membrana nuclear, efecto anti-apoptótico indirecto por inhibición de la proteína Bax inductora de apoptosis (Hale y colaboradores, 1996, Park y colaboradores 1996).

El documento de solicitud de patente alemana DE-A-4327516 divulga la utilización de flupirtin, entre otras enfermedades, en la esclerosis lateral amiotrófica y en broncoespasmos. A partir de J. Neurotrauma, 1995, 12(3): 489 y de Invest. Ophthalm. Vis. Sci., Febrero 1996, 37(2): 274-280 se conoce la utilización de flupirtin en el caso de diferentes enfermedades tales como, entre otras, isquemia cerebral, daños celulares tóxicos después de enfermedades neurodegenerativas, traumas cerebrales e isquemia retinal. El documento T. W. Neurologie Psychiatrie, 1995, 9(10): 606 apunta adicionalmente a una ventajosa influencia del flupirtin en el caso de daños celulares por apoptosis.

Es objeto del presente invento, en particular en comparación con el estado de la técnica mencionado, la utilización de la sustancia activa flupirtin o de sus sales utilizables farmacéuticamente, para la preparación de un medicamento destinado a la terapia y la profilaxis del infarto de miocardio, del riñón conmocionado y del pulmón conmocionado.

Con ayuda de las investigaciones farmacológicas se debe explicar con mayor detalle el nuevo efecto conforme al invento del flupirtin.

Investigaciones farmacológicas

Influencia del flupirtin sobre la expresión de Bcl-2.

Materiales y métodos Materiales

Se adquirieron los siguientes reactivos: poli-L-lisina (M_{r} > 300.000), glicina, (bromuro de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazolio; Azul de tiazolilo [MTT], Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM/HG; que contiene 4,5 g/l de glucosa sin glutamina) y Medio Esencial Mínimo de Eagle [sin metionina, cisteína ni L-glutamina] (MEM) de Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.); L-glutamina de Biochrom (Berlín); [^{35}S]metionina/cisteína de ICN-Radiochemicals (Irvine, CA; EE.UU.) y anticuerpos monoclonales contra Bcl-2 humana (cultivados en un ratón) de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EE.UU.).

El maleato de flupirtin [maleato de 2-amino-3-etoxicarbonilamino-6-(4-fluoro-bencilamino)-piridina] (M_{r}: 420,41) (de ASTA-Medica AG), neuronas de hNT, medio acondicionado por neuronas de hNT y medio para la inhibición de neuronas de hNT (Stratagene, Heidelberg).

Neuronas de hNT

Las neuronas de hNT se cultivaron tal como se ha descrito (por Younkin y colaboradores, 1993; Pleasure y Lee, 1993). Éstas se cultivaron en el primer momento en un medio para la inhibición de neuronas de hNT y durante las tres siguientes semanas en un medio acondicionado por neuronas de hNT como se describe en las instrucciones de uso de la entidad Stratagene.

Neuronas de hNT [con una edad de 4 semanas] (Younkin y colaboradores, 1993) se trataron con diferentes concentraciones de glutamato en una solución salina, que contenía 120 mM de NaCl, 5,4 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl_{2}, 15 mM de glucosa y 25 mM de Hepes [de pH 7,4]. En los experimentos, la solución salina se suplementó adicionalmente con 50 \muM de glicina.

Las células se incubaron con glutamato durante 30 min. a 37ºC. Después de la incubación, la solución salina se eliminó y se reemplazó por el medio DMEM/HG, que contenía 2 mM de glutamina, 100 mU/l de insulina, 0,1 U/ml de penicilina y 0,1 U/ml de estreptomicina. La incubación se prosiguió durante 24 horas adicionales.

Se añadió flupirtin a las células 2 horas antes de la adición de glutamato.

Marcación metabólica y determinación cuantitativa de la precitación inmunológica de Bcl-2.

Las neuronas de hNT se marcaron metabólicamente durante 6 horas en un medio MEM [sin metionina, cisteína ni L-glutamina] complementado con 1% de albúmina de suero bovino en presencia de 100 \muCi/ml de [^{35}S]metionina/cisteína. Las células fueron cosechadas y lisadas en presencia de un 0,4% de SDS y ácido tricloroacético.

Un material que fija anticuerpos se precipitó inmunológicamente con el anticuerpo monoclonal anti-Bcl-2 tal como se describe (por Oltvai y colaboradores, 1993; Dole y colaboradores 1994). El resultante material precipitado inmunológicamente se separó, en función del tamaño de sus proteínas, mediante un gel al 12,5% de SDS-poli(acrilamida) y se elaboró ulteriormente tal como se ha descrito (por Castle y colaboradores, 1993).

Para el análisis semicuantitativo de las bandas en el auto-radiograma, las bandas fueron exploradas con un densitómetro integrador (Shimadzu CS-910/C-R1A).

Coloración inmunológica

Las células se fijaron con metanol, que contenía un 0,02% de ácido etilen-glicol-bis(\beta-aminoetil-éter)-N,N,N',N'-tetraacético [EGTA] a -20ºC, tal como se ha descrito (por Bachmann y colaboradores, 1986). A continuación, las células se incubaron con anticuerpos monoclonales anti-Bcl-2 [cultivados, contra un antígeno humano]; los complejos inmunitarios se hicieron visibles con Ig anti-ratón marcada con FITC.

Resultados

Influencia de flupirtin sobre la expresión de Bcl-2.

La expresión de Bcl-2 en neuronas de hNT se determinó con dos técnicas diferentes. En un caso, la Bcl-2 fue localizada con el método de la microfluorescencia. Las células, que o bien estaban sin tratar o habían sido tratadas previamente con 10 \muM de flupirtin durante 2 horas, fueron fijadas e incubadas con anticuerpos contra Bcl-2. A continuación, los complejos inmunitarios fueron hechos visibles con un microscopio de fluorescencia.

Las células, que habían sido tratadas con flupirtin, muestran un modelo cromático intensificado manifiestamente para la Bcl-2 en comparación con el grupo testigo. Esta observación apunta a que el flupirtin induce la expresión de Bcl-2.

Con el fin de respaldar adicionalmente esta conclusión, se aplicó un procedimiento adicional, de precipitación inmunológica de una Bcl-2 marcada metabólicamente. Las neuronas de hNT se incubaron con [^{35}S]metionina/cisteína. Los complejos inmunitarios resultantes fueron precipitados con anticuerpos monoclonales anti-Bcl-2 y las proteínas fueron separadas en función de sus tamaños. En el auto-radiograma, la proteína Bcl-2 de 26 kDa es visible en extractos procedentes de muestras testigos juntamente con la banda de 31 kDa, que se había observado ya anteriormente por Oltvai y colaboradores (1993). Si se establece igual a 100% la intensidad de la banda de Bcl-2 de 26 kDa, las células, que habían sido incubadas con 1 mM de glutamato, muestran una expresión considerablemente disminuida de Bcl-2, \approx 80%.

La incubación de neuronas de hNT con glutamato juntamente con concentraciones crecientes de flupirtin (3 y 10 \muM) condujo a un aumento mayor que 6 veces de la Bcl-2.

Influencia sobre la necrosis mediante flupirtin Materiales y métodos

Cultivo cortical de células nerviosas:

Se utilizó el cerebro anterior (prosencéfalo) de ratas fetales con una edad de 16-18 días. Las meninges se eliminaron y las células corticales disociadas (1,5 - 2 \cdot 10^{6}) se sembraron sobre placas de Petri de 35 mm, que habían sido revestidas con 0,1 mg/ml de poli-D-lisina y a continuación se bloquearon con un medio que contenía suero (Medio de Eagle Modificado por Dulbecco - DMEM -, mezclado con 4 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina / 100 mg/ml de estreptomicina y 10% de suero de ternero fetal. Los cultivos primarios se cultivaron en el DMEM, que estaba mezclado con L-glutamina (4 mM) - glucosa 6 g/l), penicilina (100 U/ml) estreptomicina 100 mg/ml y 10% de un "medio hormonal" al que se habían añadido transferrina (1 mg/ml), insulina (250 mg/ml), putrescina (6 \cdot 10^{-4} M), selenito de sodio (3 \cdot 10^{-7} M), progesterona (2 \cdot 10^{-7} M) y estradiol (10^{-11} M).

Los cultivos se mantuvieron durante por lo menos 7 días en este medio con una mezcla de 5% de CO_{2} y 95% de aire en una atmósfera saturada con humedad a 37ºC.

Hipoxia y reoxigenación

7 días después de la siembra, las neuronas corticales se incubaron en DMEM 1 g/ml, que contiene: glucosa con L-glutamina y una mezcla de penicilina y estreptomicina sin "medio hormonal" en una atmósfera anóxica (mezcla de 95% de N y 5% de CO_{2}) a 37ºC durante 5 h. Para la reoxigenación las células se sometieron durante 3 h a condiciones normóxicas (mezcla de 95% de aire y 5% de CO_{2}). Los cultivos testigos se mantuvieron en condiciones normóxicas. Se añadió flupirtin al cultivo antes de la hipoxia.

Ensayo de lactato deshidrogenasa

El daño celular se midió a través de la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) en un material sobrenadante de cultivo después de hipoxia y reoxigenación.

La actividad de LDH se determinó por fotometría espectral; se incubó piruvato (0,6 mM) a 25ºC en un tampón de fosfato de pH 7,5 con nicotinamido-adenosina-dinucleótido reducido (NADH) (0,18 mM) en presencia de la muestra que se había de investigar (50 mM en 1,5 ml) y se determinó a 340 nM el consumo de NADH a lo largo de un intervalo de tiempo de 2 min.

Resultados

Los procesos necróticos están vinculados con una liberación aumentada de lactato deshidrogenasa [LDH]. Tal como se puede deducir de la Tabla 1, después de haberse sometido las células a una atmósfera hipóxica y una subsiguiente reoxigenación se efectúa un aumento en más de 50% de la liberación de LDH. Mediante tratamiento previo con flupirtin se impide la necrosis inducida por hipoxia y subsiguiente reoxigenación, como se puede deducir a partir de la ausencia de aumento de la liberación de LDH en comparación con el testigo (p < 0,05).

TABLA 1

Aumento de la liberación de LDH (Valor testigo: 21,13 \pm 3,14 mU/ml/mg de proteína)

Tratamiento	Aumento de la liberación de LDH en comparación con
	el testigo (mU/ml/mg de proteína)
Hipoxia 5 h + reoxigenación 3 h	13,52 \pm 2,85
Hipoxia 5 h + reoxigenación 3 h + flupirtin 100 \muM	1,19 \pm 1,03 *
Ensayo ANOVA unilateral, seguido por el ensayo de Dunnet
* p < 0,05.

Estos resultados muestran con claridad que el flupirtin es un medicamento muy prometedor, en particular para el tratamiento de enfermedades de órganos con procesos destructores de células, tales como p.ej. infarto de miocardio, riñón conmocionado, pulmón conmocionado, degeneración macular senil o traumas como consecuencia de influencias mecánicas, térmicas, por radiaciones o tóxicas.

En varios modelos in vitro e in vivo se pudo comprobar para el flupirtin un efecto antagonista del NMDA y un efecto neuroprotector vinculado con ello. Como consecuencia de estos datos, se puede concebir un empleo clínico del flupirtin, entre otras indicaciones, en la encefalopatía por SIDA. Para la génesis de la encefalopatía por SIDA se discute que los macrófagos infectados ponen en libertad, entre otras, neurotoxinas que actúan de un modo agonista del NMDA, que luego conducen a la muerte celular nerviosa a través de una estimulación del receptor del NMDA (Lipton 1992).

En experimentos de cultivos celulares se pudo comprobar que tanto el efecto neurotóxico mediado por NMDA como también el mediado por HIV (gp120) puede ser inhibido por el flupirtin (Perovic y colaboradores, 1994).

No era totalmente sorprendente el hecho de que el flupirtin está en situación de aumentar la expresión de la proteína Bcl-2 inhibidora de la apoptosis, cuya presencia no solamente está limitada a células nerviosas. La Bcl-2 está localizada en la membrana nuclear, en partes del retículo endoplasmático y en la membrana mitocondrial.

Además de ello, se encontró asimismo de manera sorprendente que el flupirtin es capaz de inhibir in vitro también la muerte celular necrótica, como lo demuestra la liberación reducida de la enzima citoplasmática lactato deshidrogenasa. Unos aumentos de la lactato deshidrogenasa aparecen en seres humanos, tal como es conocido, como consecuencia de procesos destructores de células, entre otros casos, después de un infarto de miocardio, en el caso de una hepatitis aguda o de daños hepáticos tóxicos.

El flupirtin se puede administrar para la profilaxis y la terapia, de un modo conocido, en las siguientes formas de presentación:

Tabletas, tabletas con película, cápsulas de gelatina dura, cápsulas de gelatina blanda, comprimidos, granulados, grageas, supositorios, microcápsulas, suspensiones acuosas u oleosas, soluciones oleosas, soluciones inyectables para la administración intramuscular, soluciones inyectables para la administración intravenosa.

\newpage

Sales apropiadas para la preparación del medicamento son todas las sales fisiológicamente compatibles del flupirtin. Por ejemplo, entran en consideración las sales hidrocloruro, maleato, sulfato y gluconato de flupirtin.

Los contenidos de flupirtin en los medicamentos conformes al invento ascienden a 0,1 mg-3.000 mg, preferiblemente a 10 mg-500 mg. Las dosis individuales mencionadas del medicamento se pueden administrar 1 - 5 veces, preferiblemente 1 - 3 veces por día.

Los datos de dosificaciones se refieren siempre al flupirtin en forma de la base. Si se emplean sales del flupirtin, hay que convertir por cálculo de modo correspondiente al peso molecular.

La manipulación farmacéutica y galénica de los compuestos conformes al invento se efectúa de acuerdo con los métodos normalizados usuales. Por ejemplo, el flupirtin y el vehículo y/o las sustancias coadyuvantes se mezclan bien por agitación u homogeneización, trabajándose por lo general a unas temperaturas comprendidas entre 20 y 80ºC, preferiblemente entre 20 y 50ºC.

Claims (3)

1. Utilización de la sustancia activa flupirtin o de sus sales utilizables farmacéuticamente, para la preparación de un medicamento destinado a la terapia y la profilaxis del infarto de miocardio.

2. Utilización de la sustancia activa flupirtin o de sus sales utilizables farmacéuticamente, para la preparación de un medicamento destinado a la terapia y la profilaxis del riñón conmocionado.

3. Utilización de la sustancia activa flupirtin o de sus sales utilizables farmacéuticamente, para la preparación de un medicamento destinado a la terapia y la profilaxis del pulmón conmocionado.