JP5395024B2

JP5395024B2 - 脈絡膜血管新生の抑制方法

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Publication number: JP5395024B2
Application number: JP2010223994A
Authority: JP
Inventors: アランラティエス，; ロンウェン，; ジジュンルー，
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 2002-09-18
Filing date: 2010-10-01
Publication date: 2014-01-22
Anticipated expiration: 2023-09-18
Also published as: AU2003272471A1; US20090036479A1; US20050187241A1; EP2514420B1; US8618088B2; EP1539157A2; EP2514420A3; SI1539157T1; WO2004027027A3; PT1539157E; CA2498191A1; AU2010221791A1; CA2498191C; EP2514420A2; EP1539157B1; EP1539157A4; ES2428354T3; DK1539157T3; AU2003272471B2; ES2494791T3

Description

本発明は、望ましくない血管新生、例えば眼組織の血管新生を抑制するための組成物および方法に関する。特に眼疾患における脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）の治療のための組成物および方法を提供する。本発明は、ラパマイシン（シロリムス）およびタクロリムスに関して例示するが、その一方、望ましくない血管新生を抑制するための「リムス」化合物のファミリーの使用を提供する。

＜政府利権＞
本発明は、米国国立衛生研究所からの補助金Ｙ１２７２７により一部支援された。政府は本発明においてある種の権利を有する。

眼の網膜は、色を検出する網膜錐体および杆体を含有する。網膜の中心には、直径約１／３〜１／２ｃｍの黄斑が存在する。黄斑は特に中心（中心窩）において、錐体が高密度に存在するため、詳細な視力を提供する。血管、神経節細胞、内部核層および細胞ならびに網状層はすべて、一側に置き換えられ（錐体上に静止しているのではない）、それにより光をよりまっすぐに錐体に直進させる。

網膜下には、線維組織内に埋もれた血管の集まりを含む脈絡膜と、脈絡膜層を覆う濃色色素上皮が存在する。脈絡膜血管は、網膜に（特にその視細胞）に栄養を提供する。

現在の治療法が最適でない種々の網膜障害が存在する。網膜は裂けて、穴を形成し、そして下に有る脈絡膜から剥離し得る。

加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）は、米国における５５歳以上の個体に関する重症の視力損失の主因である。ＡＭＤは、萎縮性または（あまり一般的でない）滲出性形態で起こる。滲出性ＡＭＤでは、血管はブルック膜の欠損により脈絡毛細管板から、そしていくつかの場合には下にある網膜色素上皮から成長する（脈絡膜血管新生または血管新生）。これらの血管から流出する漿液性または出血性滲出物の組織化は、神経網膜の付随的変性を伴う黄斑領域の線維血管性瘢痕形成、網膜色素上皮の剥離および裂け目、硝子体の出血ならびに中心視力の恒久的損失を生じる。この過程は、ＡＭＤ患者における有意の視力損失の８０％より多くの症例に関与する。

米国特許第５，５２７，９０７号米国特許第６，３７６，５１７号米国特許第６，３２９，３８６号公開米国特許出願第２００２／０１２３５０５米国特許第６，３７６，５１７号米国特許第５，３８７，５８９号

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いくつかの研究では近年、ＡＭＤに関連した初期または再発性の新生血管性病変の治療におけるレーザー光凝固の使用を記載している（非特許文献１、非特許文献２）。残念ながら、レーザー治療を施された中心窩下病変を有するＡＭＤ患者は、３ヶ月追跡調査で視力のかなり急勾配の低減（平均３ライン）を経験した。さらに治療後２年目に、処置眼は、それらの非処置の対照より瑣末的に良好な視力を有しただけであった（それぞれ平均２０／３２０および２０／４００）。本手法の別の欠点は、術後の視力が直ちにいっそう悪くなることである。

脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）は、ほとんどの症例において治療に対して抵抗性があることを立証した。レーザー治療はＣＮＶを消散させ、そして網膜の中心を含まない選択症例において視力を維持するのに役立ったが、しかしこれは症例の約１０％のみに限定される。ＣＮＶを矯正するために利用可能な他の治療はない。残念ながら、上首尾のレーザー光凝固を用いる場合でも、新生血管形成は約５０〜７０％の眼において再発する（５０％が
３年を越えて、そして＞６０％が５年で）（非特許文献４）。さらにＣＮＶはレーザー治療には大きすぎるため、あるいは位置が確定され得ず、したがって医者が正確にレーザーを向けることができないため、ＣＮＶを発症する多数の患者は、レーザー療法のための良好な候補でない。したがって本発明までは、脈絡膜血管新生を防止するかまたは有意に抑制する方法の必要性があると長い間思われていた。

ＡＭＤのほかに、脈絡膜血管新生は、以下のような網膜障害により引き起こされる：推定眼ヒストプラスマ症候群、近視性変性、色素線条または眼性外傷。網膜および硝子体内新生血管形成に関連した血管新生性損傷は、広範な疾患、例えば糖尿病性網膜症、静脈閉塞、鎌状赤血球網膜症、未熟児網膜症、網膜剥離、眼性虚血および外傷において起こる。

上記の文書の引用は、上記のいずれかが関連従来技術であるということを承認するものではない。これらの文書の日付に関する記述あるいは内容に関する表現は全て、本出願人に利用可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関するいかなる承認もなさない。

本発明は、望ましくない血管新生、特に加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）およびヒストプラスマ症候群のような眼性疾患に関連した脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を抑制するのに有効である組成物および方法を提供する。血管新生を抑制するための本発明の組成物は、脈絡膜における血管新生を抑制するために、イムノフィリンファミリーの細胞タンパク質の成員、例えばシクロフィリンおよびＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）と結合する「リムス」ファミリーの化合物中の活性作用物質を含む。「リムス」ファミリーの化合物の成員としては、シロリムス（ラパマイシン）およびその水溶性類似体ＳＤＺ−ＲＡＤ、タクロリムス、エベロリムス、ピメクロリムス、ＣＣＩ−７７９（Wyeth）、ＡＰ２３８４１（Ariad）およびＡＢＴ−５７８（Abbott Laboratories）ならびにそれらの類似体および誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の治療量の活性作用物質は、種々の異なる経路により患者に投与し、そして安全であり且つ内部部位に血管新生抑制を提供する投与量で投与して良い。したがって本発明は、本発明の１つまたは複数の活性作用物質を含む組成物を投与することにより、望ましくない、そして制御されていない血管新生を特徴とする哺乳類の疾患の治療方法を提供する。本発明の特定の一実施形態では、眼の脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を抑制するかまたは治療する方法を提供する。

したがって本発明は、ある種の眼性新生血管性疾患、例えば加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）を含む黄斑変性、を治療するために特に有用である。本発明は、血管が脈絡膜中のそれらの正常位置から網膜下の望ましくない位置に増殖する湿潤型ＡＭＤの治療または抑制に特に有用である。これらの新血管からの漏出および出血は、視力損失を、そしておそらくは失明をもたらす。本発明は、乾燥型のＡＭＤ（この場合、網膜色素上皮またはＲＰＥは変性し、光受容体細胞の死ならびに網膜下のドルーゼンと呼ばれる黄色沈着物の形成をもたらす）から湿潤型のＡＭＤへの移行を抑制するための方法も提供する。したがって本発明は、乾燥型のＡＭＤの治療のための方法も提供する。

本発明に用いるために意図する化合物は、疾患の進行を停止し、そして新生血管形成の低減または退行を可能にするために患者に投与される。本発明を用いて治療され得るその他の疾患としては、糖尿病性網膜症、新生血管性緑内障および水晶体後線維増殖症が挙げられるが、これらに限定されない。

したがって、そして第一の態様では、本発明は、ヒトまたは動物の網膜における望ましくない血管新生ならびに新生血管形成を抑制するための化合物、組成物、キットおよび方法を提供する。第二の態様では、本発明は、被験体における血管新生または脈絡膜血管新生により媒介される疾患のための治療法を提供する。さらなる態様では、本発明は、湿潤型のＡＭＤを予防し、抑制しまたは治療するための、例えばそれに関連した視力損失を抑制するための方法を提供する。

本発明の別の態様は、血管新生、新生血管形成および湿潤型のＡＭＤの治療ならびにそれに関連した視力の損失を低減するために既知のその他の方法と組合せた上記の方法の使用である。さらに本発明は、付加的な抗血管新生、抗新生血管形成および抗ＡＭＤ化合物の迅速な同定のための検定法として適用され得る脈絡膜血管新生の身体ならびに動物モデルにおける親油性染料の使用による血管の可視化のための方法を提供する。

本発明の利点および新規の特徴は、以下の説明、実施例および図面に一部が記述されているが、それらは全て、例示のみのためであるよう意図され、いかなる点でも本発明を限定するものではなく、また、一部が以下の検査に関して当業者に明らかになり、あるいは本発明の実施により知り得る。

網膜血管の三次元再構築を示す。スケールバー：１００μｍ。マトリゲル注入眼の組織におけるＣＮＶを示す。スケールバー：１００μｍ。ラパマイシンによるＣＮＶ形成の抑制を示す。スケールバー：１００μｍ。

本発明の好ましい形態の詳細な説明
本発明は、血管新生および新生血管形成を含む障害、例えば眼障害、特に網膜障害、例えば黄斑変性、脈絡膜血管新生等、および上記のような網膜における、あるいは網膜とその下にある脈絡膜組織との間における、または脈絡膜組織を含む網膜における障害の治療のための方法を提供する。本方法は、大環状ラクトンシロリムス（ラパムン（登録商標）(Wyeth-Ayerst)として市販）としても既知である免疫抑制剤のラパマイシンに関する新規の使用を含む（非特許文献５参照）。メルクインデックス（Merck Index）, 第１２版（非特許文献６）によれば、ラパムンは、ＲＡＰＡ、ＲＰＭ、シロリムス、ＡＹ２２９８９およびＮＳＣ−２２６０８０としても既知である。

シロリムスは免疫抑制剤として既知であるが、しかし原発性および転移性腫瘍の状況では抗血管新生化合物として報告されている（非特許文献７および非特許文献８）。それらの研究においては、他の型の新生血管形成、例えば脈絡膜血管新生に関する考察はない。代わりに、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）およびその血清レベルの関与についての考察がある。ＶＥＧＦは、多数の適応症に関連する因子であるが、それらに対する療法が上記の適応症を治療するのに有効であるという確実性を伴わない。例えばＶＥＧＦはＡＭＤにおける病原性の新血管の形成に関与すると示唆されているが、しかしＶＥＧＦ活性はＡＭＤに関して動物モデルで試験されたことはない。したがってＶＥＧＦ活性を標的化することによりＡＭＤを治療する能力は依然として実験段階である。

シロリムスの使用のほかに、本発明は、血管新生および新生血管形成を治療するための、その他のイムノフィリン結合化合物ならびにラパマイシン誘導体および類似体の使用を提供する。このような化合物の例としては、ＳＤＺ−ＲＡＤ、タクロリムス、エベロリムス、ピメクロリムス、ＣＣＩ−７７９（Wyeth）、ＡＰ２３８４１（Ariad）およびＡＢＴ−５７８（Abbott Laboratories）ならびに米国特許第５，５２７，９０７号（特許文献１）、第６，３７６，５１７号（特許文献２）および第６，３２９，３８６号（特許文献３）に記載されたものが挙げられるが、これらに限定されない。更なる誘導体としては、公開米国特許出願第２００２／０１２３５０５（特許文献４）に開示されたものが挙げられる。これらの文書は全て、これらの記載内容が完全に参照により本明細書中に援用される。

本発明は、血管新生または新生血管形成、特にＣＮＶの治療のための他の作用物質および治療薬と組合せた上記の作用物質の使用も提供する。このような付加的な作用物質および治療薬の例としては、ピロリジン、ジチオカルバメート（ＮＦκＢ阻害剤）；スクアラミン；ＴＰＮ４７０類似体およびフマギリン；ＰＫＣ（プロテインキナーゼＣ）阻害剤；Ｔｉｅ−１およびＴｉｅ−２キナーゼ阻害剤；ＶＥＧＦ受容体キナーゼの阻害剤；プロテオソーム阻害剤、例えばベルケード（商標）（ボルテゾミブ、注射用）；ラニブズマブ（ルセンチス（商標））および同一標的に対するその他の抗体；ペガプタニブ（マキュゲン（商標））；ビトロネクチン受容体アンタゴニスト、例えばビトロネクチン受容体型インテグリンの環状ペプチドアンタゴニスト；α−ｖ／β−３インテグリンアンタゴニスト；α−ｖ／β−１インテグリンアンタゴニスト；チアゾリジンジオン、例えばロシグリタゾンまたはトログリタゾン；インターフェロン、例えばγ−インターフェロン、あるいはデキストランの使用および金属配位によりＣＮＶに対して標的化されるインターフェロン；色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）；エンドスタチン；アンギオスタチン；酢酸アネコルタブ；アセトニド；トリアムシノロン；テトラチオモリブデート；ＶＥＧＦ発現を標的化するリボザイムを含む血管新生因子のＲＮＡサイレンシングまたはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）；アキュタン（商標）（１３−シスレチン酸）；ＡＣＥ阻害剤、例えばキノプリルまたはペリンドズリル；ｍＴＯＲ（ラパマイシンの哺乳類標的）の阻害剤；３−アミノサリドマイド；ペントキシフィリン；２−メトキシエストラジオール；コルヒチン；ＡＭＧ−１４７０；シクロオキシゲナーゼ阻害剤、例えばネパフェナク、ロフェコキシブおよびジクロフェナク；ｔ−ＲＮＡシンターゼモジュレーター；メタロプロテアーゼ１３阻害剤；アセチルコリンエステラーゼ阻害剤；カリウムチャンネル遮断剤；エンドレペリン；６−チオグアニンのプリン類似体；環状ペルオキシドＡＮＯ−２；（組換え）アルギニンデイミナーゼ；エピガロカテキン−３−ガレート；セリバスタチン；スラミンの類似体；ＶＥＧＦトラップ分子；ビスダイン（商標）および光力学的治療（ＰＤＴ）を伴うその他の光線感作物質；ならびにレーザー光凝固が挙げられるが、これらに限定されない。

「黄斑変性」は、黄斑および網膜におけるまたはその下の線維血管性沈着物の過剰蓄積、ならびに網膜色素上皮（ＲＰＥ）の萎縮および／または除去を特徴とする。ラパマイシンの投与は、このような治療なしでは起こり得る加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）における過剰血管新生、例えば脈絡膜血管新生を抑制すると思われる。本明細書中で用いる場合、「血管新生」という用語は、組織または器官中への新血管の生成（「新生血管形成」）を意味する。眼または網膜の「血管新生媒介性疾患または症状」は、眼または網膜において病原的に新血管が生成されて、視力の損失またはその他の問題、例えばＡＭＤと関連した脈絡膜血管新生を生じるものである。

本発明の方法は、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏでラパマイシンおよび／またはその他の活性作用物質を用いた好ましい実施形態を含む。ｉｎｖｉｔｒｏで投与する場合、本方法は、例えば網膜または脈絡膜組織または細胞中での新生血管形成または血管新生を制御するかまたは低減する活性に関して付加的な候補活性作用物質に関してスクリーニングし、またはその作用を検定するために用いられる。これは、付加的な抗血管新生またはＣＮＶ剤に関する有用な検定として用いることができる。ｉｎｖｉｖｏで投与される場合、本方法は、例えばＡＭＤで典型的に観察される脈絡膜血管新生を発症する素因を持つ患者を治療し、あるいはこのような患者における脈絡膜血管新生を予防しまたは抑制するために、あるいはＡＭＤ患者における脈絡膜血管新生を低減するために用いられる。予防、抑制および低減は、脈絡膜血管新生における本発明の活性作用物質の作用に関してそれらの通常の意味を与えられる。素因を有するかまたは予防を必要とする患者は、当該技術分野で確立された方法および判定基準により当業者により同定され得る。当業者はまた、望ましくない血管新生および／または新生血管形成を同定するための当該技術分野における確立された判定基準に基づいた抑制または治療を必要とする個体を容易に診断し得る。

薬剤の有効量は、求められる治療作用を提供する量であり、例えばラパマイシンまたは薬剤等価物の治療に有効な用量は、ＡＭＤ患者における脈絡膜血管新生を低減する量、あるいはＡＭＤの素因を有する患者または素因を有さない場合でも、ＡＭＤの初期兆候を示す患者における脈絡膜血管新生を抑制するかまたは完全に予防する量である。したがって治療に有効な用量は、ラパマイシンで治療される全ての患者において同一であるというわけではない。有効量は、本発明により開示されるようなそのためのモデルまたは検定における血管新生または新生血管形成を抑制する薬剤の量も指す。

「患者」は、好ましくは本発明の好ましい方法により治療されなければ、滲出性ＡＭＤに関連した脈絡膜血管新生を有するかまたは発症し得る被験体を指す。このような患者は、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはヒトであるが、しかし本発明の方法はモデル実験動物および獣医学的動物被験体に対する適用でもある。

本発明の活性作用物質、例えばラパマイシンは、好ましくは経口的に、静脈内に、局所的に、眼内に、筋肉内に、局在的にまたは眼用具中に投与され得る。さらに好ましくは投与方式は、以下から選択される：眼内注入、網膜下注入、強膜下注入、脈絡膜内注入、結膜下注入、局所投与、経口投与および非経口投与。最も好ましくは活性作用物質は、網膜下注入により網膜領域に直接投与されるが、しかし同等に有効である低侵襲性投与方式が開発され得る。長時間に亘る時限放出または遅延放出のための処方物も、本発明により提供される。

活性作用物質の投与量は、治療される症状、特定の作用物質、ならびにその他の臨床因子、例えばヒトまたは動物の体重および症状、作用物質の投与経路に応じて決まる。本発明はヒトおよび獣医学的使用の両方のための用途を有する、と理解されるべきである。ヒトへの投与に関しては、有効投与量は脈絡膜血管新生を抑制するものである。ラパマイシンの場合、用いられ得る抑制量は、一般に約０．１〜３００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくは約１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。種々の症状を治療するための本発明の種々の作用物質の投与量は、本発明に関する臨床試験の使用により改良され得る。さらに本発明の実施のための用量範囲は、米国特許第６，３７６，５１７号および第５，３８７，５８９号に開示されたものを含む（これらの記載内容は完全に、参照により本明細書中に援用される）。

本発明の活性作用物質、例えばラパマイシンは、慣用的薬学的操作、例えば滅菌に付され得るし、および／または慣用的アジュバント、例えば防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤等を含有し得る。作用物質はまた、薬学的組成物を製造するために、臨床的使用のための薬学的に許容可能な賦形剤とともに処方され得る。経口投与に適した本発明の処方物は、離散単位、例えば各々予定量の活性成分を含有するカプセル、サッシェまたは錠剤として；粉末または顆粒として；水性液または非水性液中の溶液または懸濁液として；あるいは水中油型液体エマルションまたは油中水型エマルションとして、ならびにボーラス剤等として提示され得る。言い換えれば本発明の活性作用物質は、本明細書中に記載された症状のいずれかの治療のための医薬剤を調製するために用いられ得る。

投与のために、活性作用物質、例えばラパマイシンは、指示投与経路に適した１つまたは複数のアジュバントと組合され得る。活性作用物質は、ラクトース、スクロース、デンプン粉末、アルカン酸のセルロースエステル、ステアリン酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウムおよびカルシウム塩、アラビアゴム、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンおよび／またはポリビニルアルコールと混合され、そして慣用的投与のために錠剤化されるかまたは封入され得る。あるいは本発明の化合物は、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液、エタノール、トウモロコシ油、落花生油、綿実油、ゴマ油、トラガカントゴムおよび／または種々の緩衝液中に溶解され得る。その他のアジュバントおよび投与方式は薬学的技術分野で既知であり、本発明の実施に用いられ得る。担体または希釈剤として、時間遅延物質、例えばモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリル（単独、あるいは蝋または当該技術分野で既知のその他の物質を伴う）を含んでも良い。

本発明の処方物としては、経口、眼（例えば硝子体内または眼房内）、鼻、局所（例えば頬および舌下）または非経口（例えば皮下、筋肉内、皮内、気管内および硬膜上）投与に適したものを含む。処方物は、好都合には単位剤形で提示され、慣用的薬学的技法により調製され得る。このような技法としては、活性成分と薬学的担体（単数または複数）または賦形剤（単数または複数）とを会合させる過程を含む。概して処方物は、活性成分を液体担体または微粉砕固体担体あるいはそれらの両方と均一に且つしっかり会合させて、次に、必要な場合には、生成物を造形することにより調製される。

本発明の別の態様でさらに提供するのは、治療に有効な量の活性作用物質、例えばラパマイシンと眼または眼組織への投与に適した薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物である。

さらに、本発明の治療に有効な量の活性成分、例えばラパマイシンを含む少なくとも１つのバイアル、ならびに眼または眼組織への投与に適した薬学的に許容可能な担体を含む第二のバイアルを含むキットを提供する。本発明のその他のキットは、本明細書中に開示された方法の実施に用いるための本発明の活性作用物質のような構成成分を含み、この場合、本方法に利用される各々１つ以上の種々の試薬（典型的には濃縮形態で）、例えば緩衝剤、ならびに必要な場合にはその他の試薬を含有する容器も含まれる。本発明の方法におけるキット構成成分を説明するラベルまたは標示、あるいはその使用のための一組の使用説明書も典型的には包含され、この場合、使用説明書はキットまたはその構成成分の包装挿入物および／またはパッケージに付随しても良い。

本発明に従って治療され得る網膜／脈絡膜血管新生に関連する疾患としては、糖尿病性網膜症、黄斑変性、未熟児網膜症、網膜炎または脈絡膜炎を引き起こす感染、推定眼性ヒストプラスマ症候群、近視性変性、色素線条、眼性外傷およびＡＭＤが挙げられるが、これらに限定されない。本発明に従って治療され得るその他の疾患および望ましくない症状の例としては、弾性線維性仮性黄色腫、静脈閉塞、動脈閉塞、頚動脈閉塞性疾患、鎌状赤血球網膜症、イールズ病、近視、慢性網膜剥離、過粘稠度症候群、トキソプラズマ症、外傷およびレーザー後合併症が挙げられるが、これらに限定されない。その他の疾患としては、ルベオーシスに関連した疾患（隅角の新生血管形成）、ならびに線維血管性または線維性組織の異常増殖により引き起こされる疾患、例えば全形態の増殖性硝子体網膜症（糖尿病に関連または無関連のいずれにせよ）が挙げられるが、これらに限定されない。

望ましくない症状の治療のための組成物および方法のほかに、本発明は、身体中の血管の可視化のための方法も提供する。このような方法は、後の可視化のために身体中の血管を検出可能に標識する方法としても考えられ得る。血管可視化のための組織試料を処理するための慣用的方法は、労働集約的であり且つ多くの時間を要する。組織調製における効率を向上させるために、血管ペインティング（vessel painting）と呼ばれる技法を本発明により提供する。血管ペインティングの基本概念は、蛍光染料で血管の内張りを選択的に染色することである。血管は、親油性染料で直接染色され得る脂質二分子膜である内皮細胞膜で裏打ちされる。この技法の鍵は、特別に処方された溶液である血管ペイントであり、これは親油性染料を含有する。このような染料はモレキュラープローブス（Molecular Probes）から入手可能であり、それらの例としては、ニューロンのトレーサーとして用いられる長鎖ジアルキルカルボシアニンおよびジアルキルアミノスチリル染料であるＤｉＩ、ＤｉＯ、ＤｉＯ、ＤｉＤ、ＤｉＡおよびＤｉＲが挙げられるが、これらに限定されない。血管ペイントによる動物の心臓内灌流と、その後の、任意の固定剤溶液、例えば４％パラホルムアルデヒド溶液(これに限定されない)中での洗浄により、血管が即時に染色される。組織は、灌流直後に蛍光顕微鏡により観察できる。染色は、異なる倍率の対物レンズを用いて高コントラストな画像が得られるよう、極めて低いバックグラウンドを有し、顕著に明るい。

本発明は、眼性新生血管形成の動物モデルも提供する。モデルは以下で詳細に考察されるが、しかし一般にそれは、動物の眼の網膜下間隙への物質の注入を基礎とする。眼性疾患のための任意の適切な非ヒト動物モデルが用いられ、注入物質は、細胞培養実験における再構築基底膜として広範に用いられるネズミＥＨＳ（Engelbreth-Holm-Swarm）腫瘍からの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質の抽出物であるマトリゲル（商標）から、ラット尾コラーゲンＩ、ウシコラーゲンＩおよびヒトコラーゲンＩの単一溶液（例えばBDBiosciencesから入手可能）までの範囲であり得る（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１を参照）。コラーゲンのその他の供給源、例えば０．１×ＤＭＥ、ｐＨ４．０（Life TechnologiesからのＤＭＥ粉末をＮａＨＣＯ₃を用いずに、しかしｐＨ色指示薬を用いて、１０×溶液を作製し、ＨＣｌを用いてｐＨを４．０に調整し、次にこの溶液を水で希釈して、０．１×ＤＭＥ溶液を作製する）ならびに１０％酢酸溶液中に溶解される凍結乾燥コラーゲン（例えばRocheからのラット尾コラーゲン）を用いることにより生成されるものが用いられ得る。

理論に縛られることなく、本発明の理解を高めるために提案されると考えると、コラーゲン（またはタンパク質）溶液の注入は、新血管の侵襲を誘導するための網膜下間隙への注入後にＡＭＤで起こる異常沈着物を模倣するのに十分である。このような動物モデルは、血管新生、新生血管形成（ＣＮＶ）およびＡＭＤに対する活性に関して本発明の候補活性作用物質をスクリーニングするために有益に用いられ得る。このような方法の例としては、上記動物への候補作用物質の投与（本明細書中に開示された任意の方法による）、ならびに上記動物における血管新生または新生血管形成に及ぼす作用（増加、低減、無変化）の判断を含む方法が挙げられるが、これらに限定されない。

以下の実施例は、本発明の製造および使用方法の十分な開示および説明を当業者に提供するために示されており、本発明者らが自己の発明とみなすものの範囲を限定するものでもなく、あるいは以下の実験が実施される全てのそして唯一の実験であることを表すものでもない。用いられる数値（例えば量、温度等）に関する精度を保証するために努力がなされてきたが、しかしいくつかの実験的誤差および偏差は考慮されるべきである。別記しない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、そして圧力は大気圧または大気圧にほぼ等しい圧力である。

＜実施例１＞
マトリゲル（商標）ベースの動物モデル
本出願内では、別記しない限り、利用される技法はいくつかの既知の参考文献、例えば以下の参考文献のいずれかに見出すことができる（非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４）。

ＣＮＶのための有効な治療の探索に際して、１０μｌハミルトン微小注射器に連結された３３ゲージ針を用いて、成体スプラーグ−ドーリーラットの網膜下間隙に２〜３μｌのマトリゲル（商標）を注射することにより、簡便な動物モデルを作製した。１週間後またはそれ以後に、ＣＯ₂吸入により動物を屠殺し、作用物質、例えば化学化合物およびタンパク質を、ＣＮＶの抑制におけるそれらの能力に関してスクリーニングし得る本発明者らの実験室で近年開発された新規の可視化技法である血管ペイントで灌流した（非特許文献１５）。血管ペインティングは、ＤｉＩを含有する溶液と、その後の４％パラホルムアルデヒド溶液の使用を包含し、以下でさらに考察される。

眼の前方部分、例えば角膜および水晶体を除去し、眼杯を５％アガロース中に包埋した。眼の連続厚切り切片（１００μｍ）をビブラトームで切断し、スライドガラス上に載せた。マトリゲル（商標）沈着物中の新生血管形成に関して、蛍光顕微鏡により眼の切片を検査した。共焦点顕微鏡を用いて、連続光学切片を得た。オートビジュアリズ（Auto Visualiz）−３Ｄ（Autouant Imaging, Inc.）を用いて、新規発達血管の三次元再構築を達成した。エバンスブルー染料の静脈内注射後のマトリゲル（商標）沈着物における色変化を評価することにより、新規血管のタンパク質漏出を検出した。

マトリゲル（商標）注射後７日目という早期に新生血管形成を観察し、注射した眼の全てにおいてマトリゲル（商標）注射後１０日目には広範なＣＮＶが明白であった。専ら脈絡膜毛管から生じる新規の血管はマトリゲル（商標）沈着物を侵襲し、マトリゲル（商標）注射後１４日目に広範な網状構造を形成した。三次元再構築は明らかに、新規血管が脈絡膜から生じたことを示した。マトリゲル（商標）沈着物は、淡白色の周囲組織と比較して、エバンスブルー注射後に淡青色に変色したが、このことは、バリアの欠如を示す。マトリゲル（商標）注射の３０日後に、円盤型瘢痕を観察した。

したがって網膜下マトリゲル（商標）沈着物は、網膜下間隙におけるＣＮＶを誘導し、滲出または湿潤型ＡＭＤにおいて観察される病態を模倣し、それによりＣＮＶの病態を探索するための、そして潜在的な治療法を試験するための改良型動物モデルを提供する。

＜実施例２＞
ＣＮＶの抑制
モデルの初期の特性化に際して、新生血管形成の生成におけるマトリゲル（商標）に対する炎症反応の潜在的な関与が存在する、と推測した。その結果、２つの既知の免疫抑制剤、シクロスポリンおよびラパマイシンを試験した。

シクロスポリン（マトリゲル（商標）注射の４日前〜注射後１０日間、１５ｍｇ／ｋｇ／日を投与）の経口投与は、ＣＮＶに影響を及ぼさなかった。しかしながらそれとは大きく異なり、経口ラパマイシン（ラパムン（登録商標）、マトリゲル（商標）注射の４日前〜注射後１０日間、１．５ｍｇ／ｋｇ／日を投与）は、試験した１６の眼においてＣＮＶ発症の完全抑制に起因した。ラパマイシンは、経口溶液として商業的に入手可能であり、Wyeth-Ayerstによりラパムン経口溶液として市販されている。したがって局所投与によるラパマイシンの抗ＣＮＶ特性をさらに調べた。

ラパマイシンは水に可溶性でないため、ＤＭＳＯ中に溶解する（８眼で試験）かまたはＰＢＳ中に懸濁し（６眼で試験）、次にマトリゲル（商標）と混合した。混合マトリゲル（商標）含有ラパマイシンを網膜下間隙に注射した。２５μｇ／μｌラパマイシン（あるいは３０μｇ／注射。各注射は１．２μｌのマトリゲル（商標）を用いたため）の用量で、ラパマイシン処置眼においてＣＮＶの完全抑制が再び認められた。

さらなる実験において、そして上記の方法を用いて、ラパマイシンの量を２．５μｇ／μｌに低減した。この量で（「濃度」という語は、ラパマイシンが水に可溶性でないため、用いられない）、ラパマイシンの結晶は、１０日後でさえ、明らかに可視であった。各々の場合、処置眼においては検出可能な新生血管形成は存在しなかった。不溶性に伴う問題（その問題が在る場合）は、本発明の可溶性活性作用物質、例えばＳＤＺ−ＲＡＤ（これに限定されない）の使用により対処され得る。

したがってラパマイシンは、ヒト患者においてＣＮＶを抑制するかまたは予防する可能性を有する。さらにラパマイシンの局所投与は明らかに、ＣＮＶ治療への実際的アプローチであり、これは、全身投与の不利な影響を与える可能性がある場合に、特に有益である。

＜実施例３＞
血管ペインティング
ＣＯ₂過剰投与により屠殺した正常３か月齢スプラーグ−ドーリーラットからの網膜を血管ペイント（ＤｉＩ、０．１ｍｇ／ｍｌ）により灌流し、その後４％パラホルムアルデヒドを用いて灌流した。網膜を切り出して、同一固定剤液中で１時間、固定して、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中ですすぎ、スライドガラス上に平らに封入する（flat-mounted）。ニコンＥ８００顕微鏡で顕微鏡写真を撮った。

平坦封入(flat-mount)網膜の顕微鏡写真は、血管が明るく染まり、低バックグラウンドであることを示した。内皮細胞核も染色され、容易に同定可能であった。血管系の空間的構造は良好に保存され、深部網膜毛管も見えた。

血管網状構造は、その三次元性を示すための画像により良好に識別される。血管系の良好な３−Ｄ画像は、腐食−成型（corrosion-casting）技法および走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて得られる（非特許文献１６参照）。しかしながら腐食成型は、ＳＥＭと同様に、技術的に難しく、時間がかかる。代わりに３−Ｄ画像は、共焦点顕微鏡により多数の連続光学切片から再構築され得る。血管ペインティングによる明るい染色および高いシグナル対ノイズ比は、レーザー走査共焦点顕微鏡により１００〜１５０μｍという厚さの試料の連続光学切片を得ることを可能にし、低倍率の対物レンズを用いる場合でも、試料の底部からのシグナルの有意の低下を伴わない。異なる視角度での高品質の３−Ｄ画像は、市販のソフトウェアを用いて多数の２−Ｄデジタル画像から再構築され得る。図１は、上記のように処理された平坦封入網膜の３−Ｄ再構築画像を示す。Bio-RadＭＲＣ−１０２４共焦点顕微鏡で２０×対物レンズを用いた共焦点顕微鏡により、Ｚ軸（ｚステップ＝１μｍ）に沿った多数の７８光学切片を撮った。３−Ｄ画像を再構築して、０°（図１Ａ）または１８０°（図１Ｂ）の角度での網膜血管系を示した。これらの図はともに、深部毛管との連結を有する網膜表面の動脈を表す。

＜実施例４＞
マトリゲル（商標）注入領域におけるＣＮＶ
マトリゲル（商標）は、ネズミＥＨＳ（Engelbreth-Holm-Swarm）腫瘍からの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質の抽出物であり、細胞培養実験において再構築基底膜として広範に用いられる。それは、ｉｎｖｉｖｏ検定であるマトリゲル（商標）プラグ検定において血管新生または抗血管新生性作用物質を評価するためにも用いられる（非特許文献１７）。病理学的試験は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）とブルック膜との間の位置におけるＣＮＶと細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の異常沈着物との間の会合を示す。ＡＭＤにおいて起こる異常沈着物を模倣するために、ラットの網膜下間隙にマトリゲル（商標）を注入した。マトリゲル（商標）注入直後に、新血管がマトリゲル（商標）沈着物を侵襲する。

以下において、スプラーグ−ドーリーラットの眼への注射により、マトリゲル（商標）を網膜下間隙に導入した。注射後の所定時間に、動物を屠殺し、血管ペイントで、その後、４％パラホルムアルデヒド溶液で灌流した。眼の前方部分を除去し、次に眼杯を５％アガロース中に包埋した。連続横断切片（１００μｍ厚）をビブラトームで切断した。

脈絡膜毛管から生じる新血管が、マトリゲル（商標）注射後４日目という早期に検出可能であり、注射後１０日目までに十分に発達するようになった。マトリゲル（商標）注射後１０日目の２ヶ月齢動物からの眼の横断切片のＤＩＣ画像を図２Ａに示す。脈絡膜および網膜血管系と一緒にＣＮＶを示すために、ＤＩＣ画像を光学切片と重ね合わせた（図２Ａ）。新血管は単一部位でブルック膜を貫通し（黄色矢頭）、次にＲＰＥおよび網膜間のマトリゲル（商標）層中に分枝する。多数の４２光学切片をこの試料から撮影し、３−Ｄ画像を再構築した（図２Ｂ）。３−Ｄ画像は明らかに、新血管が単一貫通部位（黄色矢頭）を通って脈絡膜毛管から生じたことを示した。

エバンスブルー検定により、新規に生成した血管の透過性を評価した。１０日前にマトリゲル（商標）を眼に注射しておいたスプラーグ−ドーリーラットに、エバンスブルー（ＰＢＳ中６０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射した。脈絡膜−網膜標本を切り出して、平坦封入し、蛍光顕微鏡で観察した。エバンスブルー染色はマトリゲル（商標）注射領域のみに観察され、このことは、新血管の漏出性を示す。

＜実施例５＞
ラパマイシンによるＣＮＶの抑制
マトリゲル（商標）モデルを用いた潜在的な抗血管新生作用物質の初期スクリーンにおいて、ラパマイシンは、新血管形成を抑制する顕著な能力を実証した。免疫抑制剤として臨床的に用いられるラパマイシン（カハンＢＤ（Kahan BD） (2001) シロリムス：包括的レビュー（非特許文献１８）は、ＦＫＢＰ（ＦＫ５０６結合タンパク質）と結合して、ＦＫＢＰ−ラパマイシン複合体を形成し、これが次に、細胞増殖の中心制御物質であるｍＴＯＲ（ラパマイシンの哺乳類標的）の機能を抑制する（非特許文献１９）。ラパマイシンは内皮細胞増殖を（非特許文献２０）、そしてＶＥＧＦ（非特許文献２１）ならびにｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）およびＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）に対する応答を抑制する。ツァオ等（Cao et al.）(1995) 増殖因子に刺激された血管平滑筋細胞のＤＮＡ合成におけるラパマイシンの影響。塩基性線維芽細胞増殖因子および血小板由来増殖因子活性の抑制とＦＫ５０６によるラパマイシンの拮抗作用（Effects of rapamycin on growth factor-stimulated vascular smooth muscle cell DNA synthesis. Inhibition of basic fibroblast growth factor and platelet-derived growth factor action and antagonism of rapamycin by FK506）. Transplantation 59 (3): 390-5（非特許文献２２）、およびルイグロク等（Ruygrok et al.）(2003) ラパマイシンと循環器系内科（Rapamycin and cardiovascular medicine）. Intern. Med. J. 33(3): 103-9（非特許文献２３）を参照。腫瘍血管新生を遮断することも示されている（非特許文献２４）。

成体スプラーグ−ドーリーラット（ｎ＝２２）の網膜下間隙にマトリゲル（商標）を注射した。マトリゲル（商標）注射の４日前に開始して、３ｍｇ／ｋｇの用量で１日１回、ラパマイシンを動物に給餌した。マトリゲル（商標）注射後１０日目（ｎ＝１８）または２０日目（ｎ＝４）に眼を回収し、実施例４に記載したように処理した。蛍光顕微鏡により、組織切片を検査した。１０日目に回収した眼において、ラパマイシン処置動物で網膜下間隙に侵襲する新血管を含有したものはなかった。２０日目の群では、新規に形成した多少の血管がマトリゲル（商標）領域に侵襲し始めた。この群におけるＣＮＶの量を（＋）として半定量した。比較に際して、対照動物（１０日目）におけるＣＮＶを、図２に示したように（＋＋＋〜＋＋＋＋）として等級分けした。

別の動物群では、ラパマイシンをマトリゲル（商標）（懸濁液、１μｇ／μｌ、ｎ＝６；１０μｇ／μｌ、ｎ＝１１）と混合し、マトリゲル（商標）（ゲル中送達（in-gel delivery））と網膜下間隙に同時注射した。注射後１０日目に眼を回収し、実施例４に記載したように処理した。ゲル中送達によりラパマイシンで処理した眼のいずれにもＣＮＶは見出されなかった。図３は、網膜下間隙中のラパマイシン粒子を示すために組織回収の１０日前に高用量（１０μｇ／μｌ懸濁液）でマトリゲルおよびラパマイシンを注射した眼の切片のＤＩＣ画像を示す。マトリゲル（商標）中のラパマイシン粒子はＤＩＣ画像に明瞭に見られるが、これを血管ペイントの共焦点画像に重ね合わせて、脈絡膜および網膜血管を示す。ＣＮＶはラパマイシンを注射したいずれの眼においても見出されなかった。

全実験において、ラパマイシンは眼の正常血管系に及ぼす識別可能な作用を有さなかった。同じく免疫抑制剤であるシクロスポリンは、同一実験例により経口投与(１００ｍｇ／ｋｇ／日、ｎ＝３)またはゲル中（２５μｇ／μｌ、ｎ＝３）投与した場合、ＣＮＶ形成を抑制しなかった。

＜実施例６＞
ＦＫ５０６タクロリムス処理眼におけるＣＮＶ指数
水溶性でないＦＫ５０６を、１０μｇ／μｌでマトリゲル（商標）（懸濁液として）と混合し、１．２μｌを上記のように網膜下間隙に注射した。注射後１０日目に眼を回収し、血管を血管ペイントで染色した。眼を５％アガロース中に包埋し、ビブラトームで連続切片を切断した（１００μｍ厚）。蛍光顕微鏡によりＣＮＶを検査し、各眼のＣＮＶ指数を算定した。結果を以下に示す。

ＦＫ５０６平均＝１２．６７（ｎ＝６）ＳＥＭ＝２．７６

対照平均＝３２．００（ｎ＝１０）ＳＥＭ＝６．４１

スチューデントｔ検定Ｐ＝０．０４２

したがってＦＫ５０６は、ＣＮＶを６０％抑制した。

本明細書中で引用した参考文献、例えば特許、特許出願および出版物は全て、上記に具体的に援用したか否かにかかわらず、これらの記載内容は参照により本明細書中に援用される。

ここに詳細に本発明を説明してきたが、本発明の精神および範囲を逸脱しない限り、そして過度の実験を伴わずに、広範囲の等価のパラメーター、濃度および条件内で、同様の実施をし得ることが当業者に理解されるであろう。

本発明をその特定の実施形態とともに説明してきたが、さらなる修正がなされ得ることが理解されるであろう。本出願は、概して本発明の原理に従って、本発明に関する当該技術分野内の既知のまたは慣例的実施内に入るような、そして本明細書中に記載した本質的特徴に当てはまり得るような本発明の開示からの逸脱を含めて、本発明の任意の変更、使用または適応を網羅するよう意図される。

Claims

脈絡膜血管新生を抑制または予防するための、目または目の組織に投与するのに適した医薬組成物であって、前記医薬組成物が、治療に有効な量のラパマイシンおよび薬学的に許容可能な担体を含み、前記脈絡膜血管新生が加齢性黄斑変性において起こり、投与方法が、眼内注入、網膜下注入、強膜下注入、脈絡膜内注入、結膜下注入、および硝子体内注入からなる群から選択される、医薬組成物。
投与方法が結膜下注入又は硝子体内注入である、請求項１に記載の医薬組成物。
血管形成又は新生血管形成の治療のための他の作用物質を含む、請求項１又は２に記載の医薬組成物。