CN110869045A - 包含i型胶原及色素上皮衍生因子肽作为有效成分的预防或治疗新生血管性疾病的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种包含胶原和34‑mer色素上皮衍生因子(PEDF)肽为有效成分的预防或治疗新生血管疾病的药学组合物，更详细地，通过I型胶原和34‑mer PEDF肽联合给药，可以增加PEDF的短的抗新生血管活性周期，并扩大PEDF的给药量范围，因此，可以解决现有的PEDF的频繁注入而带来的不便和由此带来的副作用，并且，可适用为各种新生血管疾病的治疗剂。

Description

包含I型胶原及色素上皮衍生因子肽作为有效成分的预防或 治疗新生血管性疾病的药物组合物

技术领域

本发明涉及一种包含I型胶原及34-mer色素上皮衍生因子肽(Pigmentepithelium derived factor peptide)作为有效成分的预防或治疗新生血管性疾病的药物组合物。

背景技术

黄斑作为位于视网膜中心部的神经组织，大部分视细胞聚集在视网膜中心部，并且作为物体的图像形成的位置，负责中心视力。黄斑变性是一种随着年龄的增长而发展的情况较多的眼球疾病，并且其还是会引起黄斑区变性而引起视力障碍的眼球疾病，发病早期会引起视野模糊，并且近距离的视物翘曲，最终会导致失明。

目前，在65岁以上老人中，年龄相关性黄斑变性(Age-related maculardegeneration)成为了最常见的失明的原因，其作为世界第三的引起失明的疾病，全球范围内3千万名左右的患者受此病的困扰，并且，每年50万名的患者由于该疾病而丧失视力。

在韩国，65岁以上的16.5％的人患有早期黄斑变性，由于高龄人口的增长，患病率逐渐上升。发病时期也呈现从60多岁向40多岁、50多岁的中年人阶层下降的趋势。

年龄相关性黄斑变性大致分为萎缩性和渗出性两种类型，其中萎缩性类型在年龄相关性黄斑变性当中占有90％，并且作为黄斑部的视网膜色素上皮等出现异常导致中心视力渐渐地下降的疾病，至今除了戒烟、防紫外线和服用抗氧化剂之外，没有恢复其视力低下的治疗方法。

另外，渗出性类型在年龄相关性黄斑变性当中占有10％，并且相比萎缩性类型，其视力障碍发展速度更快、更严重。在渗出性类型的情况下，伴有眼底所见的脉络膜新生血管、感知性视网膜脱离、视网膜色素上皮撕裂，并且已知的年龄相关性黄斑变性而引起的失明中的70％～90％是由渗出性病变引起的。

色素上皮衍生因子(Pigment epithelium derived factor；PEDF)是一种具有抗新生血管作用的蛋白质，其被认为是可作为由新生血管引起的各种疾病的治疗剂的物质。目前，正在进行使用PEDF作为黄斑变性治疗剂的研究，但是，其被指出的问题包括：根据其半衰期短的特征而需要反复输注，并且用于治疗疾病的能够适用的浓度范围窄。因此，实际情况是需要解决上述PEDF的问题的研究，从而使黄斑变性的治疗效果最大化。

发明内容

发明所要解决的问题

本发明为了增强34-mer色素上皮衍生因子肽的抗新生血管效果，提供一种含有I型胶原为有效成分的组合物，并要提供包含I型胶原和34-mer色素上皮衍生因子肽为有效成分的眼球新生血管疾病的预防或治疗用组合物。

用于解决问题的方案

本发明提供一种包含I型胶原为有效成分，并提高34-mer色素上皮衍生因子(Pigment epithelium derived factor；PEDF)肽的抗新生血管效果的组合物。

另外，本发明提供一种预防或治疗眼球新生血管疾病的药学组合物，其包含I型胶原和由SEQ ID NO：1表示的氨基酸构成的34-mer色素上皮衍生因子(PEDF)肽作为有效成分，上述I型胶原能保持PEDF肽的眼球内新生血管抑制效果。

发明效果

根据本发明，当将34-mer色素上皮衍生因子肽和I型胶原联合给药时，抑制34-mer色素上皮衍生因子肽以高容量来进行处理时的新生血管的效果，并且由于确认了能长时间维持抗新生血管效果，I型胶原可以作为34-mer色素上皮衍生因子肽的载体或者佐剂(adjuvant)来使用。另外，当I型胶原和34-mer色素上皮衍生因子肽联合给药时，由于延长了34-mer色素上皮衍生因子肽的短的抗新生血管的周期，因此可以解决频繁注入所带来的不便和由此带来的副作用，并且可以扩大色素上皮衍生因子的给药量范围，因此，可以适用为各种新生血管疾病的治疗剂。

附图说明

图1是在HUVECs细胞模型中，确认根据34-mer色素上皮衍生因子肽和从猪中所分离的I型胶原的给药浓度的抑制管形成的效果的结果，图1的A及图1的B是在利用重组人VEGF-165进行处理而诱导管形成的HUVECs细胞中，通过0.2mg/ml的阿瓦斯丁(avstin)(对照组)和0.02pmol/ml、0.2pmol/ml、0.4pmol/ml、1pmol/ml及5pmol/ml的34-mer色素上皮衍生因子肽分别进行处理，并培养4小时后，对每组的管形成程度进行确认的结果；图1的C及图1的D是在VEGF-165诱导的HUVECs细胞中，通过I型胶原以0.01％、0.05％、0.1％浓度进行处理，且在4小时后对每组的管形成程度进行确认的结果。

图2是在通过激光照射而诱导视网膜病变的小鼠动物模型中，根据34-mer色素上皮衍生因子肽和I型胶原的给药浓度确认病变大小的结果，图2的A和图2的B是对于对照组用PBS进行处理，并且对于实验组分别将0.01pmol、0.05pmol、0.1pmol、10pmol的34-mer色素上皮衍生因子肽向眼球内注射的方式给药5日，并且在照射激光后第14日，通过显微镜进行拍摄的图以及对新生血管大小进行定量的图表；图2的C和2的B是对于对照组用PBS进行处理，对于实验组分别将0.1％、0.5％和1％的I型胶原向眼球内注射的方式进行给药，并且照射激光后第14日，通过显微镜进行拍摄的图以及对新生血管的大小进行定量的图表(其中，“CNV”表示脉络膜新生血管(Choroidal Neovascularization))。

图3是在HUVECs细胞模型中，对I型胶原作为34-mer色素上皮衍生因子肽的载体的可利用性进行确认的结果，图3的A和图3的B是利用重组人VEGF-165而诱导管形成的HUVECs细胞模型中，将0.05％和0.1％的I型胶原和0.02pmol/ml、0.2pmol/ml、1pmol/ml、10pmol/ml、50pmol/ml、100pmol/ml、200pmol/ml、500pmol/ml和1000pmol/ml的34-mer色素上皮衍生因子肽分别进行混合并进行给药后，通过荧光显微镜对每个实验组的管形成程度进行拍摄的结果中的代表性的图像结果，以及对每个实验组的管形成程度进行定量的图表。

图4是在HUVECs细胞模型中，为了确认34-mer色素上皮衍生因子肽的合适的载体，将透明质酸(hyaluronic acid，HA)、明胶及I型胶原单独或者与34-mer色素上皮衍生因子肽进行混合，并对细胞进行处理后，对抑制管形成的功效进行确认的结果，图4的A和图4的B是利用重组人VEGF-165而诱导管形成的HUVECs细胞模型中，将0.1％的I型胶原、0.1％的透明质酸、0.1％的明胶与浓度为0.02pmol/ml、0.2pmol/ml、1pmol/ml、10pmol/ml、50pmol/ml、100pmol/ml、200pmol/ml、500pmol/ml的34-mer色素上皮衍生因子肽分别进行混合并给药后，通过荧光显微镜对每个实验组的管形成程度进行拍摄的结果中的代表性的图像结果，以及对每个实验组的管形成程度进行定量的图表。

图5是在通过照射激光而诱导新生血管形成的动物模型中，对I型胶原作为34-mer色素上皮衍生因子肽的载体的可利用性进行确认的结果；图5的A示出了动物模型的实验方案，即图5的A是表示照射激光后，0.05pmol的34-mer色素上皮衍生因子肽单独给药或0.1％的I型胶原单独给药或将0.25pmol、2.5pmol、25pmol、50pmol、100pmol及200pmol的34-mer色素上皮衍生因子肽与0.1％的I型胶原进行混和并进行给药的时间的模式图；图5的B和图5的C是对由上述方法所处理的每个实验组中生成的新生血管的大小进行确认的结果。

图6是在通过激光照射而诱导新生血管形成的动物模型中，确认34-mer色素上皮衍生因子肽和I型胶原混合物的抗新生血管的效果是否与I型胶原的存在有关的结果，图6的A和图6的B是对0.1％的胶原单独处理组和25pmol的34-mer色素上皮衍生因子肽单独处理组及0.1％的I型胶原和25pmol的34-mer色素上皮衍生因子肽混合物处理组的抗新生血管效果进行拍摄的图和对新生血管大小进行定量的图表。

图7是在照射激光后的第七天的时间点，即新生血管完全形成以后，利用34-mer色素上皮衍生因子肽和I型胶原混合物进行处理来对抗新生血管效果进行确认的结果；如果图2、图5及图6中所示的是照射激光后立即给药并进行确认的预防效果确认概念的实验，那么图7则是治疗效果确认概念的实验。图7的A是显示动物实验的方案，即图7的A是表示照射激光后的第七天，用0.1％的I型胶原单独处理或用25pmol的34-mer色素上皮衍生因子肽单独处理及用0.1％的I型胶原和25pmol的34-mer色素上皮衍生因子肽混合物进行处理的时间的模式图；图7的B和图7的C是对通过上述方法进行处理的每个实验组中生成的新生血管的大小进行确认的结果。

图8是在HUVECs细胞中对34-mer色素上皮衍生因子肽和I型胶原混合物的作用机制进行确认的结果，图8的A和图8的B是通过重组人VEGF-165对HUVECs细胞进行处理后，对0.2pmol/ml或1pmol/ml的34-mer色素上皮衍生因子肽单独处理组和0.05％的I型胶原与1pmol/ml的34-mer色素上皮衍生因子肽混合物处理组执行蛋白印迹实验，从而对每组中产生影响的作用机制进行确认的结果。通过上述结果确认了包含于VEGF信号传导机制的MAPK信号传导机制(如JNK、p38、ERK)和AKt信号传导机制，并确认了色素上皮衍生因子的信号传导机制中的Wnt/beta-连环素(catenin)信号传导机制。图8的C是通过HUVECs细胞的管形成实验，使用图8的A和图8的B中所确认的信号机制的抑制剂，从而确认了管形成对信号机制的依赖与否。

图9是对I型胶原和34-mer色素上皮衍生因子肽混合物的透光性进行确认的结果，具体为，在380nm～780nm的可见光线波长下，以0.05％、0.1％及0.2％的浓度溶于PBS的I型胶原分别与34-mer色素上皮衍生因子肽混合的混合物中以10nm为单位测量吸光度，从而对每个混合物的透光性进行确认的结果。

图10是确认I型胶原和34-mer色素上皮衍生因子肽混合物滴眼剂(eye drop)对新生血管病变的治疗效果的结果，其中图10的A是说明实验过程的模式图；图10的B是用混合物进行处理后，对病变大小的减小程度进行确认的结果；图10的C是用浓度为5pmole及25pmole的34-mer色素上皮衍生因子肽与胶原或HA进行混合并进行处理后，对病变大小减小程度进行确认的结果。

图11是对I型胶原及34-mer色素上皮衍生因子肽混合物的稳定性进行确认的HUVECs管形成分析结果。

优选实施方式

本发明提供一种包含I型胶原为有效成分，并增强34-mer色素上皮衍生因子肽的抗新生血管效果的组合物。

上述34-mer色素上皮衍生因子肽的浓度范围能够是0.2pmol/ml至50pmol/ml。

上述I型胶原能够从猪中分离。

上述34-mer色素上皮衍生因子能够以SEQ ID NO：1的氨基酸构成。

另外，本发明提供一种预防或治疗眼球新生血管疾病的药学组合物，其特征在于，包含I型胶原和由SEQ ID NO：1的氨基酸形成的34-mer色素上皮衍生因子肽作为有效成分，上述I型胶原能够维持PEDF肽的眼球内血管生成抑制效果。

本发明中，能够包含0.2pmol/ml至50pmol/ml浓度范围的上述34-mer色素上皮衍生因子肽，并且上述I型胶原能够从猪中分离。

上述眼球新生血管疾病可以选自角膜新生血管疾病、糖尿病性视网膜病及脉络膜新生血管疾病及年龄相关性黄斑变性构成的组中。

根据本发明的一实施例，对于通过照射激光而诱导视网膜病变的实验动物中，给予浓度为0.1％、0.5％及1％的来源于猪的I型胶原，从而对胶原的新生血管的抑制效果进行确认，其结果如图2的C和图2的D所示，显示为随着胶原的处理浓度的增加，相反于抑制新生血管，反而会增加新生血管。

可以从上述结果来确认，高浓度的胶原不适合作为抑制新生血管的治疗剂。

但是，根据本发明的另一实施例，对于处理重组人VEGF-165而诱导管形成的HUVECs细胞，将34-mer色素上皮衍生因子肽单独给药或与I型胶原进行混合给药的结果，如图3所示，0.2pmol/ml浓度的34-mer色素上皮衍生因子肽单独给药组和34-mer色素上皮衍生因子肽与胶原混合给药组中显示出类似的管形成抑制效果。然而，34-mer色素上皮衍生因子肽单独给药的实验组中随着处理的34-mer色素上皮衍生因子肽的浓度增加，管形成急剧增加，相反，在I型胶原和高浓度的34-mer色素上皮衍生因子肽进行混合给药的实验组中，持续显示出管形成抑制效果。

另外，对于通过激光照射而诱导病变的实验动物中，将34-mer色素上皮衍生因子肽单独给药或将浓度为0.1％的来源于猪的I型胶原和34-mer色素上皮衍生因子肽混合给药，然后对胶原的新生血管抑制效果进行确认的结果，如图5所示，确认为34-mer色素上皮衍生因子肽单独给药组与0.1％的胶原和25pmol的34-mer色素上皮衍生因子肽混合物给药组显示出的新生血管抑制效果彼此类似。从上述结果确认为，将低浓度的34-mer色素上皮衍生因子肽进行5次给药时出现的效果和将高浓度的34-mer色素上皮衍生因子肽与I型胶原进行混合并进行1次给药时出现的效果类似。

因此，确认为当34-mer色素上皮衍生因子肽与I型胶原混合给药时，色素上皮衍生因子以高容量的方式处理时出现的新生血管效果被抑制，并且可以减少色素上皮衍生因子的给药次数的同时可以长时间保持抗新生血管的效果。

上述药学组合物可以包含0.01重量％～50重量％的34-mer色素上皮衍生因子和50重量％～99.99重量％的I型胶原。

将I型胶原和SEQ ID NO：1的氨基酸构成的34-mer色素上皮衍生因子肽与药用载体进行混合，从而上述药学组合物可以以滴眼剂形状的眼药、凝胶(gel)状的眼软膏或注射剂的方式被提供。

本发明的其他具体例中，包含上述I型胶原和SEQ ID NO：1的氨基酸构成的色素上皮衍生因子作为有效成分的预防或治疗新生血管疾病的药学组合物进一步包括选自通常用于制造药学组合物的载体、赋形剂、崩解剂、甜味剂、包覆剂、膨胀剂、润滑剂、增滑剂、增味剂、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂及润滑剂构成的组中的一种以上的添加剂。

具体地，载体、赋形剂及稀释剂可以使用乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油，并且用于口服给药的固体制剂包括有片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等；这种固体制剂可以将至少一个以上的赋形剂，如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等混合于上述组合物来进行制造。另外，除了单纯的赋形剂以外也可以使用如硬脂酸镁、滑石等润滑剂。用于口服的液体制剂具有混悬剂、内服溶液剂、乳剂、糖浆剂等，并且除了包括通常使用的作为单纯稀释剂的水、液状石蜡以外，还可以包括含各种赋形剂(例如，润湿剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等)。用于非口服给药的制剂包括有灭菌水溶液、非水性溶剂、混悬剂、乳剂、冻干制剂、佐剂等。可以将植物油(如丙二醇、聚乙二醇、橄榄油)、可注射的酯类(如油酸乙酯)等用作非水性溶剂、混悬剂。作为佐剂的基材可以使用半合成脂肪酸酯(witepsol)、聚乙二醇(macrogol)、吐温(tween)61、可可油脂、月桂酸甘油酯、甘油明胶等。

根据本发明的一实施例，上述药学组合物可以通过静脉内、动脉内、腹腔内、肌内、动脉内、腹腔内、胸骨内、经皮、鼻侧内、吸入、局部、经口、眼球内或皮内途径，以常规方式给药予对象体。

上述肽的优选给药量可根据对象体的状态及体重、疾病的种类及程度、药物形态、给药途径及时间而不同，其可根据本领域技术人员而进行适当的选择。

本发明在于，虽然上述“对象体”可以是包含人类的哺乳动物，但不局限于此。

具体实施方式

以下，为了帮助理解本发明，通过实施例来进行详细地说明。但是，下述的实施例是仅仅是示例本发明的内容，本发明的范围并非局限于下述实施例。本发明的实施例用于向本发明提供至本领域技术人员完整的对本发明进行说明。

<实验例1>管形成试验(Tube formation assay)

利用200μl基底膜基质(Matrigel)涂覆48孔板，并在37℃下保持1小时，并利用钙黄绿素(Calcein-AM)在37℃下对HUVECs细胞进行15分钟的染色。

在涂覆有基底膜基质的板的每个孔中种植2×10⁴个染色的HUVECs细胞，并利用重组人VEGF-165对每个孔进行处理，从而诱导细胞的管形成。

之后，利用I型胶原(I型胶原蛋白α1，部分[欧洲野猪]基因库：AAR03833.1)和34-mer色素上皮衍生因子肽(DPFFK VPVNK LAAAV SNFGY DLYRV RSSTS PTTN：SEQ ID NO：1)分别进行单独处理或进行混合处理，并在37℃下培养4小时后，对每组的管形成程度进行确认。

确认管形成程度是通过执行利用显微操作器(Micromanipulator)(奥林巴斯(Olympus))的图拍摄并测量管的长度来进行比较。

<实验例2>制作脉络膜新生血管形成模型

从东方公司(Orient)购入并使用5至8周龄的C57BL/6小鼠。

将5mg/mL托品酰胺(Tropicamide；日本，大阪，北区，参天制药有限公司(santenpharmaceutical co.ltd))滴眼液用于每只小鼠，使瞳孔扩张，并将100mg/kg氯胺酮(ketamine；韩国，京畿道，城南市，汇恩斯(Huons))注射到上述小鼠腹腔内，从而进行了麻醉。

进行麻醉后，将小鼠固定在小鼠固定台，并且利用裂隙灯显微镜激光系统，将强度为150mW至210mW的激光照射0.1秒，从而在小鼠的视网膜中的3点、6点、9点和12点方向共形成4个大小为50μm至100μm的病变。此时，照射激光时必须将上述病变制作为形成滴状形式，其对于破坏布鲁赫(Bruch’s)膜而形成新生血管非常重要。

在视网膜制造病变之后，对于对照组，将PBS注射到小鼠眼睛的玻璃体内，而对于实验组，将I型胶原(collagen)、34-mer色素上皮衍生因子肽及I型胶原和34-mer色素上皮衍生因子肽的混合物注射到小鼠眼睛的玻璃体内，并且以相同的方法，一日一次的进行给药，共给药1日或5日。

照射激光后的第14天，使用氯胺酮(100mg/kg)及赛拉嗪(Xylazine)(10mg/kg)对每实验组的小鼠进行麻醉，并将浓度为25mg/ml的FITC标记右旋糖酐(FITC-dextran)(西格玛奥德里奇(sigma aldrich)，圣路易斯，密苏里州，美国)100μl注入到眼眶后(retro-orbital)，从而对视网膜血管进行30分钟的染色。

将染色的眼球进行分离，并放入10％的福尔马林(formalin)中固定30分钟后，在显微镜下以固定的眼球的视网膜不会受损的方式小心地将眼球周围的肌肉、角膜、虹膜、晶状体及玻璃体进行去除，并以3点、6点、9点击12点方向切割成4部分之后盖上盖玻片(Coverslip)，并通过荧光显微镜拍摄病变，测量其大小并与对照组进行比较。

<实施例1>确认34-mer色素上皮衍生因子肽的临界点

在实验例1的管形成分析实验及实验例2的脉络膜新生血管模型中确认了34-mer色素上皮衍生因子肽(SEQ ID NO：1)的抗新生血管效果。

其结果，尽管如图1的A和图1的B所示，处理0.2pg/ml的34-mer色素上皮衍生因子肽的实验组中显示为管形成抑制效果最大，但是以相应浓度以上的高浓度来进行处理时，显示为管形成再次增加。另外，如图2的A及图2的B所示，在由激光而诱导的新生血管(CNV)模型中可以确认34-mer色素上皮衍生因子肽以0.01pmol、0.5pmol及0.1pmol的浓度进行处理时上述新生血管显著地减少，但是以10pmol的高浓度进行处理时，新生血管(CNV)再次增加。

从上述结果可知，尽管34-mer色素上皮衍生因子肽显示出抑制管形成，并且抑制由激光而诱导的新生血管的作用，但是当利用34-mer色素上皮衍生因子肽以高浓度进行处理时，确认了会再次诱导新生血管，因此可以确认为抑制新生血管而能进行处理的34-mer色素上皮衍生因子肽的浓度非常有限。

<实施例2>确认I型胶原的抗新生血管效果

为了确认I型胶原对管形成及新生血管的影响，在按照实验例1而准备的HUVECs细胞中，利用从猪胶原蛋白中提取的I型胶原分别以0.01％、0.05％及0.1％的浓度进行处理，并对管形成程度进行了确认。

其结果显示为，如图1的C及图1的D所示，胶原以浓度依赖性的方式抑制管形成。

但是，将0.1％、0.5％及1％的浓度的从猪中分离出的I型胶原施用于诱导视网膜病变的实验动物，并对胶原的抑制新生血管的效果进行确认的结果，如图2的C及图2的D所示，可以确认为随着胶原处理浓度的增加，新生血管的大小也增加。

从上述结果可以确认为，高浓度的胶原作为用于抑制新生血管的治疗剂是不合适的。

<实施例3>在管形成模型中确认I型胶原和34-mer色素上皮衍生因子肽的联合处理效果

在根据实验例1制造的管形成模型中，将34-mer色素上皮衍生因子肽单独给药或与I型胶原混合并进行给药的结果，如图3所示，尽管浓度为0.2pmol/ml的34-mer色素上皮衍生因子肽单独给药组和I型胶原混合给药组中显示出类似的抑制效果，但是在将高浓度的34-mer色素上皮衍生因子肽单独进行给药的实验组中管形成急剧增加，相反，在I型胶原和高浓度的34-mer色素上皮衍生因子肽进行混合处理的实验组中可以确认管形成抑制效果持续出现。

从上述结果能够提供一种与I型胶原的联合给药方法以便能够解决34-mer色素上皮衍生因子肽的处理浓度窄的问题。

<实施例4>在管形成模型中确认I型胶原或其他药物载体与34-mer色素上皮衍生因子肽的联合处理效果

对于管形成模型，将34-mer色素上皮衍生因子肽与各种物质进行联合处理，以便确认34-mer色素上皮衍生因子肽的最合适的载体。

在HUVECs细胞的管形成模型中，将34-mer色素上皮衍生因子肽单独进行给药或与I型胶原、透明质酸及明胶分别混合并进行给药，并确认管形成抑制效果。

其结果，如图4所示，在34-mer色素上皮衍生因子肽单独给药组与利用34-mer色素上皮衍生因子肽和I型胶原的混合物进行处理的模型中，确认了相同的抑制效果，相反，与透明质酸混合处理的模型组中未确认出具有显著性的管形成抑制效果。另外，仅用明胶单独进行处理时，也增加了管形成，并且还可以确认当利用明胶与34-mer色素上皮衍生因子肽进行联合给药时，反而增加了管形成。

从上述结果可以确认，I型胶原是能够扩大34-mer色素上皮衍生因子肽的有效治疗浓度范围的最合适的物质。

<实施例5>在脉络膜新生血管形成动物模型中确认I型胶原和34-mer色素上皮衍生因子肽的联合处理效果

基于之前的实验的确认结果，对于I型胶原作为34-mer色素上皮衍生因子肽的载体的可能性，在脉络膜新生血管形成动物模型中进行了确认。

首先，通过如图5的A所示的方法，对于对照组而言，将浓度为0.05pmol的34-mer色素上皮衍生因子肽分5次注射到根据实验例2制造的脉络膜新生血管形成动物模型中，并且对于34-mer色素上皮衍生因子肽和I型胶原混合物给药组而言，将0.1％的I型胶原和浓度为0.25、2.5、25、50、100及200pmol的34-mer色素上皮衍生因子肽注射到上述根据实验例2制造的脉络膜新生血管形成动物模型中，且注射一次。

其结果显示为，如图5的B及图5的C所示，高浓度的34-mer色素上皮衍生因子肽和I型胶原混合物给药组的新生血管抑制效果与低浓度的34-mer色素上皮衍生因子肽单独给药组的新生血管抑制效果类似。

从上述结果可以确认的是，当34-mer色素上皮衍生因子肽和I型胶原进行混合给药时，抑制了将34-mer色素上皮衍生因子肽以高容量的方式进行处理时出现的促进新生血管效果，由此可以减少34-mer色素上皮衍生因子肽的给药次数，并且可以长时间维持34-mer色素上皮衍生因子肽的抗新生血管效果。

另外，为了确认上述I型胶原和34-mer色素上皮衍生因子肽的联合处理效果是否与I型胶原的存在有关，将所制造的脉络膜新生血管形成动物模型分为PBS单独给药对照组、0.1％的I型胶原单独给药组、25pmol的34-mer色素上皮衍生因子肽单独给药组及0.1％的I型胶原和25pmol的34-mer色素上皮衍生因子肽混合物，并分别在照射激光后立即进行一次给药。

其结果，虽然如图6的A和图6的B所示，每个单独处理组中未出现与对照组类似的新生血管抑制效果，但是混合物处理组中确认了新生血管抑制效果。

从上述结果可以确认，I型胶原在减少药物给药次数的同时保持34-mer色素上皮衍生因子肽的抗新生血管的效果方面起到了重要的作用。因此，确认了I型胶原作为34-mer色素上皮衍生因子肽的药物载体或作为佐剂(adjuvant)的可利用性，并且I型胶原和34-mer色素上皮衍生因子肽的联合给药方式延长了34-mer色素上皮衍生因子肽的短的抗新生血管活性周期，从而能够解决现有的34-mer色素上皮衍生因子肽的频繁注入而带来的不便的问题，以及由此带来的副作用的问题，并且能够将34-mer色素上皮衍生因子肽的给药量范围扩大，从而可适用为各种新生血管疾病的治疗剂。

<实施例6>在完全形成新生血管的动物模型中确认I型胶原和34-mer色素上皮衍生因子肽的联合处理效果

在完全形成血管的动物模型中，为了确认新生血管治疗效果，按照如图7的A的方式制作的脉络膜新生血管形成动物模型中照射激光后，在完全形成新生血管的第7日的时间点，对于对照组进行PBS单独给药，对于实验组分别进行0.1％的I型胶原单独给药、25pmol的34-mer色素上皮衍生因子肽单独给药及将I型胶原和25pmol的34-mer色素上皮衍生因子肽混合物给药，且各自进行一次给药。

其结果，尽管如图7的B及图7的C所示，每个单独处理组以与对照组表现出类似的水平，即几乎未出现新生血管抑制效果，但是在混合物处理组中确认了新生血管抑制效果。

基于上述结果，确认了I型胶原和34-mer色素上皮衍生因子肽混合物对已经形成的新生血管也可以实现有效的治疗，因此可适用为已经形成的新生血管疾病的治疗剂。

<实施例7>确认I型胶原和34-mer色素上皮衍生因子肽的联合处理效果的作用机制

通过在HUVECs细胞中处理重组人VEGF-165，从而对VEGF信号传导机制进行激活后，将0.2pmol/ml或1pmol/ml的34-mer色素上皮衍生因子肽单独给药及将0.05％的I型胶原和1pmol/ml的34-mer色素上皮衍生因子肽混合物进行给药，之后执行蛋白印迹分析(western blot)，从而对信号传导作用机制进行确认。

另外，对VEGF诱导HUVECs细胞管形成适用了已确认作用机制的抑制剂，由此确认了其是否依赖于其机制。

其结果，确认了如图8的A及图8的B所示，在包含于VEGF信号传导机制的如JNK、p38、ERK等的MAPK信号机制和Akt信号传导机制以及如Wnt/beta-catenin信号传导机制的色素上皮衍生因子信号转导机制中，I型胶原和34-mer色素上皮衍生因子肽混合物能抑制JNK和ERK信号传导机制的活化，并且，还确认了如图8的C所示，通过JNK和ERK的抑制剂可以减少HUVECs细胞的管形成。

<实施例8>确认I型胶原和34-mer色素上皮衍生因子肽混合物的透光性

在I型胶原和34-mer色素上皮衍生因子肽混合物显示治疗效果的浓度中，在可见光波长下对其透光度进行了确认，从而分析了注射治疗剂时，上述混合物对当前视野的影响。

将I型胶原以0.05％、0.1％及0.2％的浓度溶解于PBS中，然后与34-mer色素上皮衍生因子肽进行混合，从而在380nm至780nm的波长下以10nm为单位对吸光度进行测量。

其结果确认为，I型胶原和34-mer色素上皮衍生因子肽混合物的透光度与PBS的可见光的波长透光度类似。

随着从上述结果确认的注射I型胶原和34-mer色素上皮衍生因子肽混合物并不会对当前视野造成阻碍，因此可以用作有效的治疗方法。

<实施例9>确认I型胶原和34-mer色素上皮衍生因子肽混合物滴眼剂的新生血管病变治疗效果

对小鼠进行麻醉，并通过照射激光来形成病变。

之后，通过如图10的A所示的过程，照射激光后将10μl的34-mer PEDF肽和I型胶原和混合物立即仅滴入于一侧眼中，并且以每日一次、持续两周的方式进行给药。

激光照射后的第14天，通过眼眶后注射(retro orbital injection)来注射FITC标记右旋糖酐(FITC-dextran)后提取眼球并进行铺片(flat mount)，从而对病变的治疗情况进行确认。

其结果，如图10的B所示，PEDF 34-mer肽和胶原混合物在50pmol、25pmol及5pmol的浓度下均显示出治疗效果，并且还可确认在50pmol浓度下，给药一侧的相反侧眼球中也显示出治疗效果。

并且，将浓度为5pmol及25pmol的PEDF 34-mer肽与胶原或者与HA混合的混合物的治疗效果相比较的结果，可以确认为，如图10的C及图10的D所示，尽管在25pmol的浓度下两个混合物显示出了功效，但是在作为更低浓度的5pmol的浓度下，只有与胶原进行混合的混合物显示出了治疗效果。

<实施例10>确认稳定性

为了确认PEDF 34-mer肽与胶原混合物的稳定性，将PEDF 34-mer肽和胶原混合物与PEDF 34-mer肽在4℃和室温(RT)下保管6周后，对PEDF34-mer肽与PEDF 34-mer肽和胶原混合物的稳定性进行了比较。

通过对每个混合物执行管形成分析来确认新生血管抑制效果。

通过其结果确认为，如图11所示，利用保管6周的PEDF 34-mer肽单独进行处理的实验组相对于利用实验之前制造的PEDF 34-mer肽进行处理的实验组进行比较，不能抑制管形成，但是与胶原混合的PEDF 34-mer肽混合物的情况下，相对于实验之前制造的混合物进行比较，管形成效果并未减小。

从上述结果可以确认，当PEDF 34-mer肽与胶原形成混合物时，能够保持稳定性。

以上，详细描述了本发明内容的特征部分，并且这样的具体的技术对本领域技术人员来说，仅是优选实施例，并且可以清楚地看出本发明的范围不限于此。因此，本发明的实际范围应由所附的权利要求和其等价物所定义。

<110> 仁济大学校产学协力团

<120> 包含I型胶原及色素上皮衍生因子肽作为有效成分的预防或治疗新生血管性疾病的药物组合物

<130> ADP-2017-0030

<160> 1

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 34

<212> PRT

<213> 色素上皮衍生因子肽

<400> 1

Asp Pro Phe Phe Lys Val Pro Val Asn Lys Leu Ala Ala Ala Val Ser

1 5 10 15

Asn Phe Gly Tyr Asp Leu Tyr Arg Val Arg Ser Ser Thr Ser Pro Thr

20 25 30

Thr Asn

Claims (10)

1.一种增强抗新生血管效果的组合物，其特征在于，

所述组合物包含I型胶原为有效成分，从而增强34-mer色素上皮衍生因子肽的抗新生血管的效果。

2.根据权利要求1所述的增强抗新生血管效果的组合物，其特征在于，

所述34-mer色素上皮衍生因子肽的浓度范围是0.2pmol/ml至50pmol/ml。

3.根据权利要求1所述的增强抗新生血管效果的组合物，其特征在于，

所述34-mer色素上皮衍生因子肽是从猪中分离出的。

4.根据权利要求1所述的增强抗新生血管效果的组合物，其特征在于，

所述34-mer色素上皮衍生因子肽是由SEQ ID NO：1表示的氨基酸构成。

5.一种预防或治疗眼球新生血管疾病的药学组合物，其特征在于，

包含I型胶原和由SEQ ID NO：1表示的氨基酸构成的34-mer色素上皮衍生因子肽作为有效成分，

其中，所述I型胶原能保持34-mer色素上皮衍生因子肽的眼球内新生血管抑制效果。

6.根据权利要求5所述的预防或治疗眼球新生血管疾病的药学组合物，其特征在于，

包含0.2pmol/ml至50pmol/ml浓度范围的所述34-mer色素上皮衍生因子肽。

7.根据权利要求5所述的预防或治疗眼球新生血管疾病的药学组合物，其特征在于，

所述I型胶原是从猪中分离出的。

8.根据权利要求5所述的预防或治疗眼球新生血管疾病的药学组合物，其特征在于，

所述眼球新生血管疾病选自角膜新生血管疾病、糖尿病性视网膜病及脉络膜新生血管疾病及年龄相关性黄斑变性。

9.根据权利要求5所述的预防或治疗眼球新生血管疾病的药学组合物，其特征在于，

所述药学组合物包含0.01重量％～50重量％的34-mer色素上皮衍生因子和50重量％～99.99重量％的I型胶原。

10.根据权利要求5所述的预防或治疗眼球新生血管疾病的药学组合物，其特征在于，

所述药学组合物通过将I型胶原和由SEQ ID NO：1表示的氨基酸构成的34-mer色素上皮衍生因子肽与药用载体混合，从而以滴眼剂形式的眼药、凝胶形式的眼软膏或注射剂的方式提供。

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