KR102412681B1

KR102412681B1 - 다중 자극 반응성 블록 코폴리펩타이드 기반 약물전달체

Info

Publication number: KR102412681B1
Application number: KR1020200046902A
Authority: KR
Inventors: 임동우; 강민정
Original assignee: 한양대학교 에리카산학협력단
Priority date: 2019-04-18
Filing date: 2020-04-17
Publication date: 2022-06-27
Also published as: KR20200123026A

Abstract

본 발명은 다중 자극 반응성 약물전달체로서, 구체적으로, 온도와 pH 자극에 반응하여 나노구조체를 형성하고 붕괴할 수 있는 융합 폴리펩타이드와 이를 이용하여 제작된 약물전달체 등에 관한 것이다. 본 발명은 혈관신생을 억제할 수 있는 PEDF 34mer 펩타이드와 친수성 엘라스틴 기반 펩타이드 및 Histidine을 포함하는 소수성 엘라스틴 기반 펩타이드가 결합된 융합 폴리펩타이드를 제조하여, 중성 조건에서 상기 융합 폴리펩타이드로 코어-쉘 구조의 나노구조체를 제작할 수 있으며, 산성 조건에서 상기 나노구조체가 붕괴됨을 확인하였다. 이에, 본 발명은 혈관신생 억제와 함께 세포 내부에 유입되어 산성 조건에서 붕괴됨으로서 효과적으로 약물을 전달할 수 있는 다중 자극 반응성 약물전달체를 제공할 수 있다.

Description

다중 자극 반응성 블록 코폴리펩타이드 기반 약물전달체 {Multi-stimuli responsive block copolypeptide-based drug delivery systems}

본 발명은 다중 자극 반응성 약물전달체로서, 구체적으로, 온도와 pH 자극에 반응하여 나노구조체를 형성하고 붕괴할 수 있는 융합 폴리펩타이드와 이를 이용하여 제작된 약물전달체 등에 관한 것이다. 본 발명은 혈관신생을 억제할 수 있는 PEDF 34-mer 펩타이드와 친수성 엘라스틴 기반 펩타이드 및 소수성 엘라스틴 기반 펩타이드가 결합된 융합 폴리펩타이드를 제조하여, 중성 조건에서 상기 융합 폴리펩타이드로 코어-쉘 구조의 나노구조체를 제작할 수 있으며, 산성 조건에서 상기 나노구조체가 붕괴됨을 확인하였다. 이에, 본 발명은 혈관신생 억제와 함께 세포 내부에 유입되어 산성 조건에서 붕괴됨으로서 효과적으로 약물을 전달할 수 있는 다중 자극 반응성 약물전달체를 제공할 수 있다.

혈관신생(angiogenesis)은 조직이나 장기에 신규의 혈관을 제공하는 생물학적 과정으로, 구체적으로는 기존의 미세혈관으로부터 새로운 모세혈관이 생성되는 것을 의미하며 성장 후 체내에서 혈관이 생성되는 근본적인 과정이다. 인체에서 정상적으로 관찰되는 생리적 혈관신생은 배아 및 태아의 발달, 자궁의 성숙, 태반의 증식, 황체의 형성 및 상처의 치유와 같은 매우 제한된 상황에서만 일어나며, 이 시기에도 매우 엄격히 조절되어 필요한 기능이 달성되면 혈관신생은 중단된다. 신규한 혈관신생은 신생혈관생성 조절인자에 의해 엄격하게 조절되며, 신생혈관생성의 표현형은 신생혈관생성 자극인자의 상향조절(up-regulation) 및 신생혈관생성 억제인자의 하향조절(down-regulation) 사이의 전체적인 균형에 의하여 바뀐다고 보고되어 왔다.

혈관신생과 관련이 있는 질환을 크게 분류해 보면 관절염과 같은 염증성 질환, 당뇨병성 망막증과 같은 안과 질환, 건선(psoriasis)과 같은 피부과 질환 및 가장 대표적인 질환인 암으로 나눌 수 있다. 혈관신생에 의한 안과 질환으로는 노인성 퇴화반(macular degeneration), 당뇨병의 합병증으로 망막에 있는 모세혈관이 초자체를 침습하여 결국 눈이 멀게 되는 당뇨성 망막증(diabetic retinopathy), 조숙아의 망막증, 신생혈관 녹내장과 같은 질병 등이 있으며, 이러한 질병에 의하여 해마다 전 세계적으로 수백만 명이 실명하게 된다. 또한, 관절염은 자가면역 이상이 원인으로 작용하나 병이 진행하는 과정에서 활액강에 생긴 만성염증이 혈관신생을 유도한다고 알려져 있으며, 새로운 모세혈관이 관절을 침습하여 연골이 파괴되어 생기는 질병이다. 아울러, 건선도 피부에 생기는 만성의 증식성 질환인데, 빠른 증식을 하기 위해서는 많은 혈액이 공급되어야 하므로 혈관신생이 활발히 일어날 수밖에 없다.

또한, 비정상적인 혈관신생은 종양의 성장과 증식에 필요한 영양과 산소를 공급하는 역할을 하며, 종양까지 침투한 신생 모세혈관은 전이하는 암세포가 혈액순환계로 들어갈 수 있는 기회를 제공하여 암세포가 전이되도록 한다. 따라서, 혈관신생의 기전에 대한 연구 및 이를 억제할 수 있는 물질의 개발은 암의 예방 및 치료에 있어서 관심의 초점이 되고 있으며, 최근에는 동물의 암 모델과 인간의 임상실험에서 종양의 혈관신생 저해는 종양의 성장과 발달을 효과적으로 저해할 수 있고 환자의 생명을 연장할 수 있다는 사실이 증명되면서 혈관신생 억제제 개발에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

이러한 혈관신생 억제제는 항암 치료법에 있어서 특히 각광을 받고 있는데 이러한 이유로는 첫째, 혈관신생 억제제는 모든 고형성 종양에서 공통적으로 사용할 수 있는 가능성이 있고, 둘째, 기존의 항암 화학요법은 암 세포가 빠르게 성장하는 특징을 이용하여 치료하기 때문에 비교적 세포주기가 빠른 골수세포 및 위장관계 세포에 독성 작용을 나타내는 반면, 혈관신생 억제제는 장기 투여하여도 비교적 부작용이 적다는 장점이 있고, 셋째, 하나의 혈관세포는 수백 개의 암세포에 영양분과 산소를 공급하기 때문에 하나의 혈관세포 억제를 통해 많은 암세포를 억제할 수 있으며, 넷째, 기존의 항암 요법의 경우에는 항암제가 혈관 밖으로 유출되어 암세포에 영향을 나타내는 반면, 혈관신생 억제제는 직접적으로 혈관 내피세포에 접촉하여 작용함으로써 약물 전달을 용이하게 할 수 있다는 장점을 가지고 있기 때문이다.

암, 안과질환, 관절염, 및 건선 등과 같은 과도한 혈관신생과 관련된 질환은 혈관신생을 억제하는 것이 근원적인 치료방법이 될 것이나, 현재 사용되고 있는 혈관신생 억제제는 일반적으로 유기합성의 방법으로 제조된 것이어서 그 효과가 만족스럽지 못하고 부작용 또한 심한 문제가 있다. 이에 따라, 약학적 특성이 높고 부작용이 적은 혈관신생 억제제 개발에 대한 연구가 필요한 실정이었다.

한편, 혈관신생 억제의 전략으로는 두 가지가 있다. 혈관신생을 유도하는 신호를 방해하는 전략과, 색소상피유래인자(pigment epithelial-derived factor, PEDF)와 같은 혈관신생 저해제를 사용하여 항-혈관신생 신호를 활성화하는 전략이다.

PEDF는 항-혈관신생 신호를 활성화할뿐만 아니라 혈관신생 저해제로서 혈관신생의 균형을 유지하는 역할을 하며, 신경영양(neurotrophic) 및 항종양(antitumorigenic) 특성을 가진다. PEDF의 두 종류의 조각 (fragment)들인 (1) 34-mer 펩타이드(amino acid residues: 44-77) 및 (2) 44-mer 펩타이드(amino acid residues: 78-121) 의 두 기능적인 부분은 몇가지 메커니즘을 통해 규명되었다. PEDF 44-mer 펩타이드는 혈관 누출(vascular leakage)을 막고, 정상 세포에서 신경영양 기능을 가지며, 종양 세포에서 신경내분비계 분화(neuroendocrine differentiation) 및 신경세포 퇴화(neurite outgrowth)를 유발한다.

PEDF 34-mer 펩타이드는 다양한 경로를 통해 항-혈관신생 및 항종양 기능을 가진다. PEDF 34-mer 펩타이드는 c-jun-NH2 kinases (JNK)를 활성화하고, nuclear factor of activated T cells (NFAT)를 불활성화한다. 활성화된 JNK는 세포사멸(apoptosis)를 위해 내생의 카스페이즈 저해제(endogenous caspase inhibitor) 및 cellular FLICE (FADD-like IL-1β-converting enzyme)-inhibitory protein (c-FLIP)의 발현을 방해하고 NFAT의 불활성화 상태를 복원한다. 불활성화된 NFAT는 신혈관 생성 억제를 위해 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF) 및 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 유도 전사를 방해한다. PEDF 34-mer 펩타이드는 F1-ATP 합성효소의 catalytic β-subunit과 결합 친화력이 있으며, 이는 ATP 합성효소 활성을 저해하기 위함이다. 세포 표면의 ATP 부족은 종양 성장 및 침입의 제한을 초래한다. PEDF 34-mer 펩타이드는 내피세포막의 라미닌(laminin) 수용체와 결합 친화력이 있다. 라미닌은 내피세포 아래 위치한 기초적인 막 중 하나인 바닥판(basal lamina)의 주요 구성요소이다. 라미닌 수용체를 포함한 PEDF 34-mer 펩타이드는 내피세포의 세포사멸을 야기하고 튜브 형성을 저해한다.

EBP(elastin based peptide)는 온도 민감성을 가진 폴리펩타이드이며, EBP의 특정 클라스는 자가조립 나노구조체에 사용된다. 엘라스틴(elastin)은 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)의 단백질의 주요 구성성분이며, 탄성중합체 도메인(Elastomeric domain)과 교차결합 도메인(Crosslinking domain)으로 구성되어 있다. 탄성중합체 도메인은 소수성 아미노산과 VPGG, VPGVG, 및 APGVGV와 같은 반복적인 펩타이드로 이루어진다. EBPs는 탄성중합체 도메인을 기반으로 자극-반응성, 생체적합성, 생분해성, 및 비면역성을 가지도록 고안되었다. EBPs는 열 반응성이 있는 바이오중합체로서, 많은 '펜타펩타이드 반복 유닛'인 (Val or Ile)-Pro-(Gly or Ala)-X_aa-Gly으로 구성되어 있으며, 이 때 X_aa는 반복적인 상기 유닛에서 4번째 아미노산으로 Pro를 제외한 어떤 아미노산이든 가능하다. EBPs는 하한 임계 용액 온도(Lower critical solution temperature, LCST) 거동을 가져 온도에 따라 가역적인 상전이를 보인다. 그들의 LCST 거동은 EBPs의 열적으로 유발되는 상전이를 사용하는, 단백질 정제 방법론에 기초한 역 전이 순환(Inverse Transition Cycling, ITC)이 가능하다는 장점이 있다. EBPs의 용이한 정제와 자극-유발 상전이는 다른 기능적인 단백질 및 펩타이드의 유전적 융합을 가능하게 한다. 예를 들어, EBPs는 자가절단 단백질(Self-cleaving protein)인 인테인(Intein)과 유전적으로 융합하는 방법으로 친화크로마토그래피(Affinity chromatography) 또는 단백질 가수분해 태그 제거 없이 클로로페니콜 아세틸전달효소(Chloramphenicol acetyl transferase, CAT) 또는 티오레독신(Thioredoxin, Trx)과 같은 표적 단백질의 산출을 증가하기 위해 단백질 정제 태그로서 사용되었다. 가용성의 EBPs는 폴리에틸렌글리콜(poly(ethylene glycol), PEG)과 같은 '비활성의 단백질-기반 바이오재료'와 첨단 약물 전달 시스템, 재생의학, 및 조직공학을 위해 약물 또는 다른 기능적인 단백질과 함께 '약물 전달체(Drug delivery carriers)'로서 기능할 수 있다.

본 발명자들은 종전 연구에서 PEDF의 항-혈관신생 기작의 활성화 기능을 포함한 복합적 작용과 EBP의 자가조립(self-assembly) 기능을 이용한 신혈관 생성 억제용 약물 전달체로서의 융합단백질 및 이로 이루어진 나노구조체를 제공하였다. 이에, 본 발명자들은 종양 조직, 종양 세포 내, 엔도솜(endosomes) 및 라이소좀(lysosomes)과 같은 산성 조건에 반응하여 약물을 전달할 수 있는 pH 민감성 나노구조체 제조를 위하여 예의 연구하여 본 발명을 완성하였다.

KR 10-2017-0115929

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 온도와 pH 자극에 민감하게 반응하는 자가조립 가능한 융합 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 융합 폴리펩타이드의 자가조립으로 형성된 나노구조체를 약물 전달체로 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 융합 폴리펩타이드에 혈관신생 억제 기능의 펩타이드를 결합시켜 혈관신생에 기인한 질환의 치료용 약학적 조성물 제공을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 친수성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(elastin based polypeptide: EBP); 및 상기 친수성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드에 연결되는 소수성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드;를 포함하는 융합 폴리펩타이드을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 융합 폴리펩타이드의 친수성 EBP는 종양 성장, 암세포 전이, 및/또는 혈관신생 억제능이 있는 펩타이드에 연결된 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 혈관신생 억제능이 있는 펩타이드는 색소상피유래인자(epigment epithelial-derived factor: PEDF) 유래 펩타이드일 수 있으며, 상기 PEDF 유래 펩타이드는 서열번호 6의 34-mer 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 친수성 EBP는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 블록을 연속적으로 3~36 회 반복하여 포함할 수 있고, 바람직하게는 3회 반복하여 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 소수성 EBP는 히스티딘(Histidine)이 포함된 것으로서, 구체적으로 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 2 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 소수성 EBP는 상기 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 아미노산 서열로 이루어진 블록을 연속적으로 반복하여 포함할 수 있고, 상기 반복 횟수는 6~36 회일 수 있으나, 바람직하게는 6회 일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 융합 폴리펩타이드가 자가조립하여 형성된 코어-쉘 구조의 나노구조체를 다중 자극 반응성 약물전달체로서 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 자극은 온도 및 pH이고, 상기 나노구조체는 중성 조건 및 전이온도 보다 높은 온도에서 상기 융합 폴리펩타이드의 소수성 EBP에 의해 코어 구조가 형성되며, 산성 조건에서 상기 구조가 붕괴될 수 있다.

또한, 본 발명은 색소상피유래인자(epigment epithelial-derived factor: PEDF) 유래 펩타이드; 상기 PEDF 유래 펩타이드에 연결되는 친수성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(elastin based polypeptide: EBP); 및 상기 친수성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드에 연결되는 소수성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드;가 연결된 융합 폴리펩타이드를 포함하는, 혈관신생 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 약학적 조성물은 혈관신생에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료할 수 있으며, 상기 혈관신생에 의해 유발되는 질환은 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 조숙아의 망막증, 황반부변성증, 맥락막 신생혈관생성증, 신생혈관성 녹내장, 각막혈관신생에 의한 안구질환, 각막 이식 시의 거부반응, 각막 부종, 각막 혼탁, 암(cancer), 혈관종, 혈관섬유종, 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 및 건선 등일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 약학적 조성물의 융합 폴리펩타이드는 코어-쉘 구조의 나노구조체를 형성할 수 있으며, 상기 나노구조체는 코어 내부에 혈관신생에 기인하는 질환의 예방 또는 치료를 위한 1 종 이상의 약물을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 융합 폴리펩타이드 또는 약물 전달체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생에 기인하는 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 혈관신생에 기인하는 질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 상기 융합 폴리펩타이드 또는 약물 전달체의 용도를 제공한다.

본 발명의 융합 폴리펩타이드는 코어-쉘 구조의 나노구조체로 자가조립될 수 있으며, 종양 조직, 종양 세포 내의 엔도좀과 라이소좀과 같은 산성 조건에서 붕괴되어 코어 내부에 담지된 약물을 방출할 수 있다. 또한, 본 발명의 융합 폴리펩타이드는 혈관신생을 억제하는 PEDF 유래 펩타이드를 포함하여 종양 표적화 약물 전달과 동시에 혈관신생에 기인하는 질병의 치료를 위한 약물전달시스템으로 제공될 수 있다.

도 1의 (A)는 PEDF 34-mer peptide, EBPP[A₁G₄I₁]₁ 및 EBPPI[H₅G₁]₁의 아미노산 서열을 도시한 것이고, (B)(a) PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPP[H₅G₁]₆의 블록 디자인 및 (b) 약물 캡슐화와 함께 마이셀 구조로의 자가조립 및 산성 조건에서 약물 방출과 함께 구조 붕괴의 도식화한 것이다. PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPP[H₅G₁]₆는 T_t보다 높은 온도에서 약물 캡슐화와 함께 다가성 PEDF 34-mer 펩타이드를 가진 마이셀 구조로 자가조립되며, 히스티딘이 풍부한 EBP 블록의 pH 자극 반응성으로 인해, pH가 감소하면서 T_t의 증가로 나노구조체가 붕괴되고, 약물이 방출된다. 또한, 도 1의 (C) (a) 마이셀 구조의 항-혈관신생 메커니즘 및 (b) 약물 전달체로의 응용의 도식화한 것으로서, 다가성 PEDF 34-mer 펩타이드를 가진 마이셀 구조는 항-혈관신생 단백질 약물이자 약물 캡슐화와 함께 약물 전달체로서 작용할 수 있다.
도 2는 EBPP[H₃A₂I₁]_n, EBPP[H₅G₁]_n, EBPPI[H₃A₂I₁]_n, 및 EBPPI[H₅G₁]_n(n:1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24, 30, 및 36)의 아가로스 젤 이미지이다. EBP의 반복 유닛(n)은 각 젤 이미지의 위쪽에 표시했고, EBP 암호화하는 유전자의 길이는 유전자 조각 아래에 표시했다.
도 3은 EBPP[H₃A₂I₁]_n, EBPP[H₅G₁]_n, EBPPI[H₃A₂I₁]_n, 및 EBPPI[H₅G₁]_n(n: 6, 12, 및 18)의 SDS-PAGE 젤 이미지이다. EBP의 반복 유닛(n)은 각 젤 이미지의 위쪽에 표시했고, EBP의 예상 분자량은 밴드 아래에 표시했다. SDS-PAGE 젤은 구리 염색을 통해 시각화했다.
도 4는 본 발명에 이용된 EBPs의 열적 프로파일이다. 구체적으로 (A) EBPP[H₃A₂I₁]_n, (B) EBPP[H₅G₁]_n, (C) EBPPI[H₃A₂I₁]_n, 및 (D) EBPPI[H₅G₁]_n의 반복 유닛, n (a) 6, (b) 12, 및 (c) 18의 온도 및 pH 민감성. 25 μM EBP의 흡광도는 10 mM phosphate buffer pH 6.4, 6.8, 7.4, 및 8.0와 10 mM PBS에서 가열속도 1 °C/min로 350 nm에서 측정했다.
도 5는 PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆의 (A) 아가로스 젤 및 (B) SDS-PAGE 젤 이미지이다. 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자의 길이는 유전자 조각 아래에 표시했으며, 융합 폴리펩타이드의 예상 분자량은 밴드 아래에 표시했다. SDS-PAGE 젤은 구리 염색에 의해 시각화되었다. 10 mM phosphate buffer pH 6.4, 6.8, 7.4, 및 8.0, 10 mM PBS, 기타 첨가 없이 HUVEC culture medium (EBM-2) 및 2% FBS 및 8종류의 성장인자와 항생제를 처리한 EBM-2에서 PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPP[H₅G₁]₆의 (C) 혼탁도 프로파일 및 (D) 유체역학적 반경. 350 nm에서의 흡광도와 유체역학적 반경은 가열속도 1 °C/min 로 측정되었다.
도 6은 PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆의 HUVECs 체외(in vitro) 튜브 형성을 조사한 도면이다. 구체적으로 (A)는 형광 현미경 이미지 및 (B) 0.01 nM - 10 uM의 PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆가 처리된 calcein-AM 표지된 HUVECs의 튜브 형성 정도를 정량화한 그래프 이다. 튜브 형성 정도는 (A) 이미지로부터 정량화되었다.

자극 반응성 바이오재료(biomaterials)들은 바이오메디컬에의 응용으로 약물 방출에 따른 환경을 위해 개발되었다. 자극 반응성 바이오재료 중 하나는 pH 민감성 중합체로서, 종양 조직, 종양 세포 내, 엔도솜(endosomes) 및 라이소좀(lysosomes)과 같은 산성 조건을 표적하기 위해 사용되었다. 히스티딘(histidine)은 pKa보다 낮은 조건에서 양성자 첨가(protonation)에 의해 (+)전하를 띠는 pH 민감성 이미다졸(imidazole) 고리를 가지고 있다. 폴리히스티딘은 '양성화된 이미다졸기와 (-) 하전된 세포막 인지질(phospholipid)간의 상호작용으로 이루어진 이중층(lipid bilayer)'과 융합되어 엔도솜 붕괴 제제(endosomolytic agent)로서 작용한다. 공중합체(copolymer)를 포함하는 폴리히스티딘으로 구성된 pH 민감성 입자는 유전자나 약물 전달체로서 활용된다.

본 발명자들은 히스티딘을 온도 민감성을 가진 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(elastin-based polypeptides, EBP)에 도입하고, 히스티딘이 풍부한 엘라스틴 기반 이중블록 코폴리펩타이드(histidine-rich elastin-based diblock copolypeptide)는 마이셀 구조로 자가조립을 확인하였으며, 상기 구조는 pH의 감소에 따라 전이 온도의 증가로 인해 붕괴됨을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

보다 구체적으로, 본 발명자들은 EBP에서 히스티딘 비율과 블록 길이, 히스티딘이 풍부한 EBP에서 온도 민감성은 유전적 수준에서 정확하게 조절할 수 있음을 확인하였다. 제작된 융합펩타이드의 LCST 거동의 pH 반응성은 종전 연구 결과와 일치하였다. 히스티딘이 풍부한 EBP는 이미다졸 고리의 양성자 첨가에 의해 pH가 감소함에 따라 가용성이 되며, 히스티딘이 풍부한 EBP의 T_t는 중성 조건보다 산성 조건에서 더 높았다. EBPPI[H₅G₁]₆는 BP pH 7.4에서 적절한 T_t를 가지고, EBPP[H₃A₂I₁]보다 pH 민감성이 높기 때문에 EBP 이중 블록을 위해 채택되었다. 히스티딘이 풍부한 EBP를 포함하는 융합 폴리펩타이드인 PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆는 다가성 PEDF 34-mer 펩타이드를 포함하는 자가조립 나노구조체로서 개발되었다. PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆를 암호화하는 유전자는 PCR에 의해 유전적으로 합성되어, 클로닝되었으며, PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆는 E.coli에서 발현되고, ITC에 의해 정제되었다. PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆의 T_t는 pH가 감소함에 따라 증가했다. PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆는 T_t보다 높은 온도에서 안정한 나노구조체로 자가조립되었고, 나노구조체를 형성하는 온도도 pH가 감소함에 따라 증가함을 확인할 수 있었다. PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆의 자가조립 나노구조체는 상온 및 중성조건에서 자가조립되었고, pH가 감소할 때 붕괴되었다. HUVECs의 체외(in vitro) 튜브 형성 조사에서, PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆는 농도가 증가함에 따라 점진적으로 HUVECs의 튜브 형성을 감소시킴을 확인하였다. 상기 결과로부터, 이러한 융합 폴리펩타이드와 PEDF 34-mer 펩타이드를 포함하는 그들의 자가조립 다가성 마이셀 나노구조체는 각막, 망막, 및 맥락막 신경혈관 질환, 종양 성장, 암세포 전이, 당뇨병성 망막증, 및 천식 치료제와 같이 항-혈관신생 기능을 가지는 첨단 치료용 폴리펩타이드로서 상당한 잠재력을 가짐을 알 수 있다.

본 발명에서 상이한 LCST 거동을 하는 EBP 다중블록 코폴리펩타이드는 하이드로겔(hydrogel), 베시클(vesicle), 실린더형 마이셀 등과 같은 특정 구조로의 열적으로 유발되는 자가조립에 결합되었다. EBP 이중블록 코폴리펩타이드로 구성된 자가조립체 중 하나는 코어쉘 마이셀 나노구조체(core-shell micellar nanostructures)이다. 낮은 상전이 온도(lower temperature of phase transition, T_t) 이상에서, EBPs 이중블록 코폴리펩타이드는 EBP 블록의 상이한 서열, 조성, 및 사슬 길이에 기인한, 다른 EBP 블록의 T_t보다 낮은 T_t를 가진 EBP 블록의 불용화(insolubilization) 때문에 양친성(amphiphilic character)을 띤다. 이전 보고에서, EBP 이중 블록 코폴리펩타이드는 다른 기능적인 펩타이드 또는 단백질과 유전적으로 융합되었으며, 향상된, 추가적인 기능을 위해 약물이나 형광 염료와 같은 화합물과 화학적으로 접합되었다. 예를 들어, 항암제인 독소루비신(doxorubicin)은 보호되어 전달되기 위해 EBP 이중 블록 코폴리펩타이드 구조의 중심부에 화학적으로 콘쥬게이션되었다. pH 민감성 Lysosensor 염료 또한 pH에 따른 방출 피크의 변화를 이용하여 약물 담체의 세포내 위치를 추적하기 위해 EBP 이중 블록 코폴리펩타이드-기반의 나노입자의 중심부에 화학적으로 콘쥬게이션되었다. 상기 화학적 콘쥬게이션을 위해 시스테인(cysteine)을 포함하는 짧은 펩타이드를 가진 다른 기능적인 펩타이드 또는 단백질은 EBP 이중 블록 코폴리펩타이드와 유전적으로 암호화되었다. 가용성의 EBP 블록에 대한 다른 기능적인 펩타이드 또는 단백질의 도입은 자가조립 또는 하이드로겔로의 구조적 변화 이후 다가성 마이셀 나노구조체를 가능하게 했다. 금속-결합 펩타이드는 향상된 기계적 성질(mechanical property)을 가진 하이드로겔로의 마이셀 구조의 변화를 위해 EBP 이중 블록 공중합체 구조의 외각(shell)에 도입되었다. 금속-결합 펩타이드는 자가조립된 마이셀 구조 형성 이후 아미노산 서열에 따라 특정 금속과 배위결합했다. EBP 이중 블록 공중합체는 약물 또는 형광을 포함하는 나노구조체의 세포내 축적을 향상시키기 위해 cell penetrating peptide (CPP), thioredoxin (Trx) 또는 fibronectin type III domain (Fn3)와 융합하며, 그들의 세포내 흡수는 향상되었다.

본 발명에서 사용되는 용어 "아미노산"은 천연　아미노산　또는　인공　아미노산을 의미하며, 바람직하게는 천연　아미노산을 의미한다. 예컨대 상기　아미노산은 글리신, 알라닌, 세린, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 글루타민, 아스파라진, 시스테인, 히스티딘, 페닐알라닌, 아르기닌, 타이로신 또는 트립토판 등을 의미한다.

상기 아미노산의 성질은 이 기술분야에 널리 공지되어 있다. 구체적으로 친수성(음전하성 또는 양전하성)을 나타내거나 소수성을 나타내고, 지방족 또는 방향족의 성질도 나타낸다.

본 명세서에서 사용된 용어 “색소상피유래인자(pigment epithelial-derived factor, PEDF)”는 항-혈관신생 신호를 활성화할 뿐만 아니라 혈관신생 저해제로서 혈관신생의 균형을 유지하는 역할을 수행한다. 본 발명에서 “PEDF 유래 펩타이드”는 상기 기능을 수행하는 PEDF의 절편일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 6의 34-mer의 펩타이드(잔기 44-77)일 수 있으나, 혈관신생 억제 기능을 수행하는한 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에 사용된 용어 "폴리펩타이드"란 아미노산의 임의의 중합체 체인을 의미한다. "펩타이드" 및 "단백질"이란 용어는　폴리펩타이드란　용어와 혼용할 수 있는 것으로서, 이 역시 아미노산의 중합체 체인을 의미한 다. "폴리펩타이드"란 용어는 천연 또는 합성 단백질, 단백질 단편 및 단백질 서열의　폴리펩타이드　유사체를 포함한다.　폴리펩타이드는 단량체 또는 중합체일 수 있다.

본 명에서에서 사용된 용어 "상 전이(phase transition)"이란, 물이 수증기로 변하거나 얼음이 물로 변하는 것과 같이, 물질의 상태가 변하는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 상기 폴리펩타이드는, 기본적으로, 자극 반응성을 가지는 엘라스틴-기반 폴리펩타이드(elastinbased polypeptides: EBPs)이다. 상기 "엘라스틴-기반 폴리펩타이드"는 "엘라스틴-유사 폴리펩타이드(ealstinlike polypeptieds: ELP)"라고도 불린다. 본 발명의 기술분야에서 널리 사용되는 용어이다.

본 명세서에서, 상기 X_aa (또는 X) "게스트 잔기"라고 칭한다. 상기 X_aa를 다양하게 도입하여 본 발명에 따른 다양한 종류의 EBP를 제조할 수 있다.

상기 EBP는, 전이 온도(transition temperature: T_t )라고도 칭하는 하한 임계 용액 온도(lower critical solution temperature: LCST)에서 가역 상 전이를 거친다. 이들은, T_t 미만에서 수용성이 크지만, 온도가 T_t를 초과하면 불용성으로 된다. 다시말해, T_t 가 높으면 친수성을 나타내고 T_t 가 낮으면 소수성을 나타낸다.

본 발명에 따른 EBP 블럭들도 게스트 잔기를 포함하는 아미노산 서열과 분자량에 변화를 줌으로써 T_t 를 올리거나 낮출 수 있다. 그리하여 친수성 EBP 블럭 또는 소수성 EBP 블럭의 제조가 가능하다. 참고로, 체온 보다 낮은 T_t 를 가지는 EBP는 소수성 블럭으로 사용될 수 있고, 체온 보다 높은 T_t 를 가지는 EBP 는 친수성 블럭으로 사용될 수 있다. EBP가 가지는 이러한 성질로 인해, EBP의 친수성과 소수성의 성질은 생체 공학적으로 응용할 때에는 상대적으로 정의할 수 있다.

본 발명은 EBP에서 히스티딘의 비율 및 LCST에 영향을 미치는 pH의 영향에 다른 “histidine rich EBPs” 블록 길이를 스크리닝하여 약물전달체로서 최적의 EBP 블록을 제공한다.

본 발명에서, EBP의 물리화학적 특성들은 펜타펩타이드 반복 단위인 Val-Pro-(Gly 또는 Ala)-X aa -Gly의 조합에 의해 주로 제어된다. 구체적으로, 그 반복 단위의 3번째 아미노산은 상대적 기계적 특성을 결정한다. 예를 들어, 본 발명에서, 3번째 아미노산인 Gly 는 탄성(elasticity)을, 또는 Ala는 가소성(plasticity) 결정한다. 상기 탄성 또는 가소성은 전이 이후에 나타나는 성질이다.

본 발명에 따른 EBP는 펜타펩타이드가 반복된 폴리펩타이드일 수 있고, 이 반복된 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 블럭(EBP 블럭)을 형성할 수 있다. 구체적으로 친수성 EBP 블럭 또는 소수성 EBP 블럭을 형성할 수 있다. 본 발명의 EBP 블럭의 친수성 또는 소수성의 성질은 EBP의 전이온도가 깊은 관련성이 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "EBP 다이블럭"이란, "친수성 EBP-소수성 EBP"로 구성된 블럭을 말하며, "EBP 다이블럭 공중합체", "EBP 다이블럭 블럭", "다이 블럭 EBP" "다이 블럭 EBPs" 또는 "다이 블럭 EBPPs" 라고도 부른다.

본 발명은 유전적으로 암호화된 새로운 종류의 혈관신생 억제용 다중 자극 반응성 융합 폴리펩타이드에 관한 것으로서, 상기 융합 폴리펩타이드를 이용하여 제작된 나노구조체를 혈관신생 억제와 함께 표적 조직, 세포, 또는 세포 소기관에 약물을 전달할 수 있는 약물 전달 시스템을 제공한다.

따라서 본 발명의 융합 폴리펩타이드가 혈관신생 관련 질병 치료를 위한 폴리펩타이드 약물로 제시될 수 있다.

본 발명의 융합 폴리펩타이드는 종래 펩타이드 약물 및 펩타이드-중합체 결합체를 생체 내 치료에 적용힐 때 발생하는 다음의 한계를 극복할 수 있다: (1) 단백질분해효소에 의한 빠른 제거; (2) 시간과 비용이 소모되는 접합 및 정제; (3) 임의 분포 및 (다양한 중합체와 펩타이드 약물의 중합시 나타나는) 일관성 없는 접합 효율; 및 (4) 미셀 구조의 다분산 분자량으로 인한 이질적인 미셀 구조.

본 발명에서 "혈관신생 관련 질환" 또는 “혈관신생에 의해 유발되는 질환”은 상기한 바와 같은 신생혈관 형성이 비정상적으로 진행되어 야기되는 질환을 의미한다. 본 명세서 내에서 “혈관신생 관련 질환”과 “혈관신생에 의해 유발되는 질환”은 상호 호환적으로 기재할 수 있다.

본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 혈관신생 관련 질환은 혈관형성-의존성 암, 양성 종양, 류마티스 관절염, 당뇨병성 망막증, 조숙아 망막증, 신생혈관 녹내장, 증식성 망막증, 홍색증, 건선, 오슬러-웨버 증후군, 심근 혈관형성, 플라크 신혈관화, 모세혈관확장증, 혈우병 관절증, 혈관섬유종, 외상 과립화, 장 유착증, 투석 이식 혈관 통로 협착증, 동맥경화증, 경피증, 비후성 반흔, 캣스크래치 질환, 헬리코박터 파일로리(Helicobactor pylori) 궤양, 비만, 또는 염증 등이 포함될 수 있다. 본 발명의 조성물은 혈관신생 또는 맥관형성을 억제함으로써 상기 혈관신생 관련 질환들을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 혈관신생 관련 질환의 발생, 확산 또는 재발을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 용어, "약학적 조성물"은 질병의 예방 또는 치료를 목적으로 제조된 것을 의미하며, 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

또한, 각각의 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 담체, 예컨대 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 담체를 추가로 포함하여 제조할 수 있다.

한편, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

따라서, 본 발명의 약학적 조성물을 개체에 투여하여 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료할 수 있으며, 상기 혈관신생 관련 질환은 암일 수 있다.

본 발명에서 용어, “개체”는 쥐, 가축, 생쥐, 인간 등 포유류일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에 투여를 위한 다양한 형태로 제형화 될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화 될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는 예를들면 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신)와 활탁제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 포함할 수 있다. 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 포함할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제 및/또는 감미제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 방부제, 수화제, 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제와 같은 보조제와 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 제제화 될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 목적하는 효과를 상승시킬 수 있는 공지의 화합물과도 병행하여 투여할 수 있다

본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여경로로는 경구적으로 또는 정맥 내, 피하, 비강 내 또는 복강 내 등과 같은 비경구적으로 사람과 동물에게 투여될 수 있다. 경구 투여는 설하 적용도 포함한다. 비경구적 투여는 피하주사, 근육 내 주사 및 정맥 주사와 같은 주사법 및 점적법을 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 본 발명에 따른 재조합 융합 폴리펩타이드의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 성인을 기준으로 1회 투여시 100㎍ 내지 3,000㎎의 유효용량으로 하루에 수차례 반복 투여될 수 있다. 그러나 상기 재조합 융합 폴리펩타이드의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐 만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정될 수 있다. 따라서 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 융합 폴리펩타이드의 혈관신생 억제제 또는 혈관신생 관련 질환의 치료 또는 예방제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있으며, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여방법에 특별히 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 유효성분으로서 본 발명의 재조합 융합 폴리펩타이드 이외에 공지된 혈관신생 저해제를 추가로 포함할 수 있고, 이들 질환의 치료를 위해 공지된 다른 치료와 병용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 혈관신생 저해제의 예시에는 안지오스타틴(angiostatin)(플라스미노겐 절편); 항-안지오제닉 항트롬빈 III; 안지오자임(angiozyme); ABT-627; Bay 12-9566; 베네핀(benefin); 베바시주마브(bevacizumab); BMS-275291; 연골 유래 억제제(cartilage-derived inhibitor, CDI); CAI; CD59 보체 절편; CEP-7055; Col 3; 콤브레타스타틴(combretastatin) A-4; 엔도스타틴(endostatin)(콜라겐 X VIII 절편); 피브로넥틴 절편; 그로-베타(Gro-beta); 할로퓨리논(halofuginone); 헤파리나제; 헤파린 헥사사카라이드 절편; HMV833; 인간 융모막 고나도트로핀(hCG); IM-862; 인터페론 알파/베타/감마; 인터페론 유도 단백질(IP-10); 인터루킨-12; 크링글(Kringle) 5(플라즈미노겐 절편); 마리마스타트(marimastat); 덱사메타손; 금속단백분해효소(metalloproteinase) 억제제(TIMP); 2-메톡시에스트라디올 MMI 270(CGS 27023A); MoAb IMC-1C11; 네오바스타트(neovastat); NM-3; 판젬(Panzem); PI-88; 태반 리보뉴클레아제 억제제 플라즈미노겐 활성화제 억제제 혈소판인자-4 (PF4); 프리노마스타트(prinomastat); 프로락틴 16 kD 절편 프로리페린(proliferin)-관련 단백질(PRP); PTK 787/ZK 222594; 레티노이드 소리마스타트 스쿠알라민 SS 3304; SU 5416; SU6668; SU11248; 테트라하이드로코티솔-S; 테트라티오몰리브데이트(tetrathiomolybdate); 탈리도마이드 트롬보스폰딘(Thrombospondin)-1(TSP-1); TNP-470; 형질전환(transforming) 성장인자-베타(TGF-b); 바스큘로스타틴(vasculostatin); 바소스타틴(칼레티큘린(calreticulin) 절편); ZD6126; ZD6474; 파네실(farnesyl) 트랜스페라제 억제제(FTI); 및 비스포스포네이트(예를 들어, 알렌드로네이트, 에티드로네이트(etidronate), 파미드로네이트, 리세드로네이트, 이반드로네이트, 졸레드로네이트(zoledronate), 올파드로네이트(olpadronate), 이칸드로네이트 또는 네리드로네이트(neridronate)) 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서는 아미노산 서열을 IUPAC-IUB 명명법에 따라 아래와 같이 약어로 기재하였다.

아르기닌(Arg, R), 라이신(Lys, K), 히스티딘(His, H), 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T), 글루타민(Gln, Q), 아스파라진(Asp, N), 메티오닌(Met, M), 루신(Leu, L), 이소루신(Ile, I), 발린(Val, V), 페닐알라닌(Phe, F), 트립토판(Trp, W), 티로신(Tyr, Y), 알라닌(Ala, A), 글리신(Gly, G), 프롤린(Pro, P), 시스테인(Cys, C), 아스파르트산(Asp, D) 글루탐산(Glu, E), 노르루신(Nle)

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

[방법 및 재료]

1. 재료

pET-21a (+) 벡터 및 BL21 (DE3) E. Coli 세포는 Novagen Inc. (Madison, WI, U.S.)사의 제품을 사용했다. Top10 competent cells 및 Calcein-AM은 Invitrogen (Carlsbad, CA, U.S.)사에서, HUVECs는 Lonza (Basel, Switzerland)사에서 구매했다. 모든 주문제작 올리고뉴클레오타이드는 Cosmo Gene Tech (Seoul, South Korea)사에서 합성했으며, 인간 재조합 VEGF-165 (rhVEGF₁₆₅)는 R&D SYSTEMS (Minneapolis, U.S.) 사의 제품을 사용했다. CIP(Calf intestinal alkaline phosphatase), BamHI 및 XbaI는 Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, U.S.) 사의 제품을 사용했다. AcuI 및 BseRI는 New England Biolabs (Ipswich, MA, U.S.)사에서 구매했다. T4 DNA ligase는 Elpis Bio-tech (Taejeon, South Korea)사의 제품을 사용했다. DNA miniprep, gel extraction, 및 PCR purification kits는 Geneall Biotechnology (Seoul, South Korea)사의 제품을 사용했다. Dyne Agarose High는 DYNE BIO, Inc. (Seongnam, South Korea)사의 제품을 사용했다. Top10 cells은 MO BIO Laboratories, Inc. (Carlsbad. CA, U.S.)사에서 구매한 TB DRY media에서 배양했다. BL21(DE3) 세포는 MP Biomedicals (Solon, OH, U.S.)사에서 구매한 Circle Grow media에서 배양했다. HUVECs는 Lonza (Basel, Switzerland)사에서 구매한 EGM-2 Bullet Kit 및 EBM-2에서 키웠다. Phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4) 및 ampicillin은 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, U.S.)사의 제품을 사용했다. 마트리겔(Matrigel)은 BD Biosciences (San Diego, CA, U.S.)사에서 구매했다.

2. 상이한 EBP 블록과 그들의 블록 폴리펩타이드의 명명법

'펜타펩타이드 반복 유닛(pentapeptide repeating unit)'인 (Val or Ile)-Pro-(Gly or Ala)-Xaa-Gly과 함께 상이한 EBPs의 이름은 다음과 같다. (이 때, Xaa는 반복적인 상기 유닛에서 4번째 아미노산으로 Pro를 제외한 어떤 아미노산이든 가능하다.) 첫째, 가소성이 있는 펜타펩타이드 반복(pentapeptide repeats)인 Val-Pro-Ala-X_aa-Gly는 가소성 있는 EBPs(elastin-based polypeptide with plasticity, EBPP)로서 명명되었고, 탄력성이 있는 펜타펩타이드 반복인 Val-Pro-Gly-X_aa-Gly는 탄력성 있는 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(elastin-based polypeptide with elasticity, EBPE)로 명명되었다. 그리고 Ile-Pro-Ala-X_aa-Gly는 Ile를 포함하는 EBPP(EBPPI)로서 규명되었다.

둘째, [X_iY_jZ_k]_n에서 괄호의 대문자는 게스트 잔기(guest residues)의 아미노산의 단일문자코드를, 아래첨자로 적은 문자는 반복되는 유닛으로서 엘라스틴 기반 폴리펩타이드의 단량체 유전자 안에서 게스트 잔기의 비율을 나타낸다. 이 때 게스트 잔기는 엘라스틴 기반 폴리펩타이드 펜타펩타이드의 4번째에 위치한 아미노산(X_aa)를 가리킨다. [X_iY_jZ_k]_n의 아래첨자로 적은 숫자 n은 게스트 잔기가 i, j, 및 k의 비율로 구성되는 하나의 엘라스틴 기반 폴리펩타이드 블록의 반복 횟수를 가리킨다. 예를 들어, EBPP[A₁G₄I₁]₆는 [VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG] 의 단위가 6번 반복되어 이루어진 EBPP 블럭이며, 여기서 4번째 게스트 잔기 위치(X_aa)에서의 Ala, Gly 및 Ile의 비는 1:4:1이다. EBPP와 다른 펩타이드의 블록 코폴리펩타이드 (block copolypeptide)는 PEDF 34-mer-EBPP[A ₁ G ₄ I ₁ ] ₃ -EBPPI[H ₅ G ₁ ] ₆ 와 같이 폴리펩타이드 블럭들 사이 하이폰과 함께 명명된다.

3. 매끄러운 (seamless) 유전자 클로닝(gene cloning)을 위한 유전자 재조합 pET-21a 벡터의 제조

pET-21a 벡터를 FastDigest buffer에서 37℃, 20분간 XbaI, BamHI 및 CIP 처리하고 탈인산화(dephosphorylation)했다. 제한효소 처리된 플라스미드 DNA를 PCR purification kit를 이용해 정제하며, 탈이온수로 용출했다. XbaI 및 BamHI의 sticky ends를 포함하며 양립할 수 있는 두 올리고뉴클레오타이드는 다음과 같이 고안되었다.

5′-ctagaaataattttgtttaactttaagaaggaggagtacatatgggctactgataatgatcttcag-3′

5′-gatcctgaagatcattatcagtagcccatatgtactcctccttcttaaagttaaacaaaattattt-3′

T4 DNA ligase buffer에서 두 올리고뉴클레오타이드를 95℃, 2분간 가열함으로써 어닐링(annealing)하고, 이후 상온에서 3시간동안 천천히 냉각시켰다. 어닐링된 이중가닥 DNA(dsDNA)와 선형화된 벡터를 T4 DNA ligase buffer에서 T4 DNA ligase 처리하고 37℃에서 30분동안 배양함으로써 pET-21a 벡터의 다중 클로닝 부위(multiple cloning site, MCS)에 DNA 삽입유전자(insert)를 ligation했다. 완벽한 클로닝과 발현을 위해 유전자 재조합 pET-21a (mpET-21a) 벡터를 Top10 competent cell에 형질전환(transformation)했고, 이후 50 μg/ml의 ampicillin이 처리된 super optimal broth with catabolite repression (SOC) plates에 도말했다. mpET-21a 벡터의 DNA 염기서열은 fluorescent dye terminator DNA sequencing (Applied Biosystems Automatic DNA Sequencer ABI 3730)에 의해 입증되었다.

4. 단량체 EBPs 유전자 합성 및 올리고머화(oligomerization)

EBPP[A_xB_yC_z]₁를 암호화하기 위한 올리고뉴클레오타이드 한 쌍을 T4 DNA ligase buffer에서 95℃, 3분간 가열함으로써 어닐링(annealing)하고, 이후 상온에서 3시간동안 천천히 냉각시켰다. mpET-21a 클로닝 벡터를 37℃에서 30분간 BseRI 및 CIP 처리하고 탈인산화했다. 제한효소 처리된 플라스미드 DNA를 PCR purification kit를 이용해 정제하며, 탈이온수로 용출시켰다. 어닐링된 dsDNA와 선형화된 mpET-21a 클로닝 벡터를 T4 DNA ligase buffer에서 T4 DNA ligase 처리하고 16℃에서 30분동안 배양함으로써 접합(ligation)했다. 접합된 플라스미드를 Top10 chemically competent cells에 형질전환했고, 이후 50 μg/ml의 ampicillin이 처리된 SOC plates에 도말했다. DNA 염기서열은 DNA 시퀀싱(DNA sequencing)을 통해 확인되었다. EBPP[A_xB_yC_z]₆ 유전자를 제조한 후, recursive directional ligation (RDL)를 이용하여 반복횟수가 36(EBPP[A_xB_yC_z]₃₆)이 될 때까지 EBP 유전자를 합성했다. EBPP[A_xB_yC_z]_6n 유전자 카피(copy)를 포함하는 벡터를 CutSmart buffer에서 37℃, 30분간 XbaI, BseRI 및 CIP 처리하고 탈인산화했다. 제한효소 처리된 DNA를 PCR purification kit를 이용하여 정제하며, 탈이온수로 용출했다. 삽입유전자 제작을 위해, EBPP[A_xB_yC_z]₆을 포함하는 유전자를 CutSmart buffer에서 37℃, 30분간 XbaI 및 AcuI를 처리했다. 처리 후, 반응 생성물을 아가로스 젤(agarose gel)에 전기영동(electrophoresis)하고, 삽입유전자를 gel extraction kit를 이용하여 정제했다. 정제된 삽입유전자와 선형화된 벡터를 T4 DNA ligase buffer에서 T4 DNA ligase 처리하고 16℃, 30분동안 배양함으로써 ligation했다. Ligation된 생성물을 Top 10 chemically competent cells에 형질전환하고, 50 μg/mL의 ampicillin이 처리된 SOC plates에 도말했다. 형질전환체는 초반에 진단적인 제한효소 처리에 의해 아가로스 겔 위에서 스크리닝되었으며, 상기 언급된 DNA 시퀀싱에 의해 추가로 확인되었다.

5. PCR을 이용한 클로닝 벡터에서 PEDF 34-mer 암호화하는 유전자의 제조

PEDF cDNA fragment 34-mer (130-231)는 인간 PEDF cDNA 절편으로부터 다음과 같은 프라이머와 함께 PCR에 의해 증폭되었다.

5'-AAAGGATCCCCCTACTGGTAATGCTCTTCAGTCTAGAGAT-3' (forward)

5'-CACGACCAACGGCTACTGATAGTGATCTTCAGCTAGCGAT-3' (reverse).

정방향 프라이머는 3'말단에 XbaI 제한효소 사이트가 있고, 역방향 프라이머는 5'말단에 NheI 제한효소 사이트가 있었다. 양 프라이머는 EBPP[A₁G₄I₁]_n를 포함하는 유전자의 매끄러운 클로닝을 위해 중간에 AcuI 제한효소 인식 사이트를 가지고 있었다. PEDF 34-mer의 증폭된 유전자 절편에 CutSmart buffer에서 37℃, 2시간동안 XbaI 및 NheI을 처리하여 삽입유전자를 제작했다. 처리 후, 생성물을 아가로스 젤에 전기영동하고, 삽입 유전자를 gel extraction kit를 사용하여 정제했다. pET-21a 클로닝 벡터에 37℃, 1시간동안 XbaI 및 CIP를 처리하고 탈인산화했다. 제한효소 처리된 DNA를 PCR purification kit를 사용하여 정제하고 탈이온수에 용출했다. 제한효소 처리된 PEDF 34-mer 유전자 절편과 선형화된 pET-21a 클로닝 벡터를 T4 DNA ligase buffer에서 T4 DNA ligase 처리하고 16℃에서 30분동안 배양함으로써 ligation했다. Ligation된 생성물을 Top10 chemically competent cells에 형질전환하고, 50 μg/mL의 ampicillin이 처리된 SOC plates에 도말했다. 형질전환체는 초반에 진단적인 제한효소 처리에 의해 아가로스 젤 위에서 스크리닝되었으며, 상기 언급된 DNA 시퀀싱에 의해 추가로 확인되었다.

6. PEDF 34-mer-EBPP[A ₁ G ₄ I ₁ ] ₃ 및 PEDF 34-mer-EBPP[A ₁ G ₄ I ₁ ] ₃ -EBPPI[H ₅ G ₁ ] ₆ 융합 폴리펩타이드의 유전자 제작

EBPP[A₁G₄I₁]₃ 또는 PEDF 34-mer의 라이브러리를 포함하는 플라스미드는 EBPP[A₁G₄I₁]₃의 융합 폴리펩타이드 라이브러리를 암호화하는 유전자를 형성하는데 사용되었다. EBPP[A₁G₄I₁]₃를 포함하는 벡터를 제조하기 위해, EBPP[A₁G₄I₁]₃를 포함하는 플라스미드는 CutSmart buffer에서 37℃, 1시간 동안 BseRI 처리되었다. 제한효소 처리된 플라스미드 DNA는 PCR purification kit를 이용하여 정제되고, CutSmart buffer에서 37℃, 1시간 동안 CIP에 의해 탈인산화되었다. 제한효소 처리되고 탈인산화된 DNA는 PCR purification kit를 이용하여 정제되고, 탈이온수에 의해 용출되었다. 삽입유전자의 제조를 위해, PEDF 34-mer를 포함하는 유전자에 CutSmart buffer에서 37℃, 1시간 동안 AcuI를 처리했다. 처리 후, 반응 생성물을 아가로스 겔에 전기영동하였으며, 삽입 유전자는 gel extraction kit를 이용하여 정제했다. 정제된 삽입유전자와 선형화된 벡터를 T4 DNA ligase buffer에서 T4 DNA ligase 처리하고 16℃, 30분 동안 배양함으로써 ligation했다. Ligation한 생성물을 Top10 chemically competent cell에 형질전환하고 50 μg/mL의 ampicillin이 처리된 SOC plates에 도말했다. 형질전환체는 초반에 진단적인 제한효소 처리에 의해 아가로스 젤 위에서 스크리닝되었으며, 상기 언급된 DNA 시퀀싱에 의해 추가로 확인되었다.

융합폴리펩타이드 제작을 위한 유전자 서열과 아미노산 서열은 아래 표 1과 같다.

아미노산 서열	서열번호1	EBPP[H₃A₂I₁]₁	VPAHG VPAAG VPAHG VPAIG VPAHG VPAAG
	서열번호2	EBPP[H₅G₁]₁	VPAGG VPAHG VPAHG VPAHG VPAHG VPAHG
	서열번호3	EBPPI[H₃A₂I₁]₁	IPAHG IPAAG IPAHG IPAIG IPAHG IPAAG
	서열번호4	EBPPI[H₅G₁]₁	IPAGG IPAHG IPAHG IPAHG IPAHG IPAHG
	서열번호5	EBPP[A₁G₄I₁]₁	VPAGG VPAAG VPAGG VPAGG VPAIG VPAGG
	서열번호6	PEDF 34-merpeptide	DPFFKVPVNKLAAAVSNFGYDLYRVRSSTSPTTN
유전자 서열	서열번호7	EBPP[H₃A₂I₁]₁	GTG CCG GCG CAT GGA GTT CCT GCC GCC GGT GTT CCT GCG CAT GGT GTA CCG GCA ATT GGC GTT CCG GCA CAT GGT GTG CCG GCC GCC GGC
	서열번호8	EBPP[H₅G₁]₁	GTT CCG GCC GGA GGT GTA CCG GCG CAT GGT GTT CCG GCA CAT GGT GTG CCG GCT CAC GGT GTG CCT GCG CAT GGC GTT CCT GCG CAT GGC
	서열번호9	EBPPI[H₃A₂I₁]₁	ATT CCG GCC CAT GGC ATT CCT GCA GCC GGT ATT CCG GCG CAT GGC ATT CCT GCC ATT GGC ATC CCG GCA CAT GGC ATT CCG GCC GCC GGC
	서열번호10	EBPPI[H₅G₁]₁	ATT CCG GCC GGA GGC ATT CCT GCA CAT GGT ATT CCG GCG CAT GGC ATT CCT GCC CAT GGC ATC CCG GCA CAT GGC ATT CCG GCC CAT GGC
	서열번호11	EBPP[A₁G₄I₁]₁	GTT CCA GCT GGC GGT GTA CCT GCT GCT GCT GTT CCG GCC GGT GGT GTT CCG GCG GGC GGC GTG CCT GCA ATA GGA GTT CCC GCT GGT GGC
	서열번호12	PEDF 34-merpeptide	GAT CCT TTC TTC AAA GTC CCC GTG AAC AAG CTG GCA GCG GCT GTC TCC AAC TTC GGC TAT GAC CTG TAC CGG GTG CGA TCC AGC ACG AGC CCC ACG ACC AAC

7. EBP 단일블록 및 PEDF 34-mer-EBPP[A ₁ G ₄ I ₁ ] ₃ -EBPPI[H ₅ G ₁ ] ₆ 의 발현 및 정제

EBP 단일블록 및 PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃ -EBPPI[H₅G₁]₆를 포함하는 각각의 벡터를 E. coli strain BL21(DE3) cells에 형질전환하고, 50 μg/mL ampicillin을 처리한 4 mL의 TB DRY 배지에 접종했다. 사전배양(preculture)은 진탕배양기(shaking incubator)에서 37 °C, 200rpm으로 밤새 이루어졌다. 이후 4 mL의 TB DRY media를 50 μg/mL ampicillin가 처리된 500 mL의 CircleGrow media에 접종하고, 진탕배양기에서 37 °C, 200rpm으로 12시간동안 배양했다. 600 nm에서 흡광도(optical density) (OD₆₀₀)가 1.0에 도달했을 때, 최종 1 mM이 되도록 IPTG를 첨가함으로써 폴리펩타이드의 과발현(overexpression)이 유도되었다. 세포들을 4500rpm으로 4 °C에서 10분간 원심분리했다. 발현된 EBP 단일블록 및 PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃ -EBPPI[H₅G₁]₆는 상술한 바와 같이 역 전이 순환(inverse transition cycling, ITC)을 이용하여 정제했다. 세포 펠렛(cell pellet)을 40 mL의 PBS buffer에 재현탁하고, 세포를 10초동안 초음파분해(sonication) (VC-505, Sonic and materials Inc, Danbury, CT) 후 20초 쉬면서 얼음 수조(ice bath)에서 세포를 용해시켰다. 세포용해액을 50 mL 원심분리 튜브에 담아 불용성의 잔해물을 침전시키기 위해 13000 rpm으로 4 °C, 15분동안 원심분리했다. 용해된 EBP를 포함하는 상청액을 새로운 50 mL 원심분리 튜브에 담고, 핵산 오염물을 침전시키기 위해 PEI 0.5 % w/v, 13000 rpm으로 4 °C, 15분동안 원심분리했다. EBP를 포함하는 상청액의 역상전이(inverse phase transition)는 최종 농도 4M이 되도록 NaCl을 첨가함으로써 유발되며, 응집된 EBPs는 용해액으로부터 13000rpm으로 40 °C에서 15분동안 원심분리함으로써 분리되었다. 응집된 EBPs를 차가운 PBS buffer에서 재현탁하고, 응집된 단백질 오염물을 제거하기 위해 13000rpm으로 4 °C, 15분동안 원심분리했다. 이러한 응집과 재현탁 과정을 EBP의 순도가 SDS-PAGE로 결정했을 때 약 95%에 도달할 때까지 5-10번 반복했다.

8. EBP 단일블록 및 PEDF 34-mer-EBPP[A ₁ G ₄ I ₁ ] ₃ -EBPPI[H ₅ G ₁ ] ₆ 의 특성화

EBP 단일블록 및 PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃ -EBPPI[H₅G₁]₆의 순도는 SDS-PAGE에 의해 결정되었다. PBS와 phosphate buffer (PB) pH 6.4, 6.8, 7.4, 및 8.0에서, 25 μM 농도의 EBP 단일블록 및 PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃ -EBPPI[H₅G₁]₆의 pH 및 온도 민감성을 25 ~ 65 °C, 1 °C/min의 가열 속도로 multi-cell thermoelectric temperature controller를 가진 Cary 100 Bio UV/Vis Spectrophotometer(Varian Instruments, Walnut Creek, CA)에 의해 OD₃₅₀을 측정함으로써 결정했다. 그들의 T_t는 열적 프로파일(thermal profile)의 변곡점(inflection point)으로서 규명되었다. 가용성의 유니머(unimers)로부터 마이셀로의 PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃ -EBPPI[H₅G₁]₆의 자가조립 거동은 온도 조절 Nano ZS90 (ZEN3690) 동적 광산란(dynamic light scattering, DLS) 장비(Malvern instruments, Worcestershire, UK)에 의해 특성화되었다. PBS와 phosphate buffer (PB) pH 6.4, 6.8, 7.4, 및 8.0에서, 25 μM 농도에서 그들의 유체역학적 반경(hydrodynamic radius, R_H)은 1 °C/min의 가열 속도로 25 ~ 65 °C 범위에서, 각 온도마다 7번씩 측정되었다.

9. PEDF 34-mer-EBPP[A ₁ G ₄ I ₁ ] ₃ -EBPPI[H ₅ G ₁ ] ₆ 을 이용한 HUVECs의 체외( in vitro ) 튜브 형성 조사

PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃ -EBPPI[H₅G₁]₆을 이용한 HUVECs의 체외(in vitro) 튜브 형성 조사는 EBP의 길이에 따른 내피세포의 성장(proliferation), 이동(migration) 및 튜브 형성에 미치는 PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃ -EBPPI[H₅G₁]₆의 효과를 평가하기 위해 수행되었다. 48 well plates에 150 μL의 마트리겔을 코팅시키기 위해 37 °C에서 30분동안 배양시켜 마트리겔을 고체화(solidification)하였다. 형광 표지를 위해 HUVECs를 0.5 μM calcein-AM에 37 °C에서 15분동안 배양했다. 내피세포의 성장, 이동 및 튜브 형성이 어떻게 촉진되는지 측정하기 위해 4 × 10⁴ cells/well의 calcein-표지된 HUVECs를 마트리겔-코팅된 wells에 뿌리고, 37 °C에서 4시간동안 상이한 농도로 50 ng/ml 인간 재조합 벡터 rhVEGF₁₆₅ 및 PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃ -EBPPI[H₅G₁]₆를 배양했다. HUVECs의 튜브 형성을 Micromanipulator (ZEISS, Oberkochen, Germany) 하에서 촬영했고, 신혈관 생성 분석기로 각 well마다 세 개의 임의 구역의 전체 튜브 길이를 측정함으로써 정량화했다. 튜브 형성은 세 번 반복 수행으로 관찰하였다.

[결과 및 고찰]

도 1은 (A) PEDF 34-mer peptide, EBPP[A₁G₄I₁]₁, 및 EBPPI[H₅G₁]₁의 아미노산 서열, (B) 블록디자인, 온도 및 pH 의존성 자가조립을 위한 도식화, 및 (C) PEDF-34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]_3- EBPPI[H₅G₁]₆의 항-혈관신생 메커니즘 및 약물전달체로서의 응용을 보여준다. 융합 폴리펩타이드 및 PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆의 블록 디자인은 도 1(B)(a)에 도시되어 있으며, 약물이 함입된 융합 폴리펩타이드의 자가조립과, 온도 및 pH에 따른 약물 방출과 구조의 붕괴는 도1(B)(b)에 도시되어 있다. 히스티딘이 풍부한 EBP 블록의 LCST 거동은 환경의 pH에 영향을 받는다. PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆은 EBPPI[H₅G₁]₆의 T_t보다 높은 온도에서 다가성 PEDF 34-mer 펩타이드와 마이셀 구조로 자가조립되었으며, 소수성 약물은 중심부로 함입되었다. 산성 조건에서 EBPPI[H₅G₁]₆의 T_t의 증가를 유발하는 히스티딘의 이미다졸 고리의 양성자 첨가로 인해 상기 구조는 붕괴되며 약물을 방출했다. PEDF 34-mer 펩타이드는 다양한 메커니즘을 통해 항-혈관신생 신호를 유발함으로써 내피세포에서 혈관신생의 균형을 유지하는 기능적인 펩타이드이다. 항-혈관신생을 위한 PEDF 34-mer의 일부 메커니즘은 이미 규명되었다. 예를 들어, PEDF 34-mer 펩타이드는 세포외 기질에서 라미닌과 내피세포간 상호작용을 방지하기 위해 세포막에서 라미닌 수용체와 결합했다. 다가성 PEDF 34-mer 펩타이드를 가진 마이셀 구조는 항-혈관신생 단백질 약물이자, 약물 캡슐화(drug encapsulation)와 함께 다중자극 약물전달체로서 작용한다(도 1(C)). 중성 pH 및 상온에서 자가조립하고, 종양 세포, 엔도솜, 라이소좀과 같은 산성 조건에서 붕괴되는 마이셀 구조를 만들기 위해서, 4종류의 히스티딘이 풍부한 EBPs, EBPP[H₃A₂I₁]_n, EBPP[H₅G₁]_n (n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 및 18), EBPPI[H₃A₂I₁]_n, 및 EBPPI[H₅G₁]_n (n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24, 30, 및 36)가 개발되었다. 3종류의 반복 유닛(6, 12, 및 18)을 가진 EBPs는 발현되고, 정제되었으며, pH에 따른 열 민감성이 특성화되었다. 적절한 T_t와 낮은 pH에서 T_t의 충분한 감소를 보이는 EBPPI[H₅G₁]₆은 온도 및 pH 반응성 소수성 블록으로서 채택되었으며, EBPP[A₁G₄I₁]₃는 친수성 블록으로서 도입되었다. 4종류의 히스티딘이 풍부한 EBP, EBPP[H₃A₂I₁]_n 및 EBPP[H₅G₁]_n (n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 및 18) 및 EBPPI[H₃A₂I₁]_n 및 EBPPI[H₅G₁]_n (n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24, 30, 및 36)의 유전자는 분자생물학적 클로닝에 의해 제작되었으며, Xba I 및 BamH I이 처리된 상기 유전자들의 길이는 아가로스 젤 전기영동으로 확인되어 도 2에 도시되었다. 4종류의 히스티딘이 풍부한 EBP를 암호화하는 각 유전자의 DNA 길이는 각 유전자 조각 아래에 표시되었으며, 반복 유닛(n)이 동일한 경우, 동일한 DNA 길이를 가졌다. 반복유닛 n=1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24, 30, 또는 36일 때, EBP를 암호화하는 유전자의 DNA 길이는 각각 156, 246, 336, 426, 516, 606, 1146, 2226, 354, 624, 1164 또는 2244 bp였다. Xba I 및 BamH I 제한효소 처리한 DNA 서열은 EBP 암호화하는 유전자에 놓이지 않아 DNA 길이가 원래 유전자 크기보다 더 긴 66bp였다.

EBPP[H₃A₂I₁]_n, EBPP[H₅G₁]_n, EBPPI[H₃A₂I₁]_n, 및 EBPPI[H₅G₁]_n (n = 6, 12, 및 18)는 온도 반응성 EBPs에 대해 이전에 보고한 바와 같이 E. coli에서 발현되었고, ITC로 정제되었다. 도 3에서 구리-염색된 SDS-PAGE 젤은 EBPP[H₃A₂I₁]_n, EBPP[H₅G₁]_n, EBPPI[H₃A₂I₁]_n, 및 EBPPI[H₅G₁]_n가 ITC에 의해 정제되었다는 점을 보여준다. EBPP[H₃A₂I₁]_n, EBPP[H₅G₁]_n, EBPPI[H₃A₂I₁]_n, 및 EBPPI[H₅G₁]_n의 예상 분자량은 밴드 아래에 표시되어 있으며, SDS-PAGE 젤 양 끝 레인은 이동한 표준 단백질 크기 마커(migrated standard protein size markers)를 나타낸다. 각 EBP는 표준 단백질 마커와 비교했을 때 이론적인 분자량보다 더 많이 이동했다. EBP가 표준 단백질 마커에 비해 이론적인 분자량보다 약 20% 더 이동한다는 사실은 이전에 보고된 바 있다. EBPP[H₃A₂I₁]_n, EBPP[H₅G₁]_n, EBPPI[H₃A₂I₁]_n, 및 EBPPI[H₅G₁]_n의 이동 유형은 이전 연구결과와 일치한다.

도 4는 T_t에 미치는 EBP의 길이와 pH의 영향, 및 T_t의 pH 민감성에 미치는 히스티딘 비율의 영향을 조사하기 위해 10 mM의 phosphate buffer (PB) pH 6.4, 6.8, 7.4, 및 8.0와 10 mM의 PBS에서, EBPP[H₃A₂I₁]_n, EBPP[H₅G₁]_n, EBPPI[H₃A₂I₁]_n, 및 EBPPI[H₅G₁]_n의 열적 전이 거동을 보여준다. 도 4의 혼탁도 프로파일(Turbidity profiles)은 10 mM PB pH 6.4, 6.8, 7.4, 및 8.0와 10 mM PBS에서 1 °C/min의 가열속도로 350 nm에서, 25 μM EBPP[H₃A₂I₁]_n, EBPP[H₅G₁]_n, EBPPI[H₃A₂I₁]_n, 및 EBPPI[H₅G₁]_n의 흡광도를 측정함으로써 얻어진다. T_t는 도 4의 열적 플롯의 변곡점으로 규명되었으며, 하기 표 2에 정리하였다.

Phosphate Buffer PH	6.4	6.8	7.4	8.0	PBS
EBPP[H₃A₂I₁]₆	-	-	-	-	80 ~
EBPP[H₃A₂I₁]₁₂	60.11	54.22	50.28	50.47	46.57
EBPP[H₃A₂I₁]₁₈	58.17	48.17	43.37	44.47	37.62
EBPP[H₅G₁]₆	N/A	68.12	56.37	52.42	48.57
EBPP[H₅G₁]₁₂	61.12	49.17	40.37	36.52	35.57
EBPP[H₅G₁]₁₈	47.67	36.22	32.37	32.52	31.57
EBPPI[H₃A₂I₁]₆	48.12	43.22	40.27	40.42	37.57
EBPPI[H₃A₂I₁]₁₂	31.07	25.27	21.42	19.47	18.62
EBPPI[H₃A₂I₁]₁₈	35.17	29.27	23.37	21.47	20.62
EBPPI[H₅G₁]₆	56.17	47.27	40.37	37.51	31.72
EBPPI[H₅G₁]₁₂	40.12	30.32	21.37	17.42	18.62
EBPPI[H₅G₁]₁₈	41.13	32.22	25.37	23.52	23.67
PEDF-34mer-EBPPP[A₃G₂I₁]₃-EBPPI[H₅I₁]₆	50.12	45.20	42.37	44.49	41.57

EBP 블록 길이가 길어지고, PBS에서 NaCl의 농도가 증가함에 따라, 그들의 T_t가 낮아진다는 사실은 이미 보고된 바 있다. T_t에 미치는 EBP 길이의 영향은 도 3의 혼탁도 프로파일에 제시되어 있다. 반복유닛 12의 EBP의 T_t는 모든 조건에서 반복유닛 6의 EBP의 T_t보다 낮음을 확인할 수 있었다. PBS에서 정확한 EBPP[H₃A₂I₁]₆의 T_t는 수득하기 어려운데, 이는 EBPP[H₃A₂I₁]₆가 80 °C이상에서 상 전이를 보이며, 열적 플롯의 변곡점이 명확하지 않기 때문이다. 그래서, EBPP[H₃A₂I₁]₆의 T_t의 열적 플롯은 이전 보고에 따라, 1M NaCl을 첨가한 10 nM PBS에서 수득되었다. PB의 pH가 감소할 때, EBPP[H₃A₂I₁]_n, EBPP[H₅G₁]_n, EBPPI[H₃A₂I₁]_n, 및 EBPPI[H₅G₁]_n의 T_t는 증가했다. 이는 히스티딘의 이미다졸 고리의 양성자 첨가로 히스티딘이 (+)전하를 가져 EBP의 용해도를 증가시키기 때문이었다. 히스타딘의 pI는 중성인 약 7.64이나, 폴리펩타이드에서 히스티딘의 pKa는 R기의 pK값(5.97)에 의해 결정되므로, 히스타딘의 이미다졸 고리의 pKa 때문에 낮은 pH에서 T_t의 차이가 높은 pH에서보다 컸다. R기의 pK와 가까운 pH일수록 T_t에 미치는 영향이 컸다. H, G를 게스트 잔기(guest residue)로서 5:1로 포함하는 EBP의 T_t는 H, A, I를 게스트 잔기로서 3:2:1로 포함하는 EBP보다 더 pH의 영향을 많이 받았다. T_t의 pH 민감성에 대한 상기 경향성은 예상 결과와 매우 일치한다.

다양한 pH 완충액에서 EBPP[H₃A₂I₁]_n, EBPP[H₅G₁]_n, EBPPI[H₃A₂I₁]_n, 및 EBPPI[H₅G₁]_n의 열적 프로파일에 따르면, PEDF 34-mer peptide, EBPP[A₁G₄I₁]₃, 및 EBPPI[H₅G₁]₆로 구성된 융합 폴리펩타이드는 고안되었고, 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자의 클로닝으로 제조되었으며, E. coli에서 발현되었다. 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자 제작을 위해 우선 PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃을 클로닝했으며, 이후 EBPPI[H₅G₁]₆를 암호화하는 유전자를 포함하는 플라스미드에 PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃의 유전자를 삽입했다. 제작된 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자에 XbaI 및 Hind III 처리 후, 도 5(A)에 도시된 바와 같이 아가로스 젤 전기영동으로 확인했다. PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆의 DNA 길이는 924 bp였다. pET-21a 플라스미드는 XbaI 및 Hind III 제한효소 사이트를 가지고 있었고, PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆에는 상기 사이트가 존재하지 않았기 때문에, 아가로스 젤에서 각 유전자 조각 아래에 표시된 DNA 길이는 82bp로 원래 유전자보다 컸다.

PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆는 온도 반응성 EBPs의 정제에 대해 이전에 보고한 바와 같이 E. coli에서 발현되었고, ITC로 정제되었다. 정제된 PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆의 순도와 분자량은 SDS-PAGE에 의해 확인되었으며, 이는 구리-염색으로 시각화되어 도 5(B)에 도시되어 있다. PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆의 예상 분자량은 27.79 kDa로 밴드 아래에 표시되었으며, SDS-PAGE의 왼쪽의 레인은 표준 단백질 크기 마커의 이동을 보여준다 (24, 35, 40, 50, 65, 90, 110, 및 150 kDa 아래에서 위로). 표준 사이즈 마커와 이론적인 분자량을 비교했을 때, PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆의 이동은 단백질 표준 마커의 이동과 일치하지 않았다. 융합 폴리펩타이드는 단백질 표준 마커보다 더 많이 이동했으며, 이는 EBP는 단백질 표준 마커와 비교했을 때, 이론적인 분자량보다 약 20% 더 이동한다는 이전 보고와 매우 일치한다.

상 전이를 관찰하기 위해 온도가 증가함에 따른 상이한 pH 완충액에서 폴리펩타이드 용액의 흡광도를 측정함으로써 PEDF 34-mer-EBPP[A1G4I1]₃-EBPPI[H5G1]₆의 pH 및 온도 민감성을 특성화했다. 혼탁도 프로파일은 10 mM PB pH 6.4, 6.8, 7.4, 및 8.0와 10 mM PBS, 기타 첨가 없이 HUVECs culture medium (EBM-2)에서, 1 °C/min 의 가열속도로, 25 μM PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆의 흡광도를 측정함으로써 수득되었다(도 5(C)). (이 때, 기타 첨가물로는 human Epidermal Growth Factor (hEGF), Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), R3-Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1), Ascorbic Acid, Hydrocortisone, human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β), Heparin, Gentamicin/Amphotericin-B (GA) 및 2% FBS이 포함될 수 있다.) 각 조건에서 T_t는 도 5(C)의 열적 플롯의 변곡점으로 규명되었으며, 표 2에 요약되어 있다. 혼탁도 프로파일에 T_t에 대한 pH의 영향이 제시되어 있으며, T_t 값이 요약되어 있다. PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆의 T_t는 PB의 pH가 감소에 따라 증가했다(phosphate buffer pH 6.4, 6.8, 7.4, 및 8.0에서 각각 50.12, 45.20, 42.37, 및 44.49 °C). PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆의 T_t의 증가는 히스티딘의 이미다졸 고리의 양성자 첨가로 히스티딘이 (+)전하를 가져 EBP의 용해도를 증가시키기 때문이다. 양성자 첨가의 정도는 히스티딘의 이미다졸 고리의 pKa에 의존한다. 히스타딘의 pI는 중성인 약 7.64이나, 폴리펩타이드에서 히스티딘의 pKa는 R기의 pK값(5.97)에 의해 결정된다. R기의 pK와 가까운 pH일수록 T_t에 더 큰 영향을 미치며, 도 5(C)에서 PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆의 열적 플롯은 이와 일치했다. 표 2에서, PB pH 8.0에서 T_t값이 이론적으로는 PB pH 7.4에서 T_t값보다 낮아야 함에도 불구하고 PB pH 8.0에서 T_t값은 PB pH 7.4에서의 값보다 높았다. 이는 각 pH에서 열적 플롯의 형태 때문이며, 히스타딘의 이미다졸 고리의 pKa와의 간격 때문에 pH의 영향이 적었기 때문이다. T_t의 pH 민감성에 대한 상기 경향성은 이전 보고에 의해 잘 설명된다. 기타 첨가물 제외 또는 포함 EBM-2에서 PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆의 T_t는 각각 39.07°C 및 40.22°C를 나타내어, 10 mM PBS에서 T_t보다 낮았고, 두 상태의 전이온도들은 큰 차이가 없었다. 이는 PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆의 T_t가 EBM-2의 조성에 영향을 받았으나, PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆와 EBM-2에 첨가되는 요소들(human Epidermal Growth Factor (hEGF), Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), R3-Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1), Ascorbic Acid, Hydrocortisone, human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β), Heparin, Gentamicin/Amphotericin-B (GA) 및 2% FBS)과 상호작용하지 않는다는 것을 의미한다. 첨가물은 그들의 색에 따라 T_t보다 낮은 온도에서 흡광도의 증가만을 야기할 뿐이었다.

PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆는 다가성 PEDF 34-mer 펩타이드와 나노구조체로 자가조립되기 위해 소수성 EBPPI[H₅G₁]₆의 T_t보다 높은 온도에서 양친성을 가지도록 고안되었다. 소수성 EBPPI[H₅G₁]₆의 T_t보다 높은 온도에서, EBPPI[H₅G₁]₆블록은 소수성이 되며, EBPP[A₁G₄I₁]₃ 블록은 친수성을 유지하며 EBPPI[H₅G₁]₆보다 더 높은 T_t를 갖는다. 양친성 PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆는 다가성 PEDF 34-mer 펩타이드를 가진 다중자극 반응성 나노구조체로 자가조립되었다. PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆는 가용성의 유니머로부터 마이셀 구조로 자가조립되었고, 자가조립에 대한 pH의 영향은 동적 광산란(dynamic light scattering, DLS)에 의해 특성화되었다(도 5(D)). 10 mM PB pH 6.4, 6.8, 7.4, 및 8.0, 10 mM PBS, 기타 첨가 없는 및 기타 첨가된 HUVECs culture medium (EBM-2)에서 25 μM PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆의 유체역학적 반경(R_H)은 1 °C/min의 가열속도로 25 ~ 65 °C의 온도 범위에서, 각 온도마다 7번씩 측정되었다. 25 μM PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆는 모든 완충액에서 T_t보다 낮은 온도에서 가용성 유니머였으며, 각 조건에서 R_H는 약 10 nm였다. 온도가 T_t보다 높아지면, 10 mM PB pH 6.4, 6.8, 7.4, 및 8.0, 10 mM PBS, 기타 첨가 없이 EBM-2에서, PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆의 R_H는 즉시 50 nm 이상 증가했고, 자가조립체들은 일정한 값을 유지했다. 기타 첨가된 EBM-2에서 PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆의 R_H는 T_t보다 높은 온도에서 온도가 계속 증가함에 따라 계속적으로 불규칙하게 증가했다. 잠재적으로, 첨가물의 성장인자(Growth Factor)와 같은 요소는 가열로 변성되었고, 변성된 요소들의 응집은 R_H를 증가시켰다. PB pH 6.4 및 6.8에서 PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆의 T_t는 PB pH 7.4에서 T_t보다 높았다. PB pH 6.4에서 T_t의 증가율은 PB pH 6.8에서보다 더 컸다. DLS에서 PB의 pH에 따른 상기 T_t 변화 경향은 도 5(C)의 결과 및 이전 보고와 일치했다. T_t보다 높은 온도에서, PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆는 안정한 구조로 PB, PBS, 및 세포가 배양된 배지(Cell cultured medium)에서 자가조립되었고, 자가조립된 구조는 물리적 조건하에서 pH의 감소에 따라 붕괴되었다.

PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆은 도 5(C)에 도시된 바와 같이 물리적 조건 하에서 자가조립되었다. 내피세포의 성장, 이동 및 튜브 형성에 대한 PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆ 자가구조체의 농도에 따른 효과는 HUVECs 체외에서(in vitro) 평가되었다. calcein-표지된 HUVECs (4Х10⁴ cells/well)을 마트리겔이 사전 코팅된 48-well plates에서 키우고, 내피세포의 튜브 형성을 촉진하기 위해 상이한 농도의 PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]_n 및 50 ng/ml의 rhVEGF₁₆₅를 첨가하여 배양했다. calcein-AM 표지된 HUVECs의 형광 이미지 및 튜브 형성 정도는 HUVECs의 튜브 길이로 정상화되었으며, 도 6에 도시되어 있다. HUVECs의 튜브 길이는 HUVECs의 형광 신호를 추적하여 측정되었으며, 각 조건에서 평균으로 계산했다. 기타 첨가 없이 EBM-2에서 배양된 이동된 HUVECs의 튜브 길이를 기준(baseline)으로 하고, rhVEGF₁₆₅ 처리하고 EBM-2에서 4시간 배양한 HUVECs의 튜브 길이를 100%로 설정하여 각 농도에서의 값을 정상화했다. PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆ 자가조립체와 함께 배양된 HUVECs의 튜브 형성은 PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆의 농도가 0.5 - 5 nM 범위에서 증가함에 따라 점진적으로 감소했다. 0.1 nM보다 낮은 농도에서, 튜브 형성 정도는 rhVEGF₁₆₅ 처리한 HUVECs와 비교하여 큰 차이가 없었다. 5 nM의 PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆를 처리한 HUVECs는 튜브 형성에 있어 가장 큰 감소율을 보였다. 상기 체외(in vitro) HUVEC 튜브 형성 조사는 향상된 항-혈관신생 효과를 위한 PEDF 34-mer-EBPP[A₁G₄I₁]₃-EBPPI[H₅G₁]₆의 최적화된 농도를 보여준다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University ERICA Campus <120> Multi-stimuli responsive block copolypeptide-based drug delivery systems <130> DHP19-261-P1 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPP[H3A2I1]1 <400> 1 Val Pro Ala His Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala His Gly Val 1 5 10 15 Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala His Gly Val Pro Ala Ala Gly 20 25 30 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPP[H5G1]1 <400> 2 Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala His Gly Val Pro Ala His Gly Val 1 5 10 15 Pro Ala His Gly Val Pro Ala His Gly Val Pro Ala His Gly 20 25 30 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPPI[H3A2I1]1 <400> 3 Ile Pro Ala His Gly Ile Pro Ala Ala Gly Ile Pro Ala His Gly Ile 1 5 10 15 Pro Ala Ile Gly Ile Pro Ala His Gly Ile Pro Ala Ala Gly 20 25 30 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPPI[H5G1]1 <400> 4 Ile Pro Ala Gly Gly Ile Pro Ala His Gly Ile Pro Ala His Gly Ile 1 5 10 15 Pro Ala His Gly Ile Pro Ala His Gly Ile Pro Ala His Gly 20 25 30 <210> 5 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPP[A1G4I1]1 <400> 5 Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val 1 5 10 15 Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly 20 25 30 <210> 6 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEDF 34-mer <400> 6 Asp Pro Phe Phe Lys Val Pro Val Asn Lys Leu Ala Ala Ala Val Ser 1 5 10 15 Asn Phe Gly Tyr Asp Leu Tyr Arg Val Arg Ser Ser Thr Ser Pro Thr 20 25 30 Thr Asn <210> 7 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene for EBPP[H3A2I1]1 <400> 7 gtgccggcgc atggagttcc tgccgccggt gttcctgcgc atggtgtacc ggcaattggc 60 gttccggcac atggtgtgcc ggccgccggc 90 <210> 8 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene for EBPP[H5G1]1 <400> 8 gttccggccg gaggtgtacc ggcgcatggt gttccggcac atggtgtgcc ggctcacggt 60 gtgcctgcgc atggcgttcc tgcgcatggc 90 <210> 9 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene for EBPPI[H3A2I1]1 <400> 9 attccggccc atggcattcc tgcagccggt attccggcgc atggcattcc tgccattggc 60 atcccggcac atggcattcc ggccgccggc 90 <210> 10 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene for EBPPI[H5G1]1 <400> 10 attccggccg gaggcattcc tgcacatggt attccggcgc atggcattcc tgcccatggc 60 atcccggcac atggcattcc ggcccatggc 90 <210> 11 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene for EBPP[A1G4I1]1 <400> 11 gttccagctg gcggtgtacc tgctgctgct gttccggccg gtggtgttcc ggcgggcggc 60 gtgcctgcaa taggagttcc cgctggtggc 90 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene for PEDF 34-mer peptide <400> 12 VPAGGVPAHG VPAHGVPAHG VPAHGVPAHG 30

Claims

색소상피유래인자(epigment epithelial-derived factor: PEDF) 유래 펩타이드;
상기 PEDF 유래 펩타이드에 연결되는 친수성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(elastin based polypeptide: EBP); 및
상기 친수성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드에 연결되는 Histidine을 포함하는 소수성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드;를 포함하는 융합 폴리펩타이드로서,
상기 소수성 EBP는 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 융합 폴리펩타이드.
제1항에 있어서,
상기 Histidine을 포함하는 소수성 EBP는 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열로 이루어진 블록을 연속적이고 반복적으로 포함하되, 상기 반복 횟수는 6 내지 36인 것을 특징으로 하는, 융합 폴리펩타이드.
제1항에 있어서,
상기 친수성 EBP는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 블록을 연속적으로 3 내지 36회 반복하여 포함하는 것을 특징으로 하는, 융합 폴리펩타이드.
제1항에 있어서,
상기 PEDF 유래 펩타이드는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 융합 폴리펩타이드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드를 포함하는 다중 자극 반응성 약물전달체.
제5항에 있어서,
상기 자극은 온도 및 pH 인 것을 특징으로 하는, 약물전달체.
제5항에 있어서,
상기 융합 폴리펩타이드는 온도 자극에 의해 소수성 EBP가 코어 구조를 형성하고, 친수성 EBP가 쉘 구조를 형성하여 코어-쉘 구조의 자가조립 나노구조체를 만들고,
상기 나노구조체는 산성 조건에서 붕괴되는 것을 특징으로 하는, 약물전달체.
색소상피유래인자(epigment epithelial-derived factor: PEDF) 유래 펩타이드;
상기 PEDF 유래 펩타이드에 연결되는 친수성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(elastin based polypeptide: EBP); 및
상기 친수성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드에 연결되는 소수성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드;가 결합된 융합 폴리펩타이드를 포함하는, 혈관신생 억제용 약학적 조성물로서,
상기 소수성 EBP는 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제8항에 있어서,
상기 PEDF 유래 펩타이드는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제8항에 있어서,
상기 친수성 EBP는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 블록을 연속적으로 3 내지 36회 반복하여 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제8항에 있어서,
상기 소수성 EBP는 서열번호 3또는 4의 아미노산 서열로 이루어진 블록을 연속적이고 반복적으로 포함하되, 상기 반복 횟수는 6 내지 36인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제8항에 있어서,
상기 조성물은 혈관신생에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 것을 특징으로 하는, 혈관신생 억제용 약학적 조성물.
제12항에 있어서,
상기 혈관신생에 의해 유발되는 질환은 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 조숙아의 망막증, 황반부변성증, 맥락막 신생혈관생성증, 신생혈관성 녹내장, 각막혈관신생에 의한 안구질환, 각막 이식 시의 거부반응, 각막 부종, 각막 혼탁, 암(cancer), 혈관종, 혈관섬유종, 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 및 건선으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는, 혈관신생 억제용 약학적 조성물.