WO2005105130A1 - Nadphオキシダーゼ活性を抑制する色素上皮由来因子の新規治療用途 - Google Patents

Nadphオキシダーゼ活性を抑制する色素上皮由来因子の新規治療用途 Download PDF

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WO2005105130A1
WO2005105130A1 PCT/JP2005/007989 JP2005007989W WO2005105130A1 WO 2005105130 A1 WO2005105130 A1 WO 2005105130A1 JP 2005007989 W JP2005007989 W JP 2005007989W WO 2005105130 A1 WO2005105130 A1 WO 2005105130A1
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pedf
activity
nadph oxidase
tnf
disease
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PCT/JP2005/007989
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Sho-Ichi Yamagishi
Tsutomu Imaizumi
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Kurume University
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition or vector for preventing or treating vascular disorders.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition containing pigment epithelium-derived factor (PEDF) or a variant thereof as an active ingredient and a vector comprising a nucleic acid encoding PEDF or a variant thereof.
  • PEDF pigment epithelium-derived factor
  • Pigment epithelium-derived factor is a glycoprotein belonging to the superfamily of serine protease inhibitors. Initially, human epithelial pigment epithelial cells have a strong neuronal activity in human retinoblastoma cells. The culture supernatant strength was also purified (Reference 1). Recently, PEDF has been shown to inhibit angiogenesis very effectively in cell culture and animal models. PEDF inhibited retinal epithelial cell growth and migration and suppressed ischemia-induced retinal neovascularization (References 2 and 3).
  • PEDF epithelial cell
  • Atherosclerosis is also an inflammatory fibroproliferative disorder associated with EC (References)
  • ROS reactive oxygen species
  • ROS in vascular cells is mainly produced by NADPH oxidase (Reference 31), which is essential in cell pathophysiological responses, including cell growth, gene expression of adhesion molecules and cytoforce-ins. It is known (Reference 31).
  • NADPH oxidase is activated by a terminal sugar product (AGE), an aged large protein derivative that is accelerated in diabetes, thereby correlating acid stress with changes in gene expression in EC. It is thought that diabetic micro- and macrovascular disorders develop (Reference 32).
  • AGE terminal sugar product
  • PEDF significantly inhibits AGE-induced pericyte cell apoptosis and microvascular epithelial cell injury by suppressing ROS production (References 15 and 33).
  • the inventors thought that PEDF could prevent the progression of various types of vascular disorders, including diabetic vascular complications, by blocking the NADPH oxidase-mediated intracellular signaling pathway.
  • PEDF actually suppresses NADPH oxidase activity, especially that PEDF suppresses Rac activity in human umbilical vein endothelial cells (hereinafter referred to as HUVEC).
  • a pharmaceutical composition for inhibiting NADPH oxidase activity comprising an active ingredient selected from the group consisting of: a pharmaceutical composition for inhibiting the production of NADPH oxidase-mediated reactive oxygen species; and inhibiting NADPH oxidase activity Said pharmaceutical composition, which inhibits NF- ⁇ B activation, IL-6 expression, TNF- ⁇ activity, angiotensin II activity, and / or terminal glycation end signaling;
  • the pharmaceutical composition of the present invention for preventing or treating a disease caused by NADPH oxidase; more specifically, a disease caused by NADPH oxidase is a vascular disorder, a NF- ⁇ B activation-related disease, IL A pharmaceutical composition selected from the group consisting of a -6 expression-related disease, a TNF-a activity-related disease, an angiotensin II activity-related disease, and a terminal glycation product signaling-related disease;
  • a pharmaceutical composition of the invention wherein the vascular disorder is selected from the group consisting of vasculitis, atherosclerosis, acute coronary event, hypertension, insulin resistance, obesity, diabetic vascular complications, and cerebral infarction;
  • NF- ⁇ B activity is related to vasculitis, atherosclerosis, acute coronary event, hypertension, insulin resistance, obesity, diabetic vascular complications, cancer, inflammation, rheumatoid arthritis, liver disease,
  • IL-6 expression-related disease is coronary event, vasculitis, atherosclerosis, acute coronary event, hypertension, insulin resistance
  • a pharmaceutical composition of the present invention selected from the group consisting of sex, fatness, diabetic vascular complications, cancer, inflammation, rheumatoid arthritis, liver disease, kidney disease, cerebral infarction, and malignant myeloma;
  • TNF- ⁇ activity-related diseases are vasculitis, atherosclerosis,
  • a vector for suppressing NADPH oxidase activity comprising a nucleic acid encoding a variant of the pigment epithelium-derived factor (a) that is functionally equivalent to the factor; suppressing NADPH oxidase-mediated reactive oxygen species production
  • a vector that inhibits NADPH oxidase activity thereby inhibiting NF- ⁇ B activation, IL-6 expression, TNF-o; active angiotensin II activity and Z or terminal sugar product signal transduction;
  • the vector selected from the group consisting of a related disease, a TNF- ⁇ activity related disease, an angiotensin II activity related disease, and a terminal glycation end signaling related disease;
  • a vector of the invention wherein the vascular disorder is selected from the group consisting of vasculitis, atherosclerosis, acute coronary event, hypertension, insulin resistance, obesity, diabetic vascular complications, and cerebral infarction;
  • ⁇ B activity ⁇ 1 related disease power Vasculitis, atherosclerosis, acute coronary event, hypertension, insulin resistance, obesity, diabetic vascular complication, cancer, inflammation, rheumatoid arthritis, liver disease, kidney disease,
  • IL-6 expression related disease is coronary event, vasculitis, atherosclerosis, acute coronary event, hypertension, insulin resistance, obesity
  • a vector of the present invention selected from the group consisting of: urinary diabetic vascular complications, cancer, inflammation, rheumatoid arthritis, liver disease, kidney disease, cerebral infarction, and malignant myeloma
  • TNF- ⁇ activity Sex-related diseases are vasculitis, atherosclerosis, acute coronary
  • the present invention provides:
  • a method for preventing or treating a disease caused by NADPH oxidase comprising administering an active ingredient selected from the group consisting of to a patient in need of prevention or treatment of the disease caused by NADPH oxidase About.
  • the present invention provides:
  • It relates to the use of an active ingredient selected from the group consisting of for the manufacture of a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diseases caused by NADPH oxidase.
  • FIG. 1 shows the effect of PEDF on intracellular ROS generation in HUVEC.
  • Figure 1A shows
  • FIG. 2 is a graph showing the effect of TNF- ⁇ on intracellular ROS generation in HUVEC: *, P ⁇ 0.01 (compared to values without TNF- ⁇ ).
  • FIG. 1B is a graph showing the effect of PEDF, DPI, or anti-PEDF antibody (Abs) on intracellular ROS production in HUVEC: *, P ⁇ 0.01 (compared to the value of TNF- ⁇ alone).
  • Figure 1C shows the ROS generation for HUVEC
  • FIG. 3 is a graph showing DN-RacT17N: *, P ⁇ 0.01 (compared to the value of pseudo-transfected cells treated with TNF- ⁇ ).
  • FIG. 1D is a graph showing the effect of PEDF on TNF- ⁇ -induced Rac-1 mRNA levels.
  • FIG. 1E is a graph showing the effect of PEDF on TNF-o; induced Rac activity: *, P ⁇ 0.01 (compared to the value of TNF-a alone).
  • FIG. 2 is a graph showing the effect of PEDF on NADPH oxidase activity in HUVEC.
  • FIG. 2A is a graph showing the effect of PEDF on TNF- ⁇ -induced NADPH oxidase activity: *, P 0.01 (TNF-o; compared to single value).
  • FIG. 2B shows a typical photomicrograph of the cells under a confocal microscope.
  • FIG. 3 is a graph showing the effect of PEDF on NF- ⁇ B activity in HUVEC: *, P ⁇ 0.05 (compared to the value of TNF- ⁇ alone).
  • FIG. 3A is a graph showing that PEDF and NAC suppress TNF- ⁇ -induced increase in NF- ⁇ promoter activity.
  • Figure 3 ⁇ is a graph showing that TNF- ⁇ increases NF- ⁇ 65 activity, which is significantly inhibited by PEDF: *, P ⁇ 0.05 (compared to the value of TNF- ⁇ alone) .
  • FIG. 4 shows the effect of PEDF on IL-6 mRNA and protein levels in HUVEC.
  • FIG. 4A is a graph showing quantitatively the induction of IL-6 gene. Data were normalized by the intensity of the
  • FIG. 4B is a graph quantifying the induction of IL-6 protein: *, P ⁇ 0.01 (TNF-o; compared to single value).
  • FIG. 5 shows the effect of TNF-a on PEDF gene expression in HUVEC.
  • the lower panel shows the induction of the PEDF gene quantitatively. Data were normalized by the intensity of the 13-actin mRNA-derived signal and compared to control values. An unpaired t test was performed; p ⁇ 0.05 was considered significant: *, P ⁇ 0.01 (compared to control cell values).
  • FIG. 6 shows the binding of purified PEDF protein (A and B) and TNF-a (C) to HUVEC.
  • FIG. 6A is a ligand blot with fluorescein-labeled PEDF.
  • Figure 6B shows
  • FIG. 6C is a graph showing the effect of PEDF on TNF- ⁇ binding in HUVEC.
  • FIG. 7 A graph showing the effect of PEDF on angiotensin II (Angll) -induced NF- ⁇ activity in HUVEC: * indicates that P is 0.05 compared to Angll alone treatment group It shows that.
  • FIG. 8 is a graph showing the effect of PEDF on Angll-induced increase in MCP-1 mRNA and protein levels in HUVEC: * indicates that P ⁇ 0.01 is significant for Angll alone treatment group Show.
  • Figure 8A shows the effect of PEDF on MCP-1 mRNA
  • Figure 8B shows It is a graph which shows the effect of PEDF with respect to MCP-1 protein, respectively.
  • FIG. 9 A graph showing the effect of PEDF on Angll-induced intramolecular ROS generation in HUVEC.
  • Fig. 9A shows that ROS is generated by Angll (* indicates that it is significant at P ⁇ 0.01 compared to Angll untreated group), and
  • Fig. 9B shows that PEDF suppresses ROS generation. (* And * * marks are significant at P ⁇ 0.05 and P ⁇ 0.01, respectively, compared to Angll values).
  • FIG. 10 Graph showing the effect of PEDF on Angll-induced NADPH oxidase activity in HUVEC (*, * * marks are significant at P ⁇ 0.05 and P ⁇ 0.01, respectively, compared to Angll values. Show).
  • FIG. 11 is a graph showing the effect of PEDF on the generation of intracellular reactive oxygen species and NADPH oxidase activity in microvascular endothelial cells (* indicates AGE-BSA treatment group (shown as AGEs in the figure)) For P is 0.01).
  • FIG. 12 is a graph showing the effect on serum AGE fractionation in microvascular endothelial cells (* indicates that the PEDF-administered group is significant at P ⁇ 0.01 compared to the DM-HD group).
  • FIG. 13 is a graph showing the effect of intravenous administration on retinal vascular permeability in AGE-perfused rats (* indicates that PEDF administration group is significant at P 0.01 compared to non-administration group).
  • PEDF suppresses TNF-a-induced NADPH oxidase activity by two different methods shown in the examples described below (FIG. 2). Although the exact molecular mechanism is not clear, our study suggests that PEDF may inhibit TNF-a-induced NADPH oxidase activity by inhibiting Rac activation in HUVEC. Suggest.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used for preventing or treating NADPH oxidase disorders.
  • prevention includes prevention of recurrence.
  • NADPH oxidase mediates the production of reactive oxygen species (ROS).
  • ROS is a molecule such as hydrogen peroxide, an ion such as hypochlorite ion or superoxide-one, a radical such as hydroxyl radical, and is involved in sterilization.
  • ROS is a retinopathy And may cause acid stress, which plays a major role in atherosclerosis.
  • TNF-a significantly increased intracellular ROS production, which was completely suppressed by PEDF or NADPH oxidase inhibitor diph-ren'yordonium (hereinafter referred to as DPI). Furthermore, PEDF completely inhibited the increase in NADPH oxidase activity induced by TNF-a.
  • ROS reactive oxygen species
  • PEDF or the antioxidant N-acetylcystein significantly inhibited TNF-a-induced NF- ⁇ activity.
  • PEDF inhibited TNF- ⁇ induced IL-6 expression at both the mRNA and protein levels.
  • TNF- ⁇ decreased PEDF mRNA levels.
  • Ligand blot analysis revealed that HUVEC has a membrane protein with binding affinity for PEDF.
  • angiotensin II activates NF- ⁇ B, a transcription factor sensitive to redox in HUVEC, followed by the expression of MCP-1 (Monocyte Chemoattractant protein-1).
  • MCP-1 Monocyte Chemoattractant protein-1
  • NAC N-acetyl cystine
  • AGEs advanced glycation end products significantly stimulate the activity of intramolecular reactive oxygen species in microvascular endothelial cells, but they are completely suppressed by PEDF. Inhibiting NADPH Oxidase Induced by Terminal Glucose Products (AGE) as well as an increase in oxidase activity
  • the target diseases targeted by the present invention are those caused by NADPH oxidase, including, for example, vascular disorders, NF- ⁇ B activation-related diseases, IL-6 expression-related diseases, TNF-a activity 1 related disease, angiotensin ⁇ activity 1 related disease, and advanced glycation end product (AGE) signaling related disease.
  • NADPH oxidase including, for example, vascular disorders, NF- ⁇ B activation-related diseases, IL-6 expression-related diseases, TNF-a activity 1 related disease, angiotensin ⁇ activity 1 related disease, and advanced glycation end product (AGE) signaling related disease.
  • Vascular disorders include vasculitis, atherosclerosis, vasculitis, atherosclerosis, acute coronary event, hypertension, insulin resistance, obesity, diabetic vascular complications, cancer, inflammation, rheumatoid arthritis, Includes liver disease, kidney disease, cerebral infarction and the like.
  • NF- ⁇ B activity-related diseases include vasculitis, atherosclerosis, acute coronary event, hypertension, insulin resistance, obesity, diabetic vascular complications, cancer, inflammation, Rheumatoid arthritis, liver disease, kidney disease, and cerebral infarction are included.
  • the transcription factor NF- ⁇ B regulates pro-inflammatory site force-in and growth factor gene expression and plays a central role in the development of vascular dysfunction and atherosclerosis (Reference 34).
  • the present inventors have discovered that TNF-a significantly induces IL-6 expression at the mRNA and protein levels via the activity of NF- ⁇ .
  • PEDF or the antioxidant NAC significantly inhibits TNF-a-induced NF- ⁇ activation and subsequent increase in IL-6 mRNA expression, so PEDF inhibits IL-6 expression through its antioxidant properties. This has been reduced, and the inventors have provided much evidence in this regard as described herein.
  • IL-6 expression related diseases include coronary events, vasculitis, atherosclerosis, acute coronary events, hypertension, insulin resistance, obesity, diabetic vascular complications, cancer, inflammation, joints Includes rheumatism, liver disease, kidney disease, cerebral infarction, and malignant myeloma.
  • the power of the systemic inflammatory response in atherosclerosis can be explained by the action of IL-6.
  • IL-6 is a major inducer of hepatic synthesis of C-reactive protein (CRP), and elevated serum levels of IL-6 and CRP in patients with unstable angina are associated with poor prognosis Yes (Refs. 35, 36).
  • PEDF could have a beneficial effect on the progression of atherosclerosis by weakening IL-6 and CRP production.
  • PEDF may play an important role in the development and progression of atherosclerosis.
  • TNF-a activity-related diseases include vasculitis, atherosclerosis, acute coronary events, hypertension, insulin resistance, obesity, diabetic vascular complications, cancer, inflammation, joints Includes rheumatism, liver disease, kidney disease, and cerebral infarction.
  • TNF- ⁇ exerts pleiotropic effects on multiple cell functions through ROS generation (References 8, 13, and 14).
  • the examples shown below show that TNF-a induces ROS generation, NF- ⁇ activation and IL-6 expression.
  • the examples shown below also show that these functions elicited by TNF-o; were actually suppressed or inhibited by PEDF.
  • PEDF could be used to prevent or treat TNF-a activity, particularly TNF-a activity-related diseases based on NADPH oxidase activity.
  • Angiotensin II activity-related diseases include vasculitis, atherosclerosis, acute coronary events, hypertension, insulin resistance, obesity, diabetic vascular complications, and cerebral infarction.
  • Angiotensin II (Angll) is the dominant effector of the renin-angiotensin system and can modulate numerous inflammatory proliferative responses in vascular wall cells, thereby causing arteriosclerosis. It has been known.
  • the present inventors combined the test results other than the test results of the following examples, and PEDF inhibited the activity of vascular endothelial cells induced by Angll in vitro, and the mechanism was mediated by NADPH oxidase. It was found that this was caused by suppressing the occurrence of ROS.
  • PEDF has an important preventive and therapeutic effect on the onset and exacerbation of arteriosclerosis.
  • the present invention suppresses angiotensin II activity due to the inhibition of NADPH oxidase activity of PEDF, which makes it possible to suppress angiotensin II-derived diseases such as vascular disorders, particularly arteriosclerosis. It is possible to provide a preventive or therapeutic agent for cardiovascular diseases.
  • the present invention further provides a terminal sugar candy product by inhibiting NADPH oxidase activity ( Provided is a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetic vascular complications associated with AGE) generation, that is, glycation end products (AGE) signaling related diseases.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetic vascular complications associated with AGE that is, glycation end products (AGE) signaling related diseases.
  • End glycation end product (AGE) signaling related disorders include diabetic vascular complications such as reproductive diabetic retinopathy.
  • compositions and vectors of the present invention can be used to prevent or treat a number of diseases described herein more safely, more conveniently, and without concern about side effects.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition and Z or a vector therefor that prevent or treat a disease caused by NADPH oxidase.
  • the present invention only prevents or treats illness caused by NADPH oxidase, and does not exhibit an excessive effect.
  • the active ingredient can be selected from the group power consisting of:
  • a vector comprising a nucleic acid molecule encoding the factor (a) or the variant (b); and b) a variant of the factor having properties equivalent to those of the pigment epithelium-derived factor (a);
  • PEDF pigment epithelium-derived factor
  • PEDF produces DNA encoding the protein according to many publications and references such as Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). It can be produced from cocoon.
  • the expression plasmid is constructed by inserting the DNA of the present invention into an appropriate expression vector (eg pBK-CMV). Then, the expression plasmid is introduced into an appropriate host cell to obtain a transformed cell. Examples of host cells include prokaryotes such as E. coli, unicellular eukaryotes such as yeast, and multicellular eukaryotes such as insects and animals.
  • Expression plasmids can be introduced into host cells by conventional methods such as the calcium phosphate method, electroporation method, lipofuctin method and the like.
  • the desired protein is produced by culturing the transformant in an appropriate medium according to a usual method.
  • the protein thus obtained can be isolated and purified according to standard biochemical techniques.
  • PEDF variants having functionally equivalent properties to PEDF include all types of PEDF variants having functionally equivalent properties to human PEDF.
  • mutants of PEDF are described in US6319687, WO03059248, W09324529 and the like (the contents described in each document form part of the contents of the present application from the citation).
  • PEDF variants include amino acid sequences having one or more, or several amino acid residue changes that are substitutions, deletions and / or additions to the amino acid sequence of human PEDF. And variants of PEDF that have functionally equivalent properties to human PEDF.
  • Functionally equivalent to human PEDF means suppression of NADPH oxidase activity equivalent to human PEDF.
  • Variants of the invention can also be prepared by the recombinant techniques described above. Whether or not the mutant prepared as described above has functionally equivalent properties can be proved according to the examples described later in this specification.
  • composition of the present invention containing PEDF or a variant thereof can also optionally contain a conventional carrier.
  • a pharmaceutical composition of the invention containing PEDF or a variant thereof can be administered, for example, by intradermal, subcutaneous or intravenous injection.
  • PEDF or a variant thereof is administered directly to the site where the lesion is present by injection.
  • the amount of protein in such a formulation will vary depending on the disease being treated, the age and weight of the patient, etc.
  • PEDF or a variant thereof O.OOOlmg-1000 mg, preferably every day or every few months, daily (can be administered once or in several divided doses) O.Olmg-100 mg, more preferably O.Olmg-10 mg is administered.
  • the active ingredient contained in the pharmaceutical composition of the present invention comprises pigment epithelium-derived factor, or one or several amino acid residues that are substitutions, deletions and Z or additions to the amino acid sequence of pigment epidermis It may be a vector containing a nucleic acid encoding a variant thereof that contains a change and has a functionally equivalent property to the pigment epithelium-derived factor.
  • nucleic acid includes DNA and RNA, which may be single-stranded or double-stranded. Nucleic acids are easily prepared according to standard DNA synthesis or genetic engineering methods, as described in standard texts such as f row XJ Molecular Cloning, 2nd ed., Old Spring Harbor Laboratory Press (1989). be able to.
  • PEDF or a variant thereof is highly expressed in the cancer cells of the patient. That is, these vectors are useful for gene therapy as are routinely used.
  • vectors include cells that incorporate the aforementioned nucleic acids into DNA or RNA viruses, such as retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpes viruses, cocoon viruses, box viruses, polioviruses, or Sindbis viruses.
  • the virus vector to be introduced is included. Of these methods, those using retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses or cuticular viruses are particularly preferred.
  • Specific examples of the vector include pAd / CMV / V5-DEST Gateway Vector (Invitrogen).
  • composition containing the vector of the present invention may also contain a conventional carrier, if necessary.
  • a pharmaceutical composition comprising such a vector can be administered, for example, by intradermal administration, subcutaneous administration or intravenous injection.
  • PEDF or a variant thereof is administered directly to the site where the lesion is present.
  • the amount of vector in such a formulation will vary depending on the disease to be prevented or treated, the age and weight of the patient, etc., but is typically daily (in one or several divided doses). Every few months.
  • the nucleic acid is administered at 0.0001 mg-100 mg, preferably O.OOlmg-10 mg.
  • the present invention also encompasses the aforementioned vectors themselves.
  • HUVEC has a membrane protein with binding affinity for PEDF.
  • PEDF force exerts its effect through the interaction with TNF- ⁇ receptor, and we have to investigate it. Since the present inventors have revealed for the first time that PEDF-specific binding protein exists in the cell membrane of cultured HUVEC (FIG. 6A), it is unlikely. Scatchyard analysis of the binding data revealed that it is a single class high affinity receptor (FIG. 6B). Antibodies against peptides in the receptor binding region of PEDF (Reference 15) completely neutralized the anti-acidic properties of PEDF (Fig. 1B). Furthermore, as shown in FIG.
  • PEDF exerted a force that prevented the binding of TNF- ⁇ to its receptor.
  • we results suggest that there are PEDF-specific binding proteins involved in the inhibition of TNF-o; -induced ROS production in HUVEC.
  • Reference 30 it was reported that different types of PEDF-binding proteins with Kd values of 1.7-3.6 nM and 80-85 kDa exist on retinoblastoma, and cell type-specific PEDF receptors. This suggests that there is a possibility that it exists.
  • HUVEC we used HUVEC to examine TOS-a induced ROS (reactive oxygen species) production. TNF- ⁇ exerts pleiotropic effects on many cell functions through the generation of ROS (References 8, 13, and 14).
  • the present inventors first examined whether and how to inhibit TUV-!-Induced intracellular ROS production in HUVEC using TNF-a. Next, the present inventors examined the effect of PEDF on NF- ⁇ activation and subsequent IL_6 expression in TNF-a-exposed HUVECs.
  • PEDF protein was purified as previously reported (Reference 15). SDS-PAGE analysis of the purified PEDF protein showed a single band with a molecular weight of approximately 50 kDa, which was positive for anti-human PEDF monoclonal antibody (Reference 15). Polyclonal antibodies against human PEDF were also prepared as previously reported (Reference 15).
  • PEDF cDNA was first isolated from the human placenta cDNA library (Clontech, Palo Alto, CA) and inserted into the mammalian expression vector pBK-CMV (Stratagene, La Jolla, CA) as previously reported (Reference 35). .
  • PEDF a gene encoding PEDF was isolated from the cDNA library by PCR under the following conditions:
  • the PCR product was ligated to the Sma I site of pBluescript II KS.
  • the structure was confirmed by restriction enzyme digestion and sequencing, and it was also confirmed to contain an Xba I site on the 5 'side.
  • the plasmid pBK-CMV-PEDF which is the PEDF-expression vector, was obtained by inserting between the Nhe 1 (Brant) and Xba I sites of (STRATAGENE).
  • an expression vector for purifying PEDF was constructed according to the following procedure.
  • the ligated product was inserted into purified pBK-CMV-PEDF cut with Bgl II and Xba I. Structure confirmed by restriction enzyme digestion and sequencing [0038]
  • a portion of the enhancer isolated from pcDNA4-HisMax (Invitrogen) using Sac I and Xba I was ligated to the same restriction enzyme site of pBluescript II KS. After isolation of the clone, the vector was cleaved at the Nco I site (Brant) and Bam HI site to obtain a vector backbone.
  • 5′-GCATGCAGGCCCTGGTGCTACTCC -3 ′ (SEQ ID NO: 8) (Sph I site inserted at PEDF 5 ′ end) and 5 ′
  • HUVEC (Clonetics, CC-2517) was cultured in EBM medium supplemented with 2% ushi fetal serum, 0.4% ushi brain extract, 10 ng / ml human epidermal growth factor and 1 ⁇ g / ml hydrocortisone .
  • TNF-o treatment was carried out in medium without epidermal growth factor and hydrocortisone! /.
  • ROS active oxygen species
  • HUVEC was treated with 10 ng / ml TNF- ⁇ for the time indicated, and then intracellular ROS generation was performed using the fluorescent probe CM-H DCFDA (Molecular Probes Inc., Eugene, OR) as previously reported.
  • intracellular ROS production was detected as described above.
  • the ratio of ROS formation is relative to the value of the control with no additive and is shown on the vertical axis.
  • the results are shown in Figure 1B.
  • PEDF or DPI has been shown to completely inhibit TNF-a-induced increases in ROS production.
  • Example 1 PEDF was shown to completely inhibit the increase in ROS production induced by TNF- ⁇ , similar to DPI. However, since pharmacological inhibitors such as DPI are not completely specific for certain target cells, we investigated here the mechanism of PEDF inhibition of ROS production.
  • DN-RacTl 7N dominant negative human Rac-1 mutant
  • DN-RacT17 completely blocks the action of GTPase Rac-1 (Reference 28), an essential component of NADPH oxidase.
  • DN-RacT17N expression vector (provided by Dr. Horiguchi) (Reference 16) or an empty vector was transiently transfected into HUVEC.
  • DN-RacT17N-transfected and mock transfectants HUVEC were treated with 10 ng / ml TNF- ⁇ for 24 hours, and ROS was quantitatively analyzed. The ratio of ROS production is relative to the value of mock transfectant control cells without TNF- ⁇ .
  • FIG. 1C DN-RacT17N overexpression completely inhibited TNF-a-induced increase in ROS production.
  • TNF-a could induce ROS production through Rac-1 expression and activation in HUVEC.
  • HUVECs were treated for 4 hours with or without 10 ng / ml TNF- ⁇ in the presence or absence of 10 nM PEDF and then analyzed by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • the lower panel shows a quantitative representation of Rac-1 gene induction. Data are normalized by the intensity of the signal derived from j8-actin mRNA and contrasted with the control. As shown in FIG. 1D, TNF- ⁇ moderately but significantly increased Rac-1 mRNA levels, which were completely suppressed by 10 nM PEDF.
  • Rhin activity was measured using Rac Activation Assay Kit (Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY). HUVECs were treated with or without 10 ng / ml TNF- ⁇ in the presence or absence of 10 nM PEDF for 24 hours. As shown in FIG. 1E, the Rac-GTP pull-down assay showed that TNF-a significantly activated Rac, which was also completely inhibited by PEDF treatment.
  • the inventors next examined whether PEDF can actually suppress NADPH oxidase activity.
  • NADPH oxidase activity was measured by luminescence assay in phosphate buffer (50 mM, pH 7.0) containing 100 ⁇ M NADPH as a substrate (Reference 20).
  • TNF- ⁇ significantly increased NADPH oxidase activity. It was completely suppressed by 10 nM PEDF.
  • the increase in NADPH oxidase activity induced by TNF- ⁇ approximated the increase in ROS production.
  • TNF-a increased NADPH oxidase activity approximately 1.3 times. PEDF alone does not affect NADPH oxidase activity in HUVEC.
  • HUVECs were treated for 24 hours. The cells were then incubated in Dulbecco's modified Eagle's medium without phenol red containing 2 M dihydroethyl. After 30 minutes, the cells were imaged with a confocal laser microscope. As shown in Figure 2B, cell staining with dihydroethyl also revealed that PEDF inhibited TNF- ⁇ -induced NADPH oxidase activity in HUVEC. TNF- ⁇ did not increase the mRNA level of p22phox or gp91phox, one of the key components of NADPH oxidase in HUVEC.
  • ROS reactive oxygen species
  • Dr. Fujita T (Department of Tumor and ell Biology, Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science), which includes an NF- ⁇ B promoter linked upstream of the luciferase reporter gene (Reference 21 ). Treat HUVEC for 4 hours with or without 10 ng / ml TNF-a in the presence or absence of 1 or 10 nM PEDF or the antioxidant 1 mM NAC, then NF- ⁇ as previously reported ⁇ Lucifer erase activity was measured (Reference 17). The ratio of luciferase activity is relative to the control value. As shown in Fig. 3 T, TNF-a significantly increased NF- ⁇ - promoter activity. PEDF and the antioxidant NAC were found to partially but significantly suppress TNF- ⁇ -induced increase in NF- ⁇ B promoter activity.
  • NF- ⁇ B p65 activity In order to measure NF- ⁇ B p65 activity, nucleoproteins were extracted and their binding activity to the NF- ⁇ 65 consensus sequence was measured using the TansFactor kit. HUVEC at 4 o'clock with or without 10 ng / ml TNF- ⁇ in the presence or absence of 10 nM PEDF Processed for a while. Extracting nuclear proteins from cells using TransFactor extraction kit (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, Calif.), TransFactor NF- ⁇ 65 kit (BD
  • the amount of poly (A) + RNA (30 ng) and number of cycles for amplification are: Selected in a quantitative range in which the reaction proceeds linearly (determined by plotting signal intensity as a function of saddle amount and cycle number) (Ref. 27).
  • the primer sequences used in semi-quantitative RT-PCR are human Rac-1 nucleotide 5, -ACCCCTTCTGACTGAGCAATATGCC-3, (SEQ ID NO: 10) and 5, -CAATAGGCAAAGCGACTACAGGAGG-3, (SEQ ID NO: 11) (Reference 22) ), Human IL-6 mRNA, 5, -CCTTCTCCACAAGCGCCTTC-3, (SEQ ID NO: 12) and 5,
  • -GGCAAGTCTCCTCATTGAATC-3 (SEQ ID NO: 13) (Reference 23) and human PEDF mRNA 5; -TCACAGGCAAACCCATCAAGCTGAC-3, (SEQ ID NO: 14) and 5, -GCCTTCGTGTCCTGTGGAATCTGCT-3, (SEQ ID NO: 15) (Reference 24) )Met.
  • the internal oligodeoxyribonucleotide probes for detecting human IL-6 and PEDF cDNA are 5, -TCAATTCGTTCTGAAGAGGTGAGTGGCTGT-3, (SEQ ID NO: 16) and 5, -CGCCCCATCCTCGTTCCACTCAAAGCC-3, (SEQ ID NO: 17).
  • PDTC pyrrolidine dithio-rubamate
  • HUVECs were treated for 24 hours with or without 10 ng / ml TNF-a in the presence or absence of 1 or 10 nM PEDF.
  • IL-6 protein released into the medium was measured using an ELISA kit according to the manufacturer's instructions.
  • PEDF was also clearly able to significantly inhibit the secretion of IL-6 protein, which has been exposed to TNF-a-exposed HUVEC (Fig. 4B).
  • HUVECs have cell surface proteins that show binding affinity for PEDF.
  • HUVEC-derived surfactant-soluble cell membrane proteins were separated on a 15% polyacrylamide gel and transferred to a polyvinylidene difluoride membrane.
  • membranes and 30 nM fluorescein-labeled PEDF were incubated in the absence (lane 1) or presence (lane 2) of a 20-fold excess of unlabeled PEDF protein.
  • the resulting immune complex was visualized by CDP-Star chemiluminescence system.
  • FIG. 6A a HUVEC membrane protein having a molecular weight of about 60 kDa bound to a fluorescein-labeled PEDF protein.
  • the binding signal is almost undetectable in the presence of a 20-fold excess of unlabeled PEDF protein, which causes fluorescein labeling on membrane extracts of cultured HUVECs.
  • PEDF binding to the membrane in HUVEC is about 1.3 times higher.
  • Radiolabeled PEDF was prepared as previously described from (Reference 15) purified PEDF protein 1 25 1.
  • concentration of 125 I-PEDF protein showing HUVEC and the absence (black circle) or presence (non-specific binding, white circle) of 20-fold excess of molecule-unlabeled PEDF protein were incubated.
  • Specific PEDF binding was measured as previously reported (Reference 15).
  • Specific binding black squares was calculated by subtracting non-specific binding from total binding. All experimental points were shown as an average of 4 cases.
  • Dissociation constant (K) 84.7 ⁇ single class binding site ( ⁇ d max per HUVEC cell)
  • the present inventors examined whether PEDF inhibits receptor binding of TNF-a in HUVEC ( 125I -TNF- ⁇ binding assay). Incubate HUVEC with 10 ng / ml 125 I-TNF- ⁇ at 4 ° C for 90 min in the presence or absence of 10 nM PEDF, then lyse the cells with 1 M NaOH and report the radioactivity of the cell lysate (Reference 15).
  • HUVEC were treated with 100 nM angiotensin II (Angll) for 4 hours in the presence or absence of 10 nM PEDF, and NF- ⁇ luciferase activity was measured. Angll untreated was also tested.
  • HUVEC were cultured in a sputum medium supplemented with 2% fetal bovine serum (FBS), 0.4% bovine brain extract, 10 ng / mL human epidermal growth factor and 1 ⁇ g / mL hydrocortisone.
  • FBS fetal bovine serum
  • bovine brain extract 10 ng / mL human epidermal growth factor
  • hydrocortisone 1 ⁇ g / mL hydrocortisone from the medium.
  • the measurement of luciferase activity was performed by Yamagishi S. et al. Using a plasmid in which the NF- ⁇ B promoter was connected upstream of the luciferase reporter gene.
  • MCP-1 is one of the NF- ⁇ B target genes and induces chemotaxis to monocytes in vitro and in vivo. Therefore, we examined the effect of PEDF force HUVEC on the expression of MCP-1.
  • Poly (A) T RNA isolated from HUVEC was treated with 100 nM Angll in the presence or absence of 10 nM PEDF for 4 hours. Measured by PCR. Angll untreated was also tested. RT-PCR method is It was performed by the method described in Yamabeishi S et al. Diabetologia.1998; 41: 1435-1441.
  • HUVEC was treated with 100 nM Angll in the presence or absence of 10 nM PEDF for 24 hours, and the MCP-1 protein produced in the medium was analyzed by the ELIZA method. Measured with Angll untreated was also tested.
  • ROS is known to regulate the expression of genes that induce arteriosclerosis through transcriptional activation of NF- ⁇ B (eg Grindling KK et al. Cir. Res. 1994; 74:
  • ROS begins to occur after 4 hours by Angll and reaches its maximum in 24 hours. In 24-hour cultures at 100 nM Angll, 1.4-fold ROS generation was observed. Therefore, the effect of PEDF on the occurrence of ROS was investigated. HUVEC with 1 nM or 10 nM PEDF, 10 nM PEDF with 50 g / mL anti-PEDF antibody, and 100 nM Angll in the presence or absence of 50 nM DPI for 24 hours The ROS was quantified as described above. As a result, as shown in FIG.
  • PEDF suppressed the increase of ROS induced by Angll in a concentration-dependent manner, and was completely suppressed by 10 nM PEDF.
  • anti-PEDF antibody for example, J. Mol. Cell. Cardiol. 2004; 37: 497-506 by Yamagishi S. et al.
  • the inhibitory action was neutralized. It can be seen that PEDF acts specifically.
  • DPI known as a NADPH oxidase inhibitor, suppressed ROS generation, PEDF The molecular mechanism of action is thought to be inhibition of NADPH oxidase.
  • Example 8 Application to diabetic vascular complications associated with the production of terminal sugar ⁇ products (AGE) by inhibiting NADPH oxidase activity
  • vascular endothelial cells Human adult skin microvascular endothelial cells (hereinafter referred to as vascular endothelial cells) are treated with antisense DNA for 1M or 10M PEDF, 50M DPI or terminal glycan end product (AGE) receptor (RAGE) mRNA ( 10 ⁇ ) in the presence or absence of AGE-treated bovine serum albumin (AGE-BSA) or non-sugar cochlear serum albumin at the specified concentration for 24 hours, and then reactive oxygen species (ROS) Quantitative analysis.
  • AGE-BSA was prepared by the method described in Reference 15.
  • CM-H2DCFDA Molecular Probes In
  • CM-H2DCFDA Molecular Probes In
  • * indicates that the value treated with 100 / zg / ml AGE-BSA is significant at P ⁇ 0.01.
  • BSA shows the result of treatment with non-sugar cochlear serum albumin
  • AGEs shows the result of treatment with AGE-treated bovine serum albumin.
  • PEDF showed a better inhibitory effect than RPI on ROS production from serum albumin modified by AGE.
  • NADPH oxidase activity was measured by the luminescence method. That is, the cells were suspended in a buffer (ImM EDTA containing 20 mM Hepes, pH 7.0, lOOmM potassium chloride, protease inhibitor cocktail), and the cell homogenate was prepared by ImMEDTA, 150 mM sucrose, electrons, by the method described in Reference 20. It was measured by the luminescence method in a 50 mM phosphate buffer ( ⁇ 7.0) containing 5 ⁇ lucigenin as an acceptor and 100 ⁇ M NADPH as a substrate. The results are shown in Fig. 11 (b). As is clear from this figure, PEDF showed an excellent NADPH oxidase inhibitory effect on serum albumin-treated cells modified with AGE.
  • a buffer ImM EDTA containing 20 mM Hepes, pH 7.0, lOOmM potassium chloride, protease inhibitor cocktail
  • Human adult skin microvascular endothelial cells (Clonetics Corp.), the vascular endothelial cells used in this experiment (a) and (b), are 5% fetal bovine serum, 0.4% bovine brain extract, 10ng / ml human epithelial growth.
  • the cells were cultured in Yeosin'methylene blue medium supplemented with factors and 1 ⁇ g / ml hydrocortisone.
  • AGE treatment was performed in a medium excluding human epidermal growth factor and hydrocortisone.
  • AGE fraction is obtained from hemodialysis diabetic patients (DM-HD) serum or healthy human (Normal) serum with informed consent by a conventional method, and the fraction is used for microvascular endothelial cells in the presence or absence of lOnMPEDF. Treated in the presence for 24 hours.
  • the results of quantitative analysis of the production of superoxide, which is a reactive oxygen species, are shown in FIG. Where superoxa Id formation was performed by culturing the cells obtained as described above in phenol red-free Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 3 M dihydrozyme, and measuring the fluorescence intensity after 30 minutes. The cells were imaged and quantitatively analyzed with a laser scanning confocal microscope. As is clear from this figure, PEDF significantly suppressed the production of reactive oxygen species by cellular force treated with the AGE fraction from hemodialysis diabetic (DM-HD) serum.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • BRB damage was calculated by the formula of [(a) / (b)] / [( C ) x (d)].
  • (a) is the amount of FITC-conjugated dextran in the retina ⁇ g)
  • (b) is the retinal weight (g)
  • (c) is the FITC-conjugated dextran concentration (g / mL) in plasma
  • (d ) Indicates circulation time (h).
  • the PEDF administration group showed a significant effect compared to the non-administration group.
  • Example 8 NADFH oxidase induced by terminal glycosylation product (AGE) was confirmed by PEDF suppressing intramolecular active oxygen species in microvascular endothelial cells by terminal glycosylation product (AGE). Inhibiting the activity, it was also shown that PEDF shows significant activity against cells treated with AGE fraction of hemodialysis diabetic (DM-HD) serum. Furthermore, it showed efficacy against retinal vascular permeability in AGE perfused rats.
  • DM-HD hemodialysis diabetic
  • TNF-a-induced NF- ⁇ activation and IL-6 expression in PEDF force HUVEC are produced from NADPH oxidase-mediated ROS (reactive oxygen species) generation.
  • ROS reactive oxygen species
  • PEDF or antioxidant NAC significantly inhibited TNF- ⁇ -induced NF- ⁇ activation and IL-6 expression (see Examples 4 and 5).
  • Example 7 showed that PEDF significantly inhibited NADPH oxidase activity induced by Angll in a concentration-dependent manner.
  • Example 8 showed the possibility that PEDF can prevent or treat diabetic vascular complications associated with the production of terminal glycoprotein (AGE) by inhibiting NADPH oxidase activity.
  • AGE terminal glycoprotein
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Abstract

　色素上皮由来因子の新規な医療上用途を提供する。 　活性成分として色素上皮由来因子またはその変異体を含有する、NADPHオキシダーゼ活性を抑制するための医薬組成物は血管障害をはじめとした種々の疾患の治療および予防に有用であり得る。

Description

NADPHォキシダーゼ活性を抑制する色素上皮由来因子の新規治療用 途
技術分野
[0001] 本発明は、血管障害を予防または治療するための医薬組成物またはベクターに関 する。特に、色素上皮由来因子 (PEDF)またはその変異体を活性成分として含有する 医薬組成物および PEDFまたはその変異体をコードする核酸を含むベクターに関す る。
背景技術
[0002] 色素上皮由来因子 (PEDF)はセリンプロテアーゼインヒビターのスーパーファミリー に属する糖タンパク質であり、当初、ヒト網膜芽細胞腫細胞において強力な神経分ィ匕 活性を有する因子としてヒト網膜色素上皮細胞の培養上清力も精製された (文献 1)。 最近、 PEDFが細胞培養および動物モデルにぉ 、て血管形成を非常に効果的に阻 害することが示されている。 PEDFは、網膜上皮細胞の成長および移動を阻害し、虚 血誘発網膜新血管形成を抑制した (文献 2, 3)。
[0003] 網膜は眼球に栄養や酸素を供給するための細小血管がネットワークを構成してい るが、糖尿病などで高血糖状態が長く続くとこれらの血管が障害され、透過性の亢進 を生じる。この病態がさらに進行し虚血領域が拡大していくと、新生血管を伴う増殖 性糖尿病網膜症に至る。 PEDFは硝子体に存在しており、そのレベルは眼血管形成 疾患にお ヽて減少して ヽることから、眼に存在する PEDFは増殖性糖尿病網膜症の 発症において機能的に重要であることが示唆される (文献 4)。しかしながら、 PEDFが どのように上皮細胞 (EC)の成長および機能を調節するのかは完全には理解されてい ない。
[0004] ァテローム性動脈硬化症も同様に ECに関連する炎症性繊維増殖疾患であり (文献
5)、その病因は、 ECにおいて血栓性および炎症性反応を誘導する TNF- o;および IL-1のような古典的炎症誘発性サイト力インであると考えられる (文献 6, 7)。 ECはこれ らサイト力インに暴露されると、 IL-6産生、接着分子の発現および凝血促進活性の誘 導を含む、決定的な機能的変化を起こす (文献 8- 10)。これらサイト力インのシグナル 伝達および遺伝子発現は、 ECにおける活性酸素種 (ROS)の生成に大きく依存してい る (文献 11 , 12)。 ROSは、網膜症およびァテローム性動脈硬化症において主要な役 割を果たす酸ィ匕的ストレスを引き起こす。
[0005] 血管細胞における ROSは主として、 NADPHォキシダーゼにより産生され (文献 31)、 NADPHォキシダーゼは、細胞の成長、接着分子やサイト力インの遺伝子発現を含む 、細胞の病態生理学的応答において不可欠であることが知られている (文献 31)。実 際、 NADPHォキシダーゼは終末糖ィ匕産物 (AGE) (糖尿病において形成が加速され る老齢巨大タンパク質誘導体）によって活性化され、それにより酸ィ匕的ストレスと ECに おける遺伝子発現の変化とが関連付けられ、糖尿病性ミクロおよびマクロ血管障害 が発症すると考えられている (文献 32)。
発明の開示
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは最近、 PEDFが ROS生成を抑制することによって AGE誘発周皮細胞ァ ポトーシスおよび微小血管上皮細胞傷害を有意に阻害することを示した (文献 15, 33) そこで、本発明者らは、 PEDFが、 NADPHォキシダーゼ仲介細胞内シグナル経路を 遮断することによって、糖尿病性血管合併症を含む様々なタイプの血管障害の進行 を予防し得ると考えた。本発明者らの PEDFについての研究により、 PEDFは実際には NADPHォキシダーゼ活性を抑制すること、特に、ヒト臍帯静脈内皮細胞 (以下、 HUVECと表記する)において PEDFが Rac活性ィ匕を抑制することにより TNF- α誘発性 NADPHォキシダーゼ活性を阻害し、その結果 NF- κ B活性化、 IL-6発現、アンジォ テンシン II活性および Zまたは終末糖ィ匕産物 (AGE)情報伝達を阻害することが明らか となり、それによつて本発明を完成させた。
[0007] 即ち本願は、以下の発明を提供する：
( 1) a)色素上皮由来因子；
b)色素上皮由来因子 (a)と機能的に同等な性質を有する該因子の変異体；および c)該因子 (a)または該変異体 (b)をコードする核酸分子を含むベクター より成る群カゝら選択される活性成分を含有する、 NADPHォキシダーゼ活性を抑制 するための医薬組成物； NADPHォキシダーゼ仲介活性酸素種の生成を抑制する 該医薬組成物； NADPHォキシダーゼ活性を抑制することにより、 NF- κ B活性化、 IL-6発現、 TNF- α活性、アンジォテンシン II活性、および/または終末糖化産物情 報伝達を阻害する、該医薬組成物；
具体的には、
NADPHォキシダーゼに起因する疾患を予防または治療するための、本発明の医 薬組成物；より具体的には、 NADPHォキシダーゼに起因する疾患が、血管障害、 NF- κ B活性化一関連疾患、 IL-6発現一関連疾患、 TNF- a活性一関連疾患、アン ジォテンシン II活性一関連疾患、および終末糖化産物情報伝達 関連疾患より成る 群から選択される、該医薬組成物；
さらに具体的には、
血管障害が、血管炎、ァテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、ィ ンシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、および脳梗塞より成る群から選択さ れる、本発明の医薬組成物； NF- κ B活性ィ匕—関連疾患が、血管炎、ァテローム性 動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血 管合併症、癌、炎症、関節リウマチ、肝疾患、腎疾患、および脳梗塞より成る群から 選択される、本発明の医薬組成物； IL-6発現一関連疾患が、冠動脈イベント、血管 炎、ァテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥 満、糖尿病性血管合併症、癌、炎症、関節リウマチ、肝疾患、腎疾患、脳梗塞、およ び悪性骨髄腫より成る群から選択される、本発明の医薬組成物； TNF- α活性一関 連疾患が、血管炎、ァテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシ ュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、癌、炎症、関節リウマチ、肝疾患、腎疾 患、および脳梗塞より成る群から選択される、本発明の医薬組成物； アンジォテンシ ン II活性一関連疾患が、血管炎、ァテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高 血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、および脳梗塞より成る群か ら選択される、本発明の医薬組成物； NADPHォキシダーゼ活性を抑制することによ り、終末糖ィヒ産物生成に伴う糖尿病性血管合併症を治療するための本発明の医薬 組成物； 終末糖化産物情報伝達一関連疾患が、終末糖化産物生成に伴う糖尿病 性血管合併症である、本発明の医薬組成物；
(2) a)色素上皮由来因子;または
b)色素上皮由来因子 (a)と機能的に同等な性質を有する該因子の変異体 をコードする核酸を含む、 NADPHォキシダーゼ活性を抑制するためのベクター； NADPHォキシダーゼ仲介活性酸素種生成を抑制するベクター； NADPHォキシダ ーゼ活性を抑制することにより、 NF- κ B活性化、 IL-6発現、 TNF- o;活性アンジォテ ンシン II活性および Zまたは終末糖ィ匕産物情報伝達を阻害するベクター；
具体的には、
NADPHォキシダーゼに起因する疾患を予防または治療するための、本発明のベタ ター；より具体的には、 NADPHォキシダーゼに起因する疾患力 血管障害、 NF- κ B 活性化一関連疾患、 IL-6発現一関連疾患、 TNF- α活性一関連疾患、アンジォテン シン II活性一関連疾患、および終末糖化産物情報伝達 関連疾患より成る群から選 択される、該ベクター；
さらに具体的には、
血管障害が、血管炎、ァテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、ィ ンシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、および脳梗塞より成る群から選択さ れる、本発明のベクター； NF- κ B活性ィ匕一関連疾患力 血管炎、ァテローム性動 脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管 合併症、癌、炎症、関節リウマチ、肝疾患、腎疾患、および脳梗塞より成る群から選 択される、本発明のベクター； IL-6発現一関連疾患が、冠動脈イベント、血管炎、ァ テローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖 尿病性血管合併症、癌、炎症、関節リウマチ、肝疾患、腎疾患、脳梗塞、および悪性 骨髄腫より成る群から選択される、本発明のベクター； TNF- α活性—関連疾患が、 血管炎、ァテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗 性、肥満、糖尿病性血管合併症、癌、炎症、関節リウマチ、肝疾患、腎疾患、および 脳梗塞より成る群から選択される、本発明のベクター； アンジォテンシン II活性—関 連疾患が、血管炎、ァテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシ ュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、および脳梗塞より成る群から選択される 、本発明のベクター； NADPHォキシダーゼ活性を抑制することにより、終末糖化産 物生成に伴う糖尿病性血管合併症を治療するための本発明のベクター； 終末糖化 産物情報伝達 関連疾患が、終末糖化産物生成に伴う糖尿病性血管合併症である 、本発明のベクター；に関する。
[0008] 別の観点において、本発明は、
a)色素上皮由来因子；
b)色素上皮由来因子 (a)と機能的に同等な性質を有する該因子の変異体；および c)該因子 (a)または該変異体 (b)をコードする核酸分子を含むベクター
より成る群カゝら選択される活性成分を、 NADPHォキシダーゼに起因する疾患の予 防または治療を必要とする患者に投与することを含む、 NADPHォキシダーゼに起因 する疾患を予防または治療するための方法に関する。
[0009] さらに別の観点において、本発明は、
a)色素上皮由来因子；
b)色素上皮由来因子 (a)と機能的に同等な性質を有する該因子の変異体；および c)該因子 (a)または該変異体 (b)をコードする核酸分子を含むベクター
より成る群カゝら選択される活性成分の、 NADPHォキシダーゼに起因する疾患を予 防または治療するための医薬組成物の製造のための使用に関する。
図面の簡単な説明
[0010] [図 1]HUVECにおける細胞内 ROS生成に対する PEDFの効果を示す。図 1Aは、
HUVECにおける細胞内 ROS生成に対する TNF- αの効果を示すグラフである： *, P < 0.01 (TNF- α抜きの値と比較）。図 1Bは、 HUVECにおける細胞内 ROS生成に対す る PEDF、 DPI,または抗 PEDF抗体 (Abs)の効果を示すグラフである： *, P〈0.01 ( TNF- α単独の値と比較）。図 1Cは、 HUVECにおける ROS生成に対する
DN- RacT17Nを示すグラフである： *, P〈0.01 (TNF- αを処理した偽トランスフエタト 細胞の値と比較）。図 1Dは、 TNF- α誘発 Rac- 1 mRNAレベルに対する PEDFの効 果を示すグラフである。図 1Eは、 TNF- o;誘発 Rac活性に対する PEDFの効果を示す グラフである： *, P〈0.01 (TNF- a単独の値と比較）。 [図 2]HUVECにおける NADPHォキシダーゼ活性に対する PEDFの効果を示すグラフ である。図 2Aは、 TNF- α -誘発 NADPHォキシダーゼ活性に対する PEDFの効果を 示すグラフである： *, Pく 0.01 (TNF- o;単独の値と比較)。図 2Bは、共焦点顕微鏡 下での細胞の典型的顕微鏡写真を示す。
[図 3]HUVECにおける NF- κ B活性に対する PEDFの効果を示すグラフである： *, P < 0.05 (TNF- α単独の値と比較）。図3Aは、PEDFぉょびNACが、TNF- αの誘発する NF- κ Βプロモーター活性の上昇を抑制することを示すグラフである。図 3Βは、 TNF- αが NF- κ Β ρ65活性を上昇させ、それが PEDFによって有意に阻害されることを示 すグラフである： *, P〈0.05 (TNF- α単独の値と比較）。
[図 4]HUVECにおける IL-6 mRNAおよびタンパク質レベルに対する PEDFの効果を 示す。図 4Aは、 IL-6遺伝子の誘導を定量的に示すグラフである。データは |8 -ァク チン mRNA由来シグナルの強度によってノーマライズし、対照の値と対比させた: *, P 〈0.05; **, P〈0.01 (TNF- α単独の値と比較）。図 4Bは、 IL-6タンパク質の誘導を定 量的に示すグラフである： *, P〈0.01 (TNF- o;単独の値と比較)。
[図 5]HUVECにおける PEDF遺伝子発現に対する TNF- aの効果を示す。下のパネ ルは PEDF遺伝子の誘導を定量的に示したものである。データは 13 -ァクチン mRNA 由来シグナルの強度によってノーマライズし、対照の値と対比させた。 Unpaired t test を行った； pく 0.05を有意であると判断した: *, Pく 0.01 (対照細胞の値と比較)。
[図 6]HUVECに対する精製 PEDFタンパク質 (Aおよび B)および TNF- a (C)の結合 を示す。図 6Aはフルオレセン標識 PEDFによるリガンドブロットである。図 6Bは、
PEDF結合プロファイルを示すグラフである。図 6Cは、 HUVECにおける TNF- α結合 に対する PEDFの効果を示すグラフである。
[図 7]HUVECにおけるアンジォテンシン II (Angll)誘発性 NF- κ Β活性に対する PEDF の効果を示すグラフである： *印は、 Angll単独処理群に対して、 Pく 0.05で有意であ ることを示す。
[図 8]HUVECにおける Angll誘発性 MCP-1 mRNAおよびタンパク質レベル上昇に対 する PEDFの効果を示すグラフである： *印は、 Angll単独処理群に対して、 P〈0.01で 有意であることを示す。図 8Aは MCP-1 mRNAに対する PEDFの効果を、図 8Bは MCP-1タンパク質に対する PEDFの効果をそれぞれ示すグラフである。
[図 9]HUVECにおける Angll誘発性分子内 ROS発生に対する PEDFの効果を示すダラ フである。図 9Aは Angllにより ROSが発生することを示し（ *印は Angll無処理群に対 して、 P< 0.01にて有意であることを示す）、図 9Bはその ROS発生を PEDFが抑制する ことを示している（*、 * *印は Angllでの値に比べて、それぞれ P〈0.05、 P〈0.01で有 意であることを示す)。
[図 10]HUVECにおける Angll誘発性 NADPHォキシダーゼ活性に対する PEDFの効果 を示すグラフである（ *、 * *印は Angllでの値に比べて、それぞれ P〈0.05、 P〈0.01 で有意であることを示す)。
[図 11]微小血管内皮細胞での細胞内活性酸素種の生成および NADPHォキシダー ゼ活性に対する PEDFの作用を示すグラフである（*は AGE-BSA処置群 (図では AGEs と表記されて 、る)に対して Pく 0.01にて有意であることを示す)。
[図 12]微小血管内皮細胞における血清 AGE分画に対する効果を示すグラフである (* は DM- HD群に対して PEDF投与群が P〈0.01にて有意であることを示す)。
[図 13]AGE灌流ラットでの網膜血管浸透性に対する静脈投与での効果を示すグラフ である (*は PEDF投与群は非投与群に比べ、 Pく 0.01にて有意であることを示す)。 発明を実施するための最良の形態
[0011] (1) NADPHォキシダーゼ活性を抑制するための医薬組成物
本発明者らは、後述する実施例に示す 2つの異なる方法（図 2)によって、 PEDFが TNF- a誘発 NADPHォキシダーゼ活性を抑制することを示した。正確な分子機構は 明らかでないが、本発明者らの本研究は、 PEDFが HUVECにおいて Rac活性化を抑 制することにより TNF- a誘発 NADPHォキシダーゼ活性を阻害して 、る可能性がある ことが示唆する。
[0012] 本発明の医薬組成物は、 NADPHォキシダーゼ障害を予防または治療するために 使用することができる。本発明において、予防には再発防止も含む。 NADPHォキシ ダーゼは活性酸素種 (ROS)の生成を仲介する。 ROSは、過酸化水素のような分子、 次亜塩素酸イオンまたはスーパーオキサイドァ-オンのようなイオン、ヒドロキシルラ ジカルのようなラジカルなどであり、殺菌に関与する。し力しながら、 ROSは網膜症お よびァテローム性動脈硬化症において主要な役割を果たす酸ィ匕的ストレスを引き起 こす場合がある。
[0013] 従って本発明者らは、 TNF- a暴露 HUVECにおける活性酸素種 (ROS)生成、 NF- κ B活性ィ匕および IL-6発現に対する PEDFの効果について検討した。 TNF- aは細胞 内 ROS生成を有意に上昇させ、それは PEDFまたは NADPHォキシダーゼ阻害物質で あるジフ -レン'ョードニゥム (以下、 DPIと表記する)により完全に抑制された。さらに 、 PEDFは TNF- aが誘発する NADPHォキシダーゼ活性の上昇を完全に阻害した。
PEDFまたは抗酸化剤である N-ァセチルシスティンは、 TNF- a誘発 NF- κ Β活性ィ匕 を有意に阻害した。 PEDFは、 TNF- α誘発 IL-6発現を mRNAおよびタンパク質レベル の両者において阻害した。さらに、 TNF- αは PEDF mRNAレベルを減少させた。リガ ンドブロット解析により、 HUVECが PEDFに対して結合親和性を有する膜タンパク質を 有することが明ら力となった。これらの結果は、 PEDFが HUVECにおいて NADPHォキ シダーゼ仲介 ROS生成を抑制することにより、 TNF- a誘発 NF_ κ Β活性化およびそ の後の IL-6過剰発現を阻害することを示して 、る。
[0014] さらに、アンジォテンシン II (Angll)が HUVECにおいて、酸化還元に感受性を有す る転写因子である NF- κ Bの活性化、ついで MCP- 1 (Monocyte Chemoattractant protein-1)の発現を顕著に誘発し、これらが抗酸化剤である N-ァセチルシスティン（ 以下、 NACと表記する)同様、 PEDFによって完全に阻害されること、および HUVECに おいて Angllにて誘発された ROSの発生を NADPHォキシダーゼ阻害剤である DPIと 同様に阻害することを見出した。
[0015] また、終末糖化産物 (AGE)は、微小血管内皮細胞での分子内活性酸素種の活性 を顕著に刺激するが、これらが PEDFによって完全に抑制されること、また、 PEDFは、 NADPHォキシダーゼ活性における増加と同様に終末糖ィ匕産物 (AGE)にて誘発され た NADPHォキシダーゼを阻害すること、さらに PEDFは、血液透析糖尿病患者
(DM-HD)血清からの AGE分画で処理した細胞に対し、有意な抗酸化活性を示すこと を明らかにした。さらに、 AGE灌流ラットでの網膜血管浸透性に対し、有効性を示した 。以上の一連の事象を本明細書にお!、ては「終末糖化産物 (AGE)情報伝達」 t 、う 以上の知見より、本発明はまた、 NADPHォキシダーゼ活性を抑制することにより、 NF- κ B活性化、 IL-6発現、 TNF-ひ活性、アンジォテンシン II活性および Zまたは終 末糖化産物 (AGE)情報伝達を阻害する医薬組成物を提供する。
[0016] 本発明が目的とする対象疾患は NADPHォキシダーゼに起因する疾患であり、これ には例えば血管障害、 NF- κ B活性化一関連疾患、 IL-6発現一関連疾患、 TNF- a 活性一関連疾患、アンジォテンシン Π活性一関連疾患、および終末糖化産物 (AGE) 情報伝達 関連疾患が包含される。
血管障害には、脈管炎、ァテローム性動脈硬化症、血管炎、ァテローム性動脈硬 化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併 症、癌、炎症、関節リウマチ、肝疾患、腎疾患、脳梗塞などが含まれる。
[0017] NF- κ B活性ィ匕—関連疾患の例には、血管炎、ァテローム性動脈硬化症、急性冠 動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、癌、炎症、 関節リウマチ、肝疾患、腎疾患、および脳梗塞が含まれる。
転写因子である NF- κ Bは、炎症誘発性サイト力インおよび成長因子の遺伝子発現 を調節し、血管機能障害およびァテローム性動脈硬化症の発症において中心的役 割を果たす (文献 34)。本発明者らは本発明において、 TNF- aが IL- 6発現を NF- κ Β の活性ィ匕を介して mRNAおよびタンパク質レベルで有意に誘導することを発見した。
PEDFまたは抗酸化物質 NACは、 TNF- a誘発 NF- κ Β活性化およびそれに続く IL-6 mRNA発現上昇を有意に阻害するので、 PEDFはその抗酸ィ匕特性を介して IL-6発現 を減少させた可能性があり、本明細書で述べるように本発明者らはそれに関して多く の証拠を示した。
[0018] IL-6発現一関連疾患の例には、冠動脈イベント、血管炎、ァテローム性動脈硬化 症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症 、癌、炎症、関節リウマチ、肝疾患、腎疾患、脳梗塞、および悪性骨髄腫が含まれる。 ァテローム性動脈硬化症における全身性炎症反応のほとんど力 IL-6の作用によつ て説明できる。 IL-6は C-反応性タンパク質 (CRP)の肝合成の主要な誘導因子であり、 また、不安定狭心症の患者における IL-6および CRPの血清レベルの上昇は予後不 良と関連がある (文献 35, 36)。さらに、最近幾つかの研究により、 CRPがー見健康な 中年男性における心血管疾患の独立した予測危険因子であり得ることが示された (文 献 37)。それ故 PEDFは、 IL-6および CRP産生を弱めることによって、ァテローム性動 脈硬化症の進行に対して有利な効果を示し得るであろう。以上のことから、 PEDFは、 ァテローム性動脈硬化症の発達および進行にぉ 、て重要な役割を果たして 、る可 能性がある。
[0019] TNF- a活性一関連疾患の例には、血管炎、ァテローム性動脈硬化症、急性冠動 脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、癌、炎症、関 節リウマチ、肝疾患、腎疾患、および脳梗塞が含まれる。 TNF- αは、 ROSの生成を 介して複数の細胞機能に対し多面的作用を発揮する (文献 8, 13, 14)。事実、以下に 示す実施例は、 TNF- aが ROS生成、 NF- κ Β活性化および IL-6発現を誘発すること を示す。それに対して、以下に示す実施例はまた、 TNF- o;によって誘発されるこれら 機能が実際に PEDFによって抑制または阻害されたことを示す。即ち PEDFは、 TNF- a活性、特に NADPHォキシダーゼ活性に基づく TNF- a活性—関連疾患を予防ま たは治療するのに使用できると考えられる。
[0020] アンジォテンシン II活性一関連疾患には、血管炎、ァテローム性動脈硬化症、急性 冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、および 脳梗塞が含まれる。アンジォテンシン II (Angll)は、レニン-アンジォテンシン系の支配 的なエフェクターであり、血管壁細胞での数多くの炎症性増殖性応答を調整し、その ことにより動脈硬化症を惹起しうることが知られている。本発明者らは、以下の実施例 試験結果以外の試験結果も合わせて、 PEDFが、 Angllが誘発された血管内皮細胞 の活性ィ匕を試験管内で阻害し、その機序が NADPHォキシダーゼにより媒介された ROSの発生を抑制することによるものであることを見出した。このことにより、 PEDFは 動脈硬化症の発症および悪化に重要な予防、治療効果を示すことが判明した。この 知見により、本発明は、さら〖こ、 PEDFの NADPHォキシダーゼ活性阻害作用によるァ ンジォテンシン II活性を抑制し、このことからアンジォテンシン II由来の疾患、たとえ ば、血管障害、特に動脈硬化症等の循環器系疾患の予防または治療剤を提供する ことができる。
[0021] 本発明は、さらに NADPHォキシダーゼ活性を抑制することにより終末糖ィ匕産物（ AGE)生成に伴う糖尿病性血管合併症、即ち終末糖化産物 (AGE)情報伝達 関連 疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供する。
終末糖化産物 (AGE)情報伝達一関連疾患には、糖尿病性血管合併症、例えば増 殖性糖尿病網膜症等が含まれる。
[0022] また、本発明者らは本研究にお!、て、 PEDF単独では TNF- aに暴露されて!、な！/ヽ HUVECにおける NADPHォキシダーゼ活性、 NF- κ Βプロモーター活性または IL-6 mRNAレベルに影響しないことを発見した。つまり、 PEDFは基本状態では ECに対し て有害な作用を示さないようである。従って本発明の組成物およびベクターは、本明 細書記載の数多くの疾患を、より安全に、より都合良ぐそして副作用の問題を懸念 することなく、予防または治療するのに使用可能である。
この知見により、本発明は、 NADPHォキシダーゼに起因する疾患から予防または 治療させる医薬組成物および Zまたはそのためのベクターを提供する。この態様に おいて、本発明は、 NADPHォキシダーゼに起因する疾患力 予防または治療させる のみであり、過剰の作用を示さない。
[0023] (2)本発明の医薬組成物に含まれる活性成分
活性成分は、以下より成る群力 選択することができる：
a)色素上皮由来因子；
b)色素上皮由来因子 (a)と機能的に同等な性質を有する該因子の変異体;および c)該因子 (a)または該変異体 (b)をコードする核酸分子を含むベクター。
[0024] (2)-1.色素上皮由来因子
色素上皮由来因子 (PEDF)のアミノ酸配列および核酸配列は、 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (4), 1526-1530 (1993)に記載されており（本文献は引用により本明細 書の一部を成す）、ジーンバンクァクセシヨン番号 M76979で登録されている。参考の ため、ヒト PEDFのアミノ酸配列および核酸配列をそれぞれ配列番号： 1および 2にお いて示す。本発明によれば、 PEDFには、ヒト、ィヌ、ネコ、ゥシ、およびゥマのような哺 乳類由来の全種類の PEDFが含まれる力 ヒト由来の PEDFが好ましい。
[0025] PEDFは、 Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) のような多くの出版物および参考文献に従って、該タンパク質をコードする DNAを発 現させること〖こより産生することができる。特に、発現プラスミドは、本発明の DNAを適 切な発現ベクター (例えば pBK-CMV)に挿入することによって構築する。そして、その 発現プラスミドを適切な宿主細胞に導入し形質転換細胞を得る。宿主細胞の例には 、大腸菌のような原核生物、酵母のような単細胞性真核生物、および昆虫並びに動 物のような多細胞性真核生物の細胞が含まれる。発現プラスミドは、リン酸カルシウム 法、電気穿孔法、リポフ クチン法等のような常套的方法により宿主細胞へ導入する ことができる。所望のタンパク質は、該形質転換体を通常の方法に従い適切な培地 中で培養することにより産生される。このようにして得られたタンパク質は、標準的生 化学的手法に従って単離精製することができる。
[0026] 本明細書で用いる場合、「PEDFと機能的に同等の性質を有する PEDFの変異体」 には、ヒト PEDFと機能的に同等の性質を有するすべての種類の PEDF変異体が含ま れる。例えば PEDFの変異体は、 US6319687、 WO03059248, W09324529等に記載さ れている（各文献の記載内容は引用より本願の内容の一部を成す)。
PEDF変異体の好ましい例には、ヒト PEDFのアミノ酸配列に対して置換、欠失およ び/または付加である 1つもしくはそれ以上、または幾つかのアミノ酸残基の変化を 有するアミノ酸配列を含み、かつヒト PEDFと機能的に同等の性質を有する PEDFの変 異体が含まれる。
ヒト PEDFと機能的に同等の性質とは、ヒト PEDFと同等の NADPHォキシダーゼ活性 の抑制を意味する。
本発明の変異体もまた、前述の組換え技術によって調製することができる。 前述のように調製した変異体が機能的に同等の性質を有する力否かは、本明細書 で後述する実施例に従って証明することができる。
[0027] PEDFまたはその変異体を含有する本発明の医薬組成物はまた、要すれば、常套 的な担体を含むことができる。
PEDFまたはその変異体を含有する本発明の医薬組成物は、例えば、皮内、皮下ま たは静脈内注射によって投与することができる。好ましくは、このような PEDFまたはそ の変異体は、注射によって病変が存在する部位に直接投与する。そのような製剤中 のタンパク質の量は、治療する疾患、患者の年齢および体重等に依存して適宜変化 するであろうが、典型的には、毎日（1回または数回に分けて投与することができる)、 数日から数ケ月ごとに PEDFまたはその変異体を O.OOOlmg-1000 mg、好ましくは O.OOlmg- 100 mg、より好ましくは O.Olmg- 10mg投与する。
[0028] (2)-2.核酸およびベクター
本発明の医薬組成物が含有する活性成分は、色素上皮由来因子、または色素上 皮由来因子のアミノ酸配列に対して置換、欠失および Zまたは付加である 1つまたは 幾つかのアミノ酸残基の変化を含み、かつ色素上皮由来因子と機能的に同等の性 質を有するその変異体をコードする核酸を含むベクターであってよい。
[0029] 本明細書で用いる場合、「核酸」には DNAおよび RNAが含まれ、それらは一本鎖ま たは二本鎖であってよい。核酸は、典型的 DNA合成または遺伝子工学的方法に従 ヽ、 f列 XJ Molecular Cloning , 2nd ed., し old Spring Harbor Laboratory Press (1989)のような標準的テキストの記載に従 、容易に調製することができる。
[0030] また、ベクターに組み込まれた核酸を癌患者に投与することにより、 PEDFまたはそ の変異体は患者の癌細胞において高発現する。つまり、これらベクターは、常套的に 用いられるように遺伝子治療に有用である。ベクターの例には、前述の核酸を DNAま たは RNAウィルス、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウィルス、ヘルべ スウィルス、ヮクチ-ァウィルス、ボックスウィルス、ポリオウイルス、またはシンドビスウイ ルスに組み込んで細胞に導入するウィルスベクターが含まれる。これら方法のうち、 レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウィルスまたはヮクチ-ァウィルスを用いる ものが特に好ましい。該ベクターの具体例には、 pAd/CMV/V5-DEST Gateway Vector (Invitrogen)が含まれる。
[0031] 本発明のベクターを含有する医薬組成物はまた、要すれば、常套的な担体を含ん でも良い。
このようなベクターを含む医薬組成物は、例えば、皮内投与、皮下投与または静脈 注射により投与することができる。好ましくは、このような PEDFまたはその変異体は、 病変の存在する部位に直接投与する。そのような製剤中のベクターの量は、予防ま たは治療する疾患、患者の年齢および体重等に依存して変化するであろうが、典型 的には、毎日（1回または数回に分けて投与することができる)、数日力も数ケ月ごとに 核酸を 0.0001mg-100 mg、好ましくは O.OOlmg-10 mg投与する。
本発明はまた、前述のベクター自身を包含する。
[0032] (3)結合タンパク質
本発明者らはさらに、 HUVECが PEDFに対する結合親和性を有する膜タンパク質を 有するかについて研究した。
前述のように、 PEDF力 α誘発性 ROS生成を阻害することは、 TNF- α暴露 HUVECにおける PEDFの抗酸化機能を示唆する。しかしながら、 PEDF力TNF- αの 受容体との相互作用を介してその効果を発揮して 、な 、かにつ 、て調べなければな らな 、。本発明者らは培養 HUVECの細胞膜に PEDF特異的結合タンパク質が存在 することを初めて明らかにしたので（図 6A)、その可能性はなさそうである。該結合デ 一タのスキャッチヤード解析により、シングルクラスの高親和性受容体であることがわ 力つた（図 6B)。 PEDFの受容体結合領域のペプチドに対する抗体 (文献 15)は、 PEDFの抗酸ィ匕特性を完全に中和した（図 1B)。さらに、図 6Cに示すように、 PEDFは TNF- αとその受容体との結合を妨げな力つた。これらを総合すると、本発明者らの結 果は、 HUVECにおいて TNF- o;誘発性 ROS生成の阻害に関与する PEDF特異的結 合タンパク質が存在することを示唆する。なお、文献 30によると、網膜芽細胞腫上に Kd値 1.7-3.6 nM、 80-85 kDaの異なるタイプの PEDF結合タンパク質が存在すること を報告されて 、て、細胞タイプ特異的な PEDF受容体が存在して 、る可能性があるこ とを示唆している。
実施例
[0033] 本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、いかなる意味おいてもこれら実 施例に限定されるものではない。全ての値を平均士 SEMで示した。特に示さない限 り、統計学的比較のため、 one-way ANOVAに続いて Scheffe F testを行った。
本参考例および実施例において用いた TNF- α、 DPI,ルシゲニン、 NADH、 NADPH、 NACおよびピロリジンジチォ力ルバメート (PDTC)は、 Sigma (St. Louis, MO) より購入した。 CDP- Star化学発光システムおよび125 HTNF- α は、 Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire , United !Mngdom)より購入し 7こ。 IL—り ELI¾Aン スアムは、 Biosource (Camarillo, CA)より得た。 [0034] 以下の実施例において本発明者らは、 TNF- aによって誘発される ROS (活性酸素 種)産生について調べるため HUVECを使用した。 TNF- αは、多くの細胞機能に対し て ROSの生成を介して多面的作用を発揮する (文献 8, 13, 14)。そこで本発明者らは 初めに TNF— aを用いて、 HUVECにお!/、て PEDF力 TNF— a誘発細胞内 ROS生成を 阻害できるか、およびどのように阻害するかについて調べた。次に本発明者らは、 TNF- a暴露 HUVECにおける NF- κ Β活性化およびそれに続く IL_6発現に対する PEDFの効果にっ 、て検討した。
[0035] 参考例 1 PEDFタンパク質の精製
PEDFタンパク質は既報のようにして精製した (文献 15)。精製 PEDFタンパク質の SDS-PAGE解析により分子量約 50kDaの一本のバンドが示され、それは抗ヒト PEDF モノクローナル抗体と陽性反応を示した (文献 15)。ヒト PEDFに対するポリクローナル 抗体もまた、既報のように調製した (文献 15)。
[0036] PEDF-発現ベクターおよび PEDF精製のための発現ベクターの調製につ!、て簡単 に説明する。
PEDF cDNAは、初めにヒト胎盤 cDNAライブラリー (Clontech, Palo Alto, CA)より単 離し、既報のように哺乳類発現ベクターである pBK- CMV(Stratagene, La Jolla, CA) に挿入した (文献 35)。
簡単に説明すると、該 cDNAライブラリーから PEDFをコードする遺伝子を以下の条 件の PCRにより単離した：
PCRプライマー
Fw： 5 ' -CTCAGTGTGCAGGCTTAGAG-3 ' (配列番号： 3)
Rev： 5 ' -CCTTCGTGTCCTGTGGAATC-3 ' (配列番号： 4)
X 10 pfuノ ッファー 4 μ 1
dNTP (各 2mM) 4 μ \
プライマー（Fw) (10 μ Μ) 4 μ \
プライマー（Rev) (10 μ Μ) 4 μ \
铸型 (200 mg)
pfoポリメラーゼ (STRATAGENE) 0.5 μ 蒸留水 /合計 40 1
PCR条件 (Parkin Elmer 2400)
(ステップ 1 X 1)
9o C 5mm
(ステップ 2 x 30)
95°C 0.5min
60°C 0.5min
72°C 1.5min
(ステップ 3 x 1)
72°C lOmin
4°C ∞min
増幅確認後、 PCR産物を pBluescript II KSの Sma Iサイトにライゲートした。制限酵素 消化およびシークェンスによって構造を確認し、また、 5'側に Xba Iサイトを含むことも 確認した。
Xba Iおよび Hind ΠΙ(ブラント)で切断した PEDF PCR産物を、 pBK- CMV
(STRATAGENE)の Nhe 1(ブラント)および Xba Iサイトの間に挿入し、 PEDF-発現べクタ 一であるプラスミド pBK- CMV- PEDFを得た。
次に、 PEDF精製のための発現ベクターを以下の手順に従い構築した。
His- Tag用オリゴ DNA、
5， -AATTCCATCATCATCATCATCATTAAT-3，（配列番号： 5)および
5， -CTAGATTAATGATGATGATGATGATGG -3，（配列番号： 6)を合成し、互!ヽに ァニールさせた。 PEDFのストップコドンを取り除き 3'末端に Eco RIサイトを挿入する ため、 5，- CGGAATTCGGGGCCCCTGGGGTCC -3，（配列番号： 7)並びに前述の Fwプライマー（配列番号： 4)、および铸型として pBK-CMV-PEDFを用いて PCRによ りオリゴ DNAを合成した。増幅産物を Bgl IIおよび Eco RIで切断し、切断産物を前述 のァニール済 His Tag用オリゴ DNAにライゲートした。ライゲート産物を Bgl IIおよび Xba Iで切断した精製 pBK-CMV-PEDFに挿入した。構造を制限酵素消化およびシ ークエンスによって確認した [0038] 翻訳ェンハンサーを挿入するため、 pcDNA4- HisMax (Invitrogen)から Sac Iおよび Xba Iを用いて単離したェンハンサ一部分を pBluescript II KSの同じ制限酵素サイト にライゲートした。クローンの単離後、該ベクターを Nco Iサイト（ブラント)および Bam HIサイトで切断し、ベクターバックボーンを得た。
[0039] PEDFの 5 '末端を修飾するため、 5 ' - GCATGCAGGCCCTGGTGCTACTCC -3 ' ( 配列番号: 8) (PEDF 5'末端に Sph Iサイトを挿入)並びに 5 '
- TTAGGTACCATGGATGTCTGGGCT - 3，（配列番号： 9)、および铸型として pBK- CMV- PEDFを用いてオリゴ DNAを合成し、合成産物を pGEM- T easy
(Promega)に挿入した。クローンを単離し、そして Sph Iサイト (ブラント)および Bam HIサ イトで切断した。その結果生じた断片を前述のベクターバックボーンに挿入した。 得られたベクターを Sac Iサイト (ブラント)および Bam HIサイトで切断して翻訳ェンノヽ ンサ一— PEDF5，部分を取り出した。翻訳ェンハンサ一— PEDF5，部分を含む断片を 、 Nhe Iサイト (ブラント)および Bam HIサイトで切断した 3， His- Tag含有
pBK- CMV-PEDFにライゲートし、 PEDF精製のための発現ベクターを得た。得られた ベクターを制限酵素消化および配列決定によって確認した。
[0040] 参考例 2 HUVECストックの調製
HUVEC(Clonetics, CC- 2517)を、 2 %ゥシ胎児血清、 0.4 %ゥシ脳抽出物、 10 ng/mlヒト上皮細胞増殖因子および 1 μ g/mlヒドロコルチゾンを添加した EBM培地中 で培養した。実施例において、 TNF- o;処理は上皮細胞増殖因子およびヒドロコルチ ゾンを含まな!/、培地中で行った。
[0041] 実施例 1 HUVECにおける ROS生成に対する PEDFの効果（1)
本発明者らは初めに、 PEDF力 に暴露された HUVECにおいて ROS (活性酸 素種)生成を阻害できるかにつ!/、て検討した。
HUVECを 10 ng/ml TNF- αで示した時間処理し、その後細胞内の ROS生成を蛍光 プローブ CM- H DCFDA (Molecular Probes Inc. , Eugene, OR)を用いて既報のよう
2
にして検出した (文献 18, 19)。図 1Aに示すように、 ROS生成は 4時間で上昇し始め、 24時間で最大に達した； 10 ng/ml TNF- αで 24時間インキュベートすると、細胞内 ROS生成が約 1.4倍増加した。 10 ng/mUり高い濃度の TNF- αは HUVECに対して毒 性を示す。
[0042] 1または 10 nMの PEDF、 50 nM DPI,または 5 μ g/ml抗 PEDF抗体（Abs)の存在ま たは非存在下、 10 ng/ml TNF- αで、またはそれ抜きで HUVECを 24時間処理し、そ の後細胞内 ROS生成を前述のように検出した。 ROS生成の比率は無添加の対照の 値に対するものであり、縦軸に示している。結果は図 1Bに示す。 PEDFまたは DPIは、 TNF- aが誘発する ROS生成の上昇を完全に阻害することがわ力つた。
PEDFに対するポリクローナル抗体を PEDFと組み合わせて添加すると、 TNF- a暴 露 HUVECにおける PEDFの抗酸化効果は完全に消失した。 10 nM PEDFは、無細胞 系におけるキサンチン/キサンチンォキシダーゼ反応によるスーパーオキサイド生成 を阻害しない。これらの結果は、 PEDF自身がフリーラジカル除去作用を有するので はないことを示唆する。
[0043] 実施例 2 HUVECにおける ROS生成に対する PEDFの効果（2)
実施例 1において、 PEDFは DPIと同様に、 TNF- αが誘発する ROS生成の上昇を完 全に阻害することが示された。しかし、 DPIのような薬理学的阻害物質はある標的細 胞に対して完全に特異的ではないので、ここでは、 PEDFの ROS生成阻害の機序に ついて調べた。本発明者らは、 TNF- α暴露 HUVECにおける ROS生成が NADPHォ キシダーゼによるものであることをさらに検討するため、 DN-RacTl 7N (ドミナント ネ ガティブ ·ヒト Rac-1変異体)過剰発現技術を用いて実験を行った。 DN-RacT17は、 NADPHォキシダーゼに不可欠な構成要素である GTPase Rac-1(文献 28)の作用が完 全に遮断されている。
[0044] 既報のように (文献 17)、 DN-RacT17N発現ベクター（堀口博士から供与) (文献 16) または空のベクターを、 HUVECに一過性にトランスフエタトした。 DN- RacT17N-トラン スフェクトおよび模擬トランスフエタト HUVECを、 10 ng/ml TNF- αで 24時間処理し、 ROSを定量的に解析した。 ROS生成の比率は、 TNF- αなしでの模擬トランスフエタト 対照細胞の値に対するものである。図 1Cに示すように、 DN-RacT17Nの過剰発現に より、 TNF- a誘発性の ROS生成上昇は完全に阻害された。
[0045] 本発明者らは次に、 TNF- aが HUVECにおいて Rac-1発現および活性化を介して ROS生成を誘導し得るかにつ 、て検討した。 10 nM PEDFの存在または非存在下、 10 ng/ml TNF- αで、またはそれ抜きで HUVECを 4時間で処理し、その後逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR)により解析 した。下のパネルは、 Rac-1遺伝子誘導を定量的に表したものを示す。データは j8 - ァクチン mRNA由来シグナルの強度によってノーマライズし、対照と対比している。図 1Dに示すように、 TNF- αは、中程度に、しかし有意に Rac-1 mRNAレベルを上昇さ せ、それは 10 nM PEDFによって完全に抑制された。その後、 Rac Activation Assay Kit (Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY)を用いて Rac活性を測定した。 10 nM PEDFの存在または非存在下、 10 ng/ml TNF- αで、またはそれ抜きで HUVECを 24時間で処理した。図 1Eに示すように、 Rac-GTPプルダウンアツセィにより、 TNF- aは有意に Racを活性ィ匕し、それはまた、 PEDF処理によって完全に阻害されることが わかった。
[0046] これらの知見は、 NADPHォキシダーゼの重要な構成要素の 1つである Rac-1が
TNF- a誘発性 ROS生成に直接関与し、また PEDFの分子標的であることを示唆する 。一方、一酸化窒素合成酵素阻害物質である Ν- ω -二トロ- L-アルギニンメチルエス テル、キサンチンォキシダーゼ阻害物質であるォキシプリノール、またはミトコンドリア NADPHデヒドロゲナーゼ阻害物質であるロテノンは、 HUVECにおける TNF- a誘発 性 ROS生成に影響しない。本発明者らはまた、 PEDFは TNF- α暴露 HUVECにおけ るアポトーシス性細胞死を増加させないことを見出している。これらの結果は、 TNF- a暴露 HUVECに対する PEDFの抗酸化効果が、単純にそのアポトーシス促進性に 起因するものではな 、ことを示唆して 、る。
[0047] 実施例 3 HUVECにおける NADPHォキシダーゼ活性に対する PEDFの効果
本発明者らは次に、 PEDFが実際に NADPHォキシダーゼ活性を抑制できるかにつ いて検討した。
10 nM PEDFの存在または非存在下、 10 ng/ml TNF- αで、またはそれ抜きで HUVECを 24時間で処理し、その後、 1 mM EGTA、 150 mMスクロース、電子受容体 として 5 μ Μルシゲニン、および基質として 100 μ M NADPHを含有するリン酸緩衝 液（50 mM, pH 7.0)における発光アツセィにより、 NADPHォキシダーゼ活性を測定し た（文献 20)。図 2Aに示すように、 TNF- αは NADPHォキシダーゼ活性を有意に上昇 させ、それは 10 nM PEDFによって完全に抑制された。 TNF- αによって誘発される NADPHォキシダーゼ活性の上昇度は、 ROS生成の上昇度と近似していた。 TNF- a は NADPHォキシダーゼ活性を約 1.3倍に上昇させた。 PEDF単独では HUVECにおけ る NADPHォキシダーゼ活性には影響しな 、。
[0048] 10 nM PEDFの存在または非存在下、 10 ng/ml TNF- aで、またはそれ抜きで
HUVECを 24時間で処理した。その後、 2 Mジヒドロェチジゥムを含有するフエノー ルレッド不含ダルベッコ改変イーグル培地で細胞をインキュベートした。 30分後、共 焦点レーザー顕微鏡によって細胞を画像ィ匕した。図 2Bに示すように、ジヒドロェチジ ゥムによる細胞染色によっても、 PEDFが HUVECにおいて TNF- α誘発 NADPHォキ シダーゼ活性を阻害することが明ら力となった。 TNF- αは、 HUVECにおける NADPH ォキシダーゼの重要な構成要素の 1つである p22phoxまたは gp91phoxの mRNAレべ ルを上昇させな力つた。
[0049] 実施例 4 HUVECにおける NF- κ Βプロモーター活性に対する PEDFの効果
ROS (活性酸素種)は、転写因子 NF- κ Bの活性化を介して数多くの遺伝子発現を 調節する (文献 29)。それ故本発明者らは、 PEDFが HUVECにおいて TNF- αが誘発 する NF- κ B転写活性を減弱することができるかについて調べた。
ルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流に連結された NF- κ Bプロモーターを含む プフス^ド【ま、 Dr. Fujita T (Department of Tumorし ell Biology, Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science)より提供していただいた (文献 21)。 1または 10 nMの PEDFまたは抗酸化物質である 1 mM NACの存在または非存在下、 10 ng/ml TNF- aで、またはそれ抜きで HUVECを 4時間処理し、その後既報のように NF- κ Βルシフ エラーゼ活性を測定した (文献 17)。ルシフェラーゼ活性の比率は対照の値に対するも のである。図 3Αに示すように、 TNF- aは NF- κ Βプロモーター活性を有意に上昇さ せた。 PEDFおよび抗酸化物質 NACは、部分的ではあるものの有意に TNF- α誘発 性の NF- κ Bプロモーター活性上昇を抑制することがわかった。
[0050] NF- κ B p65活性を測定するために、核タンパク質を抽出し、それらの NF- κ Β ρ65 コンセンサス配列に対する結合活性を TansFactorキットを用いて測定した。 10 nM PEDFの存在または非存在下、 10 ng/ml TNF- αで、またはそれ抜きで HUVECを 4時 間処理した。 TransFactor抽出キット (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)を用 いて細胞から核タンパク質を抽出し、 TransFactor NF- κ Β ρ65キット (BD
Biosciences Clontech)を用いて NF- κ B p65コンセンサス配列に対するそれらの結合 活性を測定した。図 3Bに示すように、 TNF-ひは NF- κ B p65活性を上昇させ、それ は PEDFによって有意に阻害された。
実施例 5 HUVECにおける IL-6 mRNAおよびタンパク質レベルに対する PEDFの効 果
本発明者らは次に PEDFが HUVECにおいて IL-6の発現に影響し得るかについて 検討した。
10 nM PEDF, 1 mM NAC、または NF— κ Bの阻害物質である 10 μ M PDTC (ピロ リジンジチォ力ルバメート)の存在または非存在下、 10 ng/ml TNF- αで、またはそれ 抜きで 4時間処理した HUVECよりポリ (A)+RNAを単離し、既報のようにして半定量的 RT-PCRによって解析した (文献 26)。増幅のためのポリ (A)+RNA铸型量 (30 ng)および サイクル数（Rac-1遺伝子につき 28サイクル； IL-6および PEDF遺伝子につき 35サイク ル； j8 -ァクチン遺伝子につき 22サイクル）は、反応が直線的に進行する定量的範囲 (シグナル強度を铸型量およびサイクル数の関数としてプロットすることによって決定) において選択した (文献 27)。半定量的 RT-PCRにおいて用いたプライマー配列は、 ヒト Rac- 1にっき 5， -ACCCCTTCTGACTGAGCAATATGCC-3，（配列番号： 10)およ び 5， -CAATAGGCAAAGCGACTACAGGAGG-3，（配列番号： 11)(文献 22)、ヒト IL- 6 mRNAにっき 5， -CCTTCTCCACAAGCGCCTTC-3，（配列番号： 12)および 5，
- GGCAAGTCTCCTCATTGAATC- 3，（配列番号： 13)(文献 23)およびヒト PEDF mRNAにっき 5， -TCACAGGCAAACCCATCAAGCTGAC-3，（配列番号： 14)および 5 ， -GCCTTCGTGTCCTGTGGAATCTGCT-3，（配列番号： 15)(文献 24)であった。ヒト IL-6および PEDF cDNAを検出するための内部オリゴデォキシリボヌクレオチドプロ一 ブは、それぞれ 5， -TCAATTCGTTCTGAAGAGGTGAGTGGCTGT-3，（配列番号： 16)および 5， -CGCCCCATCCTCGTTCCACTCAAAGCC-3，（配列番号： 17)であつ た。ヒト β -actin mRNAを検出するために半定量的 RT-PCRで使用した上流および下 流プライマーの配列は、既報のものを同じである (文献 25)。 [0052] 図 4Aに示すように、 TNF- aは IL- 6 mRNAレベルを有意に上昇させ、それは、
PEDF, NAC、または NF- κ Βの阻害物質である PDTC (ピロリジンジチォ力ルバメート） によって、部分的ではあるものの有意に阻害された。 PEDF、 NACまたは PDTC (ピロリ ジンジチォ力ルバメート)単独では IL-6 mRNAレベルには影響しなかった。
[0053] その後、 1または 10 nMの PEDFの存在または非存在下、 10 ng/ml TNF- aで、また はそれ抜きで HUVECを 24時間処理した。培地中に放出された IL-6タンパク質は、 ELISAキットを用いて製造元の説明に従 、測定した。 PEDFは、 TNF- a暴露 HUVEC 力もの IL-6タンパク質の分泌を有意に阻害することも明ら力となった（図 4B)。
[0054] 実施例 6 HUVECにおける PEDF結合タンパク質
本発明者らは次に、 HUVECが PEDFに対して結合親和性を示す細胞表面タンパク 質を有するかにつ 、て検討した。
HUVEC由来の界面活性剤溶解性細胞膜タンパク質を 15 %ポリアクリルアミドゲルで 分離し、ポリビ-リデンジフルオライドメンブランに転写した。既報のように (文献 15)、メ ンブランと 30 nMフルオレセン標識 PEDFを、分子 20倍過剰量の非標識 PEDFタンパ ク質の非存在 (レーン 1)または存在 (レーン 2)下インキュベートした。その結果生じた 免疫複合体を CDP-Star化学発光システムにより視覚化した。図 6Aに示すように、分 子量約 60 kDaの HUVEC膜タンパク質が、フルオレセン標識 PEDFタンパク質と結合し た。結合シグナルは、分子 20倍過剰量の非標識 PEDFタンパク質の存在下ではほと んど検出できず、これにより培養 HUVECの膜抽出物に対するフルオレセン標識
PEDFの結合の特異性が確認された。さら〖こ、 10 ng/ml TNF- αを処理すると、
HUVECにおける膜に対する PEDF結合が約 1.3倍上昇する。
[0055] 本発明者らは次に、 PEDF結合プロファイルを解析し、その物理ィ匕学的パラメーター を測定した。放射性標識 PEDFは、既報のようにして (文献 15)精製 PEDFタンパク質と 1251から調製した。 HUVECを示した濃度の125I-PEDFタンパク質と、分子 20倍過剰量の 分子非標識 PEDFタンパク質の非存在 (黒丸)または存在 (非特異的結合、白丸)下ィ ンキュペートした。特異的 PEDF結合は既報のように測定した (文献 15)。全結合から非 特異的結合を差し引くことにより特異的結合 (黒四角)を計算した。全ての実験ポイント を 4例の平均で示した。図 6Bに示すように、結合データのスキャッチヤード解析により 、解離定数 (K ) 84.7 ηΜのシングルクラス結合部位（HUVEC 1細胞につき Β = d max
51 ,000部位)であることがわかった。
[0056] 本発明者らは次に、 PEDFが HUVECにおいて TNF- aの受容体結合を阻害するか について検討した（125I-TNF- α結合アツセィ)。 10 nM PEDFの存在または非存在下 、 HUVECを 10 ng/ml 125I- TNF- αと 4 °Cで 90分間インキュベートし、その後細胞を 1 M NaOHで溶解し、細胞溶解物の放射活性を既報のように測定した (文献 15)。
Unpaired t testを行った； p〈0.05を有意と判断した。図 6Cに示すように、 PEDFは TNF- aの受容体に対する結合に影響しな力つた。
[0057] 実施例 7 PEDFの抗動脈硬化症作用
(l) HUVECにおける Angll誘発性 NF- κ Βプロモーター活性に対する PEDFの効果
HUVECを 10 nMの PEDFの存在下または非存在下に、 100 nMのアンジォテンシン II (Angll)にて 4時間処理し、 NF- κ Βルシフェラーゼ活性を測定した。 Angll未処理も試 験した。
すなわち、 HUVECを、 2%牛胎児血清 (FBS)、 0.4%牛脳抽出物、 10ng/mLヒト上皮 成長因子および 1 μ g/mLヒドロコルチゾンを追加した ΕΒΜ培地にて培養した。 Angll 処理は、前記培地から上皮成長因子およびヒドロコルチゾンを除!、た培地で行った。 また、ルシフェラーゼアツセィの測定は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流に NF- κ Bプロモーターを接続させたプラスミドを用いて、 Yamagishi Sらによる J.
Cardiovasc. Pharmacol. 2004; 43: 724- 730に記載の方法によった。
結果を図 7に示す。図 7から明らかなように、 Angllは NF- κ Βプロモーター活性を顕 著に増加させる力 PEDFはその作用を完全に抑制した。
[0058] (2) HUVECにおける Angll誘発性 MCP-1 mRNAおよびタンパク質レベル上昇に対す る PEDFの効果
MCP- 1は NF- κ B標的遺伝子の一つであり、 in vitroおよび in vivoにて単球に対す る走化性を誘発する。そこで、 PEDF力 HUVECにて MCP-1の発現にどのような影響 を与えるか実験した。 MCP-1 mRNAに対する効果の試験は、 HUVECから単離された Poly(A)TRNAを 10 nMの PEDFの存在下または非存在下に、 100 nMの Angllにて 4時 間処理し、 RT-PCRにて測定した。 Angll未処理も試験した。 RT-PCR法は、 Yamagishi Sらによる Diabetologia.1998; 41 : 1435- 1441に記載された方法にて行った 。 MCP-1タンパク質に対する効果の試験は、 HUVECを 10 nMの PEDFの存在下また は非存在下に、 100 nMの Angllにて 24時間処理し、培地中に生じた MCP-1タンパク 質を ELIZA法にて測定した。 Angll未処理も試験した。
結果を図 8に示す。図 8Aおよび Bに示すように、 Angllは mRNAおよびタンパク質レ ベルにて MCP-1の発現を顕著に増加させた力 これは PEDFによって完全に阻害さ れた。
(3) HUVECにおける Angll誘発性分子内 ROS発生に対する PEDFの効果
ROSは NF- κ Bの転写活性化を通して動脈硬化を誘発する遺伝子の発現を調整す ることが知られている（たとえば、 Griendling KKらによる Cir. Res. 1994; 74:
1141-1148参照）。一方、抗酸化剤である NACが Angllに暴露された HUVECでの NF- κ Bの活性ィ匕および MCP-1発現に作用することを見出している。これらから、 Angllに より発生する ROSが PEDFの分子標的となる可能性がある。そこで、 HUVECにおける 分子内 ROS発生に対する PEDFの効果を調べた。まず、 Angllの ROS発生への効果を 調べた。実験は、 HUVECを図 9Aに示された時間をかけて 100 nMの Angllで処理し、 生成した ROSを蛍光プローブである CM- H DCFDA (米国 Molecular Probe Inc.)を用
2
いて定量分析した（検出手法は、たとえば、 Yamagishi S.らによる J. Biol. Chem. 2001 ; 276: 25096-25100等に記載されている）。図 9Aに示すように、 ROSは Angllにより 4時 間後から発生し始め、 24時間で最大となる。 100 nMの Angllでの 24時間培養では、 1.4倍の ROS発生が観測された。そこで、その ROS発生に対する PEDFの効果を調べ た。 HUVECを 1 nMまたは 10 nMの PEDF、 10 nMの PEDFに 50 g/mLの抗 PEDF抗体 を共存させたもの、および 50 nMの DPIの存在下または非存在下に 100 nMの Angllに て 24時間処理し、上記と同様に ROSを定量した。その結果、図 9Bに示したように、 PEDFは濃度依存的に Angllにより誘発された ROSの増加を抑制し、 10 nMの PEDFに て完全に抑制された。これに抗 PEDF抗体（たとえば、 Yamagishi S.らによる J. Mol. Cell. Cardiol. 2004; 37: 497-506参照）を共存させた系では、抑制作用が中和された ことから、 HUVECに対し、 PEDFが特異的に作用することが分かる。また、 NADPHォ キシダーゼ阻害剤として知られている DPIが、 ROS発生を抑制したことから、 PEDFの 分子作用機序は NADPHォキシダーゼの抑制であると考えられる。
[0060] (4) HUVECにおける Angll誘発性 NADPHォキシダーゼ活性に対する PEDFの効果 上記実施例等により、 PEDFが NADPHォキシダーゼ活性を阻害して、 Angllに作用 していることが示唆された力 それを本実験により確認した。
HUVECを 1 nMまたは 10 nMの PEDF、 10 nMの PEDFと 5 μ g/mLの抗 PEDF抗体との 共存系の存在下または非存在下に 100 nMの Angllにて 24時間処理し、細胞を均質 液調製用緩衝液（20 mMの Hepes、 pH7.0、 100 mMの塩化カリウム、プロテアーゼ阻 害剤カクテルを含有する 1 mMの EDTA)に懸濁し、基質としての NADPH (100 ju M)を 含有する 50 mMのリン酸緩衝液（pH7.0、さら〖こ 1 mMの EDTA、 150 nMのショ糖およ び電子受容体としての 5 μ Μのルシゲニンを含有する）中にてリン光分析にて NADPH を測定した（たとえば、 Griendling KKによる Cir. Res. 1994; 74: 1141- 1148参照）。 結果を図 10に示す。図 10から明らかなように、 PEDFは濃度依存的に Angllにより誘 発された NADPHォキシダーゼ活性を抑制し、一方、抗 PEDF抗体を共存させると、そ の抑制効果が中和されることが示された。
[0061] 実施例 8 NADPHォキシダーゼ活性を抑制することによる終末糖ィ匕産物 (AGE)生成 に伴う糖尿病性血管合併症への適用
(1) 微小血管内皮細胞での細胞内活性酸素種の生成および NADPHォキシダーゼ 活性に対する作用
(a)ヒト成人皮膚微小血管内皮細胞 (以下、血管内皮細胞という)を、 1Mまたは 10Mの PEDF, 50Mの DPIまたは終末糖ィ匕産物（AGE)の受容体 (RAGE)mRNAに対するアン チセンス DNA(10 μ Μ)の存在下または非存在下に所定濃度の AGE処理牛血清アル ブミン (AGE-BSA)または非糖ィ匕牛血清アルブミンにて 24時間処理し、その後、活性 酸素種 (ROS)を定量的に解析した。ここで、 AGE-BSAは文献 15に記載された方法に より調製した。すなわち、牛血清アルブミン (50mg/ml)を 0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液 (PH7.4)中にて 0.1MD -ダリセルアルデヒドとともに無菌下に 7日間培養することにより 調製した。未反応還元糖は、リン酸緩衝化生理食塩水で透析することにより除去した 。対照となる非糖ィ匕牛血清アルブミンは還元糖を存在させないことを除いて同一の条 件にてインキュベーションし作製した。得られた調製物にエンドトキシンが含まれて!/ヽ ないことを確認した（使用機器： Endospecy ES-20S,生化学工業 (株)）。 RAGE mRNA に対するアンチセンス DNAは、 Yamagishi, S.らによる FEBS Lett. 1996, 384: 103-106 に記載された方法に準拠して調製した。活性酸素種の細胞内生成は、 Yamagishi, S. らによる Kidney Int. , 2003, 63:464-473に記載された方法に準拠して蛍光プローブ (CM-H2DCFDA, Molecular Probes In )を用いて測定した。その結果を図 11(a)に示 す。図中、 *は 100 /z g/mlの AGE-BSAにて処理した値に対して P〈0.01にて有意である ことを示す。 BSAは非糖ィ匕牛血清アルブミンによる処理の結果を、 AGEsは AGE処理 牛血清アルブミンによる処理の結果を示す。本図から明らかなように、 PEDFは AGEに より修飾された血清アルブミンからの ROS生成に対し、 DPIよりも優れた抑制作用を示 した。
[0062] (b)血管内皮細胞を ΙΟηΜの PEDFの存在下または非存在下に 100 μ g/mlの
AGE-BSAまたは非糖ィ匕牛血清アルブミンにて 24時間処理し、 NADPHォキシダーゼ 活性をルミネッセンス法により測定した。すなわち、細胞を緩衝液 (20mM Hepes、 pH7.0、 lOOmM塩化カリウム、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する ImM EDTA)に 懸濁し、細胞ホモジネートを文献 20に記載した方法により、 ImMEDTA, 150mMショ糖 、電子ァクセプターとして 5 μ Μルシジェニンおよび基質として 100 μ M NADPHを含有 する 50mMリン酸緩衝液 (ρΗ7.0)中にてルミネッセンス法により測定した。結果を図 11(b)に示す。本図から明らかなように、 PEDFは AGEにより修飾された血清アルブミン 処理細胞にぉ 、て、優れた NADPHォキシダーゼ抑制作用を示した。
本実験 (a),(b)に用いた血管内皮細胞であるヒト成人皮膚微小血管内皮細胞 (Clonetics Corp.)は、 5%牛胎児血清、 0.4%牛脳抽出物、 10ng/mlヒト上皮成長因子お よび 1 μ g/mlヒドロコルチゾンを追加したェォシン'メチレン ·ブルー培地にて培養した 。 AGE処理は、ヒト上皮成長因子およびヒドロコルチゾンを除いた培地中にて行った。
[0063] (2)微小血管内皮細胞における血清 AGE分画に対する効果
インフォームドコンセントを得た血液透析糖尿病患者 (DM-HD)血清または健康人 (Normal)血清から常法により AGE分画を得、その分画を用いて微小血管内皮細胞を lOnMPEDFの存在下または非存在下に 24時間処理した。活性酸素種であるスーパ 一オキサイドの産生を定量的に分析した結果を図 12に示す。ここで、スーパーォキサ イド生成は、上記のように処理して得た細胞を 3 Mジヒドロェチジゥムを含むフエノー ルレッドフリーのダルベッコ変性イーグル培地 (DMEM)にて培養し、 30分後に蛍光強 度を測定し、細胞をレーザースキャニング共焦点顕微鏡にて画像ィ匕し、定量ィ匕した。 本図から明らかなように、 PEDFは血液透析糖尿病患者 (DM- HD)血清からの AGE分 画で処理した細胞力 の活性酸素種産生を有意に抑制した。
[0064] (3) AGE灌流ラットでの網膜血管浸透性に対する静脈投与での効果
Adamis, A.P.らの方法 (Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 2000, 44: 2155- 2162)に準じ て血液網膜関門 (Blood retinal barrier,以下、 BRBという)損傷に対する PEDFの効果 を実験した。すなわち、 SD系ラットを麻酔処置後、 FITC抱合デキストラン (4.4kDa, Sigma社)を静脈注射した。 10〜15分後、血液サンプルをとり、各ラットをリン酸緩衝ィ匕 生理食塩水にて灌流した。灌流後、網膜を採取し、重量を測定し、均質化して FITC 抱合デキストランを抽出した。 BRB損傷を [(a)/(b)]/[(C)x(d)]の式により計算した。ここ で、（a)は網膜内 FITC抱合デキストラン量^ g)を、（b)は、網膜重量 (g)を、（c)は血漿中 の FITC抱合デキストラン濃度 ( g/mL)を、（d)は循環時間 (h)を示す。図 13に示したよ うに、 AGE-BSA処置群において、 PEDF投与群は非投与群に比べ、有意な効果を発 揮した。
[0065] 実施例 8は、 PEDFが終末糖ィ匕産物 (AGE)による微小血管内皮細胞での分子内活 性酸素種を抑制し、終末糖ィ匕産物 (AGE)にて誘発された NADPHォキシダーゼ活性 を阻害し、また、 PEDFが血液透析糖尿病患者 (DM- HD)血清力もの AGE分画で処理 した細胞に対し、有意な活性を示すことを明らかにした。さらに、 AGE灌流ラットでの 網膜血管浸透性に対し、有効性を示した。
[0066] 考察
本発明にお 、て本発明者らは、 PEDF力 HUVECにお!/、て TNF- a誘発 NF- κ Β活 性化および IL-6発現を、 NADPHォキシダーゼ仲介 ROS (活性酸素種)生成から回復 させることにより阻害することを、以下の証拠に基づき示した： [1] TNF- o;は HUVEC において細胞内 ROS (活性酸素種)生成を有意に刺激し、それは、 PEDF, NADPHォ キシダーゼ阻害物質である DPI (実施例 1参照）、または DN-RacT17N (ドミナント—ネ ガテブ 'ヒト Rac-1変異体)の過剰発現 (実施例 2参照）によって完全に抑制された； [2] PEDFは TNF- aの誘発する NADPHォキシダーゼ活性上昇を完全に抑制した (実 施例 3参照）；および、
[3] PEDFまたは抗酸化剤 NACは、 TNF- α誘発 NF- κ Β活性化および IL- 6発現を有 意に阻害した (実施例 4および 5参照)。実施例 7からは、 PEDFが濃度依存的に Angll により誘発された NADPHォキシダーゼ活性を有意に抑制することが示された。また、 実施例 8からは、 PEDFが NADPHォキシダーゼ活性を抑制することによる終末糖ィ匕産 物 (AGE)生成に伴う糖尿病性血管合併症が予防または治療できる可能性が示され た。
[0067] PEDFは 10 nMで TNF- a誘発性 ROS産生を対照レベル以下に減少させる一方で、 TNF- aの非存在下では ROS生成に影響を及ぼさな 、ことは興味深 、ことであった。 本発明者らは正確なメカニズムを理解して 、な 、が、以下のように説明できるであろう 。 HUVECにおける PEDF遺伝子発現に対する TNF-ひの効果を検討するため、 10 ng/ml TNF- αで、またはそれ抜きで 4時間処理した HUVECよりポリ (A)+RNAを単離し 、 RT—PCRにより解析した。図 5に示すように、 TNF— αは HUVECにおいて PEDF mRNAレベルを減少させることがわかった。従って本発明者らは、 PEDF mRNAの減 少は、逆にその機能的結合タンパク質の上昇をもたらし、それによつて外部から投与 された PEDFの ROS生成に対する阻害効果を増強して 、る可能性があると推測して!/ヽ る。 TNF- α処理により HUVECにおける膜に対する PEDF結合は約 1.3倍増加し、この ことは本発明者らの推測を支持している。 TNF- αが誘発する PEDF mRNA減少のメ 力-ズムは本発明者らの研究からは明らかではない。本発明者らはごく最近、培養
ECおよび周皮細胞の両者において、酸化的ストレス条件下 PEDF mRNAレベルが抑 制されることを発見したので、 TNF- α誘発性 ROS生成が PEDF mRNAレベルの抑制 に関与しているの力もしれない。どのようなメカニズムにせよ、 TNF- αによる PEDF発 現の減少は、酸化的ストレス誘発細胞障害をさらに悪化させるであろう。
[0068] 関連文献の表示
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Claims

請求の範囲
[1] a)色素上皮由来因子；
b)色素上皮由来因子 (a)と機能的に同等な性質を有する該因子の変異体；および c)該因子 (a)または該変異体 (b)をコードする核酸分子を含むベクター
より成る群カゝら選択される活性成分を含有する、 NADPHォキシダーゼ活性を抑制 するための医薬組成物。
[2] NADPHォキシダーゼ仲介活性酸素種の生成を抑制する、請求項 1記載の医薬組 成物。
[3] NADPHォキシダーゼ活性を抑制することにより、 NF- κ Β活性化、 IL-6発現、 TNF- α活性、アンジォテンシン II活性、および Ζまたは終末糖化産物情報伝達を阻害す る、請求項 1または 2記載の医薬組成物。
[4] NADPHォキシダーゼに起因する疾患を予防または治療するための、請求項 1から
3までの 、ずれか記載の医薬組成物。
[5] NADPHォキシダーゼに起因する疾患力 血管障害、 NF- κ Β活性化一関連疾患、
IL-6発現一関連疾患、 TNF- α活性一関連疾患、アンジォテンシン II活性一関連疾 患、および終末糖ィ匕産物情報伝達一関連疾患より成る群力 選択される、請求項 4 記載の医薬組成物。
[6] 血管障害が、血管炎、ァテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、ィ ンシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、および脳梗塞より成る群から選択さ れる、請求項 5記載の医薬組成物。
[7] NF- κ B活性ィ匕—関連疾患が、血管炎、ァテローム性動脈硬化症、急性冠動脈ィ ベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、癌、炎症、関節リ ゥマチ、肝疾患、腎疾患、および脳梗塞より成る群から選択される、請求項 5記載の 医薬組成物。
[8] IL-6発現一関連疾患が、冠動脈イベント、血管炎、ァテローム性動脈硬化症、急性 冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、癌、炎 症、関節リウマチ、肝疾患、腎疾患、脳梗塞、および悪性骨髄腫より成る群から選択 される、請求項 5記載の医薬組成物。 TNF- α活性—関連疾患が、血管炎、ァテローム性動脈硬化症、急性冠動脈ィべ ント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、癌、炎症、関節リウ マチ、肝疾患、腎疾患、および脳梗塞より成る群から選択される、請求項 5記載の医 薬組成物。
アンジォテンシン II活性一関連疾患が、血管炎、ァテローム性動脈硬化症、急性冠 動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、および脳 梗塞より成る群から選択される、請求項 5記載の医薬組成物。
NADPHォキシダーゼ活性を抑制することにより、終末糖ィ匕産物生成に伴う糖尿病性 血管合併症を治療するための請求項 1記載の医薬組成物。
終末糖化産物情報伝達 関連疾患が、終末糖化産物生成に伴う糖尿病性血管合 併症である、請求項 5記載の医薬組成物。
a)色素上皮由来因子;または
b)色素上皮由来因子 (a)と機能的に同等な性質を有する該因子の変異体 をコードする核酸を含む、 NADPHォキシダーゼ活性を抑制するためのベクター。
NADPHォキシダーゼ仲介活性酸素種生成を抑制する、請求項 13記載のベクター
NADPHォキシダーゼ活性を抑制することにより、 NF- κ B活性化、 IL-6発現、 TNF- α活性アンジォテンシン II活性および Zまたは終末糖ィ匕産物情報伝達を阻害する、 請求項 12または 14記載のベクター。
血管障害、 NF- κ Β活性化—関連疾患、 IL-6発現—関連疾患、 TNF- a活性—関 連疾患、アンジォテンシン II活性一関連疾患、および終末糖化産物情報伝達一関連 疾患を予防または治療するための、請求項 13から 15までのいずれか記載のベクタ
NADPHォキシダーゼ活性を抑制することにより終末糖ィ匕産物生成に伴う糖尿病性血 管合併症を治療するための請求項 13記載のベクター。
終末糖化産物情報伝達 関連疾患が、終末糖化産物生成に伴う糖尿病性血管合 併症である請求項 16記載のベクター。
a)色素上皮由来因子； b)色素上皮由来因子 (a)と機能的に同等な性質を有する該因子の変異体；および c)該因子 (a)または該変異体 (b)をコードする核酸分子を含むベクター
より成る群カゝら選択される活性成分を、 NADPHォキシダーゼに起因する疾患の予 防または治療を必要とする患者に投与することを含む、 NADPHォキシダーゼに起因 する疾患を予防または治療するための方法。
a)色素上皮由来因子；
b)色素上皮由来因子 (a)と機能的に同等な性質を有する該因子の変異体；および c)該因子 (a)または該変異体 (b)をコードする核酸分子を含むベクター
より成る群カゝら選択される活性成分の、 NADPHォキシダーゼに起因する疾患を予 防または治療するための医薬組成物の製造のための使用。
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