KR101906494B1

KR101906494B1 - 콜라겐 타입 ι 및 색소 상피성 인자 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 신생혈관질환 예방 또는 치료용 약학조성물

Info

Publication number: KR101906494B1
Application number: KR1020170071521A
Authority: KR
Inventors: 박세광; 노국환; 김연예; 김현웅; 안기정
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2017-06-08
Filing date: 2017-06-08
Publication date: 2018-12-05
Also published as: US11197918B2; WO2018226058A2; EP3636275A4; EP3636275A2; WO2018226058A9; CN110869045A; US20210077599A1; CN110869045B; WO2018226058A3; EP3636275B1

Abstract

본 발명은 콜라겐 및 색소 상피성 인자(Pigemented Epithelium Derived Factor)를 유효성분으로 함유하는 신생혈관질환 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 콜라겐 타입 Ⅰ과 PEDF 병용 투여를 통하여 PEDF의 짧은 항혈관신생 활성주기에 증가시키고, PEDF의 투여 용량 범위를 확장시킬 수 있으므로, 종래의 PEDF 잦은 주입에 따른 불편함과 그에 따른 부작용 문제를 해결할 수 있으며, 다양한 혈관신생질환 치료제로 적용이 가능하다.

Description

콜라겐 타입 Ι 및 색소 상피성 인자 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 신생혈관질환 예방 또는 치료용 약학조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating angiogenic diseases comprising collagen type Ι and pigemented epithelium derived factor peptide}

본 발명은 콜라겐 타입 Ι 및 34-mer 색소 상피성 인자 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 신생혈관질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

황반은 망막의 중심부에 위치한 신경조직으로 시세포의 대부분이 이곳에 모여 있으며, 물체의 상이 맺히는 곳으로 중심시력을 담당한다. 황반변성은 나이가 들면서 진행되는 경우가 많은 안구질환으로 황반 부분에 변성이 일어나 시력장애를 일으키는 질환으로, 발병 초기에는 시야가 흐려지고 가까운 곳의 시력이 뒤틀려서 보이다가 나중에는 실명에 이르게 된다.

나이관련 황반변성(Age-related macular degeneration)은 최근 65세 이상 노인에게서 가장 흔한 실명의 원인이며, 세계 3위의 실명유발 질병으로, 세계적으로 3 천만명 정도가 이병으로 고통받고 있으며, 매년 50 만명의 환자가 이 질병으로 인해 시력을 잃고 있다.

우리나라에서도 65세 이상의 16.5%가 초기 황반변성을 앓고 있음, 고령인구의 증가로 유병율이 점차 증가하고 있다. 발병 시기 또한 60대에서 4, 50대의 중장년층으로 낮아지고 있는 추세이다.

나이관련 황변변성은 크게 위축성과 삼출성 두 가지 유형으로 분류되는데 위축성 유형은 황반변성의 90%를 차지하며 황반부의 망막색소상피 등의 이상이 나타나 중심시력이 서서히 떨어지는 질환으로, 현재까지는 금연, 자외선 차단 및 황산화제 복용 이외의 시력저하를 회복시키는 치료방법은 전무한 상태이다.

또한, 삼출성은 나이관련 황반변성의 10% 정도를 차지하며 위축성 유형보다 시력장애가 빠르고 심각하게 나타난다. 삼출성의 경우, 맥락막혈관신생, 망막색소상피박리, 감각망막박리, 망막색소상피 파열들의 안저소견을 동반하며, 나이관련 황반변성으로 인한 실명의 70~90%가 삼출성 병변에 의한 것으로 알려져있다.

색소상피성 인자(Pigment epithelium derived factor; PEDF)는 항신생혈관 효과를 나타내는 단백질로, 혈관신생에 의한 다양한 질환의 치료제로 고려되는 물질이며, 현재 PEDF를 황반변성 치료제로 사용하기 위한 연구가 진행되고 있으나, 짧은 반감기에 따른 반복적인 주입이 필요하고, 질병 치료를 위해 적용될 수 있는 농도 범위가 좁다는 문제점이 지적되고 있다. 이에 따라, 상기 PEDF의 문제점을 해결하여 황반변성 치료 효과를 극대화할 수 있는 연구가 필요한 실정이다.

한국공개특허 제2005-0120714호(2005년 12월 22일 공개)

본 발명은 색소 상피성 인자 펩타이드의 항혈관신생 효과를 증진시키기 위해, 콜라겐 타입 Ⅰ을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공하며, 콜라겐 타입 Ⅰ및 색소 상피성 인자 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 안구 신생혈관질환 예방 또는 치료제로 제공하고자 한다.

본 발명은 콜라겐 타입 Ⅰ을 유효성분으로 함유하며, 색소 상피성 인자(Pigemented Epithelium Derived Factor)의 항혈관신생 효과를 증진시키는 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 콜라겐 타입 Ⅰ 및 서열번호 1로 표시되는 아미노산으로 이루어진 색소 상피성 인자(Pigemented Epithelium Derived Factor)를 유효성분으로 함유하는 신생혈관질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 34-mer 색소 상피성 인자 펩타이드와 콜라겐 타입 Ⅰ을 병용 투여할 경우, 34-mer 색소 상피성 인자 펩타이드를 고용량으로 처리하였을 때 나타나는 혈관신생 효과가 억제되고 항혈관신생 효과가 장기간 유지되는 것이 확인됨에 따라, 콜라겐 타입 Ⅰ은 34-mer 색소 상피성 인자 펩타이드의 운반체 또는 어주번트(adjuvant)로 활용할 수 있다. 또한, 콜라겐 타입 Ⅰ과 34-mer 색소 상피성 인자 펩타이드가 병용 투여될 경우, 34-mer 색소 상피성 인자 펩타이드의 짧은 항혈관신생 활성주기를 증가시켜 종래의 잦은 주입에 따른 불편함과 그에 따른 부작용 문제를 해결할 수 있으며, 색소 상피성 인자의 투여 용량 범위를 확장시킬 수 있으므로, 다양한 혈관신생질환 치료제로 적용이 가능하다.

도 1은 HUVECs 세포모델에서 34-mer 색소 상피성 인자(Pigemented Epithelium Derived Factor; PEDF) 펩타이드와 돼지에서 분리된 콜라겐 타입 I의 투여농도에 따라 관 형성을 억제하는 효과를 확인한 결과로, 도 1A 및 1B는 재조합 사람 VEGF-165를 처리하여 관 형성을 유도시킨 HUVECs 세포에 대조군으로 아바스틴(avstin) 0.2 mg/ml과 0.02, 0.2, 0.4, 1 및 5 pmol/ml의 34-mer 색소 상피성 인자 펩타이드를 각각 처리하고 4시간 배양한 후 각 그룹의 관 형성 정도를 확인한 결과이며, 도 1C 및 1D는 VEGF-165에 의해 유도된 HUVECs 세포에 콜라겐 타입 I을 0.01, 0.05, 0.1% 농도로 처리하고 4시간 후 각 그룹의 관 형성 정도를 확인한 결과이다.
도 2는 레이저 조사를 통하여 망막 병변을 유도시킨 마우스 동물모델에서 34-mer 색소 상피성 인자 펩타이드와 콜라겐 타입 Ⅰ의 투여농도에 따라 병변의 크기를 확인한 결과로, 도 2A 및 2B는 대조군에는 PBS를 처리하고, 실험군은 0.01, 0.05, 0.1, 10 pmol의 34-mer 색소 상피성 인자 펩타이드를 각각 안구 내 주사로 5일 동안 투여하고 레이저 조사 후 14일째에 현미경으로 촬영한 사진과 신생혈관의 크기를 정량화한 그래프이며, 도 2C 및 2D는 대조군에는 PBS를 처리하고, 실험군에는 0.1, 0.5 및 1%의 콜라겐 타입 I을 각각 안구 내 주사로 투여하고 레이저 조사 후 14일째 현미경으로 촬영한 사진과 신생혈관의 크기를 정량화한 그래프이다.
도 3은 HUVECs 세포모델에서 34-mer 색소 상피성 인자 펩타이드 운반체로 콜라겐 타입 Ⅰ의 활용 가능성을 확인한 결과로, 도 3A 및 3B는 재조합 사람 VEGF-165를 처리하여 관 형성을 유도시킨 HUVECs 세포모델에 0.05 및 0.1% 콜라겐 타입 Ⅰ과 34-mer 색소 상피성 인자 펩타이드 0.02, 0.2, 1, 10, 50, 100, 200, 500 및 1000 pmol/ml을 각각 혼합하여 투여하고 각 실험군의 관 형성 정도를 형광현미경으로 촬영한 결과중 대표적인 이미지 결과이며, 각 실험군의 관 형성 정도를 정량한 그래프이다.
도 4은 HUVECs 세포모델에서 34-mer 색소 상피성 인자 펩타이드의 적합한 운반체를 확인하기 위해, 히알루론산 (hyaluronic acid, HA), 젤라틴 및 콜라겐 타입 Ⅰ을 단독 또는 34-mer 색소 상피성 인자 펩타이드와 혼합하여 세포에 처리한 후 관형성 억제 효능을 확인한 결과로, 도 4A 및 4B는 재조합 사람 VEGF-165를 처리하여 관 형성을 유도시킨 HUVECs 세포모델에 0.1% 콜라겐 타입 Ⅰ, 0.1% 히알루론산 및 0.1% 젤라틴을 0.02, 0.2, 1, 10, 50, 100, 200 및 500 pmol/ml 농도의 34-mer 색소 상피성 인자 펩타이드와 각각 혼합하여 투여하고 각 실험군의 관 형성 정도를 형광현미경으로 촬영한 결과중 대표적인 이미지 결과이며, 각 실험군의 관 형성 정도를 정량한 그래프이다.
도 5는 레이저 조사를 통하여 신생혈관 형성이 유도된 동물모델에서 34-mer 색소 상피성 인자 펩타이드 운반체로 콜라겐 타입 Ⅰ의 활용 가능성을 확인한 결과로, 도 5A는 동물 모델의 실험 스케줄을 나타낸 것으로, 레이저 조사 후 0.05 pmol 34-mer 색소 상피성 인자 펩타이드 단독 또는 0.1% 콜라겐 타입 I 단독 또는 0.25, 2.5, 25, 50, 100 및 200 pmole 34-mer 색소 상피성 인자 펩타이드와 0.1% 콜라겐 타입 I을 혼합하여 투여된 시기를 나타낸 모식도이며, 도 5B 및 5C는 상기 방법으로 처리된 각 실험군에서 생성된 신생혈관의 크기를 확인한 결과이다.
도 6는 레이저 조사를 통하여 신생혈관 형성이 유도된 동물모델에서 34-mer 색소 상피성 인자 펩타이드와 콜라겐 타입 Ⅰ 혼합물의 항신생혈관 효과가 콜라겐 타입 Ⅰ의 존재 때문인지 확인한 결과로, 도 6A와 B는 0.1% 콜라겐 타입 I 단독 처리군과 25 pmol의 34-mer 색소 상피성 인자 펩타이드 단독 처리군 및 0.1% 콜라겐 타입 I과 25 pmol 34-mer 색소 상피성 인자 펩타이드 혼합물 처리군의 항 신생혈관 효과를 촬영한 사진과 신생혈관 크기를 정량화한 그래프이다.
도 7은 레이저 조사 후 7일째 되는 시점에 신생혈관이 완전히 형성된 이후 34-mer 색소 상피성 인자 펩타이드와 콜라겐 타입 Ⅰ 혼합물을 처리하여 항신생혈관 효과를 확인한 결과로, 도 2, 5 및 6에서는 레이저 조사 후 바로 투여하여 확인한 예방 효과 확인 개념의 실험이었다면, 도 7은 치료효과 확인 개념의 실험이다. 도 7A는 동물 실험의 스케줄을 나타낸 것으로, 레이저 조사 후 7일째 되는 날 0.1% 콜라겐 타입 I 단독 처리 혹은 25 pmol 34-mer 색소 상피성 인자 펩타이드 단독 처리 및 0.1% 콜라겐 타입 I과 25 pmol 34-mer 색소 상피성 인자 펩타이드 혼합물 처리 시기를 나타낸 모식도이며, 도 7B와 C는 상기 방법으로 처리된 각 실험군에서 생성된 신생혈관의 크기를 확인한 결과이다.
도 8은 HUVECs 세포에서 34-mer 색소 상피성 인자 펩타이드와 콜라겐 타입 I 혼합물의 작용기전을 확인한 결과로, 도 8A 및 8B는 HUVECs 세포에 재조합 사람 VEGF-165를 처리한 후 0.2 또는 1 pmol/ml 34-mer 색소 상피성 인자 펩타이드 단독 처리군과 0.05% 콜라겐 타입 I과 1 pmol/ml 34-mer 색소 상피성 인자 펩타이드 혼합물 처리군을 웨스턴 블롯 실험을 수행하여 각각의 그룹이 영향을 미치는 작용 기전을 확인한 결과이며, 상기 결과를 통하여 VEGF 신호전달 기전에 포함되는 JNK, p38, ERK와 같은 MAPK 신호전달 기전과 Akt 신호전달 기전을 확인하였고, 색소 상피성 인자의 신호전달 기전 중 Wnt/beta-catenin 신호전달 기전을 확인하였다. 도 8C는 HUVECs 세포의 관 형성 실험을 통하여, 도 8A 및 8B에서 확인된 신호 기전의 억제제를 사용하여 관 형성이 신호기전에 의존적인지 확인하였다.
도 9는 콜라겐 타입 I 및 34-mer 색소 상피성 인자 펩타이드 혼합물의 투과성을 확인한 결과로, PBS에 0.05, 0.1 및 0.2% 농도로 녹인 콜라겐 타입 I을 34-mer 색소 상피성 인자 펩타이드와 각각 혼합한 혼합물에 380~780 nm 가시광선파장에서 10nm 단위로 흡광도를 측정하여 각 혼합물의 투과성을 확인한 결과이다.

상기 콜라겐 타입 Ⅰ은 돼지에서 분리된 것일 수 있다.

상기 색소 상피성 인자는 서열번호 1로 표시되는 아미노산으로 이루어진 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 34-mer 색소 상피성 인자 펩타이드일 수 있다.

또한, 본 발명은 콜라겐 타입 Ⅰ 및 서열번호 1로 표시되는 아미노산으로 이루어진 색소 상피성 인자(Pigemented Epithelium Derived Factor)를 유효성분으로 함유하는 신생혈관질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.

상기 약학조성물은 안구 내 혈관 생성을 억제할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 레이저를 조사를 통하여 망막 병변이 유도된 실험동물에 0.1, 0.5 및 1% 농도의 돼지 유래 콜라겐 타입 Ⅰ을 투여하고 콜라겐의 혈관신생 억제 효과를 확인한 결과, 도 2C 및 도 2D와 같이 콜라겐의 처리 농도가 증가할수록 혈관신생이 억제되기보다 증가되는 것으로 나타났다.

상기 결과로부터 고농도의 콜라겐은 혈관신생을 억제하기 위한 치료제로 부적합한 것으로 확인되었다.

그러나 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 재조합 사람 VEGF-165 처리에 의해 관 형성이 유도된 HUVECs 세포에 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드를 단독 투여하거나 콜라겐 타입 Ⅰ과 혼합하여 투여한 결과, 도 3과 같이 0.2 pmol/ml 농도의 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드 단독 투여군과 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드 및 콜라겐 혼합 투여군에서 관 형성 억제 효과가 유사하게 나타났으나, 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드가 단독으로 투여된 실험군에서는 처리된 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드 농도가 증가할수록 관 형성이 급격하게 증가한 반면, 콜라겐 타입 Ⅰ과 고농도의 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드가 혼합투여된 실험군에서는 관 형성 억제효과가 지속적으로 나타났다.

콜라겐 타입 Ⅰ은 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드와 결합할 수 있는 부위를 통하여 결합하지만 콜라겐 타입 II 등 다른 타입과는 결합능이 떨어진다. 또한 안구 유리체액에는 콜라겐 타입 II가 대부분 존재하므로 콜라겐 타입 Ⅰ의 사용을 통하여 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드를 투여하는 것이 유리하다 (Meyer et al. 2002 J Biol Chem 22; 45400-45407).

또한, 레이저를 조사를 통하여 망막 병변이 유도된 실험동물에 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드를 단독으로 투여하거나 0.1% 농도의 돼지 유래 콜라겐 타입 Ⅰ과 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드를 혼합투여한 후 콜라겐의 혈관신생 억제 효과를 확인한 결과, 도 5와 같이 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드 단독 투여군과 0.1% 콜라겐 및 25 pmol 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드 혼합물 투여군의 혈관신생 억제효과가 유사하게 나타나는 것으로 확인되었다. 상기 결과로부터 저농도의 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드를 5회 투여하였을 때 나타나는 효과와 고농도의 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드를 콜라겐 타입 Ⅰ과 혼합하여 1회 투여하였을 때 유사한 효과를 나타내는 것이 확인되었다.

따라서 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드와 콜라겐 타입 Ⅰ을 혼합하여 투여할 경우, 색소상피성 인자가 고용량으로 처리되었을 때 나타나는 혈관신생 효과가 억제되고, 색소상피성 인자의 투여횟수를 감소시키면서 항혈관신생 효과를 장기간 유지시킬 수 있음이 확인되었다.

상기 신생혈관질환은 각막 신생혈관질환, 당뇨병성 망막증, 맥락막 신생혈관질환 및 나이관련 황반변성으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 보다 바람직하게는 나이관련 황반변성일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 약학조성물은 색소 상피성 인자 0.01~50 중량% 및 콜라겐 타입 Ⅰ 50~99.99 중량%를 포함할 수 있다.

상기 약학조성물은 서열번호 1로 표시되는 아미노산으로 이루어진 색소 상피성 인자 및 콜라겐 타입 Ⅰ을 약제학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하여 점안제 형태의 안약; 젤 형태의 안연고 또는 주사제로 제공할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 콜라겐 타입 Ⅰ 및 서열번호 1로 표시되는 아미노산으로 이루어진 색소 상피성 인자를 유효성분으로 포함하는 신생혈관질환 예방 또는 치료용 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.

상기 펩타이드의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실험예 1> 관 형성 분석(Tube formation assay)

48-웰 플레이트를 200 μl 마트리겔(Matrigel)로 코팅하고 37℃에서 1시간 유지시켰으며, HUVECs 세포는 37℃에서 15분간 칼세인(Calcein)-AM으로 염색하였다.

염색된 HUVECs 세포를 마트리겔로 코팅된 플레이트의 각 웰에 2×10⁴ 세포로 분주하고, 재조합 사람 VEGF-165를 각 웰에 처리하여 세포의 관(tube) 형성을 유도하였다.

그 후, 콜라겐 타입 Ⅰ(collagen type I alpha 1, partial [Sus scrofa] GenBank: AAR03833.1) 및 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드(DPFFK VPVNK LAAAV SNFGY DLYRV RSSTS PTTN: 서열번호 1)를 각각 단독 처리하거나, 혼합 처리하고, 37℃에서 4시간 동안 배양한 후, 각 그룹의 관 형성 정도를 확인하였다.

관 형성 정도 확인은 Micromanipulator (Olympus)를 이용한 사진 촬영을 수행하고, 관의 길이를 측정하여 비교하였다.

< 실험예 2> 맥락막 신생혈관 형성 모델 제작

5 내지 8 주령 C57BL/6 마우스를 오리엔트에서 구입하여 사용하였다.

각 마우스에 5 mg/mL 트로피카마이드(Tropicamide; santen pharmaceutical co. ltd, Kita-ku, Osaka, Japan) 점안액을 사용하여 동공을 팽창시키고, 100 mg/kg 케타민(ketamine; Huons, SEONGNAM-SI, GYEONGGI-DO, Korea)과 10 mg/kg 자일라진(xylazine; BAYER, Leverkusen, Germany)을 복강 내에 주사하여 마취하였다.

마취 후 마우스 고정대에 마우스를 고정시키고, 세극등 현미경 레이저 시스템을 이용하여 150~210 mW 세기의 레이저를 0.1초간 조사하여 50~100 μm 사이즈의 병변을 마우스의 망막에 3, 6, 9 및 12시 방향으로 총 4개의 병변을 제작하였다. 이때 레이저 조사 시 방울이 맺히듯 만들어야 하는데, 이는 Bruch's 막을 파괴하여 신생혈관(CNV)을 형성하는데 중요하다.

망막에 병변이 제작된 직후, 대조군에는 PBS, 실험군에는 콜라겐(collagen) 타입 Ⅰ, 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드 및 콜라겐 타입 Ⅰ과 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드의 혼합물을 마우스 눈의 유리체 내에 주사하고, 1일 또는 5일간 1일 1회 동일한 방법으로 투여하였다.

레이저 조사 후 14일째 케타민 (100 mg/kg) 및 자일라진(10 mg/kg)을 사용하여 각 실험군의 마우스를 마취하고, 25 mg/ml 농도의 FITC-dextran (sigma aldrich, St. Louis, MO, USA) 100 μl를 retro-orbital에 주입하여 30분간 망막 혈관을 염색하였다.

염색된 안구를 분리하여 10% 포르말린(formalin)에 넣어 30분간 고정시킨 후, 현미경 상에서 고정된 안구의 망막이 다치지 않게 조심스럽게 안구 주위의 근육, 각막, 홍채, 수정체 및 유리체를 제거하고, 3, 6, 9 및 12시 방향으로 4부분을 절개한 후 커버슬립(Coverslip)을 덮고, 형광 현미경을 통해 병변을 촬영한 후, 크기를 측정하여 대조군과 비교하였다.

< 실시예 1> 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드의 한계점 확인

34-mer 색소상피성 인자 펩타이드 (서열번호 1)의 항신생혈관 효과를 실험예 1의 관 형성 분석 실험 및 실험예 2의 맥락막 신생혈관 모델에서 확인하였다.

그 결과, 도 1A와 1B와 같이 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드 0.2pg/ml 가 처리된 실험군에서는 관 형성 억제 효과가 최대로 나타났으나, 그 이상의 고농도로 처리된 경우 관 형성이 다시 증가하는 것으로 나타났다. 또한, 도 2A 및 2B와 같이 레이저에 의해 유도된 혈관신생(CNV) 모델에서는 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드가 0.01, 0.5 및 0.1 pmol로 처리된 경우 유의성 있게 감소되었으나, 10 pmol의 고농도로 처리된 경우 혈관신생(CNV)이 다시 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드는 관 형성을 억제하고, 레이저에 의해 유도된 혈관신생을 억제하는 효과를 나타내었으나, 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드가 고농도로 처리될 경우, 다시 혈관신생이 유도되는 것으로 확인됨에 따라, 혈관신생 억제를 위해 처리될 수 있는 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드의 농도가 매우 제한적인 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 2> 콜라겐 타입 Ι의 항혈관신생 효과 확인

콜라겐 타입 Ⅰ이 관 형성 및 혈관신생에 미치는 효과를 확인하기 위해, 실험예 1과 같이 준비된 HUVECs 세포에 돼지 콜라겐에서 추출된 콜라겐 타입 Ⅰ을 각각 0.01, 0.05 및 0.1% 농도로 처리하고 관 형성 정도를 확인하였다.

그 결과, 도 1C 및 1D와 같이 콜라겐의 농도 의존적으로 관 형성 억제가 나타났다.

그러나 망막 병변이 유도된 실험동물에 0.1, 0.5 및 1% 농도로 돼지에서 분리된 콜라겐 타입 Ⅰ을 투여하고 콜라겐의 혈관신생 억제 효과를 확인한 결과, 도 2C 및 도 2D와 같이 콜라겐 처리 농도가 증가할수록 혈관신생 크기가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 3> 관 형성 모델에서 콜라겐 타입 Ι과 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드 병용 처리 효과 확인

관 형성 모델을 통하여 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드 운반체로서의 콜라겐 타입 Ⅰ의 가능성을 확인하였다.

실험예 1과 같이 제작된 관 형성 모델에 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드를 단독 투여하거나 콜라겐 타입 Ⅰ과 혼합하여 투여한 결과, 도 3과 같이 0.2 pmol/ml 농도의 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드 단독 투여군과 콜라겐 타입 Ⅰ 혼합 투여군에서는 관 형성 억제 효과가 유사하게 나타났으나, 고농도의 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드가 단독으로 투여된 실험군에서는 관 형성이 급격하게 증가된 반면, 콜라겐 타입 Ⅰ과 고농도의 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드가 혼합처리된 실험군에서는 관 형성 억제효과가 지속적으로 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드의 좁은 처리농도 범위 문제점을 해결하기 위한 방법으로 콜라겐 타입 Ⅰ과의 병용투여가 제안될 수 있다.

< 실시예 4> 관 형성 모델에서 콜라겐 타입 Ι 또는 다른 약물운반체와 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드의 병용 처리 효과 확인

관 형성 모델을 통하여 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드의 가장 적합한 운반체를 확인하기 위해, 다양한 물질과 병용처리하였다.

HUVECs 세포의 관 형성 모델에 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드를 단독 투여하거나 콜라겐 타입 Ⅰ, 히알루론산 및 젤라틴과 각각 혼합하여 투여하고 관 형성 억제 효과를 확인하였다.

그 결과, 도 4와 같이 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드 단독 투여군과 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드와 콜라겐 타입 Ⅰ 혼합물을 처리한 모델군에서는 동일한 억제효과가 확인된 반면, 히알루론산과 혼합처리된 모델군에서는 유의성있는 관형성 억제효과가 확인되지 않았다. 또한, 젤라틴 단독 처리만으로도 관 형성이 증가하였으며, 젤라틴과 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드가 병용 투여된 경우 오히려 관형성이 증가가 되는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드의 치료 유효 농도 범위를 확장 시켜줄 수 물질로 콜라겐 타입 Ⅰ이 가장 적합한 것이 확인되었다.

< 실시예 5> 맥락막 신생혈관 형성 동물모델에서 콜라겐 타입 Ⅰ과 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드의 병용 처리 효과 확인

앞선 실험에서 확인된 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드 운반체로서의 콜라겐 타입 Ⅰ의 가능성을 맥락막 신생혈관 형성 동물모델에서 확인하였다.

먼저, 실험예 2와 같이 제작된 맥락막 신생혈관 형성 동물모델에 도 5A와 같은 방법으로 대조군에는 0.05 pmol 농도의 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드를 5회 주사하였으며, 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드 및 콜라겐 타입 Ⅰ 혼합물 투여군에는 0.1% 콜라겐 타입 Ⅰ과 0.25, 2.5, 25, 50, 100 및 200 pmol 농도의 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드를 1회 주사하였다.

그 결과, 도 5B 및 5C와 같이 고농도의 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드 및 콜라겐 타입 I 혼합물 투여군의 혈관신생 억제효과가 저농도의 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드 단독 투여군과 유사하게 나타났다.

상기 결과로부터 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드와 콜라겐 타입 I을 혼합하여 투여할 경우, 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드를 고용량으로 처리하였을 때 나타나는 혈관신생 촉진효과가 억제됨에 따라 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드 투여 횟수를 감소시키고, 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드의 항혈관신생 효과를 장기간 유지시킬 수 있음이 확인되었다.

한편, 상기 콜라겐 타입 I과 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드의 병용 처리 효과가 콜라겐 타입 I의 존재 때문인지를 확인하기 위해, 제작된 맥락막 신생혈관 형성 동물모델을 PBS 단독 투여 대조군, 0.1% 콜라겐 타입 I 단독 투여군, 25pmol 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드 단독 투여군 및 0.1% 콜라겐 타입 I과 25pmol 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드 혼합물 투여군으로 나누고 각각 레이저 조사 후 바로 1회 투여하였다.

그 결과, 도 6A 및 6B와 같이 각각의 단독 처리군에서는 대조군과 유사하게 혈관신생 억제효과가 거의 나타나지 않았으나 혼합물 처리군에서는 혈관신생 억제효과가 확인되었다.

상기 결과로부터 콜라겐 타입 I은 약물 투여 횟수를 감소시키면서 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드의 항혈관신생 효과를 유지시키는데 중요한 역할을 하는 것이 확인되었다. 따라서, 콜라겐 타입 Ⅰ은 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드의 약물 운반체 또는 어주번트(adjuvant)로써의 활용이 가능한 것이 확인되었으며, 콜라겐 타입 Ⅰ과 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드의 병용 투여는 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드의 짧은 항혈관신생 활성주기를 연장시켜 종래의 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드의 잦은 주입에 따른 불편함과 그에 따른 부작용 문제를 해결할 수 있으며, 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드의 투여 용량 범위를 확장시킬 수 있으므로, 다양한 혈관신생질환 치료제로 적용이 가능하다.

< 실시예 6> 신생혈관 형성이 완전히 이루어진 동물모델에서 콜라겐 타입 Ⅰ과 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드의 병용 처리 효과 확인

완전히 혈관이 생성된 동물모델에서 신생혈관 치료 효과를 확인하기 위해, 도 7A와 같이 제작된 맥락막 신생혈관 형성 동물모델에 레이저 조사 후 신생혈관 형성이 완전히 일어나는 7일째 되는 시점에 대조군에는 PBS를 단독 투여하였으며, 실험군은 0.1% 콜라겐 타입 I 단독 투여, 25 pmol 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드 단독 투여 및 0.1% 콜라겐 타입 I과 25 pmol 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드 혼합물을 각각 1회씩 투여하였다.

그 결과, 도 7B 및 7C와 같이 각각의 단독 처리군은 대조군과 유사한 수준으로 혈관신생 억제효과가 거의 나타나지 않았으나, 혼합물 처리군에서는 혈관신생 억제효과가 확인되었다.

상기 결과로부터 콜라겐 타입 I과 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드 혼합물은 이미 생성되어있는 신생혈관 역시 효과적으로 치료할 수 있음이 확인됨에 따라, 이미 진행된 신생혈관 질환 치료제로써의 적용이 가능하다.

< 실시예 7> 콜라겐 타입 I과 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드의 병용 처리 효과의 작용기전 확인

HUVECs 세포에 재조합 사람 VEGF-165를 처리하여 VEGF 신호전달 기전을 활성화 시킨 후 0.2 또는 1 pmol/ml 34-mer 색소 상피성 인자 펩타이드 단독 투여 및 0.05% 콜라겐 타입 I과 1 pmol/ml 34-mer 색소 상피성 인자 펩타이드 혼합물을 투여하고 웨스턴 블롯을 수행하여 신호전달 작용 기전을 확인하였다.

또한, VEGF에 의해 유도되는 HUVECs 세포의 관 형성을 확인된 작용 기전의 억제제를 사용하여 그 기전에 의존적인지 확인하였다.

그 결과, 도 8A 및 8B와 같이 콜라겐 타입 I과 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드 혼합물은 VEGF 신호전달 기전에 포함되는 JNK, p38, ERK와 같은 MAPK 신호전달 기전과 Akt 신호전달 기전 그리고 Wnt/beta-catenin 신호기전 같은 색소 상피성 인자의 신호전달 기전 중 JNK와 ERK 신호전달 기전의 활성화를 억제하는 것을 확인하였으며, 도 8C과 같이 HUVECs 세포의 관 형성 또한 JNK와 ERK의 억제제를 통해 감소되는 것을 확인하였다.

상기의 결과로부터 콜라겐 타입 I과 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드 혼합물은 JNK와 ERK 신호전달 기전과 밀접한 관련이 있으며, 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드의 항신생혈관 효능 기전 연구에 중요하게 적용될 수 있다.

< 실시예 8> 콜라겐 타입 Ⅰ 및 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드 혼합물의 투과성 확인

콜라겐 타입 Ⅰ 및 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드 혼합물이 치료효과를 나타내는 농도에서 가시광선 파장의 빛 투과도를 확인하여 치료제 주사 시 상기 혼합물이 기존 시야에 미치는 영향을 분석하였다.

콜라겐 타입 Ⅰ을 0.05, 0.1 및 0.2% 농도로 PBS에 용해시킨 후 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드와 혼합하여 380 내지 780nm 가시광선 파장에서 10 nm 단위로 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 9와 같이 콜라겐 타입 Ⅰ 및 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드 혼합물과 PBS의 가시광선의 파장 투과도가 유사한 것으로 확인되었다.

상기 결과로부터 콜라겐 타입 Ⅰ 및 34-mer 색소상피성 인자 펩타이드 혼합물 주사는 기존 시야를 방해하지 않는 것으로 확인됨에 따라, 효과적인 치료방법으로 이용될 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> inje university industry-academic cooperation foundation <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating angiogenic diseases comprising collagen type and pigemented epithelium derived factor peptide <130> ADP-2017-0030 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 34 <212> PRT <213> pigemented epithelium derived factor peptide <400> 1 Asp Pro Phe Phe Lys Val Pro Val Asn Lys Leu Ala Ala Ala Val Ser 1 5 10 15 Asn Phe Gly Tyr Asp Leu Tyr Arg Val Arg Ser Ser Thr Ser Pro Thr 20 25 30 Thr Asn

Claims

콜라겐 타입 Ⅰ을 유효성분으로 함유하며, 0.2 내지 50 pmol/ml 농도의 34-mer 색소 상피성 인자(Pigemented Epithelium Derived Factor)의 항혈관신생 효과를 증진시키는 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 콜라겐 타입 Ⅰ은 돼지에서 분리되는 것을 특징으로 하는 항혈관신생 효과를 증진시키는 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 34-mer 색소 상피성 인자는 서열번호 1로 표시되는 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 항혈관신생 효과를 증진시키는 조성물.
콜라겐 타입 Ⅰ 및 서열번호 1로 표시되는 아미노산으로 이루어진 34-mer 색소 상피성 인자(Pigemented Epithelium Derived Factor)를 유효성분으로 함유하며, 상기 콜라겐 타입 Ⅰ 이 0.2 내지 50 pmol/ml 농도의 색소 상피성 인자의 안구 내 혈관생성 억제 효과를 유지시키는 것을 특징으로 하는 안구 신생혈관질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 4에 있어서, 상기 콜라겐 타입 Ⅰ은 돼지에서 분리되는 것을 특징으로 하는 안구 신생혈관질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
삭제
청구항 4에 있어서, 상기 안구 신생혈관질환은 각막 신생혈관질환, 당뇨병성 망막증, 맥락막 신생혈관질환 및 나이관련 황반변성으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 안구 신생혈관질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 4에 있어서, 상기 약학조성물은 34-mer 색소 상피성 인자 0.01~50 중량% 및 콜라겐 타입 Ⅰ 50~99.99 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 안구 신생혈관질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 4에 있어서, 상기 약학조성물은 콜라겐 타입 Ⅰ 및 0.2 내지 50 pmol/ml 농도의 서열번호 1로 표시되는 아미노산으로 이루어진 34-mer 색소 상피성 인자 펩타이드를 약제학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하여 점안제 형태의 안약; 젤 형태의 안연고 또는 주사제로 제공되는 것을 특징으로 하는 안구 신생혈관질환 예방 또는 치료용 약학조성물.